DE10061968A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Einfrieren von Hornhautgewebe - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vitrifikation von Hornhautgewebe, wobei das Hornhautgewebe (1) in einem Behälter (3) mit einer Vitrifikationslösung (2) auf eine Temperatur abgekühlt wird, bei der das Hornhautgewebe (1) vitrifiziert. Das Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß als zu vitrifizierendes Hornhautgewebe (1) Gewebe von hinteren Hornhautlamellen (Teile des Stroma, die Descemet-Membran, das Endothel) verwendet wird. Ein anderes erfindungsgemäßes Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß die Vitrifikationslösung (2) schockartig auf eine Temperatur Ts geringfügig unterhalb der Glasübergangstemperatur Tg der Vitrifikationslösung (2) und dann weiter in kleineren Temperaturschritten auf eine tiefer liegende Endtemperatur Tt abgekühlt wird. Ebenso betrifft die Erfindung eine entsprechende Vitrifizierungsvorrichtung.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vitrifikation von Hornhautgewe­ be, wobei das Hornhautgewebe in einem Behälter mit einer Vitrifikati­ onslösung auf eine Temperatur abgekühlt wird, bei der das Hornhaut­ gewebe vitrifiziert.

Gegenwärtig sind Erkrankungen, die eine Narbenbildung oder Trübung der Hornhaut bedingen, weltweit die häufigste Ursache für eine Erblin­ dung. Mit einer Hornhauttransplantation ist bei einem großen Teil die­ ser Patienten eine Erblindung vermeidbar. Der Mangel an Spender- Hornhäuten erklärt den großen personellen und technischen Aufwand, der betrieben wird, um jede zur Verfügung stehende Hornhaut zu transplantieren. Die Auswahl und Einbestellung eines geeigneten Empfängers, die serologischen Untersuchungen zum Ausschluß über­ tragbarer Erkrankungen durch die Transplantation und die weiteren Vorbereitungen für die Operation machen eine Lagerung der Hornhäute unumgänglich. Mit den heute zur Verfügung stehenden Konservie­ rungsmöglichkeiten ist eine Lagerung von maximal vier Wochen mög­ lich.

Die Gefrierkonservierung stellt von allen Konservierungsverfahren als einzige die Möglichkeit einer unbegrenzten Lagerung von Organen in Aussicht. Die Lagerung einer Spenderhornhaut in flüssigem Stickstoff bei -196°C sorgt für einen effektiven Stillstand aller Stoffwechselvor­ gänge. Bei solchen Temperaturen laufen die normalen zellulären che­ mischen Reaktionen nicht ab, da das Energieniveau zu niedrig ist, um die für einen Ablauf der Reaktion ausreichende molekulare Bewegung zuzulassen.

Allerdings gehört die Hornhaut zu den Organen, für die trotz zahlreicher Untersuchungen bisher keine geeignete Methode zur Gefrierkonservie­ rung entwickelt wurde. Dabei bietet die Hornhaut den großen Vorteil, daß die Einfrierbedingungen ganz auf die Bedürfnisse des innenliegen­ den Hornhautendothels abgestimmt werden können, da die anderen Bestandteile der Hornhaut - von außen nach innen Epithel, Bowman- Membran, Stroma, Descemet-Membran - entweder gegenüber dem Einfrierprozeß unempfindlich sind (Stroma) oder durch einwandernde Zellen des Empfängers nach der Transplantation ersetzt werden (Epit­ hel). Es gibt zudem Hinweise, daß die Gefrierkonservierung der Horn­ haut zu einer Abnahme der Immunogenität des Gewebes führt. Dies wäre neben der zeitlich unbegrenzten Lagerung ein weiterer Anreiz zur Etablierung eines Verfahrens zur Kryo- bzw. Gefrierkonservierung.

Die ersten Versuche zur Gefrierkonservierung von isolierten Hornhäu­ ten bei -196°C wurden in den sechziger Jahren entwickelt, wobei lang­ same Einfrierraten unter Einsatz von Gefrierschutzmitteln bzw. Kryo­ protektoren verwendet wurden. Unter Kryoprotektoren (cryoprotective agents; CPA's) versteht man Chemikalien, die das Überleben von Zel­ len während des Einfrier- und Auftauprozesses fördern. Insbesondere regulieren oder verhindern sie eine Bildung von Eiskristallen, die für die Zelle letal wären.

Alle Kryoprotektoren sind gut wasserlöslich; viele von ihnen sind Alko­ hol- oder Zuckerderivate. Das momentan am weitesten verbreitete Ge­ frierschutzmittel ist Dimethylsulfoxid.

Es werden zwei große Gruppen an Kryoprotektoren unterschieden, ei­ nerseits membrangängige (sog. intrazelluläre) Kryoprotektoren, die auch intrazellulär wirken können, und andererseits nicht membrangän­ gige (sog. extrazelluläre) Kryoprotektoren. Der kryoprotektive Effekt der intrazellulären Kryoprotektoren, aber auch deren unerwünschte toxi­ sche und osmotische Wirkung steigt mit der Konzentration des Kryo­ protektors. Auch eine Erhöhung der Temperatur und der Expositions­ dauer der Zellen gegenüber dem Kryoprotektor führt zu einer stärkeren Schädigung.

Zwar konnten in einigen der Versuche in den sechziger Jahren klare Hornhäute in Transplantationsexperimenten wie auch in limitierten kli­ nischen Versuchen erhalten werden, allerdings streute die Erfolgsquote sehr stark. Diese Probleme bei der langsamen Einfrierung von Horn­ häuten hat man bis heute nicht gelöst.

Wenn Zellen unter Verwendung relativ langsamer Kühlraten in einer wässrigen Lösung eingefroren werden, bildet sich das Eis zunächst im extrazellulären Medium. Die Bildung von Eis hinterläßt notwendigerwei­ se einen Rest einer extrazellulären Lösung, deren Volumen sich zu­ nehmend verringert und deren Konzentration an gelösten Stoffen konti­ nuierlich ansteigt. Die Zellen, die zunächst mit der umgebenden Lösung im osmotischen Gleichgewicht standen, verlieren nun über ihre semi­ permeable Zellmembran Wasser und beginnen zu schrumpfen (Kryo­ dehydratation). Da auch Wasser die Zellmembran nicht ungehindert passieren kann, hängt das Ausmaß der Zellschrumpfung vom zeitlichen Verlauf der Abkühlung ab. Bei sehr langsamer Abkühlung kann viel Wasser die Zelle verlassen, wodurch es zu einer starken Zellschrump­ fung und damit verbunden zu hohen zellschädigenden Salzkonzentra­ tionen im Zellinnern kommt. Bei schnellerer Abkühlung verbleibt wenig Zeit für eine osmotische Wasserabgabe. Durch den dann hohen intra­ zellulären Wassergehalt wird die Bildung von intrazellulärem Eis wäh­ rend des weiteren Abkühlens sehr wahrscheinlich. Die Eisbildung bei schnellerer Abkühlung ist ebenso wie die hohen intrazellulären Salz­ konzentrationen bei zu langsamer Abkühlung für die Zelle letal. Diese beiden Schädigungsmechanismen wurden von Mazur als Zwei-Faktor- Hypothese beschrieben (Mazur, P., Leibo; S. P., Chu, E. H. Y., A two­ factor-hypothesis of freezing injury, Exp. Cell Res. 1977, 71, 343-355). Diese Schädigungsmechanismen können durch ein erfolgversprechen­ des alternatives Einfrierverfahren, die sogenannte Vitrifikation, vermie­ den werden.

Vitrifikation ist ein Abkühlungsvorgang, bei dem wässrige Lösungen so schockartig abgekühlt werden, daß für eine Ausbildung von Eiskristal­ len im intra- und extrazellulären Raum keine Zeit bleibt. Hierbei werden die wässrigen Lösungen bei der sog. Glasübergangstemperatur Tg (im strengeren Sinn ein Temperaturbereich) in einen Glaszustand über­ führt. Geeignete Lösungen verhalten sich dabei wie weit unter den Ge­ frierpunkt unterkühlte Flüssigkeiten sehr hoher Viskosität.

Eine Vitrifikation von wäßrigen Lösungen bei Kühlraten, die in der Pra­ xis erreichbar sind, ist nur durch Verwendung der erwähnten Gefrier­ schutzmitteln möglich, welche für die Vitrifikation in erheblich höheren Konzentrationen erforderlich sind als bei den herkömmlichen Einfrier­ techniken. Ein besonderes Problem dieses Verfahrens stellt daher die erhöhte Toxizität der Kryoprotektoren dar. Es ist deshalb unabdingbar, eine optimale Einstellung der Konzentration des oder der verwendeten Kryoprotektoren in Abhängigkeit vom Gefrierpunkt, der Kristallisation und der Glasübergangstemperatur der Lösung zu finden. In der Publi­ kation "Vitrification as an Approach to Cryopreservation" von G. M. Fahy in Cryobiology 21, 407-426 (1984) ist diese komplexe Abhängig­ keit im Detail beschrieben.

Mittels des Vitrifikationsverfahrens wurden beispielsweise schon erfolg­ reich Erythrozyten, Mäuseembryonen, Langerhans-Inseln, menschliche Monozyten und Oozyten vitrifiziert. Bei der Tiefkühlkonservierung von größeren Organen und Organismen treten bisher weitgehend ungelöste Probleme dahingehend auf, daß die Erzeugung von beliebigen, überall im Gefriergut gleichen Kühl- und Heizraten mit zunehmender Zellver­ bandgröße immer schwieriger wird.

Die Hornhaut ist aufgrund ihrer geringen Größe und der guten Erreich­ barkeit ihrer oberflächlichen Zellen theoretisch gut für eine Vitrifikation geeignet. In den dennoch bislang nur wenigen Arbeiten über Vitrifikati­ onsversuche von Hornhäuten wurden verschiedene Kryoprotektoren in unterschiedlichen Behältern mit einem Volumen von 3 ml aufwärts aus Glas oder Polypropylen verwendet (s. "Human Corneal Studies with a Vitrification Solution Containing Dimethylsulfoxide, Formamide, and 1,2-Propanediol" von W. M. Bourne und L. R. Nelson, Cryobiology, 31, 522-530 (1994), und "Vitrification of Organized tissues" von J. M. Ar­ mitage und S. J. Rich, Cryobiology 27, 483-491 (1990)). Polypropylen erwies sich hierbei als schonender für die Zellen als Glas. Die auftre­ tenden vielfältigen Probleme bestanden insbesondere darin, daß sich inter- und intrazelluläre Vakuolen bildeten, die Hornhäute keine ausrei­ chende Funktion besaßen, sich Risse bildeten, der Zellkontakt zwi­ schen Endothel und Descemetscher Membran zerstört war, eine Eisbildung im Bereich der Sklera und der dickeren peripheren Hornhaut zu beobachten war oder die toxischen Schäden zu groß waren.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren der eingangs genannten Art weiterzubilden bzw. eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, so daß größere Erfolgsraten bei der Vitrifizierung von Hornhautgewebe erreicht werden.

Diese Aufgabe wird bei dem Verfahren der eingangs genannten Art in einem ersten Aspekt der Erfindung dadurch gelöst, daß als zu virtrifizie­ rendes Hornhautgewebe Gewebe von hinteren Hornhautlamellen (Teile des Stroma, die Descemet-Membran, das Endothel) verwendet wird.

Die genannte Aufgabe wird zudem bei dem Verfahren der eingangs genannten Art in einem zweiten Aspekt der Erfindung dadurch gelöst, daß weniger als 1 ml Vitrifikationslösung in den Behälter gefüllt werden.

Diese Aufgabe wird bei dem Verfahren der eingangs genannten Art in einem dritten Aspekt der Erfindung dadurch gelöst, daß als Behälter ein solcher mit gegenüber dem Hornhautgewebe im wesentlichen inertem Material auf der Behälterinnenseite verwendet wird.

Weiterhin wird diese Aufgabe bei dem Verfahren der eingangs ge­ nannten Art in einem vierten Aspekt der Erfindung dadurch gelöst, daß die Lösung schockartig auf eine Temperatur Ts geringfügig unterhalb der Glasübergangstemperatur Tg und dann weiter in kleineren Tempe­ raturschritten auf eine tiefer liegende Endtemperatur Tt abgekühlt wird.

Die Aufgabe wird bei der Vitrifikationsvorrichtung gelöst durch ein der­ art ausgebildetes erstes Gefäß zur Aufnahme eines ersten Kühlmediums, daß in dem ersten Kühlmedium ein Behälter mit einer Vitrifikati­ onslösung und dem darin befindlichen Hornhautgewebe auf eine Tem­ peratur geringfügig unterhalb der Glasübergangstemperatur Tg der Vi­ trifikationslösung abkühlbar ist, ein zweites Gefäß zur Aufnahme eines zweiten Kühlmediums und eine Vorrichtung zur Wärmeübertragung von dem zweiten Kühlmedium auf das erste Kühlmedium.

Die Vorteile gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung bestehen insbe­ sondere darin, daß die Masse des einzufrierenden Hornhautgewebes wesentlich geringer ist als bei den Versuchen gemäß dem Stand der Technik. Ermöglicht wird eine derartige Präparation des zu transplantie­ renden Hornhautgewebes beispielsweise durch die Verwendung eines speziellen Mikrokeratoms. Eine solche Schneidevorrichtung ist in der DE 34 33 581 beschrieben, deren Offenbarung hiermit durch Bezug­ nahme eingeschlossen ist. Die mit diesem Keratom erhaltenen Horn­ hautgewebe weisen nur ca. 11%-12% des Volumens der bisher ge­ frierkonservierten Korneoskleralscheiben auf. Die Konservierung von hinteren Hornhautlamellen ist auch von klinischer Bedeutung, da bei eingetrübten Hornhäuten nämlich in den meisten Fällen schon eine Transplantation der Endothelzellen oder einer hinteren Hornhautschicht ausreichen würde, um die Transparenz wieder herzustellen.

Wesentlicher Gedanke der Erfindung gemäß ihrem ersten Aspekt ist demnach, daß bei Verkleinerung des Volumens des Gewebeverbandes ein umso schnelleres Eindringen der Kryoprotektoren in das Gewebe und eine im wesentlichen gleichmäßige Temperaturverteilung im Ge­ friergut ermöglicht wird. Damit werden die Expositionszeiten gegenüber den Kryoprotektoren erheblich verkürzt. Zudem ermöglicht eine Reduk­ tion an Gewebe ein schnelleres und besser kontrolliertes Einfrieren und Erwärmen des Gewebes.

Die Vorteile der Erfindung gemäß ihrem zweiten Aspekt bestehen ins­ besondere darin, daß mittels des erfindungsgemäßen Beutels nachteil­ hafte Wechselwirkungen zwischen Behälter und Hornhaut vermieden werden. Die bisher verwendeten Behälter waren alle derart ausgebildet, daß ein Kontakt aufgrund allein schon des Behältervolumens ausge­ schlossen wurde. Die Erfindung hat erkannt, daß Berührungen zwi­ schen Hornhautgewebe und Behälterinnenwand durchaus unschädlich sind, wenn nur die Innenseite des Behälters aus einem geeigneten Material besteht. Der zweite Aspekt der Erfindung ist nicht beschränkt auf die Vitrifizierung von Hornhautlamellen oder Teilen des Hornhaut­ gewebes. Vielmehr können auch ganze Hornhäute vitrifiziert werden.

Insbesondere hat sich Polytetrafluorethylen (Teflon®) als innenseitiges Material als geeignet erwiesen. Generell scheinen Fluoropolymere ge­ eignet zu sein. Teflon® ist sehr inert und verhindert eine Adsorption wie auch eine Adhäsion der verwendeten hinteren Hornhautlamellen an der Teflon®-Innenseite des Behälters. Es konnten keine mechanischen Schädigungen bei Kontakt zwischen Endothel und Gefäßwand festge­ stellt werden.

Wird weiterhin vorteilhafterweise ein durchsichtiger Behälter verwendet, kann die Hornhautlamelle bzw. das Hornhautgewebe während des Ein­ frierens und Auftauens beobachtet werden.

Vorzugsweise wird ein Behälter mit einem an seiner Außenseite ein Polyimid, insbesondere Kapton®, aufweisenden Material verwendet. Dies erlaubt insbesondere ein Beschriften des Behälters. Mit Teflon® auf der Innenseite und einem Polyimid, insbesondere Kapton®, auf der Außenseite weist der Behälter bevorzugt einen zweischichtigen Wandaufbau auf. Zusätzlich können auch noch ein oder mehrere in­ nenliegende Schichten vorgesehen sein.

Weiterhin haben sowohl Teflon® als auch Kapton® den Vorteil, daß sie in flüssigem Stickstoff flexibel bleiben. Mechanische Spannungen in der Lösung, verursacht durch die hohen Temperaturbewegungen während des Einfrierens oder Auftauens, können daher besser abgefangen wer­ den.

Der erfindungsgemäß verwendete Beutel weist eine ausreichende Sta­ bilität auf und ist leicht zu handhaben, da die Hornhautlamelle bzw. die Hornhaut unkompliziert eingelegt, danach der Behälter in einfacher Weise verschweißt und nach Aufschneiden des Behälters die Horn­ hautlamelle bzw. die Hornhaut wieder herausgenommen werden kann.

Ein Lösungsvolumen von weniger als 1 ml gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung ermöglicht extrem hohe Einfrier- und Auftauraten, da die Wärmeausbreitung nur über kürzeste Entfernungen vonstatten gehen muß. Sehr gute Erfahrungen wurden bei einem Behältervolumen von ca. 0.1 ml gemacht. Hierbei wurde der oben beschriebene Behälter mit Teflon®-Innenseite verwendet, der als inert gegenüber den verwende­ ten hinteren Hornhautlamellen angesehen werden kann. Vor Einbrin­ gen des Hornhautgewebes in den Behälter wird dieser nahezu voll­ ständig glatt gestrichen, um sein Volumen weiter zu verkleinern.

Der dritte Aspekt der Erfindung ist nicht beschränkt auf die Vitrifizierung von Hornhautlamellen oder Teilen des Hornhautgewebes. Es können auch ganze Hornhäute vitrifiziert werden.

Bei dem vierten Aspekt der Erfindung sowie der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind die Vorteile insbesondere darin zu sehen, daß mittels des Protokolls keine Schäden, wie beispielsweise Risse, an dem Horn­ hautgewebe feststellbar sind. Durch schockartiges Abkühlen des Horn­ hautgewebes, insbesondere der Hornhautlamelle, auf eine geringfügig unterhalb der Glasübergangstemperatur Tg liegende Temperatur Ts wird eine nahezu sofortige Vitrifikation bei gleichzeitiger schonender Behandlung des Hornhautgewebes erreicht. Die beim bisherigen schockartigen Abkühlen durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff ent­ standenen Risse wurden hierdurch vermieden. Das ebenfalls bisher bekannte Abkühlen mit Kühlraten von bis zu 45°C/min auf eine Tempe­ ratur von geringfügig unterhalb der Glasübergangstemperatur ließ ent­ weder eine Eis- oder Rißbildung eintreten. Es kann bei diesen Kühlra­ ten nicht von einer schockartigen Abkühlung im Sinne der vorliegenden Erfindung gesprochen werden. Im Sinne dieser Erfindung sind unter "schockartiger" Abkühlung Abkühlraten von mehr als 150°C/min, insbe­ sondere mehr als 200°C/min, zu verstehen, welche auch durch die Verwendung der oben beschriebenen kleinvolumigen Behälter für die hinteren Hornhautlamellen bzw. eines Hornhautgewebes ermöglicht werden.

Das langsame weitere Abkühlen von der Temperatur Ts auf die End­ temperatur Tt verhindert die Bildung von Rissen im Gefriergut.

Der vierte Aspekt der Erfindung ist nicht beschränkt auf die Vitrifizie­ rung von Hornhautlamellen oder Teilen des Hornhautgewebes. Es kön­ nen auch ganze Hornhäute vitrifiziert werden.

Bevorzugt liegt die Temperatur Ts ungefähr 2°C bis 30°C unterhalb von Tg, insbesondere 10°C-20°C unterhalb von Tg. Bei einer vorteilhaften Glasübergangstemperatur Tg von ca. -120°C ist Ts dann beispielswei­ se im Bereich von ungefähr -122°C bis -150°C angesiedelt.

Mit Vorteil wird ein erstes Kühlmedium zur äußeren Kühlung des Be­ hälters verwendet, welches zuvor oder gleichzeitig mit Hilfe eines zweiten Kühlmediums auf eine Temperatur nahe Ts abgekühlt wurde bzw. wird. Auf diese Weise läßt sich die Temperatur des ersten Kühl­ mediums gezielt auf die gewünschte, knapp unterhalb Tg liegende Temperatur Ts einstellen.

Es bietet sich hierbei an, als erstes Kühlmedium verflüssigtes Propan zu verwenden. Der kostengünstige Stickstoff ist für das Abkühlen von Gefrierproben zum Zwecke der Vitrifikation zwar verbreitet, aber nicht sehr gut geeignet. Zwar weist die Dampfphase von Stickstoff eine gün­ stige Temperatur von ca. -130°C auf, aber die Einhaltung dieser Tem­ peratur ist problematisch, da bspw. beim Öffnen des entsprechenden Gefäßes Stickstoff entweichen kann. Zudem verdampft Stickstoff bei Kontakt mit dem das Hornhautgewebe aufnehmenden Behälter auf­ grund seines niedrigen Siedepunktes und die sich dabei bildende Dampfschicht behindert den Wärmeübergang (Leidenfrost-Phänomen). Der Siedepunkt von Propan hingegen liegt mit -42°C um 154°C höher als der von Stickstoff. Demzufolge ist beim Kontakt des Gefriergutträ­ gers mit Propan im Vergleich zum Stickstoff die Ausbildung einer Dampfschicht geringer. Dies bedingt vorteilhafterweise einen höheren Wärmeübergang.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens wird als Vitrifikationslösung eine Lösung mit den Substanzen Dimethylsulfoxid, 1,2-Propandiol, Formamid, Chondroitinsulfat verwen­ det. Geringe toxische Schädigungen der Hornhaut konnten nachgewiesen werden mit einer Lösung mit der Bezeichnung VS41a (s. obigen Artikel in Crybiology 31, 522-530), die eine Glasübergangstemperatur Tg von ca. -123°C besitzt.

Bei der Verwendung von VS41a wird das Gefriergut bevorzugt im er­ sten Schritt mit maximaler Kühlrate auf eine Temperatur von etwa - 130°C bis -145°C abgekühlt. Um diese Kühlung mit Hilfe des Propans zu erreichen, wird zunächst das Propan auf diese Temperatur herab­ gekühlt. Die Kühlung und die damit einhergehende Verflüssigung von Propan erfolgt vorzugsweise durch verflüssigtes Methylcyclopentan, welches auch für andere Vitrifikationslösungen mit ähnlich tiefen Glas­ übergangstemperaturen einsetzbar ist.

Methylcyclopentan liegt bei Raumtemperatur als Flüssigkeit vor. Auf­ grund seines Gefrierpunkts bei -142,4°C kann es durch Abkühlung, die bevorzugt mit flüssigem Stickstoff vorgenommen wird, verfestigt wer­ den. Wenn der Verfestigungsvorgang einsetzt, weiß der Bediener, daß das Methylcyclopentan nun den Gefrierpunkt durchläuft. Nach Beendi­ gung der Kühlung beginnt Methylcyclopentan zu schmelzen und besitzt dann die angestrebte Temperatur von etwa -140°C. Der Wärmekontakt von Propan mit dem auf diese Temperatur gebrachten Methylcyclo­ pentan läßt das Propan dann auch eine Temperatur in diesem Tempe­ raturbereich einnehmen.

Durch die Kühlung von Methylcyclopentan mit flüssigem Stickstoff, der Kühlung von Propan in dem abgekühlten flüssigen Methylcyclopentan und schließlich durch die Kühlung des Behälters samt eingebrachtem Hornhautgewebe in Propan kann demnach das erstrebte Ziel erreicht werden, die Hornhautlamellen bzw. das Hornhautgewebe im ersten Schritt schockartig auf eine Temperatur von etwa -140°C abzukühlen.

Prinzipiell ist es auch möglich, den Behälter direkt in flüssiges Me­ thylcyclopentan an der Schwelle zur Verfestigung zu tauchen. Es könnte hierbei der Kühlschritt des Propans mittels Methylcyclopentan bei sonst vorteilhafterweise gleichem Vorgehen eingespart werden.

Wird eine andere Vitrifikationslösung verwendet, sind die verschiede­ nen Kühlmittel entsprechend geeignet zu wählen. Insbesondere das zweite Kühlmedium, welches die Temperatur des ersten Kühlmediums bestimmt, ist dann entsprechend zu wählen. Hier bieten sich insbeson­ dere flüssige Kühlmittel an, da mit flüssigen Medien ein schneller Wär­ meübergang zu realisieren ist.

Als Vitrifikationslösung kommt vorteilhafterweise auch eine Lösung in Betracht, welche eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Polyvinylalkohole enthält. Zusätzlich oder alternativ kann 2,3-Butandiol eingesetzt werden, welches teilweise oder ganz 1,2-Propandiol erset­ zen kann. 2,3-Butandiol und insbesondere (+)- und (-)-2,3-Butandiol besitzen bei niedrigerer Konzentration die gleichen vitrifizierenden Ei­ genschaften wie 1,2-Propandiol.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zeichnet sich gegenüber herkömm­ lichen Einfrierautomaten dadurch aus, daß eine präzise und zudem schnelle Abkühlung auf die Temperatur Ts, d. h. eine Temperatur ge­ ringfügig unterhalb der Glasübergangstemperatur Tg, ermöglicht wird. Der Wärmekontakt zwischen dem ersten Kühlmedium (mit einer Tem­ peratur geringfügig unterhalb der Glasübergangstemperatur Tg) in dem ersten Gefäß und dem Behälter samt dem Hornhautgewebe ermöglicht eine extrem schnelle Vitrifikation der Vitrifikationslösung und des Hornhautgewebes auf die Temperatur Ts. Es sind somit extrem hohe Kühl­ raten zu realisieren.

Besonders bevorzugt sind das erste und/oder das zweite Gefäß zur Aufnahme von verflüssigt vorliegendem ersten und/oder zweiten Kühl­ medium ausgebildet.

Bevorzugt umfaßt die Vorrichtung zur Wärmeübertragung eine Kühllei­ tung, durch die das erste Kühlmedium hindurchgeleitet wird. Die Kühl­ leitung ist vorzugsweise durch das zweite Gefäß geführt, kommt hierbei mit dem zweiten Kühlmedium in Wärmekontakt und mündet in das er­ ste Gefäß. Um schnell und effizient die Wärme bzw. die Kälte vom zweiten auf das erste Kühlmedium in der Kälteleitung zu übertragen, besteht die Kühlleitung bevorzugt aus Kupfer.

Der Wärmeübergang wird noch dadurch gefördert, wenn die Kühllei­ tung eine längere Passage in dem zweiten Kühlmedium zurücklegt und zu diesem Zweck vorteilhafterweise spiralförmig ausgebildet ist.

Auch das erste Gefäß ist bevorzugt aus Kupfer hergestellt. Dies bietet sich insbesondere dann an, wenn das erste Gefäß im zweiten Gefäß angeordnet ist und mit dem zweiten Kühlmedium in Berührungskontakt steht.

Eine Wärmetauscheinrichtung zwischen dem zweiten und einem dritten Kühlmedium ist vorteilhafterweise vorgesehen, um das zweite Kühlme­ dium auf eine Temperatur einzustellen, die geringfügig unterhalb der Glasübergangstemperatur Tg liegt. Vorteilhaft ist hierbei, wenn jene Temperatur einer Phasenübergangstemperatur des zweiten Kühlmediums entspricht, bspw. dem Gefrierpunkt des zweiten Kühlmediums. Es ist somit leicht beobachtbar, wann diese Temperatur erreicht ist.

Anhand des in der einzigen Figur dargestellten Ausführungsbeispiels wird das erfindungsgemäße Verfahren sowie die entsprechende Vor­ richtung näher erläutert:
In der Vorbereitung für die Vitrifizierung wird folgendermaßen vorge­ gangen: Es werden vorzugsweise doppelwandige, durchsichtige Be­ hälter 3 mit einem außenseitigen 0,025 mm starken Film aus beschrift­ barem Kapton® und einer innenseitigen, ebenfalls 0,025 mm starken Teflon®-Schicht verwendet, um darin Gewebe von hinteren Hornhaut­ lamellen 1 einzulegen. Die Kammergröße eines solchen Behälters 3 beträgt beispielsweise 2,4 cm × 2,4 cm. Durch Glattstreichen der Be­ hälterwände wird ein Behältervolumen von ca. 0.1 ml erhalten. Mittels einer Eppendorf-Pipette wird ein solches Volumen der 100%igen, oben beschriebenen Vitrifikationslösung 2 (VS41a) eingebracht. Die Glas­ übergangstemperatur Tg liegt für VS41a bei ca. -123°C. Zur Bildung von Kristallkeimen kommt es bei Temperaturen oberhalb von -90°C. Als Basismedium für die Vitrifikationslösung dient bevorzugt CPTES (Cor­ neal-Potassium-TES), eine kaliumreiche Elektrolytlösung, die den nicht zellgängigen anionischen pH-Puffer N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminoethan-sulphon-Säure (TES) enthält. Dem CPTES wird 2,5% Chondroitinsulfat (Typ A) zugesetzt. Die Beutel bzw. Behälter 3 werden bis zum Einlegen der hinteren Hornhautlamellen 1 auf Eis gelagert. Vor dem Einlegen des Hornhautgewebes 1 in den Behälter 3 wird das Ge­ webe nacheinander in Schälchen mit aufsteigenden Konzentrationen an VS41a jeweils für mehrere Minuten an die Virifikationslösung ge­ wöhnt. Mit einem Färbelöffel wird anschließend das Hornhautgewebe in den Behälter unter Spreizung der Behälteröffnung mittels einer Pinzette eingebracht. Nach Einlegen der Hornhautlamellen 1 wird der Kap­ ton®/Teflon®-Behälter 3 dann mit einem Schweißgerät (335°C) wieder verschlossen, damit keine Vermischung mit den Kühlmedien oder der Luft stattfindet.

Wie der Figur zu entnehmen ist, ist ein erstes offenes Gefäß 5 aus vor­ zugsweise Kupfer an seinem Rand über einen schmalen Steg 11 in einem größeren, zweiten Gefäß 7 befestigt. Das erste Gefäß 5 dient zur Aufnahme eines ersten Kühlmediums 4, in welches der Behälter 3 mit der eingeschlossenen Vitrifikationslösung 2 und dem Hornhautge­ webe 1 eingelegt wird. Das zweite Gefäß 7 nimmt ein zweites Kühlme­ dium 6 auf, welches das erste Gefäß 5 möglichst gleichmäßig umspü­ len soll. Von außen ragt eine Kühlleitung 10 aus vorzugsweise Kupfer in das zweite Gefäß 7, verläuft darin in einigen Windungen und mündet im ersten Gefäß 5. Das andere Ende der Kühlleitung 10 ist an eine Propangasflasche (nicht dargestellt) angeschlossen.

Als zweites Kühlmittel 6 wird vorteilhafterweise flüssiges Methylcyclo­ pentan 6 in das zweite, im gezeigten Ausführungsbeispiel nach oben offene Gefäß 7 gefüllt, das beispielsweise als Dewar-Gefäß ausgebildet ist. Auf die Oberfläche des Methylcyclopentans 6 wird nun flüssiger Stickstoff (-196°C) gegossen, so daß das Methylcyclopentan 6 bei sei­ nem Gefrierpunkt von ca. -142°C in den festen Aggregatzustand über­ geht. Der Stickstoff 8 und das Methylcyclopentan 6 vermischen sich hierbei nicht. Wird diese Verfestigung des Methylcyclopentans 6 fest­ gestellt, wird die Zufuhr von flüssigem Stickstoff 8 gestoppt und eine Weile gewartet, bis das Methylcyclopentan 6 im wesentlichen wieder flüssig geworden ist. Dann wird die Kühlleitung 10 wie in der Figur dar­ gestellt in das zweite Gefäß 7 gehängt. Alternativ hängt die Kühlleitung 10 auch schon während des Abkühlvorgangs des Methylcyclopentans 6 in dem zweiten Gefäß 7. Durch die Kühlleitung 10 wird nun Propangas 4 aus der Propangasflasche in das erste Gefäß 5 eingeleitet, welches insbesondere auf der spiralförmigen Passage der Kühlleitung 10 durch das Methylcyclopentan 6 auf ca. -140°C abgekühlt und auf diese Weise verflüssigt wird. Das flüssige, -140°C kalte Propan 4 wird am Ende der Kühlleitung 10 im ersten Gefäß 4 aufgefangen. Durch Eintauchen des Gefriergutbehälters 3 in das Propan 4 wird nun die Hornhautlamelle 1 im ersten Schritt auf eine Temperatur von ca. -140°C abgekühlt.

Zur weiteren Temperaturabsenkung bis ca. -180°C wurde der Behälter 3 samt Hornhautgewebe 1 in einen Kühlautomaten eingebracht und dort mit einer Kühlrate von -2°C/min abgekühlt. Zur Aushärtung des Glases wurde die Temperatur bei -150°C für 10 Minuten konstant ge­ halten. Für die stufenweise Temperaturabsenkung in diesem zweiten Schritt wird bevorzugt ein programmierbarer Einfrierautomat (z. B. Cryo­ son BV-10) eingesetzt. Anschließend kann das Gefriergut direkt in flüs­ sigen Stickstoff eingebracht und bei -196°C gelagert werden.

Claims (24)

1. Verfahren zur Vitrifikation von Hornhautgewebe, wobei das Hornhaut­ gewebe (1) in einem Behälter (3) mit einer Vitrifikationslösung (2) auf ei­ ne Temperatur abgekühlt wird, bei der das Hornhautgewebe (1) vitrifi­ ziert, dadurch gekennzeichnet, daß als zu virtrifizierendes Hornhautge­ webe (1) Gewebe von hinteren Hornhautlamellen (Teile des Stroma, die Descemet-Membran, das Endothel) verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verwen­ deten hinteren Hornhautlamellen (1) ca. 6% bis 20%, vorzugsweise ca. 11% bis 12%, des Volumens der gesamten Hornhaut ausmachen.

3. Verfahren zum Vitrifizieren von Hornhautgewebe, insbesondere nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Hornhautgewebe (1) in einem Behälter (3) mit einer Vitrifikationslösung (2) auf eine Tempe­ ratur abgekühlt wird, bei der das Hornhautgewebe (1) vitrifiziert, dadurch gekennzeichnet, daß als Behälter (3) ein solcher mit gegenüber dem Hornhautgewebe (1) im wesentlichen inertem Material auf der Behälte­ rinnenseite verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß ein Fluoropolymer, insbesondere Polytetrafluorethy­ len (Teflon®), als innenseitiges Material des Behälters (3) verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß als Behälter (3) ein solcher mit Polyimid, insbesonde­ re Kapton®, an seiner Außenseite verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Behälter (3) nach Einbringen des Hornhautgewe­ bes (1) verschweißt wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß ein durchsichtiger Behälter (3) verwendet wird.

8. Verfahren zur Vitrifikation von Hornhautgewebe, insbesondere nach ei­ nem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Hornhautgewebe (1) in einem Behälter (3) mit einer Vitrifikationslösung (2) auf eine Temperatur abgekühlt wird, bei der das Hornhautgewebe (1) vitrifiziert, dadurch ge­ kennzeichnet, daß weniger als 1 ml Vitrifikationslösung (2) in den Be­ hälter (3) gefüllt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß weniger als 0.2 ml Vitrifikationslösung (2) in den Behälter (3) gefüllt werden.

10. Verfahren zur Vitrifikation von Hornhautgewebe, insbesondere nach ei­ nem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Hornhautgewebe (1) in einem Behälter (3) mit einer Vitrifikationslösung (2) auf eine Temperatur abgekühlt wird, bei der das Hornhautgewebe (1) vitrifiziert, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Vitrifikationslösung (2) schockartig auf eine Tem­ peratur Ts geringfügig unterhalb der Glasübergangstemperatur Tg der Vitrifikationslösung (2) und dann weiter in kleineren Temperaturschritten auf eine tiefer liegende Endtemperatur Tt abgekühlt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß Ts im Be­ reich von ca. 2°C-30°C, insbesondere 10°C-20°C unterhalb von Tg liegt.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß ein erstes Kühlmedium (4) durch Wärmekontakt mit einem zweiten Kühlmedium (6) auf eine Temperatur unterhalb der Glas­ übergangstemperatur Tg der Vitrifikationslösung (2), vorzugsweise auf eine Temperatur im Bereich der Temperatur Is geringfügig unterhalb Tg, gebracht wird und daß der Behälter (3) in Wärmekontakt mit dem er­ sten Kühlmedium (4) gebracht wird.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß als erstes Kühlmedium (4) verflüssigtes Propan oder verflüssigtes Methylcyclopenthan verwendet wird.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß als zweites Kühlmedium (6) verflüssigtes Methylcy­ clopentan oder Stickstoff verwendet wird.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das zweite Kühlmedium (6) über Wärmeaustausch mit einem dritten Kühlmedium (8), insbesondere flüssigem Stickstoff, auf eine Temperatur unterhalb der Glasübergangstemperatur Tg der Vitrifi­ kationslösung (2) abgekühlt wird.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß als Vitrifikationslösung (2) eine Lösung mit den Sub­ stanzen Dimethylsulfoxid, 1,2-Propandiol, Formamid, Chrondroitinsulfat verwendet wird.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß zur Herstellung der Vitrifikationslösung (2) 2,3- Butandiol und/oder eine Verbindung aus der Gruppe der Polyvinylalko­ hole verwendet wird.

18. Vitrifizierungsvorrichtung zur Vitrifikation von Hornhautgewebe zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, mit einem derart ausgebildeten ersten Gefäß (5) zur Aufnahme ei­ nes ersten Kühlmediums (4), daß in dem ersten Kühlmedium (4) ein Be­ hälter (3) mit einer Vitrifikationslösung (2) und dem darin befindlichen Hornhautgewebe (1) auf eine Temperatur geringfügig unterhalb der Glasübergangstemperatur Tg der Vitrifikationslösung (2) abkühlbar ist, mit einem zweiten Gefäß (7) zur Aufnahme eines zweiten Kühlmediums (6) und mit einer Vorrichtung zur Wärmeübertragung (10) von dem zweiten Kühlmedium (6) auf das erste Kühlmedium (4).

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Gefäß und/oder das zweite Gefäß zur Aufnahme von verflüssigtem er­ stem und/oder zweitem Kühlmedium (4, 6) ausgebildet sind.

20. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Vorrichtungsansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zur Wärmeübertragung (10) eine Kühlleitung (10) zum Hindurchleiten des ersten Kühlmediums (4) umfaßt, die durch das zweite Gefäß (7) zum Wärmeaustausch mit dem zweiten Kühlmedium (6) geführt ist und in das erste Gefäß (5) mündet.

21. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Vorrichtungsansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Gefäß (5) und/oder die Kühllei­ tung (10) aus Kupfer bestehen.

22. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Vorrichtungsansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der mit dem zweiten Kühlmedium (6) in Berührungskontakt zu bringende Abschnitt der Kühlleitung (10) zumin­ dest teilweise spiralförmig ausgebildet ist.

23. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Vorrichtungsansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Gefäß (5) im zweiten Gefäß (7) angeordnet ist.

24. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Vorrichtungsansprüche, gekennzeichnet durch eine Wärmetauscheinrichtung zur Abkühlung des zweiten Kühlmediums (6) mittels eines dritten Kühlmediums (8), vor­ zugsweise flüssigem Stickstoff.