JPH05508991A - 細胞分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞分析装置 本出願は、］−９９９０６６４４日は出願の米国特許出願箱０７１５３２，５７ １号の部分継続出願である。

本発明はミクロフィジオメータ（ｓｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）の分野に 関し、特に１回使用の使い捨て装置および用具、並びにミクロフィジオメータと 組合せて使用する再使用可能な周辺部品に関するものである。

従来技術の説明 従来技術は底部にフィルタ膜を備えたカップを記載しており、この種のカップは 膜の内表面にて細胞を濾過すると共に分類すべく使用することができる（「細胞 免疫学における選択方法」、バーバラＢ、ＥッシヱルおよびスタンレーＭ、シイ ギー編、カリホルニア大学、バークレー、編集コンサルタント：クラウジア・ヘ ンリーおよびロバート■、ミソシェル、カリホルニア大学、バークレー、Ｗ、Ｈ ，フリーマン・アンド俸カンパニー出版、サンフランシスコ、コピーライト１９ ８０、第３７．４０．４３．６１．６２．６３および６４頁）。さらに、興味あ るものは米国特許第４，５９１，５５０号、第４゜７３７．４６４号、第４，７ ４１，６１９号、第４．７０４．３５３号および第４，５１９．８９０号に記載 されたミクロフローセル（■ｉｃｒｏｒｌｏｗ　ｃｅｌｌ）に使用するための珪 素電極である。これら米国特許を参考のためここに引用する。

さら（こ、フローシステム（ｆｌｏｗ　５ｙｓｔｅ■）を５己載した米国特許第 ４，１７２，７７０号（セメルスキー）および同様に７０−システムを記載した 日本国特許第１００２−０６０Ａ号も参照することができる。

さらに従来技術は、生細胞を培養するための市販入手しうる使い捨て容器の形態 をも示している。一般に生細胞はその環境の化学的および物理的性質（たとえば 内毒素微生物による或いはクリーニング溶液による潜在的な汚染問題を含む）に 対し極度に鋭敏であるため、慎重に制御された条件下で製造された培養容器を使 用し、次いで清浄かつ循環せずに投げ捨てることが好ましい。市販入手しうる使 い捨て容器は瓶、チューブおよび単一もしくは複数穴で覆われた皿などを含む多 くの形態としうるが、最も簡単に市販入手しうる従来技術の物品は全て上記に示 した最初の引例（特に引例の第６１．６２．６３および６４頁）に記載した設計 にて実質的に製造されたものである。この種の物品の製造業者はコスタ−・コー ポレーション社、ケンブリッジ、ＭＡ商品名ニドランスウェル）およびミリポア ・コーポレーション社、ベッドフォード、ＭＡ（商品８二ミリセル）を包含する 。この装置は、さらにＥＰＡ２３９，６９７号にも記載されている。

第１図は実施例１による装置の各部品の断面図であり、第１ａ図はミクロフロー チャンバ（ｓｉｃｒｏｒｌｏｖｃｈａｗｂｅｒ）の断面図であり、 第２図はバネ負荷メカニズムを示す装置の断面図であり、 第２ａ図は第２図の切断平面図であり、第２ｂ図は第２図の平面図であり、 第３図は一体的スペーサ手段を示す断面図であり、第３ａ図は一体的スペーサ手 段を示す断面図であり、第４図は細菌表示装置の略図であり、 第４ａ図は細胞を有する多孔質膜材料のカプセルであり、 第５図は３７３細胞に対するカルボニルシアナイドｍ−二トロフエルニルヒドラ ジン（ＣＣＣＰ）の作用ヲ示し、 第６図はＰ３８８Ｄ−１細胞に対するエタノールの作用を示し、 第７図は付着性および非付着性細胞の連続監視を示し、第８図は不連続コラーゲ ンマトリックスにおけるＰ３８８Ｄ−１細胞に関する酸性化速度と時間とのプロ ットであり、 第９図は酸性化速度と時間との半対数プロットであり、第１０図は外側スリーブ として作用する３−先端カップを示し、 第１１図は第１０図または第１図のカップに嵌合する細胞集中用挿入体を示し、 第１２図はフィブリノーゲンにおける集中実験のグラフを示し、 第１３図は切断コラーゲンにおける集中実験のグラフ本発明は、チャンバ壁部の 少なくとも１部が多孔質材料から作成された多孔質ミクロチャンバ（５ｉｃｒｏ ｃｈａＩｌｂｅｒ）に関し、そこに含有される流体および薬剤は流動する流れに 入れると多孔質ミクロチャンバに流入しうるが、細胞は流口しない。

１具体例において本発明は、ミクロフィジオメータに使用する前の選択した細胞 を含有するミクロチャンバの便利な集成体（またはクロージャ）を提供する。こ の具体例において、１端部が多孔質膜で覆われた硬質の内側および外側スリーブ はスペーサ手段と共に合体されて、内側スリーブが外側スリーブ内に充分挿入さ れた際に膜がスペーサ手段により分離されるようにする。かくしてスペーサ手段 と内側および外側膜とは、内部に生細胞を捕獲したミクロチャンバを形成する。

これらスリーブは、扁平なミクロチャンバの１壁部を形成する珪素電極に隣接し て細胞を含有するミクロチャンバを保持するのに適する。細胞は多孔質ミクロチ ャンバの内部キャビティに保持されると共に、液体は膜の上方、膜間、および膜 の下と細胞の周囲とを流過することができる（第１図参照）。液体の主たる流動 方向は膜の平面と珪素表面とに対し平行である。細胞を包囲する媒体の変化（た とえばｐＨ変化）は珪素電極により測定することができる。設計の目的は、（ａ ）測定感度を増大させるべく細胞容量／媒体容積の比を最大化させ、（ｂ）消費 した媒体を流出させかつまたは試薬を導入すべく流動液の交換速度を最適化させ 、（ｃ）たとえばプロトンのような測定可能な物質が拡散して珪素電極に到達せ ねばならない距離を最小化させることを含む。本発明の装置は、本出願と同一出 願人に係る米国特許出願第０７／４０８．８９６号（参考のためここに引用する ）に記載された種類のミクロフィジオメータに使用するための便利な使い捨て用 具を提供する。

本発明の他の具体例においては、たとえば細菌内生胞子のような成る種の細胞を 、互いに縁部で溶着または付着されてミクロフィジオメータのフローチャンバ中 に落下させうるような予備組立パッケージを形成する２枚の膜円盤の間に捕捉さ れる。この種の装置の使用は限定はしないが滅菌過程の確認を包含し、予備組立 ての内生胞子パッケージは滅菌すべき物品の充填物に含まれる生物学的インジケ ータ（Ｂｌ）として使用される。ミクロフィジオメータに使用する８１の他の改 善においては、供拾物および廃棄物の経路を内生胞子パッケージおよびフィルタ に堅固に付着して、汚染性微生物が供給経路から流入して廃棄経路から流出する のを防止する。かくして、多孔質ミクロチャンバを形成する多孔質材料に包封さ れた細胞はミクロフローチャンバ内に設置されて、有利に本発明により試験する ことができる。

発明の詳細な説明 本発明による幾つかの実施例を第１図を参照して説明する。最も簡単な具体例に おいて、外側スリーブ１は上側開口部２と多孔質膜４で覆われた下側開口部３と を備える。内側スリーブ１０は上側開口部１１と多孔質膜１３で覆われた下側開 口！１２とを備える。内側スリーブ１０は外側スリーブ１内に嵌合する。スペー サ手段２゜（この場合は開口部２１を規定する１片のプラスチックシート材）が 外側スリーブ中に嵌合する。スペーサ手段は約２５〜２００μ■、好ましくは約 ５０μ厘の厚さを有し、細胞を珪素電極から約１０〜３００μｍの範囲内に保持 する。ミクロフローチャンバの高さは約５０〜３００μｍである。これら寸法は 、約１〜約５分間にわたり約０．１〜０．５ｐＨ単位のｌ）Ｈ変化の検出を可能 にする。典型的な流速は毎分的１０〜２００μｍである。

かくして内側スリーブを外側スリーブ内に挿入すると、膜］３および４とスペー サ手段とは第１ａ図に示したように多孔質ミクロチャンバ２５を形成する。操作 に際しプランジャ３０は内側スリーブ中に挿入される。プランジャ３０は入口３ １と出口３２とを備え、プランジャを膜１３に対し緊密押圧すると、***部３３ によりシールが形成され、或いはプランジャにおける同位置にてのグランドにＯ リングを封入する。液体は入口３１から流入し、１１１３および４の上方、その 間またはその下に流動して出口３２から流出することができる。米国特許第４゜ ５１９．５５０号、第４．７３７，４６４号、第４，７４１．６１９号、第４， ７０４．３５３号および第４゜５１９．８９０号に記載された種類の珪素センサ は、膜４の外表面に隣接すると共にこれら平行であって、たとえばｐＨのような 細胞によって生ずる溶液の変化をセンサ４０により検出することができる。測定 の後、細胞を含んだ内側および外側スリーブは捨てることができる。

１具体例において、自然付着する細胞は膜４の内表面に置かれる。他の具体例に おいては、細胞をスペーサ手段の開口部２１における重合体マトリックス（たと えばコラーゲンスポンジ）上に設置する。重合体マトリックスにおける細胞は次 いで多孔質ミクロチャンバ２５中に組み込まれる。この具体例は、主として多孔 質膜に自然付着しない細胞につき使用される。第１図に示した具体例においてス ペーサ手段は別途挿入の円盤であるが、このスペーサ手段は内側および外側スリ ーブと一体的にすることもできる。第３の具体例においては、非付着性細胞の混 合物と細胞直径の典型的には１０〜１００００倍の直径を有するコラーゲンスポ ンジの粒子のような不連続マトリックスの調製物とを外側スリーブ中へ同時遠心 分離した後、内側スリーブを挿入してチャンバを形成する。

多孔質膜は生物適合性の多孔質ポリマー材料で作成される。好適材料は多孔質ポ リカーボネート膜である。この膜の孔寸法は、種々異なる細胞につき使用するよ う選択することができる。たとえば細菌については小孔寸法（０，４５μ謳もし くはそれ以下）が適しているのに対し、真咳性菌体については大きい孔寸法（一 般に３〜１２μ−の範囲）が選択される。

内側および外側スリーブは各種の形状を有することができ、たとえば円形、楕円 形、正方形または矩形とすることができる。好適形状は流動パターンの考慮から 楕円形である。内側スリーブは外側スリーブ中へ極めて緩く嵌合することもでき るが、好ましくは内側スリーブと外側スリーブとは、たとえば突出部もしくは隆 起部の形態の参照符号１４のような離間部材を内側スリーブの外径上に或いは外 側スリーブの内径上に有して、一方のスリーブを他方のスリーブに対し正確に位 置決めするが、これらスリーブの間で流体を押圧させうるようにすべきである。

これらスリーブは一般にたとえばポリスチレンのような硬質ポリマー材料で作成 される。外側スリーブと内側スリーブとは組合せてミクロチャンバおよび特に外 側スリーブにおける膜の外表面を検出電極と緊密接触させるような構造にするの か重要である。さらに、プランジャはプランジャ***部３３もしくはＯ−リング およびスペーサ手段と一緒になってシールを形成することにより、ミクロフロー チャンバ２６を画成する漏れのない分室を与え、溶液が人口３１および出口３２ によりミクロフローチャンバ２６に対し流入および流出しうるようにすることが 重要である。かくして、珪素電極表面４０はミクロフローチャンバ２６の１壁部 を形成すると共に、プランジャ３４の底部表面はミクロフローチャンバ２６の上 表面を形成し、その内部には細胞を含有する多孔質ミクロチャンバが着脱自在に 設置される。ミクロフローチャンバ２６は１０ｎｌ〜１０μｍの寸法を有する。

チャンバからの流出物の分析が望ましくかつ細胞が重合体マトリックスにより捕 捉される成る種の用途については大きい容積も好適であるが、細胞の大容積／フ ローチャンバ容積は充分なｐＨ変化割合を測定するよう充分高く保つことができ る。プランジャは硬質ポリマー材料で作成されかつバネ負荷されて、膜の外縁部 に対するシールを確保する。内側および外側スリーブとスペーサとは、細胞捕捉 用重合体マトリックと共に成るいはそれなしに、使い捨て物品にすることか意図 される。

第２図は、プランジャをミクロフローチャンバを形成すると共に封止するような 位置にプランジャを維持するバネ負荷メカニズムを示している。フローチャンバ ケーシング５０は外側スリーブ１を収容する。内側スリーブ１０は外側スリーブ １内に嵌合すると共にプランジャ３０は内側スリーブ１０内に充分緩く嵌合して 、これらを位置決めした際に空気がこれら部材間から容易に流出するようにする 。チューブ３１および３２はミクロフローチャンバ２６に対しプランジャを介し て溶液を供給および流出する。バネ５１はプランジャの頂部５２およびプランジ ャ保持装置５３に取り付けられる。プランジャ保持手段５３は、プランジャをポ スト５５との係合により下方位置に保持するための開口部５４を有する。その平 面図を第２ａ図に示す。第２ｂ図は底部プレート５０とシリコン電極４０とを示 す。穴部６１はフローチャンバケーシング５０に対しプレート６０を固定する。

第１０図は、スリーブ部分９２を支持する先端部９１を備えた有利な外側スリー ブ９０を示している。膜４がスリーブ９２の底部に示されている。第１０ａ図は この装置の平面図であり、第１０ｂ図はそのＡＡ断面図である。第１０ｃ図は、 電極に当接する膜４の外表面を示す底面図である。プランジャ保持器５３を反時 計方向に回転させるとプランジャ保持器が解除されて、プランジャを除去するこ とができる。

さらに細胞は、外側膜の中心に集中させるのが有利である。これは第１１図の集 中用挿入体８０を外側スリーブ１中に設置して底面８１が膜４上に載ると共に細 胞８３を開口部８２内に位置させて膜４の部材のみがそこにこれら細胞を膜上に 遠心分離し、挿入体８０を外側スリーブから除去する。これは細胞を膜の小さい 領域に集中させるよう作用する。第１２図および第１３図は、細胞が膜４の１／ １０の面積に集中した際、どのように細胞個数の１１５〜１／１０て匹敵する結 果を与えうるかを示している。典型的には細胞を５〜１５■２、好ましくは約１ ０１　の面積に集中させ、約５　ｇ＋＋２の面積である珪素検知装置の応答円彩 領域に集中させる。この集中用挿入体８０は、第１図のスリーブ１または第１０ 図のスリーブ９２に設置することができる。

第３図および第３ａ図は他の種類の一体的スペーサ手段を示している。第３図に おいて、一体成形されたスペーサ１６は、膜１３の前に底部開口内側スリーブ１ ０上に載置される。第３ａ図において、スペーサ１７はスリーブ１の底部開口部 に一体成形されると共に、膜４を部材】７の外側に位置させめかっ膜１３をスペ ーサの内側にてスリーブ１０に位置せしめる。細胞を外側スリーブ１の１１１４ の内表面に位置せしめ、スペース２０を外側スリーブに挿入する。内側スリーブ １６を挿入してスペーサ２０に対し押圧させる。プランジャ３０を内側スリーブ 中に圧入（−で、スペーサと膜との間にシールを形成するト共にミクロブローチ ャンバ２６を画成する。膜４は珪素電極４０上に載り、流体が細胞に対しポンプ 輸送される。各種の細胞に影響を与える薬剤を流体に含有させると共に、細胞に 対するこれら薬剤の作用を珪素電極４０によって測定する。ミクロフローチャン バの小さい容積は極めて鋭敏な応答測定値を与える。

第４図は、生物学的インジケータとして使用する目的の多孔質ミクロチャンバの 詳細を示している。第４図において、胞子６１は上側６０および下側７０の多孔 質膜の間に捕捉され、供給経路もしくは入口６２には経路内フィルタ６３を設け ると共に、廃棄経路もしくは出口６４には経路内フィルタ６５を設ける。フィル タは細菌がミクロチャンバ６６中に流入するのを防止し、たとえば典型的には０ ．２〜０．４５μ■の孔寸法を有するニトロセルロースもしくはポリカーボネー トのメツシュ材料のような材料から作成される。この具体例において、液体は供 給経路６２を流過すると共にミクロチャンバ６６を介し廃棄経路から流出するこ とができる。

内生胞子は典型的にはバチルス属、たとえばバチルス・ズブチリス（Ｂａ＋ｊｌ ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｌＬｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣＮｏ、　９３７２サブスペシース ・ニが−である。第４ａ図は、細胞７６を含有する多孔質材料７５のカプセルを 示している。

この多孔質カプセルはミクロフローチャンバに嵌合する。

以下、実施例により本発明をさらに説明する。

しばしば、固定（ａｎｃｈｏｒａｇｅ　）−依存性細胞と称する付着性細胞は一 般に、安定な代謝速度および個数増加を維持するために、生物適合性表面に付着 されねばならない。付着性細胞ラインは毒物学、薬理学および環境学の用途を含 め広範な種類の研究に用いられている。付着性細胞かミクロフィジオメータにつ き設計された使い捨て細胞分析装置に使用し・）るかどうかを検討するため、次 の試験を行なった。外側スリーブ１を１２穴の組織培養ブｌノー　１・内に設］ １〜．５？６胎児牛血清を含有するズルベノコ改変イーグル培地（ＤＭＥ）を容 量の５０％まで穴に添加１−５だ。これらスリーブにマウス繊維芽３７３−細胞 （付着性細胞ライン）を接種すると共に、全プレートを３７℃にて５９６　ＣＯ ２内で２日間もしくはそれ以上にわたり培養（−だ。この時間中に細胞はスリー ブの底部まで沈降し、て多孔質膜に付着し、この後、これらを約７０？６の集合 まで増殖させた。この時点で各外側スリーブをプレートから外（７、スペーサ手 段２０と内側スリーブ］０とを生細胞の層の頂部に置い／：。次いて、この全集 成体をフローチャンバケーシング５０の内側に入れた。

組立てに際し、気泡がフローチャンバに導入されないよう防止することか重要で あった。これは次の手段よって行なわれる。（１）少量の媒体を珪素電極４０の 頂部に存在させて、スリーブ１を頂部に載置した際に空気か２つの表面間に捕捉 されないようにせねばならず：　（２）少量の媒体を細胞の層の頂部に存在させ ると共にスペーサ手段をｌｌｌＩ４の頂部に存在させねばならず、かつ内側スリ ーブ１０を外側スリーブ１中に挿入する前に膜１３を乾燥状聾にせねばならず、 膜の間または底部膜４の下に気泡か捕捉されないよう肉眼的に確保すべく注意せ ねばならず、（３）入口経路３１に媒体を充填すると共に媒体の小滴をプランジ ャ表面３４の下に落した後にプランジャ集成体を内側スリーブ中に導入せねばな らない。他の部品は明細書に説明しかつ第１図および第２図に示したように組立 て、全体をミクロフイジオメータの内部に設置すると共に３７℃に維持した。重 炭酸塩を含まないＤＭＥ　（約２ｍＭの緩衝能力を有する）を次いでチャンバ内 に？１１流させると共に、酸性化速度をパース等［サイエンス、第２４６巻、第 ２４３頁（１９８９）コに記載されたように定期的に測定した。示した期間に際 し、ＤＭＥには代謝性分離剤カルボニルシアニドｍ−二トロフェニルヒドラジン （ＣＣＣＰ；５ａモル、μＭ）を補充した。媒体酸性化の速度が増大すると共に 細胞が露出され、次いでｃｃｃｐ−含有の還流培地を初期の培地で置換した後に 再び初期の酸性化速度まで復帰した（第５図参照）。

非付着性細胞（固定−独立性細胞としても知られる）は一般に隣接表面に固定さ れない。しかしながら、これら種類の細胞の代謝を毒物学、薬理学、環境学など の目的で監視するにはミクロフィジオメータを使用するのが望ましい。非付着性 細胞を実施例１に記載した２枚の膜間に捕捉する初期の実験においては再現性の ある酸性化が観察されず、その後の試験が示したところではこれら細胞は流体の 容積にわたるその運動により中心検出器から多孔質ミクロチャンバの側部まで掃 引された。流体移動に基づくこの非付着性細胞の損失を防＋ｈするには、細胞移 動の制限が必要であると思われた。

多数の生物適合性スブンジ状材料が、止血剤として使用すべく市販されている。

これら材料は、限定はしないが、コラーゲン、ポリビニルアルコールおよびポリ ウレタンを包含する。外科的外傷に用いる場合、これら物質は新たな組織の付着 を促進する。これら物質の迷路ネットワークおよび判明した生物適合性は細胞固 定化マトリックスとして作用させることを可能にし、したがって成る種のこれら 物質をミクロフィジオメータ内に非付着性細胞を固定化する能力につき試験した 。これを行なうため、スペーサ手段２０を孔径５μｍのポリカーボネート膜を有 する外側スリーブ１内に入れた。スペーサ手段の中央穴部には、重合体マトリッ クスよりなる直径６１１ＩＩの円盤（厚さ約１５０μｇ＋）を入れた。外側スリ ーブ１と重合体マトリックスとを１２穴ミクロタイター板の穴に入れた。哺乳動 物細胞を用いる実験については、スペーサ手段２０を重合体マトリックスの添加 前に外側スリーブ内に挿入した。Ｐ３８８Ｄ−１細胞（非付着性の哺乳動物細胞 ；約１０７細胞／１１）またはサツカロミセス・セレビシイ（非付着性の酵母細 胞；約１０７細胞／ａ＋Ｉ）のいずれかを含有する１−１の懸濁液を外側スリー ブ中にピペットで採取した。次いで、このミクロプレートを４００ｘｇにて５分 間遠心分離し、次いで内側スリーブ１０を外側スリーブ内に入れ、かくして第２ の膜を重合体マトリックス内に捕捉された細胞の上方に位置せしめた。

内側および外側スリーブとスペーサ手段（存在させる場合）と重合体マトリック スと細胞とをフローチャンバケーシング５０に挿入し、細胞の酸性化速度を実施 例］、に記載したように測定した。哺乳動物細胞ラインにつき、実験の継続期間 にわたり安定な代謝速度が達成された。

酵母実験については、ミクロフィジオメータにより測定した酸性化の速度は時間 共に増大し、実験の継続期間にわたりミクロフローチャンバ内の細胞個数の増加 を示した。これら両実験は、細胞が適切に固定化されると共にその代謝が固定化 過程またはミクロフィジオメータの環境により悪影響を受けないことを示唆する 。

Ｐ３８８Ｄ−１細胞を重合体マトリックス中に遠心分離すると共に、その代謝を 実施例２に記載【１、たようにミクロフィジオメータで監視した。細胞環境の酸 性化速度が安定化する時間にわたりミクロフィジオメータの環境に調節した後、 ５％胎児牛血清を含有するＤＭＥの代りに５％胎児牛血清と１０％エタノールと を含有するＤＭＥを５分間にわたり用いた。この潜在的に有害な組成物に露出し た後、エタノールを含まない媒体をミクロソイジオメータ中に再導入し、これを 用いてエタノール含有媒体を除去した。Ｐ３８８Ｄ−１細胞の代謝を媒体交換の 際に連続監視した。第６図に見られるように、この濃度のエタノールは細胞の代 謝を抑制すると共に、その作用は潅流媒体からエタノールを除去することにより 逆転せず、これは不可逆性の被害がミクロフィジオメータに固定された細胞に対 し加えられたことを示唆する。

非付着性（Ｐ３８８Ｄ−１）および付着性（ＮＲＫ）細胞を２個の使い捨て細胞 分析装置のそれぞれに実施例］８および２に記載したように入れると共に、ミク ロフィジオメータにおける２個の細胞室のそれぞれに入れた。

２種の集団の各酸性化速度を１２時間にわたり測定すると共に、５％胎児牛血清 を含有するＤＭＥを細胞室に潅流させた。第７図はこれら細胞集団の酸性化速度 のプロットを示し、その両者は実験の期間にわたり安定な速度を示し、た。非付 着性細胞集団はミクロフィジオメータの環境に対する調整期間（約２．５時間） を必要とし、その期間に際Ｉ、この集団の酸性化速度は急速に上昇した。

これに続き酸性化速度における長時間のそれ程顕著でない上昇が続き、この状部 は残余の実験にわたり生した。

実権例５：不連続マトリックスにおける非付着性細胞の固定化および代謝の連続 監視 付着性細胞の周囲に形成すると共に細胞を固定化する重合体マトリックスは、予 備注型重合体マトリックスの円盤を作成しかつ位置決めする必要性を排除する。

この概念を試験するため、実施例２に記載した手順を次の改変と共に行なった。

予備注型重合体マトリックスをスペーサ手段２０中に挿入しなかった。コラーゲ ン止血スポンジ（コラスタット、ビタフォア・コーポレーション社、シカゴ、イ リノイ州）を燐酸塩緩衝塩水溶液（ｐＨ７゜２）に懸濁させると共に、３秒間の ６回のサイクルにつきブレンダー内で微細に切断した。０．５１容積のこの懸濁 物は殆ど直径０．２〜１．０ｓｍの範囲における種々の寸法を有しかつ懸濁物の 約０．５％（Ｖ／Ｖ）を占めるコラーゲンマトリックスの粒子で構成され、これ を０゜５ｍｌのＰ３８８Ｄ−１細胞懸濁物（約１０７細胞／１）と混合した。細 胞／重合体懸濁物を４００Ｘｇにて５分間にわたりスペーサ手段２０を有する外 側スリーブ１中に遠心分離した。内側スリーブ１０を施し、この集成体をフロー チャンバケーシング５０に挿入した。環境を酸性化する速度により示される細胞 の代謝を実施例］に記載したように監視した。ミクロフィジオメータの環境に順 化する期間の後、安定な酸性化速度を実験の期間にわたり測定した（第８図）。

これら結果が示すところでは、この実験に用いた不連続マトリックスは非付着性 細胞を固定したが、細胞代謝は明かにこの手順により悪影響を受けなかった。こ の種の不連続マトリックス調製物はしたがって実施例３に記載したような細胞影 響剤の作用を決定するのに適している。

細菌集団によるミクロフローチャンバ環境の酸性化速度を測定するため、実施例 １に記載した実験および使い捨て部材の設計に対し多数の改変を行なった。ペト ロフ・ハウザー直接計数チャンバにて計数したバチルス・ズブチリスの内生胞子 の懸濁物を、スペーサ手段２０を備えた外側スリーブ１中に遠心分離した。ミク ロフローチャンバを完全に組立てた際に約２５０の内生胞子がこのミクロフロー チャンバ内に存在するような密度まで懸濁物を希釈した。重合体マトリックスは 存在させず、下側膜４は０．４μ■の孔寸法を有し、内生胞子１３の上方の膜は ０，２２μ■の孔寸法を有した。５％胎児牛血清を有するＤＭＥの代りに複合細 菌栄養培地を用いると共に、細胞を３７℃にてミクロフィジオメータで培養した 。

この実施例は、本発明が生物学的インジケータとして使用する際に滅菌過程の確 認の分野で有用性を有するという証拠を与える。実験を開始してから約４時間の 後まで認めうる代謝割合が観察されず、その後に酸性化の急上昇が見られた。こ れら割合の半対数プロットから、ミクロフィジオメータにおけるＢ・ズブチリス の倍増時間を決定することができた（第９図）。

実施例７：　「細胞集中」装置を用いるミクロフィジオメ標準細胞充填法を用い て細胞カプセル中に細胞を充填する際、〜Ｉ　Ｘ　１０６細胞（ＴＦ−１、骨髄 細胞）を用いて〜１００μＶ／秒の酸性化速度を得ねばならない（培地緩衝剤１ ｍＭ）。細胞充填に際し膜面積全体（１１３雪■２）に付着するため多数の細胞 が必要とされる。

実際の測定面積はずっと小さく、すなわち−５１１２である。

酸性化速度測定の最適精度を得るのに必要である同等速度を得るのに要する細胞 個数を減少させるべく、プラスチック挿入体である「細胞集中器」を設計して充 填過程に際し細胞を細胞カプセル膜の真中の小領域に指向させる。これは円筒の ような形状を有して細胞が集中器の底部における円形領域に均一分配されると共 に、頂部は漏斗のような形状を有して多量の細胞を所要の細胞充填数に達するよ う必要に応じ使用することができる（第１１図）。集中器の頂部における外縁部 には***部が存在し、細胞カプセルの上縁部に載置されて細胞充填に際し装置を 支持し、さらに細胞カプセル中に下方向に延びる集中器のバレルは底部膜と接触 してこれに押圧するのに適する長さを有する。細胞は１１．４■■２の円形領域 に付着する。

１２−穴タイター板におけるスペーサを備えた細胞カプセルに０．７１の充填培 地を満たし、細胞集中器をカプセル穴に中心に整列するよう入れた。１００，０ ００〜２００．０００個の細胞を含有する０、１〜０．　２ｍｌの細胞懸濁液を 細胞集中器に入れた。次いて集成体を２１の充填培地を含有する穴に入れた。次 いでプレートを５００Ｘｇにて室温で５分間にわたり遠心分離した。細胞集中器 を慎重にビンセットでカプセルから除去し、細胞には５０μｍのフィブリノーゲ ン／スワンビン混合試薬を載せた。フィブリノーゲン／スロンビン試薬は、その 使用直前に等容積の精製フィブリノーゲン（１０Ｂ／■１のヒト血清アルブミン と１％Ｄ−グルコースとを含有するＲＰＭＩ　１．６４０培地に溶解されたμｍ 、１ｇ／ｌ）溶液を精製スロンビン溶液（〜０．８ＮＩＨ単位／■１、ＲＰＭＩ 　１６４０に溶解）と混合して作成した。全試薬は内生毒素を含まない。フィブ リンゲルが硬化した後（５分間）、膜挿入体を捕捉された細胞上に載せた。次い てカプセルをミクロフィジオメータに組立てた。

細胞集中器を用いて細胞を充填すると、細胞は集中器を除去した後に再混合され ないよう充分に膜に付着する。

円形パターンで細胞の上に位置するフィブリンゲルは細胞を所定位置に緊密に保 持し、毎分１００μｍの流速を用いて顕微鏡下で観察した際に細胞移動は生じな い。この方法は、底部膜を標準的手順にしたがい切断コラーゲンのカーペットで 予ｍ被覆することにより、切断コラーゲンを用いても好適に行なわれた。第１２ 図は、標準フィブリンゲル捕捉法（Ｉ　Ｘ　１０Ｂ細胞）および１１５細胞数（ ２ｘ１０５細胞）を含む細胞集中器を用いたＧＭ−ｃｓｆによるＴＦ−１細胞の 刺戟を示している。同等な結果が得られると共に、細胞集中器は３４％高い速度 を与えた。第１３図は、切断コラーゲンを用いて行なった同じ実験を示している 。この場合も同等な結果が観察され、細胞集中器の速度は標準法と同じであった 。

細胞集中器を用い、細胞の個数の１１５〜１／１０（１００，０００〜２００， ０００個の細胞）によって標準法と同等な結果を得ることが可能である。これは 、主細胞培養におけるように細胞が増殖困難である場合に極めて重要である。ア ルギン酸カルシウムゲルが、細胞を固定するのに適している。

要約書 本発明は、細胞を含有すると共に細胞をチャンバ内に保持しながらチャンバに対 し液体を流入および流出させる多孔質ミクロチャンバに関する。これら多孔質ミ クロチャンバは、細胞をミクロフローチャンバ内に設置して多孔質ミクロチャン バ内の細胞の性質を測定しうるようにした使い捨て装置として役立つ。

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．ミクロフィジオメータの約１０ｎｌ〜約１０μｌの容積を有するミクロフロ ーチャンバに細胞を着脱自在に設置する装置において、細胞を含有すると共に液 体がミクロチャンバに対し流入および流出する際に細胞をミクロチャンバ内に保 持する多孔質ミクロチャンバを備え、この多孔質ミクロチャンバは厚さ約２５〜 ２００μｍのスペーサ手段により分離された内側および外側の多孔質膜からなる ことを特徴とする装置。
2. ２．ミクロフィジオメータの約１０ナノリッタ〜約１０μｌの容積を有するミク ロフローチャンバに細胞を着脱自在に設置する装置において、細胞を含有すると 共に液体がミクロチャンバに対し流入および流出する際に細胞をミクロチャンバ 内に保持する多孔質ミクロチャンバを備え、この多孔質ミクロチャンバは多孔質 膜材料のカプセルからなることを特徴とする装置。
3. ３．多孔質ミクロチャンバに直接取付けられた入口および出口流路を備えること により、液体を入口流路を介し多孔質ミクロチャンバ中へ流入させて多孔質ミク ロチャンバ内の細胞と接触させ、さらに出口流路を介し多孔質ミクロチャンバか ら流出させる請求の範囲第２項に記載の装置。
4. ４．組合せにおいて、ミクロフローチャンバ内に（ａ）液体をミクロフローチャ ンバに対し流入および流出させる手段と、 （ｂ）ミクロフローチャンバ内の液体の性質変化を検出する手段と を備える請求の範囲第１項、第２項または第３項に記載の多孔質ミクロチャンバ 。
5. ５．ミクロフローチャンバの高さが約５０〜３００μｍである請求の範囲第４項 に記載の組合せ。
6. ６．細胞を多孔質ミクロチャンバにより珪素電極から約１０〜約３００μｍに保 持する請求の範囲第４項に記載の組合せ。
7. ７．約１０ｎｌ〜１０μｌの容積を有するミクロフィジオメータのミクロフロー チャンバに細胞を着脱自在に設置する装置において： （ａ）頂部開口部と底部開口部とを備え、底部開口部が多孔質膜で覆われた外側 スリーブと、（ｂ）外側スリーブ内に嵌合すると共に頂部開口部と底部開口部と を備え、底部開口部が多孔質膜で覆われた内側スリーブと、 （ｃ）内側スリーブと外側スリーブとの各多孔質膜間にあって約２５〜２００μ ｍの厚さを有し、開口部を画成すると共に内側スリーブが外側スリーブ内に位置 して両多孔質膜がスペーサ手段と接触する際に多孔質膜と一緒に多孔質ミクロチ ャンバを形成し、かつ液体が多孔質膜を流過する際に細胞を多孔質ミクロチャン バ内に維持するスペーサ手段と を備えることを特徴とする装置。
8. ８．スペーサ手段が、外側スリーブの内壁部に嵌合すると共に開口部を形成しか つ約２５〜２００μｍの厚さを有する薄いプラスチック材料の連続ストリップで ある請求の範囲第７項に記載の装置。
9. ９．スペーサ手段が外側もしくは内側スリーブと一体的である請求の範囲第７項 に記載の装置。
10. １０．ミクロフローチャンバの高さが約５０〜約３００μｍである請求の範囲第 ８項または第９項に記載の装置。
11. １１．細胞を多孔質ミクロチャンバにより珪素電極から約１０〜約３００μｍに 保持する請求の範囲第７項に記載の装置。
12. １２．細胞を外側スリーブにおける膜の１部に集中させる請求の範囲第７項に記 載の装置。
13. １３．スペーサ手段により画成される開口部が、細胞を捕捉する重合体メッシュ で覆われた請求の範囲第７項に記載の装置。
14. １４．重合体メッシュがコラーゲンスポンジである請求の範囲第１３項に記載の 装置。
15. １５．非付着性細胞がフィブリンゲルに固定される請求の範囲第７項に記載の装 置。
16. １６．試験すべき細胞を重合体マトリックス粒子と相互混合すると共に、内側ス リーブの挿入前に外側スリーブの多孔質膜にて同時遠心分離する請求の範囲第１ ４項に記載の装置。
17. １７．重合体マトリックス粒子がコラーゲンスポンジの粒子である請求の範囲第 １６項に記載の装置。
18. １８．請求の範囲第７項に記載の装置との組合せにおいて、頂部および底部表面 を有するプランジャを備え、液体の流れをプランジャ中に指向させる開口部を有 すると共に内側スリーブ中に嵌合し、さらにプランジャの底部表面は内側スリー ブの多孔質膜と接触し；さらに外側スリーブにおける多孔質膜の外表面と接触す る珪素電極を備え、プランジャを押圧した際に多孔質膜とスペーサ手段とプラン ジャと珪素電極との間にシールを形成してミクロフローチャンバを形成し、ここ で液体はプランジャにおける開口部を介し約１０ｎｌ〜約１０μｌの容積を有す るミクロフローチャンバに対し流入および流出する装置。
19. １９．内側および外側スリーブが離間部材により分離された請求の範囲第７項に 記載の装置。