JPH0572481A - 蛍光コンフオーカル顕微鏡 - Google Patents
蛍光コンフオーカル顕微鏡Info
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- JPH0572481A JPH0572481A JP3260488A JP26048891A JPH0572481A JP H0572481 A JPH0572481 A JP H0572481A JP 3260488 A JP3260488 A JP 3260488A JP 26048891 A JP26048891 A JP 26048891A JP H0572481 A JPH0572481 A JP H0572481A
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- objective
- pupil
- scanning
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- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B13/00—Optical objectives specially designed for the purposes specified below
- G02B13/04—Reversed telephoto objectives
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01B—MEASURING LENGTH, THICKNESS OR SIMILAR LINEAR DIMENSIONS; MEASURING ANGLES; MEASURING AREAS; MEASURING IRREGULARITIES OF SURFACES OR CONTOURS
- G01B9/00—Measuring instruments characterised by the use of optical techniques
- G01B9/04—Measuring microscopes
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0052—Optical details of the image generation
- G02B21/0072—Optical details of the image generation details concerning resolution or correction, including general design of CSOM objectives
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
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- G02B21/0052—Optical details of the image generation
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- Analytical Chemistry (AREA)
- Microscoopes, Condenser (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 広い視野に渡って、優れた光学的切断機能と
良好な横方向分解能が得られるとともに、定量測定の精
度を向上させることのできる蛍光コンフォーカル顕微鏡
を提供する。 【構成】 スキャナミラー５，６と対物光学系（瞳投影
レンズ１０，対物レンズ１１）の間のスキャナ光学系７
は、レトロフォーカスタイプの構成をなし、励起波長及
び蛍光波長での対物光学系の倍率色収差を打ち消すよう
な倍率色収差をもつ。対物レンズ１１の瞳は、瞳投影レ
ンズ１０とスキャナ光学系７によって、スキャナミラー
５，６の近傍にリレーされる。このときの瞳倍率βP
は、｜βP ｜≦１とする。
良好な横方向分解能が得られるとともに、定量測定の精
度を向上させることのできる蛍光コンフォーカル顕微鏡
を提供する。 【構成】 スキャナミラー５，６と対物光学系（瞳投影
レンズ１０，対物レンズ１１）の間のスキャナ光学系７
は、レトロフォーカスタイプの構成をなし、励起波長及
び蛍光波長での対物光学系の倍率色収差を打ち消すよう
な倍率色収差をもつ。対物レンズ１１の瞳は、瞳投影レ
ンズ１０とスキャナ光学系７によって、スキャナミラー
５，６の近傍にリレーされる。このときの瞳倍率βP
は、｜βP ｜≦１とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、励起光で試料面を走査
し、試料から発せられた蛍光をピンホール上に集光して
ピンホールを通過した蛍光を検出することにより、合焦
情報だけを選別して得るようにした蛍光コンフォーカル
顕微鏡に関するものである。
し、試料から発せられた蛍光をピンホール上に集光して
ピンホールを通過した蛍光を検出することにより、合焦
情報だけを選別して得るようにした蛍光コンフォーカル
顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来の蛍光コンフォーカル顕微鏡におい
ては、その対物レンズとして、肉眼あるいはテレビカメ
ラによる通常の観察用に倍率色収差が補正された顕微鏡
対物レンズが使用されていた。
ては、その対物レンズとして、肉眼あるいはテレビカメ
ラによる通常の観察用に倍率色収差が補正された顕微鏡
対物レンズが使用されていた。
【０００３】従来の顕微鏡対物レンズ単体、または、コ
ンペンセーション方式では顕微鏡対物レンズと接眼レン
ズの合成系では、特定の２波長（例えばＦ線（青）とＣ
線（赤））について倍率色収差が補正されているが、他
の波長については倍率色収差の２次スペクトルがあっ
た。
ンペンセーション方式では顕微鏡対物レンズと接眼レン
ズの合成系では、特定の２波長（例えばＦ線（青）とＣ
線（赤））について倍率色収差が補正されているが、他
の波長については倍率色収差の２次スペクトルがあっ
た。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ところで、上記のよう
な従来の蛍光コンフォーカル顕微鏡においては、多くの
場合そうであるように、励起光の波長と蛍光の波長が対
物レンズの倍率色収差補正の対象となっている特定の波
長と一致していないと、励起波長と蛍光波長で倍率色収
差が現われることになる。
な従来の蛍光コンフォーカル顕微鏡においては、多くの
場合そうであるように、励起光の波長と蛍光の波長が対
物レンズの倍率色収差補正の対象となっている特定の波
長と一致していないと、励起波長と蛍光波長で倍率色収
差が現われることになる。
【０００５】この倍率色収差は、通常の蛍光顕微鏡にお
いては、単に蛍光像の倍率が変わるだけであるから、そ
れ程問題にはならない。しかし、蛍光コンフォーカル顕
微鏡においては、励起光波長と蛍光波長で倍率色収差が
あると、蛍光スポットの中心がピンホールの中心からず
れるため、ピンホールを通過する光量が減少して像が暗
くなる。
いては、単に蛍光像の倍率が変わるだけであるから、そ
れ程問題にはならない。しかし、蛍光コンフォーカル顕
微鏡においては、励起光波長と蛍光波長で倍率色収差が
あると、蛍光スポットの中心がピンホールの中心からず
れるため、ピンホールを通過する光量が減少して像が暗
くなる。
【０００６】一般に、視野の外側に行く程倍率色収差は
大きくなるので、物体（試料）が視野の中心と周辺部で
同量の蛍光を発していたとしても、蛍光コンフォーカル
顕微鏡による画像では、視野の周辺部の像は視野の中心
の像より暗くなってしまう。
大きくなるので、物体（試料）が視野の中心と周辺部で
同量の蛍光を発していたとしても、蛍光コンフォーカル
顕微鏡による画像では、視野の周辺部の像は視野の中心
の像より暗くなってしまう。
【０００７】特に、蛍光コンフォーカル顕微鏡の特徴で
ある、光学的切断機能と良好な横方向分解能を得るため
にピンホールの径を小さくすると、視野周辺での光量の
減少が甚だしくなって実質的に視野の中心付近しか観察
できず、通常の顕微鏡より視野が狭くなってしまうとい
う問題が生じる。
ある、光学的切断機能と良好な横方向分解能を得るため
にピンホールの径を小さくすると、視野周辺での光量の
減少が甚だしくなって実質的に視野の中心付近しか観察
できず、通常の顕微鏡より視野が狭くなってしまうとい
う問題が生じる。
【０００８】また、蛍光スポット中心とピンホール中心
がずれると、試料の光軸方向の移動に対する検出光量の
応答の形が変化して、得られた画像の信頼性が落ちてし
まう。
がずれると、試料の光軸方向の移動に対する検出光量の
応答の形が変化して、得られた画像の信頼性が落ちてし
まう。
【０００９】更に、励起光１波長，蛍光２波長の蛍光試
薬（ｉｎｄｏ−１）や励起光２波長，蛍光１波長の蛍光
試薬（Ｆｕｒａ−２）等を使用して、１つの波長の励起
光に対する２つの異なる波長の蛍光の光量の比較、ある
いは２つの異なる波長の励起光に対する１つの波長の蛍
光の光量の比較によってイオン等の定量測定を行なう場
合、２つの励起波長又は蛍光波長で倍率色収差の大きさ
が異なると、視野の周辺に行くに従って、２つの異なる
励起波長又は蛍光波長間で光量の減少の仕方が違ってく
るため、測定の定量性がなくなるという問題があった。
薬（ｉｎｄｏ−１）や励起光２波長，蛍光１波長の蛍光
試薬（Ｆｕｒａ−２）等を使用して、１つの波長の励起
光に対する２つの異なる波長の蛍光の光量の比較、ある
いは２つの異なる波長の励起光に対する１つの波長の蛍
光の光量の比較によってイオン等の定量測定を行なう場
合、２つの励起波長又は蛍光波長で倍率色収差の大きさ
が異なると、視野の周辺に行くに従って、２つの異なる
励起波長又は蛍光波長間で光量の減少の仕方が違ってく
るため、測定の定量性がなくなるという問題があった。
【００１０】この発明は、かかる点に鑑みてなされたも
のであり、励起波長と蛍光波長での倍率色収差を低減さ
せることにより、広い視野にわたって優れた光学的切断
機能と良好な横方向分解能を得ることができ、また、複
数の励起波長又は蛍光波長を扱う定量測定の精度を向上
させることができる蛍光コンフォーカル顕微鏡を提供す
ることを目的とするものである。
のであり、励起波長と蛍光波長での倍率色収差を低減さ
せることにより、広い視野にわたって優れた光学的切断
機能と良好な横方向分解能を得ることができ、また、複
数の励起波長又は蛍光波長を扱う定量測定の精度を向上
させることができる蛍光コンフォーカル顕微鏡を提供す
ることを目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明の蛍光コンフォー
カル顕微鏡は、励起光を試料上に集光する対物光学系
と、前記励起光で前記試料表面を走査するための走査手
段（実施例におけるスキャナミラー）と、該走査手段と
前記対物光学系の間に配置された走査光学系（実施例に
おけるスキャナ光学系）とを有し、前記試料から発せら
れ、前記対物光学系及び前記走査光学系を通過した蛍光
を検出する顕微鏡であり、上記の課題を達成するため
に、前記走査光学系を含む中間光学系が、前記対物光学
系の前記励起波長及び前記蛍光波長における倍率色収差
を補正するように構成されたものである。
カル顕微鏡は、励起光を試料上に集光する対物光学系
と、前記励起光で前記試料表面を走査するための走査手
段（実施例におけるスキャナミラー）と、該走査手段と
前記対物光学系の間に配置された走査光学系（実施例に
おけるスキャナ光学系）とを有し、前記試料から発せら
れ、前記対物光学系及び前記走査光学系を通過した蛍光
を検出する顕微鏡であり、上記の課題を達成するため
に、前記走査光学系を含む中間光学系が、前記対物光学
系の前記励起波長及び前記蛍光波長における倍率色収差
を補正するように構成されたものである。
【００１２】本発明において、対物光学系の倍率色収差
を走査光学系によって補正する場合には、前記走査手段
側から負レンズ群及び正レンズ群からなるレトロフォー
カスタイプとするとともに、前記対物光学系の瞳投影レ
ンズと前記走査光学系によって、前記対物レンズの瞳が
前記走査手段近傍にリレーされ、かつ瞳倍率βP が下式
を満たす構成をとることが望ましい。 ｜βP ｜＜１
を走査光学系によって補正する場合には、前記走査手段
側から負レンズ群及び正レンズ群からなるレトロフォー
カスタイプとするとともに、前記対物光学系の瞳投影レ
ンズと前記走査光学系によって、前記対物レンズの瞳が
前記走査手段近傍にリレーされ、かつ瞳倍率βP が下式
を満たす構成をとることが望ましい。 ｜βP ｜＜１
【００１３】また、対物光学系の倍率色収差を、試料の
像をリレーするリレー光学系で補正する場合には、対物
レンズの瞳が走査手段近傍にリレーされ、かつ、前記リ
レー光学系の結像倍率βが下式を満たす構成とすること
が望ましい。 ｆs ・ｆo ・ＮＡ／（ｆt ・ｒs ）≦｜β｜＜１ 但し、ｆs は走査光学系の焦点距離、ｆo は対物レンズ
の焦点距離、ＮＡは対物レンズの開口数、ｆt は瞳投影
レンズの焦点距離、ｒs は瞳結像面における走査手段有
効半径。
像をリレーするリレー光学系で補正する場合には、対物
レンズの瞳が走査手段近傍にリレーされ、かつ、前記リ
レー光学系の結像倍率βが下式を満たす構成とすること
が望ましい。 ｆs ・ｆo ・ＮＡ／（ｆt ・ｒs ）≦｜β｜＜１ 但し、ｆs は走査光学系の焦点距離、ｆo は対物レンズ
の焦点距離、ＮＡは対物レンズの開口数、ｆt は瞳投影
レンズの焦点距離、ｒs は瞳結像面における走査手段有
効半径。
【００１４】
【作用】蛍光コンフォーカル顕微鏡で、励起光として使
用される光はレーザ光等の波長の短い光であり、検出す
べき蛍光は励起光に比べて波長の長い光である。従っ
て、この種の顕微鏡では、大きく異なる２つの波長につ
いての倍率色収差を補正する必要がある。しかし、従来
用いられている顕微鏡対物レンズは、補正波長以外のこ
のような広い波長帯域についての倍率色収差については
考慮されておらず、また、仮に収差補正しようとしても
対物光学系だけで広帯域の補正を行なうことは困難であ
る。
用される光はレーザ光等の波長の短い光であり、検出す
べき蛍光は励起光に比べて波長の長い光である。従っ
て、この種の顕微鏡では、大きく異なる２つの波長につ
いての倍率色収差を補正する必要がある。しかし、従来
用いられている顕微鏡対物レンズは、補正波長以外のこ
のような広い波長帯域についての倍率色収差については
考慮されておらず、また、仮に収差補正しようとしても
対物光学系だけで広帯域の補正を行なうことは困難であ
る。
【００１５】そこで、本発明では、対物光学系と走査手
段の間に設けられる中間光学系を、対物光学系の励起波
長及び蛍光波長での倍率色収差を打ち消すように構成す
ることによって、対物光学系と中間光学系の合成系全体
としての倍率色収差を低減している。
段の間に設けられる中間光学系を、対物光学系の励起波
長及び蛍光波長での倍率色収差を打ち消すように構成す
ることによって、対物光学系と中間光学系の合成系全体
としての倍率色収差を低減している。
【００１６】これにより、対物光学系の倍率色収差に起
因する蛍光スポット中心とピンホール中心のずれが小さ
くなり、本来ピンホールを通過すべき合焦面からの蛍光
が損失するという問題が解消される。
因する蛍光スポット中心とピンホール中心のずれが小さ
くなり、本来ピンホールを通過すべき合焦面からの蛍光
が損失するという問題が解消される。
【００１７】また、複数の励起波長に対するそれぞれの
蛍光光量を比較したり、単一波長の励起光によって発光
する複数波長の蛍光の光量を比較したりする場合、本発
明では蛍光に対する励起光同志又は励起光に対する蛍光
同志の倍率色収差の差がほとんどないため、正確な定量
測定を行なうことが可能である。
蛍光光量を比較したり、単一波長の励起光によって発光
する複数波長の蛍光の光量を比較したりする場合、本発
明では蛍光に対する励起光同志又は励起光に対する蛍光
同志の倍率色収差の差がほとんどないため、正確な定量
測定を行なうことが可能である。
【００１８】
【実施例】以下、図面を参照して本発明の実施例を説明
する。まず、図１は本発明第１実施例による蛍光コンフ
ォーカル顕微鏡の要部の構成を示す光路図である。本実
施例では、励起光１波長，蛍光２波長の蛍光波長により
試料を染色して観察する場合の光学系において、スキャ
ナ光学系で対物光学系の倍率色収差を補正する例につい
て説明する。
する。まず、図１は本発明第１実施例による蛍光コンフ
ォーカル顕微鏡の要部の構成を示す光路図である。本実
施例では、励起光１波長，蛍光２波長の蛍光波長により
試料を染色して観察する場合の光学系において、スキャ
ナ光学系で対物光学系の倍率色収差を補正する例につい
て説明する。
【００１９】図において、レーザ光源１から射出された
励起光は、ビームエクスパンダ２によってスキャナミラ
ー５，６に見合った適当な径に拡大されて平行ビームと
なり、ダイクロイックミラー３，４を透過してスキャナ
ミラー５，６（走査手段）に入射する。このスキャナミ
ラー５，６は、回転方向が互いに直交するように構成さ
れており、ミラー５の回転軸が紙面内面にあればミラー
６の回転軸は紙面と垂直な方向にある。スキャナミラー
５，６より射出された励起光はスキャナ光学系７（詳細
後述）に入射し、ミラー８で折り曲げられて１次像面９
上にスポットを結ぶ。前述のスキャナミラー５，６を振
ることにより、１次像面でレーザスポットが２次元移動
する。なお、スキャナ光学系７の後のミラー８は、光学
系を倒立型の配置にするためのものであり、他の配置を
とる場合には省略することも可能である。
励起光は、ビームエクスパンダ２によってスキャナミラ
ー５，６に見合った適当な径に拡大されて平行ビームと
なり、ダイクロイックミラー３，４を透過してスキャナ
ミラー５，６（走査手段）に入射する。このスキャナミ
ラー５，６は、回転方向が互いに直交するように構成さ
れており、ミラー５の回転軸が紙面内面にあればミラー
６の回転軸は紙面と垂直な方向にある。スキャナミラー
５，６より射出された励起光はスキャナ光学系７（詳細
後述）に入射し、ミラー８で折り曲げられて１次像面９
上にスポットを結ぶ。前述のスキャナミラー５，６を振
ることにより、１次像面でレーザスポットが２次元移動
する。なお、スキャナ光学系７の後のミラー８は、光学
系を倒立型の配置にするためのものであり、他の配置を
とる場合には省略することも可能である。
【００２０】次に、１次像面９で一旦集光した励起光
は、瞳投影レンズ１０，対物レンズ１１を経て、試料面
１２上に再度スポットを結ぶ。試料面１２上では、１次
像面と同様に、スキャナミラー５，６の振動と同期して
スポットが移動し、２次元走査がなされる。本実施例で
は、瞳投影レンズ１０と対物レンズ１１によって対物光
学系を構成しているが、瞳投影レンズ１０は、スキャナ
光学系７と組み合わされて対物レンズ１１の瞳をスキャ
ナミラー５，６の近傍（ミラー５，６の中間）に投影す
るために配置されているものである。
は、瞳投影レンズ１０，対物レンズ１１を経て、試料面
１２上に再度スポットを結ぶ。試料面１２上では、１次
像面と同様に、スキャナミラー５，６の振動と同期して
スポットが移動し、２次元走査がなされる。本実施例で
は、瞳投影レンズ１０と対物レンズ１１によって対物光
学系を構成しているが、瞳投影レンズ１０は、スキャナ
光学系７と組み合わされて対物レンズ１１の瞳をスキャ
ナミラー５，６の近傍（ミラー５，６の中間）に投影す
るために配置されているものである。
【００２１】次に、レーザスポットにより励起された試
料面１２の蛍光分子から発せられた異なる２つの波長の
蛍光は、対物レンズ１１，瞳投影レンズ１０，スキャナ
光学系７，スキャナミラー５，６を逆にたどって、それ
ぞれの波長によりダイクロイックミラー３または４によ
り反射され、コレクタレンズ１３，１６によってピンホ
ール１４，１７上に集光され、ピンホール１４，１７を
通過した蛍光だけが光検出器１５，１８で検出される。
料面１２の蛍光分子から発せられた異なる２つの波長の
蛍光は、対物レンズ１１，瞳投影レンズ１０，スキャナ
光学系７，スキャナミラー５，６を逆にたどって、それ
ぞれの波長によりダイクロイックミラー３または４によ
り反射され、コレクタレンズ１３，１６によってピンホ
ール１４，１７上に集光され、ピンホール１４，１７を
通過した蛍光だけが光検出器１５，１８で検出される。
【００２２】本実施例では、スキャナ光学系７は、スキ
ャナミラー５，６側から負レンズ群，正レンズ群からな
るレトロフォーカスタイプの構成をなしており、その倍
率色収差は、対物光学系の倍率色収差を打ち消すように
設計されているので（詳細後述）、試料面１２から発せ
られてスキャナミラー５，６に戻ってきた蛍光は、走査
中においても入射時と同じ角度でスキャナミラー５から
射出されることになる。従って、蛍光は、常にピンフォ
ール１４，１７の同じ位置にスポットを結ぶことにな
る。
ャナミラー５，６側から負レンズ群，正レンズ群からな
るレトロフォーカスタイプの構成をなしており、その倍
率色収差は、対物光学系の倍率色収差を打ち消すように
設計されているので（詳細後述）、試料面１２から発せ
られてスキャナミラー５，６に戻ってきた蛍光は、走査
中においても入射時と同じ角度でスキャナミラー５から
射出されることになる。従って、蛍光は、常にピンフォ
ール１４，１７の同じ位置にスポットを結ぶことにな
る。
【００２３】このため、倍率色収差に起因する視野周辺
での光量の減少がなくなり、２つの異なる波長の蛍光の
光量比較（図１中、検出器１５と１６でそれぞれ検出さ
れる光量の比較）によって行なう測定の定量性が確保さ
れる。
での光量の減少がなくなり、２つの異なる波長の蛍光の
光量比較（図１中、検出器１５と１６でそれぞれ検出さ
れる光量の比較）によって行なう測定の定量性が確保さ
れる。
【００２４】さて次に、図１の実施例における光学系の
設計条件について、図３を参照して説明する。図３にお
いて、実線は物体結像を表わし、点線は瞳結像を表わし
ている。物体面（試料面）１２の像は、対物レンズ１１
と瞳投影レンズ１０によって１次像面９に結像され、対
物レンズ１１の瞳Ｐo は、瞳投影レンズ１０とスキャナ
光学系７によってスキャナミラー５，６の中間にある１
次瞳面Ｐ1 に結像される。
設計条件について、図３を参照して説明する。図３にお
いて、実線は物体結像を表わし、点線は瞳結像を表わし
ている。物体面（試料面）１２の像は、対物レンズ１１
と瞳投影レンズ１０によって１次像面９に結像され、対
物レンズ１１の瞳Ｐo は、瞳投影レンズ１０とスキャナ
光学系７によってスキャナミラー５，６の中間にある１
次瞳面Ｐ1 に結像される。
【００２５】一般に、蛍光は光量が少ないため、対物レ
ンズ１１の開口いっぱいに照明して、試料面１２にでき
るだけ小さな励起光スポットを作り、更に、試料面１２
から出た蛍光を無駄なく利用できるように、図３に示さ
れるように、対物レンズ１１の瞳をスキャナミラー５，
６近傍にリレーする構成を取ることが望ましい。
ンズ１１の開口いっぱいに照明して、試料面１２にでき
るだけ小さな励起光スポットを作り、更に、試料面１２
から出た蛍光を無駄なく利用できるように、図３に示さ
れるように、対物レンズ１１の瞳をスキャナミラー５，
６近傍にリレーする構成を取ることが望ましい。
【００２６】このとき、１次瞳Ｐ1 の半径ｒP1は、式１
で表わされる。但し、対物レンズ１１瞳半径をｒP0，ス
キャナ光学系７の焦点距離をｆs ，瞳投影レンズ１０の
焦点距離をｆt ，対物レンズ１１の焦点距離をｆo ，対
物レンズ１１の物体側開口数をＮＡとする。 ｒP1＝（ｆs ／ｆt ）・ｒＰo ＝ｆs ・ｆo ・ＮＡ／ｆt …式１
で表わされる。但し、対物レンズ１１瞳半径をｒP0，ス
キャナ光学系７の焦点距離をｆs ，瞳投影レンズ１０の
焦点距離をｆt ，対物レンズ１１の焦点距離をｆo ，対
物レンズ１１の物体側開口数をＮＡとする。 ｒP1＝（ｆs ／ｆt ）・ｒＰo ＝ｆs ・ｆo ・ＮＡ／ｆt …式１
【００２７】ここで、１次瞳面９でのスキャナミラー
５，６の有効半径をｒs とおくと、スキャナミラー５，
６によってビームがけられないようにするためには、ｒ
s ≧ｒP1でなければならない。よって、式２から式３が
導かれる。但し、βP は瞳倍率（＝−ｆs ／ｆt ）であ
る。 ｒs ≧ｒP1＝ｆs ・ｆo ・ＮＡ／ｆt …式２ ｜βP ｜＝ｆs ／ｆt ≦ｒs ／（ｆo ・ＮＡ） …式３
５，６の有効半径をｒs とおくと、スキャナミラー５，
６によってビームがけられないようにするためには、ｒ
s ≧ｒP1でなければならない。よって、式２から式３が
導かれる。但し、βP は瞳倍率（＝−ｆs ／ｆt ）であ
る。 ｒs ≧ｒP1＝ｆs ・ｆo ・ＮＡ／ｆt …式２ ｜βP ｜＝ｆs ／ｆt ≦ｒs ／（ｆo ・ＮＡ） …式３
【００２８】式３において、スキャナミラー５，６の有
効径ｒs には上限があり、特に機械的にミラーを振動さ
せる場合には高速になる程有効径が小さくなるので、瞳
倍率βP は式４を満たすように設定することが望まし
い。 ｜βP ｜≦１ …式４
効径ｒs には上限があり、特に機械的にミラーを振動さ
せる場合には高速になる程有効径が小さくなるので、瞳
倍率βP は式４を満たすように設定することが望まし
い。 ｜βP ｜≦１ …式４
【００２９】また、実施例１のように、対物レンズ１１
の倍率色収差をスキャナ光学系７で補正するには、スキ
ャナ光学系７を２群構成とすることが望ましい。スキャ
ナ光学系７全体としては正のパワーをもつので、スキャ
ナミラー５，６側からみて正レンズ群−正レンズ群，正
レンズ群−負レンズ群，負レンズ群−正レンズ群の３種
類の構成が考えられる。このうち、正レンズ群−正レン
ズ群のものは全長が長くなってしまうという欠点があ
る。
の倍率色収差をスキャナ光学系７で補正するには、スキ
ャナ光学系７を２群構成とすることが望ましい。スキャ
ナ光学系７全体としては正のパワーをもつので、スキャ
ナミラー５，６側からみて正レンズ群−正レンズ群，正
レンズ群−負レンズ群，負レンズ群−正レンズ群の３種
類の構成が考えられる。このうち、正レンズ群−正レン
ズ群のものは全長が長くなってしまうという欠点があ
る。
【００３０】更に、正レンズ群−負レンズ群，負レンズ
群−正レンズ群の２つの構成について、同じ硝種を使っ
て同じ条件で収差補正すると仮定してそれぞれの場合ス
キャナ光学系７のレンズを設計し、比較してみた。それ
ぞれの場合のスキャナ光学系７の光路図（軸上周縁光線
と最大像高の光線）を図５，図６に示す。図５はスキャ
ナミラー５，６側から負レンズ群（ｆ＝−３７．５）７
ａ−正レンズ群（ｆ＝５３）７ｂからなるレトロフォー
カスタイプ（逆望遠型）の構成であり、図６はスキャナ
ミラー５，６側から正レンズ群（ｆ＝４９．９）７ｃ，
負レンズ群（ｆ＝−３６．８）７ｄからなるテレタイプ
（望遠型）の構成であり、倍率色収差はどちらも同じ程
度に補正されている。なお、図中９は、図１の１次像面
９に対応する。
群−正レンズ群の２つの構成について、同じ硝種を使っ
て同じ条件で収差補正すると仮定してそれぞれの場合ス
キャナ光学系７のレンズを設計し、比較してみた。それ
ぞれの場合のスキャナ光学系７の光路図（軸上周縁光線
と最大像高の光線）を図５，図６に示す。図５はスキャ
ナミラー５，６側から負レンズ群（ｆ＝−３７．５）７
ａ−正レンズ群（ｆ＝５３）７ｂからなるレトロフォー
カスタイプ（逆望遠型）の構成であり、図６はスキャナ
ミラー５，６側から正レンズ群（ｆ＝４９．９）７ｃ，
負レンズ群（ｆ＝−３６．８）７ｄからなるテレタイプ
（望遠型）の構成であり、倍率色収差はどちらも同じ程
度に補正されている。なお、図中９は、図１の１次像面
９に対応する。
【００３１】図５，６を比較すると明らかなように、テ
レタイプの構成（図６）では、スキャナミラーからのビ
ームを最初の正レンズ群で強く内側に曲げ、次の負レン
ズ群で強く外側に曲げるという無理のある構成となって
いる。このため、図６のテレタイプの構成では、倍率色
収差以外の収差は、図５のレトロフォーカスタイプの構
成に比べて悪くなっている。また、テレタイプのものは
レトロフォーカスタイプのものに比べて、光学系全体で
の外径が大きくなっており、正レンズ群７ｃの厚さも厚
くなっていることがわかる。従って、スキャナ光学系７
としては、ビームが自然な光路をとり、光学系全体がコ
ンパクトになるレトロフォーカスタイプの構成をとるこ
とが好ましい。
レタイプの構成（図６）では、スキャナミラーからのビ
ームを最初の正レンズ群で強く内側に曲げ、次の負レン
ズ群で強く外側に曲げるという無理のある構成となって
いる。このため、図６のテレタイプの構成では、倍率色
収差以外の収差は、図５のレトロフォーカスタイプの構
成に比べて悪くなっている。また、テレタイプのものは
レトロフォーカスタイプのものに比べて、光学系全体で
の外径が大きくなっており、正レンズ群７ｃの厚さも厚
くなっていることがわかる。従って、スキャナ光学系７
としては、ビームが自然な光路をとり、光学系全体がコ
ンパクトになるレトロフォーカスタイプの構成をとるこ
とが好ましい。
【００３２】次に、図２は本発明第２実施例による蛍光
コンフォーカル顕微鏡の構成を示す光路図である。本実
施例では、励起光１波長，蛍光２波長の蛍光波長により
試料を染色して観察する場合の光学系において、リレー
光学系で対物光学系の倍率色収差を補正する例について
説明する。なお、レーザ光源，エクスパンダ，ダイクロ
イックミラー，スキャナミラー，コレクタレンズ，ピン
ホール，光検出器の配置は図１の場合と同じてあるの
で、図２ではスキャナミラー２５，２６と試料面３２の
間の構成だけを示す。
コンフォーカル顕微鏡の構成を示す光路図である。本実
施例では、励起光１波長，蛍光２波長の蛍光波長により
試料を染色して観察する場合の光学系において、リレー
光学系で対物光学系の倍率色収差を補正する例について
説明する。なお、レーザ光源，エクスパンダ，ダイクロ
イックミラー，スキャナミラー，コレクタレンズ，ピン
ホール，光検出器の配置は図１の場合と同じてあるの
で、図２ではスキャナミラー２５，２６と試料面３２の
間の構成だけを示す。
【００３３】図２において、スキャナミラー２５，２６
より射出された励起光は、それ自体の倍率色収差が良く
補正されたスキャナレンズ２７によって集光され、２次
像面２９ｂにスポットを結ぶ。２次像面２９ｂを通過し
た励起光は、リレー光学系３３に入射し、ミラー２８で
折り曲げられて１次像面２９ａに再結像する。１次像面
２９ａを通過した励起光は、瞳投影レンズ３０及び対物
レンズ３１によって集光され、試料面３２上にスポット
を結ぶ。このとき、実施例１と同様に、スキャナミラー
２５，２６を振ることにより、励起光スポットで試料面
３２が２次元走査される。なお、図中ミラー２８は、光
学系を倒立型の配置にするためのものであり、必ずしも
必要なものではない。
より射出された励起光は、それ自体の倍率色収差が良く
補正されたスキャナレンズ２７によって集光され、２次
像面２９ｂにスポットを結ぶ。２次像面２９ｂを通過し
た励起光は、リレー光学系３３に入射し、ミラー２８で
折り曲げられて１次像面２９ａに再結像する。１次像面
２９ａを通過した励起光は、瞳投影レンズ３０及び対物
レンズ３１によって集光され、試料面３２上にスポット
を結ぶ。このとき、実施例１と同様に、スキャナミラー
２５，２６を振ることにより、励起光スポットで試料面
３２が２次元走査される。なお、図中ミラー２８は、光
学系を倒立型の配置にするためのものであり、必ずしも
必要なものではない。
【００３４】次に、励起光スポットにより励起された試
料面３２の蛍光分子から発せられた異なる２つの波長の
蛍光は、対物レンズ３１，瞳投影レンズ３０，リレー光
学系３３，スキャナミラー２５，２６を逆にたどり、図
１の場合と同様に、ダイクロイックミラーで反射され、
コレクタレンズによってピンホール上に集光され、光検
出器で検出される。
料面３２の蛍光分子から発せられた異なる２つの波長の
蛍光は、対物レンズ３１，瞳投影レンズ３０，リレー光
学系３３，スキャナミラー２５，２６を逆にたどり、図
１の場合と同様に、ダイクロイックミラーで反射され、
コレクタレンズによってピンホール上に集光され、光検
出器で検出される。
【００３５】本実施例では、リレー光学系３３の倍率色
収差は、対物レンズ１１の倍率色収差を打ち消すように
設計されており（詳細後述）、試料面３２から発せられ
てスキャナミラー２５，２６に戻ってきた蛍光は、スキ
ャナミラー５，６の動作中も、入射時と同じ角度でスキ
ャナミラー５から射出されることになる。従って、蛍光
は、常にピンホールの同じ位置にスポットを結ぶことに
なり、実施例１と同様に、倍率色収差に起因する視野周
辺での光量の減少がなくなり、２つの異なる波長の蛍光
の光量比較によって行なう測定の定量性が確保される。
収差は、対物レンズ１１の倍率色収差を打ち消すように
設計されており（詳細後述）、試料面３２から発せられ
てスキャナミラー２５，２６に戻ってきた蛍光は、スキ
ャナミラー５，６の動作中も、入射時と同じ角度でスキ
ャナミラー５から射出されることになる。従って、蛍光
は、常にピンホールの同じ位置にスポットを結ぶことに
なり、実施例１と同様に、倍率色収差に起因する視野周
辺での光量の減少がなくなり、２つの異なる波長の蛍光
の光量比較によって行なう測定の定量性が確保される。
【００３６】図２のように、試料面３２の像をリレーす
る構成をとり、リレー光学系３３によって対物光学系の
倍率色収差を補正する場合、図１に比べて光路が長くな
るが、光学系の設計の自由度は高くなる。図２の場合、
リレー光学系３３の倍率を適当な縮小倍率に設定するこ
とによって（詳細後述）、対物光学系の倍率収差を打ち
消すような倍率色収差をリレー光学系３３にもたせるこ
とが容易にできる。
る構成をとり、リレー光学系３３によって対物光学系の
倍率色収差を補正する場合、図１に比べて光路が長くな
るが、光学系の設計の自由度は高くなる。図２の場合、
リレー光学系３３の倍率を適当な縮小倍率に設定するこ
とによって（詳細後述）、対物光学系の倍率収差を打ち
消すような倍率色収差をリレー光学系３３にもたせるこ
とが容易にできる。
【００３７】次に、図２の実施例における光学系の設計
条件について、図４を参照して説明する。図４におい
て、実線は物体結像を表わし、点線は瞳結像を表わして
いる。物体面（試料面）３２の像は、対物レンズ３１と
瞳投影レンズ３０によって１次像面２９ａに結像され、
更に、リレー光学系３３によって２次像面２９ｂに再結
像される。また、対物レンズ３１の瞳Ｐo は、瞳投影レ
ンズ３０とリレー光学系３３の第１レンズ３３ａによっ
て１次瞳面Ｐ1 に結像され、更に、リレー光学系３３の
第２レンズ３３ｂとスキャナミラー２７によってスキャ
ナミラー２５，２６の中間にある２次瞳面Ｐ2 に再結像
される。
条件について、図４を参照して説明する。図４におい
て、実線は物体結像を表わし、点線は瞳結像を表わして
いる。物体面（試料面）３２の像は、対物レンズ３１と
瞳投影レンズ３０によって１次像面２９ａに結像され、
更に、リレー光学系３３によって２次像面２９ｂに再結
像される。また、対物レンズ３１の瞳Ｐo は、瞳投影レ
ンズ３０とリレー光学系３３の第１レンズ３３ａによっ
て１次瞳面Ｐ1 に結像され、更に、リレー光学系３３の
第２レンズ３３ｂとスキャナミラー２７によってスキャ
ナミラー２５，２６の中間にある２次瞳面Ｐ2 に再結像
される。
【００３８】このとき、２次瞳Ｐ2 の半径ｒP2は、式５
で表わされる。但し、スキャナレンズ２７の焦点距離を
ｆs 、リレー光学系３３の第１及び第２レンズ３３ａ，
３３ｂの焦点距離をそれぞれｆ1，ｆ2 、瞳投影レンズ
３０の焦点距離をｆt ，対物レンズ３１の焦点距離をｆ
o ，対物レンズ３１の物体側開口数をＮＡ、対物レンズ
３１の瞳半径をｒP0（＝ｆo ・ＮＡ）、１次瞳半径をｒ
P1とする。 ｒP2＝（ｆs ／ｆ1 ）・ｒP1 ＝（ｆs ／ｆ2 ）・（ｆ1 ／ｆt ）・ｒP0 ＝ｆ1 ・ｆs ・ｆo ・ＮＡ／（ｆ2 ・ｆt ） …式５
で表わされる。但し、スキャナレンズ２７の焦点距離を
ｆs 、リレー光学系３３の第１及び第２レンズ３３ａ，
３３ｂの焦点距離をそれぞれｆ1，ｆ2 、瞳投影レンズ
３０の焦点距離をｆt ，対物レンズ３１の焦点距離をｆ
o ，対物レンズ３１の物体側開口数をＮＡ、対物レンズ
３１の瞳半径をｒP0（＝ｆo ・ＮＡ）、１次瞳半径をｒ
P1とする。 ｒP2＝（ｆs ／ｆ1 ）・ｒP1 ＝（ｆs ／ｆ2 ）・（ｆ1 ／ｆt ）・ｒP0 ＝ｆ1 ・ｆs ・ｆo ・ＮＡ／（ｆ2 ・ｆt ） …式５
【００３９】ここで、２次瞳面Ｐ2 でのスキャナミラー
２５，２６の有効半径をｒs とおくと、スキャナミラー
２５，２６によってビームがけられないようにするため
には、ｒs ≧ｒP2でなければならない。よって、式６か
ら式７が導かれる。但し、βはリレー光学系の倍率（＝
−ｆ2 ／ｆ1 ）である。 ｒs ≧ｒP2＝ｆ1 ・ｆs ・ｆo ・ＮＡ／（ｆ2 ・ｆt ） …式６ ｜β｜＝ｆ2 ／ｆ1 ≧ｆ3 ・ｆo ・ＮＡ／（ｆt ・ｒs ） …式７
２５，２６の有効半径をｒs とおくと、スキャナミラー
２５，２６によってビームがけられないようにするため
には、ｒs ≧ｒP2でなければならない。よって、式６か
ら式７が導かれる。但し、βはリレー光学系の倍率（＝
−ｆ2 ／ｆ1 ）である。 ｒs ≧ｒP2＝ｆ1 ・ｆs ・ｆo ・ＮＡ／（ｆ2 ・ｆt ） …式６ ｜β｜＝ｆ2 ／ｆ1 ≧ｆ3 ・ｆo ・ＮＡ／（ｆt ・ｒs ） …式７
【００４０】式７において、スキャナミラー２５，２６
の有効径ｒs には上限があり、また、スキャナレンズ２
７の焦点距離ｆs をあまり短くすると、２次瞳面Ｐ2 近
傍に配置されるスキャナミラー２５，２６とスキャナレ
ンズ２７が干渉するので（ミラーが回転するときにレン
ズにぶつかる）、リレー光学系３３の倍率βP は式７で
表わされる下限が存在する。
の有効径ｒs には上限があり、また、スキャナレンズ２
７の焦点距離ｆs をあまり短くすると、２次瞳面Ｐ2 近
傍に配置されるスキャナミラー２５，２６とスキャナレ
ンズ２７が干渉するので（ミラーが回転するときにレン
ズにぶつかる）、リレー光学系３３の倍率βP は式７で
表わされる下限が存在する。
【００４１】また、対物光学系の倍率色収差をリレー光
学系３３で補正する場合のリレー光学系３３の倍率は、
｜β｜＜１であることが望ましい。故に、リレー光学系
３３の倍率βは式８の条件を満たすことが望ましい。 ｆs ・ｆo ・ＮＡ／（ｆt ・ｒs ）≦｜β｜＜１ …式８
学系３３で補正する場合のリレー光学系３３の倍率は、
｜β｜＜１であることが望ましい。故に、リレー光学系
３３の倍率βは式８の条件を満たすことが望ましい。 ｆs ・ｆo ・ＮＡ／（ｆt ・ｒs ）≦｜β｜＜１ …式８
【００４２】なお、上記の実施例では、励起光１波長，
蛍光２波長の蛍光試薬を用いる場合について説明した
が、本発明はこれに限定されるものでなく、励起光１波
長，蛍光１波長、あるいは励起２波長，蛍光１波長、そ
の他の蛍光試薬を用いる場合にも適用できるものであ
る。
蛍光２波長の蛍光試薬を用いる場合について説明した
が、本発明はこれに限定されるものでなく、励起光１波
長，蛍光１波長、あるいは励起２波長，蛍光１波長、そ
の他の蛍光試薬を用いる場合にも適用できるものであ
る。
【００４３】また、実施例１ではスキャナ光学系によっ
て、実施例２ではリレー光学系によってそれぞれ対物光
学系の倍率色収差を補正しているが、スキャナ光学系と
リレー光学系を組み合わせて対物光学系の倍率色収差を
補正するようにしても良いことは言うまでもない。
て、実施例２ではリレー光学系によってそれぞれ対物光
学系の倍率色収差を補正しているが、スキャナ光学系と
リレー光学系を組み合わせて対物光学系の倍率色収差を
補正するようにしても良いことは言うまでもない。
【００４４】
【発明の効果】以上のように、本発明においては、対物
光学系と走査手段の間に設けられる中間光学系によっ
て、対物光学系の励起光波長及び蛍光波長での倍率色収
差を補正しているので、対物光学系と中間光学系の合成
系全体として倍率色収差が低減される。このため、蛍光
スポット中心とピンホール中心のずれが小さくなり、視
野の広い範囲にわたって優れた光学的切断機能と良好な
横方向分解能が得られる。また、試料の光軸方向の移動
に対する検出光量の応答の形が理論値に近くなり、得ら
れる画像の信頼性が向上する。更に、複数の波長の異な
る励起光又は蛍光を使用する定量測定を行なう際に、視
野の広い範囲に渡って測定の定量性を確保することがで
きる。
光学系と走査手段の間に設けられる中間光学系によっ
て、対物光学系の励起光波長及び蛍光波長での倍率色収
差を補正しているので、対物光学系と中間光学系の合成
系全体として倍率色収差が低減される。このため、蛍光
スポット中心とピンホール中心のずれが小さくなり、視
野の広い範囲にわたって優れた光学的切断機能と良好な
横方向分解能が得られる。また、試料の光軸方向の移動
に対する検出光量の応答の形が理論値に近くなり、得ら
れる画像の信頼性が向上する。更に、複数の波長の異な
る励起光又は蛍光を使用する定量測定を行なう際に、視
野の広い範囲に渡って測定の定量性を確保することがで
きる。
【図１】本発明第１実施例による蛍光コンフォーカル顕
微鏡の構成を示す光路図である。
微鏡の構成を示す光路図である。
【図２】本発明第２実施例による蛍光コンフォーカル顕
微鏡の構成を示す光路図である。
微鏡の構成を示す光路図である。
【図３】実施例１における望ましい設計条件を説明する
ための要部光路図である。
ための要部光路図である。
【図４】実施例２における望ましい設計条件を説明する
ための要部光路図である。
ための要部光路図である。
【図５】レトロフォーカスタイプのスキャナ光学系で倍
率色収差補正を行なうの拡大光路図である。
率色収差補正を行なうの拡大光路図である。
【図６】テレタイプのスキャナ光学系で倍率色収差補正
を行なうの拡大光路図である。
を行なうの拡大光路図である。
１ レーザ光源 ２ ビームエクスパンダ ３，４ ダイクロイックミラー ５，６，２５，２６ スキャナミラー ７ スキャナ光学系 ２７ スキャナレンズ ８，２８ ミラー ９，２９ａ １次像面 ２９ｂ ２次像面 １０，３０ 瞳投影レンズ １１，３１ 対物レンズ １２，３２ 試料面 １３，１６ コレクタレンズ １４，１７ ピンホール １５，１８ 光検出器 ３３ リレーレンズ Ｐ0 対物レンズ瞳 Ｐ1 １次瞳面 Ｐ2 ２次瞳面
Claims (5)
- 【請求項１】 励起光を試料上に集光する対物光学系
と、前記励起光で前記試料表面を走査するための走査手
段と、該走査手段と前記対物光学系の間に配置された走
査光学系とを有し、前記試料から発せられ、前記対物光
学系及び前記走査光学系を通過した蛍光を検出する蛍光
コンフォーカル顕微鏡において、 前記走査光学系を含む中間光学系が、前記対物光学系の
前記励起波長及び前記蛍光波長における倍率色収差を補
正するように構成されたことを特徴とする蛍光コンフォ
ーカル顕微鏡。 - 【請求項２】 前記走査光学系が、前記走査手段側から
負レンズ群及び正レンズ群からなるレトロフォーカスタ
イプの構成をなすことを特徴とする請求項１の蛍光コン
フォーカル顕微鏡。 - 【請求項３】 前記対物光学系が対物レンズと瞳投影レ
ンズとを有し、該瞳投影レンズと前記走査光学系によっ
て、前記対物レンズの瞳が前記走査手段近傍にリレーさ
れ、かつ瞳倍率βP が下式を満たすことを特徴とする請
求項２の蛍光コンフォーカル顕微鏡。 ｜βP ｜＜１ - 【請求項４】 前記中間光学系が前記対物光学系による
前記試料の像をリレーするリレー光学系を含むことを特
徴とする請求項１の蛍光コンフォーカル顕微鏡。 - 【請求項５】 前記対物光学系が対物レンズと瞳投影レ
ンズとを有し、前記対物レンズの瞳が前記走査手段近傍
にリレーされ、かつ、前記リレー光学系の結像倍率βが
下式を満たすことを特徴とする請求項４の蛍光コンフォ
ーカル顕微鏡。 ｆs ・ｆo ・ＮＡ／（ｆt ・ｒs ）≦｜β｜＜１ 但し、ｆs は走査光学系の焦点距離、ｆo は対物レンズ
の焦点距離、ＮＡは対物レンズの開口数、ｆt は瞳投影
レンズの焦点距離、ｒs は瞳結像面における走査手段有
効半径。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03260488A JP3082346B2 (ja) | 1991-09-12 | 1991-09-12 | 蛍光コンフォーカル顕微鏡 |
| US07/942,713 US5296700A (en) | 1991-09-12 | 1992-09-09 | Fluorescent confocal microscope with chromatic aberration compensation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03260488A JP3082346B2 (ja) | 1991-09-12 | 1991-09-12 | 蛍光コンフォーカル顕微鏡 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0572481A true JPH0572481A (ja) | 1993-03-26 |
| JP3082346B2 JP3082346B2 (ja) | 2000-08-28 |
Family
ID=17348665
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03260488A Expired - Fee Related JP3082346B2 (ja) | 1991-09-12 | 1991-09-12 | 蛍光コンフォーカル顕微鏡 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5296700A (ja) |
| JP (1) | JP3082346B2 (ja) |
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| WO2002097408A1 (fr) * | 2001-05-30 | 2002-12-05 | Olympus Corporation | Lecteur de fluorescence |
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| JP2013152484A (ja) * | 2007-07-17 | 2013-08-08 | Olympus Corp | レーザー走査型顕微鏡システム |
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| US6175754B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-01-16 | Keravision, Inc. | Method and apparatus for measuring corneal incisions |
| US5585639A (en) * | 1995-07-27 | 1996-12-17 | Hewlett-Packard Company | Optical scanning apparatus |
| US5813987A (en) * | 1995-08-01 | 1998-09-29 | Medispectra, Inc. | Spectral volume microprobe for analysis of materials |
| US5713364A (en) * | 1995-08-01 | 1998-02-03 | Medispectra, Inc. | Spectral volume microprobe analysis of materials |
| US6104945A (en) * | 1995-08-01 | 2000-08-15 | Medispectra, Inc. | Spectral volume microprobe arrays |
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