JPH0552451B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は試料自体の調製の際に組織の超微細構
造の有意的な変性を回避することによる超微細構
造分析用生体組織試料の調製方法および装置に関
する。医学技術上組織試料を検査し、細胞構造お
よびその機能を決定するために、殆んど全ての分
析方法を適用する前に組織が「固定」されなけれ
ばならないことが良く知られている。

各種顕微鏡或いは関連した拡大装置を使用して
組織試料を検査することが長年実施されている
が、試料構成成分の検査をＸ−線分析により２〜
３Å単位の点間解像力をもつて500倍〜500000倍
の倍率で行うことを可能にする現代の高解像力分
析顕微鏡、例えばSTEM電子顕微鏡、に使用す
るための組織試料の調製に当り、内在する問題が
あつた。

具体的には、組織調製過程中に生じた各種人為
結果（人為構造ということもある）の程度を同時
に評価しながら組織分析の結果を解釈することが
困難である。従つて、可能な限り人為経過を回避
することが必須である。もう一つの問題は、組織
試料が極端ではあるが、現在の定説においては首
尾良い調製操作に必要である程度の操作に付され
た場合に、組織試料自体の物理的収縮から生ずる
ものである。殆んどの通常の組織調製工程におい
て組織の収縮は40％〜50％のオーダーにある。こ
の収縮は必然的に超微細構造の変更および下部構
造分解の大きな再配列をもたらす。この超微細構
造の変更の損傷の正味の結果はこの分析操作を介
した説明における不正確な詳細である。

所謂「形態学の黄金時代」の際には定性的およ
び定量的顕微鏡における基本的な目標は審美的に
楽しい像であつた。この目標は現在利用可能であ
る固定方法および装置を用いて容易に達成可能で
ある。しかしながら、調製方法により生成される
審美的に楽しい像はまた生きた生物体における組
織の真の状態を正確に反映する、即ち、「生きた
状態」に近似する組織試料もまたもたらすことが
必須となるに至つている。これが将に本発明の方
法および装置が目的とし、その解決を図らんとす
る問題である。分析用に現在利用可能である拡大
装置は従来使用されて来た現在の組織調製技術よ
りも技術的にはるかに進歩している。本発明の方
法は公知の拡大および分析装置に容易に使用され
る組織試料の調製を与えるものである。

分析用組織試料の最も通常の従来方法は化学固
定および有機溶媒脱水によるものである。この方
法に内在するのは、同時に起る人為結果の形成、
試料の収縮およびその結果得られる組織特性への
損傷および変性である。これらの変性は人為結果
などの形態を取ると否とを問わず個人による解釈
或いは試料を分析或いは評価する装置を必要とす
る。これは多くの場合に不満足な誤差の危険性を
導入する。化学的固定法は周知の技術であり長年
に亘つて分析生物学者に役立つており今後もある
種の限られた用途においては疑いもなく寄与し続
けるものである。しかしながら、組織試料分析の
用途がより複雑になりその様な分析の用途がより
広範になるに従つて化学的固定法に代るものが必
要とされている。これは、利用可能な拡大および
分析装置において進歩がなされるにつれて特に真
実である。組織調製方法および装置は試料の分析
に使用されている分析道具即ち電子顕微鏡と同等
に進歩して組織試料を調製する必要がある。明ら
かに組織試料調製の技術が顕微鏡の技術に遅れて
いる場合には、進歩した顕微鏡は形態学者その他
の組織研究者にとり何の役にも立たないことにな
る。

化学的固定法および有機溶媒脱水に代わる最も
通常のものは凍結乾燥冷凍固定試料である。冷凍
固定に従う凍結乾燥は文献によく記載されてお
り、組織保存のため良く知られた技術である。そ
れは幾つかの利点を有する。冷凍固定凍結乾燥の
結果、ほぼ瞬間的な細胞代謝の捕獲が行われる。
また、試料との溶媒接触の除去により可溶性細胞
構成成分の安定化および保持が行われる。これら
は、冷凍固定および凍結乾燥技術を公知の組織調
製方法に適用する試みにおける数多くの研究努力
において生じた冷凍固定−凍結乾燥への相当な利
点である。

不幸なことに、凍結乾燥の使用は多くの欠点が
あることが判明した。現在利用可能な凍結乾燥技
術における主たる欠点は氷結晶形成の防止であ
る。容易に理解される如く、氷結晶の形成は観察
されている組織の超微細構造の形態学的特徴を破
壊する。像は細胞質が細網化する際に変形され
る。試料内における氷結晶の形成はまたおそらく
巨大分子の異常な架橋を引き起こす可能性のある
組織のPHの変化を生ぜしめる可能性がある（共晶
形成）。また、蛋白質が変性し、析出する可能性
もある。これらは凍結乾燥方法に内在するほんの
僅かの欠点を示したにすぎない。

この一般的トピツクは、より詳細に他の従来方
法と共に「電子顕微鏡用生体組織の凍結および乾
燥」という標題の文献に記載されている
（“Freezing and Drying of Biological Tissues
for Electron Microscopy”、Louis Terracio
and Karl G.Schwabe、published in The
Journal of Histochemistry and
Cytochemistry、Volume29、No.9at pp.1021−
1028（1981）。人為構造形成に伴う問題は「凍結−
破壊複製における人為構造の問題の理解：総説」
（“Understanding the Artifact Problem in
Freeze−Fracture Replication：Ａ Review”、
The Royal Microscopial Society（1982）103−
123）に記載されている。

組織試料の調製において有用性を示してきた凍
結技術に適用可能な一般原理は、冷却速度が上昇
するにつれ、組織流体が水分を細胞外空間に分離
することなく凍結されるということである。しか
しながら、冷却速度の如何に拘らず、氷結晶がお
そらくなお生ずるが、しかし、冷却速度が増大す
るにつれて細胞内氷結晶の大きさが減少するとい
うことが判明した。高い凍結速度における氷結晶
の小径は勿論これにより最少の人為構造形成およ
び脱水中における最少の超微細構造損傷が行われ
るにすぎないので形態学的検査においては実質的
な利点である。

歴史的に見て、迅速凍結の技術が判断された基
準は系の冷却速度ではなく、単に組織が凍結され
た環境の温度であつた。この様に迅速凍結の用語
は冷却剤が−150℃以下の温度を有する如何なる
系にも適用されて来た。冷却系の有効性は熱が試
料から除去される速度に依存する。熱移動は冷却
系の温度のみならず、またその物理的および熱的
特性並びに試料の大きさおよび熱的特性にも依存
する。

迅速凍結に最も普通に使用されている技術は液
体冷却浴槽中に試料を浸漬即ち「急冷」すること
である。急冷に最も通常使用されている液体は液
体窒素、イソペンタンプロパンおよびFreon12お
よびFreon22などのフルオロカーボン類である。
液体窒素は一般的にその低温（−196℃）により
理想的な急冷流体とみなされているが、液体窒素
の低い蒸発熱による組織表面膜沸騰の発生により
液体窒素の使用には内在的な欠点が存在する。膜
沸騰は実際に試料を断熱することにより熱移動速
度を阻害する液体窒素の特性である。

迅速凍結の従来の代替法の一つに冷却金属表面
上の凍結がある。これは典型的には組織試料を磨
かれた平坦な金属表面に対して堅く押し付けて対
向させることよりなるものである。銀および銅が
磨かれた金属ブロツクとして典型的に使用されて
いる。この方法は、これらの金属が液体窒素或い
は液体ヘリウム温度までに冷却された際の高い熱
伝導性および熱容量を利用するように設計された
ものである。金属表面上の冷却における重要な工
程は、乾燥した冷却金属表面と回転、並行移動或
いははね返りの動きがなくしつかり接触させるこ
とである。医学において有用性の知られている市
販の装置が「はね返りのない」凍結を提供する。
この装置の開発はメアリーランド医学大学校の
Alan Boyne博士によつてなされたものと一般的
にみなされている。

最近、冷却速度と急冷液体中の超微細構造保存
の間に直接の相関関係があるとの証明がなされて
いる。凍結速度が毎秒100〜4100℃の範囲を越え
て増大すると（液体窒素−プロパン）、それに応
じて存在する氷結晶の大きさの減少があり、従つ
て形態学的保存の改良が得られる。

引き続く組織調製過程において重要な工程は、
常に、最近断熱的「分子蒸留」過程として説明さ
れている過冷却組織液の昇華−脱水である。一
度、適当な過冷却方法が選択され、手段が提供さ
れたら、凍結された水和標本の観察を可能にする
電子顕微鏡その他の拡大装置は容易に利用可能で
ないので、さらに組織を顕微鏡評価のために加工
する必要がある。この様に、脱水は生体組織試料
の調製における必須工程であり、しばしば組織形
態学の下部構造および超微細構造の細網化により
破壊が生ずる工程である。

ある種の従来の乾燥技術において、結合水画室
内に細胞流体溶質が濃縮されるので濃縮されるに
つれ、共晶が形成されるために組織試料は全く固
化されていなかつた。この溶質の移動はゆるやか
な冷却が使用される際に、物質が流体状態にある
間に生ずるものである。迅速凍結技術が使用され
る場合には脱水工程において特別の考慮が必要と
される。これらの問題は、脱水が液体状態よりも
むしろ固体状態において、即ち昇華によつて生じ
なければならない（水は除去されなければならな
い）という事実から生ずるものである。

従来技術において、凍結代替手法は溶媒或いは
溶媒−固定剤混合物を水と−75〜−80℃において
置換することによる組織水の除去を含むものであ
つた。これは、過去の化学固定法よりも、組織試
料に対してよりおだやかな溶媒相分離および化学
的変成人為構造を導入するものである。実用的見
地からは凍結乾燥は組織試料が過冷却水の蒸気圧
を増大し、昇華を合理的時間内に行わせるように
加温するべきであるという要請により複雑なもの
である。蒸気圧の増大に加えて、温度の上昇は氷
結晶の拡大および同時に組織試料の超微細構造形
態への損傷に導く一連の物理的現象をもたらす。
加温操作の際に生ずる多くの物理的現象は存在す
る水の物理状態における転移に関連するものであ
る。典型的に見られる変化はガラス転移、失透お
よび一連の結晶格子立体配置転移を伴う再結晶化
である。

この様に、凍結乾燥およびその他の凍結調製技
術は形態学的検査のための組織試料の調製のため
の例外的機会を提供するものである。しかしなが
ら、凍結調製技術の使用においては、試料の脱水
および固定に伴う問題が内在する。これらは本発
明の方法および装置により向けられた問題点であ
る。

本発明の冷凍調製方法は、角膜組織の移植にお
いて異常な適応性を示した。本発明の前には供与
者からの角膜の除去後に必要な凍結或いは凍結乾
燥を含んだ角膜移植の試みは移植時に常に曇つた
角膜となつたというものであつた。この移植角膜
の物理的状態は角膜自体における結晶形成および
支質（基質）への同時に存する損傷によつて生じ
たものであつた。本発明の方法を使用することに
より、眼科医は供与者から取り出した後に直ちに
角膜を凍結調製し、次いでそれらの角膜を殆んど
曇り或いは結晶形成などなしに受領者に移植する
ことが可能になつた。その様に角膜を移植する能
力は本発明の方法に特別の利点を示すと共に角膜
移植外科医術における医学的突破口を示すもので
もある。

従つて、本発明の目的は組織試料の超微細構造
の形態学的特徴の明白な崩壊或いは破壊のない生
体試料の調製方法を提供することである。

さらに本発明の目的は迅速凍結による固体ガラ
ス相に得られる組織試料の製造方法を提供するも
のであり、その凍結方法は通常の分析装置による
解釈を制限する不必要な人為結果を生ずるもので
はない。

さらに本発明の目的は、組織超微細構造に対応
する損傷を与えることなく試料の有効な脱水を可
能にし、近代的高倍率拡大装置に使用することの
できる試料を与える組織試料の調製方法を提供す
ることである。

さらにまた本発明の目的は、本発明の方法に使
用される試料保持装置を提供することである。

本発明のこれらおよびその他の目的は、以下の
好ましい実施態様の説明から理解されるであろ
う。

本発明は超微細構造分析用生体組織試料の凍結
調製方法に関する。この方法は厳密に脱圧（減
圧）された条件下における生体組織試料の断熱的
脱水を含むものである。この脱圧されたガラス化
組織試料は−140℃未満の温度において平衡化さ
れる。この組織へ試料を次いで平衡状態に保ちな
がら脱水する。組織水の除去後組織試料を脱気さ
れた樹脂で浸潤させ、その後樹脂を重合して包埋
された組織試料を形成させる。本発明はさらに本
発明の方法における独特な使用特性を有する試料
保持装置に関するものである。

本発明を適用するための方法において、所望の
生体試料が得られることが基本的な前提要件であ
る。生体試料は各種手段、即ち外科的摘出、抜き
出された血液試料、バインダーおよび任意の公知
の通常の各種その他の技術により集められる。生
体試料を得る特別の方法は、本発明の方法および
装置に限定的なものではない。しかしながら、本
発明の方法および装置における組織試料の調製
は、組織試料が摘出後なるべく早く加工されると
高められる。

組織試料を運搬、貯蔵その他の必要な操作に際
して維持しようとする試みにおいて、これを固定
液、即ちホルムアルデヒドその他の生物学的に活
性な安定化溶液に保持することは可能ではない。
また、本発明の方法に従つた調製前に試料を常法
に従つて凍結或いはその他の物理的変性を行つて
はならないことも重要である。この組織試料の大
きさは、本発明において特に重要である。組織試
料の調製はそれが受け取られると直ちに行われ
る。この試料は、その後、装置内における長期間
の貯蔵のため或いは現在利用可能な各種分析装置
に使用するために物理的に切断その他の物理的な
準備を行うことができる。

本発明の方法による調製のための好ましい最適
生体試料は新鮮な１mm³の部検（バイオプシー）試
料である。これらの試料はなるべく早くガラス化
されなければならない。ガラス化とは「冷凍」と
は異る試料の凍結固定を生ずる方法を指すもので
ある。ガラス化の方法においては、使用される凍
結装置は組織試料中に含まれる可溶性および不溶
性部分が妨害されず、移動されず或いは変更され
ずまた、濃縮（共晶物として）されないように試
料をガラス相にするものである。定義によれば、
ガラス化液体は例えば窓ガラスのように剪断応力
にかけられると粉々になるものである。ガラス相
は液体水の非晶質、即ち「ガラス」相への転換を
含むものである。これは、組織試料をそれを−
196℃に維持された金属棒の高度に磨かれた（鏡
状）表面、凝縮物のない表面に「はね返りのない
状態」で接触させることにより迅速に過冷却させ
ることにより達成される。これらの操作は前記従
来技術の説明の箇所において既に説明した。

本発明の方法および装置において、特に有用で
あるのはメアリーランド医学大学校のアレン・ボ
イン博士（Dr.Allen Boyne）と共同して確認さ
れた「はね返りのない」凍結装置である。この凍
結装置においては、銅ブロツクが使用されて組織
試料をガラス化する。過冷却液体、例えば液体窒
素、ヘリウム、プロパン或いは各種フレオン類な
どと共に行われるこのガラス化は視察可能な或い
は決定可能な細胞水氷結晶の形成前および／また
はなしに組織試料液体を非晶質状態に過冷却す
る。この様にガラス化された組織試料は組織水の
除去前に貯蔵および移動操作に際して約−140℃
未満の温度に維持されることが絶対に必須であ
る。

試料の凍結と試料の脱水の間の予想される時間
間隔に応じて、それは液体窒素デユワービン中に
沈めて貯蔵することが出来る。一度試料が乾燥さ
れ、適当に包埋されると、それは、組織を分析デ
ータとして解釈不可能にする望ましくない人為結
果をもたらす変性および変形を起こす細胞質の細
網化その他の形態の細胞の異化作用を起こすこと
なく、実質的に無限に貯蔵することができる。

ガラス化後、および組織試料を−140℃未満の
温度に維持しながら、それを標本輸送により移動
し真空中において標本ホールダーに供給する。こ
の標本ホールダー（また、試料ホールダーとも呼
ばれる）は温度制御された容器内に維持されてい
る。この容器および標本ホールダーは両者共に−
140℃の温度に維持されている。本発明の最も好
ましい実施態様においては−196℃の液体窒素の
温度が維持されるのが好ましい。−140℃が臨界点
である理由は、液体窒素温度においてガラス相に
存在する純水が−140℃において立方氷結晶の形
成を開始しはじめるからである。前記従来技術の
説明において、確立したように、氷結晶化は組織
試料の形態学に対して超微細構造的損傷即ち、細
網化を引き起こす。

次に組織試料、標本ホールダーおよび容器の周
囲の雰囲気を脱圧する。これは典型的には試料ホ
ールダーを真空に引くことにより行われる。この
真空はほぼ300分以内に３×10^-9Torrの程度に引
かれる。本発明のその他の実施態様において、３
×10^-9Torr〜１×10^-10Torrに引かれる真空は全
て300分未満以内に達成される。これらの圧力は
所定の通常操作の残りの間全ての組織水が除去さ
れるまで５×10^-9Torrに留まる。系の平衡化
（24〜48時間）の間、真空が引かれおよび維持さ
れながら標本温度を液体窒素により維持する。

この時点において、組織試料は超低圧および極
めて低い平衡凍結温度にある。平衡が得られた後
（平衡温度−140℃未満）組織試料内に見られたガ
ラス状水は組織内の昇華先端部に昇華熱に等しい
エネルギーが間欠的および増加的に供給されるに
つれて昇華しはじめる。これは、遅い工程である
が試料の調製には重要なものである。試料に各エ
ネルギーの添加後平衡に到達する十分な時間が与
えられることが重要な要件である。平衡化とは組
織試料の温度が２〜４時間の時間間隔に亘つて最
早変化しないことを意味する。典型的な組織調製
方法において、試料は−196℃に迅速にガラス化
され、および昇華（乾燥）装置内の試料ホノール
ダー中の貯蔵／移動に際しては−140℃に維持さ
れ、適当な平衡化時間の後には平衡温度は−140
℃と−196℃間のいずれかにある。この全平衡化
過程に際して、臨界的超低圧は３×10^-9Torr以
下に維持される。

本発明の方法における必須段階である平衡化過
程の後、昇華のエネルギー（熱）が系に添加され
たいならば試料から感知できる程度の量の水が蒸
発するまでには極めて長い時間がかかる。本発明
の方法に従つた温度および圧力において水が蒸発
するには数年間の時間が推定される。従つて、本
発明の最も好ましい実施態様においては、乾燥組
織試料の超微細構造に損傷を与えることなく、第
二次エネルギー源（加熱）が昇華水分子を励起す
るために添加される。特別の波長を有する放射エ
ネルギーがこの目的を達成するために特に有用な
手法であると思われる。マイクロ波、レーザー系
統および磁気エネルギーによる昇華エネルギーも
また適当である。最も好ましい第二次エネルギー
源は上記エネルギー源と組み合わされた核磁気共
鳴手法である。平衡において、組織の温度は至近
の環境に対する周囲のパラメーター（放射エネル
ギーが支配的である。即ち室温は27℃）が変化し
なければ変化しない。これが系の平衡点の一般的
確認である。

組織試料の平衡到達に引き続き、組織中にガラ
ス化操作中に形成された過冷却固体水分および／
または現在決定不能な氷結晶（直径20mm以下）を
除去する必要がある。この部分の脱水は絶対的に
必要であり、組織中の超微細構造の殆んどの潜圧
的崩壊および細網化がそれ自体を表わす段階であ
る。これは、試料中の昇華エネルギーを時間当り
最少量の断熱的熱を添加しながら徐々に置換する
ことにより達成される。最適条件は組織温度の増
加を有しないことである。その様に昇華潜熱に等
価の熱エネルギーを上昇することにより、ミクロ
氷結晶或いは非晶質過冷却水の如何を問わず全て
の固体水分が周囲凍結系より組織試料から有効に
除去される。この乾燥は−140℃〜−80℃の温度
で達成される。この比較的大きな温度の自由度は
各種の結果を与え、各種濃度において細胞水中に
溶解している溶質による脱ガラス化温度の上昇に
よりとにかく可能である。適当な器具を用いるこ
とにより、全ての細胞水が除去された時点を決定
することが可能である。その時点においてエネル
ギー上昇を加速して室温より３℃高い最終標本温
度（28〜30℃）を形成することができる。この様
に、この器具の使用により本発明の方法における
有意義な利点が得られる。

この様に脱水された組織試料は室温＋３℃に到
達する。室温に到達しても、真空は試料の周囲の
温度を有するように元の極めて超低圧に維持され
る。本発明の目的のための室温はほぼ24〜27℃と
理解されるべきである。この温度範囲には論理的
には変化があり得るものである。

この時点において、研究者は電子密度によるコ
ントラストを強調させるためにほぼ１時間組織を
オスミウム蒸気に曝すことができる。これは利益
上有害であることが証明されるか或いは最終目標
が臨床用途である場合には省略することができ
る。オスミウム蒸気は凍結沈降による再結晶化に
より除去される。その他の確立された固定化方法
においては、緩衝溶液中のパラホルムアルデヒド
および／またはグルタルアルデヒドが使用され
る。これらの物質は典型的に化学的固定物質と称
される。典型的に添加される最も好ましい物質は
四酸化オスミウムである。この物質は組織試料の
解釈に使用される各種分析装置の組織の各種構成
成分の解像力およびコントラストを高める。

次いで脱気された樹脂がなお脱圧された条件を
保ちながら組織に添加される。これは典型的には
樹脂浸潤と称され、包埋された組織試料を生ず
る。過去の方法において有用性を示した樹脂は同
等に本発明の方法に適用可能である。

これらの工程に引き続き組織試料および樹脂を
徐々に樹脂口から空気を通して大気圧にする。樹
脂適用過程から生じた包埋された組織試料を取り
出し、樹脂を所定温度において重合させる。重合
方法は使用された樹脂の種類に応じて大きく異
る。典型的には、組織試料はオーブン中で熱を加
えて12時間重合される。通常の温度は60℃である
が必要に応じては−80℃程度の低温も使用するこ
とが出来る。重合工程は組織の超微細構造に損傷
を与えないように達成することが必要である。

重合後組織試料を次いで室温で貯蔵し、薄い断
片にして染色し、或いはその他の分析のためにさ
らに準備することが出来る。しかしながら、本発
明により開示される要領で脱水された後において
は、それは通常のウルトラマイクロトームおよび
電子顕微鏡により容易に解釈可能である凍結固定
状態に保たれ、人為構造の相当な変更および減少
をもつて組織試料の極めて有意義な分析の基礎を
提供し、同時に過去の束縛を減少或いは除去して
視覚分析のための固定および／或いは組織調製の
ために至るところに存在し得るものである。

これらの生体組織における構造対機能の実際の
関連付けは、これ迄通常の電子顕微鏡では使用さ
れないとみなされていた適用可能な染色方法の巨
大な拡張をもつて通常の超薄切断法（即ち、任意
の可溶性部分、糖類、脂質類および可溶性蛋白質
の免疫学的分析）、無器官内の酵素細胞化学、Ｘ
−線分配STEM分析、組織移植調製、マイクロ
プロープ分析、オートコバイオグラフイー
（autocobiograhy）（特に可溶性化合物の）およ
び薬品調製によりなされる。

この体系の実施には、その他の装置も利用可能
であるが、しかしながら、上記の必要な定義され
たパラメーターを完全に導入するものでないので
いずれも期待された結果をもたらさなかつた。本
発明の実施に使用される装置は模式的に第２図お
よび第３図に図示されている。

第３図に図示される試料ホールダーとも称され
る標本ホールダーは本発明の実施に独特なもので
ある。この試料ホールダーは組織試料に悪影響を
およぼすことなく凍結温度において組織試料を保
持する能力を有さなければならない。好ましく
は、組織試料は懸架され、分離された（熱的伝導
のない）状態で保持される。模式図から見られる
ように、試料ホールダーは、コンスタントン−カ
ツパー（constanton−Copper）熱電対温度ゲー
ジにより監視される加減抵抗器で制御された加熱
要素を含有する。これらの材料の調和された使用
により組織試料自体の近似温度を制御および監視
することが可能である。

試料ホールダーは低温保持装置又は低温装置内
に入れられ、それは次いで脱圧装置に連結され
る。脱圧装置は第２図に示される如く、極めて低
圧を維持するための各種の通常の装置の任意のも
のを包含する。これらは通常の真空型圧力ではな
く、事実、シイミユレーシヨン型の脱圧であるこ
とに注意すべきである。この装置は必要とされる
熱移動のための適当な条件を形成するために本発
明の方法に使用する適当な装置の一例であるが、
これは本発明を限定するものではなく単に有用性
を示した装置の型の一例であるに過ぎない。多く
の脱圧装置におけると同様に、脱圧装置の適当な
機能を容易に働かせるために各種の吸引手段、モ
ーター類、フアンおよび加熱要素が存在すること
が必要である。

Alan Boyne型の装置により達成される迅速凍
結は本発明の実施に必須である。通常、冷却金属
付属物と組合わされた液体窒素或いはその他の型
の急冷浴槽が本発明の方法において、それらが細
胞水のガラス化相を与える程度に使用される。第
２図に模式的に図示されるように、組織ホールダ
ー中に含まれる組織試料の温度を低下および維持
を行うために液体窒素急冷浴槽が使用される。組
織試料は液体窒素状態中に維持されるが、管の取
付けは本発明の方法において任意に使用すること
が好ましい各種染色および固定材料並びに本発明
の組織材料を重合前に包埋するために最終的に使
用される各種樹脂に接近するようにされることが
必要であることに注目すべきである。又これらの
機能の各々は添附の図面に概略図示する。しかし
ながら、これらは本発明の限定的な特徴を示すこ
とを目的とするものではなく、利用可能な技術の
例示にすぎない。

本発明の方法に使用するための装置の設計或い
は装置の選択にあたり、極めて低温および低圧の
各種材料におよぼす影響を理解することが必要で
ある。このため、ガラス化状態にある物質を処理
するために使用される本発明の装置の部分は典型
的にステンレス製である。その他の材料も同様に
利用可能である。同様に、本発明の装置の部分は
大部分がテトラフロランにより構成される
Dupont社の製品であるTeflonで作られた或いは
被覆されたものであつてもよい。

第２図は本発明を実施するために使用される装
置の模式図である。機械ポンプ１１が超高真空ポ
ンプ１０に取り付けられている。真空装置１０は
試料室２０に連結されている。この超高真空ポン
プ１０は各種市販の真空ポンプ装置の任意のもの
でよい。好ましい実施態様は特にLeybold−
Heraeusにより製造されているターボ分子ポンプ
である（モデルTMP−360）。この超高真空ポン
プはそれがターボ分子ポンプであると否とを問わ
ず炭化水素のない真空をもたらすものであること
が必須である。機械ポンプ１１は超高真空ポンプ
１０を介して試料室２０から運び込まれたガスを
ポンプ出しするために使用される。

試料室２０はより詳細に第３図において説明さ
れ、示されている。しかしながら、第２図におい
ては、試料室２０は標本ホールダー支持組み合わ
せ体３０に直ちに隣接している。試料室２０は実
際の組織試料を保持するために使用される。熱放
射シールド４０は試料室２０および閉じ込められ
た組織試料を周囲環境から断熱するために試料室
２０を取り囲むものである。

典型的には、冷凍浴槽環境５０はデユワービン
に含有された液体窒素である。必須特性は温度が
−140℃を越えてはならないことである。冷凍浴
槽環境５０からの冷凍エネルギーの試料室２０へ
の熱伝導性は構造に固有のものである。組織試料
に適当な温度を維持するために放射シールド４０
と試料室２０の間には何等の直接の接続が存在す
る必要はない。

第３図は試料室２０および標本ホールダー支持
装置３０をより詳細に図示するものである。実際
の標本ホールダーは番号６０により示されてい
る。１個以上の標本ホールダー６０は試料室２０
内に含まれる。標本ホールダー６０は支持体３０
により支持されている。標本ホールダーは周囲環
境から、拡散性（吸収性）である内表面２２Ａお
よび分光性（反射性）である外表面２２Ｂを有す
る放射制御シールド２２により断熱されている。
本発明の好ましい実施態様においては表面２２Ａ
は、発光量＝０の完全黒色（黒色の外観）を有
し、完全に如何なる熱放射も吸収するものであ
る。分光表面２２Ｂは高度に磨かれて如何なる放
射エネルギーも完全に反射するものである。ニツ
ケルその他の高度に磨くことのできる材料で外部
表面２２Ｂを被覆することが好ましい。

放射加熱手段２４は第３図に図示されており、
組織試料への放射熱源を提供する。放射加熱手段
２４は制御手段２６により制御される。制御手段
２６は放射加熱手段に無限の可変性を可能にする
ものであり、典型的には加減抵抗器或いはサーモ
スタツトである。環境の温度および組織試料の温
度が特別に制御されるように試料室のいくつかの
点に温度／指示手段２８も接続されている。

第９図および第１０図は本発明の好ましい方向
性放射加熱手段を図示するものである。好ましい
放射加熱手段２４において適当な配列および製造
の結果、熱が、より効率が低いがより典型的であ
るランダムな球状の放射熱伝導とは対照的に、実
質的線形に伝導される。この実施態様において
は、第３図の番号２４により図示されるような標
準的な加熱材料のブロツクの代りに第９図および
第１０図に図示される如き特別に如き特別に設計
された加熱材料のブロツクが使用される。この実
施態様において、突出部９１は好ましい放射加熱
器９０の最上部表面から延在している。突出部９
１の表面９２は放射熱が出来るだけエネルギーの
損失を少なく伝導されるように高度に磨かれてお
り、且つ放射エネルギーの実質的に線状に伝導の
基礎を提供するように特別の角度が与えられてい
る。更に、特に第１０図を参照すると９３で示さ
れている突出部９１を分離する溝部分は最大エネ
ルギー伝達を与えるように黒色物質で被覆されて
いる。

本発明の最も好ましい実施態様において、放射
加熱手段２４、制御手段２６および温度支持手段
２８は全て精密に規定された範囲内においてコン
ピユーターにより操作されている。

第３図は放射熱を例示するものであるが、本発
明の装置および方法においては他の形態のエネル
ギーも同様に有用である。より具体的にはマイク
ロ波、ラジオ波、音響波、可視光線波および紫外
線或いは近紫外線波などの電磁エネルギー源を使
用することが出来る。磁束も又有用であり、特に
上記エネルギー形態の任意のものと組み合わせて
使用することが出来る。本発明の装置が置かれる
用途および試料に応じて上記エネルギー源の組み
合せも使用することが出来る。赤外線照射は、避
けるべきである。最終的に選択されるエネルギー
の決定に当つては試料の特性が最も重要である。

次に、第４図により標本ホールダー組み合わせ
物６０が示されている。典型的には、ステンレス
製である標本室６１が示されている。放射エネル
ギーの循環並びに水分の除去の基礎を与えるため
に穴６２が任意に存在することが出来る。間隔配
置部材６３を室６１の周辺に設けるのが好まし
い。その最も好ましい形態において、スペーサー
６３はテフロンＯ−リングである。チユーブ状の
支持部材６４は標本室６１の底部から延在し、そ
の末端はスペーサー部材６５で終了する。スペー
サー６５は好ましくはテフロンで構成され、収納
部６６および対をなすＯ−リング６７および６８
により構成される。好ましい実施態様において、
チユーブ状支持部材６４はゼオライトのような乾
燥剤物質を含む。

第５図は本発明の標本ホールダーの上面図であ
る。標本室６１の側面に見られる穴６２は又第５
図に図示される標本室の底部においても結合され
ている。これらの穴は水分の流れおよび放射エネ
ルギーの移動を可能にするものである。複数の標
本スペーサー７０が標本室６１の底部の至るとこ
ろに見られる穴６４中に挿入されている。最も好
ましい態様（第７図参照）においては、標本スペ
ーサー７０は、第８図に図示され、チユーブ状支
持部材６４の表面に含まれて取り付けられている
周辺エネルギー移動部材８０中に挿入されている
下方に延在する脚部７１を有する。好ましくは、
部材８０はその内部長さ方向にタングステン線が
内張りされているテフロンチユーブよりなるのが
よい。これらのチユーブは、タングステン線およ
び標本スペーサー７０の脚部７１の両者が該部材
８０の内部に取り外し可能に挿入可能である大き
さである。実施に際して実際の標本は隣接標本ス
ペーサー７０の間に置かれる。標本スペーサー７
０の使用により無限の変化を有する形状および立
体構造を得ることが出来る。この様に本発明の標
本ホールダーは実質的に任意の種類或いは大きさ
の標識標本に適用可能である。

第７図は本発明の標本スペーサーを図示するも
のである。その好ましい実施態様において、標本
スペーサー７０は穴７３を有し、保持ピン７４に
枢着されている平面状フランジ７２を含むもので
ある。保持ピン７４はチユーブ８０内に挿入可能
な下方に延在する脚部７１を有する。複数の標本
スペーサー７０を穴６４および場合によりチユー
ブ状部材８０内に挿入することにより、各種構造
および配置の組織標本を享受することが出来る。

第６図は、標本ホールダー６０、特にメツシユ
６９の底部を図示するものである。テフロンメツ
シユ６９が備えられて、チユーブ状支持部材６４
内にゼオライトその他の乾燥剤を保持すると共に
同時に該標本ホールダー６０の底部を通じて水分
などの自由流動を可能にしている。

以上、詳細に本発明の標本ホールダーの好まし
い実施態様について説明したが、特別の最終用途
のために装置を設計する者には各種の実施態様が
容易に利用可能である。本発明の好ましい標本ホ
ールダーの説明は本発明を限定する意図を有する
ものでなく、単に本発明の好ましい実施態様を例
示するものにすぎない。上記説明されたものに修
正および変化を導入するその他の標本ホールダー
も又同様に本発明の範囲内に含まれるものであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法の概略フローダイアグラ
ムである。第２図は本発明の装置の概略図であ
る。第３図は本発明の試料室の概略図である。第
４図は本発明の標本ホールダーの側面図である。
第５図は、本発明の標本ホールダーの上面図であ
る。第６図は、本発明の標本ホールダーの底面図
である。第７図は、本発明の標本分離手段の斜視
図である。第８図は、第４図の線８−８に沿つて
とられた断面図である。第９図は、本発明の好ま
しい放射加熱器の上面斜視図である。第１０図
は、本発明の好ましい放射加熱器の側面斜視図で
ある。 図中、１０……超高真空ポンプ、１１……機械
ポンプ、２０……試料室、２２……放射制御装
置、２２Ａ……拡散性（吸収性）表面、２２Ｂ…
…分光性（反射性）表面、２４……放射加熱手
段、２６……放射加熱制御手段、２８……温度指
示装置、３０……標本ホールダー支持体、４０…
…熱放射シールド、５０……冷凍浴槽環境、６０
……標本ホールダー。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 試料室２０内の試料ホルダ６０にガラス
   化された生体組織試料を載置する工程 (b) 超真空が得られるように上記試料室２０を脱
   圧する工程 (c) 上記真空が維持されている間に−140℃未満
   の温度において平衡化させる工程、および (d) 脱ガラス化が起る前にエネルギーの添加によ
   り上記試料からガラス化された水を除去するこ
   とにより上記試料を脱水する工程 を有することを特徴とする超微細構造分析用生体
   組織試料の凍結調整方法。 ２ 試料室２０の脱圧工程は、ターボ分子ポンプ
   によつて行われている特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ３ 試料室２０を約３×10^-9Torr及び１×
   10^-10Torr間の圧力に脱圧する、特許請求の範囲
   第１項または第２項記載の方法。 ４ 放射エネルギー源２４によつて試料にエネル
   ギーを添加する、特許請求の範囲第１項乃至第３
   項のいずれかに記載の方法。 ５ 放射エネルギー源２４は線状のエネルギー伝
   達源９０である、特許請求の範囲第４項記載の方
   法。 ６ 放射エネルギー源２４が電磁エネルギー源で
   ある、特許請求の範囲第４項記載の方法。 ７ 電磁エネルギー源はさらに磁束が加えられ
   る、特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８ (a) 試料室２０内の試料ホルダ６０にガラス
   化された生体組織試料を載置する工程 (b) 超真空が得られるように上記試料室２０を脱
   圧する工程 (c) 上記真空が維持されている間に−140℃未満
   の温度において平衡化させる工程、および (d) 脱ガラス化が起る前にエネルギーの添加によ
   り上記試料からガラス化された水を除去するこ
   とにより上記試料を脱水する工程 (e) 上記真空を維持している間に重合可能な樹脂
   で上記試料を浸潤する工程、および (f) 化学的に固定された組織試料が形成されるよ
   うに樹脂浸潤試料を重合させる工程 を有することを特徴とする超微細構造分析用生体
   組織試料の凍結調整方法。 ９ 試料室２０の脱圧は、ターボ分子ポンプによ
   つて行なわれる特許請求の範囲第８項記載の方
   法。 １０ 試料室２０を約３×10^-9Torr及び１×
   10^-10Torr間の圧力に脱圧する、特許請求の範囲
   第９項または第１０項記載の方法。 １１ 放射エネルギー源２４によつて試料にエネ
   ルギーを添加する、特許請求の範囲第８項乃至第
   １０項のいずれかに記載の方法。 １２ 放射エネルギー源２４は線状のエネルギー
   伝達源９０である、特許請求の範囲第１１項記載
   の方法。 １３ 放射エネルギー源２４が電磁エネルギー源
   である、特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １４ 電磁エネルギー源はさらに磁束が加えられ
   る、特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５ (a) 生体組織を保持する試料ホルダ６０
   と、 (b) −140℃未満の凍結温度に維持できるように
   試料ホルダ６０を収納保持する試料室２０と (c) 試料室２０を脱圧するための超高真空装置１
   ０と、 (d) 脱ガラス化が起る前に前記組織を脱水する装
   置 とを有する、生体組織の凍結調整装置。 １６ 凍結デユワービンには液体凍結剤が収納さ
   れ、その中に試料室が載置される、特許請求の範
   囲第１５項記載の装置。 １７ 液体凍結剤は液体窒素からなる、特許請求
   の範囲第１６項記載の装置。 １８ 超高真空装置１０はターボ分子ポンプから
   なる、特許請求の範囲第１５項乃至第１７項のい
   ずれかに記載の装置。 １９ 超高真空装置１０は約３×10^-9Torr及び
   １×10^-10Torr間の圧力を発生する、特許請求の
   範囲第１５項乃至第１８項のいずれかに記載の装
   置。 ２０ 脱水装置はエネルギー源からなる、特許請
   求の範囲第１５項乃至第１９項のいずれかに記載
   の装置。 ２１ エネルギー源は放射エネルギー源からな
   る、特許請求の範囲第２０項記載の装置。 ２２ 放射エネルギー源２４は線状のエネルギー
   伝達源９０である、特許請求の範囲第２１項記載
   の装置。 ２３ 放射エネルギー源２４は電磁エネルギー源
   からなる、特許請求の範囲第２２項記載の装置。