JPH06105688A - ファクターviii cをコードする遺伝子 - Google Patents
ファクターviii cをコードする遺伝子Info
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- JPH06105688A JPH06105688A JP5092775A JP9277593A JPH06105688A JP H06105688 A JPH06105688 A JP H06105688A JP 5092775 A JP5092775 A JP 5092775A JP 9277593 A JP9277593 A JP 9277593A JP H06105688 A JPH06105688 A JP H06105688A
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- factor viii
- dna sequence
- sequence
- factor
- dna
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ファクターVIII Cをコードする遺伝子を提
供する。 【構成】 ファクターVIII C又はその前駆体の少なく
とも部分をコードする約200bp以上のDNA。 【効果】 遺伝子工学的にファクターVIII C又はその
誘導体を製造するための手段を提供する。
供する。 【構成】 ファクターVIII C又はその前駆体の少なく
とも部分をコードする約200bp以上のDNA。 【効果】 遺伝子工学的にファクターVIII C又はその
誘導体を製造するための手段を提供する。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】ファクターVIII Cは血液凝固の
本質的経路に関与する血漿蛋白質である。遺伝性のX染
色体連鎖劣性出血性疾患であるA型血友病を有する個体
においてはこのファクターは存在せず、又は不足してい
る。ファクターVIII Cの血漿中濃度は極めて低く、そ
して一層大形の蛋白質前駆体の中間分解生成物または最
終生成物であると考えられるため、該ファクターの単離
においては大きな困難に遭遇する。従って、ファクター
VIII Cを単離しようとすれば分子量の異る有意に不均
一な複雑な混合物が得られる。
本質的経路に関与する血漿蛋白質である。遺伝性のX染
色体連鎖劣性出血性疾患であるA型血友病を有する個体
においてはこのファクターは存在せず、又は不足してい
る。ファクターVIII Cの血漿中濃度は極めて低く、そ
して一層大形の蛋白質前駆体の中間分解生成物または最
終生成物であると考えられるため、該ファクターの単離
においては大きな困難に遭遇する。従って、ファクター
VIII Cを単離しようとすれば分子量の異る有意に不均
一な複雑な混合物が得られる。
【0002】生理的に活性な蛋白質の製造に広く適用す
ることができる方法の1つに精製された形での目的蛋白
質の単離が含まれる。目的蛋白質は、その蛋白質の製造
のための組換DNA技法の開発において非常に大きな助
けとなる。目的蛋白質を手にすることによって、該蛋白
質に特異的なモノクローナル抗体を製造することがで
き、この抗体を用いて、細胞溶解物、卵母細胞中でのメ
ッセンジャーRNAからの発現、又は単細胞微生物中で
のcDNA遺伝子からの発現において、蛋白質の製造を
確立することができる。
ることができる方法の1つに精製された形での目的蛋白
質の単離が含まれる。目的蛋白質は、その蛋白質の製造
のための組換DNA技法の開発において非常に大きな助
けとなる。目的蛋白質を手にすることによって、該蛋白
質に特異的なモノクローナル抗体を製造することがで
き、この抗体を用いて、細胞溶解物、卵母細胞中でのメ
ッセンジャーRNAからの発現、又は単細胞微生物中で
のcDNA遺伝子からの発現において、蛋白質の製造を
確立することができる。
【0003】さらに、アミノ酸配列を決定することによ
り、特定のアミノ酸配列をコードするコドンを用いて、
メッセンジャーRNA、染色体DNA又はcDNAとハ
イブリダイズするプローブを開発することができ、従っ
て該当する遺伝子の検出、単離及び発現をもたらし、そ
して所望の生成物を1種類又は複数種類の宿主において
高収量で製造することができる。
り、特定のアミノ酸配列をコードするコドンを用いて、
メッセンジャーRNA、染色体DNA又はcDNAとハ
イブリダイズするプローブを開発することができ、従っ
て該当する遺伝子の検出、単離及び発現をもたらし、そ
して所望の生成物を1種類又は複数種類の宿主において
高収量で製造することができる。
【0004】
【従来の技術】米国特許第4,361,509号及びこ
れに引用された文献にはファクターVIII Cの精製が記
載されている。さらに、 Fulcher及びZimmerman,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA(1982)79:1648-1652 を参照のこ
と。 Tuddenham等、J.of Lab.Clinical Medicine(197
9)93:40-53 にはポリクローナル抗体を用いるファク
ターVIII Cの精製について記載されている。Austen,
British J.Hematology(1979)43:669-674 にはファクタ
ーVIII Cの精製のためのアミノヘキシル−セファロー
スの使用について記載されている。 Weinstein等、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA(1981)78:5137-5141 にはファ
クターVIII Cに対するスロンビンの効果が検討されて
いる。さらに、 Kuo等、Abstracts for IX Internation
al Congress of Thrombosis and Hemostasis、(コペン
ハーゲン、1983年7月)を参照のこと。
れに引用された文献にはファクターVIII Cの精製が記
載されている。さらに、 Fulcher及びZimmerman,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA(1982)79:1648-1652 を参照のこ
と。 Tuddenham等、J.of Lab.Clinical Medicine(197
9)93:40-53 にはポリクローナル抗体を用いるファク
ターVIII Cの精製について記載されている。Austen,
British J.Hematology(1979)43:669-674 にはファクタ
ーVIII Cの精製のためのアミノヘキシル−セファロー
スの使用について記載されている。 Weinstein等、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA(1981)78:5137-5141 にはファ
クターVIII Cに対するスロンビンの効果が検討されて
いる。さらに、 Kuo等、Abstracts for IX Internation
al Congress of Thrombosis and Hemostasis、(コペン
ハーゲン、1983年7月)を参照のこと。
【0005】
【発明の概要】微生物又は哺乳動物組織培養細胞での発
現によるヒト−ファクターVIII C、その前駆体及びサ
ブユニットの製造方法及び組成物が提供される。この方
法は、純粋なファクターVIII C、そのサブユニット及
び断片を単離し、そして特にスロンビン消化を用いてこ
れらの生理的関連性を決定することを含む。関連する一
連のポリペプチドの各々の少なくとも部分を配列決定
し、そしてこの配列を複合プローブの開発に使用する。
現によるヒト−ファクターVIII C、その前駆体及びサ
ブユニットの製造方法及び組成物が提供される。この方
法は、純粋なファクターVIII C、そのサブユニット及
び断片を単離し、そして特にスロンビン消化を用いてこ
れらの生理的関連性を決定することを含む。関連する一
連のポリペプチドの各々の少なくとも部分を配列決定
し、そしてこの配列を複合プローブの開発に使用する。
【0006】ゲノムDNA断片を相同配列について探索
し、ハイブリダイズする断片を単離し、そして完全なサ
ブユニット又は断片をコードするDNA断片を得るため
にさらに操作し、そして/又は成熟mRNAを単離する
ために使用し、このmRNAからcDNAを得る。次に
DNA配列をさらに操作して発現ベクターに挿入し、そ
してこの発現ベクターを適合性の宿主に挿入しポリペプ
チドを発現せしめる。
し、ハイブリダイズする断片を単離し、そして完全なサ
ブユニット又は断片をコードするDNA断片を得るため
にさらに操作し、そして/又は成熟mRNAを単離する
ために使用し、このmRNAからcDNAを得る。次に
DNA配列をさらに操作して発現ベクターに挿入し、そ
してこの発現ベクターを適合性の宿主に挿入しポリペプ
チドを発現せしめる。
【0007】
【特定の態様の記載】ヒト−ファクターVIII C断片及
びサブユニットが実質上純粋な形で提供される。さら
に、前駆体としての又は活性形でのファクターVIII C
を製造するため、あるいは天然に得られるサブユニット
と組合わせて使用する個々のサブユニットを得るための
ファクターVIII Cサブユニット及び断片を発現するた
めの方法及び構成物が提供される。このサブユニット及
び断片はファクターVIII Cと関連する1又は複数の生
物学的性質、例えばエピトープ部位、凝固活性、及び免
疫原性を有し、抗体を製造するために使用され、この抗
体は試薬として、特にイムノアッセイにおけるラベルさ
れた試薬として使用される。
びサブユニットが実質上純粋な形で提供される。さら
に、前駆体としての又は活性形でのファクターVIII C
を製造するため、あるいは天然に得られるサブユニット
と組合わせて使用する個々のサブユニットを得るための
ファクターVIII Cサブユニット及び断片を発現するた
めの方法及び構成物が提供される。このサブユニット及
び断片はファクターVIII Cと関連する1又は複数の生
物学的性質、例えばエピトープ部位、凝固活性、及び免
疫原性を有し、抗体を製造するために使用され、この抗
体は試薬として、特にイムノアッセイにおけるラベルさ
れた試薬として使用される。
【0008】ヒト−ファクターVIII Cは、約460kd
の見かけ分子量を示しそして実質上純粋な形で単離され
得る複合蛋白質である。変性条件下での電気泳動に際
し、種々の分子量、すなわち240,160,140,
115,92.5,80、及び77kdの多数の断片が生
じ、後2者はダブレットとして移動する。免疫的関係を
調べるために抗体を用いそして構造的関係を調べるため
に切断パターンを用いながら、化学的切断及びスロンビ
ン切断を含むプロテアーゼ切断により断片を分析するこ
とにより、92.5kdポリペプチドが240,160,
140及び115ポリペプチドと関連しており、他方7
7/80ダブレットは他のペプチドと共通の同定され得
る特性を有さず240kdポリペプチドとのみ共通の特性
を有することが示される。
の見かけ分子量を示しそして実質上純粋な形で単離され
得る複合蛋白質である。変性条件下での電気泳動に際
し、種々の分子量、すなわち240,160,140,
115,92.5,80、及び77kdの多数の断片が生
じ、後2者はダブレットとして移動する。免疫的関係を
調べるために抗体を用いそして構造的関係を調べるため
に切断パターンを用いながら、化学的切断及びスロンビ
ン切断を含むプロテアーゼ切断により断片を分析するこ
とにより、92.5kdポリペプチドが240,160,
140及び115ポリペプチドと関連しており、他方7
7/80ダブレットは他のペプチドと共通の同定され得
る特性を有さず240kdポリペプチドとのみ共通の特性
を有することが示される。
【0009】さらに、77/80kdダブレットはスロン
ビンにより67/70kdダブレットに転換され、他方ス
ロンビンで処理された精製ファクターVIII C物質中に
存在する92.5kdポリペプチドはスロンビンにより直
接的又は間接的に約40及び52.5kdの2個のポリペ
プチドに切断される。電気泳動的に単離された77/8
0kdダブレットポリペプチドはそのN−端がブロックさ
れており、67/70kdダブレットはそのN−端がブロ
ックされていないことが見出される。
ビンにより67/70kdダブレットに転換され、他方ス
ロンビンで処理された精製ファクターVIII C物質中に
存在する92.5kdポリペプチドはスロンビンにより直
接的又は間接的に約40及び52.5kdの2個のポリペ
プチドに切断される。電気泳動的に単離された77/8
0kdダブレットポリペプチドはそのN−端がブロックさ
れており、67/70kdダブレットはそのN−端がブロ
ックされていないことが見出される。
【0010】さらに、ファクターVIII Cの座は大きな
イントロンと共にエクソンを含み、エクソンはファクタ
ーVIII Cと関連する種々の領域を含むことが見出され
る。すなわち、ファクターVIII C複合体に関する特定
のポリペプチド及びその断片に係る個々のエクソンを単
離することができる。ファクターVIII Cサブユニット
及びその断片に関する特定のアミノ酸配列を同定するこ
とにより、ゲノムDNAからエクソンを選択的に単離
し、そしてそのエクソンをそれ自体として組合わせて、
又は合成DNAにより連結して、ファクターVIII Cの
ポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする配
列を得、これらを製造することができる。
イントロンと共にエクソンを含み、エクソンはファクタ
ーVIII Cと関連する種々の領域を含むことが見出され
る。すなわち、ファクターVIII C複合体に関する特定
のポリペプチド及びその断片に係る個々のエクソンを単
離することができる。ファクターVIII Cサブユニット
及びその断片に関する特定のアミノ酸配列を同定するこ
とにより、ゲノムDNAからエクソンを選択的に単離
し、そしてそのエクソンをそれ自体として組合わせて、
又は合成DNAにより連結して、ファクターVIII Cの
ポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする配
列を得、これらを製造することができる。
【0011】便利には、エクソン及びイントロンの両者
を含有するファクターVIII CゲノムDNA配列を哺乳
動物細胞中での転写及び翻訳に適当な発現ベクターに挿
入し、cDNAのクローニングに適するように適切にス
プライスされた実質的な量のメッセンジャーRNAを
得、そしてファクターVIII C、サブユニット又は断片
を製造する。さらに、ゲノムから単離されたDNA配列
を用いてファクターVIII Cをコードする天然メッセン
ジャーRNAとハイブリダイズさせることができる。
を含有するファクターVIII CゲノムDNA配列を哺乳
動物細胞中での転写及び翻訳に適当な発現ベクターに挿
入し、cDNAのクローニングに適するように適切にス
プライスされた実質的な量のメッセンジャーRNAを
得、そしてファクターVIII C、サブユニット又は断片
を製造する。さらに、ゲノムから単離されたDNA配列
を用いてファクターVIII Cをコードする天然メッセン
ジャーRNAとハイブリダイズさせることができる。
【0012】次に、このメッセンジャーRNAを用いて
ファクターVIII Cのサブユニットをコードするds
cDNAを調製することができる。DNA配列は、これ
を転写及び翻訳のために必要な制御がシグナルを有する
適当な発現ベクターに挿入することによって、発現のた
めに使用することができる。ファクターVIII C遺伝子
発現ベクター(ファクターVIII C、その前駆体、サブ
ユニット又は断片の全体又は部分をコードする1個又は
複数個の遺伝子を担持する発現ベクター)を適合性の宿
主に導入し、そしてこの宿主をファクターVIII Cの発
現のために増殖せしめることができる。
ファクターVIII Cのサブユニットをコードするds
cDNAを調製することができる。DNA配列は、これ
を転写及び翻訳のために必要な制御がシグナルを有する
適当な発現ベクターに挿入することによって、発現のた
めに使用することができる。ファクターVIII C遺伝子
発現ベクター(ファクターVIII C、その前駆体、サブ
ユニット又は断片の全体又は部分をコードする1個又は
複数個の遺伝子を担持する発現ベクター)を適合性の宿
主に導入し、そしてこの宿主をファクターVIII Cの発
現のために増殖せしめることができる。
【0013】宿主を適切に選択することにより、ファク
ターVIII CのDNAを分泌リーダー及びプロセシング
シグナルの下流に挿入し、生成物が宿主から分泌され、
そしてプロセシングされて完全なポリペプチドとなるよ
うにすることができる。適当であれば、このポリペプチ
ドをさらに処理してこれに天然ポリペプチド上に存在す
る官能基又は置換基を導入することができる。
ターVIII CのDNAを分泌リーダー及びプロセシング
シグナルの下流に挿入し、生成物が宿主から分泌され、
そしてプロセシングされて完全なポリペプチドとなるよ
うにすることができる。適当であれば、このポリペプチ
ドをさらに処理してこれに天然ポリペプチド上に存在す
る官能基又は置換基を導入することができる。
【0014】この発明の最初の段階において、高度に精
製したファクターVIII Cを得そして特徴付ける。精製
されたファクターVIII Cは市販のヒト−抗血友病因子
(AHF)から得ることができる。この因子は正常なヒ
トの新鮮な血漿から冷却沈澱物として調製されるもので
あり約40倍に濃縮されている。これを適当な緩衝液、
例えばイミダゾール−リジン−HCl塩溶液(pH7.
4)に溶解し、次にファクターVIII C又はファクター
VIII Rに対するポリクローナル抗体又はモノクローナ
ル抗体を有するアフィニティーカラム上でクロマトグラ
フ処理することによりファクターVIII Cをさらに濃
縮、精製する。便利には、抗体をセファロース支持体に
共有結合せしめる。
製したファクターVIII Cを得そして特徴付ける。精製
されたファクターVIII Cは市販のヒト−抗血友病因子
(AHF)から得ることができる。この因子は正常なヒ
トの新鮮な血漿から冷却沈澱物として調製されるもので
あり約40倍に濃縮されている。これを適当な緩衝液、
例えばイミダゾール−リジン−HCl塩溶液(pH7.
4)に溶解し、次にファクターVIII C又はファクター
VIII Rに対するポリクローナル抗体又はモノクローナ
ル抗体を有するアフィニティーカラム上でクロマトグラ
フ処理することによりファクターVIII Cをさらに濃
縮、精製する。便利には、抗体をセファロース支持体に
共有結合せしめる。
【0015】比較的高濃度のカルシウムイオンとグリセ
リンとの組合せを用いてカラムからファクターVIII C
を溶出することができる。次に、カラムから得られた画
分を低いカルシウム濃度の上記の適当な緩衝液を用いて
透析し、そして次にアミノヘキシル−セファロースカラ
ムを用い高濃度の塩化カルシウム又は塩化ナトリウムを
含む緩衝液で溶出することにより、さらに精製すること
ができる。追加のクロマトグラフ段階、例えばゼラチン
セファロース、HPLC、デキストランサルフェート又
はMono Q上でのイオン交換、レクチン又はファク
ターVIII Cに対する抗体を用いるアフィニティーカラ
ム等によりさらに精製することができる。
リンとの組合せを用いてカラムからファクターVIII C
を溶出することができる。次に、カラムから得られた画
分を低いカルシウム濃度の上記の適当な緩衝液を用いて
透析し、そして次にアミノヘキシル−セファロースカラ
ムを用い高濃度の塩化カルシウム又は塩化ナトリウムを
含む緩衝液で溶出することにより、さらに精製すること
ができる。追加のクロマトグラフ段階、例えばゼラチン
セファロース、HPLC、デキストランサルフェート又
はMono Q上でのイオン交換、レクチン又はファク
ターVIII Cに対する抗体を用いるアフィニティーカラ
ム等によりさらに精製することができる。
【0016】特に、デキストランサルフェートを使用す
ることにより微量汚染物、例えばフィブリノーゲン、フ
ィブロレクチン、IgGが標品から除去され、外来性蛋
白質を実質上含有しない生成物が残る。カラムからの画
分の活性は、凝固アッセイ(市販キット)及びファクタ
ーVIII Cに特異的な抗体を用いて、生物学的活性及び
抗原活性のいずれか又は両方について監視することがで
きる。血漿中のファクターVIII の濃度に基いて、上記
の方法により約200,000倍の精製が達成される。
ることにより微量汚染物、例えばフィブリノーゲン、フ
ィブロレクチン、IgGが標品から除去され、外来性蛋
白質を実質上含有しない生成物が残る。カラムからの画
分の活性は、凝固アッセイ(市販キット)及びファクタ
ーVIII Cに特異的な抗体を用いて、生物学的活性及び
抗原活性のいずれか又は両方について監視することがで
きる。血漿中のファクターVIII の濃度に基いて、上記
の方法により約200,000倍の精製が達成される。
【0017】ファクターVIII Cの特徴付け ゲル濾過により、ファクターVIII Cが約460kdの見
かけ分子量を有する複合体として挙動することが示され
る。SDS−ゲル電気泳動(変性条件)を用いて分子量
を異にする7個の個別のポリペプチドを単離することが
できる。その分子量により定義される断片は240,1
60,140,115,92.5,80及び77kd断片
である。これらの断片を次の方法により特徴付けた。
かけ分子量を有する複合体として挙動することが示され
る。SDS−ゲル電気泳動(変性条件)を用いて分子量
を異にする7個の個別のポリペプチドを単離することが
できる。その分子量により定義される断片は240,1
60,140,115,92.5,80及び77kd断片
である。これらの断片を次の方法により特徴付けた。
【0018】第1の研究は、血友病患者から単離された
阻害抗体を用いることを含む。これらの抗体をZ及びE
と称する。両抗体は77/80kdダブレットと反応し
た。E抗体は240kdポリペプチドと強く反応し、そし
てダブレットと240kdポリペプチドとの間の複数のバ
ンドと弱く反応した。Z抗体は240kdポリペプチドと
も弱く反応した。
阻害抗体を用いることを含む。これらの抗体をZ及びE
と称する。両抗体は77/80kdダブレットと反応し
た。E抗体は240kdポリペプチドと強く反応し、そし
てダブレットと240kdポリペプチドとの間の複数のバ
ンドと弱く反応した。Z抗体は240kdポリペプチドと
も弱く反応した。
【0019】免疫沈澱実験において、E抗体は77/8
0kdダブレット、並びに160,140,115及び9
2.5kdの高分子量種を沈澱せしめ、ダブレットは一層
強いバンド中にある。EGTAを含有せしめることによ
りダブレット以外のバンドが消失し、92.5kd種がC
a++橋に中介されて複合体中で77kd及び/又は80kd
種と会合することが示される。
0kdダブレット、並びに160,140,115及び9
2.5kdの高分子量種を沈澱せしめ、ダブレットは一層
強いバンド中にある。EGTAを含有せしめることによ
りダブレット以外のバンドが消失し、92.5kd種がC
a++橋に中介されて複合体中で77kd及び/又は80kd
種と会合することが示される。
【0020】次の研究において、ファクターVIII Cに
介在される凝固活性を阻害しそして複合体の成分と反応
するモノクローナル抗体を調製した。クラスIは77/
80kdダブレット及び240kdポリペプチドと反応し、
クラスIIは160,140,115及び92.5kdポリ
ペプチドと反応する。クラスI抗体とスロンビン消化フ
ァクターVIII Cとの免疫沈澱により、生成する70/
67kdダブレットはファクターVIII C中に存在する7
7/80kdダブレットに由来することが示される。
介在される凝固活性を阻害しそして複合体の成分と反応
するモノクローナル抗体を調製した。クラスIは77/
80kdダブレット及び240kdポリペプチドと反応し、
クラスIIは160,140,115及び92.5kdポリ
ペプチドと反応する。クラスI抗体とスロンビン消化フ
ァクターVIII Cとの免疫沈澱により、生成する70/
67kdダブレットはファクターVIII C中に存在する7
7/80kdダブレットに由来することが示される。
【0021】クラスIIモノクローナル抗体は、160,
140及び115kdペプチドが92.5kdペプチドの前
駆体であることを示した。92.5kdペプチドの切断生
成物である40kdペプチドもクラスII抗体により結合さ
れた。EGTAの存在下及び非存在下でモノクローナル
抗体を用いるELISA測定によりファクターVIIIC
複合体の92.5kd成分と77kd及び/又は80kd成分
との間のCa++橋会合が確認された。
140及び115kdペプチドが92.5kdペプチドの前
駆体であることを示した。92.5kdペプチドの切断生
成物である40kdペプチドもクラスII抗体により結合さ
れた。EGTAの存在下及び非存在下でモノクローナル
抗体を用いるELISA測定によりファクターVIIIC
複合体の92.5kd成分と77kd及び/又は80kd成分
との間のCa++橋会合が確認された。
【0022】ヒト阻害抗体及びモノクローナル抗体の両
者は、イムノソルベントカラム法においてファクターV
III Cを得るために使用することができ、又はEGTA
を用いながら、構成成分である92.5kd種と77/8
0kd種を分けるために使用することができる。
者は、イムノソルベントカラム法においてファクターV
III Cを得るために使用することができ、又はEGTA
を用いながら、構成成分である92.5kd種と77/8
0kd種を分けるために使用することができる。
【0023】次の研究では、精製されたファクターVII
I C物質のpH6.8又は7.4におけるスロンビン消化
を用いた。アリコートを凝固活性について測定しそして
ゲル分析のためにTCA沈澱せしめた。凝固活性は9
2.5kd種の量の増加及び減少に伴って時間と共に増加
しそして減少することが示された。精製されたファクタ
ーVIII C物質の短時間(5〜15分間)のスロンビン
処理により92.5kd種の量が増加し、77/80kdダ
ブレットは部分的に67/70kdダブレットに転換され
る。
I C物質のpH6.8又は7.4におけるスロンビン消化
を用いた。アリコートを凝固活性について測定しそして
ゲル分析のためにTCA沈澱せしめた。凝固活性は9
2.5kd種の量の増加及び減少に伴って時間と共に増加
しそして減少することが示された。精製されたファクタ
ーVIII C物質の短時間(5〜15分間)のスロンビン
処理により92.5kd種の量が増加し、77/80kdダ
ブレットは部分的に67/70kdダブレットに転換され
る。
【0024】長時間、例えば1時間スロンビン消化する
場合、92.5kd蛋白質が分解され、そして40kd及び
52.5kdの2個の新たなペプチドが生じ、40kdペプ
チドは92.5kd種の免疫原性を維持している。52.
5kdペプチドは、化学的及び酵素的分解パターン及び9
2.5kd種に類似する生成物により、切断生成物である
ことが示される。
場合、92.5kd蛋白質が分解され、そして40kd及び
52.5kdの2個の新たなペプチドが生じ、40kdペプ
チドは92.5kd種の免疫原性を維持している。52.
5kdペプチドは、化学的及び酵素的分解パターン及び9
2.5kd種に類似する生成物により、切断生成物である
ことが示される。
【0025】次の研究において、個々のファクターVII
I Cサブユニット及び前駆体(例えば240,77/8
0,92.5kd種)を調製用SDSゲル電気泳動により
単離し、そして次に単離されたポリペプチドの経時的ス
ロンビン消化を行った。調製用ゲルから単離された24
0kd断片は160,140,115、及び92.5kdの
バンドを生成した。80kd及び77kdの断片はそれぞれ
70kd及び67kdの断片を生成した。
I Cサブユニット及び前駆体(例えば240,77/8
0,92.5kd種)を調製用SDSゲル電気泳動により
単離し、そして次に単離されたポリペプチドの経時的ス
ロンビン消化を行った。調製用ゲルから単離された24
0kd断片は160,140,115、及び92.5kdの
バンドを生成した。80kd及び77kdの断片はそれぞれ
70kd及び67kdの断片を生成した。
【0026】77kd及び/又は80kd種と92.5kdポ
リペプチドとをカルシウム橋複合体として含有するファ
クターVIII C複合体は高度に精製された形で得られ
る。抗−ファクターVIII Rイムノソルベントカラム及
びアミノヘキシルセファロースカラムで処理した後、フ
ァクターVIII C物質(複合体及び前駆体種)の純度
は、全蛋白質を基礎にして、通常は80%より高く、し
ばしば90%より高く、そして98%以上でありえ、そ
して複合体の純度は、全蛋白質を基礎にして20%以上
であり、さらに一般的には30%以上である。
リペプチドとをカルシウム橋複合体として含有するファ
クターVIII C複合体は高度に精製された形で得られ
る。抗−ファクターVIII Rイムノソルベントカラム及
びアミノヘキシルセファロースカラムで処理した後、フ
ァクターVIII C物質(複合体及び前駆体種)の純度
は、全蛋白質を基礎にして、通常は80%より高く、し
ばしば90%より高く、そして98%以上でありえ、そ
して複合体の純度は、全蛋白質を基礎にして20%以上
であり、さらに一般的には30%以上である。
【0027】追加のクロマトグラフ段階、例えばデキス
トランサルフェートの使用により、ファクターVIII C
物質(複合体+前駆体)の純度レベルが90%以上に上
昇する。調製用SDSゲル電気泳動により単離されたフ
ァクターVIII C成分、すなわち92.5kd種及び77
/80kdダブレットの純度は通常98%以上である。上
記のように、ダブレットの1員又は92.5kdポリペプ
チドに特異的なモノクローナル抗体を用いて複合体を得
ることができる。次に、変性剤又はチャオトロピック
(chaotropic) 溶剤、例えば尿素水溶液又はチオイソシ
アナートを用いて複合体を抗体から分離することができ
る。
トランサルフェートの使用により、ファクターVIII C
物質(複合体+前駆体)の純度レベルが90%以上に上
昇する。調製用SDSゲル電気泳動により単離されたフ
ァクターVIII C成分、すなわち92.5kd種及び77
/80kdダブレットの純度は通常98%以上である。上
記のように、ダブレットの1員又は92.5kdポリペプ
チドに特異的なモノクローナル抗体を用いて複合体を得
ることができる。次に、変性剤又はチャオトロピック
(chaotropic) 溶剤、例えば尿素水溶液又はチオイソシ
アナートを用いて複合体を抗体から分離することができ
る。
【0028】プローブの調製 67及び79kdポリペプチドのN−端の部分的アミノ酸
配列は次の通りである。
配列は次の通りである。
【化2】
【0029】この配列に基いて、67/70kdダブレッ
ト用の(従って、このダブレットが由来する77/80
kdダブレット用の)、次の配列を有するプローブを調製
することができる。
ト用の(従って、このダブレットが由来する77/80
kdダブレット用の)、次の配列を有するプローブを調製
することができる。
【化3】
【0030】52.5kd蛋白質のN−端アミノ酸配列は
実質上次の通りである。
実質上次の通りである。
【化4】
【0031】このアミノ酸配列に基いて、52.5kd蛋
白質用の、次のようなコード鎖を基礎にするプローブを
調製することができる。
白質用の、次のようなコード鎖を基礎にするプローブを
調製することができる。
【化5】
【0032】77/80kd蛋白質の3個の断片のアミノ
酸配列は次の通りである。
酸配列は次の通りである。
【化6】
【0033】これらの配列に基いて、非コード鎖に基礎
を置くそれぞれ次のようなプローブを調製することがで
きる。
を置くそれぞれ次のようなプローブを調製することがで
きる。
【化7】
【0034】これらのペプチドの配列及び対応するプロ
ーブの調製については実験の部において詳細に後記す
る。DNAの単離 上記のプローブを用いてゲノムDNA又はメッセンジャ
ーRNAの検出及び単離を行うことができる。ゲノムD
NAのクローニングは、1種又は複数種の制限酵素によ
るゲノムDNAの切断及び約10〜25kdの断片のサイ
ズ選択を含む。制限消化はクローン化される断片がオー
バーラップするように不完全であるべきである。これら
の断片は適当なベクターにクローン化して微生物、例え
ば細菌、例えばE.コリ(E.coli) 中にクローンの「ラ
イブラリー」を調製することができる。
ーブの調製については実験の部において詳細に後記す
る。DNAの単離 上記のプローブを用いてゲノムDNA又はメッセンジャ
ーRNAの検出及び単離を行うことができる。ゲノムD
NAのクローニングは、1種又は複数種の制限酵素によ
るゲノムDNAの切断及び約10〜25kdの断片のサイ
ズ選択を含む。制限消化はクローン化される断片がオー
バーラップするように不完全であるべきである。これら
の断片は適当なベクターにクローン化して微生物、例え
ば細菌、例えばE.コリ(E.coli) 中にクローンの「ラ
イブラリー」を調製することができる。
【0035】プラスミド又はウイルス、例えばpBR3
22、ラムダ、シャロン4A、EMBL−4等の種々の
ベクターを使用することができる。酵素的に放射能ラベ
ルした上記のプローブを用いてDNAをスクリーニング
し、そして相同な配列を検出する。1又は複数のプロー
ブとハイブリダイズするこれらの配列を再クローン化
し、そして1回又は複数回再ハイブリダイズすることが
できる。
22、ラムダ、シャロン4A、EMBL−4等の種々の
ベクターを使用することができる。酵素的に放射能ラベ
ルした上記のプローブを用いてDNAをスクリーニング
し、そして相同な配列を検出する。1又は複数のプロー
ブとハイブリダイズするこれらの配列を再クローン化
し、そして1回又は複数回再ハイブリダイズすることが
できる。
【0036】最初に使用したプローブとは異る1種類又
は複数種類の制限酵素を用いて一層小さい断片を得るこ
とができる。これらの小断片は一般には約1〜10kd、
さらに普通には1〜6kdの範囲の大きさを有する。次
に、これらの断片をサブクローン化し、そしてスクリー
ニングして陽性の断片を同定することができる。次に、
DNA断片の配列決定のためにプライマーとして合成プ
ローブを使用することができる。
は複数種類の制限酵素を用いて一層小さい断片を得るこ
とができる。これらの小断片は一般には約1〜10kd、
さらに普通には1〜6kdの範囲の大きさを有する。次
に、これらの断片をサブクローン化し、そしてスクリー
ニングして陽性の断片を同定することができる。次に、
DNA断片の配列決定のためにプライマーとして合成プ
ローブを使用することができる。
【0037】最も便利に配列決定される断片は、1種類
又は複数種類の上記のプローブと相補的な配列を含有す
る断片であり、ここで相同な配列は5′−端から約5塩
基〜約500塩基である。注目される他の断片には最初
にクローン化された断片の末端部の断片が含まれる。な
ぜなら、これらはライブラリー中の他のクローンにおい
て示され、そしてそれ故に完全な目的遺伝子を回収する
まで染色体にそって「歩く」ために使用されるからであ
る。
又は複数種類の上記のプローブと相補的な配列を含有す
る断片であり、ここで相同な配列は5′−端から約5塩
基〜約500塩基である。注目される他の断片には最初
にクローン化された断片の末端部の断片が含まれる。な
ぜなら、これらはライブラリー中の他のクローンにおい
て示され、そしてそれ故に完全な目的遺伝子を回収する
まで染色体にそって「歩く」ために使用されるからであ
る。
【0038】DNA断片を配列決定した後、決定された
配列に基いてさらに操作する。この配列に基いて、決定
されたアミノ酸配列を含むオープンリーディングフレー
ムを同定することができる。制限部位を決定することに
より、コード配列を失うことなく断片のサイズをさらに
小さくすることができる。但し、N−端の短い配列を除
去することは許容される。これは適当なアダプターを用
いて置き換えることができるからである。
配列に基いてさらに操作する。この配列に基いて、決定
されたアミノ酸配列を含むオープンリーディングフレー
ムを同定することができる。制限部位を決定することに
より、コード配列を失うことなく断片のサイズをさらに
小さくすることができる。但し、N−端の短い配列を除
去することは許容される。これは適当なアダプターを用
いて置き換えることができるからである。
【0039】適当な位置において制限部位を容易に用い
ることができない場合には、DNA断片を種々の時間に
わたってBal31切断(リセクト)により変形し、生
じた断片をクローン化し、そして種々の技法によりN−
端を決定することができる。便利には、リセクトされた
断片が連結される3′−塩基の適切な選択により特定の
制限酵素の認識部位を設けることができる。この方法に
おいて、生ずるクローンをあらかじめ定められた制限部
位についてスクリーニングすることができ、この部位は
所望の部位へのリセクトされた断片の存在を示すであろ
う。
ることができない場合には、DNA断片を種々の時間に
わたってBal31切断(リセクト)により変形し、生
じた断片をクローン化し、そして種々の技法によりN−
端を決定することができる。便利には、リセクトされた
断片が連結される3′−塩基の適切な選択により特定の
制限酵素の認識部位を設けることができる。この方法に
おいて、生ずるクローンをあらかじめ定められた制限部
位についてスクリーニングすることができ、この部位は
所望の部位へのリセクトされた断片の存在を示すであろ
う。
【0040】好ましくは、エクソン、又は50bp以上、
さらに一般的には約100bp以上、さらには約250bp
又はこれより大きいエクソン断片を変性し、そしてヒト
細胞、特にファクターVIII CのためのmRNAを産生
するヒト細胞からmRNAを得るためのプローブとして
使用することができる。ハイブリダイズするmRNAを
単離することによって、卵母細胞又は網状赤血球溶解物
中での翻訳、及びファクターVIII Cに対する抗体又は
ファクターVIII Cサブユニットへの結合に基く凝固活
性を用いるファクターVIII Cの産生の検出を行うこと
によりmRNAをスクリーニングすることができる。次
に、例えばAMV逆転写酵素を用いてmRNAを逆転写
することができる。
さらに一般的には約100bp以上、さらには約250bp
又はこれより大きいエクソン断片を変性し、そしてヒト
細胞、特にファクターVIII CのためのmRNAを産生
するヒト細胞からmRNAを得るためのプローブとして
使用することができる。ハイブリダイズするmRNAを
単離することによって、卵母細胞又は網状赤血球溶解物
中での翻訳、及びファクターVIII Cに対する抗体又は
ファクターVIII Cサブユニットへの結合に基く凝固活
性を用いるファクターVIII Cの産生の検出を行うこと
によりmRNAをスクリーニングすることができる。次
に、例えばAMV逆転写酵素を用いてmRNAを逆転写
することができる。
【0041】逆転写酵素又はDNAポリメラーゼI(Kl
enow断片) 第2鎖を形成しそして適当であればヌクレア
ーゼ、例えばS1 ヌクレアーゼにより末端ループを除去
することにより、種々の方法を用いてss cDNAを
ds cDNAに転換することができる。不完全なコピ
ーが得られる場合、mRNAの5′−コード配列がコピ
ーされるまでメッセンジャーを「歩かせ」、又はcDN
Aプライム合成を行い、そしてmRNAの全コード領域
をコードするDNA配列を得ることができる。
enow断片) 第2鎖を形成しそして適当であればヌクレア
ーゼ、例えばS1 ヌクレアーゼにより末端ループを除去
することにより、種々の方法を用いてss cDNAを
ds cDNAに転換することができる。不完全なコピ
ーが得られる場合、mRNAの5′−コード配列がコピ
ーされるまでメッセンジャーを「歩かせ」、又はcDN
Aプライム合成を行い、そしてmRNAの全コード領域
をコードするDNA配列を得ることができる。
【0042】上記の方法に基いて、ファクターVIII C
の前駆体又は該ファクターの大断片をコードするDNA
配列を用いて発現せしめ、又はファクターVIII Cの特
定のサブユニット、例えば92.5kd、80kd又は77
kdのサブユニットをコードする小断片を用いることがで
きる。
の前駆体又は該ファクターの大断片をコードするDNA
配列を用いて発現せしめ、又はファクターVIII Cの特
定のサブユニット、例えば92.5kd、80kd又は77
kdのサブユニットをコードする小断片を用いることがで
きる。
【0043】前駆体ポリペプチド(プローファクターV
III C)のためには、遺伝子を1端又は両端において平
滑末端化し、そして相補末端を有する発現ベクター中に
挿入することができ、あるいは5′−コード端から下流
で切断し、そしてベクターに挿入するために適当なアダ
プターに連結することができる。そして、適当なN−端
を有する断片(70kd又は80kdポリペプチドのコード
配列にあってもよく、又は最初の塩基から下流、一般に
約30塩基以下下流、さらに一般的には約20塩基以下
下流に5′−端を有してもよい)を、適当であればアダ
プターを用いて、適切なベクターに挿入することができ
る。
III C)のためには、遺伝子を1端又は両端において平
滑末端化し、そして相補末端を有する発現ベクター中に
挿入することができ、あるいは5′−コード端から下流
で切断し、そしてベクターに挿入するために適当なアダ
プターに連結することができる。そして、適当なN−端
を有する断片(70kd又は80kdポリペプチドのコード
配列にあってもよく、又は最初の塩基から下流、一般に
約30塩基以下下流、さらに一般的には約20塩基以下
下流に5′−端を有してもよい)を、適当であればアダ
プターを用いて、適切なベクターに挿入することができ
る。
【0044】染色体外要素を得るため、特定の宿主、発
現の態様、構成的か誘導的か、好ましいマーカー、分泌
が好ましいか否か等に依存して種々のベクターを使用す
ることができる。(ここで、ベクターとは無傷の複製系
を意味する。)現在、哺乳動物宿主、例えば組織培養細
胞、又は原核性微生物及び真核性微生物、例えばE.コ
リ、B.ズブチリス(B.subtilis) 、B.サーモフィル
ス(B.thermophilus)、S.セレビシエー(S.cerevisi
ae)等により認識される転写及び翻訳制御シグナルを有
する種々のベクターを使用することができる。
現の態様、構成的か誘導的か、好ましいマーカー、分泌
が好ましいか否か等に依存して種々のベクターを使用す
ることができる。(ここで、ベクターとは無傷の複製系
を意味する。)現在、哺乳動物宿主、例えば組織培養細
胞、又は原核性微生物及び真核性微生物、例えばE.コ
リ、B.ズブチリス(B.subtilis) 、B.サーモフィル
ス(B.thermophilus)、S.セレビシエー(S.cerevisi
ae)等により認識される転写及び翻訳制御シグナルを有
する種々のベクターを使用することができる。
【0045】ベクターは宿主により認識される複製系を
有するであろう。但し、ある場合には、宿主ゲノムへの
翻訳及び転写制御シグナル並びに注目のシストロンを有
する構成物の組み込みが望ましいであろう。このような
場合には、構成物の両端に宿主ゲノム中の配列と相同の
配列が付加されるであろう。
有するであろう。但し、ある場合には、宿主ゲノムへの
翻訳及び転写制御シグナル並びに注目のシストロンを有
する構成物の組み込みが望ましいであろう。このような
場合には、構成物の両端に宿主ゲノム中の配列と相同の
配列が付加されるであろう。
【0046】使用される発現ベクターは宿主により認識
される転写及び翻訳シグナルを有するであろう。転写シ
グナルはプロモーター及びターミネーター、並びに1又
は複数個のエンハンサーのごとき補助シグナルを含むで
あろう。さらに、転写の制御は、オペレーター、アクチ
ベーター、抑制をもたらす遺伝子等を含有せしめること
によって行われるであろう。転写に関する他の配列には
キャップ配列、ポリアデニル化配列等が含まれる。翻訳
のためには、宿主に依存して、リボゾーム結合部位、開
始コドン、終始コドン等が存在するであろう。
される転写及び翻訳シグナルを有するであろう。転写シ
グナルはプロモーター及びターミネーター、並びに1又
は複数個のエンハンサーのごとき補助シグナルを含むで
あろう。さらに、転写の制御は、オペレーター、アクチ
ベーター、抑制をもたらす遺伝子等を含有せしめること
によって行われるであろう。転写に関する他の配列には
キャップ配列、ポリアデニル化配列等が含まれる。翻訳
のためには、宿主に依存して、リボゾーム結合部位、開
始コドン、終始コドン等が存在するであろう。
【0047】便利には、宿主により認識されるシグナル
が適切な関連において存在するように、宿主にとって本
来的である遺伝子由来の非コード5′−及び3′−フラ
ンク領域が用いられるであろう。遺伝子のリーディング
フレームが開始コドンと整合し、そしてそれ自身の終止
コドンを有し又は1又は複数の終止コドンのすぐ上流に
挿入されるように、上記のフランク領域を遺伝子に連結
することができる。ベクターは、選択を可能にし、そし
て宿主の増殖中に連続的な選択圧をもたらす1個又は複
数個のマーカーを有するであろう。これらのマーカーに
は、栄養要求宿主における原栄養性、抗生物質耐性、毒
性耐性等が含まれるであろう。
が適切な関連において存在するように、宿主にとって本
来的である遺伝子由来の非コード5′−及び3′−フラ
ンク領域が用いられるであろう。遺伝子のリーディング
フレームが開始コドンと整合し、そしてそれ自身の終止
コドンを有し又は1又は複数の終止コドンのすぐ上流に
挿入されるように、上記のフランク領域を遺伝子に連結
することができる。ベクターは、選択を可能にし、そし
て宿主の増殖中に連続的な選択圧をもたらす1個又は複
数個のマーカーを有するであろう。これらのマーカーに
は、栄養要求宿主における原栄養性、抗生物質耐性、毒
性耐性等が含まれるであろう。
【0048】分泌リーダー及びプロセシングシグナルが
設けられる場合、通常アダプターを使用する必要があろ
う。分泌リーダー及びプロセシングシグナルをコードす
るDNA配列の末端又はその上流に適当な制限部位を設
けることにより、通常約10〜50bpのオリゴヌクレオ
チドアダプターを合成し、これを、分泌リーダー及びプ
ロセシングシグナル又はその切断部位と注目の遺伝子
(この遺伝子は遺伝子の開始コドン又はその下流に5′
末端を有する)との間に挿入し、こうすることによって
アダプターが必要な喪失塩基のすべてを修復し、そして
遺伝子のリーディングフレームとリーダー配列の開始コ
ドンが整合するようにすることができよう。
設けられる場合、通常アダプターを使用する必要があろ
う。分泌リーダー及びプロセシングシグナルをコードす
るDNA配列の末端又はその上流に適当な制限部位を設
けることにより、通常約10〜50bpのオリゴヌクレオ
チドアダプターを合成し、これを、分泌リーダー及びプ
ロセシングシグナル又はその切断部位と注目の遺伝子
(この遺伝子は遺伝子の開始コドン又はその下流に5′
末端を有する)との間に挿入し、こうすることによって
アダプターが必要な喪失塩基のすべてを修復し、そして
遺伝子のリーディングフレームとリーダー配列の開始コ
ドンが整合するようにすることができよう。
【0049】次に、こうして得られた所望の遺伝子を含
有する構成物を、常法、例えばトランスホーメーショ
ン、接合、トランスフェクション等によって、培養にお
いて増殖することができる宿主に導入することができ
る。次に、宿主を適当な栄養培地中で増殖せしめ、そし
て生成物を常法に従って単離することができる。生成物
が細胞内に維持される場合、細胞を集め、そして溶解す
る。分泌される場合には、生成物を培地から単離する。
生成物にクロマトグラフィーにより、例えばアフィニテ
ィークロマトグラフィー、電気泳動、抽出、HPLC等
により精製することができる。
有する構成物を、常法、例えばトランスホーメーショ
ン、接合、トランスフェクション等によって、培養にお
いて増殖することができる宿主に導入することができ
る。次に、宿主を適当な栄養培地中で増殖せしめ、そし
て生成物を常法に従って単離することができる。生成物
が細胞内に維持される場合、細胞を集め、そして溶解す
る。分泌される場合には、生成物を培地から単離する。
生成物にクロマトグラフィーにより、例えばアフィニテ
ィークロマトグラフィー、電気泳動、抽出、HPLC等
により精製することができる。
【0050】哺乳動物細胞での発現のためにはベクター
として哺乳動物ウイルス、例えばSV−40、乳頭腫ウ
イルス、マロニー(Maloney)ネズミサルコーマウイル
ス、アデノウイルス等を使用することができる。これら
のウイルスは哺乳動物細胞の培養物中で発現ベクターと
して使用するために変性されている。代表的な系におい
ては、組込まれたSV−40ゲノムを担持しそしてSV
−40の複製のために必要なラージT抗原を産生するC
OS細胞が使用される〔Gluzman,Cell (1981) 23:175
〕。SV−40地図上のHpa I部位からSV−4
0地図上の0.14部位にわたる断片がベクターとして
使用される。ファクターVIII C遺伝子又はその部分と
SV−40ベクターとを連結することによって得られる
組換プラスミドはモンキーCV−1細胞のトランスフェ
クトのために使用することができる。
として哺乳動物ウイルス、例えばSV−40、乳頭腫ウ
イルス、マロニー(Maloney)ネズミサルコーマウイル
ス、アデノウイルス等を使用することができる。これら
のウイルスは哺乳動物細胞の培養物中で発現ベクターと
して使用するために変性されている。代表的な系におい
ては、組込まれたSV−40ゲノムを担持しそしてSV
−40の複製のために必要なラージT抗原を産生するC
OS細胞が使用される〔Gluzman,Cell (1981) 23:175
〕。SV−40地図上のHpa I部位からSV−4
0地図上の0.14部位にわたる断片がベクターとして
使用される。ファクターVIII C遺伝子又はその部分と
SV−40ベクターとを連結することによって得られる
組換プラスミドはモンキーCV−1細胞のトランスフェ
クトのために使用することができる。
【0051】この発明に従えば、ファクターVIII Cの
精製されたサブユニット及び断片が得られ、そして特定
のサブユニットを必要とする個体の凝固能力を強化する
ために使用される。ファクターVIII Cはまた医療にお
いて使用される。さらに、この発明によって製造された
ポリペプチドは、ファクターVIII C、そのサブユニッ
ト及び断片に対するモノクローナル抗体を製造するため
に使用することができる。
精製されたサブユニット及び断片が得られ、そして特定
のサブユニットを必要とする個体の凝固能力を強化する
ために使用される。ファクターVIII Cはまた医療にお
いて使用される。さらに、この発明によって製造された
ポリペプチドは、ファクターVIII C、そのサブユニッ
ト及び断片に対するモノクローナル抗体を製造するため
に使用することができる。
【0052】さらに、サブユニット及び断片は試薬とし
て使用される。この試薬はラベルされ、そして抗体と組
合わせて生理的液体、例えば血液又は血清中の1又は複
数のサブユニット又はその分解断片の存在に診断的測定
において使用される。次に例によりこの発明をさらに具
体的に説明する。特にことわらない限りAbは抗体を意
味し、そしてAgは抗原を意味する。
て使用される。この試薬はラベルされ、そして抗体と組
合わせて生理的液体、例えば血液又は血清中の1又は複
数のサブユニット又はその分解断片の存在に診断的測定
において使用される。次に例によりこの発明をさらに具
体的に説明する。特にことわらない限りAbは抗体を意
味し、そしてAgは抗原を意味する。
【0053】実験 I.ファクターVIII Cの精製 a)E.G.D.Tuddenham, N.C.Trabold, J.A.Collins 及び
L.W.Hoyer, J.of Lab.Clinical Medicine (1979)93:40
により最初に記載された方法によるポリクローナル抗体
VIII R−セファロースカラムを用いるイムノソルベン
トクロマトグラフィー;及び b)D.E.G.Austen, Brit
ish J.of Hemotology (1979)43:669 により最初に記載
されたアミノヘキシル置換アガロース上でのクロマトグ
ラフ的分離により、市販の冷却沈澱標品からヒト−ファ
クターVIII Cを単離した。
L.W.Hoyer, J.of Lab.Clinical Medicine (1979)93:40
により最初に記載された方法によるポリクローナル抗体
VIII R−セファロースカラムを用いるイムノソルベン
トクロマトグラフィー;及び b)D.E.G.Austen, Brit
ish J.of Hemotology (1979)43:669 により最初に記載
されたアミノヘキシル置換アガロース上でのクロマトグ
ラフ的分離により、市販の冷却沈澱標品からヒト−ファ
クターVIII Cを単離した。
【0054】この方法の詳細を次に記載する。アトラン
ティック・アンチボディー(Atlantic Antibody)から得
られたヤギ抗−ヒトファクターVIII 関連抗原(VIII
:R)血清(カット No.040−01)を、標準0−
50%硫酸アンモニウムカットで処理し、次にDEAE
セルロースカラムクロマトグラフィーにかけ、又は同様
の0−33%カットで処理し、次にクロマトグラフィー
を行わなかった。次にこれらの物質をそれぞれCNBr
−活性化セファロースCL2B又は4B(ファルマシ
ア、17−0140−01又は17−0430−01)
と接合せしめ、そしてカラムに注入した(抗VIII :R
−セファロースカラム)。
ティック・アンチボディー(Atlantic Antibody)から得
られたヤギ抗−ヒトファクターVIII 関連抗原(VIII
:R)血清(カット No.040−01)を、標準0−
50%硫酸アンモニウムカットで処理し、次にDEAE
セルロースカラムクロマトグラフィーにかけ、又は同様
の0−33%カットで処理し、次にクロマトグラフィー
を行わなかった。次にこれらの物質をそれぞれCNBr
−活性化セファロースCL2B又は4B(ファルマシ
ア、17−0140−01又は17−0430−01)
と接合せしめ、そしてカラムに注入した(抗VIII :R
−セファロースカラム)。
【0055】“HEMOFIL”、すなわち正常なヒト
の新鮮な血漿から調製された濃縮形の抗血友病因子(フ
ァクターVIII 、AFH、AHG)の安定な乾燥標品
(ファクターVIII Cについて約40倍に濃縮されてい
る)を、0.02Mイミダゾール、0.15M NaC
l、0.1Mリジン−HCl、0.02%NaN3 を含
むpH7.4の緩衝液に溶解した。
の新鮮な血漿から調製された濃縮形の抗血友病因子(フ
ァクターVIII 、AFH、AHG)の安定な乾燥標品
(ファクターVIII Cについて約40倍に濃縮されてい
る)を、0.02Mイミダゾール、0.15M NaC
l、0.1Mリジン−HCl、0.02%NaN3 を含
むpH7.4の緩衝液に溶解した。
【0056】溶解した後、HEMOFILを上記の抗V
III :R−セファロースカラムに適用した。非特異的に
結合した蛋白質を0.5M NaClに変性された上記
の緩衝液によって溶出した。次に、0.35M CaC
l2 を含有する上記の緩衝液を用いて、ファクターVII
I C活性を安定化する10%グリセリンを添加して、フ
ァクターVIII Cを溶出した。イムノソルベントカラム
からの活性画分をプールし、緩衝液(0.02Mイミダ
ゾール、0.15M NaCl、0.1Mリジン−HC
l、0.025M CaCl2 、0.02%NaN3 、
10%グリセリン、pH7.4)に対して透析した。
III :R−セファロースカラムに適用した。非特異的に
結合した蛋白質を0.5M NaClに変性された上記
の緩衝液によって溶出した。次に、0.35M CaC
l2 を含有する上記の緩衝液を用いて、ファクターVII
I C活性を安定化する10%グリセリンを添加して、フ
ァクターVIII Cを溶出した。イムノソルベントカラム
からの活性画分をプールし、緩衝液(0.02Mイミダ
ゾール、0.15M NaCl、0.1Mリジン−HC
l、0.025M CaCl2 、0.02%NaN3 、
10%グリセリン、pH7.4)に対して透析した。
【0057】1,100ユニットのファクターVIII C
を含有する透析された画分のアリコートを、上記の透析
緩衝液で平衡化されたアミノヘキシル−セファロース4
Bカラム(1×6cm)に適用した。ファクターVIII C
を0.35M CaCl2 又は2M NaClを含有す
る同じ緩衝液で溶出した。500ユニット/mlのファク
ターVIII Cを含有する2mlの容積中に活性が存在する
ことが見出された。同様にして行った後続の実験によ
り、抗VIII :Rカラムにおける25%引きの収量及び
アミノヘキシルカラムにおける約90%引きの収量が得
られた。
を含有する透析された画分のアリコートを、上記の透析
緩衝液で平衡化されたアミノヘキシル−セファロース4
Bカラム(1×6cm)に適用した。ファクターVIII C
を0.35M CaCl2 又は2M NaClを含有す
る同じ緩衝液で溶出した。500ユニット/mlのファク
ターVIII Cを含有する2mlの容積中に活性が存在する
ことが見出された。同様にして行った後続の実験によ
り、抗VIII :Rカラムにおける25%引きの収量及び
アミノヘキシルカラムにおける約90%引きの収量が得
られた。
【0058】上記の方法に代えて、イムノソルベントカ
ラムから溶出され、プールされ、透析された物質をま
ず、上記の透析緩衝溶液で平衡化されたデキストランサ
ルフェート(ファルマシア)カラムに適用し、そして同
じ緩衝液により溶出する。若干の微量汚染物、例えばフ
ィブリノーゲン、フィブロネクチン、IgGはカラム上
に保持され、ファクターVIII Cは流過液中に現われ
る。この液を集め、そして前記のアミノヘキシル−セフ
ァロースカラムに負荷する。
ラムから溶出され、プールされ、透析された物質をま
ず、上記の透析緩衝溶液で平衡化されたデキストランサ
ルフェート(ファルマシア)カラムに適用し、そして同
じ緩衝液により溶出する。若干の微量汚染物、例えばフ
ィブリノーゲン、フィブロネクチン、IgGはカラム上
に保持され、ファクターVIII Cは流過液中に現われ
る。この液を集め、そして前記のアミノヘキシル−セフ
ァロースカラムに負荷する。
【0059】後続の測定により、精製されたファクター
VIII C中に両生物学的活性、すなわち凝固活性及び抗
原(cAg)活性が存在し、HEMOFIL中の40倍
濃縮よりさらに5,000倍濃縮されていることが示さ
れた。ゼネラル・ジアグノスティクス(General Diagno
stics)製の市販の標準的3成分キット〔APTT、ファ
クターVIII 欠損血漿、ベリファイ・ノーマル・シトレ
ート(Verify NarmalCitrate)〕を用いて凝固測定を行
った。ファクターVIII Cの高レベルの生物学的活性が
示された。
VIII C中に両生物学的活性、すなわち凝固活性及び抗
原(cAg)活性が存在し、HEMOFIL中の40倍
濃縮よりさらに5,000倍濃縮されていることが示さ
れた。ゼネラル・ジアグノスティクス(General Diagno
stics)製の市販の標準的3成分キット〔APTT、ファ
クターVIII 欠損血漿、ベリファイ・ノーマル・シトレ
ート(Verify NarmalCitrate)〕を用いて凝固測定を行
った。ファクターVIII Cの高レベルの生物学的活性が
示された。
【0060】使用する抗体は阻害患者から得た。コート
抗体(ab)としての低力価(LZ)を有するものと、
ラベルされるabとしての高力価を有するものである。
2つの異るタイプの測定において抗体を使用した。RI
A測定においてはHZabをI125 でラベルし、ELI
SA測定においてはHZabをホースラディッシュ・パ
ーオキシダーゼ(HRP)と接合せしめる。RIAのた
めの 125Iによる抗体HZのラベル化はHunter W.M., R
adioimmunoassay, Weir D.M 編、Hand book ofExperime
ntal Immunology、第3版、Vol 1, Blackwell Scientif
ic Publications, オックスフォード、1978に従っ
て行った。
抗体(ab)としての低力価(LZ)を有するものと、
ラベルされるabとしての高力価を有するものである。
2つの異るタイプの測定において抗体を使用した。RI
A測定においてはHZabをI125 でラベルし、ELI
SA測定においてはHZabをホースラディッシュ・パ
ーオキシダーゼ(HRP)と接合せしめる。RIAのた
めの 125Iによる抗体HZのラベル化はHunter W.M., R
adioimmunoassay, Weir D.M 編、Hand book ofExperime
ntal Immunology、第3版、Vol 1, Blackwell Scientif
ic Publications, オックスフォード、1978に従っ
て行った。
【0061】HRP−HZ接合はWilson及びNakane, Im
munofluorescense and Related Staining Techniques,
Knopp 等編、Elsevier, North-Holland Biomedical Pre
ss、アムステルダム、1978,215−224頁に従
って行った。LZは700Bethesdaユニット/mlの活性
を有し、HZは1,500Bethesdaユニット/mlの活性
を有していた。コート抗体(LZ)は、0.1M Na
HCO3(pH9.8)中(RIA)又は0.05Mイミダ
ゾール、0.1M NaCl、0.01Mチメロサー
ル、0.05%トウィーン20、5%BSA中(ELI
SA)、あるいは両方法のためにPBS−CMF(1l
につき、200mg KCl、200mg KH2 PO4 、
8.0g NaCl、1.15g無水Ha2 HPO4 、
pH7.4)中に3.5μg/mlに溶解し、そして1mlを
各チューブ(ポリスチレン)に加え、そして室温にて一
夜インキュベートした。
munofluorescense and Related Staining Techniques,
Knopp 等編、Elsevier, North-Holland Biomedical Pre
ss、アムステルダム、1978,215−224頁に従
って行った。LZは700Bethesdaユニット/mlの活性
を有し、HZは1,500Bethesdaユニット/mlの活性
を有していた。コート抗体(LZ)は、0.1M Na
HCO3(pH9.8)中(RIA)又は0.05Mイミダ
ゾール、0.1M NaCl、0.01Mチメロサー
ル、0.05%トウィーン20、5%BSA中(ELI
SA)、あるいは両方法のためにPBS−CMF(1l
につき、200mg KCl、200mg KH2 PO4 、
8.0g NaCl、1.15g無水Ha2 HPO4 、
pH7.4)中に3.5μg/mlに溶解し、そして1mlを
各チューブ(ポリスチレン)に加え、そして室温にて一
夜インキュベートした。
【0062】この溶液を吸引除去し、そしてチューブを
0.05%のトウィーン20を含有する0.15M N
aCl又はPBS−CMF3〜3.5mlで3回洗浄し
た。サンプル又は標準(ゼネラル・ディアグノスティク
ス、ベリファイ・ノーマル・シトレート、カタログ#3
4112)を稀釈し、そして全容量がチューブ当り0.
9mlとなるようにチューブに加え、そして室温にて一夜
インキュベートする〔稀釈は、0.02M Tris、
0.15M NaCl、5%BSA、0.05%トウィ
ーン20、0.01%チメロサール、pH6.5(RIA
のため)中に;又は0.05Mイミダゾール、0.1M
NaCl、0.01%チメロサール、0.05%トウ
ィーン20、5%BSA(ELISAのため)中に;あ
るいはPBS−CMF(両方法のため)中に行った〕。
0.05%のトウィーン20を含有する0.15M N
aCl又はPBS−CMF3〜3.5mlで3回洗浄し
た。サンプル又は標準(ゼネラル・ディアグノスティク
ス、ベリファイ・ノーマル・シトレート、カタログ#3
4112)を稀釈し、そして全容量がチューブ当り0.
9mlとなるようにチューブに加え、そして室温にて一夜
インキュベートする〔稀釈は、0.02M Tris、
0.15M NaCl、5%BSA、0.05%トウィ
ーン20、0.01%チメロサール、pH6.5(RIA
のため)中に;又は0.05Mイミダゾール、0.1M
NaCl、0.01%チメロサール、0.05%トウ
ィーン20、5%BSA(ELISAのため)中に;あ
るいはPBS−CMF(両方法のため)中に行った〕。
【0063】溶液を吸引除去し、そしてチューブを上記
のようにして洗浄した。RIAについては、600μl
のRIA稀釈緩衝液中ファクターVIII Cに対する 125
I−ラベル抗体(HZ)5×105 cpm を各チューブに
加え、このチューブを37℃にて16〜18時間インキ
ュベートし、溶液を除去し、チューブを上記のようにし
て洗浄し、そしてガンマ−カウンターにより計数した。
のようにして洗浄した。RIAについては、600μl
のRIA稀釈緩衝液中ファクターVIII Cに対する 125
I−ラベル抗体(HZ)5×105 cpm を各チューブに
加え、このチューブを37℃にて16〜18時間インキ
ュベートし、溶液を除去し、チューブを上記のようにし
て洗浄し、そしてガンマ−カウンターにより計数した。
【0064】ELISAについては、抗−ファクターV
III C(HZ)に接合したパーオキシダーゼ0.9mlを
各チューブに加え、次にこれを室温にて一夜インキュベ
ートし、溶液を除去し、そしてチューブを前記のように
して洗浄し、次に0.9mlのOPD溶液(100mlにつ
いて、0.37gクエン酸、1.19g燐酸二ナトリウ
ム、0.15go−フェニレンジアミン、pH5.0、使
用直前に10%H2 O 2 を250μl添加)を加え、そ
して暗中、室温にて30分間インキュベートした。この
反応を停止するために0.5mlの6N HCl(又は
0.9mlの1MH2 SO4 )を各チューブに加え、そし
てOD492 を読み取った。
III C(HZ)に接合したパーオキシダーゼ0.9mlを
各チューブに加え、次にこれを室温にて一夜インキュベ
ートし、溶液を除去し、そしてチューブを前記のように
して洗浄し、次に0.9mlのOPD溶液(100mlにつ
いて、0.37gクエン酸、1.19g燐酸二ナトリウ
ム、0.15go−フェニレンジアミン、pH5.0、使
用直前に10%H2 O 2 を250μl添加)を加え、そ
して暗中、室温にて30分間インキュベートした。この
反応を停止するために0.5mlの6N HCl(又は
0.9mlの1MH2 SO4 )を各チューブに加え、そし
てOD492 を読み取った。
【0065】II.ファクターVIII C複合体の構造 A.免疫沈澱実験 次の条件:0.1%インシュリン(安定化のためのキャ
リヤー蛋白質として)、0.25M CaCl2 、0.
01%チオメロサール、0.05Mイミダゾール、pH
7.2のもとで、精製されたファクターVIII C物質に
ついてAcA 44カラムを用いてゲル濾過実験を行っ
た。溶出液のファクターVIII C凝固活性及び抗原活性
を監視した。2つの抗原ピークが観察された。ファクタ
ーVIII C凝固活性を有するものはこれらの条件下で約
460,000の見かけ分子量を有する複合体として挙
動した(天然物)。他のピーク(凝固活性を喪失してい
る)は67,000よりわずかに低い観察された分子量
において溶出した。
リヤー蛋白質として)、0.25M CaCl2 、0.
01%チオメロサール、0.05Mイミダゾール、pH
7.2のもとで、精製されたファクターVIII C物質に
ついてAcA 44カラムを用いてゲル濾過実験を行っ
た。溶出液のファクターVIII C凝固活性及び抗原活性
を監視した。2つの抗原ピークが観察された。ファクタ
ーVIII C凝固活性を有するものはこれらの条件下で約
460,000の見かけ分子量を有する複合体として挙
動した(天然物)。他のピーク(凝固活性を喪失してい
る)は67,000よりわずかに低い観察された分子量
において溶出した。
【0066】標準的分析用 Laemmli SDS−ゲル電気泳動
〔Lesmmli,Nature(1970)227 :680-685 〕により分析
した場合、240,160,140,115,92.
5,80及び77kdの種々の蛋白質種が得られた。これ
らの蛋白質とファクターVIIICとの関係を標準的免疫
沈澱法により決定した。この免疫沈澱法においては、遊
離の 125I−ラベルファクターVIII Cから抗原−Ab
複合体を分離するために、アフィニティー精製された第
2抗体(ヤギ抗−マウスIgG又は抗−ヒトIgG)を
コートしたポリスチレンビーズ〔1/8インチ、プレシ
ジョン・プラスチック・ボール社(Precision Plastic
Ball Co.)〕又はS.アウレウス(S.aureus) 蛋白質A
−セファロースCL4Bを使用した。
〔Lesmmli,Nature(1970)227 :680-685 〕により分析
した場合、240,160,140,115,92.
5,80及び77kdの種々の蛋白質種が得られた。これ
らの蛋白質とファクターVIIICとの関係を標準的免疫
沈澱法により決定した。この免疫沈澱法においては、遊
離の 125I−ラベルファクターVIII Cから抗原−Ab
複合体を分離するために、アフィニティー精製された第
2抗体(ヤギ抗−マウスIgG又は抗−ヒトIgG)を
コートしたポリスチレンビーズ〔1/8インチ、プレシ
ジョン・プラスチック・ボール社(Precision Plastic
Ball Co.)〕又はS.アウレウス(S.aureus) 蛋白質A
−セファロースCL4Bを使用した。
【0067】アフィニティーカラムから溶出した蛋白質
をヨウ素化し、そしてファクターVIII Cに特異的な抗
体と反応せしめた。これらの抗体は血友病患者から単離
されたヒト阻害抗体であり、抗−ファクターVIII C
(Z)及び(E)、又は阻害抗体(Z)及び(E)と称
される。
をヨウ素化し、そしてファクターVIII Cに特異的な抗
体と反応せしめた。これらの抗体は血友病患者から単離
されたヒト阻害抗体であり、抗−ファクターVIII C
(Z)及び(E)、又は阻害抗体(Z)及び(E)と称
される。
【0068】この結果は、両抗体が77/80kdダブレ
ットと反応することを示す。“E”抗体はさらに240
kdバンド強く反応し、そしてダブレットと240kd種と
の間の複数のバンド(160,140,115,92.
5kd)の弱い沈澱をもたらす。“Z”抗体はまた92.
5kd及び240kd蛋白質を沈澱せしめる。“E”抗体と
240kd種との強い反応は、この種がファクターVIII
Cの前駆体であることを示唆する。
ットと反応することを示す。“E”抗体はさらに240
kdバンド強く反応し、そしてダブレットと240kd種と
の間の複数のバンド(160,140,115,92.
5kd)の弱い沈澱をもたらす。“Z”抗体はまた92.
5kd及び240kd蛋白質を沈澱せしめる。“E”抗体と
240kd種との強い反応は、この種がファクターVIII
Cの前駆体であることを示唆する。
【0069】抗体カラムで精製したファクターVIII C
画分をヨウ素化し、そしてEGTA〔エチレングリコー
ルビス(β−アミノエチルエーテル)N,N,N′,
N′,−四酢酸〕の存在下及び非存在下でヒト阻害抗体
と反応せしめた。これは、ファクターVIII Cポリペプ
チドの会合における2価陽イオン、特にCa++の役割の
研究を可能にする。阻害抗体(E)は77/80kdダブ
レット、並びに160,140,115及び92.5kd
の一層分子量の高い種を沈澱せしめることが観察され
た。
画分をヨウ素化し、そしてEGTA〔エチレングリコー
ルビス(β−アミノエチルエーテル)N,N,N′,
N′,−四酢酸〕の存在下及び非存在下でヒト阻害抗体
と反応せしめた。これは、ファクターVIII Cポリペプ
チドの会合における2価陽イオン、特にCa++の役割の
研究を可能にする。阻害抗体(E)は77/80kdダブ
レット、並びに160,140,115及び92.5kd
の一層分子量の高い種を沈澱せしめることが観察され
た。
【0070】ダブレットは常に一層強いバンドの間に存
在する。(この免疫沈澱実験はポリスチレンビーズを用
いて行った。この方法は低いバックグラウンドをもたら
し、ファクターVIII C標品中のラベルされたIgGは
沈澱しない。)EGTAを含有させることにより高分子
量のバンド(92.5〜160kd)は消失するが、ダブ
レットの沈澱量は影響を受けない。イムノソルベントと
してセファロースに結合したZ抗体を使用して同様の実
験を行った。
在する。(この免疫沈澱実験はポリスチレンビーズを用
いて行った。この方法は低いバックグラウンドをもたら
し、ファクターVIII C標品中のラベルされたIgGは
沈澱しない。)EGTAを含有させることにより高分子
量のバンド(92.5〜160kd)は消失するが、ダブ
レットの沈澱量は影響を受けない。イムノソルベントと
してセファロースに結合したZ抗体を使用して同様の実
験を行った。
【0071】精製したファクターVIII Cをカラムに適
用し、そして77/80kdを介して結合した後、EDT
A(エチレンジアミン四酢酸)により92.5kdポリペ
プチドが選択的に溶出する。この方法は92.5kd種を
分画調製するために使用される。このイムノソルベント
カラム又はこれに類似するものはファクターVIII Cに
対するポリクローナル抗体を用いて調製される。EGT
Aの代りにチャオトロピック溶剤又は変性溶剤、例えば
それぞれチオシアナート溶液又は尿素水溶液を用いて溶
出する場合、ファクターVIII Cはさらに精製される。
用し、そして77/80kdを介して結合した後、EDT
A(エチレンジアミン四酢酸)により92.5kdポリペ
プチドが選択的に溶出する。この方法は92.5kd種を
分画調製するために使用される。このイムノソルベント
カラム又はこれに類似するものはファクターVIII Cに
対するポリクローナル抗体を用いて調製される。EGT
Aの代りにチャオトロピック溶剤又は変性溶剤、例えば
それぞれチオシアナート溶液又は尿素水溶液を用いて溶
出する場合、ファクターVIII Cはさらに精製される。
【0072】これらの結果は92.5kdペプチドがCa
++橋を介して非共有結合的に77/80kdダブレットに
会合していることを示唆する。より分子量の高いバンド
(115kd、140kd、160kd)はおそらく92.5
kdの前駆体であろう。このことは、92.5kdポリペプ
チドに対するモノクローナル抗体の115kd、140kd
及び160kdポリペプチドと交差反応する能力により示
される。
++橋を介して非共有結合的に77/80kdダブレットに
会合していることを示唆する。より分子量の高いバンド
(115kd、140kd、160kd)はおそらく92.5
kdの前駆体であろう。このことは、92.5kdポリペプ
チドに対するモノクローナル抗体の115kd、140kd
及び160kdポリペプチドと交差反応する能力により示
される。
【0073】アフィニティーカラムからの種々の蛋白質
種の関係を、G.Kohler及びC.Milstein〔Eur.J.of Immun
ol. (1975)6:511 〕の方法によって調製したモノクロ
ーナル抗体による、ヨウ素化され、精製されたファクタ
ーVIII Cの免疫沈澱により示した。Balb/c マウスを
液相免疫吸着されたファクターVIII Cにより免疫し
た。脾臓細胞(108 個)を1011個のNSO又はNS
Iマウス骨髄腫細胞と融合させた。
種の関係を、G.Kohler及びC.Milstein〔Eur.J.of Immun
ol. (1975)6:511 〕の方法によって調製したモノクロ
ーナル抗体による、ヨウ素化され、精製されたファクタ
ーVIII Cの免疫沈澱により示した。Balb/c マウスを
液相免疫吸着されたファクターVIII Cにより免疫し
た。脾臓細胞(108 個)を1011個のNSO又はNS
Iマウス骨髄腫細胞と融合させた。
【0074】融合生成物を2枚の96ウエルミクロタイ
タートレイにプレートした。脾臓細胞フィーダー層を1
04 細胞/ウエルで使用した。コロニーは5日目から顕
微鏡観察でき、そして上清液は数日毎にELISA法に
より測定した。次の層を使用した。第1層:前記Iにお
ける、ヘキシル−セファロース4Bカラムから溶出した
ファクターVIII C;第2層:ハイブリドーマ細胞上清
液;第3層:ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ
(HRP)−ラベルしたヤギ抗−マウスIgG;第4
層:HRP−基質。
タートレイにプレートした。脾臓細胞フィーダー層を1
04 細胞/ウエルで使用した。コロニーは5日目から顕
微鏡観察でき、そして上清液は数日毎にELISA法に
より測定した。次の層を使用した。第1層:前記Iにお
ける、ヘキシル−セファロース4Bカラムから溶出した
ファクターVIII C;第2層:ハイブリドーマ細胞上清
液;第3層:ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ
(HRP)−ラベルしたヤギ抗−マウスIgG;第4
層:HRP−基質。
【0075】モノクローナル抗体の幾つかのクラスが同
定され、その2つはファクターVIII C凝固活性を阻害
した。クラスI抗体は80/77kdダブレット及び24
0kdポリペプチドと反応し;そしてクラスII抗体は24
0,160,140,115,92.5kdの蛋白質と反
応した。スロンビン消化したファクターVIII とクラス
Iモノクローナル抗体との免疫沈澱は、生成した70/
67kdダブレットが77/80kdダブレットに由来する
ことを示す(下記参照のこと。)クラスIII モノクロー
ナル抗体は、160,140及び115kdペプチドが9
2.5kdペプチドの前駆体であることを示す。クラスII
I のモノクローナル抗体はさらに、精製されたファクタ
ーVIII C物質のスロンビン消化により生成した40kd
ペプチドとも反応する。
定され、その2つはファクターVIII C凝固活性を阻害
した。クラスI抗体は80/77kdダブレット及び24
0kdポリペプチドと反応し;そしてクラスII抗体は24
0,160,140,115,92.5kdの蛋白質と反
応した。スロンビン消化したファクターVIII とクラス
Iモノクローナル抗体との免疫沈澱は、生成した70/
67kdダブレットが77/80kdダブレットに由来する
ことを示す(下記参照のこと。)クラスIII モノクロー
ナル抗体は、160,140及び115kdペプチドが9
2.5kdペプチドの前駆体であることを示す。クラスII
I のモノクローナル抗体はさらに、精製されたファクタ
ーVIII C物質のスロンビン消化により生成した40kd
ペプチドとも反応する。
【0076】ファクターVIII C複合体中のCa++イオ
ンの役割を研究するため、EGTAを用いて上記と同様
の実験を行った。この実験はモノクローナル抗体を用い
て、次の層によるELISA法に基いて行った。第1
層:単一特異性抗(マウスIgG);第2層:クラスII
I モノクローナル抗体(抗−92.5kd);第3層:精
製ファクターVIII C物質;第4層:77/80kdに対
するHRP−ヒト阻害抗体。EGTAの添加により、キ
レート剤を用いない対照に存在する結合HRP活性が除
去された。
ンの役割を研究するため、EGTAを用いて上記と同様
の実験を行った。この実験はモノクローナル抗体を用い
て、次の層によるELISA法に基いて行った。第1
層:単一特異性抗(マウスIgG);第2層:クラスII
I モノクローナル抗体(抗−92.5kd);第3層:精
製ファクターVIII C物質;第4層:77/80kdに対
するHRP−ヒト阻害抗体。EGTAの添加により、キ
レート剤を用いない対照に存在する結合HRP活性が除
去された。
【0077】それぞれ77/80kdダブレット及び9
2.5kd蛋白質に向けられたクラスI及びクラスIII の
モノクローナル抗体がそれぞれファクターVIII C凝固
活性に対して阻害的である事実は、両者がファクターV
III C複合体の本質的構成成分であることを示唆してい
る。
2.5kd蛋白質に向けられたクラスI及びクラスIII の
モノクローナル抗体がそれぞれファクターVIII C凝固
活性に対して阻害的である事実は、両者がファクターV
III C複合体の本質的構成成分であることを示唆してい
る。
【0078】B.ファクターVIII Cのスロンビンによ
る活性化 アミノヘキシル濃縮し、アフィニティー精製したファク
ターVIII Cを、2種類の異るpH条件(6.8及び7.
4)を用いて、スロンビン〔ベーリンガー(Boehringe
r) 、ロット#1072302〕により活性化した。ア
リコートを凝固活性について測定し、そしてさらに、サ
ンプル(それぞれ約2.5ユニット)をゲル分析のため
にTCA沈澱せしめた。
る活性化 アミノヘキシル濃縮し、アフィニティー精製したファク
ターVIII Cを、2種類の異るpH条件(6.8及び7.
4)を用いて、スロンビン〔ベーリンガー(Boehringe
r) 、ロット#1072302〕により活性化した。ア
リコートを凝固活性について測定し、そしてさらに、サ
ンプル(それぞれ約2.5ユニット)をゲル分析のため
にTCA沈澱せしめた。
【0079】第1の実験において、VIII C活性は最初
46ユニット/mlであった。これを、ファクターVIII
C緩衝液(20mMイミダゾール、pH6.8、150mM
NaCl、100mMリジン、25mM CaCl2 及び1
0%グリセリン)中に最終濃度11.5ユニット/mlに
稀釈した。スロンビンの最終濃度を0.12ユニット/
ml(VIII Cの100凝固ユニット当り約1ユニットの
スロンビン)とした。この結果、凝固活性は約180ユ
ニット/mlに上昇しそして約40ユニット/ml(実質上
出発値)に低下し、これは92.5kd種の量の同様な増
加及び減少に伴って生じた。従って、92.5kd種は活
性なファクターVIII C複合体の部分であることが示唆
される。
46ユニット/mlであった。これを、ファクターVIII
C緩衝液(20mMイミダゾール、pH6.8、150mM
NaCl、100mMリジン、25mM CaCl2 及び1
0%グリセリン)中に最終濃度11.5ユニット/mlに
稀釈した。スロンビンの最終濃度を0.12ユニット/
ml(VIII Cの100凝固ユニット当り約1ユニットの
スロンビン)とした。この結果、凝固活性は約180ユ
ニット/mlに上昇しそして約40ユニット/ml(実質上
出発値)に低下し、これは92.5kd種の量の同様な増
加及び減少に伴って生じた。従って、92.5kd種は活
性なファクターVIII C複合体の部分であることが示唆
される。
【0080】製造的方法においてスロンビン活性化を用
いる目的で、一層濃縮されたファクターVIII C標品を
用いて追加の実験を行った。92.5kdポリペプチドを
生成せしめるため、1ユニットのスロンビン活性に対し
て約1000〜2000凝固ユニットのファクターVII
I Cの比率で、スロンビンを精製ファクターVIII C物
質に加え、そして短時間(FEMOFILサンプルに依
存して5〜15分間)のみ反応せしめた。次に、得られ
た生成物を7.5%調製用ゲルに適用し、そしてペプチ
ドを電気泳動により分離し、ゲルバンドを切り出し、そ
して電気溶出した。
いる目的で、一層濃縮されたファクターVIII C標品を
用いて追加の実験を行った。92.5kdポリペプチドを
生成せしめるため、1ユニットのスロンビン活性に対し
て約1000〜2000凝固ユニットのファクターVII
I Cの比率で、スロンビンを精製ファクターVIII C物
質に加え、そして短時間(FEMOFILサンプルに依
存して5〜15分間)のみ反応せしめた。次に、得られ
た生成物を7.5%調製用ゲルに適用し、そしてペプチ
ドを電気泳動により分離し、ゲルバンドを切り出し、そ
して電気溶出した。
【0081】スロンビン消化を短時間行う場合、92.
5kd種の量は2倍又は3倍になり、同時に、77/80
kdダブレットは部分的にのみ67/70kd種に転換され
る。67/70kdダブレットを単離するための条件を最
適にするためには、より長時間(1時間以上)のスロン
ビン消化を行う。この場合、92.5kd種は、さらに切
断されてさらに小さい断片が生ずる。スロンビン処理の
後、2種類の新たなペプチドである52.5kd及び40
kdペプチドが生ずる。
5kd種の量は2倍又は3倍になり、同時に、77/80
kdダブレットは部分的にのみ67/70kd種に転換され
る。67/70kdダブレットを単離するための条件を最
適にするためには、より長時間(1時間以上)のスロン
ビン消化を行う。この場合、92.5kd種は、さらに切
断されてさらに小さい断片が生ずる。スロンビン処理の
後、2種類の新たなペプチドである52.5kd及び40
kdペプチドが生ずる。
【0082】40kdペプチドは92.5kd種に対するモ
ノクローナル抗体と反応し、従って切断生成物でなけれ
ばならない。52.5kdペプチドも92.5kd蛋白質に
由来し、このことは、化学的及び酵素的切断パターンの
比較により、すなわち92.5kd種及び52.5kd種を
CNBr又はエンドプロテイナーゼLysC切断にかけ
た場合に多数の共通の断片が生ずる(SDS−PAGE
による)ことにより証明される。
ノクローナル抗体と反応し、従って切断生成物でなけれ
ばならない。52.5kdペプチドも92.5kd蛋白質に
由来し、このことは、化学的及び酵素的切断パターンの
比較により、すなわち92.5kd種及び52.5kd種を
CNBr又はエンドプロテイナーゼLysC切断にかけ
た場合に多数の共通の断片が生ずる(SDS−PAGE
による)ことにより証明される。
【0083】エンドプロテイナーゼlysC消化のた
め、lysCと蛋白質との比率を約1:1〜100、通
常は1:10とする。この消化において、20pモル
(4.8μg)のlysCを、約100μlの0.02
5M Tris−HCl、pH7.7、0.001M E
DTA、0.08%SDS中で200pモル(14μ
g)の70kdポリペプチドと混合し、そして混合物を3
7℃にて6時間〜一夜インキュベートして消化を完結し
た。lysC消化生成物の単離のために、Orsten, Ann.
N.Y.Acad.Sci. (1964) 121:321-349 のネイティブ・ポ
リアクリルアミドゲルを使用した。
め、lysCと蛋白質との比率を約1:1〜100、通
常は1:10とする。この消化において、20pモル
(4.8μg)のlysCを、約100μlの0.02
5M Tris−HCl、pH7.7、0.001M E
DTA、0.08%SDS中で200pモル(14μ
g)の70kdポリペプチドと混合し、そして混合物を3
7℃にて6時間〜一夜インキュベートして消化を完結し
た。lysC消化生成物の単離のために、Orsten, Ann.
N.Y.Acad.Sci. (1964) 121:321-349 のネイティブ・ポ
リアクリルアミドゲルを使用した。
【0084】C.ゲル単離したVIII C関連蛋白質のス
ロンビン消化 これらのペプチドの前駆体−生成物関係を確認するた
め、精製用SDSゲル電気泳動により多数のバンドを分
離し、電気溶出し、そしてスロンビン消化にかけた。結
果は次の通りであった。
ロンビン消化 これらのペプチドの前駆体−生成物関係を確認するた
め、精製用SDSゲル電気泳動により多数のバンドを分
離し、電気溶出し、そしてスロンビン消化にかけた。結
果は次の通りであった。
【0085】1.240kd蛋白質は160,140,1
15,92.5kdを含む多数のバンドを生成するが、一
層小分子量のバンド、すなわち77/80kd又は67/
70kdダブレットを生成しない。さらに、240kd断片
を経時消化し、そしてゲル電気泳動パターン、凝固活
性、及びファクターVIII C抗原(Cag)活性につい
て分析した。ゲルパターンの結果は上記と同様であり、
そしてCag活性又は凝固活性は実質上回収されなかっ
た。
15,92.5kdを含む多数のバンドを生成するが、一
層小分子量のバンド、すなわち77/80kd又は67/
70kdダブレットを生成しない。さらに、240kd断片
を経時消化し、そしてゲル電気泳動パターン、凝固活
性、及びファクターVIII C抗原(Cag)活性につい
て分析した。ゲルパターンの結果は上記と同様であり、
そしてCag活性又は凝固活性は実質上回収されなかっ
た。
【0086】2.160kd及び92.5kdゲル分離ポリ
ペプチドは、ゲルから分離した後スロンビンの基質では
ないようである。 3.スロンビンはゲル分離された77kd及び80kd種
を、それぞれ67kd及び70kdの新たなポリペプチドに
特異的に切断する。スロンビン処理の後、クラスIのモ
ノクローナル抗体は77/80kdダブレットのみならず
新たな67及び70kd種も沈澱せしめる。
ペプチドは、ゲルから分離した後スロンビンの基質では
ないようである。 3.スロンビンはゲル分離された77kd及び80kd種
を、それぞれ67kd及び70kdの新たなポリペプチドに
特異的に切断する。スロンビン処理の後、クラスIのモ
ノクローナル抗体は77/80kdダブレットのみならず
新たな67及び70kd種も沈澱せしめる。
【0087】D.アミノ酸配列分析 調製用SDS電気泳動により単離された67/70kdペ
プチド、77/80kdペプチド、及び52.5kdペプチ
ドについて、標準的方法により部分的アミノ酸配列情報
を得た。電気泳動分析は、アミノ酸配列の結果と相まっ
て、77/80kd、67/70kd、92.5kd及び5
2.5kdポリペプチドが95%以上、通常は98%の純
度で得られたことを示した。
プチド、77/80kdペプチド、及び52.5kdペプチ
ドについて、標準的方法により部分的アミノ酸配列情報
を得た。電気泳動分析は、アミノ酸配列の結果と相まっ
て、77/80kd、67/70kd、92.5kd及び5
2.5kdポリペプチドが95%以上、通常は98%の純
度で得られたことを示した。
【0088】ゲル単離されたペプチドを気相蛋白質シー
ケンサー〔アプライド・ビオシステムス(Applied Bios
ystems)〕に適用した。PTH−アミノ酸をHPLCカ
ラム(IBMシアノ、25cm)に適用し、そして得られ
たクロマトグラムからアミノ酸配列を決定した。67/
70kdダブレットのアミノ端(配列表B中棒により示
す)について次の配列が決定された。
ケンサー〔アプライド・ビオシステムス(Applied Bios
ystems)〕に適用した。PTH−アミノ酸をHPLCカ
ラム(IBMシアノ、25cm)に適用し、そして得られ
たクロマトグラムからアミノ酸配列を決定した。67/
70kdダブレットのアミノ端(配列表B中棒により示
す)について次の配列が決定された。
【0089】
【化8】
【0090】67/70kd蛋白質のN−端領域のアミノ
酸配列により得られた情報を用いて、ヒト−ゲノムライ
ブラリーのスクリーニングに使用するために次のオリゴ
ヌクレオチドプローブを合成した。 M.S.Urdea等、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:7461-7465 に記載さ
れているホスホラミデート法を使用した。
酸配列により得られた情報を用いて、ヒト−ゲノムライ
ブラリーのスクリーニングに使用するために次のオリゴ
ヌクレオチドプローブを合成した。 M.S.Urdea等、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:7461-7465 に記載さ
れているホスホラミデート法を使用した。
【化9】
【0091】次に、各プローブが導びかれたアミノ酸配
列の領域のスキームを示す。
列の領域のスキームを示す。
【化10】
【0092】後記のように92.5kd蛋白質に由来する
52.5kd蛋白質について、N−端の下記のアミノ酸配
列が決定された。
52.5kd蛋白質について、N−端の下記のアミノ酸配
列が決定された。
【化11】
【0093】52.5kdペプチドのアミノ酸配列に基い
て、次のヌクレオチド配列(コード配列)を有する部分
変性プローブを合成した。
て、次のヌクレオチド配列(コード配列)を有する部分
変性プローブを合成した。
【化12】
【0094】このプローブは、ゲノムライブラリー及び
cDNAライブラリーの両者をスクリーニングするため
に有用である。77/80kdダブレットをエンドプロテ
イナーゼLysC(ベーリンガーマンハイム)によって
消化することにより得られた2種類のペプチドのアミノ
酸配列を決定した。
cDNAライブラリーの両者をスクリーニングするため
に有用である。77/80kdダブレットをエンドプロテ
イナーゼLysC(ベーリンガーマンハイム)によって
消化することにより得られた2種類のペプチドのアミノ
酸配列を決定した。
【0095】次のようにして消化を行った。77/80
kdダブレットをアクリルアミド蛋白質ゲル上で電気泳動
し、そしてダブレットに対応するバンドを電気溶出し
た。分離された物質を精製し、エンドプロテイナーゼL
ysCにより消化し、そして生成したペプチドを逆相H
PLCにより分離した。280nmでの吸光ピークに対応
する画分を、自動シーケンサー(アプライド・ビオシス
テムス,フォスターシティー,カリホルニア,モデルA
70A)を用いて配列決定した。第1配列は次の通りで
あった。
kdダブレットをアクリルアミド蛋白質ゲル上で電気泳動
し、そしてダブレットに対応するバンドを電気溶出し
た。分離された物質を精製し、エンドプロテイナーゼL
ysCにより消化し、そして生成したペプチドを逆相H
PLCにより分離した。280nmでの吸光ピークに対応
する画分を、自動シーケンサー(アプライド・ビオシス
テムス,フォスターシティー,カリホルニア,モデルA
70A)を用いて配列決定した。第1配列は次の通りで
あった。
【化13】
【0096】このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオ
チド配列(非コード配列)を有する部分変性プローブを
合成した。
チド配列(非コード配列)を有する部分変性プローブを
合成した。
【化14】
【0097】第2ペプチドは次の配列を有していた。
【化15】
【0098】このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオ
チド配列(非コード配列)を有する部分変性プローブを
合成した。
チド配列(非コード配列)を有する部分変性プローブを
合成した。
【化16】
【0099】さらに、77/80kdダブレットをトリプ
シンにより消化した。ダブレット物質を、エンドプロテ
イナーゼLysCによる消化について上記したのと同様
にして精製し、リジンをシトラコニル化(citraconylat
ion)によりブロックしてアルギニンにおいてのみ消化さ
れるようにした。
シンにより消化した。ダブレット物質を、エンドプロテ
イナーゼLysCによる消化について上記したのと同様
にして精製し、リジンをシトラコニル化(citraconylat
ion)によりブロックしてアルギニンにおいてのみ消化さ
れるようにした。
【0100】シトラコニル化は、蛋白質を変性緩衝液に
懸濁し、懸濁された蛋白質を還元しそしてカルボキシメ
チル化し、そしてpHを8.5〜9.0に保持しながら無
水シトラコン酸で処理した。シトラコニル化した後、蛋
白質をトリプシンで消化し、そして生成したペプチドを
逆相HPLCにより分離した。280nmにおける吸光ピ
ークに対応する画分を上記のようにして配列決定した。
配列を次に示す。
懸濁し、懸濁された蛋白質を還元しそしてカルボキシメ
チル化し、そしてpHを8.5〜9.0に保持しながら無
水シトラコン酸で処理した。シトラコニル化した後、蛋
白質をトリプシンで消化し、そして生成したペプチドを
逆相HPLCにより分離した。280nmにおける吸光ピ
ークに対応する画分を上記のようにして配列決定した。
配列を次に示す。
【化17】
【0101】このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオ
チド配列(非コード配列)を有する部分変性プローブを
合成した。
チド配列(非コード配列)を有する部分変性プローブを
合成した。
【化18】
【0102】80及び77kd種のN−端配列を決定する
ための方法を実施した際、これらのアミノ端がブロック
されていることが見出された。従って、N−端配列は他
の精製法により得られた物質から決定した。この精製法
はイムノアフィニティークロマトグラフィー及びイオン
交換クロマトグラフィーを含み、そして調製用SDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いない。80/7
7kdダブレットの精製を、ファクターVIII C濃縮物を
モノクローナル抗体カラムに適用し、次にmono
ための方法を実施した際、これらのアミノ端がブロック
されていることが見出された。従って、N−端配列は他
の精製法により得られた物質から決定した。この精製法
はイムノアフィニティークロマトグラフィー及びイオン
交換クロマトグラフィーを含み、そして調製用SDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いない。80/7
7kdダブレットの精製を、ファクターVIII C濃縮物を
モノクローナル抗体カラムに適用し、次にmono
【0103】S陽イオン交換体でクロマトグラフ処理す
ることにより行った。この物質はブロックされていない
N−端を有し、ゲル濾過された80/77kd中に検出さ
れるブロックはゲル電気泳動により生ずる人為的なもの
であることが示された。80及び77kd種について決定
されたアミノ端配列は次の通りである(配列表B中棒で
示す)。
ることにより行った。この物質はブロックされていない
N−端を有し、ゲル濾過された80/77kd中に検出さ
れるブロックはゲル電気泳動により生ずる人為的なもの
であることが示された。80及び77kd種について決定
されたアミノ端配列は次の通りである(配列表B中棒で
示す)。
【化19】
【0104】E.アミノ酸組成 77/80kdペプチドのアミノ酸組成を、標準的方法に
より、次のように決定した。
より、次のように決定した。
【0105】
【表1】
【0106】F.ヒト4Xゲノムライブラリーの調製 GM1416細胞(4コピーのX染色体を含有するヒト
−リンパ芽球様セルライン)の細胞培養物の溶解物から
約3mgのDNAを調製した。このDNAを制限酵素Sa
u3Aにより部分消化し、そして消化されたDNA(4
00〜500μg)を10%〜40%シュークロースグ
ラジエント上で画分した。
−リンパ芽球様セルライン)の細胞培養物の溶解物から
約3mgのDNAを調製した。このDNAを制限酵素Sa
u3Aにより部分消化し、そして消化されたDNA(4
00〜500μg)を10%〜40%シュークロースグ
ラジエント上で画分した。
【0107】10〜25kdのサイズの範囲の画分をプー
ルし、Tris−EDTA中で透析し、そしてSchliech
er及びScheull のElutip-d無菌ジスポーサブルカラムで
精製した。このDNAのアリコートをEMBL−4アー
ム(BamHI及びSalIで消化しそしてグラジエン
ト上で単離することにより得られる)に連結し、そして
次に1×106pfu/μgのDNA挿入効率をもってバク
テリオファージλにパッケージした。使用したベクター
EMBL−4はバクテリオファージλの変形物である
〔Karn等、Methods Enzymol.(1983)101 :3-19を参照の
こと〕。全ライブラリーは5×106 個のファージから
成る。
ルし、Tris−EDTA中で透析し、そしてSchliech
er及びScheull のElutip-d無菌ジスポーサブルカラムで
精製した。このDNAのアリコートをEMBL−4アー
ム(BamHI及びSalIで消化しそしてグラジエン
ト上で単離することにより得られる)に連結し、そして
次に1×106pfu/μgのDNA挿入効率をもってバク
テリオファージλにパッケージした。使用したベクター
EMBL−4はバクテリオファージλの変形物である
〔Karn等、Methods Enzymol.(1983)101 :3-19を参照の
こと〕。全ライブラリーは5×106 個のファージから
成る。
【0108】G.ヒト4Xゲノムライブラリーのプレー
ティング及びスクリーニング バクテリオファージをE.コリDP50株に吸着せし
め、そして20枚のプレートにプレート(大きさ150
×15mm)当り50,000pfu としてプレーティング
し、合計1×106pfuとした。(プレート、上層寒天、
及びプレーティングの詳細な技法は、T.Maniatis, E.F.
Fritsch 及びJ.Sambrook;Cold Spring Harbor Lab, ニ
ューヨーク,1982, Molecular Cloning, A Laboratory M
annual中に記載されている。)
ティング及びスクリーニング バクテリオファージをE.コリDP50株に吸着せし
め、そして20枚のプレートにプレート(大きさ150
×15mm)当り50,000pfu としてプレーティング
し、合計1×106pfuとした。(プレート、上層寒天、
及びプレーティングの詳細な技法は、T.Maniatis, E.F.
Fritsch 及びJ.Sambrook;Cold Spring Harbor Lab, ニ
ューヨーク,1982, Molecular Cloning, A Laboratory M
annual中に記載されている。)
【0109】ニトロセルロースフィルターを、ファージ
プラークを有する各プレートの表面に2回適用し(こう
してパッケージされていないDNAの分子をフィルター
に移す)、そして32P−ラベルされた256倍の48マ
ープローブDNA(プローブ#4)とハイブリダイズせ
しめた。(ニトロセルロース移行法の詳細はManiatis
等、前掲、に記載されている。)前−ハイブリダイゼー
ション及びハイブリダイゼーションは Wallaceミックス
(1l中に310mlの蒸留水、200mlの50%デキス
トランサルフェート、180mlの1M Tris−HC
l、pH8.2、225mlの4M NaCl、20mlの
0.25M EDTA、50mlの100×Denhart 溶
液、5mlの100%NP−40、及び10mlの10%S
DSを含む)中で行った。
プラークを有する各プレートの表面に2回適用し(こう
してパッケージされていないDNAの分子をフィルター
に移す)、そして32P−ラベルされた256倍の48マ
ープローブDNA(プローブ#4)とハイブリダイズせ
しめた。(ニトロセルロース移行法の詳細はManiatis
等、前掲、に記載されている。)前−ハイブリダイゼー
ション及びハイブリダイゼーションは Wallaceミックス
(1l中に310mlの蒸留水、200mlの50%デキス
トランサルフェート、180mlの1M Tris−HC
l、pH8.2、225mlの4M NaCl、20mlの
0.25M EDTA、50mlの100×Denhart 溶
液、5mlの100%NP−40、及び10mlの10%S
DSを含む)中で行った。
【0110】プローブを、T4ポリヌクレオチドキナー
ゼを触媒として用いて、γ−ATP 32から各DNA分子
の5′ホスフェート端に32PO4 を酵素的に移行せしめ
ることによりラベルした。ハイブリダイゼーションの条
件は次の通りとした。10mlのハイブリダイゼーション
混合物/フィルター×5000cpm のラベル化プローブ
#4(変性)/ml。ハイブリダイゼーションは37℃に
て一夜行った。フィルターを、6×SSC、1mM ED
TA中、50〜55℃にて洗浄し、空気乾燥し、そして
X線フィルムに暴露した。
ゼを触媒として用いて、γ−ATP 32から各DNA分子
の5′ホスフェート端に32PO4 を酵素的に移行せしめ
ることによりラベルした。ハイブリダイゼーションの条
件は次の通りとした。10mlのハイブリダイゼーション
混合物/フィルター×5000cpm のラベル化プローブ
#4(変性)/ml。ハイブリダイゼーションは37℃に
て一夜行った。フィルターを、6×SSC、1mM ED
TA中、50〜55℃にて洗浄し、空気乾燥し、そして
X線フィルムに暴露した。
【0111】H.陽性クローンの特徴付け 第1回スクリーニングにおいて陽性であった23個のプ
ラークを再プレートし、ファージDNAをニトロセルロ
ースに移し、そして新たにラベルしたプローブ#4とハ
イブリダイズせしめた(第2回)。11個の陽性プラー
クを再プレートし、ファージDNAをニトロセルロース
に移し、そして新たにラベルしたプローブ#4とハイブ
リダイズせしめた(第3回)。8個の陽性プラークを分
離し、そしてDNAを調製した(それぞれ100mlずつ
の液体培養)。
ラークを再プレートし、ファージDNAをニトロセルロ
ースに移し、そして新たにラベルしたプローブ#4とハ
イブリダイズせしめた(第2回)。11個の陽性プラー
クを再プレートし、ファージDNAをニトロセルロース
に移し、そして新たにラベルしたプローブ#4とハイブ
リダイズせしめた(第3回)。8個の陽性プラークを分
離し、そしてDNAを調製した(それぞれ100mlずつ
の液体培養)。
【0112】これら8個のクローンのそれぞれに対応す
るDNAをEcoRIで消化し(挿入されたヒト−ゲノ
ムDNAをラムダベクターDNAから遊離せしめるた
め)、そして生成した断片を0.8%アガロースゲル上
での電気泳動によりサイズに従って分離し、変性し、そ
してニトロセルロースに移した。これを4通り行い、そ
して各フィルターを32P−ラベルプローブ#1,2,3
又は4とハイブリダイズせしめた。フィルターをX線フ
ィルムに暴露し、そして約4.4kdサイズの単一バンド
が4種類のすべてのプローブとハイブリダイズすること
が、2個のクローンについて見出された。
るDNAをEcoRIで消化し(挿入されたヒト−ゲノ
ムDNAをラムダベクターDNAから遊離せしめるた
め)、そして生成した断片を0.8%アガロースゲル上
での電気泳動によりサイズに従って分離し、変性し、そ
してニトロセルロースに移した。これを4通り行い、そ
して各フィルターを32P−ラベルプローブ#1,2,3
又は4とハイブリダイズせしめた。フィルターをX線フ
ィルムに暴露し、そして約4.4kdサイズの単一バンド
が4種類のすべてのプローブとハイブリダイズすること
が、2個のクローンについて見出された。
【0113】これら2個のクローンは、1方が他方に比
べて大きなDNA挿入部を有する点を除き同一であった
(15.21kdの大挿入部を有するクローンを23Dと
称し、約13kdの小挿入部を有するクローンを11と称
する)。4.4kdのゲル単離されたEcoRI断片をベ
クターM13及びpUC−9(pBR322の誘導体)
中にサブクローン化した。プライマーとして合成プロー
ブ#3及びその逆相補体を用いてM13DNA上でジデ
オキシ法によりDNA配列の決定を行った。
べて大きなDNA挿入部を有する点を除き同一であった
(15.21kdの大挿入部を有するクローンを23Dと
称し、約13kdの小挿入部を有するクローンを11と称
する)。4.4kdのゲル単離されたEcoRI断片をベ
クターM13及びpUC−9(pBR322の誘導体)
中にサブクローン化した。プライマーとして合成プロー
ブ#3及びその逆相補体を用いてM13DNA上でジデ
オキシ法によりDNA配列の決定を行った。
【0114】4.4kd断片の部分配列を次のように決定
した。この配列は( )で示すプローブ#4の配列、及
び〔 〕で示すはじめに決定された67/70kd断片の
部分アミノ酸配列を含む。
した。この配列は( )で示すプローブ#4の配列、及
び〔 〕で示すはじめに決定された67/70kd断片の
部分アミノ酸配列を含む。
【0115】
【化20】
【0116】
【化21】
【0117】従って、このクローンは77/80kdダブ
レット蛋白質の遺伝子に対応し、そしてこの蛋白質は前
記のごとくヒト−ファクターVIII C複合体に部分的に
対応する。クローン23DをEcoRI断片としてファ
ージM13中にサブクローン化し、そして挿入されたヒ
トDNAに対応する配列を決定した。
レット蛋白質の遺伝子に対応し、そしてこの蛋白質は前
記のごとくヒト−ファクターVIII C複合体に部分的に
対応する。クローン23DをEcoRI断片としてファ
ージM13中にサブクローン化し、そして挿入されたヒ
トDNAに対応する配列を決定した。
【0118】クローン23Dの完全な15.121kb配
列を第1表(配列表A)(配列番号:1)に示す。サブ
クローンの名称が配列の右側の欄外に示されており、
3′−方向に延びるEcoRI−EcoRIを示してい
る。3.110kbのオープンリーディングフレームが7
0−3断片の3′−末端から4.4kb断片の中間にわた
って存在することが見出された。従って、このオープン
リーディングフレームは77/80kbダブレット蛋白質
のコード領域の少なくとも部分を含む。
列を第1表(配列表A)(配列番号:1)に示す。サブ
クローンの名称が配列の右側の欄外に示されており、
3′−方向に延びるEcoRI−EcoRIを示してい
る。3.110kbのオープンリーディングフレームが7
0−3断片の3′−末端から4.4kb断片の中間にわた
って存在することが見出された。従って、このオープン
リーディングフレームは77/80kbダブレット蛋白質
のコード領域の少なくとも部分を含む。
【0119】I.ゲノムDNAとcDNAの比較 3個のcDNAクローンを次のようにして得た。クロク
ーンC1は、ヒト肝臓cDNAライブラリーをクローン
23Dの4.4kb EcoRI断片から構成したプロー
ブでスクリーニングすることにより得た。クローンC2
もまた、ヒト肝臓cDNAライブラリーを4.4kbプロ
ーブでスクリーニングすることにより得た。クローン2
−11は、ヒト腎臓細胞をクローン23Dのオープンリ
ーディングフレームの3′−末端に見出されるDNA配
列(配列表Aのヌクレオチド9391〜9435)に基
く合成45−マープローブでスクリーニングすることに
よって得た。このプローブは次の非コード鎖の配列から
成る。
ーンC1は、ヒト肝臓cDNAライブラリーをクローン
23Dの4.4kb EcoRI断片から構成したプロー
ブでスクリーニングすることにより得た。クローンC2
もまた、ヒト肝臓cDNAライブラリーを4.4kbプロ
ーブでスクリーニングすることにより得た。クローン2
−11は、ヒト腎臓細胞をクローン23Dのオープンリ
ーディングフレームの3′−末端に見出されるDNA配
列(配列表Aのヌクレオチド9391〜9435)に基
く合成45−マープローブでスクリーニングすることに
よって得た。このプローブは次の非コード鎖の配列から
成る。
【0120】
【化22】
【0121】クローンを配列決定し、そしてクローン2
3DのゲノムDNAに対するこれらcDNAクローンの
位置を、配列を比較することによって決定した。304
bpの長さを有するクローンC1は配列表A中の番号にお
けるヌクレオチド7773から8077までのオープン
リーディングフレームに重なる。
3DのゲノムDNAに対するこれらcDNAクローンの
位置を、配列を比較することによって決定した。304
bpの長さを有するクローンC1は配列表A中の番号にお
けるヌクレオチド7773から8077までのオープン
リーディングフレームに重なる。
【0122】878bpの長さを有するクローンC2はオ
ープンリーディングフレームの3′−端と部分的に重
り、ヌクレオチド9538から始まりそしてオープンリ
ーディングフレーム3′−端にあるヌクレオチド949
7を越えて伸びる。572bpの長さを有するクローン2
−11もオープンリーディングフレーム3′−端と重な
り、ヌクレオチド9190から始まりそしてその末端を
越えて伸びる。これらの知見はオープンリーディングフ
レームが転写されることを確認するものである。
ープンリーディングフレームの3′−端と部分的に重
り、ヌクレオチド9538から始まりそしてオープンリ
ーディングフレーム3′−端にあるヌクレオチド949
7を越えて伸びる。572bpの長さを有するクローン2
−11もオープンリーディングフレーム3′−端と重な
り、ヌクレオチド9190から始まりそしてその末端を
越えて伸びる。これらの知見はオープンリーディングフ
レームが転写されることを確認するものである。
【0123】4.4kbオープンリーディングフレームか
らのコード情報をクローン2−11及びC2からの追加
のコード情報と組合わせて、配列表B(配列番号:2)
に示すすべてのコード配列に対応する3.841kbの配
列を調製しそして伸ばすことができる。C1,C2、及
びC2−11プローブに対応する領域を枠で囲んであ
る。ファクターVIII Cを製造するために、クローン2
3又はクローン11からのDNA配列を、Laub等、J.Vi
rology(1983) 48:271 により記載されているようにS
V−40プロモーターに挿入してSV−40初期プロモ
ーターの制御のもとにおく。
らのコード情報をクローン2−11及びC2からの追加
のコード情報と組合わせて、配列表B(配列番号:2)
に示すすべてのコード配列に対応する3.841kbの配
列を調製しそして伸ばすことができる。C1,C2、及
びC2−11プローブに対応する領域を枠で囲んであ
る。ファクターVIII Cを製造するために、クローン2
3又はクローン11からのDNA配列を、Laub等、J.Vi
rology(1983) 48:271 により記載されているようにS
V−40プロモーターに挿入してSV−40初期プロモ
ーターの制御のもとにおく。
【0124】得られた組換プラスミドをCOS細胞(Gu
zman、前掲)にトランスフェクトする。この方法に代え
て、コード配列を、Maloney ネズミサルコーマウイルス
の長ターミナルレピートが挿入されているpBR322
のごときプラスミドに挿入し、クローン23又は11の
配列をウイルス性制御系の転写制御のもとにおくことが
できる。次に、構成物を3T3マウス線維芽球に導入し
て効率的に発現せしめることができる(Perkins等、Mole
cular and Collular Biology, 1983年7月、Vol 3, No.
6,1123頁を参照のこと) 。
zman、前掲)にトランスフェクトする。この方法に代え
て、コード配列を、Maloney ネズミサルコーマウイルス
の長ターミナルレピートが挿入されているpBR322
のごときプラスミドに挿入し、クローン23又は11の
配列をウイルス性制御系の転写制御のもとにおくことが
できる。次に、構成物を3T3マウス線維芽球に導入し
て効率的に発現せしめることができる(Perkins等、Mole
cular and Collular Biology, 1983年7月、Vol 3, No.
6,1123頁を参照のこと) 。
【0125】上記の結果は、ファクターVIII C複合体
のサブユニットをコードするゲノムDNAが単離された
ことを示す。このゲノムDNAを使用することにより、
DNAをさらに操作してファクターVIII C複合体サブ
ユニットをコードする配列を得ることができる。
のサブユニットをコードするゲノムDNAが単離された
ことを示す。このゲノムDNAを使用することにより、
DNAをさらに操作してファクターVIII C複合体サブ
ユニットをコードする配列を得ることができる。
【0126】次に、このDNAを発現ベクター中で使用
し、ファクターVIII Cサブユニットを製造することが
でき、これを種々の方法で、例えば診断測定のための試
薬として、療法剤として、モノクローナル抗体又はポリ
クローナル抗体の製造のために使用することでき、これ
らの抗体は次にファクターVIII C複合体の製造のた
め、又は他の目的のために使用することができる。ゲノ
ムDNA配列はまた、プロ−ファクターVIII Cをコー
ドするmRNAの単離のために使用して、前駆体蛋白質
を得ることができる。次にこの蛋白質は生体内プロセシ
ングのために用いることができる。
し、ファクターVIII Cサブユニットを製造することが
でき、これを種々の方法で、例えば診断測定のための試
薬として、療法剤として、モノクローナル抗体又はポリ
クローナル抗体の製造のために使用することでき、これ
らの抗体は次にファクターVIII C複合体の製造のた
め、又は他の目的のために使用することができる。ゲノ
ムDNA配列はまた、プロ−ファクターVIII Cをコー
ドするmRNAの単離のために使用して、前駆体蛋白質
を得ることができる。次にこの蛋白質は生体内プロセシ
ングのために用いることができる。
【0127】この発明の方法は、67/70kdダブレッ
トをコードする配列の5′−端に又はそれに隣接してい
る特異的配列を含むDNA配列を提供した。この特異的
配列はまた、77/80kdダブレットのコード配列中
5′−端から約200〜400塩基、さらに正確には約
275〜325塩基下流に存在する。なお、14.43
kb EcoRI断片を含有するバクテリオファージλF
VIII 23Dは1984年1月4日にA.T.C.C.
に、 No.40094として寄託された。
トをコードする配列の5′−端に又はそれに隣接してい
る特異的配列を含むDNA配列を提供した。この特異的
配列はまた、77/80kdダブレットのコード配列中
5′−端から約200〜400塩基、さらに正確には約
275〜325塩基下流に存在する。なお、14.43
kb EcoRI断片を含有するバクテリオファージλF
VIII 23Dは1984年1月4日にA.T.C.C.
に、 No.40094として寄託された。
【0128】
【化23】
【0129】
【化24】
【0130】
【化25】
【0131】
【化26】
【0132】
【化27】
【0133】
【化28】
【0134】
【化29】
【0135】
【化30】
【0136】
【化31】
【0137】
【化32】
【0138】
【化33】
【0139】
【化34】
【0140】
【化35】
【0141】
【化36】
【0142】
【化37】
【0143】
【化38】
【0144】
【化39】
【0145】
【化40】
【0146】
【化41】
【0147】
【化42】
【0148】
【化43】
【0149】
【化44】
【0150】
【化45】
【0151】
【化46】
【0152】
【化47】
【0153】
【化48】
【0154】
【化49】
【0155】
【化50】
【0156】
【化51】
【0157】
【化52】
【0158】
【化53】
【0159】
【化54】
【0160】
【化55】
【0161】
【化56】
【0162】
【化57】
【0163】
【化58】
【0164】
【化59】
【0165】
【化60】
【0166】
【化61】
【0167】
【化62】
【0168】
【化63】
【0169】
配列番号:1 配列の長さ:15154 塩基対 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA 由来: 生物:ヒト 配列
【0170】 GAATTCCCCG GATCTCTTAT ATTCCATTGA CTTATTGGTC TATCTTTGTA CCAGTAACAT 60 ACTATCTTAT AGTAAGTTTT AATATTTGTT AGTATAATTC CTCCAACTTT GCTCTCTTTG 120 ATTTTTATAT AAATTTTAGA ATCATCTTGT CAATTTTATC AATAAAAATA TCTTCTGAGG 180 TTTTGATAGG GATTACATTG ATTCTGCAGA TCAATTTGGG GGAGCATACC TCTTGACAAT 240 ATTGAGTATT CCTGTCCATG AGCATGGTTT AGTTATTTAT TTACATCTTT TAAATTTTCT 300 CTTGGCAATG TTTTTGTAAA ATTTTAGTGT ACAGGTCTTG CACATTTTTG TAAAGTGTAT 360 TCTTTGGTAT TTAATGCTAT TATAATATTT TTTATGGTAT CAGTTTTTGT CAATTGTGTT 420 TTTCTAGAAA TATGTCCCTT TCATCTAAGT TGTTTAATTT ACTTGAAGTA AGTTATTTGT 480 AATGTTCTTT TATCATCCTT ATAATGTCTG TACTGATGTC TCCGTTTTCA TACCTGATAT 540 TGTTATTTAT ATTTTATCTA TTTTAAGTTT ATCGCCTGCA CCCACTAACT CGTCATCTAG 600
【0171】 CATTAGGTAT ATCTCCCAAT GATATCCCTC GCCCCTCCCC CTAGTGCACA TGTACCCTAA 660 AACTTAAAGT ATAATAAAAA AAAAAAGTTT GTCGCCTTTG TTATAGGTTC ATCAAATTTA 720 CTAATCCTAC CATAGGATCA AATTTTTGCT TTGTTCATCA GGTCATGGAA TTAAAAAAAT 780 TTTTTTGTTT TGTTTATTTT CTATGTTGAA TTTTTATTTT TATTTTGCTT TGCATTTCAT 840 TTATTTCTGG TCTTTTGTTA TTATTCCAAT ACTTTCTCTG GATTCAGTTT TCTTTTTCTT 900 CTTGACTTCT TGAGATTAAA ACTTGGTTCA TTGATTTTCA ACATTTCTTA CTTTTTAAAA 960 GTTCATACAA AGCATAAATT TCCCTTTATA TACTGCTTTA ACCCCATATC ACAAATTTTG 1020 ATGAGTCATA TTTTTATTAT CATTGAGTTT AAAATATTTT ATAAATTTTA CGTTATTTCT 1080 TGTTTTATTC ATAGTTATTT TACAGTGTTT TACTTAATTT CCCAATATAT GGCGATTTTC 1140 TGGCTCTCTC TCTGTTGCTG ATTTATTTGT TTTACTGTGA TCACATAACA TACTCTATAT 1200
【0172】 TATTTCAATC ATTTGAAATT TGTTGAGACT TGCTATATGC CCAGTGAATA ATTTAATTTG 1260 ATTAATGGCC CACTGCATTT GAAACAAATA TGTCTTTGCT GTTATTGGGT AGAGTGTCAT 1320 ATATTTGCCT ATTATGTCAA GTTGCTTTAT CATGTTTTTA AAATCCTTAT AAACTTCCTG 1380 ATATTTTATC TGTTTCTTAC AGACATGGAG GAAACTGTGA CATCTCTGTG ATTGTTGAGT 1440 TTGTTATTTT GATTTTTGTA TTTGTTAGTA AGAATGTTTC AAAATAAATG AGGCAATATA 1500 AAATCAGGTG CTTACAACTT TAAGGTTGTA TTCTTATTAA ATCAATTCTT TCATCTTTGT 1560 GAAATGTCCT TTTTGTCTGA AGTAGTACTT GTTGCCTTAA ACGTCTGCAT TGTCTAAAAT 1620 TTATACACCT GCACTATCAT ATTTATTTTG CTTAATGTTT GTGTGGTATA TATTTCCCAT 1680 TCTTTTCTTT TCAACCTATC TCTATCCTTA TATTTACAGT GTGTCTTTTT TAACATTTTC 1740 TGTAGTGCAA GTCTGTTGGT TAATTAATTT TGTCAGTTTT TGCTTCTCTG AAAAGTCTTT 1800
【0173】 ATTTCTGTTT TTGAATTATA TCTTCACTGT GTATAGAATT CTGGGTTTGT GGTTGTTGTT 1860 TTTGTTTTAT TACATTTTGT TTTATTGGTT TTTCCCTCAG CACTTTAAAA ATGCCGCTCC 1920 ATTGTTTCTA CTTGCATAGT TTTTCACAAT AAGTTTGTTG TAATTCCCAT TTGCATTCAA 1980 CTGTACATAA TGTATCTTTT TAAAAAAATC TGGATGGCTT CAAGCTCTTT ACTTTGATTT 2040 TTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTTACTTTGG CATTCTCTAG 2100 GCTTATTCAA TCTGTAATTT GGTATCATTA ATTTTGAAAA ATATTTATCA TCTGTGTCTT 2160 CAAATATTGC TTCTAATTCT TTCTCTTCTT CTGGTATTGC ATTTACATAT ATTATACTGT 2220 TCAATTTTGT CACACAGCTC TTGAATATGC TGTTCTAGTT TGTTTTCTAA CTATTTTTCC 2280 TTCTAGTTGT TCAGTTTTGT TGACATTTAT TGACCTATTT TTACTTCAGT AATTGTTTCC 2340 TGGGTTGTTG AGTTAATTGA TGAACTCATA GATGACATAC AATTTATCTT TTTATTCTTG 2400
【0174】 TGTCACTTGT GCTTTTGATG TCACATCTAG GAAGGCTTTG TCTAGCCCAA GGCCACATTT 2460 ACTTCCATAT TTTCTTCTAA GAGTTTGATA GTTGTAGCTG TTACATATAT GTCTATGATC 2520 TAGTTTGAAT AAATTTTTGT GTATGGTGTG AAGAAGAGGT CTAACCTCTT TTTTATTTTT 2580 TGCATGTAAA CATCCAGTTG TCCCGGCACC ATTTGTTGAA AATATGATTC TTTTCCCATT 2640 AAGTCATCTT GACACCCTTG TTGAAAATCA ATTGACCATA AATGTGAGAG TTTATTTCTG 2700 AACTCTCCAT TCTGTTCCAT TGACCCATAC GTCTTCTATA AATTCCTTAT AGCTAATTCT 2760 ACATTAGACT TTGGTTTTTC AGATGTGGTC ATCTCATTAG ATTATGGTGA TATGTTTGGT 2820 TACAAGTTTT ATCTTCTCCT TGGCAACATT TTTTTTATTA CTGCTCTTCT TTTATTCGTT 2880 TTTGTTGTTC CTTTCTCTTT TTGTGAGACA GGGTCTCACT CTGTTGCCCA GGGTGGAGTA 2940 AGTGGTGTGA TCATGGCTCA CTGCAGCCTC AACCTCCTGG GCTCAAGCAA TCCTCCCACC 3000
【0175】 TCAGCCTCCC AAGTAGTGGG ACTACAGGCA TGCACCATCA TGCCAGGCTA ACTTTTTTAT 3060 TTTTTGTAGA GACAGGGTCT TGCTTTGTTG CCCAGGCTGG TCTTGAACTC CAAGCTCAAG 3120 CAATCCTCCA ACCTCAGCTT CCCAAAGTGC TGGGATTACC AGTATGAGCC ACTGCACCTG 3180 GCCTTGTTGT TCCTTTCTTC CTTTTATCTT GTAGTATCTT GATCCTTTTT GCTTATTATT 3240 TATCATTGAG GTGAGTTTGT TCTAAATAAA CTTTTCGCAG AAAGTTTATG TAGATATATT 3300 AATATCAATG AGGCATTAGG AGTGAGTTTT AGATTAGCAG GAATTCTCTT ATGAAAGGTA 3360 TTGATTGTAT GTGTGAGTTT TCAGCCTTTA CTTCTCTCCA GCCCATCAAG ATCAAAGCTG 3420 CAGAGTTGTT TACATTTCAG AATTTCTTTC CTCCCCTCCC CACCTTGCAA AACAGACTTA 3480 CAGTGCAAAA ATGACTTGTC AATGTGATTC TTTCTTCTGG TCCCATCTTT CCTACCTTTT 3540 GAGACTTGTG TTGAAAGGAG TCCAGTAAAA CCACCGATGC TAGCTTGTAT ACCCTGATCC 3600
【0176】 CATTGTTATA ATGAATGACT GACTGTTTTT CATATCAAAG TATAATACTT GCACCTTGAT 3660 AGAAGAAAGA AACAAGGCCA GGCACAGTGG TTCATGCCTG TAATCCCAGC ACTTTGGGAG 3720 GCTGAAGTAG GAGGAATAAT TAGACTTTGA TATTAAAAAT GGGGAAGATA TGGCGGTATA 3780 AGATATGAGG AAGTATGTCT TCTTGGACTT TTCTGAAATC TGCCAGCCAT GAGCATCCAC 3840 TCTTTTTATC TTTTGATACC TGTTTTATAT TAACTATACT TCTATTTTGT GGTTTCATGG 3900 CTTCAGATAT CTTCCAGCTT AATTGTACTC TGTCTTTAAT TATTTGCAGC AATTTCTGAA 3960 AGGAGCAAGA AGAAAGGCCA GCCCTTTCTT CACTACCTTA AAAACTGGTC ATCTTTTGAA 4020 ACCCCATGAA AGGCACAGTG GGTGACCATC TACATCAGGA GTGGGCAAAC TATGGCCCTT 4080 GGGTAGTCTG GTCTCTGTCC GTTTTTGTAA GGTTTTATTG GAACCCATAC ACACACAAAC 4140 TGATCATCTC TTGTTATGTG TTAAGTTTTC TTATAATTAT TCTTTTCTAT TTCATCCAGC 4200
【0177】 TGAATTACCA TTTCACCTTG TGTATGCCCT TTCCAGTCTT AAATTATAGA AGCTATGTCT 4260 TTGTGGTTTT AAATTATGGA AGCTGTGCCT TCTTGTGTTT TAGTATGGCA AGATATTTGT 4320 TCTTACTTTT CCTCTAGAAT CTGCAGTGGA TTACTTTCAG AAGTAGGTAT TGCCTCTAAG 4380 TTTCCTGACT TCTGTTTCCT TCTCCCTGTT CTGTAGTATA TTTATAGATT GCATGTTTTC 4440 TCGTCCTTAA ACAAGGTACA AATATGTTCT GATCAAGGTT TGCTAGCCGA GAGGATAAGT 4500 GGCTTGCTCT TAGCCTAACT CTCTGTCTAC TTAATGGATG TCGAATTCCC TTCTCAACTC 4560 AACAGCTAGT AACTAGTTCC AAGATCGGAT AATAGCTTAC AGAATTAATT AGTTCAGTGA 4620 AAGCCCTGGT TTGATCACAG AGGCAGGAGA CTGATCTATA TATTTGTAGT GCTGACTAGA 4680 CCCCAACTTG GCCAGATAGC TTATACCTAT GTCAGAAGTT GGAGGAGGAG ATTGACAGCT 4740 GAGGTGTCTC CAAGGGAATT ACAATTATTT TCATTTTCTT TGTGTCTGTA ATTATGTCTC 4800
【0178】 TTTTCTTACT TCAAATTTTG TATATGTGAA ATTTCTTAAT TTTTATTTGG TTATTTATTT 4860 TATTGACTTT TTCATCAAAC AACCAACTCT AAGTTCTTGG ATTGAAATTT ATGAATTAAT 4920 TATAATGTTT TAAATTTACC ATTAGTCACA CATACAATAC AAAAAGATAT TTTCATTACA 4980 AAATTTTAAC CCAAGCCATT AAAACTAAAC TCCAGCTTGG TCACCATTCC TAATACCAGG 5040 CCCCTCTCAG AGGAGGGTAA ATAAAAGTCC ATTTTGGTAA CTAGTTTGAC GAGAATCTCT 5100 AATTGTTTCC CTGTTTTTCT TATAATGTCT GCCTTTGAAT TATCCTCTTT TTTTCAAGAG 5160 TTCCATCATA TAATGTATTC CTTTTTGCTT ACAGATTGAC CTCCTAGAGG CATGCATCCC 5220 CCTGCTCCAG TCTGAGCTGG TTCTCTCTAG GCCTGAGGCT CAGTTATCAA CTTGGGACTT 5280 TTATTTACCC TCCCTCAGGA TAGGTACCTG GTTCTTGGAT ACCAGGTCTT ACTCTTGTTT 5340 GAGATACTCC TTTATTTTGG TGGCAAACAT TCCATAATCA CTTCCTGATA ATGGTGACAT 5400
【0179】 TTGAGGTAGA TTTTCTGAGT CTTTATATGT TAGAATATGT TTTTATTCTC CTTTGCCACT 5460 TGATTGATAA TTTGGCTGCA CATAGAATGT AAGCATTCAC AGGGCTTTTG GGAGCAGCTT 5520 CCCTTGAGAA GAAGGTGGAT GCAGTTAAGA TCTTCCCTGA AAAGACTGTG TGAAATGACA 5580 AGGCTATTGA GGTACCCAAC GGGTAGCTTG GTAAAGGTGT ATCTTGTCTC TTATGTTTAT 5640 GCATCTACTT TACCACCATG TAATTAGCCT ATTATAACTT GTTGCATTCC TTCACTCAGC 5700 TAATCTTGTT CATGGTAGAA ATTAATATTG CTAGTACCAT GGTAGAATTT TATATTAGCT 5760 GGATCCTAGA CCTAAATGCT CCTTCCTTGT GCTTACATAT TCTGCAAGTG GGTGACAGTG 5820 GATGCTAGGT ATTGTGTTAT GTGATTTCAA TGTATTATAT GATGGGGTAG ATACTATTAG 5880 CCTCATTTGA AAATTAGAAA CCTATTGTTC AGAAAGTTTA AGTGACTTTC TCAAAGTCAC 5940 ACAGCTGGTA AATGGTAGAA CTGGGATTTG AATCCAGGCA ATCTGATGGA TTTAAGAGGA 6000
【0180】 ACCTGTGCCA CTATGTGATA TAGCAATAAC ATCTAGCCAA TATAAATACT TTCCTGAATT 6060 AAATCACTGT CATATTCAGA GAGTTCTGTG TCACTATTAA GACCCTCCAT TATTGTGTAT 6120 ATTAATTACA TTTCCCTATT TTAATCCCAA TATCTATTCA TTTTTATCAC AGTCCTTTCT 6180 TATGGTCACA AACAGGCATA GTACAACAGC AGCAATGCAA AAACCACTTT TATATTACAT 6240 GTTCCAGGGA TTTAACCCAA TGACCTGTGA TATAATGATA CTGACTAGTA TTTTTTCATT 6300 TATCTGGGAA TGGGAGAGAA CCTCTAACAG AACGTTTTAG AATCTGTGTT ATGAGTAACC 6360 AGAGTCTTAG TTCTTCCTCA TCTCCAGGTC TATGGATTCT GGGGTGCCAC AACTCAGACT 6420 TTCGGAACAG AGGCATGACC GCCTTACTGA AGGTTTCTAG TTGTGACAAG AACACTGGTG 6480 ATTATTACGA GGACAGTTAT GAAGATATTT CAGCATACTT GCTGAGTAAA AACAATGCCA 6540 TTGAACCAAG AAGCTTCTCC CAGAATTCAA GACACCCTAG CACTAGGCAA AAGCAATTTA 6600
【0181】 ATGCCACCAC AATTCCAGAA AATGACATAG AGAAGACTGA CCCTTGGTTT GCACACAGAA 6660 CACCTATGCC TAAAATACAA AATGTCTCCT CTAGTGATTT GTTGATGCTC TTGCGACAGA 6720 GTCCTACTCC ACATGGGCTA TCCTTATCTG ATCTCCAAGA AGCCAAATAT GAGACTTTTT 6780 CTGATGATCC ATCACCTGGA GCAATAGACA GTAATAACAG CCTGTCTGAA ATGACACACT 6840 TCAGGCCACA GCTCCATCAC AGTGGGGACA TGGTATTTAC CCCTGAGTCA GGCCTCCAAT 6900 TAAGATTAAA TGAGAAACTG GGGACAACTG CAGCAACAGA GTTGAAGAAA CTTGATTTCA 6960 AAGTTTCTAG TACATCAAAT AATCTGATTT CAACAATTCC ATCAGACAAT TTGGCAGCAG 7020 GTACTGATAA TACAAGTTCC TTAGGACCCC CAAGTATGCC AGTTCATTAT GATAGTCAAT 7080 TAGATACCAC TCTATTTGGC AAAAAGTCAT CTCCCCTTAC TGAGTCTGGT GGACCTCTGA 7140 GCTTGAGTGA AGAAAATAAT GATTCAAAGT TGTTAGAATC AGGTTTAATG AATAGCCAAG 7200
【0182】 AAAGTTCATG GGGAAAAAAT GTATCGTCAA CAGAGAGTGG TAGGTTATTT AAAGGGAAAA 7260 GAGCTCATGG ACCTGCTTTG TTGACTAAAG ATAATGCCTT ATTCAAAGTT AGCATCTCTT 7320 TGTTAAAGAC AAACAAAACT TCCAATAATT CAGCAACTAA TAGAAAGACT CACATTGATG 7380 GCCCATCATT ATTAATTGAG AATAGTCCAT CAGTCTGGCA AAATATATTA GAAAGTGACA 7440 CTGAGTTTAA AAAAGTGACA CCTTTGATTC ATGACAGAAT GCTTATGGAC AAAAATGCTA 7500 CAGCTTTGAG GCTAAATCAT ATGTCAAATA AAACTACTTC ATCAAAAAAC ATGGAAATGG 7560 TCCAACAGAA AAAAGAGGGC CCCATTCCAC CAGATGCACA AAATCCAGAT ATGTCGTTCT 7620 TTAAGATGCT ATTCTTGCCA GAATCAGCAA GGTGGATACA AAGGACTCAT GGAAAGAACT 7680 CTCTGAACTC TGGGCAAGGC CCCAGTCCAA AGCAATTAGT ATCCTTAGGA CCAGAAAAAT 7740 CTGTGGAAGG TCAGAATTTC TTGTCTGAGA AAAACAAAGT GGTAGTAGGA AAGGGTGAAT 7800
【0183】 TTACAAAGGA CGTAGGACTC AAAGAGATGG TTTTTCCAAG CAGCAGAAAC CTATTTCTTA 7860 CTAACTTGGA TAATTTACAT GAAAATAATA CACACAATCA AGAAAAAAAA ATTCAGGAAG 7920 AAATAGAAAA GAAGGAAACA TTAATCCAAG AGAATGTAGT TTTGCCTCAG ATACATACAG 7980 TGACTGGCAC TAAGAATTTC ATGAAGAACC TTTTCTTACT GAGCACTAGG CAAAATGTAG 8040 AAGGTTCATA TGACGGGGCA TATGCTCCAG TACTTCAAGA TTTTAGGTCA TTAAATGATT 8100 CAACAAATAG AACAAAGAAA CACACAGCTC ATTTCTCAAA AAAAGGGGAG GAAGAAAACT 8160 TGGAAGGCTT GGGAAATCAA ACCAAGCAAA TTGTAGAGAA ATATGCATGC ACCACAAGGA 8220 TATCTCCTAA TACAAGCCAG CAGAATTTTG TCACGCAACG TAGTAAGAGA GCTTTGAAAC 8280 AATTCAGACT CCCACTAGAA GAAACAGAAC TTGAAAAAAG GATAATTGTG GATGACACCT 8340 CAACCCAGTG GTCCAAAAAC ATGAAACATT TGACCCCGAG CACCCTCACA CAGATAGACT 8400
【0184】 ACAATGAGAA GGAGAAAGGG GCCATTACTC AGTCTCCCTT ATCAGATTGC CTTACGAGGA 8460 GTCATAGCAT CCCTCAAGCA AATAGATCTC CATTACCCAT TGCAAAGGTA TCATCATTTC 8520 CATCTATTAG ACCTATATAT CTGACCAGGG TCCTATTCCA AGACAACTCT TCTCATCTTC 8580 CAGCAGCATC TTATAGAAAG AAAGATTCTG GGGTCCAAGA AAGCAGTCAT TTCTTACAAG 8640 GAGCCAAAAA AAATAACCTT TCTTTAGCCA TTCTAACCTT GGAGATGACT GGTGATCAAA 8700 GAGAGGTTGG CTCCCTGGGG ACAAGTGCCA CAAATTCAGT CACATACAAG AAAGTTGAGA 8760 ACACTGTTCT CCCGAAACCA GACTTGCCCA AAACATCTGG CAAAGTTGAA TTGCTTCCAA 8820 AAGTTCACAT TTATCAGAAG GACCTATTCC CTACGGAAAC TAGCAATGGG TCTCCTGGCC 8880 ATCTGGATCT CGTGGAAGGG AGCCTTCTTC AGGGAACAGA GGGAGCGATT AAGTGGAATG 8940 AAGCAAACAG ACCTGGAAAA GTTCCCTTTC TGAGAGTAGC AACAGAAAGC TCTGCAAAGA 9000
【0185】 CTCCCTCCAA GCTATTGGAT CCTCTTGCTT GGGATAACCA CTATGGTACT CAGATACCAA 9060 AAGAAGAGTG GAAATCCCAA GAGAAGTCAC CAGAAAAAAC AGCTTTTAAG AAAAAGGATA 9120 CCATTTTGTC CCTGAACGCT TGTGAAAGCA ATCATGCAAT AGCAGCAATA AATGAGGGAC 9180 AAAATAAGCC CGAAATAGAA GTCACCTGGG CAAAGCAAGG TAGGACTGAA AGGCTGTGCT 9240 CTCAAAACCC ACCAGTCTTG AAACGCCATC AACGGGAAAT AACTCGTACT ACTCTTCAGT 9300 CAGATCAAGA GGAAATTGAC TATGATGATA CCATATCAGT TGAAATGAAG AAGGAAGATT 9360 TTGACATTTA TGATGAGGAT GAAAATCAGA GCCCCCGCAG CTTTCAAAAG AAAACACGAC 9420 ACTATTTTAT TGCTGCAGTG GAGAGGCTCT GGGATTATGG GATGAGTAGC TCCCCACATG 9480 TTCTAAGAAA CAGGTATGAA TGCATTGGTT ATTCCTTTGC TCTGCTCTTG TGACATTTGA 9540 CTTTACCAGA TGATGACACC AACAATGAGA GTTAGAGGAT GAAAAATCAA GGTGTCTTGA 9600
【0186】 AACTCTTACT CTGGTGAGAT AGAGAGAAGA GAGGTTTACA AGAGGGTAGA GGAATCAGGG 9660 ACAAGAAGGA GCAATGGGGA GCAGGAAGAA AGTCAACCTC ACCTATCAAC CTTATGAGCT 9720 GCAGGGGAAA TCTTAGTCTC ATCAGAGAAC TTTAAGCAAG GCAGAAGGAA GAAGCAAGTT 9780 CGTGTTAAAG AGGTTAAGGA CTTGGGGAGG ATTGGTTTTC ATGATACTGG GGATCCAGAG 9840 GGCAAAGTAG GATGATTTTA TTTTTAGGTG AGTAGAGGGA GGTTGAGCAG TCAAGTAGTA 9900 CAGAGAAATG TGGAATATAA ACATAAGGAG AGTCAGTCAG TCACAAATAT TTATGGAACA 9960 CCTACTACAT GCCAGACACT TTTGTACACA TTGGAGTGCA GCACAGCAGG AGCTTATATT 10020 CTATTGGAAA GAGCAAGAGA CAAGTTAGTA CAAAACTAAA TAAGGCAATC TCAATTGTGT 10080 TGTTCAGAAG ATAGAATAGA ATAATATGGT AGAGAGAATA ATATGATAGA GTAATACGTA 10140 GAGTGTTACA TTAGCTGTGG TGGTCATAGA AATCATCTTT GAGGAGTTGA GACCTAAATG 10200
【0187】 ATGATAACAG GCCAGCTGAT GGAGCTCTGA GAGAAGATGT TTCCAGACAG AGGGAAGAGA 10260 AAATGCAAAG GCCCTGAGAA TGGAAAAAGT TTACCATGTT TGAGGAACAA GAAGGGACAA 10320 GCATGACTTG TCACTTTCCC ACCTTGCTTT CTAGCTCAAG TAAGCCCTTA TTGCTGCATT 10380 GCAACCATAG ACTATTTCCC TAGTCCACTG ACTTTCTCAT TCTCCTGGAC CTCTATCTTA 10440 GATTTTCTGT GTTTTCCTTA AATCTCGAGC ACCTTTTTTC CATTCTCCAA TGCCCATTTT 10500 CACTCTTAGC TGATGCTGTG CAATGAACCT CCACAGACTC CCAACATCAC ATTTACTGGC 10560 ATTTGTACCC ATATACTCTG CCTGCACACT TATTACAATA AATAGAGTGT CTGTGCTCCT 10620 AAGGCCAACC TCTCCAGTTT TGTACTTGAT TCCCATCTCT TCTCCCTTCA TAAAAAATGT 10680 TGCTCCAGCA ATTTCTCCTT TCTCCCTTAC ATCATCAATT TATCTCTCCA CTAGATTAAT 10740 CTCATCAACA TCAATCATGC TATTATTTCC TCCCCTATCT TTACAGAAAC CGTCTTAAAA 10800
【0188】 TAATTGTCCC TGCTTGCAGC CTTTGCATCT TTTCCTGCCA TTCTCTCCTC TTTAACCCAC 10860 TCCAAAGAAG CTTTTATCTC TATTATTTCA TAAGAACTAC ATTTTCAAGG TCATTATTGA 10920 TCTTTACATT ACTGATTACT AGCCCTCATC TTATTTGAAT TCTCAGTAGT ATTTGAGAGG 10980 TGATTACTCC ATCGTTGATA CAGGTTCTCA CTTGGTTTCT CTAACACCAC TTTTCTTCAC 11040 TTTTCTACTA AACTTACTGC CAATCTTTGT CAACTTTGCG AGTCCTTCTT CATCCCCCTA 11100 ATCTTTAAAG GTTAGAGTGC TCCAGGGATT AGTTCTCCAA CTTCTTCTTT ATTCTATTTA 11160 TACTCACTCT GTGACGACAT TGTTTAGCCT CATGATTTTA AGTACTATCT ATCTGCAGAT 11220 AATTCCAGTT GAATATCTGG AGATATTCTC AGATCTCTCT CCTGAAGTCA AAATTTACAT 11280 ATCAACTCCC TACCTTAACA TGCACACAAT TAGACTCTTA ATTCCTGCCC CTTCCCAAAA 11340 CCTGCTGATT GCTCAGCCTT CTCCATGGCA ATCAAAAACC ATTCCTGGCC GGGCATGGTG 11400
【0189】 GCTCACTCCT GTAACCCCAG CACTTGGGGA AGCTGAGGCA GGTGGATTGG TTGAGCCCCA 11460 GAGTTCAAGA TCAGCCTGGG CAACATGGCA AAACCTCATC TCTATTAAAA ATACAAAAAT 11520 TAGCCAGGCG TGGTGGTGCA CACCTGCAGT CCCAGCTACT CAGGAGGCTG AGGCACGAGA 11580 ATCGCTTGAA CTGGGGAGAC GGAGGTTGCA GTGAGCTGAG ATGGCCTCAC TGCACTCCAG 11640 CCTGGGCAAC AGAGTCAGAC TTGATCTCAA AAAAATAAAT AAGTAAAACC ATTCCCTATT 11700 TCAGTTATTC AGTCACAGAT CTTGAAGTTT TCCAACTCTT TTTTTCTTAC ATTAACATCT 11760 AATCTGTAAA GGATCCTGTA TTAGTCCATT TTCACACTGC TAATAAAGAC ATACCTGAGA 11820 CTGGGCAATT TACAAAAGAA AGAAGTTTAA TGGACTCACA GTTCCACATG GCTGGGGAGG 11880 CCTCACAATC ATGGCAGAAG GCAGGGAGGA GCAAGTTATA TCTCACATGA TGGCACAGGC 11940 AAAGAGAGAG AGCTTGTGCA GGGAAACTCC TCTTTTTAAA ACCATCAGAT CTTGTGAGAC 12000
【0190】 TTATTCACTA TCATGAGAAC AGCAAGGGAA GGACCTACTG CCATGATTCA GTTACCTCCT 12060 ATCAGGTCCC TCCCACAGAA CATGGGAATT CAAGATGAGA TTTGGGTAGG GACACAGCCA 12120 AACCATATCA TTCCACCCCA TCCCCTCCCA AATCTCGTGT CCTCACATTT CAAAACCAAT 12180 CATGCCTTCC CAACAGTCCC CCAAAGTCAT AACACATTTC AGCATTAACT CAAAAGTCCA 12240 CAGTCCAATG TCTCATCTAA GACAAGGCAA GTCCCTTCCA CCTATGAGCA TGTAAAGTCA 12300 AAAGCAAGTT AGTTACTTCC TAGATACAAT GGGGTATAGG CATTGGGTAA ATACAGCCAT 12360 TCCAAATGGG AGAAATTGGC CAAAACAAAG GGCCTACAGG CCCCATGCAA GTCTGAAATT 12420 CTACGGGGCA GTCAAATCTT AAATCTCTAA AGTGATCTCC TTTGACTCCA TGTCTTGCAT 12480 CTGAGTCATG CTGATGCAAG AGGTGGGTGC CCATGGTCTT GGGCAGCTCC ACCCCTGTGG 12540 CTTTGCAGGG TACAGCCTCC CTTGTGTCTG CCTTCATGGG CTGGCATTTT CTGTAGCTTT 12600
【0191】 TCCAGATGCT GGTGCAAGTT TCTGATGGAT CTACCATTCC GGGGTCTGGA GGACGGTGGC 12660 CCTCTTCTCA CAGCTCCACT AGGTGGTACC CCAGTAGGGA CTCTGTGTGG GTGCCCTGAG 12720 CCCACATTTC CCTTCTGCAC TGCCCTAGCA GAGTTTCTAC ATGAAGGCCC ACCCCCGCAG 12780 CAAACTTCTG CCTGGGCATC CAGGCACTTC CATTAATTTC TAAACAACAA AGCATTCAAG 12840 AGGCGACTTG GGTGCTATTA AGGGCATTCA GTTTCATAAG GGAAGCAGAG CATAAAAGTT 12900 TGGAAAATTT GCAGCCTGAT AATGTTAGAG AAAAGCAAAT CCCATTTTCT GAGGAGAAAT 12960 TCAAGCAGGC TGCAGAAATT TGCATAAGTA ATGAGGAGCC GAATGTTAAT CCCAAGACAA 13020 TGGGGAAAAT GTCTCCAGGG CATGTCAGAG GTCTTCACAC CAGCCCCTCC CATCACCGGC 13080 CCAGAGGCCT AAGAGGAAAA AGTTGTTTCA TGGGCTGGGC CCAGGATCCC CATGCTGTGT 13140 GCAGCCTAGG GAGTCGGTGC CTTGTGTCCC AGCCGCTACA GCCATGGCTG AAAGGGGTCA 13200
【0192】 ATGTAGAGCT CAGGCTGTGG CTTCATAGGG TACAAGTCCC AAGCCTTGGC AGCTTCCACA 13260 TGATGTTGAG CCTGCGAGTG CACAGAAGTC AAGAACTGGG GTTTGGGAAC TTCCGCCTAG 13320 ATTTCAGAAG ATGTATGAAA ACACCTGGAT GCCTAGGCAG AAGTTTGCTG CGGGGGTGGG 13380 CCCTCATGGA GAACCTCTGC TAGGGCAGTG CAGAAGGGAA ATGTGGGCTC AGAGCACACA 13440 CACAGAGTCC CTGCTGGGGT ACCACCTAGT GGAGCTGTGA GAAGAGGACC ACCGTCCTCC 13500 AGGCCCCAGA ATGGTAGATA CCCTAAATCA TCTCTTTCAA ATTCGAAGTT CCACAAATCT 13560 CTAGGACAGG AGCAAAATGC CACCAGTATC TTTGCTAAAA CATAACAAGA GTTACCTTTG 13620 CTCCAGTTCC CAACAAGTTC CTCATCTCTA TCTGAGACCA CCTCAGCCTG GATTTCATTG 13680 TCCATATCAT TATCAGCCTT TTGGTCAAAG CCATTCAACA AGTCTCTAGA GAGTTCCAAA 13740 CTTTCCACAT TTTCCTGTCG TCTTCTGAGC CCTCCAAACT GTTCCAACCT CTGCCTGTTA 13800
【0193】 CCCAGTTCCA AAGTCGCTTC CACATTTTTG GGTATCTTTT CAGCAGCACC CCACTCTACT 13860 GGTACCAACT TACTGTATTA GTCTGTTCTC ACACTGCTGA TAAAGATATA CCTGAGACTG 13920 GGAAATTTAC AAAGGAAAGA GGTTTTATGG ACTTACTGTT CCACATGGCT GGGGAGGCCT 13980 CAAAATCATG GCAGAAGGCA AGGAGGAGCA AGTCTTGTCT TACATGGATG GCAGCAGGCA 14040 AAGAAAGAAA GCTTGTGCAG GAAAACTCTT TTTTTTCTTT TCTTCTTTTT AGACAGAGAT 14100 CTTGCTCTGT CACGCAGGCT GGAGTCAGTG GCGTGAGTCT TGGCTCACTG CAACCTCCAC 14160 CTCCCGGGTT CAAGTGATTC TCCTGCCTCA GCCTTCCAAG TAGCTGGTAC TACAGGCATG 14220 TGCCACCACA TGAGATGAGA TTTTGGTAGG GACACAGCCA AACCATATCA TTCCCCCTGT 14280 CCCCTCCCAA ATCTCATGTC CTCACATTTC AAAACCAATC ATGCCTTCCC AACAGTCCCC 14340 CAAAGTCATA ACTCATTTCA GCATTAACTC AAAAGTCCAC AGTATTTTTA GTAGAGATGG 14400
【0194】 GGTTTCACCA TATTGGCCAG ACTGGTCTCT AACTCCTGAC CTTATGATCC GCCCGCCTTG 14460 GCCTCCCAAA GCACTGGGAT TACAGGTGTG AGCCACCATG CCCAGCCAAA AACTCTTCTT 14520 TTTAAAACCA TCAGTTCTCG ATGAGACTTA TTCACTATCA CAAGAACAGC ATAGGAAAGA 14580 TCTGCCCCCA TGATTCAATT ACCTCCCACC AGGTCCCTCC CACAACACAT GGGAATTCAC 14640 GATGAGATTT GGGTGGGGAT CCTCTTGGCT ATCATTTCAA AAAATAGTCA GGGTTGATTA 14700 TGGACTTAGT ATTGAATAAG ATGAAAATGT ACTGAAATGG AACGATGAAG ATAATTGACC 14760 AGGGAAAGCA GGTTACAAGC CAAGAGAGGA TACAGTGTCA CTTCAGATGC TATAAAAGTG 14820 ATGTTTTTAT TTTTTGAATG TTATTTGGCT ATATTTTCAA ATTATCTGCA CTGCATATGC 14880 ACTGCTTCTG TAATAATAAA AGGGTATTAA AATAATAAAA TCAAGTCTAT AAATCACACA 14940 CACACACCCC AGCCTCTTCT CTACACCTCA GTGACTACCA ACCACATCTA AATTATCATC 15000 ATTTCTCATC TGAATTATTG CAAGAAGCCA TTGCAATAAT TCAGATGAGA GTTGATACAA 15060 AGCCTTCCTG TTTCCAACCT TACCCTCATA TAGTCTTTTC CCAACATTGC ATCTAAAGTA 15120 ATTTTTCAAA TTGCAATTCT GATCCGGGGA ATTC 15154
【0195】配列番号:2 配列の長さ:3851 塩基対 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA 由来: 生物:ヒト 配列
【0196】 GTCTATGGAT TCTGGGGTGC CACAACTCAG ACTTTCGGAA CAGAGGCATG ACCGCCTTAC 60 TGAAGGTTTC TAGTTGTGAC AAGAACACTG GTGATTATTA CGAGGACAGT TATGAAGATA 120 TTTCAGCATA CTTGCTGAGT AAAAACAATG CCATTGAACC AAGAAGCTTC TCCCAGAATT 180 CAAGACACCC TAGCACTAGG CAAAAGCAAT TTAATGCCAC CACAATTCCA GAAAATGACA 240 TAGAGAAGAC TGACCCTTGG TTTGCACACA GAACACCTAT GCCTAAAATA CAAAATGTCT 300 CCTCTAGTGA TTTGTTGATG CTCTTGCGAC AGAGTCCTAC TCCACATGGG CTATCCTTAT 360 CTGATCTCCA AGAAGCCAAA TATGAGACTT TTTCTGATGA TCCATCACCT GGAGCAATAG 420 ACAGTAATAA CAGCCTGTCT GAAATGACAC ACTTCAGGCC ACAGCTCCAT CACAGTGGGG 480 ACATGGTATT TACCCCTGAG TCAGGCCTCC AATTAAGATT AAATGAGAAA CTGGGGACAA 540 CTGCAGCAAC AGAGTTGAAG AAACTTGATT TCAAAGTTTC TAGTACATCA AATAATCTGA 600
【0197】 TTTCAACAAT TCCATCAGAC AATTTGGCAG CAGGTACTGA TAATACAAGT TCCTTAGGAC 660 CCCCAAGTAT GCCAGTTCAT TATGATAGTC AATTAGATAC CACTCTATTT GGCAAAAAGT 720 CATCTCCCCT TACTGAGTCT GGTGGACCTC TGAGCTTGAG TGAAGAAAAT AATGATTCAA 780 AGTTGTTAGA ATCAGGTTTA ATGAATAGCC AAGAAAGTTC ATGGGGAAAA AATGTATCGT 840 CAACAGAGAG TGGTAGGTTA TTTAAAGGGA AAAGAGCTCA TGGACCTGCT TTGTTGACTA 900 AAGATAATGC CTTATTCAAA GTTAGCATCT CTTTGTTAAA GACAAACAAA ACTTCCAATA 960 ATTCAGCAAC TAATAGAAAG ACTCACATTG ATGGCCCATC ATTATTAATT GAGAATAGTC 1020 CATCAGTCTG GCAAAATATA TTAGAAAGTG ACACTGAGTT TAAAAAAGTG ACACCTTTGA 1080 TTCATGACAG AATGCTTATG GACAAAAATG CTACAGCTTT GAGGCTAAAT CATATGTCAA 1140 ATAAAACTAC TTCATCAAAA AACATGGAAA TGGTCCAACA GAAAAAAGAG GGCCCCATTC 1200
【0198】 CACCAGATGC ACAAAATCCA GATATGTCGT TCTTTAAGAT GCTATTCTTG CCAGAATCAG 1260 CAAGGTGGAT ACAAAGGACT CATGGAAAGA ACTCTCTGAA CTCTGGGCAA GGCCCCAGTC 1320 CAAAGCAATT AGTATCCTTA GGACCAGAAA AATCTGTGGA AGGTCAGAAT TTCTTGTCTG 1380 AGAAAAACAA AGTGGTAGTA GGAAAGGGTG AATTTACAAA GGACGTAGGA CTCAAAGAGA 1440 TGGTTTTTCC AAGCAGCAGA AACCTATTTC TTACTAACTT GGATAATTTA CATGAAAATA 1500 ATACACACAA TCAAGAAAAA AAAATTCAGG AAGAAATAGA AAAGAAGGAA ACATTAATCC 1560 AAGAGAATGT AGTTTTGCCT CAGATACATA CAGTGACTGG CACTAAGAAT TTCATGAAGA 1620 ACCTTTTCTT ACTGAGCACT AGGCAAAATG TAGAAGGTTC ATATGACGGG GCATATGCTC 1680 CAGTACTTCA AGATTTTAGG TCATTAAATG ATTCAACAAA TAGAACAAAG AAACACACAG 1740 CTCATTTCTC AAAAAAAGGG GAGGAAGAAA ACTTGGAAGG CTTGGGAAAT CAAACCAAGC 1800
【0199】 AAATTGTAGA GAAATATGCA TGCACCACAA GGATATCTCC TAATACAAGC CAGCAGAATT 1860 TTGTCACGCA ACGTAGTAAG AGAGCTTTGA AACAATTCAG ACTCCCACTA GAAGAAACAG 1920 AACTTGAAAA AAGGATAATT GTGGATGACA CCTCAACCCA GTGGTCCAAA AACATGAAAC 1980 ATTTGACCCC GAGCACCCTC ACACAGATAG ACTACAATGA GAAGGAGAAA GGGGCCATTA 2040 CTCAGTCTCC CTTATCAGAT TGCCTTACGA GGAGTCATAG CATCCCTCAA GCAAATAGAT 2100 CTCCATTACC CATTGCAAAG GTATCATCAT TTCCATCTAT TAGACCTATA TATCTGACCA 2160 GGGTCCTATT CCAAGACAAC TCTTCTCATC TTCCAGCAGC ATCTTATAGA AAGAAAGATT 2220 CTGGGGTCCA AGAAAGCAGT CATTTCTTAC AAGGAGCCAA AAAAAATAAC CTTTCTTTAG 2280 CCATTCTAAC CTTGGAGATG ACTGGTGATC AAAGAGAGGT TGGCTCCCTG GGGACAAGTG 2340 CCACAAATTC AGTCACATAC AAGAAAGTTG AGAACACTGT TCTCCCGAAA CCAGACTTGC 2400
【0200】 CCAAAACATC TGGCAAAGTT GAATTGCTTC CAAAAGTTCA CATTTATCAG AAGGACCTAT 2460 TCCCTACGGA AACTAGCAAT GGGTCTCCTG GCCATCTGGA TCTCGTGGAA GGGAGCCTTC 2520 TTCAGGGAAC AGAGGGAGCG ATTAAGTGGA ATGAAGCAAA CAGACCTGGA AAAGTTCCCT 2580 TTCTGAGAGT AGCAACAGAA AGCTCTGCAA AGACTCCCTC CAAGCTATTG GATCCTCTTG 2640 CTTGGGATAA CCACTATGGT ACTCAGATAC CAAAAGAAGA GTGGAAATCC CAAGAGAAGT 2700 CACCAGAAAA AACAGCTTTT AAGAAAAAGG ATACCATTTT GTCCCTGAAC GCTTGTGAAA 2760 GCAATCATGC AATAGCAGCA ATAAATGAGG GACAAAATAA GCCCGAAATA GAAGTCACCT 2820 GGGCAAAGCA AGGTAGGACT GAAAGGCTGT GCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC 2880 ATCAACGGGA AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG 2940 ATACCATATC AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG GATGAAAATC 3000
【0201】 AGAGCCCCCG CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC 3060 TCTGGGATTA TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA 3120 GTGTCCCTCA GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC 3180 CCTTATACCG TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG 3240 AAGTTGAAGA TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT 3300 ATTCTAGCCT TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT 3360 TTGTCAAGCC TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA 3420 CTAAAGATGA GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG 3480 ATGTGCACTC AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG 3540 CTCATGGGAG ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA 3600
【0202】 CCAAAAGCTG GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC 3660 AGATGGAAGA TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA 3720 TGGATACACT ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA 3780 GCATGGGCAG CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC 3840 GAAAAAAAGA G 3851
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョージ クオ アメリカ合衆国,カリフォルニア 94122, サン フランシスコ,シックスス アベニ ュ 1370 (72)発明者 フランク アール.マシャーズ アメリカ合衆国,カリフォルニア 94131, サン フランシスコ,マービュー ウェイ 148 (72)発明者 マーサ トゥルート アメリカ合衆国,カリフォルニア 94611, オークランド,ブロードウェイ テラス 9082 (72)発明者 パブロ バレンズエラ アメリカ合衆国,カリフォルニア 94117, サン フランシスコ,アッパー テラス 455 (72)発明者 ミレラ エズバン ラスムセン デンマーク国,2100 コペンハーゲン,ア ビルドガードスガデ 24 (72)発明者 ジェニファー ファバロロ オーストラリア国,ビクトリア,カールト ン 3035,ファラデイ ストリート 108
Claims (13)
- 【請求項1】 全体にわたってオープンリーディングフ
レームを有し、そしてヒト−ファクターVIII C又はそ
の前駆体の少なくとも部分をコードする約200bp以上
のDNA配列。 - 【請求項2】 実験例に記載したDNA配列を含有する
特許請求の範囲第1項記載のDNA配列。 - 【請求項3】 ヒト−ファクターVIII Cのサブユニッ
トをコードするDNA配列。 - 【請求項4】 ファクターVIII Cの80kdペプチドを
コードする特許請求の範囲第3項記載のDNA配列。 - 【請求項5】 ファクターVIII Cの77kdペプチドを
コードする特許請求の範囲第3項記載のDNA配列。 - 【請求項6】 培養において増殖することができる宿主
細胞と適合性の複製系、及びヒト−ファクターVIII C
又はその前駆体の少なくとも部分をコードする約200
bp以上のDNA配列を含有する染色体外要素。 - 【請求項7】 前記DNA配列がファクターVIII Cの
80kdペプチドをコードする特許請求の範囲第6項記載
の染色体外要素。 - 【請求項8】 前記DNA配列がファクターVIII Cの
77kdペプチドをコードする特許請求の範囲第6項記載
の染色体外要素。 - 【請求項9】 前記DNA配列の発現のために該DNA
配列に並置された、前記宿主と適合性の転写及び翻訳制
御シグナルを含有する特許請求の範囲第6項記載の染色
体外要素。 - 【請求項10】 前記宿主が単細胞微生物である特許請
求の範囲第6項記載の染色体外要素。 - 【請求項11】 前記宿主が哺乳動物細胞である特許請
求の範囲第6項記載の染色体外要素。 - 【請求項12】 ファクターVIII Cの少なくとも部分
をコードし、そして次の配列: 【化1】 で表わされる複合プローブとハイブリダイズする、哺乳
動物ゲノム由来の約10〜25kbp のDNA配列。 - 【請求項13】 単細胞微生物クローニングベクターと
連結された特許請求の範囲第12項記載のDNA配列を
含んで成るDNA構成物。
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