DK156668B - Fremgangsmaade til kvantitativ bestemmelse af blodkoagulationsfaktor xii i humant plasma - Google Patents

Description

DK 156668 B

Den foreliggende opfindelse angàr en fremgangsmâde til kvantitativ bestemmelse af koagulationsfaktor XII (ogsâ kaldeC Hageman-faktoren) i humant plasma.

Faktor XII er den ferste faktor, der aktiveres i den endogene blod» 5 koagulationskaskade. Da denne faktor ikke alene spiller en central rolle i koagulationssystemet, men ogsâ 1 kallikrein-kininsystemet og i det fibrinolytiske System, er det vigtigt at kunne bestemme denne faktor kvantitativt i blodplasma. Den for tiden mest anvendte bestem-melsesmetode bestâr 1, at en plasmapreve inkuberes med kaolin for at 10 aktivere Hageman-faktoren maksimalt, aktiveringsblandingen inkuberes med plasma, der mangler Hageman-faktoren, inkubationsblandingen efter et bestemt tidsrum recalcineres ved tilsætning af calciumioner, og koagulationstiden af den recalcinerede blanding mâles. Koagula-tionstiden er tilnarmelsesvis en funktion af koncentrationen af 15 Hageman-faktoren i testpreven (jfr. fx Oscar D. Ratnoff, "Thrombosis and Bleeding Disorders”, 1971, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, side 215-218). Ulempen ved denne bestemmelsesmetode bestâr i, at man mâler en sterrelse, som er et résultat af en lang reaktionskaskade, og som derfor er afhangig af et stort antal reaktionsparametre. Bestemmelsen 20 vanskeliggeres yderligere ved, at der kraves vanskeligt tilgangeligt Hageman-faktor-manglende plasma til opstilling af kalibreringskurver.

I USA-patentskrift nr. 4.275.153 foreslâs det at anvende forbindelsen H-D-Phe-Pro-Arg-AIE (AIE - 5-aminoisophthalsyre-dimethylester) som substrat til bestemmelse af faktor Xlla i blodplasma. Faktor Xlla 25 spalter enzymatisk fra substratet en fluorescerende forbindelse, hvis mangde kan mâles fluorescensspektrofotometrisk. Den mængde faktor Xlla, der oprindeligt var til stede i blodplasmaet, kan bestemmes ud fra den iagttagne mangde. De resultater, der opnâs ved denne fremgangsmâde, er imidlertid ikke anvendelige, da forbindelsen H-D-Phe-30 Pro-Arg-AIE ikke alene spaltes af faktor Xlla, men ogsâ af kalli- krein, der ligeledes findes i blodplasma, oven i kebet ca. fem gange starkere end af faktor Xlla.

Det har nu vist sig at vare muligt direkte og kvantitativt at mâle den enzymatiske aktivitet af faktor Xlla, der er dannet ud fra faktor

DK 156668 B

2 XII, i blodplasma, idet der anvendes visse chromogene tripeptidde-rivater som spaltelige substrater.

Fremgangsmâden ifelge opfindelsen er ejendommelig ved, at plasmaet behandles med en aktivator for at omdanne den faktor XII, der fIndes 5 i plasma, til faktor Xlla, som omsættes med et tripeptidderivat med den almene formel H-D-NH-CH-CO-Gly-L-Arg-R1 R2 10 hvor R*- betegner en enzymatisk fraspaltelig chromogen eller fluorogen substitueret aminogruppe, og R2 betegner en ligekædet eller forgrenet alkylgruppe med 1-4 carbonatomer eller en benzyl-, p-hydroxybenzyl-, cyclohexylmethyl- eller 4-hydroxycyclohexylmethylgruppe, eller et sait deraf med en organlsk syre eller mineralsyre, og at mængden af 15 det ved hjslp af faktor Xlla fra tripeptidderivatet enzymatisk frigjorte farvede eller fluorescerende spaltningsprodukt R^H mâles fotometrisk, spektrofotometrisk eller fluorescensspektrofotometrisk.

Som aktivator kan der fx anvendes et préparât, som indeholder cepbalin og ellagsyre, eller kaolin. Aktiveringen af faktor XII 20 udferes hensigtsmæssigt ved ca. 0°C. Omsstningen af faktor Xlla med tripeptidderivatet udferes fortrinsvis i nerværelse af sojabonne-trypsininhibitor i et puffersystem med en pH-værdi pâ 7,4-8,0, fortrinsvis 7,7, og med en ionstyrke pâ 0,025-0,2, fortrinsvis 0,05.

Saltene af tripeptidderivaterne kan være salte med mineralsyrer, fx 25 HCl, HBr, H2SO4 eller H3PO4, eller med en organisk syre, fx myresyre, eddikesyre, propionsyre, mælkesyre, citronsyre, oxalsyre, vinsyre, benzoesyre, phthalsyre, trichloreddikesyre eller trifluoreddikesyre.

De i overensstemmelse med opfindelsen anvendte tripeptidderivater kan fremstilles pâ i og for sig kendt mâde.

30 Den ovenfor anferte almene formel omfatter fx de folgende enkelte tripeptidderivater:

DK 156668 B

3 2AcOH.H-D-Ala-Gly-Arg-pNA, 2AcOH.H-D-But-Gly-Arg-pNA, 2AcOH.H-D-Val-Gly-Arg-pNA, 2AcOH.H-D-Nval-Gly-Arg-pNA, 2AcOH.H-D-Leu-Gly-Arg-pNA, 2AcOH.H-D-Nleu-Gly-Arg-pNA, 2AcOH.H-D-Ile-Gly-Arg-pNA, 2AcOH.H-D-Phe-Gly-Arg-pNA, 5 2AcOH.H-D-Tyr-Gly-Arg-pNA, 2AcOH.H-D-CHA-Gly-Arg-pNA, 2AcOH.H-D-CHT-Gly-Arg-pNA.

AcOH - eddikesyre

Ala - alanyl

Arg - arginyl 10 But - a-aminobutyryl CHA - 3-cyclohexyl-alanyl CHT - 3-(4-hydroxycyclohexyl)-alanyl

Gly - glycyl

Ile - isoleucyl 15 Leu - leucyl

Nleu - norleucyl

Nval - norvalyl

Phe - phenylalanyl

Tyr - tyrosyl 20 Val - valyl pNa - paranitroanilid.

De to aminosyregrupper, der er knyttet til D-aminosyregruppen, har L-form.

De ovennævnte tripeptidderivater er i og for sig kendte forbindelser, 25 hvor p-nitrophenylaminogruppen kan erstattes med en anden chromogen eller fluorogen substitueret aminogruppe fx en l-carboxy-2-nitro-phenyl-5-ylamino-, l-sulfo-2-nitro-phen-5-ylami.no, ^-naphthylamino-, 4-methoxy-/3-naphthylamino-, 5-nitro-a-naphthylamino-, quinon-5-ylamino-, 8-nitro-quinon-5-ylamino-, 4-methyl-coumar-7-ylamino- eller 30 l,3-di(methoxycarbonyl)phen-5-ylaminogruppe (afledt af 5-amino-isophthalsyre-dimethylester).

Til udferelse af fremgangsmâden ifclge opfindelsen kan der gâs frem pâ felgende mâde.

4

DK 156 66 8 B

Det citratplasma, hvis indhold af faktor XII skal bestemmes, blandes med et vandigt præparat, som indeholder cephalin og eilagsyre, fx Actin® (fremstillet af DADE, Miami, USA) eller Cephotest® (frem-stillet af Nyegaard & Co. AS, Oslo, Norge), og blandingen inkuberes i 5 nogle fâ minutter, fortrinsvis 4 minutter, ved lav temperatur, fortrinsvis 0eC, for at omdanne faktor XII til faktor Xlla. (Citratplasma er blodplasma, til hvilket der er sat 3%'s vandig, isotonisk natrivuncitrat for at gore det ikke-koagulerende). Det er vigtigt at arbejde ved lave temperaturer for at undgâ dannelsen af enzymcom-10 plexer med plasmairihibitoren o^-makroglobulin, da disse complexer ganske vist enzymatisk ville kunne spalte de som substrat anvendte tripeptidderivater, men med ringere hastighed end de tilsvarende frie enzymer. En alikvotdel af den vundne aktiveringsblanding ssttes der-efter til et testsystem, der fremstilles ved blanding af en puffer, 15 fx tris-imidazolpuffer med en pH-værdi pâ 7,4-8,0, fortrinsvis 7,7, og en ionstyrke pâ 0,025-0,2, fortrinsvis 0,05, og som indeholder sojabonnetrypsininhibitor, med en vandig oplosning af et af de ovenfor definerede tripeptidderivater og en vandig oplosning af aktivatoren (Actin® eller Cephotest®) og prsinkubation i nogle 20 minutter ved den temperatur, ved hvilken spaltningen af tripep-tidderivatet skal mâles. Mængden af farvet eller fluorescerende spaltningsprodukt, der frisættes pr. tidserihed, mâles derefter ved fotometriske, spektrofotometriske eller fluorescensspektrofoto-metriske metoder. Nâr spaltningsproduktet er p-nitroanilin, foretages 25 mâlingen fortrinsvis ved 405 nm.

Den sojabonnetrypsininhibitor, der findes i testsystemet, har den funktion selektivt at hæmme det ved aktiveringen af faktor XII til faktor Xlla samtidigt aktiverede plasmakallikrein for at hindre dettes enzymatiske virkning pâ det som substrat anvendte tripep-30 tidderivat. Derimod har sojabonnetrypsininhibitoren ingen hæmmende virkning pâ faktor Xlla.

Fremgangsmâden ifolge opfindelsen har flere fordele fremfor den hidtil kendte bestemmelsesmetode, idet den muliggor en direkte be-stemmelse af faktor XII via den aktiverede faktor Xlla, hvis enzyma-35 tiske aktivitet kan fastsættes i et enkelt trin ved hjslp af de ovenfor anforte tripeptidderivater. I den hidtil kendte metode blev

DK 156668 B

5 aktiviteten af faktor Xlla malt indirekte ved hjslp af koagulati-onstiden. Koagulationen finder ferst sted, efter at den af faktor Xlla udleste fuldstændige endogene koagulationsproces er lebet til ende. For at fâ sammenlignelige mâlingsværdier er det nedvendigt at 5 anvende Hageman- faktor-manglende plasma for at bestemme indflydelsen af faktor Xlla pâ koagulationstiden og opstille kalibreringskurver til dette formai. Den hidtil kendte metode, hvis endelige mâlings-resultat ferst kunne fàs efter forlebet af komplicerede ind i hin-anden gribende enzymatiske processer, er behæftet med talrige 10 ukontrollerbare fejlkilder og er derfor unejagtig. Det er yderst vanskeligt at fâ et plasma, der fuldstsendigt mangler faktor XII. I kliniske laboratorier er der i dag tendens til at anvende automatiske analyseapparater, med hvilke der hurtigt og nejagtigt kan udferes analyser med et minimum af personale. Fremgangsmâden ifelge opfin-15 delsen egner sig fortræffeligt til sâdanne automatiske analyseapparater, hvorimod den hidtil kendte metode kun kan udferes semi-kvantitativt, manuelt og pâ tidsrevende mâde af uddannet laboratorie-personale.

Opfindelsen belyses nsrmere ved nedenstâende eksempel.

20 EKSEMPEL

Et testsystem, der bestâr af 0,75 ml tris-imidazolpuffer med en pH-værdi pâ 7,7 og en ionstyrke pâ 0,05, som indeholder 0,1 mg soja-bennetrypsininhibitor pr. ml, 0,25 ml 2 x 10'^ molær vandig oplesning af 2AcOH.H-D-Leu-Gly-Arg-pNA og 0,20 ml vandigt aktiveret cepha-25 loplastinreagens (Actin®, fremstillet af DADE, Miami, USA), præinku-bëres i 4 minutter ved 37eC. Præinkubatet tilsættes 0,05 ml af et inkubat, der er fremstillet ved blanding af 0,1 ml normalt citrat-plasma og 0,2 ml vandigt aktiveret cephaloplastinreagens og inku-bation i 4 minutter ved 0°C. Efter blanding af begge komponenter 30 mâles kontinuerligt mængden af det ved faktor Xlla frisette p-ni- troanilin spektrofotometrisk ved 405 nm i 5 minutter. Aktiviteten af faktor Xlla i enzymenheder pr. ml plasma beregnes ud fra foregelsen i optisk densitet pr. minut.

Claims (6)

1. Fremgangsmâde til kvantitativ bestenmelse af blodkoagulations-faktor XII i humant blodplasma, kendetegnet ved, at plasmaet behandles med en aktivator 10 for at omdanne faktor XII, der fIndes i plasmaet, til faktor Xlla, som omssttes med et tripeptidderivat med den almene formel H-D-NH-CH-CO-Gly-L-Arg-R1 R2 hvor rA betegner en enzymatisk fraspaltelig chromogen eller fluorogen 15 substitueret aminogruppe, og R2 betegner en llgeksdet eller forgrenet alkylgruppe med 1-4 carbonatomer eller en benzyl-, p-hydroxÿbenzyl-, cyclohexylmethyl- eller 4-hydroxycyclohexylmethylgruppe, eller et sait deraf med en organisk syre eller mineralsyre, og at mængden af det ved hjslp af faktor Xlla fra tripeptidderivatet enzymatisk 20 frigjorte farvede eller fluorescerende spaltningsprodukt R% mâles fotometrisk, spektrofotometrisk eller fluorescensspektrofotometrisk.

2. Fremgangsmâde ifelge krav 1, kendetegnet ved, at der som aktivator anvendes et préparât, der Indeholder cephalin og ellagsyre, eller kaolin.

3. Fremgangsmâde ifelge krav 1 og 2, kendetegnet ved, at omsætningen af faktor Xlla med tri-peptidderivatet udferes i nærværelse af sojabonnétrypsininhlbitor.

4. Fremgangsmâde ifelge krav 1-3, DK 156668 B kendetegnet ved, at omsstningen udferes i et puffersystem med en pH-værdi pâ 7,4-8,0, og med en ionstyrke pâ 0,025-0,2.

5. Fremgangsmâde ifelge krav 1, kendetegnet ved, at aktiveringen af faktor XII udferes ved 5 0°C.

6. Fremgangsmâde ifelge krav 1, kendetegnet ved, at R*- betegner en p-nitrophenylami.no-, 1-carboxy-2-nitro-phen-5-ylamino-, l-sulfo-2-nitro-phen-5-ylamino-, β-naphthylamino-, 4-methoxy-/?-naphthylamino-, 5-nitro-a-naphthylamino-, 10 quinon-5-ylamino-,· Ç-nitro-quinon-5-ylamino-, 4-methyl-coumar-7- ylamino- eller l,3-di(methoxycarbonyl)phen-5-ylaminogruppe (afledt af 5-amino-isophthalsyre-dimethylester).