JPH0586098A - コラーゲンにより刺激される血小板凝集を阻害するタンパク質 - Google Patents
コラーゲンにより刺激される血小板凝集を阻害するタンパク質Info
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- JPH0586098A JPH0586098A JP3260014A JP26001491A JPH0586098A JP H0586098 A JPH0586098 A JP H0586098A JP 3260014 A JP3260014 A JP 3260014A JP 26001491 A JP26001491 A JP 26001491A JP H0586098 A JPH0586098 A JP H0586098A
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- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43536—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 血栓性疾患の防止、予防、治療に有用なタン
パク性物質を提供する。 【構成】 ヒル（Haementeria officinalis)抽出物から
単離されたコラーゲンによる血小板凝集をブロックする
分子量約１６，０００のタンパク質、このタンパク質の
アミノ酸配列およびこれをコードするＤＮＡ配列。本タ
ンパク質は遺伝子組換えにより酵母内で発現させること
ができる。
パク性物質を提供する。 【構成】 ヒル（Haementeria officinalis)抽出物から
単離されたコラーゲンによる血小板凝集をブロックする
分子量約１６，０００のタンパク質、このタンパク質の
アミノ酸配列およびこれをコードするＤＮＡ配列。本タ
ンパク質は遺伝子組換えにより酵母内で発現させること
ができる。
Description
【０００１】ヒトの正常な止血（hemostasis) は、細胞
と体液の生化学成分の双方に関わる複雑な一連の相互に
関係したメカニズムによって行なわれる。生化学的な経
路は、無傷な内皮細胞の損傷、血小板への刺激及び血液
凝固メカニズムの活性化を含む。血管が損傷して内皮下
組織が露出すると血小板は非常にすばやく、血管壁の構
成物のどれかに、とくにコラーゲンに粘着する。血小板
は他の内皮下構成物にも粘着するが、コラーゲンのみ
が、血小板から顆粒成分を放出させて他の血小板を損傷
部位に動員するように刺激することが報告されている。
と体液の生化学成分の双方に関わる複雑な一連の相互に
関係したメカニズムによって行なわれる。生化学的な経
路は、無傷な内皮細胞の損傷、血小板への刺激及び血液
凝固メカニズムの活性化を含む。血管が損傷して内皮下
組織が露出すると血小板は非常にすばやく、血管壁の構
成物のどれかに、とくにコラーゲンに粘着する。血小板
は他の内皮下構成物にも粘着するが、コラーゲンのみ
が、血小板から顆粒成分を放出させて他の血小板を損傷
部位に動員するように刺激することが報告されている。
【０００２】要約すると本発明は、未精製のヒル（Haem
enteria officinalis)抽出物から単離した、コラーゲン
による血小板凝集の刺激をブロックし、また血小板のコ
ラーゲンへの粘着をブロックするタンパク質（ＬＡＰ
Ｐ）を含む。このタンパク質は、およそ１６，０００の
分子量である。また、本発明は、ヒル（Haementeria of
ficinalis)の唾液腺抽出物からのタンパク質の精製など
によるこのタンパク質の製造方法、及び、コラーゲンに
よる血小板凝集への刺激をブロックすることによって血
液凝固を阻害又は遅延させるタンパク質の使用方法を含
む。このタンパク質は、血栓性疾患の防止、予防、治療
及び処置に役立つ。
enteria officinalis)抽出物から単離した、コラーゲン
による血小板凝集の刺激をブロックし、また血小板のコ
ラーゲンへの粘着をブロックするタンパク質（ＬＡＰ
Ｐ）を含む。このタンパク質は、およそ１６，０００の
分子量である。また、本発明は、ヒル（Haementeria of
ficinalis)の唾液腺抽出物からのタンパク質の精製など
によるこのタンパク質の製造方法、及び、コラーゲンに
よる血小板凝集への刺激をブロックすることによって血
液凝固を阻害又は遅延させるタンパク質の使用方法を含
む。このタンパク質は、血栓性疾患の防止、予防、治療
及び処置に役立つ。
【０００３】以下本発明を詳細に説明する。本発明は、
ヒル（Haementeria officinalis)から単離したタンパク
質、及びその相同物質、アイソフォーム又は遺伝的変異
型に関する。但しそれらはコラーゲンによる血小板凝集
への刺激をブロックし、かつ特定のタンパク質に対する
特定の抗体と反応するものである。タンパク質
ヒル（Haementeria officinalis)から単離したタンパク
質、及びその相同物質、アイソフォーム又は遺伝的変異
型に関する。但しそれらはコラーゲンによる血小板凝集
への刺激をブロックし、かつ特定のタンパク質に対する
特定の抗体と反応するものである。タンパク質
【０００４】本発明のタンパク質は、開示された配列の
活性を保有する、精製タンパク質の開示された配列の変
種を含むが、これにはフラグメント又はサブユニット、
天然の突然変異体、アレリック変異体、無作為に作り出
した人工の突然変異体及び活性を保有する意図された配
列変種が含まれる。「フラグメント」又は「サブユニッ
ト」とは、タンパク質全体よりも少ないアミノ酸を有す
るあらゆる配列の一部、たとえば、タンパク質全体から
Ｎ及び／又はＣ末端をのぞいた部分的配列を意味する。
活性を保有する、精製タンパク質の開示された配列の変
種を含むが、これにはフラグメント又はサブユニット、
天然の突然変異体、アレリック変異体、無作為に作り出
した人工の突然変異体及び活性を保有する意図された配
列変種が含まれる。「フラグメント」又は「サブユニッ
ト」とは、タンパク質全体よりも少ないアミノ酸を有す
るあらゆる配列の一部、たとえば、タンパク質全体から
Ｎ及び／又はＣ末端をのぞいた部分的配列を意味する。
【０００５】また、本発明のタンパク質には、精製タン
パク質配列の作用を保有する、記述される組み換えタン
パク質配列が含まれる。また、融合タンパク質や発現ベ
クターの範囲内でのポリジーンの発現によって得られる
タンパク質等の雑種タンパク質が含まれており、ペプチ
ド結合で第２のポリペプチドに結合している前記タンパ
ク質の特定の作用を有するポリペプチドを含めてもよ
い。
パク質配列の作用を保有する、記述される組み換えタン
パク質配列が含まれる。また、融合タンパク質や発現ベ
クターの範囲内でのポリジーンの発現によって得られる
タンパク質等の雑種タンパク質が含まれており、ペプチ
ド結合で第２のポリペプチドに結合している前記タンパ
ク質の特定の作用を有するポリペプチドを含めてもよ
い。
【０００６】本発明のタンパク質の他の変種、とくに保
存的アミノ酸のみが置換されて単離したタンパク質と異
なる変種が本発明に含まれると考える。このような保存
的アミノ酸は Taylor （J. Mol. Biol., １８８．２３
３（１９８６））の表Ｉに「セット」として定義されて
いる。
存的アミノ酸のみが置換されて単離したタンパク質と異
なる変種が本発明に含まれると考える。このような保存
的アミノ酸は Taylor （J. Mol. Biol., １８８．２３
３（１９８６））の表Ｉに「セット」として定義されて
いる。
【０００７】本発明のタンパク質は、合成によって、又
は組み換え技術によって、製造することができ、あるい
は後述のように未精製のヒル（Haementeria officinali
s)抽出物から得ることができる。コラーゲンによって刺激される血小板凝集の阻害の同定
は組み換え技術によって、製造することができ、あるい
は後述のように未精製のヒル（Haementeria officinali
s)抽出物から得ることができる。コラーゲンによって刺激される血小板凝集の阻害の同定
【０００８】ヒトの血小板を、Ca++を含まない０．２mg
／mlフィブリノーゲンを含んだ改良Tyrodeバッファーで
洗浄する。洗浄した血小板を、テストするサンプルとと
もに３７℃で２分間インキュベートする。最終濃度を１
又は２μg ／mlにしてコラーゲンを加えて、アグレゴメ
ーター中の血小板凝集をモニターする。阻害作用は、血
小板凝集の速度及び／又は程度で定義する。血小板のコラーゲンへの粘着ブロッキングの同定
／mlフィブリノーゲンを含んだ改良Tyrodeバッファーで
洗浄する。洗浄した血小板を、テストするサンプルとと
もに３７℃で２分間インキュベートする。最終濃度を１
又は２μg ／mlにしてコラーゲンを加えて、アグレゴメ
ーター中の血小板凝集をモニターする。阻害作用は、血
小板凝集の速度及び／又は程度で定義する。血小板のコラーゲンへの粘着ブロッキングの同定
【０００９】イーストで発現された組換え体ＬＡＰＰ
は、洗浄した血小板がコラーゲンでコーティングしたマ
イクロタイタープレートに粘着するのをブロックするこ
とが示された。
は、洗浄した血小板がコラーゲンでコーティングしたマ
イクロタイタープレートに粘着するのをブロックするこ
とが示された。
【００１０】ポリスチレン９６穴マイクロタイタープレ
ート（Costar Cambridge, MA) を、５mM酢酸に溶解した
４０μg ／mlコラーゲンを用いて、ウェルあたり１００
μｌで１時間室温でコーティングした後、１０mg／ml熱
変性ＢＳＡを加えて１時間おいて、非特異的細胞結合部
位をブロックする。コントロールのウェルは、ＢＳＡだ
けでコーティングする。ウェルは、２０mM ＨＥＰＥ
Ｓ、pH７．４、０．１４Ｍ NaCl 及び２mM MgCl2を含ん
だＨＥＰＥＳで緩衝化した生理食塩水（ＨＢＳ）で３回
すすぐ。１００μｌの洗浄した血小板を、さまざまな濃
度のＬＡＰＰと、又はコントロールとしてバッファー
と、室温で５分間インキュベートした後、コラーゲンコ
ーティングした各ウェルに加えて、室温で４５分間イン
キュベートして、粘着しない血小板を吸入してとりのぞ
き、ウェルを２００μｌのＨＢＳで３回すすぐ。粘着し
た血小板の数を、ＢＣＡ試薬を用いて５６２nmでの各ウ
ェルの吸収を測定する、タンパク質アッセイで決定す
る。
ート（Costar Cambridge, MA) を、５mM酢酸に溶解した
４０μg ／mlコラーゲンを用いて、ウェルあたり１００
μｌで１時間室温でコーティングした後、１０mg／ml熱
変性ＢＳＡを加えて１時間おいて、非特異的細胞結合部
位をブロックする。コントロールのウェルは、ＢＳＡだ
けでコーティングする。ウェルは、２０mM ＨＥＰＥ
Ｓ、pH７．４、０．１４Ｍ NaCl 及び２mM MgCl2を含ん
だＨＥＰＥＳで緩衝化した生理食塩水（ＨＢＳ）で３回
すすぐ。１００μｌの洗浄した血小板を、さまざまな濃
度のＬＡＰＰと、又はコントロールとしてバッファー
と、室温で５分間インキュベートした後、コラーゲンコ
ーティングした各ウェルに加えて、室温で４５分間イン
キュベートして、粘着しない血小板を吸入してとりのぞ
き、ウェルを２００μｌのＨＢＳで３回すすぐ。粘着し
た血小板の数を、ＢＣＡ試薬を用いて５６２nmでの各ウ
ェルの吸収を測定する、タンパク質アッセイで決定す
る。
【００１１】実施例１ ヒル（Haementeria officinalis)抽出物からの、コラー
ゲンによって刺激される血小板凝集を阻害する物質の単
離 ヒル（Haementeria officinalis)を切断し、唾液腺組織
を、２０mMＨＥＰＥＳ、pH７．８、１０mM CaCl2中で処
理して未精製抽出液を調製した。この抽出物を、同じバ
ッファーで平衡化したヘパリン−アガロースカラムにの
せた後に、同バッファーで洗浄した。
ゲンによって刺激される血小板凝集を阻害する物質の単
離 ヒル（Haementeria officinalis)を切断し、唾液腺組織
を、２０mMＨＥＰＥＳ、pH７．８、１０mM CaCl2中で処
理して未精製抽出液を調製した。この抽出物を、同じバ
ッファーで平衡化したヘパリン−アガロースカラムにの
せた後に、同バッファーで洗浄した。
【００１２】コラーゲン仲介血小板凝集の拮抗物質は、
０．１、０．２及び０．３Ｍ NaClHeparin アガロース
溶出液中に見出された。この０．１、０．２及び０．３
Ｍのサンプルを、 Centricon−１０マイクロコンセント
レイターで濃縮した後、 Superose １２ １０／３０で
ゲル濾過した。０．０５Ｍ NaPO4、pH７．２中の０．１
５Ｍ NaCl の溶出バッファーを用いて、生物活性を維持
させた。 Superose １２カラムのフラクションの、コラ
ーゲン媒介血小板凝集の拮抗を調べて、３４、７３分で
溶出する活性のピークを単離した。その後、分離物を逆
相Ｃ18ＨＰＬＣで精製した。
０．１、０．２及び０．３Ｍ NaClHeparin アガロース
溶出液中に見出された。この０．１、０．２及び０．３
Ｍのサンプルを、 Centricon−１０マイクロコンセント
レイターで濃縮した後、 Superose １２ １０／３０で
ゲル濾過した。０．０５Ｍ NaPO4、pH７．２中の０．１
５Ｍ NaCl の溶出バッファーを用いて、生物活性を維持
させた。 Superose １２カラムのフラクションの、コラ
ーゲン媒介血小板凝集の拮抗を調べて、３４、７３分で
溶出する活性のピークを単離した。その後、分離物を逆
相Ｃ18ＨＰＬＣで精製した。
【００１３】分離したタンパク質のアミノ酸成分分析は
以下のようであった：
以下のようであった：
【表３】 実施例２ ヒル（Haementeria officinalis)抽出物からの、コラー
ゲンによって刺激される血小板凝集拮抗物質の単離
ゲンによって刺激される血小板凝集拮抗物質の単離
【００１４】ヒル（Haementeria officinalis)を切断
し、唾液腺組織を、２０mMＨＥＰＥＳ、pH７．８、１０
mMCaCl2で処理した未精製抽出液から調製した。精製方
法は、以下につけ加えることをのぞいて、実施例１で述
べたのと同様の方法であった。タンパク質を０．０５Ｍ
NaPO4、pH７．２中の０．１５Ｍ NaCl ではなく、２０
mMトリス−HCl 、pH８．７中の０．３５Ｍ NaCl で溶出
した。タンパク質は、 Centricon−１０マイクロコンセ
ントレイターで濃縮及び脱塩した後、実施例１のように
Superose １２カラムにかけるか、又は Centricon−３
０フィルターで濾過した。サンプルを乾燥させ、H2O に
再懸濁して、最終的な精製のためにＣ18逆相ＨＰＬＣに
かけた。
し、唾液腺組織を、２０mMＨＥＰＥＳ、pH７．８、１０
mMCaCl2で処理した未精製抽出液から調製した。精製方
法は、以下につけ加えることをのぞいて、実施例１で述
べたのと同様の方法であった。タンパク質を０．０５Ｍ
NaPO4、pH７．２中の０．１５Ｍ NaCl ではなく、２０
mMトリス−HCl 、pH８．７中の０．３５Ｍ NaCl で溶出
した。タンパク質は、 Centricon−１０マイクロコンセ
ントレイターで濃縮及び脱塩した後、実施例１のように
Superose １２カラムにかけるか、又は Centricon−３
０フィルターで濾過した。サンプルを乾燥させ、H2O に
再懸濁して、最終的な精製のためにＣ18逆相ＨＰＬＣに
かけた。
【００１５】単離したアミノ酸成分分析は以下のようで
あった：
あった：
【表４】
【００１６】精製したタンパク質のＶ８又はＬysＣ位で
のプロテアーゼ分解と、その後のＣ18逆相ＨＰＬＣ上で
のそれらの単離及び配列決定によって、ペプチドを作っ
た。以下のペプチド配列が得られた。
のプロテアーゼ分解と、その後のＣ18逆相ＨＰＬＣ上で
のそれらの単離及び配列決定によって、ペプチドを作っ
た。以下のペプチド配列が得られた。
【表５】 実施例３ ヒル（Haementeria officinalis)由来の、コラーゲンに
よって刺激される血小板凝集を阻害する物質のインビト
ロの作用
よって刺激される血小板凝集を阻害する物質のインビト
ロの作用
【００１７】我々の研究で、２μg ／mlのコラーゲンは
血小板凝集を刺激するが、実施例１及び２で単離した、
コラーゲン刺激性血小板凝集阻害物質は、そのような凝
集を阻害することがわかった。この阻害の IC50 は４５
nMであった。コラーゲン刺激の阻害は、その後０．２５
mMのアラキドン酸を加えることによって消失した。組み
換えＤＮＡ技術
血小板凝集を刺激するが、実施例１及び２で単離した、
コラーゲン刺激性血小板凝集阻害物質は、そのような凝
集を阻害することがわかった。この阻害の IC50 は４５
nMであった。コラーゲン刺激の阻害は、その後０．２５
mMのアラキドン酸を加えることによって消失した。組み
換えＤＮＡ技術
【００１８】組み換えＤＮＡ技術を、本発明のタンパク
質の製造に用いてよい。この技術によって、異なった細
胞、そして通常は異なった生体由来の遺伝情報、すなわ
ちＤＮＡのセグメントを、それを得た生体外で末端どう
し結合して、さらにこの交雑ＤＮＡを、オリジナルのＤ
ＮＡがコードするタンパク質の製造が可能な細胞にとり
込ませることができる。遺伝情報、つまりＤＮＡ又はｍ
ＲＮＡは単離して、適当なクローニングベクターにとり
込ませて、適当なホスト細胞に導入する。
質の製造に用いてよい。この技術によって、異なった細
胞、そして通常は異なった生体由来の遺伝情報、すなわ
ちＤＮＡのセグメントを、それを得た生体外で末端どう
し結合して、さらにこの交雑ＤＮＡを、オリジナルのＤ
ＮＡがコードするタンパク質の製造が可能な細胞にとり
込ませることができる。遺伝情報、つまりＤＮＡ又はｍ
ＲＮＡは単離して、適当なクローニングベクターにとり
込ませて、適当なホスト細胞に導入する。
【００１９】この技術に役立つクローニングベクターに
は、特定の実験的な外来ＤＮＡを容するＤＮＡ配列が含
まれる。ベクターは、安定した状態で存在してこの実験
的ＤＮＡの命ずるタンパク質を発現できるようなホスト
細胞に導入される。クローニングベクターには、プラス
ミド、バクテリオファージ、ウイルス又はコスミドが含
まれる。
は、特定の実験的な外来ＤＮＡを容するＤＮＡ配列が含
まれる。ベクターは、安定した状態で存在してこの実験
的ＤＮＡの命ずるタンパク質を発現できるようなホスト
細胞に導入される。クローニングベクターには、プラス
ミド、バクテリオファージ、ウイルス又はコスミドが含
まれる。
【００２０】発現ベクターは、適当なホスト内で、クロ
ーニングした遺伝子のコピーが転写され、そのｍＲＮＡ
が翻訳されるのに必要なＤＮＡ配列である。これらのベ
クターは、バクテリア、イースト、昆虫及び哺乳類の細
胞などの多様な細胞において、原核生物又は真核生物の
遺伝子を発現することができる。適当に構成した発現ベ
クターは、ホスト細胞内での自律的複製のための複製起
点、選択的遺伝標識、限られた数の利用できる制限酵素
部位、高いコピー数及び強力なプロモーターから成る。
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合さ
せてＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列であり、強力な
プロモーターは、この開始を高い頻度で起こすものであ
る。発現ベクターには、クローニングベクターに限らな
いが、修正クローニングベクター及び特にデザインした
プラスミド又はウイルスが含まれる。
ーニングした遺伝子のコピーが転写され、そのｍＲＮＡ
が翻訳されるのに必要なＤＮＡ配列である。これらのベ
クターは、バクテリア、イースト、昆虫及び哺乳類の細
胞などの多様な細胞において、原核生物又は真核生物の
遺伝子を発現することができる。適当に構成した発現ベ
クターは、ホスト細胞内での自律的複製のための複製起
点、選択的遺伝標識、限られた数の利用できる制限酵素
部位、高いコピー数及び強力なプロモーターから成る。
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合さ
せてＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列であり、強力な
プロモーターは、この開始を高い頻度で起こすものであ
る。発現ベクターには、クローニングベクターに限らな
いが、修正クローニングベクター及び特にデザインした
プラスミド又はウイルスが含まれる。
【００２１】発現システム 原核生物は、非常にしばしばさまざまな大腸菌（E. col
i)の株で代表される。他の微生物、たとえば枯草菌（Ba
cillus subtilis)、多様な種のシュードモナス（Pseudo
monas)又は他の細菌株のような桿菌等を用いてもよい。
このような原核生体系では、ホストと適合する種由来の
複製部位及びコントロール配列を有するプラスミドベク
ターを用いる。たとえば大腸菌（E. coli)は通常、 Bol
ivarら（Gene，（１９７７）２：９５）によって大腸菌
（E. coli)の一種より取られたプラスミド、ｐＢＲ３２
２の誘導体を用いて、形質転換する。コントロール配列
とはリボゾーム結合部位配列に加えて転写開始させるプ
ロモーターを有すると定義され、オペレーターを有して
いてもよい。広く用いられる原核生物調節配列には、以
下のような広く用いられるプロモーターが含まれる。す
なわち、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）とラクト
ース（lac)プロモーター系（Chang ら、 Nature （１９
７７）１９８：１０５６）、そしてトリプトファン（Tr
p)プロモーター系（Goeddel ら、 Nucleic Acids Res.
（１９８０）８：４０５７）、またラムダ由来ＰL プロ
モーター及びＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Shimatak
e ら、Nature（１９８１）２９２：１２８）。しかし、
原核生物に適合するあらゆる入手可能なプロモーター系
を用いることができる。
i)の株で代表される。他の微生物、たとえば枯草菌（Ba
cillus subtilis)、多様な種のシュードモナス（Pseudo
monas)又は他の細菌株のような桿菌等を用いてもよい。
このような原核生体系では、ホストと適合する種由来の
複製部位及びコントロール配列を有するプラスミドベク
ターを用いる。たとえば大腸菌（E. coli)は通常、 Bol
ivarら（Gene，（１９７７）２：９５）によって大腸菌
（E. coli)の一種より取られたプラスミド、ｐＢＲ３２
２の誘導体を用いて、形質転換する。コントロール配列
とはリボゾーム結合部位配列に加えて転写開始させるプ
ロモーターを有すると定義され、オペレーターを有して
いてもよい。広く用いられる原核生物調節配列には、以
下のような広く用いられるプロモーターが含まれる。す
なわち、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）とラクト
ース（lac)プロモーター系（Chang ら、 Nature （１９
７７）１９８：１０５６）、そしてトリプトファン（Tr
p)プロモーター系（Goeddel ら、 Nucleic Acids Res.
（１９８０）８：４０５７）、またラムダ由来ＰL プロ
モーター及びＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Shimatak
e ら、Nature（１９８１）２９２：１２８）。しかし、
原核生物に適合するあらゆる入手可能なプロモーター系
を用いることができる。
【００２２】本発明の真核生体系において有用な発現系
は、適当な真核生物遺伝子由来のプロモーターを有す
る。たとえば、イーストで有用な一群のプロモーターに
は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ合成プロモーター
（Hitzemanら，J. Biol. Chem.（１９８０）２５５：２
０７３）を含めた解糖系酵素合成プロモーターが含まれ
る。他のプロモーターとしては、エノラーゼ遺伝子由来
のプロモーター（Holland, M. J. ら、J. Biol. Chem.
（１９８１）２５６：１３８５）又はＹＥｐ１３より得
られるＬeu２遺伝子（Broach, J.ら Gene （１９７８）
８：１２１）がある。
は、適当な真核生物遺伝子由来のプロモーターを有す
る。たとえば、イーストで有用な一群のプロモーターに
は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ合成プロモーター
（Hitzemanら，J. Biol. Chem.（１９８０）２５５：２
０７３）を含めた解糖系酵素合成プロモーターが含まれ
る。他のプロモーターとしては、エノラーゼ遺伝子由来
のプロモーター（Holland, M. J. ら、J. Biol. Chem.
（１９８１）２５６：１３８５）又はＹＥｐ１３より得
られるＬeu２遺伝子（Broach, J.ら Gene （１９７８）
８：１２１）がある。
【００２３】組み換えＬＡＰＰ製造のための好適な発現
系は、実施例４で説明する。この系は、イースト株（Sa
ccharomyces cerevisiae BJ １９９５）を用いる。
系は、実施例４で説明する。この系は、イースト株（Sa
ccharomyces cerevisiae BJ １９９５）を用いる。
【００２４】適当な哺乳類のプロモーターには、ＳＶ４
０由来の初期及び後期プロモーター（Fiers,ら Nature
（１９７８）２７３：１１３）又は、ポリオーマ、アデ
ノウイルスII、ウシ乳頭腫ウイルスあるいはトリ肉腫ウ
イルス由来のプロモーター等の他のウイルスプロモータ
ーが含まれる。適当なウイルス及び哺乳類のエンハンサ
ーは、すでに掲げた。発現系として植物細胞を用いる場
合には、ノパリン合成プロモーターが適当である（Depi
cker, A.ら、 J. Mol. Appl. Gen. （１９８２）１：５
６１）。
０由来の初期及び後期プロモーター（Fiers,ら Nature
（１９７８）２７３：１１３）又は、ポリオーマ、アデ
ノウイルスII、ウシ乳頭腫ウイルスあるいはトリ肉腫ウ
イルス由来のプロモーター等の他のウイルスプロモータ
ーが含まれる。適当なウイルス及び哺乳類のエンハンサ
ーは、すでに掲げた。発現系として植物細胞を用いる場
合には、ノパリン合成プロモーターが適当である（Depi
cker, A.ら、 J. Mol. Appl. Gen. （１９８２）１：５
６１）。
【００２５】これらのタンパク質発現に有用な昆虫細胞
発現系には、 Smithらの米国特許第４，７４５，０５１
号に記載された系の改良版が含まれる。バキュロウイル
ス遺伝子又は、バキュロウイルス遺伝子のプロモーター
を含むその一部分から成るバキュロウイルスＤＮＡを切
断して、少なくともプロモーターを含むＤＮＡフラグメ
ントを得る。感受性のあるホスト昆虫細胞に組み換えバ
キュロウイルス発現ベクターを接種して所望の生成物タ
ンパク質を製造するが、この発現ベクターは、バキュロ
ウイルスポリヘドリンプロモーターの転写調節下にある
少なくとも１つの選択された異種生成物タンパク質ポリ
ペプチド構造遺伝子を有する組み換えバキュロウイルス
ゲノムである。
発現系には、 Smithらの米国特許第４，７４５，０５１
号に記載された系の改良版が含まれる。バキュロウイル
ス遺伝子又は、バキュロウイルス遺伝子のプロモーター
を含むその一部分から成るバキュロウイルスＤＮＡを切
断して、少なくともプロモーターを含むＤＮＡフラグメ
ントを得る。感受性のあるホスト昆虫細胞に組み換えバ
キュロウイルス発現ベクターを接種して所望の生成物タ
ンパク質を製造するが、この発現ベクターは、バキュロ
ウイルスポリヘドリンプロモーターの転写調節下にある
少なくとも１つの選択された異種生成物タンパク質ポリ
ペプチド構造遺伝子を有する組み換えバキュロウイルス
ゲノムである。
【００２６】ホスト昆虫細胞内で選択された遺伝子を発
現し得る組み換えバキュロウイルス発現ベクターは、好
ましくは、以下のように製造する。すなわち：バキュロ
ウイルスポリヘドリンプロモーターと、異種組み換えを
容易にするために十分な隣接するＤＮＡ配列を有するＤ
ＮＡフラグメントを作るためにバキュロウイルスＤＮＡ
を切断し；修飾クローニングベクターを形成するために
バキュロウイルスＤＮＡフラグメントをクローニングビ
ークルに挿入する；クローニングされたバキュロウイル
スポリヘドリンプロモーターの転写調節下にあるバキュ
ロウイルスＤＮＡフラグメントの選択的制限部位を同定
する；修飾クローニングベクターから、バキュロウイル
スポリヘドリンプロモーターの転写調節下にあるバキュ
ロウイルスＤＮＡの余分な制限部位を欠失させる；組み
換えシャトルベクターを形成するために選択した異種遺
伝子を唯一の制限部位へ挿入する；組み換えを行なっ
て、組み換えが起こった及び組み換えが起こらなかった
バキュロウイルスの混合物を製造するために、バキュロ
ウイルスＤＮＡを接触させる；そして、この混合物から
組み換えバキュロウイルス発現ベクターを単離する；以
上である。ベクターの構築
現し得る組み換えバキュロウイルス発現ベクターは、好
ましくは、以下のように製造する。すなわち：バキュロ
ウイルスポリヘドリンプロモーターと、異種組み換えを
容易にするために十分な隣接するＤＮＡ配列を有するＤ
ＮＡフラグメントを作るためにバキュロウイルスＤＮＡ
を切断し；修飾クローニングベクターを形成するために
バキュロウイルスＤＮＡフラグメントをクローニングビ
ークルに挿入する；クローニングされたバキュロウイル
スポリヘドリンプロモーターの転写調節下にあるバキュ
ロウイルスＤＮＡフラグメントの選択的制限部位を同定
する；修飾クローニングベクターから、バキュロウイル
スポリヘドリンプロモーターの転写調節下にあるバキュ
ロウイルスＤＮＡの余分な制限部位を欠失させる；組み
換えシャトルベクターを形成するために選択した異種遺
伝子を唯一の制限部位へ挿入する；組み換えを行なっ
て、組み換えが起こった及び組み換えが起こらなかった
バキュロウイルスの混合物を製造するために、バキュロ
ウイルスＤＮＡを接触させる；そして、この混合物から
組み換えバキュロウイルス発現ベクターを単離する；以
上である。ベクターの構築
【００２７】イーストで組み換えＬＡＰＰを製造するの
に好ましい発現ベクターを実施例４及び図１、図２で説
明する。所望のコード配列及び調節配列を有する適当な
ベクターを構築するために、この分野で周知の標準的な
結合及び制限技術を用いる。単離したプラスミド、ＤＮ
Ａ配列、又は合成したオリゴヌクレオチドを切断し、長
さを調整して、所望の形態に再結合する。
に好ましい発現ベクターを実施例４及び図１、図２で説
明する。所望のコード配列及び調節配列を有する適当な
ベクターを構築するために、この分野で周知の標準的な
結合及び制限技術を用いる。単離したプラスミド、ＤＮ
Ａ配列、又は合成したオリゴヌクレオチドを切断し、長
さを調整して、所望の形態に再結合する。
【００２８】部位特異的ＤＮＡ切断は、この分野で一般
に知られる条件下の適当な制限酵素を用いて、これら市
販の制限酵素の製造元の指定する細かい条件に従がって
処理することによって行なう（たとえば、 New England
Biolabs. Product Catalog参照）。通常、約１μg の
プラスミド又はＤＮＡ配列を、約２０μｌのバッファー
溶液中の１ユニットの酵素で切断する。一般に、ＤＮＡ
基質の完全な分解を期するためには、過剰な制限酵素を
用いる。３７℃で約１ないし２時間のインキュベーショ
ン時間が適当であるが、変更することもできる。各イン
キュベーション後、分解生成物をフェノール／クロロホ
ルムに接触させた後、 Sephadex Ｇ−５０スピンカラム
に通してもよい。望ましい場合には、標準的技術を用い
たポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル上での電
気泳動によって、切断したフラグメントのサイズ分離を
行なってもよい（サイズ分離の一般的説明は Methods i
nEnzymology（１９８０）６５：４９９−５６０にあ
る）。
に知られる条件下の適当な制限酵素を用いて、これら市
販の制限酵素の製造元の指定する細かい条件に従がって
処理することによって行なう（たとえば、 New England
Biolabs. Product Catalog参照）。通常、約１μg の
プラスミド又はＤＮＡ配列を、約２０μｌのバッファー
溶液中の１ユニットの酵素で切断する。一般に、ＤＮＡ
基質の完全な分解を期するためには、過剰な制限酵素を
用いる。３７℃で約１ないし２時間のインキュベーショ
ン時間が適当であるが、変更することもできる。各イン
キュベーション後、分解生成物をフェノール／クロロホ
ルムに接触させた後、 Sephadex Ｇ−５０スピンカラム
に通してもよい。望ましい場合には、標準的技術を用い
たポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル上での電
気泳動によって、切断したフラグメントのサイズ分離を
行なってもよい（サイズ分離の一般的説明は Methods i
nEnzymology（１９８０）６５：４９９−５６０にあ
る）。
【００２９】制限切断フラグメントは、５０mMトリス、
pH７．６、５０mM NaCl 、６mM MgCl2 及び６mM ＤＴ
Ｔ中で、２０℃〜２５℃で約１５ないし２５分のインキ
ュベーション時間を用いて、５ないし１０μM の４種の
デオキシヌクレオチド三リン酸の存在下に、大腸菌（E.
coli)ＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフラグメント（Kl
enow) と処理することにより、平滑末端にしてもよい。
Klenow フラグメントは、４種のｄＮＴＰの存在下にお
いても、５′の突出部を二重鎖にし、３′の突出した１
本鎖をとりのぞく。望ましい場合には、粘着末端の性質
によって決まる限度内で選択したｄＮＴＰを供給するこ
とによって、選択的修復を行なうことができる。 Kleno
w で処理した後、混合物をフェノール／クロロホルムで
抽出し、エタノールで沈殿させてから Sephadex Ｇ−５
０スピンカラムに通す。適当な条件下でＳ１ヌクレアー
ゼで処理すると、すべての一本鎖部分は加水分解され
る。
pH７．６、５０mM NaCl 、６mM MgCl2 及び６mM ＤＴ
Ｔ中で、２０℃〜２５℃で約１５ないし２５分のインキ
ュベーション時間を用いて、５ないし１０μM の４種の
デオキシヌクレオチド三リン酸の存在下に、大腸菌（E.
coli)ＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフラグメント（Kl
enow) と処理することにより、平滑末端にしてもよい。
Klenow フラグメントは、４種のｄＮＴＰの存在下にお
いても、５′の突出部を二重鎖にし、３′の突出した１
本鎖をとりのぞく。望ましい場合には、粘着末端の性質
によって決まる限度内で選択したｄＮＴＰを供給するこ
とによって、選択的修復を行なうことができる。 Kleno
w で処理した後、混合物をフェノール／クロロホルムで
抽出し、エタノールで沈殿させてから Sephadex Ｇ−５
０スピンカラムに通す。適当な条件下でＳ１ヌクレアー
ゼで処理すると、すべての一本鎖部分は加水分解され
る。
【００３０】以上述べたように、オリゴヌクレオチド
を、 Metteucciら（J. Am. Chem. Soc. （１９８１）１
０３：３１８５）のトリエステル法によって、又は、市
販の自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて
製造することができる。アニーリングに先立つ、あるい
は標識化のための一本鎖のリン酸化は、５０mMトリス、
pH７．６、１０mM MgCl2、５mMジチオスレイトール、１
〜２mMＡＴＰ、１．７ pmol 32P-ATP （２．９m Ci/mmo
l)、０．１mMスペルミジン、０．１mM ＥＤＴＡの存在
下で、たとえば、０．１nmolの基質に対して、約１０ユ
ニットを用いる等の、過剰なポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて、行なうことができる。
を、 Metteucciら（J. Am. Chem. Soc. （１９８１）１
０３：３１８５）のトリエステル法によって、又は、市
販の自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて
製造することができる。アニーリングに先立つ、あるい
は標識化のための一本鎖のリン酸化は、５０mMトリス、
pH７．６、１０mM MgCl2、５mMジチオスレイトール、１
〜２mMＡＴＰ、１．７ pmol 32P-ATP （２．９m Ci/mmo
l)、０．１mMスペルミジン、０．１mM ＥＤＴＡの存在
下で、たとえば、０．１nmolの基質に対して、約１０ユ
ニットを用いる等の、過剰なポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて、行なうことができる。
【００３１】連結は、１５〜３０μｌの体積において、
以下の標準的条件及び温度で行なう：２０mMトリス−HC
l 、pH７．５、１０mMMgCl2、１０mM ＤＴＴ、３３μg
／mlＢＳＡ、１０〜５０mM NaCl 、及び１mMＡＴＰ：
０．３〜０．６（Weiss)ユニットＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ、１４℃（平滑末端連結の場合）。分子間「粘着末
端」結合は、通常、３３〜１００μg ／mlの全ＤＮＡ濃
度（５〜１００nM全末端の濃度）で行なう。分子間平滑
末端結合（通常１０〜３０倍モルの過剰なリンカーを用
いる）は、１μM の全末端の濃度で行なう。
以下の標準的条件及び温度で行なう：２０mMトリス−HC
l 、pH７．５、１０mMMgCl2、１０mM ＤＴＴ、３３μg
／mlＢＳＡ、１０〜５０mM NaCl 、及び１mMＡＴＰ：
０．３〜０．６（Weiss)ユニットＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ、１４℃（平滑末端連結の場合）。分子間「粘着末
端」結合は、通常、３３〜１００μg ／mlの全ＤＮＡ濃
度（５〜１００nM全末端の濃度）で行なう。分子間平滑
末端結合（通常１０〜３０倍モルの過剰なリンカーを用
いる）は、１μM の全末端の濃度で行なう。
【００３２】「ベクター・フラグメント」を用いるベク
ターの構築では、５′リン酸をとりのぞいてベクターの
再結合をふせぐために、通常、ベクターフラグメントを
細菌アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理する。
ＢＡＰ分解は、pH８の約１５０mMトリス中で、Na+ とMg
2+の存在下に、ベクター１μg あたり約１ユニットのＢ
ＡＰを用いて、６０℃で約一時間行なう。核酸フラグメ
ントを回収するために、生成物をフェノール／クロロホ
ルムで抽出し、エタノールで沈殿させて、 Sephadex
（登録商標）Ｇ−５０スピンカラムにかけて脱塩する。
別の方法としては、不要なフラグメントで制限酵素分解
をさらに行って、２度分解をしたベクターにおいて、再
結合をふせぐことができる。
ターの構築では、５′リン酸をとりのぞいてベクターの
再結合をふせぐために、通常、ベクターフラグメントを
細菌アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理する。
ＢＡＰ分解は、pH８の約１５０mMトリス中で、Na+ とMg
2+の存在下に、ベクター１μg あたり約１ユニットのＢ
ＡＰを用いて、６０℃で約一時間行なう。核酸フラグメ
ントを回収するために、生成物をフェノール／クロロホ
ルムで抽出し、エタノールで沈殿させて、 Sephadex
（登録商標）Ｇ−５０スピンカラムにかけて脱塩する。
別の方法としては、不要なフラグメントで制限酵素分解
をさらに行って、２度分解をしたベクターにおいて、再
結合をふせぐことができる。
【００３３】配列の修正が必要なｃＤＮＡ又はゲノムＤ
ＮＡから得たベクターの部分に対して、部位特異的プラ
イマーが作用する突然変異誘発を用いる。これは、突然
変異を誘発するべき一本鎖プラスミド又はファージＤＮ
Ａに限定されたミスマッチ以外は相補的なプライマー合
成オリゴヌクレオチドを用いて行なう。簡単に言えば、
合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、ファー
ジに相補的な鎖の合成を行ない、得られた二本鎖ＤＮＡ
をファージが生育できるホスト細菌中へ形質転換する。
形質転換した細菌培養物を上層寒天に植えて、ファージ
を含んだ単一細胞からプラークを形成させる。
ＮＡから得たベクターの部分に対して、部位特異的プラ
イマーが作用する突然変異誘発を用いる。これは、突然
変異を誘発するべき一本鎖プラスミド又はファージＤＮ
Ａに限定されたミスマッチ以外は相補的なプライマー合
成オリゴヌクレオチドを用いて行なう。簡単に言えば、
合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、ファー
ジに相補的な鎖の合成を行ない、得られた二本鎖ＤＮＡ
をファージが生育できるホスト細菌中へ形質転換する。
形質転換した細菌培養物を上層寒天に植えて、ファージ
を含んだ単一細胞からプラークを形成させる。
【００３４】理論的には、新しいプラークの５０％が一
本鎖として突然変異形態を有するファージを含み、５０
％がもとのままの配列を有する。得られたプラークは、
正対合のハイブリダイゼーションは許すがオリジナルの
鎖とミスマッチのハイブリダイズをさまたげるほど十分
である温度で、リン酸化した合成プライマーとハイブリ
ダイズさせる。そして、プローブとハイブリダイズした
プラークをとり、培養して、ＤＮＡを回収する。プローブｃＤＮＡライブラリ
本鎖として突然変異形態を有するファージを含み、５０
％がもとのままの配列を有する。得られたプラークは、
正対合のハイブリダイゼーションは許すがオリジナルの
鎖とミスマッチのハイブリダイズをさまたげるほど十分
である温度で、リン酸化した合成プライマーとハイブリ
ダイズさせる。そして、プローブとハイブリダイズした
プラークをとり、培養して、ＤＮＡを回収する。プローブｃＤＮＡライブラリ
【００３５】ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリを、コロニ
ー又はプラーク交雑法を用いてスクリーニングする。細
菌コロニー（又は組み換えファージ感染細菌）の入った
各プレートを二連のニトロセルロースフィルターペーパ
ー（Ｓ＆ＳタイプＢＡ−８５）に重複培養して、細菌コ
ロニースクリーニングのために、５０μg ／mlＡmpを含
んだＬアガー上で３７℃１４〜１６時間コロニーを成長
させた。細菌を溶解して、プラスミド又はファージ及び
ＤＮＡを、５分間、それぞれ０．２Ｎ NaOH 、１．５Ｍ
NaCl 、その後０．５ＭトリスpH７．５、１．５Ｍ NaC
l 、さらにその後２倍標準クエン酸生理食塩水（２×Ｓ
ＳＣ）で順次処理してフィルターに固定する。フィルタ
ーを風乾して８０℃で２時間ベーキングする。二連のフ
ィルターは、フィルターあたり１０mlのＤＮＡ交雑バッ
ファー（５×ＳＳＣ、pH７．０、５×Denhardt溶液（ポ
リビニルピロリジンにフィコル及びウシ血清アルブミン
を加えたもの；１×＝各０．０２％）５０mMリン酸ナト
リウムバッファー、pH７．０、０．２％ＳＤＳ、２０μ
g ／mlポリＵ、及び５０μg ／ml変性サケ***ＤＮＡ）
で、４２℃で６〜８時間、予備交雑させる。
ー又はプラーク交雑法を用いてスクリーニングする。細
菌コロニー（又は組み換えファージ感染細菌）の入った
各プレートを二連のニトロセルロースフィルターペーパ
ー（Ｓ＆ＳタイプＢＡ−８５）に重複培養して、細菌コ
ロニースクリーニングのために、５０μg ／mlＡmpを含
んだＬアガー上で３７℃１４〜１６時間コロニーを成長
させた。細菌を溶解して、プラスミド又はファージ及び
ＤＮＡを、５分間、それぞれ０．２Ｎ NaOH 、１．５Ｍ
NaCl 、その後０．５ＭトリスpH７．５、１．５Ｍ NaC
l 、さらにその後２倍標準クエン酸生理食塩水（２×Ｓ
ＳＣ）で順次処理してフィルターに固定する。フィルタ
ーを風乾して８０℃で２時間ベーキングする。二連のフ
ィルターは、フィルターあたり１０mlのＤＮＡ交雑バッ
ファー（５×ＳＳＣ、pH７．０、５×Denhardt溶液（ポ
リビニルピロリジンにフィコル及びウシ血清アルブミン
を加えたもの；１×＝各０．０２％）５０mMリン酸ナト
リウムバッファー、pH７．０、０．２％ＳＤＳ、２０μ
g ／mlポリＵ、及び５０μg ／ml変性サケ***ＤＮＡ）
で、４２℃で６〜８時間、予備交雑させる。
【００３６】サンプルを所望の厳密性（stringency) に
応じた条件下で、リン酸化したプローブと交雑させる。
代表的な中程度の厳密性条件は、４２℃の温度で２４〜
３６時間プローブを含んだ１〜５ml／フィルターのＤＮ
Ａ交雑バッファーを用いる。より高い厳密性のために
は、より高温で短時間を用いる。フィルターはそれぞれ
３７℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ及び５０mMリン酸
ナトリウムバッファー、pH７で３０分間４回洗浄した
後、２×ＳＳＣ及び０．２％ＳＤＳで２回洗浄して、風
乾し、−７０℃で２〜３日間オートラジオグラフをと
る。オリゴヌクレオチドプライマー
応じた条件下で、リン酸化したプローブと交雑させる。
代表的な中程度の厳密性条件は、４２℃の温度で２４〜
３６時間プローブを含んだ１〜５ml／フィルターのＤＮ
Ａ交雑バッファーを用いる。より高い厳密性のために
は、より高温で短時間を用いる。フィルターはそれぞれ
３７℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ及び５０mMリン酸
ナトリウムバッファー、pH７で３０分間４回洗浄した
後、２×ＳＳＣ及び０．２％ＳＤＳで２回洗浄して、風
乾し、−７０℃で２〜３日間オートラジオグラフをと
る。オリゴヌクレオチドプライマー
【００３７】所望の配列のそれぞれの鎖と交雑し、か
つ、あるプライマーから合成された伸長生成物が鋳型か
ら離れた際、もう１つのプライマーを伸長させて決まっ
た長さの核酸にする鋳型として働くような、配列上の相
対的な位置に交雑するオリゴヌクレオチドプライマーを
製造する。プライマーは、例えば、それぞれ Narang,
S. A.ら、 Meth. Enzymol.,６８、９０（１９７９）及
び Brown, E. L. ら、 Meth. Enzymol.,６８、１０９
（１９７９）が記述するホスホトリエステル法及びホス
ホジエステル法、あるいはそれらの自動化した実施例な
どのどんな適切な方法を用いても製造できる。自動化し
た方法の１つでは、ジエチルホスホアミダイトを出発物
質に用いて、 Beaucage ら（Tetrahedron Letters （１
９８１）、２２：１８５９−１８６２）の述べるように
合成できる。修正固体支持体上にオリゴヌクレオチドを
合成する１つの方法が米国特許第４，４５８，０６６号
に述べられている。生体を起源として単離したプライマ
ー（制限エンドヌクレアーゼ分解物）を用いることも可
能である。ポリメラーゼ連鎖反応増幅
つ、あるプライマーから合成された伸長生成物が鋳型か
ら離れた際、もう１つのプライマーを伸長させて決まっ
た長さの核酸にする鋳型として働くような、配列上の相
対的な位置に交雑するオリゴヌクレオチドプライマーを
製造する。プライマーは、例えば、それぞれ Narang,
S. A.ら、 Meth. Enzymol.,６８、９０（１９７９）及
び Brown, E. L. ら、 Meth. Enzymol.,６８、１０９
（１９７９）が記述するホスホトリエステル法及びホス
ホジエステル法、あるいはそれらの自動化した実施例な
どのどんな適切な方法を用いても製造できる。自動化し
た方法の１つでは、ジエチルホスホアミダイトを出発物
質に用いて、 Beaucage ら（Tetrahedron Letters （１
９８１）、２２：１８５９−１８６２）の述べるように
合成できる。修正固体支持体上にオリゴヌクレオチドを
合成する１つの方法が米国特許第４，４５８，０６６号
に述べられている。生体を起源として単離したプライマ
ー（制限エンドヌクレアーゼ分解物）を用いることも可
能である。ポリメラーゼ連鎖反応増幅
【００３８】タンパク質をコードする大量のＤＮＡを、
Mullis ら（米国特許第４，８００，１５９号）の記述
するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅技術を用いて
得ることができる。あるプライマーの伸長物は、他のプ
ライマーと交雑すると、核酸配列の生成のための鋳型と
なる。
Mullis ら（米国特許第４，８００，１５９号）の記述
するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅技術を用いて
得ることができる。あるプライマーの伸長物は、他のプ
ライマーと交雑すると、核酸配列の生成のための鋳型と
なる。
【００３９】プライマー鋳型コンプレックスは複製機能
を行なってプライマーを伸長させるＤＮＡポリメラーゼ
の基質として作用する。両プライマー伸長物に共通の領
域は、変性に際して、くりかえされるプライマー伸長の
鋳型の役割をする。
を行なってプライマーを伸長させるＤＮＡポリメラーゼ
の基質として作用する。両プライマー伸長物に共通の領
域は、変性に際して、くりかえされるプライマー伸長の
鋳型の役割をする。
【００４０】ＴaqＤＮＡポリメラーゼは増幅段階でプラ
イマーの伸長を触媒する。この酵素は好熱菌（Thermus
aquaticus)から単離した熱に安定なＤＮＡポリメラーゼ
である。高い変性温度へくりかえし加熱しても活性を失
なわないために、１度しか加える必要がない。デオキシ
ヌクレオチド三リン酸は、プライマー伸長のビルディン
グブロックを提供する。
イマーの伸長を触媒する。この酵素は好熱菌（Thermus
aquaticus)から単離した熱に安定なＤＮＡポリメラーゼ
である。高い変性温度へくりかえし加熱しても活性を失
なわないために、１度しか加える必要がない。デオキシ
ヌクレオチド三リン酸は、プライマー伸長のビルディン
グブロックを提供する。
【００４１】核酸配列鎖を、鋳型の特定部位において相
補的鎖に結合するオリゴヌクレオチドプライマーの存在
下で、分離するまで加熱する。この工程を、一連の加熱
と冷却のサイクル、すなわち鎖を分離するための加熱と
再アニーリングして配列を伸長させるための冷却を行な
いつつ続ける。サイクルをくりかえすごとに、鎖のコピ
ーがどんどん製造される。増幅を通じて、コーティング
領域及び制限部位又は翻訳シグナル（シグナル配列、出
発コドン及び／又は停止コドン）等のすべての他のプラ
イマーによってコードされる情報が得られる。ＰＣＲプ
ロトコルは、しばしば、０．５mlマイクロ遠心管で１０
０μｌのスケールで行なう。ＰＣＲのサンプルは、一本
鎖又は二本鎖のＤＮＡかＲＮＡである。出発物質がＲＮ
Ａであれば、ＰＣＲに先だって第一鎖ｃＤＮＡを作るた
めに逆転写酵素を用いる。通常、ナノグラム単位のクロ
ーン化された鋳型、マイクログラム単位までのゲノムＤ
ＮＡ、又は２０，０００の標的コピーを最適化試行を始
めるために用いる。
補的鎖に結合するオリゴヌクレオチドプライマーの存在
下で、分離するまで加熱する。この工程を、一連の加熱
と冷却のサイクル、すなわち鎖を分離するための加熱と
再アニーリングして配列を伸長させるための冷却を行な
いつつ続ける。サイクルをくりかえすごとに、鎖のコピ
ーがどんどん製造される。増幅を通じて、コーティング
領域及び制限部位又は翻訳シグナル（シグナル配列、出
発コドン及び／又は停止コドン）等のすべての他のプラ
イマーによってコードされる情報が得られる。ＰＣＲプ
ロトコルは、しばしば、０．５mlマイクロ遠心管で１０
０μｌのスケールで行なう。ＰＣＲのサンプルは、一本
鎖又は二本鎖のＤＮＡかＲＮＡである。出発物質がＲＮ
Ａであれば、ＰＣＲに先だって第一鎖ｃＤＮＡを作るた
めに逆転写酵素を用いる。通常、ナノグラム単位のクロ
ーン化された鋳型、マイクログラム単位までのゲノムＤ
ＮＡ、又は２０，０００の標的コピーを最適化試行を始
めるために用いる。
【００４２】ＰＣＲプライマーは、通常１５ないし３０
個の塩基から成るオリゴヌクレオチドであり、相補的鋳
型鎖の５′末端を決定し、配列に相補的である。鋳型と
ならない相補的５′伸長物を加えて、増幅そのものに重
大な影響を与えずに、ＰＣＲ生成物に多様な増幅後の操
作を行なうことができる。この２つのＰＣＲプライマー
は、とくにその３′末端において、互いに相補的な塩基
を３個以上持たないということが大切である。プライマ
ー内の内部二次構造は避ける必要がある。
個の塩基から成るオリゴヌクレオチドであり、相補的鋳
型鎖の５′末端を決定し、配列に相補的である。鋳型と
ならない相補的５′伸長物を加えて、増幅そのものに重
大な影響を与えずに、ＰＣＲ生成物に多様な増幅後の操
作を行なうことができる。この２つのＰＣＲプライマー
は、とくにその３′末端において、互いに相補的な塩基
を３個以上持たないということが大切である。プライマ
ー内の内部二次構造は避ける必要がある。
【００４３】ＴaqＤＮＡポリメラーゼは、３７〜５５℃
の範囲で活性があるので、プライマー伸長はアニーリン
グの段階で起こり、交雑物は安定する。プライマーの好
ましい濃度は、従来のＰＣＲと同じであり、通常０．１
ないし１μM の範囲である。
の範囲で活性があるので、プライマー伸長はアニーリン
グの段階で起こり、交雑物は安定する。プライマーの好
ましい濃度は、従来のＰＣＲと同じであり、通常０．１
ないし１μM の範囲である。
【００４４】標準的なＰＣＲのプロトコルにおいては、
各デオキシヌクレオチド三リン酸の濃度は、好ましくは
約２００μM である。４種のｄＮＴＰの濃度は、好まし
くは各ｄＮＴＰの予想されるKm以上（１０〜１５μM ）
である。
各デオキシヌクレオチド三リン酸の濃度は、好ましくは
約２００μM である。４種のｄＮＴＰの濃度は、好まし
くは各ｄＮＴＰの予想されるKm以上（１０〜１５μM ）
である。
【００４５】好ましくは、ＰＣＲバッファーは、約５０
０mM塩化カリウム、１００mMトリス−HCl （室温でpH
８．３）、１５mM塩化マグネシウム及び０．０１％（w/
v)ゼラチンから成る。全体で０．８mMの濃度のｄＮＴＰ
の存在下に、１．５ないし４mMの範囲で少量ずつ滴定を
つづけて、特定の生成物の最大収量をもたらすマグネシ
ウム濃度にする。遊離でマグネシウムが少なすぎるとＰ
ＣＲ生成物は全く得られず、遊離マグネシウムが過剰で
あると多様な望ましくない生成物が生じる。
０mM塩化カリウム、１００mMトリス−HCl （室温でpH
８．３）、１５mM塩化マグネシウム及び０．０１％（w/
v)ゼラチンから成る。全体で０．８mMの濃度のｄＮＴＰ
の存在下に、１．５ないし４mMの範囲で少量ずつ滴定を
つづけて、特定の生成物の最大収量をもたらすマグネシ
ウム濃度にする。遊離でマグネシウムが少なすぎるとＰ
ＣＲ生成物は全く得られず、遊離マグネシウムが過剰で
あると多様な望ましくない生成物が生じる。
【００４６】好ましくは、１００μｌの反応容量におい
て、２．０ないし２．５ユニットのＴaqＤＮＡポリメラ
ーゼがよい。酵素は多くの反応のために用意した新しい
マスター・ミックスに適宜加えることができ、こうし
て、各チューブにそれぞれの０．５μｌ酵素液を加える
ことに伴なう精度の問題を避けることができる。ＤＮＡ
鋳型の増幅のための通常のＰＣＲプロトコルは、１分間
９４℃の変性ステップ、１分間３７℃のプライマー・ア
ニーリングステップ、及び２分間７２℃のプライマー伸
長ステップがある。これによって５００bpの生成物が、
２５サイクルで少なくとも１００，０００倍に増幅され
る。
て、２．０ないし２．５ユニットのＴaqＤＮＡポリメラ
ーゼがよい。酵素は多くの反応のために用意した新しい
マスター・ミックスに適宜加えることができ、こうし
て、各チューブにそれぞれの０．５μｌ酵素液を加える
ことに伴なう精度の問題を避けることができる。ＤＮＡ
鋳型の増幅のための通常のＰＣＲプロトコルは、１分間
９４℃の変性ステップ、１分間３７℃のプライマー・ア
ニーリングステップ、及び２分間７２℃のプライマー伸
長ステップがある。これによって５００bpの生成物が、
２５サイクルで少なくとも１００，０００倍に増幅され
る。
【００４７】ＤＮＡ変性中に、サンプルが熱平衡に達す
るのに十分な時間を与えなければならない。ほとんどの
サンプルに対して有効な変性温度の実用的範囲は、９２
〜９５℃であり、標準的な選択は９４℃である。
るのに十分な時間を与えなければならない。ほとんどの
サンプルに対して有効な変性温度の実用的範囲は、９２
〜９５℃であり、標準的な選択は９４℃である。
【００４８】プライマーのアニーリングは、通常、まず
３７℃で行なって、生成物の特異性を見積もる。望まし
くないバンドが見られるならば、その後の最適化を行な
う際に、アニーリング温度を高くする。プライマーのア
ニーリング温度の範囲は、たいていは３７〜５５℃であ
るが、場合によっては、伸長温度まで高くしてもよい。
プライマー・アニーリングとプライマー伸長のステップ
がひとつになれば、ＰＣＲ工程は２ステップとなる。
３７℃で行なって、生成物の特異性を見積もる。望まし
くないバンドが見られるならば、その後の最適化を行な
う際に、アニーリング温度を高くする。プライマーのア
ニーリング温度の範囲は、たいていは３７〜５５℃であ
るが、場合によっては、伸長温度まで高くしてもよい。
プライマー・アニーリングとプライマー伸長のステップ
がひとつになれば、ＰＣＲ工程は２ステップとなる。
【００４９】ほとんどの適用において、プライマー伸長
は７２℃の温度で十分に生じ、めったに最適化を必要と
しない。２ステップ温度のＰＣＲ工程では、温度範囲は
６５〜７０℃でよい。後期のサイクルで酵素濃度が増幅
を制限するような状態では、好ましくは、伸長はサイク
ル数に比例して増加する。通常、特定のターゲットの大
量の増幅（たとえば１，０００，０００倍）には、２５
ないし４５サイクルが必要である。形質転換
は７２℃の温度で十分に生じ、めったに最適化を必要と
しない。２ステップ温度のＰＣＲ工程では、温度範囲は
６５〜７０℃でよい。後期のサイクルで酵素濃度が増幅
を制限するような状態では、好ましくは、伸長はサイク
ル数に比例して増加する。通常、特定のターゲットの大
量の増幅（たとえば１，０００，０００倍）には、２５
ないし４５サイクルが必要である。形質転換
【００５０】用いるホスト細胞に応じて、その細胞に適
した標準的技術を用いて形質転換を行なう。カルシウム
処理には、 Cohen, S. N.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA
（１９７２）６９：２１１０）の記述するように塩化カ
ルシウムを用いるか、あるいは、 Maniatis ら ("Molec
ular Cloning ： A Laboratory Manual （「分子クロー
ニング・実験マニュアル」）（１９８２）Cold Spring
Harbor Press ｐ２５４）の述べているＲｂCl法を、原
核生物又は堅固な細胞壁バリアーを持つ他の細胞に用い
る。アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens)
による感染（Shaw. C. H. ら Gene(１９８３）２３：３
１５）を、ある種の植物細胞に用いる。このような細胞
壁を有さない哺乳類の細胞には、 Graham 及び Vander
Eb(Virology （１９７８）５２：５４６）のリン酸カル
シウム沈殿法が好ましい。イーストへの形質転換は、Va
n SolingenP. ら(J. Bacter. （１９７７）１３０：９
４６）及び Hsiao. C. L. ら (Proc. Natl. Acad.Sci.
USA（１９７９）７６：３８２９）らの方法に従がって
実行する。実施例４では、組み換えＬＡＰＰの製造に好
ましいイースト発現系について述べる。
した標準的技術を用いて形質転換を行なう。カルシウム
処理には、 Cohen, S. N.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA
（１９７２）６９：２１１０）の記述するように塩化カ
ルシウムを用いるか、あるいは、 Maniatis ら ("Molec
ular Cloning ： A Laboratory Manual （「分子クロー
ニング・実験マニュアル」）（１９８２）Cold Spring
Harbor Press ｐ２５４）の述べているＲｂCl法を、原
核生物又は堅固な細胞壁バリアーを持つ他の細胞に用い
る。アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens)
による感染（Shaw. C. H. ら Gene(１９８３）２３：３
１５）を、ある種の植物細胞に用いる。このような細胞
壁を有さない哺乳類の細胞には、 Graham 及び Vander
Eb(Virology （１９７８）５２：５４６）のリン酸カル
シウム沈殿法が好ましい。イーストへの形質転換は、Va
n SolingenP. ら(J. Bacter. （１９７７）１３０：９
４６）及び Hsiao. C. L. ら (Proc. Natl. Acad.Sci.
USA（１９７９）７６：３８２９）らの方法に従がって
実行する。実施例４では、組み換えＬＡＰＰの製造に好
ましいイースト発現系について述べる。
【００５１】実施例４ １４７アミノ酸ヒル抗血小板タンパク質（ＬＡＰＰ）の
核酸配列および全アミノ酸配列の同定およびその形質転
換サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevi
siae) 中での発現 に基づく変性オリゴヌクレオチドを用いてライブラリー
をＰＣＲ増幅する。 スクリーニングに用いる。ポジラィブなクローンをプラ
ーク純化
核酸配列および全アミノ酸配列の同定およびその形質転
換サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevi
siae) 中での発現 に基づく変性オリゴヌクレオチドを用いてライブラリー
をＰＣＲ増幅する。 スクリーニングに用いる。ポジラィブなクローンをプラ
ーク純化
【００５２】ヒル（Haementeria officinalis)から切断
した唾液腺より全ヒル唾液腺ＲＮＡを、Han, Jら(Bioch
emistry ２６，１６１７（１９８７））の方法によって
得た。ポリＡ+ ＲＮＡは、Maniatis, T.ら("Molecular
Cloning ： A Laboratory Manual" （「分子クローニン
グ：実験マニュアル」）Cold Spving Harbor Laborator
y, cold Spring Harbor, NY １９８２）に従がって単離
した。
した唾液腺より全ヒル唾液腺ＲＮＡを、Han, Jら(Bioch
emistry ２６，１６１７（１９８７））の方法によって
得た。ポリＡ+ ＲＮＡは、Maniatis, T.ら("Molecular
Cloning ： A Laboratory Manual" （「分子クローニン
グ：実験マニュアル」）Cold Spving Harbor Laborator
y, cold Spring Harbor, NY １９８２）に従がって単離
した。
【００５３】単離したポリＡ+ ＲＮＡから、 Han, J ら
（Nucleic Acids Reserch １５，６３０４（１９８
７））に従がって、λgt２２発現−ｃＤＮＡライブラリ
ーを構成した。２種のバクテリオファージＲＮＡポリメ
ラーゼプロモーター、ＳＰ６とＴ７を二重鎖ｃＤＮＡに
導入して、λgt２２のＳalＩ及びＮotＩ部位へ一方向で
クローニングした。約２×１０6 コの一次の独立なｃＤ
ＮＡクローンが得られた。
（Nucleic Acids Reserch １５，６３０４（１９８
７））に従がって、λgt２２発現−ｃＤＮＡライブラリ
ーを構成した。２種のバクテリオファージＲＮＡポリメ
ラーゼプロモーター、ＳＰ６とＴ７を二重鎖ｃＤＮＡに
導入して、λgt２２のＳalＩ及びＮotＩ部位へ一方向で
クローニングした。約２×１０6 コの一次の独立なｃＤ
ＮＡクローンが得られた。
【００５４】λgt２２ライブラリのスクリーニングを、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で作ったプローブを用
いて行なった。このプローブは、λgt２２の１つのアー
ム（挿入したｃＤＮＡの５′末端）に結合するオリゴヌ
クレオチドプライマーと、分子量１６，０００のヒル抗
血小板タンパク質のＶ８分解物からのペプチド配列に基
づいた第２の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用い
て、λgt２２ライブラリから単離した全ＤＮＡをＰＣＲ
増幅して作った。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で作ったプローブを用
いて行なった。このプローブは、λgt２２の１つのアー
ム（挿入したｃＤＮＡの５′末端）に結合するオリゴヌ
クレオチドプライマーと、分子量１６，０００のヒル抗
血小板タンパク質のＶ８分解物からのペプチド配列に基
づいた第２の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用い
て、λgt２２ライブラリから単離した全ＤＮＡをＰＣＲ
増幅して作った。
【００５５】λgt２２の腕に結合するオリゴヌクレオチ
ドの配列は、配列番号５（シーケンスＩＤ No. ５）で
ある。ペプチド配列に基づく縮重オリゴヌクレオチドの
配列は、配列番号６、７、８及び９である。オリゴヌク
レオチドプライマーは、ヒル抗血小板凝集タンパク質由
来の配列番号１０のタンパク質をコーディングするＤＮ
Ａ配列の相補体である。ＰＣＲ反応は、 Innis, M. A.
ら("PCR Protocols ；A Guide to Methods and Applica
tions"(「ＰＣＲプロトコル：方法と適用の手引」） Ac
ademic Press. San Diego. CA１９９０）が記述するよ
うに行なった。これら２種のオリゴヌクレオチドのＰＣ
Ｒ生成物をアガロースゲル上で電気泳動すると、約５０
０bpのＤＮＡフラグメントであった。この生成物を標準
的方法で配列決定して、オリゴヌクレオチドに基づくペ
プチド配列及びオリゴヌクレオチドプライマーに隣接す
るペプチド配列の両方をコーディングすることを確かめ
た。
ドの配列は、配列番号５（シーケンスＩＤ No. ５）で
ある。ペプチド配列に基づく縮重オリゴヌクレオチドの
配列は、配列番号６、７、８及び９である。オリゴヌク
レオチドプライマーは、ヒル抗血小板凝集タンパク質由
来の配列番号１０のタンパク質をコーディングするＤＮ
Ａ配列の相補体である。ＰＣＲ反応は、 Innis, M. A.
ら("PCR Protocols ；A Guide to Methods and Applica
tions"(「ＰＣＲプロトコル：方法と適用の手引」） Ac
ademic Press. San Diego. CA１９９０）が記述するよ
うに行なった。これら２種のオリゴヌクレオチドのＰＣ
Ｒ生成物をアガロースゲル上で電気泳動すると、約５０
０bpのＤＮＡフラグメントであった。この生成物を標準
的方法で配列決定して、オリゴヌクレオチドに基づくペ
プチド配列及びオリゴヌクレオチドプライマーに隣接す
るペプチド配列の両方をコーディングすることを確かめ
た。
【００５６】このＰＣＲ生成物を標準的プロトコルを用
いて放射線で標識化した後、ハイブリダイゼーションに
よってλライブラリにおいて全遺伝子をコードするｃＤ
ＮＡクローンをスクリーニングするのに用いた。まずプ
ラーク純化したクローンを単離した。Maniatis, T ら("
Molecular Cloning ： A Laboratory Manual（「分子ク
ローニング：実験マニュアル」), Cold Spving Harbor
Laboratory, cold Spring Harbor, NY １９８２）に従
がって、ＤＮＡをλクローンから単離した。このＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼＮot 1及びＳal 1で分離し
て、アガロースゲル上で電気泳動した。約７００bpのバ
ンドをゲルから切り取って電気溶出した。大腸菌(E. co
li) プラスミド（Bluescript SK. Stratagene, LaJoll
a, CA) を制限エンドヌクレアーゼＮot 1とＳal 1で切
断し（第２図）、λクローンからの７００bpフラグメン
トをこのベクターにサブクローニングした。その後、サ
ブクローニングしたフラグメントを、標準的技術を用い
て配列決定した。
いて放射線で標識化した後、ハイブリダイゼーションに
よってλライブラリにおいて全遺伝子をコードするｃＤ
ＮＡクローンをスクリーニングするのに用いた。まずプ
ラーク純化したクローンを単離した。Maniatis, T ら("
Molecular Cloning ： A Laboratory Manual（「分子ク
ローニング：実験マニュアル」), Cold Spving Harbor
Laboratory, cold Spring Harbor, NY １９８２）に従
がって、ＤＮＡをλクローンから単離した。このＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼＮot 1及びＳal 1で分離し
て、アガロースゲル上で電気泳動した。約７００bpのバ
ンドをゲルから切り取って電気溶出した。大腸菌(E. co
li) プラスミド（Bluescript SK. Stratagene, LaJoll
a, CA) を制限エンドヌクレアーゼＮot 1とＳal 1で切
断し（第２図）、λクローンからの７００bpフラグメン
トをこのベクターにサブクローニングした。その後、サ
ブクローニングしたフラグメントを、標準的技術を用い
て配列決定した。
【００５７】ＬＡＰＰ ｍＲＮＡはひとつの長いオープ
ンリーディングフレームとその後につづくpolyA 部位を
持つ。このオープンリーディングフレームをコンピュー
ターで翻訳すると、１４７個のアミノ酸のタンパク質で
あった。この配列中に、タンパク質配列決定で同定され
た５つのペプチド配列が見い出された。約２１個の疎水
性アミノ酸から成るリーダーペプチド配列も見られた。
コンピューター分析によると、ペプチダーゼ切断部位は
残基２１と２２の間であり、残基２２のＧlnに始まる１
２５個のアミノ酸の成熟タンパク質を与えると予測され
た。
ンリーディングフレームとその後につづくpolyA 部位を
持つ。このオープンリーディングフレームをコンピュー
ターで翻訳すると、１４７個のアミノ酸のタンパク質で
あった。この配列中に、タンパク質配列決定で同定され
た５つのペプチド配列が見い出された。約２１個の疎水
性アミノ酸から成るリーダーペプチド配列も見られた。
コンピューター分析によると、ペプチダーゼ切断部位は
残基２１と２２の間であり、残基２２のＧlnに始まる１
２５個のアミノ酸の成熟タンパク質を与えると予測され
た。
【００５８】この１４７個のアミノ酸配列とそれに対応
するＤＮＡクローンを、それぞれ配列番号１と配列番号
２に示す。１２５個のアミノ酸配列とそれに対応するＤ
ＮＡクローンを、それぞれ配列番号３と配列番号４に示
す。
するＤＮＡクローンを、それぞれ配列番号１と配列番号
２に示す。１２５個のアミノ酸配列とそれに対応するＤ
ＮＡクローンを、それぞれ配列番号３と配列番号４に示
す。
【００５９】次にコンピューターで予測した成熟タンパ
ク質を、発現ベクターｐＫＨ４α２のＫex切断部位を用
いてイースト中に発現させた。基質としてブルースクリ
プトベクター中のサブクローニングした７００bpフラグ
メントを用い、配列番号１１と１２のオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いてＤＮＡフラグメントをＰＣＲ生成
することによって、成熟遺伝子を単離した。
ク質を、発現ベクターｐＫＨ４α２のＫex切断部位を用
いてイースト中に発現させた。基質としてブルースクリ
プトベクター中のサブクローニングした７００bpフラグ
メントを用い、配列番号１１と１２のオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いてＤＮＡフラグメントをＰＣＲ生成
することによって、成熟遺伝子を単離した。
【００６０】ポリメラーゼ連続反応の結果、平滑末端の
フラグメントを得て、これをＢamＨＩによって分解する
通常の方法で再生した。１％アガロースゲル上での電気
泳動、バンドの切り取り、及び電気溶出をして、正しい
フラグメントを得た。精製したフラグメントを、あらか
じめＢamＨＩで分解して仔ウシアルカリ性ホスファター
ゼで処理しておいたｐＫＨ４α２（Jacobson, M. A. ら
（１９８９）Gene８５：５１３〜５１８）に連結してイ
ースト発現ベクターｐＫＨ４α２・ＬＡＰＰ（図１）を
形成した。このｐＫＨ４α２・ＬＡＰＰが、本発明のタ
ンパク質を製造する。正しく配向した正しいプラスミド
クローンの配列であることを、ＤＮＡ配列分析で確認し
た。こうして作った融合生成物は、ＫＥＸ２遺伝子がコ
ードするＬys−Ａrg−切断エンドペプチダーゼ（ＫＥＸ
２）によりタンパク質分解されてプロセシングされ、生
成物は培地に分泌される。ＫＥＸ２は、Ｌys−Ａrg残基
のＣ末端側を切断する。
フラグメントを得て、これをＢamＨＩによって分解する
通常の方法で再生した。１％アガロースゲル上での電気
泳動、バンドの切り取り、及び電気溶出をして、正しい
フラグメントを得た。精製したフラグメントを、あらか
じめＢamＨＩで分解して仔ウシアルカリ性ホスファター
ゼで処理しておいたｐＫＨ４α２（Jacobson, M. A. ら
（１９８９）Gene８５：５１３〜５１８）に連結してイ
ースト発現ベクターｐＫＨ４α２・ＬＡＰＰ（図１）を
形成した。このｐＫＨ４α２・ＬＡＰＰが、本発明のタ
ンパク質を製造する。正しく配向した正しいプラスミド
クローンの配列であることを、ＤＮＡ配列分析で確認し
た。こうして作った融合生成物は、ＫＥＸ２遺伝子がコ
ードするＬys−Ａrg−切断エンドペプチダーゼ（ＫＥＸ
２）によりタンパク質分解されてプロセシングされ、生
成物は培地に分泌される。ＫＥＸ２は、Ｌys−Ａrg残基
のＣ末端側を切断する。
【００６１】図１は、ｒ−ＬＡＰＰ合成遺伝子配列の発
現に用いる、イーストプラスミド発現ベクターｐＫＨ４
α２・ＬＡＰＰの構成を示す。示されているのは、 ＬＡＰＰ オープンリーディングフレーム α−交配因子遺伝子配列 ２μサークル配列 ｐＢＲ３２２配列 leu ２d 遺伝子配列 ＧＡＬ１０プロモーター配列
現に用いる、イーストプラスミド発現ベクターｐＫＨ４
α２・ＬＡＰＰの構成を示す。示されているのは、 ＬＡＰＰ オープンリーディングフレーム α−交配因子遺伝子配列 ２μサークル配列 ｐＢＲ３２２配列 leu ２d 遺伝子配列 ＧＡＬ１０プロモーター配列
【００６２】α−交配因子前駆体をグリシン７９におい
てＬＡＰＰに結合している７個のアミノ酸からなる連結
ペプチドに対応する、コーディング配列の領域が示され
ている。また、ＫＥＸ２プロテアーゼにより認識され
る、予想した切断部位が示されている。サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae
BJ １９９５）の形質転換
てＬＡＰＰに結合している７個のアミノ酸からなる連結
ペプチドに対応する、コーディング配列の領域が示され
ている。また、ＫＥＸ２プロテアーゼにより認識され
る、予想した切断部位が示されている。サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae
BJ １９９５）の形質転換
【００６３】ディプロイドであるイースト株（Saccharo
myces cerevisiae BJ １９９５、Gardell ら，Arch. Bi
ochem. Biophys. vol.２７８、No. ２，pp. ４６７〜４
７４（１９９０））を、標準的なプロトコル（Hinnen
ら，（１９７８） Proc. Natl.Acad. Sci. USA ７５：
１９２９〜１９３３）を用いて、ｐＫＨ４α２・ＬＡＰ
Ｐで形質転換した。
myces cerevisiae BJ １９９５、Gardell ら，Arch. Bi
ochem. Biophys. vol.２７８、No. ２，pp. ４６７〜４
７４（１９９０））を、標準的なプロトコル（Hinnen
ら，（１９７８） Proc. Natl.Acad. Sci. USA ７５：
１９２９〜１９３３）を用いて、ｐＫＨ４α２・ＬＡＰ
Ｐで形質転換した。
【００６４】イースト形質転換体を入れたプレートか
ら、シングルコロニーを単離した。これらの単離株を５
×Ｌeu- 選択培地（５×Ｌeu- ) （Jacobson, M. A.
ら、Gene８５，（１９８９））で生育させた。培養物を
４％（ｗ／ｖ）ガラクトースを含む５×Ｌeu- 培地でイ
ンキュベートして発現を行なわせる前に、ロータリー振
とう培養器を用いて３００rpm で、２８℃で１６〜１８
時間、２リットル、エーレンマイヤーフラスコ中で生育
させた。２４時間後、得られたＬＡＰＰを含んだ培地
を、細胞をペレットにすることによって細胞から分離し
た。
ら、シングルコロニーを単離した。これらの単離株を５
×Ｌeu- 選択培地（５×Ｌeu- ) （Jacobson, M. A.
ら、Gene８５，（１９８９））で生育させた。培養物を
４％（ｗ／ｖ）ガラクトースを含む５×Ｌeu- 培地でイ
ンキュベートして発現を行なわせる前に、ロータリー振
とう培養器を用いて３００rpm で、２８℃で１６〜１８
時間、２リットル、エーレンマイヤーフラスコ中で生育
させた。２４時間後、得られたＬＡＰＰを含んだ培地
を、細胞をペレットにすることによって細胞から分離し
た。
【００６５】寄託 形質転換したイースト株（Saccharomyces cerevisiae
ｐＫＨ４−ＬＡＰＰ−ＢＪ１９９５）は、 American Ty
pe Culture Collection(Rockville, MD.USA)に寄託さ
れ、ＡＴＣＣ７４０２０として登録された。この寄託
は、特許手続及びその規制を目的とする微生物寄託に関
する国際承認についてのブタペスト条約の規定に基づい
て、１９９０年９月２７日に行なわれた（ブタペスト条
約）。増殖可能な培養株の管理は、寄託後３０年間保証
される。微生物は、ブタペスト条約の定めるところによ
ってＡＴＣＣにより入手可能であり、また出願人とＡＴ
ＣＣとの同意により関連する米国特許の発行後は無制約
に入手可能となる。寄託された株の入手は、その特許法
に従がうあらゆる政府の権威の下に保証される権利に反
して本発明を行使できる許可を意味しない。
ｐＫＨ４−ＬＡＰＰ−ＢＪ１９９５）は、 American Ty
pe Culture Collection(Rockville, MD.USA)に寄託さ
れ、ＡＴＣＣ７４０２０として登録された。この寄託
は、特許手続及びその規制を目的とする微生物寄託に関
する国際承認についてのブタペスト条約の規定に基づい
て、１９９０年９月２７日に行なわれた（ブタペスト条
約）。増殖可能な培養株の管理は、寄託後３０年間保証
される。微生物は、ブタペスト条約の定めるところによ
ってＡＴＣＣにより入手可能であり、また出願人とＡＴ
ＣＣとの同意により関連する米国特許の発行後は無制約
に入手可能となる。寄託された株の入手は、その特許法
に従がうあらゆる政府の権威の下に保証される権利に反
して本発明を行使できる許可を意味しない。
【００６６】療法 本発明のタンパク質性物質は、コラーゲンによる血小板
凝集をブロックするものであり、あらゆる無毒性の有機
又は無機の酸とともに薬剤用の塩を形成する。適当な塩
を形成する無機酸の例としては、塩酸、臭化水素、硫
酸、リン酸、及びオルトリン酸１水素ナトリウムや硫酸
水素カリウム等の酸性金属塩がある。適当な塩を形成す
る有機酸の例としては、モノ、ジ及びトリカルボン酸が
ある。そのような酸には、たとえば、酢酸、グリコール
酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル
酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコル
ビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香
酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、サ
リチル酸、２−フェノキシ安息香酸、及び、メタンスル
ホン酸や２−ヒドロキシエタンスルホン酸等のスルホン
酸がある。カルボキシ末端のアミノ酸部分の塩には、あ
らゆる適当な無機又は有機塩基とともに形成した無毒性
カルボン酸塩が含まれる。これらの塩の例としては、た
とえばナトリウムやカリウム等のアルカリ金属との塩、
カルシウムやマグネシウム等のアルカリ土類金属との
塩、アルミニウムを含むIII Ａ族の軽金属との塩、ま
た、有機第一級、二級及び三級アミン、たとえば、トリ
エチルアミンを含むトリアルキルアミン、プロカイン、
ジベンジルアミン、１−エテンアミン；Ｎ，Ｎ′−ジベ
ンジルエチレンジアミン、ジヒドロアビエチルアミン、
Ｎ−（低級）アルキルピペリジン及び他の適当なアミン
がある。
凝集をブロックするものであり、あらゆる無毒性の有機
又は無機の酸とともに薬剤用の塩を形成する。適当な塩
を形成する無機酸の例としては、塩酸、臭化水素、硫
酸、リン酸、及びオルトリン酸１水素ナトリウムや硫酸
水素カリウム等の酸性金属塩がある。適当な塩を形成す
る有機酸の例としては、モノ、ジ及びトリカルボン酸が
ある。そのような酸には、たとえば、酢酸、グリコール
酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル
酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコル
ビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香
酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、サ
リチル酸、２−フェノキシ安息香酸、及び、メタンスル
ホン酸や２−ヒドロキシエタンスルホン酸等のスルホン
酸がある。カルボキシ末端のアミノ酸部分の塩には、あ
らゆる適当な無機又は有機塩基とともに形成した無毒性
カルボン酸塩が含まれる。これらの塩の例としては、た
とえばナトリウムやカリウム等のアルカリ金属との塩、
カルシウムやマグネシウム等のアルカリ土類金属との
塩、アルミニウムを含むIII Ａ族の軽金属との塩、ま
た、有機第一級、二級及び三級アミン、たとえば、トリ
エチルアミンを含むトリアルキルアミン、プロカイン、
ジベンジルアミン、１−エテンアミン；Ｎ，Ｎ′−ジベ
ンジルエチレンジアミン、ジヒドロアビエチルアミン、
Ｎ−（低級）アルキルピペリジン及び他の適当なアミン
がある。
【００６７】コラーゲンによる血小板凝集刺激をブロッ
クする本発明のタンパク質性物質が抗血栓症作用を有す
る血中濃度は、約１００nM（すなわち１．６μg ／ml）
である。
クする本発明のタンパク質性物質が抗血栓症作用を有す
る血中濃度は、約１００nM（すなわち１．６μg ／ml）
である。
【００６８】抗血液凝固療法とは、多様な血栓性の状
態、とくに冠状動脈や脳血管の疾患の治療及び予防を言
う。この分野に経験を有する者は、容易に、抗血液凝固
療法を必要とする状況がわかる。ここに用いる「患者」
とは、ヒトを含めた霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブ
タ、イヌ、ネコ、ラット及びハツカネズミである。
態、とくに冠状動脈や脳血管の疾患の治療及び予防を言
う。この分野に経験を有する者は、容易に、抗血液凝固
療法を必要とする状況がわかる。ここに用いる「患者」
とは、ヒトを含めた霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブ
タ、イヌ、ネコ、ラット及びハツカネズミである。
【００６９】本発明のタンパク質性物質は経口投与後の
腸からの吸収を経たあとも効果を失なわないが、出願者
らがより好ましいとするものは非経口投与、たとえば、
皮下、静脈内、筋肉内又は腹腔内の投与、デポ注射によ
る投与、あるいはインプラント処方である。
腸からの吸収を経たあとも効果を失なわないが、出願者
らがより好ましいとするものは非経口投与、たとえば、
皮下、静脈内、筋肉内又は腹腔内の投与、デポ注射によ
る投与、あるいはインプラント処方である。
【００７０】非経口投与のためには、本発明のタンパク
質性物質を、水や油類のように滅菌できる薬剤用担体を
用いた生体に使用可能な希釈液として、さらに表面活性
剤や他の薬剤用アジュバントを加えて、又は加えずに、
注射用の溶液又は懸濁液の投与形態で投与できる。これ
らの処方に用いることのできる油類の例としては、石油
類、動物性、植物性又は合成油類、たとえば、ラッカセ
イ油、大豆油、及び鉱物油が含まれる。一般に、水、塩
類溶液、デキストロース水溶液及びそれに類した糖の溶
液、エタノール、及び、プロピレングリコールやポリエ
チレングリコール等のグリコール類が好ましい液体担体
であるが、とりわけ注射用溶液に好ましい。
質性物質を、水や油類のように滅菌できる薬剤用担体を
用いた生体に使用可能な希釈液として、さらに表面活性
剤や他の薬剤用アジュバントを加えて、又は加えずに、
注射用の溶液又は懸濁液の投与形態で投与できる。これ
らの処方に用いることのできる油類の例としては、石油
類、動物性、植物性又は合成油類、たとえば、ラッカセ
イ油、大豆油、及び鉱物油が含まれる。一般に、水、塩
類溶液、デキストロース水溶液及びそれに類した糖の溶
液、エタノール、及び、プロピレングリコールやポリエ
チレングリコール等のグリコール類が好ましい液体担体
であるが、とりわけ注射用溶液に好ましい。
【００７１】本発明のタンパク質性物質は、活性成分の
持維的放出を可能にするために処方されるデポ注射やイ
ンプラント処方の形態で投与することができる。活性成
分をペレット又は小型の円筒に圧縮して、デポ注射かイ
ンプラントとして、皮下又は筋肉内に植えつける。イン
プラントには生体内で分解可能なポリマー又は合成シリ
コン、たとえばシラスティック、シリコンゴム又はダウ
コーニング社製の他のポリマー等の不活性物質を用いて
よい。
持維的放出を可能にするために処方されるデポ注射やイ
ンプラント処方の形態で投与することができる。活性成
分をペレット又は小型の円筒に圧縮して、デポ注射かイ
ンプラントとして、皮下又は筋肉内に植えつける。イン
プラントには生体内で分解可能なポリマー又は合成シリ
コン、たとえばシラスティック、シリコンゴム又はダウ
コーニング社製の他のポリマー等の不活性物質を用いて
よい。
【００７２】 配列番号：１ 配列の長さ：１４７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Haementeria officinalis 組織の種類：唾液腺 その他の情報：ヒル血小板凝集阻害タンパク質 配列：
【化１】
【００７３】配列番号：２ 配列の長さ：４４１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 起源 生物名：Haementeria officinalis 組織の種類：唾液腺 直接の起源 ライブラリー名：ヒルλgt２２ その他の情報：ヒル血小板凝集阻害タンパク質をコード
する配列 配列：
する配列 配列：
【化２】
【００７４】 配列番号：３ 配列の長さ：１２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Haementeria officinalis 組織の種類：唾液腺 その他の情報：ヒル血小板凝集阻害タンパク質の成熟型 配列：
【化３】
【００７５】 配列番号：４ 配列の長さ：３７８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Haementeria officinalis 組織の種類：唾液腺 その他の情報：ヒル血小板凝集阻害タンパク質の成熟型
をコードする配列 配列：
をコードする配列 配列：
【化４】
【００７６】 配列番号：５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） その他の情報：λgt２２アームに結合するプライマー
【化５】
【００７７】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） その他の情報：配列番号１０の蛋白質をコードするＤＮ
Ａに相補的な縮重プライマー 配列：
Ａに相補的な縮重プライマー 配列：
【化６】
【００７８】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） その他の情報：配列番号１０の蛋白質をコードするＤＮ
Ａに相補的な縮重プライマー 配列：
Ａに相補的な縮重プライマー 配列：
【化７】
【００７９】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） その他の情報：配列番号１０の蛋白質をコードするＤＮ
Ａに相補的な縮重プライマー 配列：
Ａに相補的な縮重プライマー 配列：
【化８】
【００８０】配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） その他の情報：配列番号１０の蛋白質をコードするＤＮ
Ａに相補的な縮重プライマー 配列：
Ａに相補的な縮重プライマー 配列：
【化９】
【００８１】配列番号：１０ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：Haementeria officinalis 組織の種類：唾液腺 その他の情報：ヒル血小板凝集阻害タンパク質の一部 配列：
【化１０】
【００８２】配列番号：１１ 配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 配列の種類：その他の核酸（合成ＤＮＡ） トポロジー：直鎖状 その他の情報：プライマー 配列：
【化１１】
【００８３】配列番号：１２ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 配列の種類：その他の核酸（合成ＤＮＡ） トポロジー：直鎖状 その他の情報：プライマー 配列：
【化１２】
【図１】ｒ−ＬＡＰＰ合成遺伝子配列の発現に用いるイ
ーストベクターを示す図である。
ーストベクターを示す図である。
【図２】ＬＡＰＰクローンの製造のフローチャートを示
す図である。
す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 3/02 3/20 3/24 13/00 ＺＮＡ 7731−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ポール エム．ケラー アメリカ合衆国，19446 ペンシルヴアニ ア，ランスデール，スプリング ヴアレー ロード 2057
Claims (15)
- 【請求項１】 分子量約１６，０００を有し、コラーゲ
ンにより刺激される血小板凝集を阻害することができ
る、生化学的に純粋なタンパク質であって、該タンパク
質はヒル（Haementeria officinalis)の唾液腺に由来す
る。 - 【請求項２】 以下の工程： ａ）ヒルの唾液腺組織を切断して取り出す； ｂ）ホモジネートを作るための適当な一定のpHを有する
緩衝塩を含む水溶液中に、前記組織をホモジナイズして
可溶化する； ｃ）ホモジネートを遠心分離して、上澄みのタンパク質
懸濁フラクションを作る； ｄ）フラクションをアッセイして、コラーゲンにより刺
激される血小板凝集を阻害する特性を有する生成物フラ
クションを選択する； ｃ）この上澄のフラクションを、pH７．８のＨＥＰＥＳ
バッファー及び１０mMCaCl2で平衡化したヘパリンアガ
ロースのアフィニティーカラムにのせる； ｆ）カラムに吸着するタンパク質を含むフラクション
と、カラムに吸着しないタンパク質を含むフラクション
を分離する； ｇ）吸着したフラクションから、コラーゲンにより刺激
される血小板凝集を阻害することのできるタンパク質を
選択する、からなるヒル（Haementeria officinalis)の
唾液腺に由来し、コラーゲンにより刺激される血小板凝
集を阻害することができるタンパク質の製造工程。 - 【請求項３】 生成物フラクションがインビトロでのコ
ラーゲンにより刺激される血小板凝集阻害作用を有する
ことを特徴とする、請求項２の生成物。 - 【請求項４】 生成物フラクションがインビトロでの血
小板のコラーゲンへの粘着ブロック作用を有することを
特徴とする、請求項２の生成物。 - 【請求項５】 哺乳類に対して、治療効果のある服用量
の生化学的に純粋な請求項１のタンパク質を投与するこ
とから成る、コラーゲンにより刺激される血小板凝集阻
害を目的とした、哺乳類の治療方法。 - 【請求項６】 配列番号１又はその保存的アミノ酸置換
物のアミノ酸配列を有する、請求項１のタンパク質。 - 【請求項７】 配列番号３又はその保存的アミノ酸置換
物のアミノ酸配列を有する、請求項１のタンパク質。 - 【請求項８】 有効量の請求項１のタンパク質を含む、
コラーゲンによって刺激される血小板凝集阻害用の治療
用組成物。 - 【請求項９】 配列番号１又はその保存的アミノ酸置換
物、あるいは、コラーゲンによって刺激される血小板凝
集を阻害できるそのフラグメントのアミノ酸配列を有す
る、請求項１のタンパク質。 - 【請求項１０】 配列番号３又はその保存的アミノ酸置
換物、あるいはコラーゲンによって刺激される血小板凝
集を阻害するそのフラグメントのアミノ酸配列を有す
る、請求項１のタンパク質。 - 【請求項１１】 請求項１のタンパク質をコードするＤ
ＮＡを有する遺伝子。 - 【請求項１２】 請求項１のタンパク質をコードするＤ
ＮＡを含む組換え分子であって、該ＤＮＡがホスト内で
の発現を目的としてコラーゲンにより刺激される血小板
凝集を阻害するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列か
らなるものである組換え分子、ただし該ＤＮＡ配列はＤ
ＮＡ分子の発現調節配列に機能的に結合している。 - 【請求項１３】 以下の段階： ａ）請求項１のタンパク質をコードするＤＮＡを含む組
換え分子で形質転換した分子ホストの培養、ただし該Ｄ
ＮＡはホスト内での発現を目的としてコラーゲンにより
刺激される血小板凝集を阻害するポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列からなるものであり、該ＤＮＡ配列はＤ
ＮＡ分子の発現調節配列に機能的に結合している； ｂ）ポリペプチドの回収、単離、からなる、コラーゲン
により刺激される血小板凝集を阻害するポリペプチドの
製造方法。 - 【請求項１４】 以下のアミノ酸構成を持つ請求項１の
タンパク質、又はその保存的アミノ酸置換体。 【表１】 - 【請求項１５】 以下のアミノ酸構成を持つ請求項１の
タンパク質、又はその保存的アミノ酸置換体。 【表２】
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US59491790A | 1990-10-09 | 1990-10-09 | |
| US594917 | 1990-10-09 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0586098A true JPH0586098A (ja) | 1993-04-06 |
| JPH0772197B2 JPH0772197B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=24380961
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3260014A Expired - Lifetime JPH0772197B2 (ja) | 1990-10-09 | 1991-10-08 | コラーゲンにより刺激される血小板凝集を阻害するタンパク質 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5324715A (ja) |
| EP (1) | EP0480651A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0772197B2 (ja) |
| CA (1) | CA2052486A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002539788A (ja) * | 1999-03-18 | 2002-11-26 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | 血小板接着の阻止用タンパク質 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5756454A (en) * | 1991-09-05 | 1998-05-26 | Schering Aktiengesellschaft | Collagen-induced platelet aggregation inhibitor |
| KR100445309B1 (ko) * | 1993-07-01 | 2004-11-12 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 콜라겐-자극혈소판응집에대한억제제 |
| MY128992A (en) * | 2000-08-25 | 2007-03-30 | Merck Patent Gmbh | Saratin for inhibiting platelet adhesion to collagen |
| US20110034396A1 (en) * | 2005-09-28 | 2011-02-10 | Biovascular, Inc. | Methods and compositions for inhibiting cell migration and treatment of inflammatory conditions |
| JP2009510105A (ja) | 2005-09-28 | 2009-03-12 | バイオバスキュラー インコーポレーティッド | 血小板および細胞の接着、細胞移動、および炎症を阻止するための方法および組成物 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987000860A1 (en) * | 1985-08-10 | 1987-02-12 | Biopharm (Uk) Limited | Collagen-specific enzyme with platelet aggregation inhibition properties |
| IL83912A (en) * | 1986-09-18 | 1993-05-13 | Pennsylvania Hospital | Protein having anticoagulant and antimetastatic properties |
| US4832849A (en) * | 1988-06-16 | 1989-05-23 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Extraction and purification of an anticoagulant principle from the south american leech, haementeria ghilianii |
-
1991
- 1991-09-30 CA CA002052486A patent/CA2052486A1/en not_active Abandoned
- 1991-10-07 EP EP91309157A patent/EP0480651A1/en not_active Withdrawn
- 1991-10-08 JP JP3260014A patent/JPH0772197B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-04-07 US US08/044,547 patent/US5324715A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CANCER RESEARCH=1984 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002539788A (ja) * | 1999-03-18 | 2002-11-26 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | 血小板接着の阻止用タンパク質 |
| JP4805461B2 (ja) * | 1999-03-18 | 2011-11-02 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 血小板接着の阻止用タンパク質 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5324715A (en) | 1994-06-28 |
| EP0480651A1 (en) | 1992-04-15 |
| JPH0772197B2 (ja) | 1995-08-02 |
| CA2052486A1 (en) | 1992-04-10 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
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