HU220301B - Véralvadásgátló protosztómiák (vérszívók) nyálából - Google Patents

Véralvadásgátló protosztómiák (vérszívók) nyálából Download PDF

Info

Publication number
HU220301B
HU220301B HU9501626A HU9501626A HU220301B HU 220301 B HU220301 B HU 220301B HU 9501626 A HU9501626 A HU 9501626A HU 9501626 A HU9501626 A HU 9501626A HU 220301 B HU220301 B HU 220301B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
seq
protein
amino acid
phe
glu
Prior art date
Application number
HU9501626A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT71210A (en
HU9501626D0 (en
Inventor
Alejandro Alagon
Delia Cuevas-Aguierre
Peter Donner
Ulrike Hechler
Bernard Händler
Christiane Nöske-Jungblut
Lourival Possani
Wolf-Dieter Schleuning
Original Assignee
Schering Ag.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19924241659 external-priority patent/DE4241659C1/de
Priority claimed from DE19934304731 external-priority patent/DE4304731A1/de
Priority claimed from DE19934328336 external-priority patent/DE4328336A1/de
Priority claimed from DE19934340798 external-priority patent/DE4340798A1/de
Application filed by Schering Ag. filed Critical Schering Ag.
Publication of HU9501626D0 publication Critical patent/HU9501626D0/hu
Publication of HUT71210A publication Critical patent/HUT71210A/hu
Publication of HU220301B publication Critical patent/HU220301B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgyát protosztómiák (vérszívók) nyálából származó véralvadásgátló fehérjék képezik.
A trombinnak kulcsszerepe van a vérerekben történő trombusképződésben. Katalizálja a fibrinogénből történő fíbrinleválást. Ez véralvadáshoz vezet. Ezenkívül elősegíti a vértestek összetapadását. Az enzim különböző betegségek, mint például az artériás és vénás trombózis vagy az érelmeszesedés kifejlődésében vesz részt.
Ezért sikerrel kecsegtető a trombózisok kezelésében egy trombininhibitor alkalmazása. Az eddig ismert legfontosabb trombininhibitorok az antitrombin Ill-heparin és a hirudin. Az antitrombin III a plazmában előforduló 58 kD molekulatömegű fehérje. Az antitrombin először a heparinhoz kötődik, amely egy poliszacharid. Utána az antitrombin Ill-heparin-komplex egy trombinhoz kapcsolódik és gátolja ezt a trombint. A trombinból és antitrombin III-ból egy nagyon stabil komplex keletkezik, majd az antitrombin III leválik a trombinról. Az antitrombin III a trombin mellett más szerinproteázokat is gátol, mint például az Xa faktort [Pratt, C. W. és Church, F. C. „Antithrombin: Structure and Function”, Seminars in Hematology 28, 3-9 (1991)].
A hirudin fehérjét Hirudo medicinalis orvosi piócából izolálták. Molekulatömege körülbelül 7 kD és ionos kölcsönhatással kapcsolódik a trombinhoz. Ez trombinra specifikus [Johnson, P. H. et al., „Biochemistry and Genetic engineering of hirudin”, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 75, 302-315 (1989)].
Az előzőekben említett, a szakmában eddig ismert trombininhibitorok mellett további, olyan inhibitorokra van szükség, amelyek más hatásmechanizmussal bírnak vagy fokozott aktivitással rendelkeznek.
A találmány olyan természetes vagy szintetikus úton előállítható trombininhibitor fehérjéket szolgáltat, amelyek emlősállatok vérét szívó rovarok nyálából izolálhatok. Előnyben részesülnek azok a találmány szerinti fehérjék, amelyek a Triatoma pallidipennis rablópoloskából izolálhatok.
A találmány szerinti fehérjék lehetnek természetes eredetűek. A fehérjéket a nyál megtisztításával nyerjük. A fehérjéket izolálhatjuk a nyálmirigyekből is, vagy a fehérjét szintetizáló sejteket kiemelve a nyálmirigyből sejttenyészetben tarthatjuk. E sejtkultúra által előállított anyagokat kinyerjük és feldolgozzuk. A sejtek felülúszóját tisztítjuk, és a találmány szerinti fehérjéket izoláljuk és dúsítjuk. Az izolálás és a tisztítás minden dúsítási lépése a találmány részét képezi. Az izolálásnak és a tisztításnak olyan dúsítási lépéseit részesítjük előnyben, amelyek következtében a találmány szerinti fehérjék gyógyászati célra felhasználhatók. Ily módon a trombininhibitomak az összes fehérjére vonatkoztatott 50%-os, előnyösen 85%-os, még előnyösebben 95%-os és legelőnyösebben 99%-os tisztítását érjük el.
A találmány nemcsak a Triatoma pallidipennisbol izolálható fehérjéket foglalja magában, hanem más rovarfajták által szintetizálható fehérjéket is. így a Triatoma pallidipennisbőX izolálható, a leginkább előnyben részesített csoporthoz tartozó fehérjék mellett olyan további fehérjéket részesítünk előnyben, amelyek a Triatoma infestans, Triatoma dimidiata, Triatoma maculata, Rhodnius prolixus, Panstrongylus megistus és Panstrongylus infestans fajokból származnak.
A találmány szerinti fehérjék előállíthatok szintetikus úton is. Ide tartoznak különböző szerzők által leírt fehérjeszintézisek [Sewart J. M. és Young J. D.: Proteinsynthese, San Francisco (1969); Meienhofer J.; Hormonal Proteins and Peptides, Academic Press New York Vol. 2, 46 (1973); Schoder E. és Lubke K.: The Peptides, Academic Press New York Vol. 1, (1965)]. A szintetikusan előállított fehérjék közé tartoznak ismert eljárásokkal előállított rekombináns fehérjék is. A találmány szerinti fehérjék a gazdaszervezettől függően lehetnek glikoziláltak, vagy ha prokariótákban szintetizáljuk azokat, nem glikoziláltak.
Az inhibitorok működését különböző tesztrendszerekben állapíthatjuk meg. A 2-4. és a 9. példákban jelenleg használatos teszt eljárásokat írunk le.
A találmány szerinti fehérjék emlősállatok vérét szívó rovarok nyálából mutathatók ki. Ezek a fehérjék általában a nyálmirigyek sejtjeiben szintetizálódnak. Ezért a fehérjék a nyálból izolálhatok. A találmány szerinti fehérjék előállítása és izolálása nem korlátozódik ezekre a módszerekre. Sokkal inkább kiterjed minden olyan szintetikusan előállított találmány szerinti trombininhibitorra, amely a nyálban mutatható ki és abból izolálható.
Az érett fehérje N-terminális szekvenciái
A találmány tárgya továbbá egy olyan természetes vagy szintetikus úton előállítható fehérje, amely trombininhibitor, és az emlősállatok vérét szívó rovarok, előnyösen a Triatoma pallidipennis nyálából izolálható,
a) ahol a fehérje mint aktív fehérje a következő Nterminális szekvenciával rendelkezik :
Alá Glu Gly Asp Asp Cys Ser Leu Glu Lys Alá Met 5 10
Gly · Asp Phe · Lys · Pro Glu · Glu · Phe Phe ...
20 vagy
b) ahol a fehérje mint aktív fehérje az előbbi, a) alatt bemutatott N-terminális aminosavszekvencia olyan allélmódosulataival rendelkezik, amelyeknél az N-terminális aminosavszekvencia egy vagy két aminosavját szubsztituáltuk (helyettesítettük), deléciót végeztünk (töröltük), vagy inszertáltuk (beiktattuk) anélkül, hogy ezáltal az aktív fehérje aktivitását lényegesen befolyásoltuk volna, vagy
c) ahol a fehérje mint aktív fehérje az a) és b) alatti Nterminális szekvenciák olyan poszttranszlációs módosulataival rendelkezik, amelyek az aktív fehérje aktivitását nem befolyásolják lényegesen.
Az érett fehérjék szekvenciái
A találmány tárgya továbbá egy olyan fehérje, amely trombininhibitor és
d) amely aktív érett fehérjeként a következő szekvenciák valamelyikét tartalmazza:
i) 1. számú szekvencia (1. számú szekvenciavázlat);
ii) 2. számú szekvencia (2. számú szekvenciavázlat);
HU 220 301 Β ifi) 3. számú szekvencia (3. számú szekvenciavázlat) és iv) 4. számú szekvencia (4. számú szekvenciavázlat), vagy
e) amely aktív érett fehéreként az előbbi, d) alatt megnevezett aminosavszekvenciák valamelyikének olyan allélmódosulataival rendelkezik, amelyeknél az aminosavszekvenciának legalább egy aminosavját helyettesítettük, töröltük vagy beiktattuk anélkül, hogy ezáltal az aktív fehéqe aktivitását lényegesen befolyásoltuk volna, vagy
f) amely aktív érett fehérjeként a d) és e) alatti szekvenciák valamelyikének olyan poszttranszlációs módosulataival rendelkezik, amelyek az aktív fehérje aktivitását nem befolyásolják lényegesen.
A találmány szerinti fehérjék csoportjába tartozik minden olyan allélmódosulat, amely 30 aminosavig terjedő helyettesítéseket, törléseket és/vagy beiktatásokat foglal magában. Előnyben részesítjük a 20 aminosavig terjedő törléseket, helyettesítéseket és/vagy beiktatásokat, még inkább előnyben részesítjük 10 aminosav, leginkább előnyben részesítjük egy, kettő, három, négy, öt, hat, hét, nyolc vagy kilenc aminosav törlését, helyettesítését és/vagy beiktatását.
Szignálszekvenciával rendelkező érett fehérjék szekvenciái
A találmány szerinti fehérjéknek egy további kiviteli alakja egy olyan fehérje, amely egy szignálszekvenciából és egy érett, találmány szerinti fehérjéből áll,
g) ahol a fehérje a következő szekvenciák valamelyikét tartalmazza:
i) 5. számú szekvencia (5. számú szekvenciavázlat);
ii) 6. számú szekvencia (6. számú szekvenciavázlat);
ifi) 7. számú szekvencia (7. számú szekvenciavázlat) és iv) 8. számú szekvencia (8. számú szekvenciavázlat), vagy
h) ahol a fehérje az előbbi, g) alatt megnevezett aminosavszekvenciák valamelyikének olyan allélmódosulataival rendelkezik, amelyeknél az aminosavszekvenciának legalább egy aminosavját helyettesítettük, töröltük vagy beiktattuk anélkül, hogy ezáltal az érett aktív fehérje aktivitását lényegesen befolyásoltuk volna, vagy
i) ahol a fehérje a g) és h) alatti szekvenciák valamelyikének olyan poszttranszlációs módosulataival rendelkezik, amelyek az aktív érett fehérje aktivitását nem befolyásolják lényegesen.
A találmány szerinti fehérjék csoportjába tartozik minden olyan allélmódosulat, amely 32 aminosavig terjedő helyettesítéseket, törléseket és/vagy beiktatásokat foglal magában. Előnyben részesítjük a 21 aminosavig terjedő törléseket, helyettesítéseket és/vagy beiktatásokat, még inkább előnyben részesítjük 11 aminosav, leginkább előnyben részesítjük egy, kettő, három, négy öt, hat, hét, nyolc vagy kilenc aminosav törlését, helyettesítését és/vagy beiktatását.
Leginkább előnyben részesítjük azokat a találmány szerinti fehérjéket, amelyek rekombináns fehérjék. Emellett a fehérjék lehetnek glikoziláltak.
A találmány szerinti fehérjék magukban foglalják az érett fehérjéket és a megfelelő prekurzor fehérjéket, amelyek egy szignálszekvenciából és az érett fehérjék szekvenciájából tevődnek össze. A szignálszekvencia megelőzi az érett fehérje szekvenciáját. Az érett fehérje az előzőekben említett, a) pont alatti N-terminális szekvenciával kezdődik. A szignálszekvencia az endoplazmatikus retikulumon történő áthatoláshoz szükséges.
A találmány szerinti fehérjéket kódoló cDNS vagy
DNS
A találmány tárgya továbbá egy érett trombininhibitort kódoló cDNS vagy DNS is, aa) ahol a cDNS vagy DNS a következő aminosavszekvenciák valamelyikét kódolja:
i) 1. számú szekvencia (1. számú szekvenciavázlat);
ii) 2. számú szekvencia (2. számú szekvenciavázlat);
ifi) 3. számú szekvencia (3. számú szekvenciavázlat) és iv) 4. számú szekvencia (4. számú szekvenciavázlat), vagy bb) ahol a cDNS vagy DNS az aa) alatti aminosavszekvenciák valamelyikének olyan allélmódosulatát kódolja, amelyben az aminosavszekvenciának legalább egy aminosavját helyettesítettük, töröltük vagy beiktattuk anélkül, hogy ezáltal az aktív fehérje aktivitását lényegesen befolyásoltuk volna.
Az allélmódosulatokat az előzőekben „Az érett fehérjék szekvenciái” címszó alatt már definiáltuk.
A találmány tárgya továbbá egy érett trombininhibitort kódoló cDNS vagy DNS, cc) ahol a cDNS vagy DNS a következő nukleotidszekvenciák valamelyikével rendelkezik:
i) 9. számú szekvencia (9. számú szekvenciavázlat);
ii) 10. számú szekvencia (10. számú szekvenciavázlat);
fii) 11. számú szekvencia (11. számú szekvenciavázlat) és iv) 12. számú szekvencia (12. számú szekvenciavázlat), vagy dd) ahol a cDNS vagy DNS a cc) alatti nukleotidszekvenciák valamelyikének olyan allélmódosulatával rendelkezik, amelyben legalább egy nukleotidot helyettesítettünk, töröltünk vagy inszertáltunk anélkül, hogy a cc) alatti nukleotidszekvencia allélmódosulata által kódolt fehérje aktivitását lényegesen befolyásoltuk volna.
Azonkívül minden olyan DNS-szerkezetet a felsorolt találmány szerinti szekvenciák közé számítunk, ha olyan nukleotidokat cserélünk ki, amelyek a degenerált kód alapján ugyanazt az aminosavat kódolják. Ilyen nukleotidok cseréje közismert, és a megfelelő aminosavak minden biokémiai tankönyvben hozzáférhetők [Knippers R.: Molekulare Genetik, Georg Thieme Verlag, 3. Auflage (1982)].
HU 220 301 B
A találmányhoz tartozik minden olyan allélmódosulás, amely az aminosavszekvencia megváltozásához vezet, amennyiben ezek a módosulatok 30 aminosavig terjedő helyettesítéseket, törléseket és/vagy beiktatásokat foglalnak magukban. Előnyben részesítjük a 20 aminosavig terjedő törléseket, helyettesítéseket és/vagy beiktatásokat, még inkább előnyben részesítjük 10 aminosav, leginkább előnyben részesítjük egy, kettő, három, négy, öt, hat, hét, nyolc vagy kilenc aminosav törlését, helyettesítését és/vagy beiktatását.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy olyan genetikai anyag is, amely az érett fehérjét kódoló szekvencia mellett egy szignálszekvenciát is tartalmaz. Ezt a szignálszekvenciát a cDNS-bankban találtuk, de elképzelhetőek más szignálszekvenciák is, amelyek a fehérje expresszióját és kiválasztódását lehetővé teszik.
Tehát a találmány magában foglal egy cDNS-t vagy DNS-t, amely egy trombininhibitort szignálszekvenciával együtt kódol, ee) ahol a cDNS vagy DNS a következő nukleotidszekvenciák valamelyikével rendelkezik:
i) 13. számú szekvencia (13. számú szekvenciavázlat);
ii) 14. számú szekvencia (14. számú szekvenciavázlat);
iii) 15. számú szekvencia (15. számú szekvenciavázlat) és iv) 16. számú szekvencia (16. számú szekvenciavázlat), vagy ff) ahol a cDNS vagy DNS az ee) alatti nukleotidszekvenciák valamelyikének olyan allélmódosulatával rendelkezik, amelynél legalább egy nukleotidot helyettesítettünk, töröltünk vagy inszertáltunk anélkül, hogy az ee) alatti nukleotidszekvencia allélmódosulata által kódolt, szignálszekvenciáját magában foglaló aktív fehérje aktivitását lényegesen befolyásoltuk volna.
Az allélmódosításokat az előzőekben, dd) alatt már definiáltuk.
Ha a fehérje aktivitását azért adjuk meg, hogy megállapítsuk, vajon az allélmódosulat a találmány szerinti fehérjék közé tartozik-e, mindig az érett fehérjét mérjük, akkor is, ha a szignálszekvencia szintén jelen van. Ha a szignálszekvenciát kell megadnunk, annak a fehérjének a működését mérjük, amelyiket a szignálszekvencia eltávolítása után kapunk.
A találmány kiterjed továbbá kötőmolekulákra (például peptidekre vagy azok származékaira), egyszálú fehérjékre (Single Chain Proteins), olyan antitestekre vagy antitestek fragmentumaira, amelyek az érett találmány szerinti fehérjén található doméneket specifikusan felismerik. Ha rendelkezésre áll a találmány szerinti tisztított fehérje, a szakember könnyen előállíthat monoklonális antitesteket. Ehhez Köhler és Milstein ismert módszereit és azok továbbfejlesztéseit használjuk fel. Ennél egy egeret a szokásos eljárással többszörösen immunizálunk a tisztított fehérjével, kivesszük a lépsejteket és ezeket megfelelő tumorsejtekkel fuzionáltatjuk. Végül a hibrideket szelektáljuk.
A találmány szerinti fehérjék a Triatoma pallidipennis rablópoloska nyálából izolálhatok. A tisztítás gélszűréssel és azt követően Trombin-Sepharose-on végzett affinkromatográfiával történik (lásd az 1. példát). A fehérjék az előzőekben leírt aminosavszekvenciákkal rendelkeznek. Molekulatömegük körülbelül 18 000±3000 D (lásd a 6. példát). Az izoelektromos pont 4,5-5,2 pH közé esik, ha a 8. példában leírt módszert alkalmazzuk.
A találmány szerinti fehérjék gátolják a trombin hatását véralvadásnál és a vértestek aktivizálásánál, valamint az amidolitikus tesztben. A tesztrendszert a 2., 3.,
4. és 9. példákban írjuk le. A fehérjék 8 nmol/1 koncentrációban gátolják a véralvadást 1,27 nmol/1 trombinkoncentrációnál. 15 ng/ml koncentrációban 100%ig gátolják a trombin kiváltotta vértest-aggregációt. Ez a koncentráció 0,06 NE/ml=0,812 pmol/ml (NE=nemzetközi egység) bemért trombinkoncentrációnál 1:1 trombin:találmány szerinti fehérjearánynak felel meg. Ezzel szemben a találmány szerinti fehéijék az amidolitikus tesztben 1:87 trombin‘.találmány szerinti fehérjearánynál csak körülbelül 50%-ig gátolják a trombin aktivitását. A találmány szerinti fehérjék 35 nmol/1 koncentrációban 5-szörösére meghosszabbítják a trombin hatásidejét (1 NE/ml).
A találmány szerinti fehéijék trombinra specifikusak. Más szerinproteázokat (például Xa faktort vagy tripszint) 40-szeres feleslegben sem gátolnak kimutathatóan (lásd 7. példa).
A találmány szerinti DNS-t tartalmazó vektorok
A találmány további tárgyát egy olyan vektor képezi, amely egy találmány szerinti cDNS-t vagy DNS-t, továbbá egy megfelelő promotert és adott esetben egy megfelelő átírásfokozót (enhancer) tartalmaz. Ugyancsak magában foglalhat még egy szignálszekvenciát is. Vektorokat írnak le részletesen az EP 0 480 651, EP 0 462 632 és az EP 0 173 177 számú európai szabadalmi leírásokban.
A találmány egy további kiviteli alakja olyan eukarióta vagy prokarióta gazdasejt, amelyet egy találmány szerinti vektorral transzformáltunk.
Allélmódosulatok
Úgy tűnik, hogy a legtöbb deléció, inszerció és szubsztitúció nem okoz átfogó változásokat a találmány szerinti fehéije sajátságaiban. Mivel egy szubsztitúció, deléció vagy inszerció pontos hatását nehéz előre megadni, a megváltoztatott fehéije működését össze kell hasonlítani a találmány szerinti fehéije működésével. Az itt alkalmazandó módszereket példaként a 2-4. és a 9. példákban adjuk meg. Standardként szolgál az 1-4. szekvenciavázlat szerinti fehéije, úgyszintén az 1. példa szerint tisztított fehéije, és az 1. példának az összehasonlító fehéqére vonatkozó tisztítási eljárásai.
A genetikai kód degenerált; ez azt jelenti, hogy a legtöbb aminosavat több mint egy, három nukleotidból álló kódon kódolja. Ezért néhány, a nukleotidok területén bekövetkező allélmódosulás nem vezet az aminosavszekvencia megváltozásához. Ezért kiváltképp a DNS-eknél fordulnak elő allélmódosulások, és ezek másodlagosan kihathatnak az aminosavszekvenciára.
HU 220 301 B
Azok a cDNS- és DNS-szekvenciák, amelyek a találmány szerinti fehéqéket kódolják, a szokásos technikák szerint úgy módosíthatók, hogy a találmány szerinti fehéijék olyan variációit állítsuk elő, amelyek lényegében a leírt és jellemzett találmány szerinti fehérjékkel azonos aktivitással bírnak. Ezeknél a 2-4. és 9. példákban leírtakkal azonos módon méijük az aktivitást.
Aminosavakat helyettesíthetünk - amint ezt az 1. táblázatban bemutatjuk - anélkül, hogy a fehérje működését lényegesen befolyásolnánk.
1. táblázat
Aminosavak szokásos cseréje egy fehérjén belül
Eredeti Példaként bemutatott
aminosav helyettesítések
Alá Gly, Ser
Arg Lys
Asn Gin, His
Asp Glu
Cys Ser
Gin Asn
Glu Asp
Gly Alá, Pro
His Asn, Gin
Ile Leu, Val
Leu Ile, Val
Lys Arg, Gin, Glu
Met Leu, Tyr, He
Phe Met, Leu, Tyr
Ser Thr
Thr Ser Trp Tyr
Tyr Trp, Phe
Val Ile, Leu
A funkciók vagy az immunológiai azonosság azonban lényegesen megváltozik, ha olyan szubsztituenseket választunk, amelyek a helyettesítésnél kevésbé konzervatívak, mint az 1. táblázatban bemutatott aminosavak. Ilyen lényeges változások olyan aminosavakkal történő szubsztitúciókkal érhetők el, amelyek szerkezetükben és funkciós csoportjaikban jobban különböznek. Lényegi változások abból adódnak, hogy megváltozik a háromdimenziós szerkezet és/vagy például befolyásoljuk a hajtogatottságot, vagy a helikális szerkezetet. A töltések és a hidrofób láncok kölcsönhatásait is figyelembe kell venni a változtatásoknál.
A mutációkat két összehasonlításban álló fehérje homológiáján (similarity=hasonlóság) keresztül definiáljuk. A homológia kifejezés magában foglalja az egymáshoz hasonló aminosavakat (például az 1. táblázatban) és az aminosavak szekvenciáiban levő hiányokat. A találmány szerinti fehérjék olyan aminosavszekvenciákkal rendelkeznek, amelyek legalább 80%-ban, előnyösen 90%-ban, még előnyösebben 95%-ban és legelőnyösebben 98%-ban a találmány szerinti struktúrák homológjai, ahogyan azt a d) vagy g) alatti szekvenciák (1-8. számú szekvenciavázlatok) által definiáltuk és továbbá ahogyan az 1. példa szerinti tisztítással kinyertük azokat.
Amint azt már előzőleg említettük, a találmány tárgyát képezik DNS- vagy cDNS-módosulatok is. Ezek a módosított szekvenciák szigorú feltételek mellett hibridizálnak olyan DNS-szekvenciákkal, amelyek a találmány szerinti fehéqéket kódolják (lásd az aa); cc) és ee) alatti szekvenciákat). A cDNS- vagy DNS-szekvenciák olyan nukleotidszekvenciákkal rendelkeznek, amelyek - beleértve rövidebb (15 nukleotidig) törléseket és beiktatásokat - legalább 70%-ban, előnyösen 82%ban, még előnyösebben 90%-ban és legelőnyösebben 95%-ban azonosak a találmány szerinti cDNS- vagy DNS-szekvenciákkal (lásd az aa); cc) és ee) alatti szekvenciákat). Az azonosság - beleértve rövidebb (15 nukleotidig) törléseket és beiktatásokat - hibridizáció segítségével mérhető, ahogyan azt Knippers [Molekulare Genetik, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York 3. Auflage (1982)] leírja.
Poszttranszlációs módosulások
Az előzőekben említett poszttranszlációs módosulásokon olyan változásokat értünk, amelyek a transzláció alatt vagy után lépnek fel. Ide tartoznak a glikozilálás, diszulfidhidak kialakulása, az aminosavak kémiai módosulásai, mint például a szulfatálódás, amelyet a hirudinnal kapcsolatban írnak le [Fenton J. W. „Thrombin Interactions with Hirudin”, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15, 265-268 (1989)].
A glikozilálás az endoplazmás retikulumnak és/vagy a Golgi-apparátusnak fontos funkciója. Az oligoszacharidok szekvenciája és elágazása az endoplazmatikus retikulumban képződik és a Golgi-apparátusban változik meg. Az oligoszacharidok lehetnek Nkapcsoltak (aszparaginnal kapcsoltak) vagy O-kapcsoltak (szerinnel, treoninnal vagy hidroxi-lizinnel kapcsoltak). A glikozilálás formája az előállító sejttípustól és attól a fajtól függ, amelytől a megfelelő sejttípus ered. A glikozilálás mértéke és fajtája vegyületekkel befolyásolható, ahogyan azt az EP 0 222 313 számú európai szabadalmi leírás tartalmazza. A glikozilálás variálása megváltoztathatja a fehérje funkcióját.
A fehérjék gyakran képeznek kovalens kötéseket a láncon belül. Ezek a diszulfidhidak két cisztein között jönnek létre. Ezáltal a fehérje specifikusan hajtogatott lesz. A diszulfidhidak stabilizálják a fehérjék háromdimenziós szerkezetét.
Az aminosavak továbbá úgy változtathatók, ahogyan azt a WO 91/10684 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés leírja. A fehéije szintén lehet szulfátéit. Ezt a változtatást a hirudinnal kapcsolatban írják le.
A találmány szerinti fehérjék izolálása és előállítása
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás a találmány szerinti fehérjék előállítására a következő lépésekkel: egy, a találmány szerinti cDNS-t vagy DNS-t tartalmazó vektorral transzformált gazdasejt tenyésztése, és a fehérje vagy fehérjék izolálása és tisztítása.
HU 220 301 B
A fehérjéket előnyösen az 1. példa szerint tisztítjuk. Lehetségesek azonban más izolálást és tisztítási módszerek is [Methods of Enzymology, 182, Guide to Protein Purification, ed. Murray P. Deutscher, Academic Press (1990); Protein Purification Application A Practical Approach, ed. E. L. V. Harris and S. Angel, IRL-Press (1990); Protein Purification, Principles and Practice, Ropert Scopes, Springer Verlag (1982) és Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications ed. H.-C. Janson and L. Ryden, VCH publishers (1989)].
Ugyancsak a találmány tárgyát képezi egy olyan eljárás a találmány szerinti fehéqék tisztítására, amelynél a fehérjéket izoláljuk, legalább egy oszlopon tisztítjuk és végül koncentráljuk. Előnyben részesítjük a kromatográfiás oszlopokat vagy adszorpciós kromatográfiás oszlopokat.
A találmány tárgyát képezi ezenfelül egy olyan eljárás a találmány szerinti fehérjék tisztítására, amelynél az eljárás a következő lépésekből áll.
A nyál felvitele egy Superose 12 HR oszlopra, eluálás és újabb felvitel egy CH-aktivált Sepharose oszlopra, amelyen előzőleg trombint kötöttünk meg, és eluálás.
A tisztítást részletesen az 1. példában írjuk le.
Gyógyszerként történő alkalmazás
A találmány szerinti fehérjék farmakológiái hatással rendelkeznek és ezért felhasználhatók gyógyszeripari hatóanyagként. Ugyancsak a találmány tárgyát képezi egy gyógyszer, amely a találmány szerinti fehérjék valamelyikét vagy azok keverékét tartalmazza. Továbbá a találmányhoz tartozik egy olyan gyógyászati készítmény, amely a találmány szerinti fehérjék valamelyikét vagy a találmány szerinti fehérjék keverékét gyógyászatilag összeférhető és elfogadható vegyületek és hordozók jelenlétében tartalmazza. A találmány úgyszintén magában foglal egy olyan gyógyászati készítményt, amely a gyógyászatilag aktív találmány szerinti fehérjék valamelyikét vagy azok keverékét és egy gyógyászatilag összeegyeztethető sót, vagy gyógyászatilag összeegyeztethető hordozót tartalmaz.
Különösen az 1-4. szekvenciavázlatokkal jellemzett találmány szerinti fehérjék mutatnak trombinaktivitás-gátlást.
A trombinaktivitás gátlása kimutatható az alvadási teszttel (lásd a 2. példát), a vörösvértestek aggregációs tesztjével (lásd a 3. példát), az amidolitikus teszttel (lásd a 4. példát) és a trombin-idő mérésével (lásd a 9. példát). A trombin-idő mérése a leginkább előnyben részesített tesztrendszer.
A találmány szerinti fehéqék 10-60 nmol/1 koncentrációnál (trombinkoncentráció 1 NE/ml) a trombin-idő meghosszabbodását mutatják. 58 nmol/1 koncentrációnál 9-szeres hosszabbodás következik be. Nagyobb koncentrációk is alkalmazhatók a tesztrendszer zavarása nélkül. Következésképp a találmány szerinti fehérjék 10-200 nmol/1 koncentrációban bevethetők.
Ennek az in vitro tesztnek a kísérleti eredményei azt mutatják, hogy a találmány szerinti fehérjék felhasználhatók gyógyszerként vagy gyógyászati kezeléshez. Ezek a kísérleti eredmények az in vitro tesztrendszerről átvihetők in vivő rendszerre, mivel az alvadási tesztnél egy telepített kísérleti elrendezésről van szó [Talbot M. „Biology of Recombinant Hirudin, a New Prospect in the Treatment of Thrombosis” Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15, 293-301 (1989)]. Ezért a találmány szerinti fehérjék trombózisok, instabil angina vagy arterioszklerózis megelőzésére vagy kezeléseként, erek újra elzáródásának megelőzésére PTCA/PTA után (angioplasztia ballonkatéterrel) vagy a hemodialízisnél fellépő véralvadás megakadályozására szolgálhatnak. A találmány szerinti fehéqék alkalmazhatók trombózis és/vagy érelmeszesedés elleni gyógyszerként emlősöknél, különösen embernél trombózisos és/vagy érelmeszesedéses bántalmak kezelésére. Ezek felléphetnek érelmeszesedéses aggregátumok (plakkok) szétoszlatásánál, endotél szövet szétszakításánál, mint például szepszisnél, transzplantátumoknál vagy instabil angina esetén. Szintén használhatók miokardiális infarktusok kezelését követő újbóli elzáródások és/vagy frbrinolízis, vagy angioplasztia elkerülésére. Ezeknél a találmány szerinti fehérje a katéter bevezetése előtt, katéterezésnél és/vagy utána adható be.
A találmány tárgyát képezi továbbá
i) a találmány szerinti fehéqék valamelyikének vagy azok keverékének felhasználása - trombózisok, instabil angina vagy érelmeszesedés kezelésére, vagy az erek PTCA/PTA-t követő újraelzáródásának megelőzésére, vagy hemodialízisnél a véralvadás gátlására szolgáló gyógyszer előállítására.
ii) egy eljárás - trombózisok, instabil angina vagy érelmeszesedés kezelésére, vagy az erek PTCA/PTA-t vagy trombolízist követő újraelzáródásának megelőzésére, vagy hemodialízisnél a véralvadás gátlására amely eljárás magában foglalja a találmány szerinti fehérje olyan mennyiségben történő beadását, amelynél a betegség visszaszorul, és ahol a fehérjemennyiséget olyan betegnek adjuk, akinek ilyen gyógyszerre van szüksége;
iii) gyógyászati készítmény - trombózisok, instabil angina vagy érelmeszesedés kezelésére, vagy az erek PTCA/PTA-t vagy trombolízist követő újraelzáródásának megelőzésére, vagy hemodialízisnél a véralvadás gátlására - amellyel történő kezelés a találmány szerinti fehérjék valamelyikét, vagy azok keverékét és legalább egy, gyógyászatilag összeférhető hordozót és adalékot foglal magában.
E gyógyászati hatások kifejtéséhez eltérő dózisok felelnek meg. Ezek például az alkalmazott fehérjétől, a gazdaszervezettől, a beadás módjától és a kezelendő állapot fajtájától és súlyosságától függnek.
Általában azonban állatoknál kielégítő eredmények várhatók, ha a napi adagok testtömeg-kg-ra vonatkoztatva 2-2000 pg közé esnek. Nagyobb emlősöknél, például az embernél ajánlott napi dózis 2-2000 pg testtömeg-kg-onként, amennyiben az 1. példában bemutatott tisztított fehérjét alkalmazzuk. Ezt a dózist például célszerűen napi négy részadagban adjuk be. Akut trombózisok rövid idejű kezelésnél testtömeg-kg-ra vonat6
HU 220 301 B koztatott 20-2000 pg napi adagokkal támadhatnak, amely magasabb, mint a krónikus kezelésnél testtömeg-kg-onkénti 2-200 pg.
Úgyszintén kielégítő eredményeket várhatunk, ha a találmány szerinti fehéqét szubkután adjuk be. Előnyben részesítjük a célzott injekciót abba a testrészbe, amelyben trombózisok képződtek.
A találmány szerinti fehérjék beadhatók a szokásos módokon, különösen injekciós oldatok vagy szuszpenziók formájában.
A találmány olyan gyógyászati készítményeket bocsát rendelkezésre, amelyek a találmány szerinti fehérjék valamelyikét, vagy azok keverékét és legalább egy, gyógyászatilag összeférhető hordozót vagy adalékot foglalnak magukban. Ilyen készítmények ismert eljárásokkal előállíthatok. Ezzel kapcsolatban a Remington’s Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980) kiadványra hivatkozunk.
A kísérleti eredmények az ábrák nyomán válnak érthetővé, amelyek a következőket mutatják:
1. ábra: A trombin-idó meghosszabbodása a Triatoma pallidipennisbőX származó találmány szerinti fehérje hozzáadásakor.
2. ábra: A trombinaktivitás gátlása az amidolitikus tesztben (Triatoma=trombin inhibitor Triatoma pallidipennisboX).
3. ábra: A trombinaktivitás gátlása a véralvadástesztben.
Példák
1. példa
Triatoma pallidipennis nyálának kinyerése és a találmány szerinti fehérje tisztítása
A rablópoloskákat szúrószervük mechanikus stimulációjával nyáluk kiválasztására ösztönözzük. A nyálat üveglemezen fogjuk fel és szilikonozott, kihúzott Pasteur-pipettával összegyűjtjük.
A nyálat fagyasztva szárítjuk és desztillált vízben 2,5 mg/ml koncentrációra oldjuk. Ennek az oldatnak 2 ml-ét Superose 12 HR 16/50 oszlopon (Pharmacia) 10 mmol/1 Tris-HCl pH 7,4 és 0,0001% Pluronic F68 keverékében gélszűrjük. A véralvadástesztben (lásd a 2. példát) aktív frakciókat egyesítjük és egy olyan CH-aktivált Sepharose oszlopra (Pharmacia) visszük fel, amelyre előzőleg a gyártó utasításai szerint trombint kapcsoltunk. A találmány szerinti fehérje kötődik erre a trombinnal telített oszlopra. Ezek után az oszlopot Tyrode-pufferrel (szérumalbumin nélkül) mossuk, majd először 10 mmol/1 Na-acetáttal, pH 4,5 és utána 10 mmol/1 glicinnel, pH 2,5 eluáljuk. Az eluátumok ρΗ-ját 7-re állítjuk. A 10 mmol/1 glicines eluátum tartalmazza a találmány szerinti tisztított fehéqét. Ez a fehérje aktív a véralvadástesztben (lásd a 2. példát), a vértest-aggregációs tesztben (lásd a 3. példát), az amidolitikus tesztben (lásd a 4. példát) és meghosszabbítja a trombin-időt (lásd a 9. példát). A készítmény nem tartalmaz az SDS-gélelektroforézissel kimutatható szennyeződéseket.
2. példa
Trombinaktivitás gátlása a véralvadástesztben
Marha-szérumalbuminnal (0, 1% 0, 1 mol/1 NaHCO3-ban pH 9, 5) bevont mikrotiterlemezre pipettázunk 80 μΐ 20 mmol/1 HEPES-t, pH 7,4; 0,15 mmol/1 NaCl-ot; 20 pl 20 mmol/1 CaCl2-ot; a találmány szerinti fehéqe (5-50 ng) hígított oldatának 100 μΐ-ét és 20 μΐ trombint (0,03 NE=nemzetközi egység). 2 perces 37 °C-on történő inkubálás után 100 μΐ fíbrinogént (5 mg/ml) adunk hozzá és 40 percig 37 °C-on inkubáljuk. Végül megmérjük az abszorpciót 405 nm-en. A találmány szerinti tisztított fehéqe 45 ng-ja (=8 nmol/1) teljes mértékben gátolja a fibrinogénleválást. Azonos tesztelési körülmények között a hirudin ugyanilyen hatékonyságot mutat (teljes gátlás 8 nmol/l-rel). (lásd a
3. ábrát)
3. példa
Trombinaktivitás gátlása a vértest-aggregációs tesztben
500 μΐ gélszűrt vörösvértestet (300 000/ml) inkubálunk a jelen találmány szerinti fehérjével (5-100 ng/ml) 1 percig 37 °C-on. Utána trombinnal (0,06 NE/ml) aggregációt idézünk elő és azt aggregométerben mérjük. A tisztított fehérjével végzett mérések azt mutatják, hogy az 15 ng/ml koncentrációnál az aggregációt 100%ig gátolja.
4. példa
Trombinaktivitás gátlása az amidolitikus tesztben
Mikrotiterlemezen 80 μΐ 100 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,4 puffért, 150 mmol/1 NaCl és 0,03 NE (1,35 nmol/1) trombin keverékét és a találmány szerinti fehérje hígított oldatának (32-630 ng) 100 μΐ-ét 10 percig 37 °Con inkubáljuk és utána 100 μΐ (50 nmol) S2238 (Kabi Vitrum) szubsztráttal egészítjük ki. 30 perces 37 °C-on történő inkubálás után mérjük az abszorpciót 405 nmen. 630 ng (117 nmol/1) fehéqe körülbelül 50%-ban gátolja a trombinaktivitást. Hirudin 6 nmol/1 koncentrációnál 85%-ban gátolja a trombinaktivitást (lásd a
2. ábrát).
5. példa
Az N-terminális aminosavszekvencia meghatározása
A találmány szerinti tisztított fehéqét automatikus aminosavszekvenátorban (Applied Biosystems, Inc.) a gyártó utasításai szerint szekvenáltuk. Az 1-21 teqedő aminosavak szekvenciái: Ala-Glu-Gly-Asp Asp-CysSer-Leu-Glu-Lys-Ala-Met-Gly-Asp-Phe-?-Pro-GluGlu-Phe-Phe. „?” azt jelenti, hogy nem azonosítható teljes biztonsággal. Ennél az aminosavnál valószínűleg lizinről van szó.
6. példa
SDS-gélelektroforézis és a molekulatömeg meghatározása
A találmány szerinti fehérjét redukált (redukció ditiotreittel) és nem redukált formában foszforiláz b (94 kD), albumin (67 kD), ovalbumin (43 kD), szénsav-anhidráz (30 kD), tripszininhibitor (20,1 kD) és laktalbumin (14,4 kD) molekulatömeg markerekkel együtt
HU 220 301 B (Electrophoresis Calibration Kit von Pharmacia) egy 12,5%-os SDS-poliakrilamid gélre vittük fel és az elektroforézis [Laemmli, Natúré 227, 680-685 (1970)] után „Coomassie brillant kék”-kel színeztük. Az elektroforézis során a találmány szerinti fehérje redukált formában csak csekély mértékben vándorol a tripszininhibitor fölé. Ez körülbelül 21 000 D molekulatömegnek felel meg. Nem redukált formában a találmány szerinti fehétje a tripszininhibitor és a laktalbumin között halad, amely körülbelül 18 000 D molekulatömegnek felel meg.
7. példa
A találmány szerinti fehérje nem gátolja az Xa faktor és tripszin szerinproteázokat
Az Xa faktor és a tripszin aktivitásának mérését a következő teszttel végezzük. 80 pl 50 mmol/1 Tris-HCl pH 8,0 és 227 mmol/1 NaCl keverékéhez az Xa faktor meghatározásához 0,004 NE (0,653 pmol) Xa faktort (American Diagnostica) és a találmány szerinti fehérje 0,5 pg-ját (28 pmol), és a tripszin meghatározásához 0,004 NE (0,019 pmol) tripszint (Sigma) és a találmány szerinti fehérje 0,016 pg-ját (0,817 pmol) adjuk, majd 2 percig 37 °C-on inkubáljuk. 0,05 pmol S2222 szubsztrát (Kabi Vitrum) hozzáadása után 20 percig 37 °C-on inkubáljuk, és végül 405 nm-en méljük az abszorpciót. Ezeknek az összetételeknek az abszorpciója ugyanolyan magas, mint a találmány szerinti fehérjét nem tartalmazóké, azaz a fehérje sem az Xa faktor, sem a tripszin aktivitását nem gátolja.
8. példa
Izoelektromos fokuszálás
A találmány szerinti fehérjét 3 és 9 pH tartományban izoelektromos fokuszálásra szolgáló gélre (Pharmacia) visszük föl és standard fehéijékkel (Calibration Kit pH 3-10) együtt fókuszáljuk. A találmány szerinti fehérje fókuszáló helyzete a szójabab tripszininhibitor (I. P.=izoelektromos pont=4,55) és a β-laktoglobulin A (I. P.=5,2) fókuszáló helyzete között volt.
9. példa
A trombin-idő meghosszabítása
A trombin-idő a tesztplazmához adott exogén trombin aktivitását méri. 0,1 ml plazmához a találmány szerinti fehérje különböző hígítású (6-58 nmol) oldatának 50 pl-ét és 50 pl dietilbarbiturát-acetát-puffert, pH 7,6 adunk és 1 percig 37 °C-on inkubáljuk. 0,1 ml trombinoldat (3 NE/ml) hozzáadása után a véralvadás megindulásáig mérjük az időt (Biomatic 2000 Coagulometer von Sarstedt). A 35 nmol/1 koncentrációban rendelkezésre álló találmány szerinti fehéije a kontroliösszetétellel összehasonlítva 5-szörösére hosszabbítja meg az alvadási időt (lásd az 1. ábrát).
70. példa
A belső aminosavszekvenciák meghatározása Lys Cvel történő hasítás után
A találmány szerinti fehérjét (59 pg) 10% 2-merkapto-etanollal redukáljuk (2 órán át N2-atmoszférában szobahőmérsékleten) és utána átalakítjuk 4-vinilpiridinnel (2 órán át N2-atmoszférában szobahőmérsékleten). 25 mmol/1 Tris-HCl, pH 8,5 és 1 mmol/1 EDTA keverékével szembeni dialízist követően a mintát 1 pg Lys C-vel (Boehringer Mannheim) elegyítjük és 6 órán keresztül 37 °C-on inkubáljuk. Ezt a hasítási elegyet Supersper RP-18, 4 pm (250x4 mm, MZ-Analysentechnik, Mainz) oszlopra visszük fel és 0,1% TFA vízben - 0,08% TFA 70% acetonitrilben gradienssel eluáljuk (HPLC-Anlage von Waters). Megméijük az abszorpciót 280 és 214 nm-en és az eluátumot frakcionáljuk. Az abszorpciós csúcsoknak megfelelő frakciókat beszárítjuk és felvesszük 30 pl vízben. Az egyes frakciókat automatikus aminosavszekvenátorban (Applied Biosystems Inc.) a gyártó utasításai szerint szekvenáljuk. A következő szekvenciák adódnak (indítás mindig az N-terminálistól, „?” azt jelenti, hogy nem azonosítható egyértelműen):
1. Ala-Met-Gly-Asp-Phe-Lys-Pro-Glu-Glu-PhePhe-?-Gly-Thr-Arg(?)-Tyr-Leu-Ala (az arginin meghatározása bizonytalan)
2. Gly-Phe-Thr-Gln-Ile-Val-Glu-Ile-Gly-TyrAsn-Lys3. Asn-Gly-Glu-Gln-Tyr-Ser-Phe-Lys77. példa
A találmány szerinti cDNS-ek molekuláris klónozása
Ha ismert a találmány szerinti fehérje N-terminális végének szekvenciája, meghatározható egy neki megfelelő nukleotidszekvencia (lásd a WO 90/07861 számon közzétett szabadalmi bejelentést).
aa) Specifikus minták előállítása PCR-technikával
A találmány szerinti cDNS meghatározása céljából először szintetizáljuk a primert (előteijesztés, indító darab), amelyet előzőleg az Edman-féle lebontásban meghatározott aminosavszekvenciából vezetünk le. A találmány szerinti cDNS egy fragmentumának PCR-rel (Polymerase Chain Reaction=polimeráz lánc reakció) történő amplifikálásához a primer szintetizált oligonukleotidszekvenciáját használjuk föl (lásd a 4,800,159 számú amerikai szabadalmat).
Két oligonukleotid primert állítunk elő azáltal, hogy a nukleotidszekvencíát a teljes találmány szerinti fehérje és valamelyik fragmentuma N-terminális területének előzőleg részben meghatározott aminosavszekvenciájából vezetjük le. Ehhez a következő aminosavszekvenciákat használjuk föl:
A teljes fehérje N-terminális szekvenciája:
Ala-Glu-Gly-Asp-Asp-Cys-Ser-Leu-Glu-Lys-Ala-Met-Gly-Asp-Phe 5 10 15 és a fragmentum N-terminális szekvenciája:
Gly-Phe-Thr-Gln-lle-Val-Glu-lle-Gly-Tyr-Asn-Lys 5 10 12
HU 220 301 Β
A lenyomat (templát) egy olyan poli-A+-RNS-ből származó cDNS-ből áll, amelyet előzőleg a Triatoma pallidipennis nyálából izoláltunk [Sambrook et al., Molecular Cloning Chapter 7, 18-22 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
Lenyomatkezdő darab (szenz primer):
5’-GCI GA(A/G) GGI GA(C/T) GA(C/T) TG(C/T) TCI CTI GA(A/G) AA(A/G) GCI ATG GGI GA(C/T) TT-3’
Nem lenyomatkezdő darab (antiszenz primer):
5’-TT (G/A)TT (G/A)TA ICC (G/A)AT (T/C)TC IAC (G/A)AT (T/C)TG IGT (G/A)AA-3
A=dezoxi-adenozin; C=dezoxi-citidin;
G=dezoxi-guanozin T=dezoxi-timidin és
I=dezoxi-inozin
A PCR 40 ciklusból tevődik össze. Egy ciklus a következőképpen néz ki:
a) 2 perc denaturálás 94 °C-on,
b) 90 másodperc hibridizálás 52 °C-on és
c) 2 perc meghosszabbítás 72 °C-on.
Az előzőleg leírt eljárás során nyert megsokszorozott PCR-termék egy sávot mutat agarózgélen. Ezt az alacsony olvadáspontú agarózgéltől elválasztjuk és közvetlenül átvisszük a PCR-plazmidba (Stratagene) és szubklónozzuk. Az eljárás megfelel a gyártó (pCR-Script™ SK(+) Cloning Kit von Stratagene) által adott leírásnak. Az inszerciós termék DNS-szekvenciája megfelel a PCR-termék szekvenciájának, és úgy határozzuk meg, ahogyan azt Sanger és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)] leírják, bb) A cDNS-bank szelekciós eljárása és a találmány szerinti cDNS-klónok izolálása
Körülbelül 400 000 a T. pallidipennis nyálmirigyének cDNS-bankjából (cDNA library=cDNS-könyvtár) való primer kiónt viszünk át nejlonmembránokra (Pali Biosupport East Hills, NY, USA) és screenelést végzünk a gyártó előírása szerint. Ehhez egy, az előzőleg leírt PCR-sokszorozó módszer segítségével nyert markírozott mintát használunk fel. A szelekciós eljárást kétszer hajtjuk végre, ezt követi a fág-DNS átalakítása plazmid-DNS-sé és e plazmid inszertumának (beépített DNS) szekvenciaanalízise. Ezáltal négy cDNS-szekvenciát határozunk meg, amelyeket a 13-16. számú szekvenciavázlatokon ábrázolunk, ahol csupán a T128 és Ti45-nél a 17-től 9-ig terjedő aminosavakra, a Til2-nél a 18-as aminosavra vonatkozó triplettek hiányoznak.
Az izolált DNS mindkét szálát szekvenáljuk. A kódoló-DNS-ből levezetett aminosavszekvencia teljes mértékben egybevág azzal az aminosavszekvenciával, amelyet előzőleg a találmány szerinti tisztított fehérjéből az Edman-féle lebontás segítségével már meghatároztunk.
A leghosszabb cDNS-klón (Til2) TG-nukleotidokkal kezdődik, amely egy hiányos metionin startkodonnak felel meg. Ez akkor válik nyilvánvalóvá, ha figyelembe veszünk egy további izolált kiónt (Ti5), amelyet ugyanazon cDNS-bank 600 000 fágjával történő szelekciós eljárás során találtunk, amelyeket a Til2, Ti28 és Ti45 szelekciójánál használtunk fel.
2. táblázat
Pozíciók, amelyekben a találmány szerinti fehérjék különbségekkel rendelkeznek
Ηκΐόη
Ti5 Til2 ΤΊ28 Ti45
Helyzet 8 Ile Leu Leu Leu
Helyzet 32 Gly Gly Asp Asp
Helyzet 72 Val Val Val Alá
Helyzet 74 Asn Asn Asn Lys
Helyzet 77 Gly Asp Asp Asp
Helyzet 86 Ser Gly Gly Gly
Helyzet 114 Thr Ile Ile Thr
Helyzet 127 Leu Phe Phe Phe
Helyzet 139 Lys Asn Asn Asn
A találmány szerinti fehérje négy cDNS-ét az előzőleg leírt módszer szerint szelektáljuk, azonosítjuk és szekvenáljuk. Csupán 9 helyzetben mutatkozik eltérés a levezetett aminosavak szekvenciáiban. Ezeket az eltéréseket a 2. táblázatban soroljuk fel.
A négy érett, találmány szerinti fehérje azonossága és hasonlósága mintegy 95 vagy 98%, aszerint, hogy melyiket vesszük az összehasonlítás alapjául.
12. példa
A találmány szerinti fehéijét kódoló plazmid előállítása és az E. coléo'án előállított fehérje expressziója és tisztítása
Amennyiben ismertek a DNS-szekvenciák, megfelelő promoterek és adott esetben megfelelő transzkripciót fokozó, hozzáköthetők a mindenkori DNS-szekvenciához oly módon, hogy ezáltal egy felhasználható vektor álljon rendelkezésre [Wirth M. et al., in: Protein Glycosylation, Cellular Biotechnical and Analytical Aspects ed. Conradt H. S., VCH publishers, Weinheim 15, 49-52 (1991); Krátzschmar J. et al., Gene 116, 281-284 (1992)]. Egy ilyen vektor expressziója eukariótákban (például fiatal hörcsögvesesejtekben) lehetséges. Továbbá a DNS-szekvenciák beépíthetők
E. coli törzsekben való expresszióra szolgáló megfelelő prokarióta vektorokba.
a) A plazmid előállítása
i) Előzmény
A találmány szerinti rekombináns fehéije prokariótákban történő expressziójára szolgáló szerkezetet úgy állítjuk elő, hogy beültetjük a kereskedelemben kapható pKK233-2 plazmidot, amely tartalmazza az IPTG-t indukáló trc promotert. Az expresszióhoz megfelelő vektor magában foglalja ezt a pKK233-2 plazmidot, amelybe beiktattuk (inszertáltuk) mind a találmány szerinti fehérjét kódoló szekvenciát, mind egy szignálszekvenciát. A szignálszekvencia egy olyan módosított szignálszekvencia, amely a kiválasztott E. coli-fehérjére, a ciklofilm a-ra vezethető vissza. A szignálszekvenciát és a kódoló-DNS-t a promotertől lefelé (downstream)
HU 220 301 Β építjük be, amelynek révén létrejön a pKK/cph plazmid [Hayano T., Biochemistry 30, 3041-3048 (1991)].
A találmány szerinti fehérjét kódoló szekvenciákat az expressziós plazmidba inszertáljuk és az így kapott szerkezetet (pKK/cph-fehérje) alkalmas E. coli JM 105 sejtek transzformációjára használjuk fel. ii) A pKK/cph plazmid összeállítása
A következő pár, egymással részben átfedő és komplementer oligodezoxinukleotidot használjuk fel a ciklofilin a szignálszekvenciáját kódoló DNS lemásolására. Ennél a műveletnél úgy módosítjuk a ciklofilinszekvencia megfelelő C-terminális végét, hogy egy optimális hasítóhelyet képezzünk a bakteriális szignálpeptidáz részére. A módosítás abban áll, hogy a C-terminális vég utolsó hét triplettjét a következő aminosavszekvenciát kódoló triplettekre cseréljük ki: Phe-Ser-AlaSer-Ala-Leu-Ala [Dalbey R. E. és Heijne G., TIBS 17, 474-478 (1992)].
Jelentést hordozó oligonukleotidszekvencia (szenz oligo):
5’-GCGATAACAT GTTCAAAAGC
ACCCTGGCGG CGATGGCTGC TGTTTTCGCT
CTGTCTG-3’;
Jelentést nem hordozó oligonukleotidszekvencia (antiszenz oligo) ’-CGCTATAAGC TTCTGCAGGC
TAGCGCGCTC GCGCTGAAAG
CAGACACAGT CGAAACAG-3’
A startszekvencia hozzákötése és ehhez kapcsolódóan Taq polimeráz felhasználásával a leány darabok komplettálása után a DNS-fragmentumokat AflIII és HindlII segítségével hasítjuk. A hasítási helyeket aláhúztuk. Ezután a DNS-ffagmentumot a pKK233-2 plazmid Ncol és HindlII hasítási helyei közé szubklónozzuk. Az Nhel helyet, amely a HindlII hellyel együtt a cDNS-darabok további szubklónozását könnyíti meg, zsímyomással jelöljük meg.
ii) A találmány szerinti fehérje plazmidjának összeállítása
A következő pár startszekvenciát (primer) használjuk fel az érett, találmány szerinti fehérjét kódoló szekvencia (Ti28=2. számú szekvencia) sokszorozására. Ennél a Nhel és HindlII hasító helyeket - aláhúzott részek - vesszük igénybe a pKK/cph plazmidba történő inszercióhoz.
Jelentést hordozó oligonukleotidszekvencia (szenz oligo):
’-GCGATAGCTA GCAGCAGAAG
GTGACGAC-3’;
Jelentést nem hordozó oligonukleotidszekvencia (antiszenz oligo)
5’-GCGATAGGAT CCAAGCTTAC
TAACAAATTT CATTAGCATC
AGG-3’
A PCR-hez (polimeráz láncreakcióhoz) tíz, a következő lépésekből álló ciklust végzünk el: 2 perc 94 °Con, 2 perc 30 °C-on és 2,5 perc 72 °C-on, amelyben 2 pg lenyomat-szálat (templátot) használunk fel. A megsokszorozott DNS-t alacsony olvadáspontú agarózgélen izoláljuk, hasítjuk A%el-gyel és Hindlllmal és átvisszük a pKK/cph plazmidba, amelyet előzőleg ugyanezekkel a restrikciós endonukleázokkal hasítottunk. Az így kapott szerkezetet a kódoló-DNS és a kódoló-DNS-t szegélyező DNS teljes szekvenálása segítségével vizsgáljuk át.
ifi) E. coli transzformálása
Az E. coli JM 105 sejteket a CaCl2-os eljárás alkalmazásával transzformáljuk. Ehhez 1 pg a találmány szerinti fehérjét kódoló pKK/cph DNS-t használunk fel. b) Az E. coli által termelt találmány szerinti fehérje tisztítása és jellemzése
A transzformált E. co/z'-sejtek tenyészetéhez 1 mmol/1 IPTG-t (IPTG=izopropil-P-D-tiogalaktozid) keverünk és hat órán át 37 °C-on inkubáljuk. A sejteket lecentrifugáljuk és ozmotikus sokknak (szacharózos és ahhoz kapcsolódó vizes kezelésnek) vetjük alá. Az így nyert periplazmafrakció a véralvadástesztben (vesd össze a 2. példával) gátolja a trombinaktivitást. A gátló aktivitást DE-52 cellulózon végzett ioncserélő kromatográfiával és trombinaffinitás-kromatográfrával finomítjuk (vesd össze az 1. példával).
A tisztított frakció ugyanolyan gátló aktivitással rendelkezik, mint a nyálfehérje. Azonos viselkedést mutat SDS-poliakrilamid-elektroforézisnél (vesd össze a 6. példával). Továbbá az N-terminális aminosavszekvenciában egyezést mutat az érett nyálfehérjével.
1. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: aminosavszekvencia A szekvencia hossza: 142 aminosav Topológia: lineáris
A molekula típusa: érett fehérje Til2 Eredete: Triatomapallidipennis-nyálmíúgy Egyed/izolátum: Til2
Megjegyzés: érett fehérjeként trombininhibitor
Az 1. számú szekvencia leírása:
Al a Glu Gly Asp Asp Cys 5 Ser Leu Glu Lys 10 Al a Me t Gly Asp Phe 15
Ly s Pro Glu Glu Phe Phe Asn Gly Thr Trp Tyr Leu Al a Hi s Gly
20 25 30
Pro Gly Val Thr Ser Pro Al a Val Cy s Gin Lys Phe Thr Thr Ser
35 40 45
HU 220 301 B
20 Gly Phe Ser Glu Ly s Ser Gly Asn Phe 50 Val 65 Thr Ly s Gin Phe
25 Asn Asp Glu Gin Tyr Ser Phe
Glu Phe Glu Al a 80 Asp Phe Thr
30 Phe Al a Leu Val 95 Cy s Arg Ser
35 Glu Asp Asp Tyr 110 Leu Val Phe
Pro Asp Alá Asn 125 Glu I le Cy s
140
2. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: aminosavszekvencia A szekvencia hossza: 142 aminosav Topológia: lineáris
A molekula típusa: érett fehérje Ti28 Eredete: Triatomapallidipennis-nyá)mmgy Egyed/izolátum: Ti28
Megjegyzés: érett fehérjeként trombininhibitor
A 2. számú szekvencia leírása:
10
Alá Glu Gly Asp Asp Cys Ser 5
15 Lys Pro Glu Glu Phe Phe Asn 20
Pro Asp Val Thr Ser Pro Alá 35
20
Gly Ser Lys Gly Phe Thr Gin 50
25 Phe Glu Ser Asn Val Lys Phe 65
Asn Asp Glu Gin Tyr Ser Phe 80
30 Glu Phe Glu Alá Asp Phe Thr 95
Phe Alá Leu Val Cys Arg Ser 110
35
Glu Asp Asp Tyr Leu Val Phe 125
40 Pro Asp Alá Asn Glu I le Cys 140
3. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: aminosavszekvencia A szekvencia hossza: 142 aminosav Topológia: lineáris
A molekula típusa: érett fehérje Ti45 Eredete: Triatomapallidipennis-nyáhningy Egyed/izolátum: Ti45
Megjegyzés : érett fehérjeként trombininhibitor
I le Val Glu 55 Asn 70 I le Gin Gly Tyr Asn Lys 60
Gin Cys
Val Asp Asn Ly s 75
Lys Cys Lys Gly Ser Asp Asn Thr
85 90
Phe I le Ser Val Ser Tyr Asp Asn
100 105
I le I le Phe Thr Ser Gl n Pro Lys
115 120
Glu Arg Thr Lys Ser As p Thr Asp
130 135
Leu Glu Lys Al a Me t Gly Asp Phe
10 15
Gly Thr Trp Tyr Leu Al a Hi s Gly
25 30
Val Cy s Gin Lys Phe Thr Thr Ser
40 45
I le Val Glu I le Gly Tyr Asn Ly s
55 60
Gin Cys Asn Gin Val Asp Asn Lys
70 75
Lys Cy s Lys Gly Ser Asp Asn Thr
85 90
Phe I le Ser Val Ser Tyr Asp Asn
100 105
I le I le Phe Thr Ser Gin Pro Lys
115 120
Glu Arg Thr Ly s Ser Asp Thr Asp
130 135
HU 220 301 B
A 3. számú szekvencia leírása: Asp 5 Cy s Ser
Alá Glu Gly Asp
10
Lys Pro Glu Glu Phe 20 Phe Asn
15 Pro Asp Va 1 Thr Ser 35 Pro Al a
Gly Ser Ly s Gly Phe 50 Thr Gin
20 Phe Glu Ser Asn Val 65 Lys Phe
Asn Asp G1 u Gin Tyr 80 Ser Phe
25
Glu Phe Glu Alá Asp 95 Phe Thr
30 Phe Alá Leu Va 1 Cy s 110 Arg Ser
Glu Asp Asp Ty r Leu 125 Val Phe
35 Pro Asp Al a Asn Glu 140 I le Cy s
4. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: aminosavszekvencia A szekvencia hossza : 142 aminosav Topológia: lineáris
A molekula típusa: érett fehérje Ti5 Eredete: Triatomapallidipennis-nyálmirigy Egyed/izolátum: Ti5
Megjegyzés: érett fehérjeként trombininhibitor
A 4. számú szekvencia leírása: Asp 5 Cy s Ser
Alá Glu Gly As p
10
Lys Pro Glu Glu Phe 20 Phe Asn
15 Pro Gly Va 1 Thr Ser 35 Pro Al a
Gly Ser Lys Gly Phe 50 Thr Gin
20 Phe Glu Ser Asn Val 65 Lys Phe
Asn Gly Glu Gin Tyr 80 Ser Phe
25
Glu Phe Glu Alá Asp 95 Phe Thr
30 Phe Alá Leu Val Cy s 110 Arg Ser
Glu Asp Asp Tyr Leu 125 Val Leu
35 Pro Asp Al a Lys Glu 140 11 e Cy s
Leu Glu Lys 10 Alá Me t Gly Asp Phe 15
Gly Thr Trp 25 Tyr Leu Al a Hi s Gly 30
Val Cy s Gin 40 Lys Phe Thr Thr Ser 45
I le Val Glu 55 I le Gly Tyr Asn Lys 60
Gin Cy s Asn 70 Gin Al a As p Lys Lys 75
Lys Cy s Ly s 85 Gly Ser As p Asn Thr 90
Phe I le Ser 100 Val Ser Tyr Asp Asn 105
I le Thr Phe 115 Thr Ser Gin Pro Ly s 120
Glu Arg Thr 130 Lys Ser As p Thr Asp 135
I 1 e Glu Ly s 10 Al a Me t Gly Asp Phe 15
Gly Thr Trp 25 Tyr Leu Al a Hi s Gly 30
Val Cy s Gin 40 Lys Phe Thr Thr Ser 45
I le Val Glu 55 Ile Gly Tyr Asn Lys 60
Gin Cy s Asn 70 Gin Val As p Asn Lys 75
Ly s Cy s Ly s 85 Ser Ser Asp Asn Thr 90
Phe Ile Ser 100 Val Ser Tyr Asp Asn 105
I le Thr Phe 115 Thr Ser Gin Pro Lys 120
Glu Arg Thr 130 Lys Ser Asp Thr Asp 135
5. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: aminosavszekvencia A szekvencia hossza: 160 aminosav Topológia: lineáris
A molekula típusa: érett fehérje szignálszekvenciával Til2 Eredete: Triatomapallidipennis-nyáhnmgy
HU 220 301 B
Egyed/izolátum: Til2
Megjegyzés: érett fehérjeként trombininhibitor
Az 5. számú szekvencia leírása:
10
11 e -15 Ile Al a Val Thr Ile -10 Phe Gly Ile
15 Al a Glu Gly As p Asp 5 Cys Ser Leu Glu
Ly s Pro Glu Glu Phe 20 Phe Asn Gly Thr
20 Pro Gly Val Thr Ser 35 Pro Al a Val Cys
Gly Ser Lys Gly Phe 50 Thr Gin Ile Val
25
Phe Glu Ser Asn Val 65 Ly s Phe Gin Cys
30 Asn Asp Glu Gin Tyr 80 Ser Phe Ly s Cy s
Glu Phe Glu Al a As p 95 Phe Thr Phe Ile
35 Phe Al a Leu Va 1 Cy s 110 Arg Ser Ile Ile
Glu As p Asp Tyr Leu 125 Val Phe Glu Arg
40
As p Pro Asp Al a Asn 140 Glu Ile Cys
6. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: aminosavszekvencia A szekvencia hossza: 160 aminosav Topológia: lineáris
A molekula típusa: érett fehérje szignálszekvenciával Ti28 Eredete: Triatomapallidipennis-ayáknmgy Egyed/izolátum: Ti28
Megjegyzés: érett fehérjeként trombininhibitor
A 6. számú szekvencia leírása:
e 15 -15
Al a
Ly s
Pro
Gly
Phe
Asn
I1e Alá
Glu Gly
Pro Glu
Asp Val
Ser Lys
Glu Ser
Asp Glu
Glu Phe Glu
Va 1 Thr
Asp Asp 5
Glu Phe 20
Thr Ser 35
Gly Phe 50
Asn Val 65
Gin Tyr 80
Al a Asp 95
Ile Phe -10 -9
Cys Ser
Phe Asn
Pro Alá
Thr Gin
Lys Phe
Ser Phe
Phe Thr
Gly Ile
-8
Leu Glu
Gly Thr
Val Cys
Ile Va 1
Gin Cys
Lys Cys
Phe Ile
Leu Thr -5
Ly s 10 Alá
Trp 25 Tyr
Gin 40 Lys
Glu 55 Ile
Asn 70 Gin
Ly s 85 Gly
Ser 100 Va 1
Phe 115 Thr
Thr 130 Ile
Le u Thr -5
Ly s 10 Al a
Trp 25 Tyr
Gin 40 Lys
Glu 55 Ile
Asn 70 Gin
Ly s 85 Gly
Ser 100 Va 1
Me t -18
Cys Alá
Me t Gly
Leu Alá
Phe Thr
Gly Tyr
Val Asp
Ser Asp
Ser Tyr
Ser Gin
Lys Ser
Me t
-18
Cys Al a
Me t Gly
Leu Al a
Phe Thr
Gly Tyr
Va 1 As p
Ser As p
Ser Tyr
Lys Thr -17
Tyr Alá -1
Asp Phe 15
His Gly 30
Thr Ser 45
Asn Lys 60
Asn Lys 75
Asn Thr 90
Asp Asn 105
Pro Lys 120
Asp Thr 135
Lys Thr
Tyr Alá -1
Asp Phe 15
His Gly 30
Thr Ser 45
Asn Lys 60
Asn Lys 75
Asn Thr 90
Asp Asn 105
HU 220 301 B
Phe Al a Leu Val Cy s Ar g Ser I le I le Phe Thr Ser Gin Pro Lys
40 110 115 120
Glu Asp Asp Tyr Leu Val Phe Glu Arg Thr Lys Ser Asp Thr Asp
125 130 135
45 Pro Asp Al a Asn Glu I le Cy s
140
7. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa : aminosavszekvencia A szekvencia hossza: lóOaminosav Topológia: lineáris
A molekula típusa: érett feltétje szignálszekvenciával Ti45 Eredete: Triatomapallidipennis-nyáhnaigy Egyed/izolátum: Ti45
Megjegyzés: érett fehérjeként trombininhibitor
A 7, számú szekvencia leírása:
Met Lys Thr -18
11 e 1 le Al a Val Thr I le Phe Gly I le Leu Thr Cy s Al a Tyr Al a
15 -15 -10 -9 -8 -5 -1
Al a Glu Gly Asp Asp Cy s Ser I le Glu Ly s Al a Me t Gly Asp Phe
5 10 15
20 Lys Pro Glu Glu Phe Phe Asn Gly Thr Trp Tyr Leu Al a Hi s Gly
20 25 30
Pro Asp Val Thr Ser Pro Al a Val Cy s Gin Lys Phe Thr Thr Ser
25 35 40 45
Gly Ser Lys Gly Phe Thr G1 n I le Val Glu I le Gly Tyr Asn Ly s
50 55 60
30 Phe Glu Ser Asn Val Lys Phe Gin Cy s Asn Gin Al a Asp Lys Lys
65 70 75
Asn Asp Glu Gin Tyr Ser Phe Lys Cy s Ly s Gly Ser Asp Asn Thr
80 85 90
35 Glu Phe Glu Al a Asp Phe Thr Phe I le Se r Val Ser Tyr Asp Asn
95 100 105
Phe Al a Leu Val Cy s Arg Ser I le Thr Phe Thr Ser Gin Pro Lys
40 110 115 120
Glu Asp Asp Tyr Leu Val Phe Glu Arg Thr Lys Ser Asp Thr Asp
125 130 135
45 Pro Asp Al a Asn Glu I le Cy s
140
8. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: aminosavszekvencia A szekvencia hossza: lóOaminosav Topológia: lineáris
A molekula típusa : érett fehérje szignálszekvenciával TíS Eredete: Triatomapallidipennis-nyáimmgy Egyed/izolátum: Ti5
Megjegyzés: érett fehérjeként trombininhibitor
A 8. számú szekvencia leírása:
Me t Lys Thr
-18
I le -15 I le Al a Val Thr I le -10 Phe Gly I le Leu Thr -5 Cy s Al a Tyr Al a -1
Alá Glu Gly Asp Asp Cy s Ser I le Glu Ly s Al a Me t Gly As p Phe
5 10 15
Lys Pro Glu Glu Phe Phe As n Gly Thr Trp Tyr Le u Alá Hi s Gly
20 25 30
HU 220 301 B
Pro Gly Val Thr Ser Pro Al a Val Cy s Gin Ly s Phe Thr Thr Ser
35 40 45
Gly Ser Ly s Gly Phe Thr Gin I le Val Glu I le Gly Tyr Asn Ly s
50 55 60
Phe Glu Ser Asn Val Ly s Phe Gin Cy s Asn Gin Val As p Asn Ly s
65 70 75
Asn Gly Glu G1 n Tyr Ser Phe Ly s Cy s Ly s Ser Ser Asp Asn Thr
80 85 90
Glu Phe Glu Al a Asp Phe Thr Phe I le Ser Val Ser Tyr Asp Asn
95 100 105
Phe Al a Leu Val Cy s Arg Ser I le Thr Phe Thr Ser Gin Pro Ly s
1 10 115 120
G1 u Asp Asp Tyr Leu Val Leu Glu Arg Thr Ly s Ser Asp Thr Asp
125 130 135
Pro Asp Al a Ly s Glu I le Cy s
140
9. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleotidszekvencia A szekvencia hossza: 429 nukleotid A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris
Hipotetikus: nem Antiszenz: nem
A molekula típusa: Til2 érett fehéijét kódoló cDNS Eredete: Triatoma pallidipennis-nyálmmgy Egyed/izolátum: Til2
Sejttípus: egysejtű szervezet
Megjegyzés: trombininhibitorként működő érett fehéijét kódol
A 9. számú szekvencia leírása :
GCA GAA GGT GAC GAC TGT TCA TTA GAA AAA GCT ATG GGG GAC TTT 045
AAA CCA GAG GAG TTT TTC AAT GGA ACG TGG TAT TTG GCT CAT GGA 090
CCG GGC GTA ACA AGT CCA GCT GTC TGT CAG AAA TTT ACT ACT AGT 135
GGA AGC AAA GGT TTC ACC CAA ATT GTT GAA ATA GGG TAC AAC AAA 180
TTT GAA AGT AAC GTG AAA TTC CAA TGC AAT CAA GTT GAT AAT AAA 225
AAT GAC GAA CAA TAT TCT TTC AAA TGC AAA GGT AGT GAT AAT ACT 270
GAA TTC GAA GCA GAT TTT ACA TTT ATT AGT GTA AGC TAT GAT AAC 315
TTT GCT TTA GTT TGT AGA AGT ATC ATA TTT ACA TCA CAG CCT AAG 360
GAA GAT GAT TAT TTG GTA TTC GAA CGG ACT AAA AGT GAC ACA GAT 405
CCT GAT GCT AAT GAA ATT TGT TAG 429
10. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleotidszekvencia A szekvencia hossza: 429 nukleotid A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris
Hipotetikus: nem Antiszenz: nem
A molekula típusa: T128 érett fehérjét kódoló cDNS Eredete: Triatoma pallidipennis-nyáhrárigy Egyed/izolátum: Ti28
Sejttípus: egysejtű szervezet
Megjegyzés: trombininhibitorként működő érett fehéijét kódol
A 10. számú szekvencia leírása:
GCA GAA GGT GAC GAC TGT TCA TTA GAA AAA GCT ATG GGG GAC TTT 045
AAA CCA GAG GAG TTT TTC AAT GGA ACG TGG TAT TTG GCT CAT GGA 090
CCG GAC GTA ACA AGT CCA GCT GTC TGT CAG AAA TTT ACT ACT AGT 135
GGA AGC AAA GGT TTC ACC CAA ATT GTT GAA ATA GGG TAC AAC AAA 180
TTT GAA AGT AAC GTG AAA TTC CAA TGC AAT CAA GTT GAT AAT AAA 225
AAT GAC GAA CAA TAT TCT TTC AAA TGC AAA GGT AGT GAT AAT ACT 270
HU 220 301 B
GAA TTC GAA GCA GAT TTT ACA TTT ATT AGT GTA AGC TAT GAT AAC 315
TTT GCT TTA GTT TGT AGA AGT ATC ATA TTT ACA TCA CAG CCT AAG 360
GAA GAT GAT TAT TTG GTA TTC GAA CGG ACT AAA AGT GAC ACA GAT 405
CCT GAT GCT AAT GAA ATT TGT TAG 429
11. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleotidszekvencia A szekvencia hossza: 429 nukleotid A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris
Hipotetikus: nem Antiszenz: nem
A molekula típusa: Ti45 érett fehérjét kódoló cDNS Eredete: Triatomapallidipennis-nyáimmgy Egyed/izolátum: Ti45
Sejttípus: egysejtű szervezet
Megjegyzés: trombininhibitorként működő érett fehérjét kódol
All. számú szekvencia leírása:
GCA GAA GGT GAT GAC TGT TCA TTA GAA AAA GCT ATG GGG GAC TTT 045
AAA CCA GAG GAG TTT TTC AAT GGA ACG TGG TAT TTG GCT CAT GGA 090
CCG GAC GTA ACA AGT CCA GCT GTC TGT CAG AAA TTT ACT ACT AGT 135
GGA AGC AAA GGT TTC ACC CAA ATT GTT GAA ATA GGG TAC AAC AAA 180
TTT GAA AGT AAC GTG AAA TTC CAA TGC AAT CAA GCT GAC AAA AAA 225
AAT GAC GAA CAA TAT TCT TTC AAA TGC AAA GGT AGT GAT AAT ACT 270
GAA TTC GAA GCA GAT TTT ACA TTT ATT AGT GTA AGC TAT GAT AAC 315
TTT GCT CTA GTT TGT AGA AGT ATC ACA TTT ACA TCA CAG CCT AAG 360
GAA GAT GAT TAT TTG GTA TTC GAA CGG ACT AAA AGT GAC ACA GAT 405
CCT GAT GCT AAT GAA ATT TGT TAG 429
12. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleotidszekvencia A szekvencia hossza: 429 nukleotid A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris
Hipotetikus: nem Antiszenz: nem
A molekula típusa: Ti5 érett fehérjét kódoló cDNS Eredete: Triatoma pallidipennis-nyálmmgy Egyed/izolátum: Ti5
Sejttípus: egysejtű szervezet
Megjegyzés: trombininhibitorként működő érett fehéijét kódol
A 12. számú szekvencia leírása:
GCA GAA GGT GAT GAC TGT TCA ATA GAA AAA GCT ATG GGG GAC TTT 045
AAA CCA GAG GAG TTT TTC AAT GGA ACG TGG TAT TTG GCT CAT GGA 090
CCG GGC GTA ACA AGT CCA GCT GTC TGT CAG AAA TTT ACT ACT AGT 135
GGA AGC AAA GGT TTC ACC CAA ATT GTT GAA ATA GGG TAC AAC AAA 180
TTT GAA AGT AAC GTG AAA TTC CAA TGC AAT CAA GTT GAC AAT AAA 225
AAT GGC GAA CAA TAT TCT TTC AAA TGC AAA AGT AGT GAT AAT ACT 270
GAA TTC GAA GCA GAT TTT ACA TTT ATT AGT GTA AGC TAT GAT AAC 315
TTT GCT CTA GTT TGT AGA AGT ATC ACA TTT ACA TCA CAG CCT AAG 360
GAA GAT GAT TAT TTG GTA TTA GAA CGG ACT AAA AGT GAC ACA GAT 405
CCT GAT GCT AAA GAA ATT TGT TAG 429
13. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleotidszekvencia A szekvencia hossza: 483 nukleotid A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris
Hipotetikus: nem Antiszenz: nem
A molekula típusa: Til2 érett fehérjét szignálszekvenciával kódoló cDNS Eredete: Triatomapallidipennis-nyáhnirigy
HU 220 301 Β
Egyed/izolátum: Til2 Sejttípus: egysejtű szervezet
Megjegyzés: trombininhibitorként működő érett fehérjét kódol A 13. számú szekvencia leírása:
ATG AAG ACG ATC ATT GCA GTG ACA ATT TTT GGA ATT TTG ACA TGT 045
10 GCA TAT GCA GCA GAA GGT GAC GAC TGT TCA TTA GAA AAA GCT ATG 090
GGG GAC TTT AAA CCA GAG GAG TTT TTC AAT GGA ACG TGG TAT TTG 135
GCT CAT GGA CCG GGC GTA ACA AGT CCA GCT GTC TGT CAG AAA TTT 180
ACT ACT AGT GGA AGC AAA GGT TTC ACC CAA ATT GTT GAA ATA GGG 225
TAC AAC AAA TTT GAA AGT AAC GTG AAA TTC CAA TGC AAT CAA GTT 270
15 GAT AAT AAA AAT GAC GAA CAA TAT TCT TTC AAA TGC AAA GGT AGT 315
GAT AAT ACT GAA TTC GAA GCA GAT TTT ACA TTT ATT AGT GTA AGC 360
TAT GAT AAC TTT GCT TTA GTT TGT AGA AGT ATC ATA TTT ACA TCA 405
CAG CCT AAG GAA GAT GAT TAT TTG GTA TTC GAA CGG ACT AAA AGT 450
GAC ACA GAT CCT GAT GCT AAT GAA ATT TGT TAG 483
14. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleotidszekvencia A szekvencia hossza : 483 nukleotid A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris
Hipotetikus: nem Antiszenz: nem
A molekula típusa: Ti28 érett fehérjét szignálszekvenciával kódoló cDNS Eredete: Triatomapallidipennis-nyaimirigy Egyed/izolátum: Ti28
Sejttípus : egysejtű szervezet
Megjegyzés: trombininhibitorként működő érett fehérjét kódol A 14. számú szekvencia leírása:
ATG AAG ACG ATC ATT GCA GTG ACA ATT TTT GGA ATT TTG ACA TGT 045
10 GCA TAT GCA GCA GAA GGT GAC GAC TGT TCA TTA GAA AAA GCT ATG 090
GGG GAC TTT AAA CCA GAG GAG TTT TTC AAT GGA ACG TGG TAT TTG 135
GCT CAT GGA CCG GAC GTA ACA AGT CCA GCT GTC TGT CAG AAA TTT 180
ACT ACT AGT GGA AGC AAA GGT TTC ACC CAA ATT GTT GAA ATA GGG 225
TAC AAC AAA TTT GAA AGT AAC GTG AAA TTC CAA TGC AAT CAA GTT 270
15 GAT AAT AAA AAT GAC GAA CAA TAT TCT TTC AAA TGC AAA GGT AGT 315
GAT AAT ACT GAA TTC GAA GCA GAT TTT ACA TTT ATT AGT GTA AGC 360
TAT GAT AAC TTT GCT TTA GTT TGT AGA AGT ATC ATA TTT ACA TCA 405
CAG CCT AAG GAA GAT GAT TAT TTG GTA TTC GAA CGG ACT AAA AGT 450
GAC ACA GAT CCT GAT GCT AAT GAA ATT TGT TAG 483
15. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleotidszekvencia A szekvencia hossza: 483 nukleotid A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris
Hipotetikus: nem Antiszenz: nem
A molekula típusa: Ti45 érett fehérjét szignálszekvenciával kódoló cDNS Eredete: Triatoma pallidipennis-nyáimirigy Egyed/izolátum: Ti45
Sejttípus: egysejtű szervezet
Megjegyzés: trombininhibitorként működő érett fehéijét kódol
A 15. számú szekvencia leírása:
10 ATG AAG ACG ATC ATT GCA GTG ACA ATT TTT GGA ATT TTG ACA TGT 045
GCA TAT GCA GCA GAA GGT GAT GAC TGT TCA TTA GAA AAA GCT ATG 090
GGG GAC TTT AAA CCA GAG GAG TTT TTC AAT GGA ACG TGG TAT TTG 135
GCT CAT GGA CCG GAC GTA ACA AGT CCA GCT GTC TGT CAG AAA TTT 180
ACT ACT AGT GGA AGC AAA GGT TTC ACC CAA ATT GTT GAA ATA GGG 225
15 TAC AAC AAA TTT GAA AGT AAC GTG AAA TTC CAA TGC AAT CAA GCT 270
HU 220 301 B
GAC AAA AAA AAT GAC GAA CAA TAT TCT TTC AAA TGC AAA GGT AGT 315
GAT AAT ACT GAA TTC GAA GCA GAT TTT ACA TTT ATT AGT GTA AGC 360
TAT GAT AAC TTT GCT CTA GTT TGT AGA AGT ATC ACA TTT ACA TCA 405
CAG CCT AAG GAA GAT GAT TAT TTG GTA TTC GAA CGG ACT AAA AGT 450
GAC ACA GAT CCT GAT GCT AAT GAA ATT TGT TAG 483
16. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa : nukleotidszekvencia A szekvencia hossza: 483 nukleotid A szekvencia száltípusa: egy szálú Topológia: lineáris
Hipotetikus: nem
Antiszenz: nem
A molekula típusa: Ti5 érett fehérjét szignálszekvenciával kódoló cDNS Eredete: Triatomapallidipennis-nyáhningy Egyed/izolátum: Ti5
Sejttípus: egysejtű szervezet
Megjegyzés: trombininhibitorként működő érett fehérjét kódol
számú szekvencia leírása:
ATG AAG ACG ATC ATT GCA GTG ACA ATT TTT GGA ATT TTG ACA TGT 045
GCA TAT GCA GCA GAA GGT GAT GAC TGT TCA ATA GAA AAA GCT ATG 090
GGG GAC TTT AAA CCA GAG GAG TTT TTC AAT GGA ACG TGG TAT TTG 135
GCT CAT GGA CCG GGC GTA ACA AGT CCA GCT GTC TGT CAG AAA TTT 180
ACT ACT AGT GGA AGC AAA GGT TTC ACC CAA ATT GTT GAA ATA GGG 225
TAC AAC AAA TTT GAA AGT AAC GTG AAA TTC CAA TGC AAT CAA GTT 270
GAC AAT AAA AAT GGC GAA CAA TAT TCT TTC AAA TGC AAA AGT AGT 315
GAT AAT ACT GAA TTC GAA GCA GAT TTT ACA TTT ATT AGT GTA AGC 360
TAT GAT AAC TTT GCT CTA GTT TGT AGA AGT ATC ACA TTT ACA TCA 405
CAG CCT AAG GAA GAT GAT TAT TTG GTA TTA GAA CGG ACT AAA AGT 450
GAC ACA GAT CCT GAT GCT AAA GAA ATT TGT TAG 483
17. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: aminosavszekvencia A szekvencia hossza: 15 aminosav Topológia : lineáris
A molekula típusa: N-terminális fehérjefragmentum Eredete: Triatomapallidipennis-nytúm'mgy Megjegyzés: érett fehérjeként trombininhibitor
A 17. számú szekvencia leírása:
Alá Glu Gly Asp Asp Cys Ser Leu Glu Lys Alá Met Gly Asp Phe 5 10 15
18. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: aminosavszekvencia A szekvencia hossza: 21 aminosav Topológia: lineáris
A molekula típusa : N-terminális fehérjefragmentum Eredete: Triatomapallidipennis-nyá\mmgy Megjegyzés: érett fehérjeként trombininhibitor
A 18. számú szekvencia leírása:
Alá Glu Gly Asp Asp Cys Ser Leu Glu Lys Alá Met Gly Asp Phe 5 10 15
Xaa Pro Glu Glu Phe Phe
19. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: aminosavszekvencia A szekvencia hossza: 21 aminosav Topológia: lineáris
A molekula típusa: N-terminális fehérjefragmentum Eredete: Triatoma pallidipennis-nyá\mmgy Megjegyzés: érett fehérjeként trombininhibitor
HU 220 301 B
A 19. számú szekvencia leírása:
Alá Glu Gly Asp Asp Cys Ser Leu Glu Lys Alá Me t Gly Asp Phe 5 10 15
Lys Pro Glu Glu Phe Phe 20
20. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: aminosavszekvencia A szekvencia hossza: 18 aminosav Topológia: lineáris
A molekula típusa: N-terminális fehérjefragmentum Lys C-vel történt hasítás után Eredete: Triatoma pallidipennis-nyahnmgy Megjegyzés: érett fehérjeként trombininhibitor
A 20. számú szekvencia leírása:
Alá Me t Gly Asp Phe Lys Pro Glu Glu Phe Phe Xaa Gly Thr Arg 5 10 15
Tyr Leu Alá 18
21. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: aminosavszekvencia A szekvencia hossza : 12 aminosav Topológia: lineáris
A molekula típusa: N-terminális fehérjefragmentum Lys C-vel történt hasítás után Eredete: Triatomapallidipennis-nyáhnmgy Megjegyzés: érett fehérjeként trombininhibitor
A 21. számú szekvencia leírása:
Gly Phe Thr Gin I le Va1 Glu I le Gly Tyr Asn Lys 5 10
22. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: aminosavszekvencia A szekvencia hossza: 8 aminosav Topológia : lineáris
A molekula típusa: N-terminális fehérjefragmentum Lys C-vel történt hasítás után Eredete: Triatomapallidipennis-nyálmmgy Megjegyzés: érett fehérjeként trombininhibitor
A 22. számú szekvencia leírása:
Asn Gly Glu Gin Tyr Ser Phe Lys 5
23. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleotidszekvencia A szekvencia hossza : 44 nukleotid A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris
Hipotetikus: igen Antiszenz: nem
A molekula típusa: matrica indító darab Eredete: az aminosavszekvenciából levezetve Megjegyzés: N=inozin
A 23. számú szekvencia leírása:
GCN GAR GGN GAY GAY TGY TCN CTN GAR AAR GCN ATG GGN GAY TT 44
24. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleotidszekvencia A szekvencia hossza: 32 nukleotid A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris
Hipotetikus: igen Antiszenz: igen
A molekula típusa: nem matricaindító darab Eredete: az aminosavszekvenciából levezetve Megjegyzés: N=mozin
HU 220 301 B
A 24. számú szekvencia leírása:
TTR TTR TAN CCR ATY TCN ACR ATY TGN GTR AA 32
25. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: aminosavszekvencia
A szekvencia hossza: 7 aminosav
Topológia: lineáris
A molekula típusa: peptidfragmentum
Eredete: Triatomapallidipennis-nyáhnirigy
Megjegyzés: a módosított „ciklofilin a” C-terminális vége A 25. számú szekvencia leírása:
Phe Ser Alá Sqer Alá Leu Alá
26. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleotidszekvencia
A szekvencia hossza: 57 nukleotid
A szekvencia száltípusa: egyszálú
Topológia: lineáris
Hipotetikus : igen
Antiszenz: nem
A molekula típusa: matricaindító darab
Eredete: a módosított „ciklofilin a” egyik aminosavszekvenciájából levezetve A 26. számú szekvencia leírása:
GCGATAACAT GTTCAAAAGC ACCCTGGCGG CGATGGCTGC 40 TGTTTTCGCT CTGTCTG 57
27. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleotidszekvencia
A szekvencia hossza : 58 nukleotid
A szekvencia száltípusa: egyszálú
Topológia: lineáris
Hipotetikus: igen
Antiszenz: igen
A molekula típusa: nem matricaindító darab
Eredete: a módosított „ciklofilin a” egyik aminosavszekvenciájából levezetve A 27. számú szekvencia leírása:
CGCTATAAGC TTCTGCAGGC TAGCGCGCTC GCGCTGAAAG 40 CAGACACAGT CGAAACAG 58
28. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleotidszekvencia
A szekvencia hossza: 28 nukleotid
A szekvencia száltípusa: egyszálú
Topológia: lineáris
Hipotetikus : igen
Antiszenz: nem
A molekula típusa: matricaindító darab
Eredete: a találmány szerinti fehéije egyik aminosavszekvenciájából levezetve A 28. számú szekvencia leírása:
GCGATAGCTA GCAGCAGAAG GTGACGAC 28
29. számú szekvenciavázlat
A szekvencia típusa: nukleotidszekvencia
A szekvencia hossza: 43 nukleotid
A szekvencia száltípusa: egyszálú
Topológia: lineáris
Hipotetikus: igen
Antiszenz: igen
A molekula típusa: nem matricaindító darab
Eredete: a találmány szerinti fehéije egyik aminosavszekvenciájából levezetve A 29. számú szekvencia leírása:
GCGATAGGAT CCAAGCTTAC TAACAAATTT CATTAGCATC AGG 43

Claims (17)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Izolált vagy szintetikusan előállítható trombininhibitor fehérje, amely emlősállatok vérét szívó rovarok nyálából izolálható,
    Alá Glu · Gly · Asp · Asp Cys 5
    Gly Asp · Phe · Lys · Pro · Glu · 15 vagy
    b) amely aktív fehérjeként az előbbi, a) alatt bemutatott N-terminális aminosavszekvencia olyan allélmódosulataival rendelkezik, amelyeknél az N-terminális aminosavszekvencia egy vagy két aminosavját helyettesítettük, töröltük vagy beiktattuk anélkül, hogy ezáltal az aktív fehétje aktivitását lényegesen befolyásoltuk volna, vagy
    c) amely aktív fehérjeként az a) és b) alatti N-terminális szekvenciák olyan poszttranszlációs módosulataival rendelkezik, amelyek az aktív fehétje aktivitását nem befolyásolják lényegesen.
  2. 2. Izolált vagy szintetikusan előállítható trombininhibitor fehérje,
    d) amely aktív, érett fehérjeként a következő szekvenciák valamelyikét tartalmazza:
    i) 1. számú szekvencia (1. számú szekvenciavázlat);
    ii) 2. számú szekvencia (2. számú szekvenciavázlat);
    iii) 3. számú szekvencia (3. számú szekvenciavázlat) és iv) 4. számú szekvencia (4. számú szekvenciavázlat), vagy
    e) amely aktív, érett fehéreként az előbbi, d) alatt megnevezett aminosavszekvenciák valamelyikének olyan allélmódosulataival rendelkezik, amelyeknél az aminosavszekvenciának legalább egy aminosavját helyettesítettük, töröltük vagy beiktattuk anélkül, hogy ezáltal az aktív fehétje aktivitását lényegesen befolyásoltuk volna, vagy
    f) amely aktív, érett fehérjeként a d) és e) alatti szekvenciák valamelyikének olyan poszttranszlációs módosulataival rendelkezik, amelyek az aktív fehérje aktivitását nem befolyásolják lényegesen.
  3. 3. Fehérje, amely egy szignálszekvenciából és az 1. és 2. igénypont valamelyike szerinti érett fehéijéből áll,
    g) ahol a fehérje a következő szekvenciák valamelyikét tartalmazza:
    i) 5. számú szekvencia (5. számú szekvenciavázlat);
    ii) 6. számú szekvencia (6. számú szekvenciavázlat);
    iii) 7. számú szekvencia (7. számú szekvenciavázlat) és iv) 8. számú szekvencia (8. számú szekvenciavázlat), vagy
    a) amely aktív fehérjeként a következő N-terminális szekvenciával rendelkezik :
    • Leu · Glu · Lys · Alá Met •PhePhe·...
    h) ahol a fehétje az előbbi, g) alatt megnevezett aminosavszekvenciák valamelyikének olyan allélmódosulataival rendelkezik, amelyeknél az aminosavszekvenciának legalább egy aminosavját helyettesítettük, töröltük vagy beiktattuk anélkül, hogy ezáltal az érett, aktív fehérje aktivitását lényegesen befolyásoltuk volna, vagy
    i) ahol a fehérje a g) és h) alatti szekvenciák valamelyikének olyan poszttranszlációs módosulataival rendelkezik, amelyek az aktív érett fehérje aktivitását nem befolyásolják lényegesen.
  4. 4. Az előző igénypontok valamelyike szerinti fehérje, amely rekombináns fehétje.
  5. 5. Az előző igénypontok valamelyike szerinti fehérje, amely fehérje glikozilált.
  6. 6. cDNS vagy DNS, amely érett trombininhibitort kódol, aa) ahol a cDNS vagy DNS a következő aminosavszekvenciák valamelyikét kódolja:
    i) 1. számú szekvencia (1. számú szekvenciavázlat);
    ii) 2. számú szekvencia (2. számú szekvenciavázlat);
    iii) 3. számú szekvencia (3. számú szekvenciavázlat) és iv) 4. számú szekvencia (4. számú szekvenciavázlat), vagy bb) ahol a cDNS vagy DNS az aa) alatti aminosavszekvenciák valamelyikének olyan allélmódosulatát kódolja, amelyben az aminosavszekvenciának legalább egy aminosavját helyettesítettük, töröltük vagy beiktattuk anélkül, hogy ezáltal az aktív fehérje aktivitását lényegesen befolyásoltuk volna.
  7. 7. cDNS vagy DNS, amely trombininhibitort kódol, cc) ahol a cDNS vagy DNS a következő nukleotidszekvenciák valamelyikével rendelkezik:
    i) 9. számú szekvencia (9. számú szekvenciavázlat);
    ii) 10. számú szekvencia (10. számú szekvenciavázlat);
    iii) 11. számú szekvencia (11. számú szekvenciavázlat) és iv) 12. számú szekvencia (12. számú szekvenciavázlat), vagy dd) ahol a cDNS vagy DNS a cc) alatti nukleotidszekvenciák valamelyikének olyan allélmódosulatával ren21
    HU 220 301 B delkezik, amelyben legalább egy nukleotidot helyettesítettünk, töröltünk vagy beiktattunk anélkül, hogy a cc) alatti nukleotidszekvencia allélmódosulata által kódolt fehérje aktivitását lényegesen befolyásoltuk volna.
  8. 8. cDNS vagy DNS, amely trombininhibitort szignálszekvenciával együtt kódol, ee) ahol a cDNS vagy DNS a következő nukleotidszekvenciák valamelyikével rendelkezik:
    i) 13. számú szekvencia (13. számú szekvenciavázlat);
    ii) 14. számú szekvencia (14. számú szekvenciavázlat);
    iii) 15. számú szekvencia (15. számú szekvenciavázlat) és iv) 16. számú szekvencia (16. számú szekvenciavázlat), vagy ff) ahol a cDNS vagy DNS az ee) alatti nukleotidszekvenciák valamelyikének olyan allélmódosulatával rendelkezik, amelynél legalább egy nukleotidot helyettesítettünk, töröltünk vagy beiktattunk anélkül, hogy az ee) alatti nukleotidszekvencia allélmódosulata által kódolt, szignálszekvenciáját magában foglaló aktív fehérje aktivitását lényegesen befolyásoltuk volna.
  9. 9. Vektor, amely a 6-8. igénypontok valamelyike szerinti cDNS-t vagy DNS-t, továbbá megfelelő promotert és adott esetben megfelelő transzkripciófokozót tartalmaz.
  10. 10. Eukarióta vagy prokarióta gazdasejt, amelyet a 9. igénypont szerinti vektorral transzformáltunk.
  11. 11. Eljárás az 1-5. igénypontok valamelyike szerinti fehérjék előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan gazdasejtet tenyésztünk, amelyet a 6-8. igénypontok valamelyike szerinti cDNS-t vagy DNS-t tartalmazó vektorral transzformáltunk, és a fehérjét izoláljuk és tisztítjuk.
  12. 12. Eljárás az 1-5. igénypontok valamelyike szerinti fehéijék tisztítására, azzal jellemezve, hogy a fehérjéket izoláljuk, legalább egy oszlopon tisztítjuk és végül koncentráljuk.
  13. 13. Eljárás az 1-5. igénypontok valamelyike szerinti fehérjék tisztítására, azzal jellemezve, hogy a nyálat egy „Superose 12 HR oszlopra” visszük fel, eluáljuk és ismételten felvisszük egy CH-aktivált Sepharose oszlopra, amelyre előzőleg trombint kötöttünk és eluáljuk.
  14. 14. Az 1-5. igénypontok valamelyike szerinti fehérjék egyike vagy azok keveréke, amely gyógyászati hatóanyag.
  15. 15. Gyógyszer, amely az 1-5. igénypontok valamelyike szerinti fehéijék egyikét vagy azok keverékét tartalmazza.
  16. 16. Gyógyászati készítmény, amely az 1-5. igénypontok valamelyike szerinti fehérjék egyikét vagy azok keverékét gyógyászatilag összeférhető és elfogadható vegyületek és hordozók jelenlétében tartalmazza.
  17. 17. Az 1-5. igénypontok valamelyike szerinti fehérjék egyikének vagy azok keverékének felhasználása trombózisok vagy instabil angina vagy érelmeszesedés kezelésére, vagy PTCA/PTA-t követően az erek újraelzáródásának megelőzésére vagy hemodialízisnél a véralvadás megakadályozására szolgáló - gyógyszer előállítására.
HU9501626A 1992-12-04 1993-12-03 Véralvadásgátló protosztómiák (vérszívók) nyálából HU220301B (hu)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19924241659 DE4241659C1 (de) 1992-12-04 1992-12-04 Thrombininhibitor aus Speichel von Protostomiern
DE19934304731 DE4304731A1 (de) 1993-02-12 1993-02-12 Thrombininhibitor aus Speichel von Protostomiern
DE19934328336 DE4328336A1 (de) 1993-08-17 1993-08-17 Thrombininhibitor aus Speichel von Protostomiern
DE19934340798 DE4340798A1 (de) 1993-11-25 1993-11-25 Thrombininhibitor aus Speichel von Protostomiern
PCT/DE1993/001172 WO1994013807A1 (de) 1992-12-04 1993-12-03 Thrombininhibitor aus speichel von protostomiern

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9501626D0 HU9501626D0 (en) 1995-08-28
HUT71210A HUT71210A (en) 1995-11-28
HU220301B true HU220301B (hu) 2001-11-28

Family

ID=27435649

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9501626A HU220301B (hu) 1992-12-04 1993-12-03 Véralvadásgátló protosztómiák (vérszívók) nyálából

Country Status (16)

Country Link
US (1) US5876971A (hu)
EP (1) EP0677107B1 (hu)
JP (1) JP3490444B2 (hu)
KR (1) KR100311883B1 (hu)
AT (1) ATE156519T1 (hu)
AU (1) AU680643B2 (hu)
CA (1) CA2150909A1 (hu)
DE (1) DE59307091D1 (hu)
DK (1) DK0677107T3 (hu)
ES (1) ES2107790T3 (hu)
FI (1) FI110669B (hu)
GR (1) GR3025015T3 (hu)
HU (1) HU220301B (hu)
NO (1) NO952215L (hu)
RU (1) RU2183214C2 (hu)
WO (1) WO1994013807A1 (hu)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ295573A (en) * 1994-10-07 1998-09-24 Heska Corp Ectoparasite (flea) saliva proteins and apparatus to collect them
US20020169104A1 (en) 1997-05-01 2002-11-14 Glenn Frank Novel ectoparasite saliva proteins and apparatus to collect such proteins
GB2304048A (en) * 1995-08-12 1997-03-12 John William Carson Medicament containing saliva extract
DE19724791B4 (de) * 1997-06-06 2006-09-28 Schering Ag Thrombin hemmende Peptide, deren Verwendung und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen
DE10153601A1 (de) * 2001-11-02 2003-05-22 Paion Gmbh DSPA zur Behandlung von Schlaganfall
CN1326496C (zh) * 2002-02-11 2007-07-18 黄金－T技术股份有限公司 预防血栓形成的装置
TWI482628B (zh) * 2007-10-18 2015-05-01 Lundbeck & Co As H 新穎之血栓溶解病患次群
CN107949569B (zh) * 2015-06-18 2022-05-31 新加坡国立大学 新型凝血酶抑制剂

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1341417C (fr) * 1984-03-27 2003-01-21 Paul Tolstoshev Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine
DE3819078A1 (de) * 1988-06-04 1989-12-07 Hoechst Ag Amblyommin, ein neuer wirkstoff fuer die antikoagulationstherapie
DE3931839A1 (de) * 1989-09-23 1991-04-04 Basf Ag Neue proteine und ihre herstellung

Also Published As

Publication number Publication date
US5876971A (en) 1999-03-02
WO1994013807A1 (de) 1994-06-23
EP0677107A1 (de) 1995-10-18
FI952712A0 (fi) 1995-06-02
NO952215D0 (no) 1995-06-02
CA2150909A1 (en) 1994-06-23
FI110669B (fi) 2003-03-14
GR3025015T3 (en) 1998-01-30
ATE156519T1 (de) 1997-08-15
JP3490444B2 (ja) 2004-01-26
KR950704488A (ko) 1995-11-20
EP0677107B1 (de) 1997-08-06
HUT71210A (en) 1995-11-28
ES2107790T3 (es) 1997-12-01
AU680643B2 (en) 1997-08-07
HU9501626D0 (en) 1995-08-28
JPH08507200A (ja) 1996-08-06
RU2183214C2 (ru) 2002-06-10
AU5560394A (en) 1994-07-04
FI952712A (fi) 1995-06-02
DE59307091D1 (de) 1997-09-11
NO952215L (no) 1995-06-02
DK0677107T3 (da) 1998-03-16
KR100311883B1 (ko) 2002-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5856126A (en) Peptide having anti-thrombus activity and method of producing the same
FI100403B (fi) Menetelmä glykosyloitujen tai glykosyloimattomien vampyyrilepakon sylj en plasminogeeniaktivaattoreiden valmistamiseksi
JPH05508150A (ja) 酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体
JPH02121934A (ja) 組合せ医薬組成物
JPH11504938A (ja) クニッツ型プロテアーゼ阻害因子
US8632780B2 (en) Human complement C3 derivates with cobra venom factor-like function
KR20010005529A (ko) 덴드로아스핀 스캐폴드에 기초한 이 또는 다기능성 분자
HU220301B (hu) Véralvadásgátló protosztómiák (vérszívók) nyálából
RU2186110C2 (ru) Рекомбинантный белок asp-паллидипин, способ его производства и очистки, вектор, штамм, фармацевтическая композиция
RU2128705C1 (ru) Протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, рекомбинантный протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, фрагмент днк, кодирующий рекомбинантный протеин, вектор экспрессии (варианты), штамм культивируемых животных клеток внк - продуцент рекомбинантного протеина (варианты), способ получения рекомбинантного протеина, фармацевтическая композиция
AU661515B2 (en) Polypeptide, DNA fragment encoding the same, drug composition containing the same and process for producing the same
EP0458903A1 (en) Soluble analogs of thrombomodulin
CA1339875C (en) Modified human psti
CA2004764C (en) Ancrod proteins, their preparation and use
PT696198E (pt) Novo polipeptido que possui actividade inibitoria do factor xa
US5801017A (en) Production of recombinant factor Xa inhibitor of leech Hirudo medicinalis
WO1999060126A9 (en) Protein z-dependent protease inhibitor
HUT52559A (en) Process for production of proteins with trombolitic effect
DE4340798A1 (de) Thrombininhibitor aus Speichel von Protostomiern
DE4328336A1 (de) Thrombininhibitor aus Speichel von Protostomiern
WO1995005836A9 (en) Draculin, its method of preparation and use

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees