JPH05508226A - アミリン・アゴニストおよびアンタゴニストに関するレセプター・ベース・スクリーニング法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アミリン・アゴニストおよびアンタゴニストに関するレセプター・ベース・スク リーニング法 発明の分野 本発明は、生理学的に活性な物質の天然または単離もしくはクローンしたレセプ ター部位と相互作用する能力を評価することによる化学化合物のような生理学的 に活性な物質の同定方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、候補化合物の、 アミリンのレセプターを含有するある生物学的調製物に結合する能力を評価する ことを含む、アミリン、およびインスリンの作用を調節するのに有用な関連ペプ チドホルモン類のアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法に関する。

関連技術の開示 インスリンに対する耐性は２型真性糖尿病、肥満症および高血圧症を含む、いく つかの重篤な疾患に存在し得る。インスリンに対する耐性は非耐性状態で得たも のと比較してインスリンの投与量の効果性の低下によって証明される。かくして 、２型真性糖尿病に罹患しているインスリン耐性患者において、内因性インスリ ンおよびこのような患者が罹患している慢性高血糖症を制御するために外因的に 投与されたインスリンの両方の能力は真剣に解明される。その結果、早期アテロ ーム性動脈硬化症、毛細管内糸球体硬化症、網膜症、神経障害および腎不全のよ うな非制御の真性糖尿病から生じる合併症は、インスリン感受性糖尿病患者にお けるよりもインスリン耐性糖尿病患者において生じるらしい。臨床学的用語では 、一般循環において正常以上の濃度のインスリンにもかかわらず正常以上のグル コース濃度が維持される場合にインスリン耐性が存在する。本質的には、インス リン耐性は基本（ｂａｓａｌ）またはインスリン刺激性糖源形成のいずれかまた は両方の正常以下のレベルへの低下によって代謝前駆体からのグリコーゲン合成 の抑制を示す。

２型真性糖尿病には高血糖症の原因が少なくとも２つある：（１）活性化される べきグルコース貯蔵の欠損［リリオジャ、ニス（Ｌｉｌｌｉｏｊａ、　Ｓ、）、 ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタポリズム（ Ｊ　、　Ｃｆｉｎ、　Ｅ　ｎｄｏｃｒ。

Ｍｅｔａｂ、　）、６２　：　９２２−９２７（１９８６）］：および（２）膵 臓からのインスリン放出の欠損［ウニインゴット、エイ（Ｗａｉｎｇｏｔ、　Ａ 、　）ら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ ンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｐ　ｒｏｃ。

Ｎａｔ’　Ｉ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）、７９　：　４４３２−４ ４３６（１９８２）コ。この疾患の治療は、これらの欠損のいずれかまたは両方 を逆転する試みに集中した。

最近、膵臓から単離した新規な蛋白ホルモンはインスリンの作用のい（つかを調 節することが判明した。アミリン（最初に糖尿病関連ペプチドまたはＤＡＰと称 された）と称される該ホルモンは、最近、ヒト２型真性糖尿病患者由来の膵臓ア ミロイドからホモジニティーに精製された。例えば、クーパー、ジー・ジエイ・ ニス（Ｃｏｏｐｅｒ、　Ｇ、　Ｊ　、　Ｓ、　）ら、プロシーディンゲス・オブ ・ナショナル・アヵデミイ・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ、８４　： 　８６２８−８６３２（１９８７）。アミリンは、１９８７年４月２７日に出願 された連合王国特許出願第８７０９８７１号、ならびに１９８８年４月２７日、 １９８８年１１月２３日および１９８９年５月２日に出願された対応するＵ、Ｓ 、出願の課題である。真性糖尿病の治療のためのアミリンの使用は、ジー・ジエ イ・ニス・クーパーらによって１９８７年８月２６日に出願された連合王国特許 出願第８７２０１１５号および１９８８年８月２６日にアメリカ合衆国に出願さ れたものの課題である。

天然アミリンは、２位および７位のＣｙｓ残基間のジスルフィド橋およびＣ−末 端チロジンのアミド基によって特徴付けられる３７アミノ酸蛋白である。アミリ ン・サブペプチド１８−２７はアミロイド形成性である、すなわち、アミロイド を形成する傾向を有する。アミリンの構造は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド −１（ＣＧＲＰ−１）に対する相同性４３％、Ｃ０ＲＰ−２に対する相同性４６ ％およびインスリンに対する多少の類似性を示す。アミリンは、Ｃ０ＲＰ、イン スリン、インスリン様成長因子およびレラキシンを含み、かつ共通の遺伝的遺伝 物を共有する関連ペプチドの群の一負であり得る。クーパー、ジー・ジエイ・ニ スら、Ｐｒｏｇ、Ｇｒｏｖｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１　：　 ９９−１０５（１９８９）。アマラ。

ニス・ジー（Ａｍａｒａ、　Ｓ　、　Ｇ、　）ら、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃ ｅ）、２２９　：　１０９４−１０９７（１９８５）　：ローゼンフェルド、エ ム・ジー（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、　Ｍ、　Ｇ、　）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒ ｅ）、３０４　：　１２９−１３５（１９８３）を参照。２つのペプチド類、カ ルシトニンおよびＣＧＲＰ−１は、第一次ｍＲＮＡ転写体のオールタネイトプロ セッシングが２種類の異なったペプチドの発生を誘導する場合にカルシトニン遺 伝子において共通のベアレンテージ（ｐａｒｅｎｔａｇｅ）を共有し、それは制 限された連続相同性（約３０％）だけを共有する。アマラ、ニス・ジーら、サイ エンス、２２９　：　１０９４−１０９７（１９８５）。

クーパー、ジー・ジェイ・ニスらによって１９８８年１１月２３日に出願された 同一所有の継続中のＵ、Ｓ、特許出願第２７５．４７５号には、アミリンが骨格 筋において標識グルコースのグリコーゲンへの基本およびインスリン刺激性取込 みの低下の原因となるという、本明細書中に引用記載されている内容が開示され ている。後者の効果がＣ０ＲＰによって共有されることも開示されている。リー トン、ビー（Ｌｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｂ、　）およびクーパー、ジー・ジェイ・ニ ス、ネイチャー、３３＋　：　６３２−６３５（１９８８）も参照。アミリンお よびＣＧＲＰは、はぼ等能であり、１〜１０ｎＭで顕著な活性を示す。アミリン はグルコースの骨格筋へのインスリン刺激性摂取を低下させ、グリコーゲン含量 を低下させることも報告されている。ヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら、アメリカン・ジ ャーナル・オブ・フイジオロジ−（Ａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、２ ５９：４５７−４６１（１９９０）。アミリンは、さらに、ある環境で、骨格筋 からの乳緩塩放出を増加させると言われている。リートン、ビーおよびフート、 イー（Ｆｏｏｔｅ、Ｅ、）、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、 　Ｊ　、　）、２６９　：　１９−２３（１９９０）。

ペプチドホルモンのアミリン群が血漿膜に存在するレセプターを介して作用する と思われる。本発明者らは、アミリンが、グリコーゲン損傷に関する速度制限酵 素、ホスホリラーゼａを活性化することによって、糖源分解を促進するレセブタ ー媒介メカニズムを介して骨格筋において作用することを示した［ヤング、エイ （Ｙｏｕｎｇ、　Ａ、　）ら、１９９１、エフ・イー・ビー・ニス・レター（Ｆ ＥＢＳＬ　ｅｔｔｅｒ）、印刷中］。

イン・ビポで報告されたアミリンの主な代謝作用は以下のとおりである。（１） 「オイグリセミッククランプＪ　（ｅｕｇｌｙｃｅｍｉｃ　ｃｌａｓｐ）条件下 で観察されたインスリン作用の低下、これによって、アミリンの注入がインスリ ン媒介グルコース・クリアランスを低下させ［モリナ（Ｍｏｌｉｎａ）ら、ディ アビーティス（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）、３９　：　２６０−２６５（１９９０）お よびヤングら、アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー、２５９　：　 ４５７−４６１（１９９０）］、肝グルコース排出のインスリン媒介性抑制を部 分的に逆転する［モリナら、上記文献：クープマンズ、ジェイ・ジェイ（Ｋｏｏ ｐｍａｎｓ、　Ｊ　、　Ｊ　、　）ら、ディアビーティス、３９　：　ｌ０ＩＡ （１９９０）３；（２）軽く麻酔した、１８時時間量したラットにおいて、アミ リンのポーラス注射は、まず血漿乳酸塩の増加を生じ、次に、血漿グルコースの 持続性増加を生じる。血漿乳酸塩の増加は、糖原分解のアミリン刺激によって生 じる、骨格筋における乳酸塩生産を反映すると思われる。このアミリンの作用は 、飼料を与えたラットおよび１８時時間量したラットにおいて、インスリンおよ びグルカゴンを含む膵臓ホルモンの分泌を制限するために投与したソマトスタチ ン注入の間でも観察された。これらのデータは、アミリンが無傷の動物において 骨格筋からの乳酸塩放出を促進するための他のホルモン調節薬と独立して作用す るという決定を証明する。

血漿グルコースの増加は注入された追跡グルコースの希釈に関連し、高い肝グル コース排出量を示す。肝グルコース排出量を増加させるための「オイグリセミッ ククランプ」したラットにおけるアミリン注入およびアミリン注射の作用がアミ リンの肝臓への直接作用の結果であるかまたは乳酸塩の筋肉からの放出のような アミリン作用の間接的な効果であるかは現在知られていない。すなわち、アミリ ンが培養ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝臓腫瘍から誘導した細胞株）中で糖質新生およ び糖原分解を増加させることが報告された。シアラルディ（Ｃ１ａｒａｌｄｉ） ら、ディアビーティス、３９：５ｕｐｐ。１．１４５Ａ（１９９０）。他方、ア ミリンが単離したラット肝細胞または潅流したラット肝臓におけるグルツース代 謝への観察可能な作用を有しないことが報告された［ステイーブンズ（Ｓ　ｔｅ ｐｈｅｎｓ）ら、ディアビーティス、印刷中、１９９１コ。

アミリンが血管拡張を含むイン・ビボでのいくつかの他の作用を及ぼすことがで きることも報告されている。プレイン・ニス・ディー（Ｂｒａｉｎ　Ｓ、Ｄ、） 、アメリカン−ジャーナル・オブ・バソロジ−（Ａｔ　Ｊ　、　Ｐａ’ｔｈｏ１ ．　）、１３６：４８７−４９０（１９９０）。アミリンは欠陥拡張薬としての 効果が関連ペプチドＣＧＲＰの１００〜１０００倍も低かった。これは、アミリ ンのＣ０ＲＰレセプターへの弱い作用を反映しているが、これを支持する証拠は 全くなかった。アミリンは、また、ウサギおよびラットにおいて血漿カルシウム を低下させることが報告されている［ダツク・エイチ・ケイ（Ｄａｔｔａ　Ｈ， Ｋ、　）ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニ ケーションズ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、　）、１６２　：　８７６−８８１（１９８９）］。この作用は カルシトニンのものに似ている。ヒトのカルシトニンは低カルシウム血症を引用 するにおいてアミリンよりも有効であり、立証されていないが、アミリンは骨細 胞上のカルシトニン・レセプターでカルシトニンはどあまり有効には作用しない かもしれない。

Ｃ０ＲＰおよびカルシトニンは、少なくともい（つかがアデニル酸シクラーゼを 活性化させ、細胞内第二メツセンジャーとして環状ＡＭＰを発生させる膜レセプ ターを介して作用すると思われる。これに関して、肝臓膜上のＣ０ＲＰに関する 高親和性結合部位（レセプター）が報告された：これらの部位でＣＧＲＰはアデ ニル酸シクラーゼを有効に活性化すると言われている。例えば、モリシタ（Ｍｏ ｒｉｓｈｉｔａ）ら、ディアビーティス、３９　：　８７５−８７７（１９９０ ）。アミリンはＣ０ＲＰ（約９ｐＭ）よりも非常に低い親和性（約３００ｎＭ） を有するが、これらの結合部位から標識Ｃ０ＲＰを置換することが報告された。

い（つかの同様の発見がチャントリイ（Ｃｈａｎｔｒｙ）ら［バイオケミカル・ ジャーナル（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ　、　）、印刷中、１９９１］によって報 告されている。これらの著者は、各々、約１００〜３００ｐＭおよび１０ｎＭの 肝臓膜上のＣ０ＲＰおよびアミリンに関する明確な親和性を報告している。チャ ントリイらは、肝臓が非常に少量のＣ０ＲＰを含有すること、およびアミリンが 肝臓に直接供給する門脈から分泌されることを指摘している。彼らは、肝代謝に おけるこれらのペプチド類のグルコース調節薬の役割が主としてアミリンによっ て媒介され得ることを提案している。しかし、チャントリイらは肝臓膜に結合す るアミリンを測定することができなかった。スティーブンズら（上記文献）は、 肝臓細胞膜の調製物に結合するＣ０ＲＰおよびアミリンを測定することができた 。しかし、分離した実質および間質肝臓細胞の研究から、彼らは主な結合が間質 細胞に対してであり、実質細胞への結合の欠乏が肝細胞代謝へのアミリン作用の 欠乏と一致したと断言した。かくして、肝臓上の機能的関連アミリン・レセプタ ー類の性質および均一な存在の疑問は混乱させられ、未解決である。実際には、 アミリン・レセプターおよびレセプター類の存在を疑問視する者もあるが、他の 者はこのようなレセプターがいつか同定されるであろうと理解している［バンク ス、ビー（Ｂａｎｋｓ、　Ｐ、）、ジャーナル・オブ・エフ・アイ・エイチ・リ サーチ（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎ　Ｉ　ＨＲｅ５ｅａｒｃｈ）、２＋３４− ３５（１９９０）：ディアビーティス・フォーカスト（Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｆｏ ｒｅｃａｓｔ）、１９９１年３月、２７〜３１〕。

今までに、骨格筋におけるアミリン・レセプター類を探索する研究の唯一の報告 がある。チャントリイ（Ｃｈａｎｔｒｙ）らは、ＣＧＲＰおよびアミリンが粗製 膜調製物に結合する＋２５Ｉ−ＣＧＲＰを競い、ＣＧＲＰが３００ｐＭのＩＣ５ ｏを有し、アミリンが１０ｎＭのＩＣ５ｏを有することを報告している。彼らは 、これらのデータが骨格筋上の両ペプチド類の作用の媒介に関する共通の系を示 すものであることを示唆する。しかし、これは、明らかに、骨格筋の機能的な研 究においてアミリンがＣＧＲＰよりも若干有効、報告された結合研究において判 明した場合の３０倍以上であるという事実と矛盾する。

次に、数人の研究者がアミリンの代謝作用を媒介できるレセプター類を要求およ び／または探求したが、同定されたものはなかったということが明らかであろう 。入手可能な結合データおよびプレイン（Ｂ　ｒａｉｎ）らによって報告された 心臓血管応答から、肝臓膜において報告された高親和性レセプターがＣＧＲＰの 有効な血管拡張薬効果を媒介するものであり、アミリンがこのレセプターを介す るその非常に弱い血管拡張薬応答を及ぼし得ることだけが推測できた。このレセ プターは適当にＣ０ＲＰレセプターと称され、チャントリイらによって研究され た骨格筋膜におけるレセプターのタイプである。

カルシトニンおよびＣＧ　Ｒ，Ｐに関する結合部位は中枢神経系に広く分布され ている。しかし、この２つのペプチド類は、異なる生化学的特異性を有するそれ ら自体の異なった高親和性レセプター類で作用し、互生レセプター部位ではあま り相互作用シナイ。セクストン、ビー−エム（Ｓ　ｅｘｔｏｎ、　Ｐ、　Ｍ、　 ）ら、（１９８８）、上記文献。例えば、ヒト大脳皮質［チョップ、エフ・エイ （Ｔｓｃｈｏｐｐ、　Ｆ、　Ａ、　）ら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナ ル・アカデミイ・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）、８２　：　２４８−２５２（１９８ ５）］およびラット大脳皮質［セクストン、ピー・エムら、ニューロサイエンス （Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１９　：１２３５−１２４５（１９８６）］の 両方において、カルシトニンがＣＧＲＰ結合部位に関する競争においてラットま たはヒトＣＧＲＰよりも５００〜１０００倍低い効力であったことが報告された 。同様に、ＣＧＲＰは脳の膜および腎臓の膜［ボルツマン（Ｇ　ｏｌ　ｔｚｍａ ｎ）およびミッチェル（Ｍｉｔｅｈｅｌｌ）、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ） 、２２７　：１３４３−１３４５（１９８５）］ならびに全腎臓切片［セクスト ン、ピー・エムら、キドニイ・インターナショナル（Ｋ　１ｄｎｅｙＩ　ｎｔ、 　）、３２　：　８６２−８６８（１９８７）］においてカルシトニン部位に関 スル競争において５００〜１０００倍低い効力であった。ラット脳の領域におけ る不規則なＣＧＲＰ結合部位に関するいくつかのデータが報告された。デニス、 ティ（Ｄｅｎｎｉｓ、　Ｔ、　）ら、Ｓｏｃ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ａｂｓ、 、１６　：　５１４、アブストラクト（Ａ　ｂｓｔｒａｃｔ）、２２０．７（１ ９９０）；セクストン、ビー・エムら、ニューロケミストリー・インターナショ ナル（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｔ　Ｉ　ｎｔ、　）、１２　：　３２３−３３５（１９ ８８）。２つの別の生化学的に異なったペプチド類、サーモン・カルシトニンお よびＣＧＲＰαに関する高親和性を有する高密度の結合部位は、後側圧積（ｐｏ ｓｔｅｒｉｏｒ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ａｃｃｕｍｂｅｎｓ）（倒産（ａｃｃｕｍｂ ｅｎｓ）の被殻に結合した小さい内側帯（ｍｅｄｉａｌ　ｂａｎｄ）を除く）お よび後尾側尾状核被殻（ｐｏｓｔｅｒｉｏｃａｕｄａｌ　ｃａｕｄａｔｅｐｕｔ ａｍｅｎ）および後線条底（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ　ｆｕｎｄｕｓ　５ｔｒｉａｔ ｉ）を有するその尾側連続（ｃａｕｄａｌ　ｃｏｎｔｉｎｕａｔｉｏｎ）を含む 腹側線条（ｖｅｎｔｒａｌ　ｓｔｒｉａｔｕｍ）、ならびに分界条の外側原核（ ｌａｔｅｒａｌ　ｂｅｄ　ｎｕｃｌｅｕｓ）の外側縁（ｌａｔｅｒａｌ　ｂｏｒ ｄｅｒ）および扁桃の内側核の部分におけるオートラジオグラフ法の使用によっ て同定されたと報告された。

セラストン。ピー・エムら（１９８８Ｘ上記文献）。脳幹神経節関連核の外側で 、締板の脈管器官（ｏｒｇａｎｕＵａｖａｓｃｕｌｏｓｕｍ）、背面緯線（ｄｏ ｒｓａｌ　ｒａｐｈｅ）の翼および最後野は、カルシトニン感受性Ｃ０ＲＰ結合 がセフストンらによって同定された場合に唯一の報告された領域であった。

最近、アミリン・アゴニスト活性は、無傷ラットのヒラメ筋におけるインスリン 刺激性グリコーゲン合成の抑制を測定することによって評価される。リートンら 、（１９８８Ｘ上記文献）。定量的生物学的アッセイとして有効であるが、この 技術は、比較的遅く、労働集約的であり、試験されるペプチド類への細胞蛋白分 解酵素の作用に対して感度が高い。ヒラメ筋アッセイは、アゴニスト類の相対的 な効力を定量化するのに有効であるが、そのレセプターに関するリガンドの親和 性は全組織または器官においてアゴニスト投与応答関係から正確には決定できな い。すなわち、種々の分子サイズもしくは溶解度または組織成分への結合性向は 、所定の効力に影響を及ぼすことができる。ヒラメ筋アッセイは、さらにまた、 アミリン・レセプター類で活性な化合物についての有効な、高い流量の最初のス クリーニング・アッセイよりもわずかな価値しか有しないかまたは全く価値を有 しない。安価で迅速でかつ生理学的理論に基づいている、臨床用途に有効なアミ リンおよび関連ペプチドホルモン・アゴニスト類およびアンタゴニスト類のスク リーニング方法は非常に望ましい。このような方法を見いだしたので、以下に説 明する。

本発明は、治療学的な有用性について有効なアミリン・アゴニスト類およびアン タゴニスト類を同定、スクリーニングおよび特徴付けするための迅速で、安価で 、かつ生理学的な方法であって、アミリンに関する膜レセプター類を有する細胞 または細胞含有組織から調製もしくは単離された膜における特異的レセプター結 合部位に結合することについて、このような候補分子の、ある標識ペプチドホル モン類および断片ならびにその類似物を含む追跡濃度のある標識ペプチド類に対 して競争する能力を評価することからなる方法からなる。アミリン・レセプター 類はマグネシウムを含まない低塩条件下で約２０〜約５０ｐＭのＢｏｌｔｏｎ− Ｈｕｎｔｅｒ　’　”　Ｉ−標識ラット・アミリンに関する結合親和性または他 のリガンド類によるこのアミリン標識の置換によって同定され得る。

１つの態様において、本発明は、１種類以上の試験化合物を含む試験試料および アミリンを結合できるアミリン・レセプターを含むアミリン・レセプター調製物 を一緒にしニアミリンをレセプター蛋白に結合させる条件下で該試験試料および 該レセプター調製物をインキュベートし、該レセプター蛋白に検出可能に結合す る１以上の試験化合物を含有するこれらの試験試料を同定することからなる、ア ミリンのアゴニスト類またはアンタゴニスト類に関する同定またはスクリーニン グにおいて使用するアッセイ方法を提供する。別の具体例では、この方法は、さ らに、アミリン・レセプター媒介性活性のイン・ビトロまたはイン・ビボ刺激ま たは抑制について該レセプター蛋白に検出可能に結合する試験試料をスクリーニ ングし、アミリンのアゴニスト類またはアンタゴニスト類として作用するこれら の試験試料を同定する工程からなる。好ましい具体例では、アミリン・レセプタ ー蛋白に検出可能に結合する試験試料は、試験試料によるレセプター蛋白調製物 からの標識第一リガントの置換を測定し、測定した試験試料によるレセプター調 製物からの第一標識リガントの置換と、測定した１種類以上の既知の第二リガン ドによるレセプター調製物からの標識第一リガントの置換とを比較することによ って同定される。標識した第一リガントおよび第二リガンドとしては、アミリン 、アミリン・アゴニストまたはアミリン・アンタゴニストが挙げられる。有用な レセプター調製物類としては、アミリン・レセプターを担持する単離された細胞 、アミリン・レセプターを担持する単離された膜調製物および単離されたアミリ ン・レセプター蛋白が挙げられる。単離された膜をレセプター調製物として使用 する場合、特に好ましくは、基底前脳領域由来の膜である。１種類を超える試験 化合物を含み、有効な結果を生じる上記の方法のいずれかで使用される試験試料 を、次いで、分割し、必要に応じて、適宜、多数回再試験して、有効な結果を生 じさせる試験試料中の化合物または化合物類を同定することができる。

別の態様では、本発明は、既知または候補のアミリン・アゴニストまたはアンタ ゴニスト化合物について決定しようとする１種類以上のレセプター結合特性を評 価するためのアッセイ方法であって、アミリン・レセプター調製物への結合につ いて該化合物の標識リガンドに対して競争する能力を評価または測定するか：Ｃ ＧＲＰレセプター調製物への結合について該化合物の標識リガンドに対して競争 する能力を評価または測定するか、カルシトニン・レセプターへの結合について 該化合物の標識リガンドに対して競争する能力を評価または測定するか、Ｃ０Ｒ Ｐレセプター調製物およびカルシトニン・レセプター調製物への結合について該 化合物の標識リガンドに対して競争する能力を評価または測定し：該化合物につ いて決定しようとするレセプター結合特性を決定する工程を含むアッセイ方法を 提供する。決定され得るレセプター結合特性としては結合親和性および結合特異 性が挙げられる。ＣＧＲＰレセプター調製物としては、−次細胞培養物または樹 立細胞株を含む肝細胞調製物が挙げられる。カルシトニン・レセプター調製物と してはＣルセプターを担持する細胞または膜調製物が挙げられる。

さらに別の態様では、本発明は、アッセイされるべき試験試料におけるアミリン ・レセプター結合化合物の存在または量を決定するためのアッセイ方法であって 、試験試料中に存在するアミリン・レセプター結合化合物の存在または量を決定 するために、試験試料およびアミリン・レセプター調製物を一緒にし；アミリン ・レセプター調製物への結合について該化合物の標識リガンドに対して競争する 能力を測定し：所望により、試験試料中のアミリン・レセプター結合化合物の量 を、いずれのアミリン・レセプター結合化合物も含まないことが知られている負 の対照試料について測定したアミリン・レセプター結合化合物の量と比較し、お よび／または、試験試料中のアミリン・レセプター結合化合物の量を、ある既知 量のアミリン・レセプター結合化合物を含む正の対照試料について測定したアミ リン・レセプター結合化合物の量と比較する工程を含むアッセイ方法を提供する 。このアッセイ方法は、さらに別の具体例では、アミリン調製物の安定性を評価 するため、アミリン調製物の効力を評価するため、およびアミリン調製物の溶解 度特性を評価するために利用され得る。

別の態様では、本発明のレセプター調製物は技術公知の方法を利用して、ポリク ローナル抗血清およびモノクローナル抗体を含む抗アミリン・レセプター抗体を 調製するために利用され得る。

別の態様では、本発明は、アミリン・レセプター類を担持するものを同定するた めに、細胞株、組織から区別された（ｄｅｓｅｇｒｅｇａｔｅｄ）細胞、および ヒトまたは動物血液由来の細胞をスクリーンするために使用される。本発明のア ミリン・レセプター調製物は固相に結合されてもよく、種々の親和性クロマトグ ラフィー法で使用され、例えば、アミリンの精製あるいはあるアミリン、アミリ ン・アゴニスト類またはアミリン・アンタゴニスト類に対する既知のまたは疑わ しい試料の評価に使用され得る。

かくして、本発明の目的は、本発明のスクリーニング法に適しているレセプター 調製物を同定することである。

本発明のもう１つの目的は、有効なアミリンのアゴニスト類およびアンタゴニス ト類に適用する場合の本発明のスゲリーニング方法の詳細を提供することである 。

本発明のさらにもう１つの目的は、候補のアゴニスト類およびアンタゴニスト類 の相対的な効力および特異性を評価するための方法を教示することである。

本発明のさらにもう１つの目的は、アミリン・レセプター調製物を使用する、ア ミリン・レセプターに結合するアミリンおよび他の分子の存在または量を決定す るための方法を提供することである。

これらおよび他の目的は、本明細書および請求の範囲への引用で容易に明らかに なるであろう。

図面の説明 第１図は、”’Ｉ−ｈ　ＣＧＲＰのラット肝臓膜への飽和結合のスキャッチャー ド・プロットを示す。ｌ！５）−ｈα−ＣＧＲＰ濃度は１．３から１５０ＭＭま で変化させた。非特異的結合は１０−’Ｍｈ　α−ＣＯＲＰの存在下で測定され た。

Ｋ（１＝１９．１ｐＭ、Ｂｍａｘ＝４９．４Ｉｍｏｌ／ｍｅ蛋白。

第２図は、トレーサーとしで”Ｉ−ｈ　ＣＧＲＰを使用して、ヒトＣ０ＲＰ（開 放正方形）、ヒトＣ０ＲＰ（断片８−３７Ｘ開放三角形）、およびラット・アミ リン（開放円形）のラット肝臓膜への結合に関する競争結合曲線を示す。

第３図は、絶食し麻酔したラットへのアミリン（実線）またはｈ　ＣＧＲＰ（破 線）の投与（０〜１，０００Ｍｇｉ、ｖ、）によって生じた血漿グルコースの増 加を示す。

第４図は、ラット小脳（Ａ）およびラット基底前脳（Ｂ）から誘導した膜におけ る”５Ｉ−ＣＯＲＰ結合部位に関するｈα−ＣＯＲＰ（開放円形）およびｒアミ リン（開放正方形）の競争に関する競争曲線を示す。

第５図は、＋４５１−ｒアミリンのラット基底前脳膜への飽和結合のスキャッチ ャード・プロントを示す。２．５富ｑ組織から調製した膜へのラット・アミリン の増加濃度の結合を測定した。非特異的結合は、１１００ｎサーモン・カルシト ニンの存在下で測定した。Ｋｄ＝２７．１±２．１ｐＭ、Ｂｍａｘ＝Ｑ、９８± ０．０９６■ｍｏｌ／ｍｇ（ｎ　＝　３　）。

第６図は、＋２５（、アミリンのラット脳領域への結合を示す。１２５■−ｒア ミリンの特異的結合は１７ｐＭの濃度で測定した。非特異的結合は２５ｎＭｒ　 アミリンの存在下で測定した。

発明の詳細な記載 本発明は、ペプチドホルモン・アミリンの生理学的作用を有する有効なアゴニス ト類およびアンタゴニスト類をスクリーニング、同定および特徴付けするための 新規な安価で迅速かつ生理学的な方法であうで、特異的なアミリン・レセプター 部位への結合について、候補のアゴニスト類およびアンタゴニスト類の、関連ペ プチド類に対して競争する相対的な能力を評価することからなる方法を提供する ものである。これらおよび他の目的のために使用されるレセプター部位は、単離 したレセプター担持組織、該レセプター担持組織から調製した細胞、該細胞から 誘導された膜調製物および組換えＤＮＡ法を使用するクローン化レセプター調製 物を含む単離したレセプター蛋白調製物として存在し得る。

一般に、「レセプター」または「特異的なレセプター」なる語は、いくつかのリ ガンドを認識して選択的に結合することができ、リガンド結合の後、生理学的応 答を導（事象の連鎖を開始するいくつかの物理的または化学的シグナルを発生さ せることができるマクロ分子を表すことが認識されている。ブレチャー、エム（ Ｂ　１ｅｃｈｅｒ、　Ｍ、　）ら、「レセプターおよびヒト疾患Ｊ　（’Ｒｅｃ ｅｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　ＨｕＩＩｌａｎＤｉｓｅａｓｅ’）、ウィリアムス・ア ンド・ウィルキンズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ）、バルチモア、 １９８１、第１章。か（して、本発明の重要な部分は、本発明の競争ベース・ス クリーニング法で使用される組織、細胞、膜またはレセプター調製物が天然レセ プターの結合特性を示すことである。

アミリンの生理学的作用の標識組織から誘導された組織調製物または細胞調製物 を、アミリン・アンタゴニスト類およびアゴニスト類のスクリーニング方法で使 用するために同定したが、本発明の方法よりも劣る。予想外に、本発明者らは、 アミリン・レセプターを担持する細胞または膜あるいはアミリン・レセプター蛋 白調製物が脳の領域から単離されるのが好ましいことを見いだした。ブレチャー 。

エム（Ｂ　１ｅｃｈｅｒ、　Ｍ、　）編、「レセプター研究の方法Ｊ　（”Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＲｅｃｅｐｔｏｒＲｅｓｅａｒｃｈ”）、バリュー１および ２、マーセル・デツカ−（Ｍｅｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク、１９ ７６　；ボウルトン、エイ・エイ（Ｂｏｕｌｔｏｎ、　Ａ、　Ａ、　）ら編、「 レセプター結合に関する神経法」（“Ｎｅｕｒｏｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｒｅ ｃｅｐｔｏｒ　Ｂｉｎｄｉｎｇ”）、ヒューマナ・プレス、クリフトン、ニュー シャーシー、１９８６゜倒産核および周辺領域由来の膜からなる基底前脳膜は、 いくつかの理由のために好ましい。第一に、以下に詳述すると、アミリンに関す る高親和性結合部位が基底前脳において、および他の脳領域において高密度で存 在する。標識アミリンの該膜への特異的結合は、該部位の特異性および豊富さを 示す、全結合の少なくとも７０％について明らかにした。第二に、以下に示すと 、これらの膜への結合について試験した３つのペプチドの相対的効力（ラット・ アミリン＞ＣＧＲＰ＞ＣＧ　ＲＰ　１３７）は、それらのヒラメ筋グリコーゲン 代謝を変える際の相対的な効力と類似しており、肝臓およびＬ６ミオサイト膜に おけるレセプターへの標識ＣＧＲＰ結合を抑制する際の相対的な効力とは全く異 なる。本発明者らは、ラット基底前脳において測定した高親和性レセプターが従 来の方法によって容易には検出されないレベルでヒラメ筋に存在し、アミリン・ アゴニストおよびアンタゴニスト薬開発に重大な好ましい目標であると決定した 。

ＣＧＲＰまたはカルシトニンのいずれかの脳への注入によって生じる効果として は、アンフェタミン誘発ロコモーター活性の低下［デ・ポーレペア、アール（ｄ ｅ　Ｂｅａｕｒｅｐａｉｒｅ、　Ｒ，）ら、ファーマコロジー・バイオケミスト リー・アンド・ビヘイビ＋　−（Ｐ　ｈａｒｍ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、’　Ｂ　 ｅｈａｖ、　）、２７　：　１７７（１９８７）；低下した食物摂取〔クーパー 、ジー・ダブリュ（Ｃｏｏｐｅｒ、　Ｃ、Ｗ、　）ら、Ｐ　ｓｙｃｈｏｐｈａｒ ｍ、　Ｂ　ｕｌｌ、、２０・４５１（１９８４）］；放出された成長ホルモンの 減少［タン不ンバウム、ジー・ニス（Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ、　Ｇ、　Ｃ，）ら 、エンドクリノロジー（Ｅ　ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　）、１１６：２６８５（１ ９８５）コ、胃酸分泌の抑制［レンズ、エイチ・ジエイ（Ｌｅｎｚ、　Ｈ，Ｊ、 ）ら、ガストｏエンテロｏジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、　）、８８　： 　５３９（１９８５）コニおよび成長ホルモン分泌の抑制［ファヒム、エイ（Ｆ ａｈｉｍ、　Ａ、　）ら、ニューロエンドクリノロジー（Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃ ｒｉｎｏｌ、　）、５１　：　６８８（１９９０）コが挙げられる。

アッセイおよびスクリーニングのために適しているアミリン・レセプターを含有 する膜調製物は、以下のとおり同定され得る　（１）”’Ｉ　Ｂｏｌｔｏｎ　Ｈ ｕｎｔｅｒラット・アミリン結合は、本明細書で詳述された条件下で、特にマグ ネシウムの欠損、および５０１Ｍまでの塩濃度、約１５ｐＭ〜約６０ｐＭのＫｄ を有する。（２）他のリガンドによる約１０〜１５ｐＭｌｆｔ識アミリンの置換 は、ラット・アミリン約２０〜４０ｐＭ：ウナギ・カルシトニン約２０〜５０ｐ Ｍ＋サーモン・カルシトニン約２５〜６０ｐＭ；ラットβ−ＣＧＲＰ約５０ｐＭ 〜１１００ｐ；ヒトβ−ＣＧＲＰ約１１００ｐ〜２００ｐＭ；ヒトα−ＣＧＲＰ 約１３０ｐＭ〜２３０ｐＭ；ラットα−ＣＧＲＰ約２５０ｐＭ〜５５０ｐＭ；” −３７ヒトＣ０ＲＰ約１ｎＭ〜５ｎＭ；ヒト・カルシトニン約２〜１０μＭのＩ Ｃ，。値を有する。最も典型的には、アミリン・レセプターの存在を立証するた めに、あるリガンドだけ、すなわち、ラット・アミリンまたはサーモン・カルシ トニンのうちの１つおよびヒト−α−ＣＧＲＰまたはヒトβ−ＣＧＲＰおよび８ −３７ヒトα−ＣＯＲＰのうちの１つを選択するのが好ましい。

一般に、組織膜はほぼ中性の緩衝化ｐＨで水浴温度で組織の簡単な（４〜１０秒 ）拘置化によって調製される。１つの具体例では、ポリトロン（Ｐ　ｏｌｙｔｒ ｏｎ）　［ブリンクマン・インストゥルメンツ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒ ｕｍｅｎｔｓ）、ニューヨーク］のような装置を使用するが、別の同様のホモジ ナイザーを使用してもよい。組織分断の後、少なくとも約２０．０００ｘｇのｇ 力で適当な時間、好ましくは４０．０００×ｇ以上のｇ力で少なくとも１０分間 、冷所で膜を単離する。内因性妨害物置を除去するために、膜を新しい緩衝液中 での再均質化によって少な（とも２回慣習に従って洗浄する。洗浄した膜を、フ ッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）またはバシトラシンのような蛋白分 解酵素抑制薬を含有する緩衝液に再懸濁する。

使用した特定のスクリーニング法具体例に適しているレベルに最終組織濃度を調 節するのに充分な量の緩衝液を添加してよい。

スクリーニング法のためのインキュベーション混合物を以下のとおり準備する。

ガラスまたはポリマー管にバシトラシンまたはＰＭＳＦのようなプロテアーゼ抑 制薬、プロテアーゼ−フリー血清アルブミン（好ましくは、分画ＶＢＳＡ、プロ テアーゼ−フリー）および所望によりＭｇ２“塩を含有するＨＥＰＥＳの如き緩 衝溶液カラする少量のバー／７７”ミクスチ＋　−（Ｂ　ｕｆｆｅｒ　Ｍｉｘｔ ｕｒｅＸｒ　ＨＢ　Ｂ　ＭＪ）を添加する。このバッファー・ミクスチャーに、 約ＩＱ−１１〜１０−’Ｍの濃度でアゴニストまたはアンタゴニスト活性につい て試験されるべき非標識分子を含有する少量の緩衝液を添加する。対照管は緩衝 液だけを含有する。二の混合物に、約１０〜約１６ｐＭの最終濃度を製造するよ うに、緩衝液中標識アミリンまたはＣ０ＲＰまたはカルシトニンを多量に添加す る。得ることができる高い比活性および化学的標識化の容易さのために、該ペプ チドホルモンを標識するのには＋２５ｉが好ましい。該ペプチドホルモンはヒト 組織から単離されるか［例えば、「ｈｃＧＲＰＪまたは「ｈアミリン」（ここで 、ｒｈＪはヒトを意味する）］、動物組織から単離されるか（例えば、サーモン ・カルシトニン、すなわち、Ｓカルシトニン、またはラット・アミリン、すなわ ち、ｒアミリン）、あるいは化学合成または組換え手段によって製造され得る。

イリノイ州アーリントン・ハイツのアマ−ジャム・コーホレイン３ン（Ａｍｅｒ ｓｈａｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から＋２５Ｉ−ｈ　ＣＧＲＰ　（’°Ｈｉ ｓで標識）および１２５ｉ−ｒ　アミリン（Ｎ−末端リシンで標識されたポルト ン−ハンター（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ））を購入し、アリコート化し、使 用まで冷凍保存してよい。

非標識ペプチド類は、バチエム・インコーホレイテッド（Ｂ　Ａ　ＣＨＥ　ＭＩ 　ｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄＸカリフォルニア州トーランス）およびベニンンユラ ・ラボラトリーズ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＸカリフォ ルニア州ベルモント）から入手することができる。それらをプロテアーゼ−フリ ー分画Ｖ　ＢＳＡを含有する滅菌水に溶解し、アリコート化し、使用まで冷凍保 存する。

反応は、各インキュベーション管に膜を添加することによって開始する。管当た りに必要な組織の量（または、より好都合には、膜蛋白の量）は、各組織タイプ のレセプター密度によって指示されるであろう。典型的には、約２．５ｙｓｇの 組織由来の膜（膜蛋白約１００μ９）を添加する。

時間内に定常状態条件に達するのに充分な時間および温度で反応混合物をインキ ュベートする。ここで使用する場合の「定常状態」なる語は結合したホルモンの 正味量に影響を与える全ての反応および工程の総合を含むことを意図する。それ は「平衡状態」と同義であっても、同義でなくてもよい。典型的には、室温で約 ６０分間、管をインキュベートする。

１　次いで、膜を単離して標識および非標識リガンド間での競争の後、結合した 標識リガンドの量を決定する。非特異的結合（ＮＳＢ）を減少させるために、試 薬で予備浸漬したガラス繊維フィルター［例えば、ＧＦ／Ｂ、ワットマン（Ｗｈ ａｔｍａｎ）］を介して真空動力ブランゾル・セルＨハーベスタ−（Ｂｒａｎｄ ｅｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）［ブランデル・インストゥルメンツ（Ｂ 　ｒａｎｄｅｌ　Ｉ　ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、メリーランド州ゲイザースバー グ、モデルＭ−２４１で濾過して膜を収集するのが好都合である。

約０．３％ポリエチレンイミン中、約５時間、フィルターを予備浸漬するのが好 ましい。当業者は、本発明を実施する際に使用できるミリポア・フィルトレイジ ョン・アセンブリー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓｅｍ ｂｌｙ）（モデル１２２５）またはサンドベック・フィルター・ボックス（Ｓａ ｎｄｂｅｃｋ　ｆｉｌｔｅｒ　ｂｏｘＸベネット、ジェイ・ビー（Ｂｅｎｎｅｔ ｔ、　Ｊ、　Ｐ、）、神経伝達物質レセプター結合（Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉ ｔｔｅｒＲｅｃｅｐｔｏｒ　Ｂｉｎｄｉｎｇ）、エイチ・アイ・ヤマムラ（Ｈ， Ｉ　、　Ｙａ＋ａａｍｕｒａ）ら、レイブン１、　ニューヨーク、１９７８、第 ５７〜９０頁）、収集フィルター、およびＮ５Ｂ−還元剤のような他の血漿膜収 集装置を知っているであろう。濾過の直前および直後に、フィルターを多量（ミ リリットル）の水冷緩衝液で洗浄して、汚染物質、例えば、未結合標識ペプチド ホルモンを除去する。フィルターを除去し、血漿膜に結合した標識ペプチドホル モンの量を定量化する。１２５１が標識である場合、放射能をガンマ線カウンタ ーで評価し得る。ケミルミネッセンス・レポーター分子（例えば、ＡＭＰＰＤ、 トロビックス、インコーポレイテッド（Ｔｒｏｐｉｘ、　Ｉ　ｎｃ、　）、マサ チューセラ州ベッドフォード）を使用する場合、得られた光をルミノメータ−で 定量化し得る。酵素標識も使用され得る。

濾過による代わりに、遠心によって（例えば、２１．　ＯＯＯｒｐ園でベックマ ン（Ｂｅｃｋａ＋ａｎ）　Ｊ　−２−２１−Ｍ冷蔵遠心機またはベックマン１２ もしくはエツペンドルフ・マイクロフユージ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｍｉｃｒｏ ｆｕｇｅ））インキュベーションの後に血漿膜を単離し、水冷緩衝液で洗浄し、 次いで、その才ままたは洗浄剤もしくはアルカリで膜を可溶化した後に計数して よい。

結合／遊離（Ｂ／Ｆ）標識ペプチドホルモンを結合量の関数としてプロットする 場合、結合データのスキャッチャード・プロット飽和分析を標準的な方法で行う 。

例えば、ブレチ＋−（Ｂｌｅｃｈｅｒ）　１９７６、ブレチ＋−１９８１、第１ 章およびボウルトン（Ｂｏｕｌｔｏｎ）ら、１９８６、第１章を参照。

結合量（Ｂ）をリガンドの濃度の対数関数としてプロットする競争曲線（第２図 〜第５図を参照）はコンピューター、例えば、４〜バラメ一ターロジステイツク 方程式に対する非線形回帰による分析［インプロット・プログラム（Ｉ　ｎｐｌ ｏｔｐｒｏｇｒａｍ）　：グラフバド・ソフトウェア（Ｇ　ｒａｐｈ　Ｐ　Ａ　 Ｄ　Ｓ　ｏｆｔｖａｒｅ）、カリフォルニア州すンディエゴ］またはデリーン（ ＤｅＬｅａｎ）らのオールフィツト・プログラム（Ａ　Ｌ　Ｌ　Ｆ　Ｉ　Ｔ　ｐ ｒｏｇｒａｍ）［オールフィツト（ＡＬＬＦＩＴ）、バージョン２．７（ＮＩＨ ，ベセスダ、ＭＤ　２０８９２）］によって分析されてよい。ムンサン、ピー・ ニー（Ｍｕｎｓｕｎ、　Ｐ、　Ｕ、　）およびロッドバード、ディ（Ｒｏｄｂａ ｒｄ、　Ｄ、　）、アナリティヵル・バイオケミストリー（、Ａｎａｌ、　Ｂ　 ｉｏｃｈｅｍ、　）、１０７：２２０−２３９（１９８０）。

結合定数を決定するために、ビイランド、ディ・ビー（Ｂｙｌｕｎｄ、　Ｄ、　 Ｂ、）ら、「レセプター結合に関する方法Ｊ　（”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｒ ｅｃｅｐｔｏｒ　Ｂｉｎｄｉｎｇ−）、エイチ。

アイ・ヤマムラ（Ｈ，Ｉ　、　Ｙａｍａｍｕｒａ）ら編、神経伝達物質分析にお ける方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ　Ａｎａ ｌｙｓｉｓ）、レイブン・プレス、ニューヨーク、１９９０、第１〜３５頁の記 載に従って、スキャッチャードの方法の変形に従って、スキャッチャード飽和曲 線を作成し、分析できる。

実験的に特異的結合値を得るために、広範囲の追跡濃度（典型的には１〜１５０ ｐＭ）の標識ペプチドホルモンを使用して全結合を得、２本の管を、非常に高濃 度、例えば、１１００ｎの非標識リガンドの存在下で再評価して非特異的結合（ ＮＳＢ）を得る。標識リガンドの各濃度での特異的結合を得るために、後者の値 を各全結合値から引く。

以下の実施例の結果によって、倒産核および周辺領域を含む基底前脳由来の膜に おける特異的レセプター類に結合することについてペプチド類の１２５１標識ア ミリン、ＣＧＲＰおよびカルシトニンに対して競争する能力を測定するための本 明細書に記載の方法がペプチド類およびこれらのレセプター類と相互作用する他 の化学化合物を同定するための特に有用な手段を代表することが立証される。倒 産核の領域およびその周囲の高い密度および特異性のレセプター類によって、薬 物スクリーニング研究に有用な範囲内で低下するシグナル対ノイズ比（すなわち 、非特異的結合に対する特異的結合の割合）が得られる。

＋１５Ｉ−ｒアミリン・レセプター部位への結合について試験される３種類のペ プチド類の相対的効力（ｒアミリン＞ＣＧＲＰ＞ＣＧＲＰ８．、）は、ヒラメ筋 グリコーゲン代謝を変える際のそれらの相対的効力と同様であると記載され、肝 臓およびヒラメ筋膜におけるそれらのそのレセプター類への結合について＋２５ １−ＣＧＲＰに対して競争する能力とは全く異なる。この結果は、倒産核領域膜 にある高親和性アミリン・レセプターが、従来の結合方法によって容易に検出さ れないレベルではあるが、ヒラメ筋にも存在するという本発明者らの結論と一致 する。

後者の組織は、もちろん、アミリン・アンタゴニストおよびアゴニスト薬物開発 について関心のある標的である。

ヒラメ筋インスリン拮抗アッセイにおける効力と結合活性との関係は、上記１２ ５工、アミリン結合アッセイがアミリンおよびＣＧＲＰのインスリン対抗作用を 有するアゴニストおよびアンタゴニストを同定する優れた予測能力を有すること を示す。脳組織を使用する結合アッセイの、アミリン・レセプターを同定し、ア ミリン・レセプター結合化合物を同定する能力は非常に予想されない。

別の態様では、アミリン・レセプター・アッセイを使用して、未知の溶液または 混合物中のアミリンまたはアミリン・レセプター活性化合物の濃度を決定するこ とができる。アミリン・レセプターは下記実施例３に記載に従ってアッセイされ る。実施例３の記載に従って、ラット脳の基底前脳領域のような高密度のアミリ ン・レセプターを含有する膜もしくは細胞調製物またはレセプター蛋白調製物を １０−’Ｍの濃度で放射性標識アミリンおよび非標識アミリンとインキュベート する。この方法で、アッセイ管中のアミリンの量と生産された放射性標識アミリ ン結合の抑制とを関係付ける競争曲線が得られる。別の管において、非標識ペプ チドを、定量化すべき未知の量のアミリンを含有する溶液と交換する。この溶液 は血漿、血清もしくは他の液体またはアッセイ緩衝液（例えば、実施例３のＨＢ ＢＰ）に溶解した固体混合物であってもよい。未知の溶液は、溶液のイオン含量 を有意に変えないように、最終アッセイ容量の約１０％以下の容量で添加するの が好ましい。多量の未知溶液を使用する場合、変化したイオン含量の結合への影 響に対する対照として等価基含量を含有する溶液が含まれる。非特異的結合、す なわち、高濃度（１０−”Ｍ）の非標識アミリンまたはサーモン・カルシトニン の存在下での放射性標識アミリンの結合を各試料に関する全結合から引いて、特 異的結合を得る。未知試料中のアミリンまたはアミリン・レセプター活性物質の 含量を決定するために、未知のものによって得られた放射性標識アミリンの特異 的結合の抑制量をアミリンによって得られた抑制曲線と比較する。これらの計算 を行う方法は神経伝達物質レセプター結合（Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ 　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｂｉｎｄｉｎｇ）、エイチ・ヤマムラ（Ｈ，Ｙａｍａｍｕ ｒａ）、ニス・ジエイ・エナ（Ｓ、　Ｊ、　Ｅｎｎａ）、およびエム・ジエイ・ クハール（Ｍ、　Ｊ　、　Ｋｕｈａｒ）編（レイブン・プレス、ニューヨーク、 １９９１）のようないくつかの情報源に開示されている。

この方法は、既知または未知の試料中のアミリン・レセプター活性化合物の量を 定量化するために使用され、アミリン、アゴニスト類およびアミリン・アンタゴ ニスト類の活性代謝産物、薬物動力学、安定性、溶解度、または分布を同定する 際に使用するために、血漿または他の体液および組繊中のアミリン・レセプター 活性化合物を定量化するために使用してもよい。これが必要である場合にアミリ ンに関するアッセイの特異性を増大させるために、未知の試料中のＣ０ＲＰの量 はＣＧＲＰに関する放射性レセプター・アッセイを介して決定され得る。このよ うな放射性レセプター・アッセイは、アミリン放射性レセプター・アッセイにつ いて記載された方法に従って、実施例２に記載された緩衝液系を用いて、実施例 ２に記載の””Ｉ−ｈＣＧＲＰおよびラット肝臓膜を使用して行うことができる 。このアッセイで未知の試料のＣ０ＲＰ含量を決定することができる。アミリン 放射性レセプター・アッセイはＣ０ＲＰを含むアミリン・レセプターの活性な全 ての化合物を同定するので、アミリン・レセプター活性化合物の全含量から放射 性レセプターまたは他のアッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ）によって測 定されたＣＧＲＰ含量を引いて、アミリンおよびＣＧＲＰの両方を含有し得る試 料（例えば、血清）中のアミリンの量を得るのに有用である。

さらにもう１つの態様では、アミリンをそのレセプターから置換する化合物を同 定するために、およびその結果、候補のアミリン・アゴニスト類またはアンタゴ ニスト類を同定するために、アミリン・レセプターを、高流量スクリーンにおい て、所望により当技術分野で公知のもののようなロボットシステムを利用して使 用する。該アッセイを使用して、例えば、合成化合物のライブラリー、植物の抽 出物、海生生物の抽出物、または細菌もしくは菌類発酵ブロスをスクリーンする ことができる。１つの具体例では、最初の工程は、上記のような約１０〜約１５ ｐＭ　”’Ｉ　Ｂａ１ｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒラット・アミリンと予備インキュベ ートした上記アミリン・レセプター調製物的５０μｌ、および試験化合物の、所 望により化合物の溶解を促進するために例えば１０％までのエタノール、もしく は１％までのＤＭＳＯもしくは５％までのアセトニトリルを含有するアッセイ緩 衝液中溶液的５０μｌを一緒にする。有機抽出物に関して、溶媒の最終濃度は、 一般に、２５％だけ冷却アミリンによって標識アミリンの標準的な置換曲線を置 換するもの、すなわち２５％未満だけ測定されたＩＣ５ａを移動させるものを超 えてはならない。

これは、各々選択された溶媒について評価され得る。合成ライブラリーから同定 された化合物について、試験濃度は、正の試験が起こる頻度に依存して約１１０ ０ｎ、ｌμＭまたは１０μＭであろう。正は、典型的には、標識アミリンの特異 的結合の少なくとも約２０％減少によって表されるであろう。ブロスおよび抽出 物について、正の試験は、正の試験の頻度にしたがって、特異的アミリン結合の 少な（とも約２０％、５０％または８０％減少によって示されるであろう。

高流量スクリーニングにおいて、リガンド結合による非特異的妨害に関する最初 のスクリーンにおいて正の試験を与える化合物または混合物を検査するのが有用 である。好ましい具体例では、全ての正の試験化合物または抽出物を、同−画調 製物中の別のリガンドについての結合アッセイに暴露する。非特異的効果を評価 するのに適しているアッセイは、ドーパミン（Ｄ２）レセプター結合の測定用放 射性標識スビベロンまたは標準試薬であろう。ヘス（Ｈｅｓｓ）ら、ジャーナル ・オブ・ファーマコロジー・アンド・エキスペリメンタル・セラビューティクス （Ｊ。

Ｐ　ｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｅ　ｘｐ、　Ｔ　ｈｅｒ、　）、２３８　：８４６− ８５４（１９８６）。Ｄ２レセプターは基底前脳において比較的豊富であり、容 易にアッセイされる。別法として、放射性標識ハロペリドールは、ドーパミン・ レセプターに対するリガンドとして使用され得る。アミリン・レセプター・スク リーンにおいて正を試験し、ドーパミン・レセプター・スクリーンにおいて同一 の定量基準によっても正を試験するいずれの化合物、ブロス、または抽出物も膜 レセプターへのリガンド結合を非選択的に妨害するとして拒絶される。

本発明のさらなる態様は、アミリン結合を選択的に減少させるＣ０ＲＰレセプタ ーまたは化合物、ブロスまたは抽出物との相互作用の決定を含む。かくして、上 記のものと同様の工程が、約１０〜１５ｐＭ　”５Ｉ−ｈｉｓ、、−ｈ　ａ−Ｃ ＯＲＰと予備インキュベートした肝臓細胞または膜からなる結合アッセイで計画 される。

アミリン・アッセイに関する上記定義の定量基準を使用して、アミリンおよびＣ ０ＲＰレセプターと相互作用する化合物、ブロスまたは抽出物は、ＣＧＲＰレセ プターではなく、アミリン・レセプターで選択的に作用するものと同定される。

記載された基準を満たす化合物について、アミリン・レセプターおよび、関連す る場合にＣＧＲＰまたはカルシトニン・レセプターとの相互作用の効力は、試験 化合物の濃度の範囲によって画調型物からリガンドの置換を測定することによっ て決定される。ブロスおよび抽出物におけるような未知の化合物の混合物につい て、所望の活性をＨＰＬＣを含む技術公知の方法によって単離および精製し、次 いで、分離された物質を試験して所望の活性を保持することを決定する。純粋ま たは比較的純粋な活性物質を得た後、アミリンおよびＣＧＲＰレセプターでのそ の効力を決定することができる。ＮＭＲ，質量分光学、および元素分析を含む技 術公知の方法を使用して、所望のレセプター結合活性を有するいずれの単離物質 も化学的同定を行うことができる。

アミリンのそのレセプターからの選択的置換の同定の後のいずれの所望の工程で も、正試験物質を機能的アッセイで評価して、例えば、ラット・ヒラメ筋におけ る標識グルコースのグリコーゲンへのインスリン刺激性取込みの抑制を介して、 アミリン・アゴニスト活性を評価することができる。該物質は、１０，２０，５ ０または１１００ｎラツト・アミリンとインキュベートしたラット・ヒラメ筋に おける標識グルコースのグリコーゲンへのインスリン刺激性取込みを回復するそ の能力を評価することによって、このアッセイでアンタゴニスト活性についても 試験され得る。また、これらのアッセイにおいて種々の濃度の試験物質を適用す ることによって、アミリン・アゴニストまたはアンタゴニスト作用の効力を決定 することもできる。

アミリン・アゴニスト作用の別の試験は、試験物質の静脈内ポーラス注射の後に 、例えば、ハロタン麻酔した１８時間断食したラットにおける血漿乳酸塩および ／またはグルコースの上昇の測定を使用する。一連の濃度を使用することによっ て、アミリン・アゴニストとしての物質の効力を測定することができる。アンタ ゴニスト活性についての関連アッセイでは、１８時間断食し麻酔したラットに試 験物質を静脈内注射する。次いで、既知量のアミリン・アゴニストの静脈内注射 に対するバイパーラクチミック（ｈｙｐｅｒｌａｃｔｅｍｉｃ）および／または 血糖上昇応答の低下（対照条件と比較して）を測定するかまたは別に評価する。

試験物質の異なる注入速度で試験を繰り返すことによって、このような物質のア ンタゴニスト効力を決定できる。

別の具体例では、アミリン・レセプター結合アッセイにおいて正を試験する物質 がアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかを評価するために、試験物 質を、アミリンが環式ＡＭＰの合成の速度を変化させるアミリン応答性膜または 細胞系と一緒にする。このような調製物としては、豊富なアミリン・レセプター を有する培養細胞株から調製した膜または細胞自体が挙げられる。ｃＡＭＰレベ ルの変化は、技術公知の方法に従ってインキュベートした膜または細胞調製物の 暴露の後にラジオイムノアッセイによって測定される。アミリンをそのレセプタ ーから置換する際に正を試験し、ｃＡＭＰ産物への影響を有しない物質はアミリ ン・レセプター・アンタゴニストであると予想され得る。アンタゴニスト作用は 、アミリンまたはアミリン・アゴニストと類似の種々の濃度の物質をインキュベ ートシ、アミリンまたはアミリン・アゴニストによって誘発されたｃＡＭＰの変 化の抑制度を測定することによってさらに評価され得る。

もう１つの態様では、本発明を使用して、アミリン・レセプターについて細胞株 、組織から分離された細胞、およびヒトまたは動物血液由来の細胞をスクリーン する。これらの細胞は、アミリン・レセプターのアゴニストおよびアンタゴニス トの開発のためにさらなるアミリン・レセプター調製物について容易に入手可能 な原料として使用されるであろう。細胞由来の膜は、ポリトロン（Ｐ　ｏｌｙｔ ｒｏｎ）　［ブリンクマン・インストゥルメンツ（Ｂｒｉｎｋ＋＊ａｎ　Ｉｎｓ ｔｒｕｍｅｎｔｓ）］のような装置で細胞をホモジナイズし、次いで遠心するこ とによって得られる。このようにして得られた膜を、実施例３に記載のような緩 衝液系中で１１３■−ラット・アミリンと合わせ、該実施例の記載に従ってイン キュベートおよび収集した。ｌ！ＳＩ−ラット・アミリンの細胞膜への特異的結 合は、例えば１０−７Ｍラット・アミリンまたは１０−’Ｍサーモン・カルシト ニンの存在下で得られた結合の減少を測定することによって同定される。Ｐ＜０ ．０５レベルでの全結合（３本の管）および非特異的結合（３本の管）の間に有 意な差がある細胞は、アミリン・レセプター機能のさらなる研究のために使用さ れるであろう。

前記したアミリン・レセプター結合アッセイを使用して、これらのレセプターを 含有する膜からアミリン・レセプターをさらに精製することができる。腹は、高 密度のアミリン・レセプターを含有することを示した領域、例えば脳倒産核から 実施例３の記載に従って得られる。蛋白１１１ｇ当たり最高密度のアミリン・レ セプターを含有する膜分画を同定するために、差動または密度勾配遠心によって 得られたサブセルーラー（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌｒａ）膜分画を、放射性標識アミ リンの特異的結合についてアッセイする。さらなる精製のために、最高レセプタ ー密度を有する膜分画を使用するのが好ましい。

この膜分画を収集し、低温（４℃）で約１時間、０．００１％〜１％洗浄剤の濃 度で、トリトン、ジギトニン、オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩、およ びコール酸塩を含む数種類の膜可溶化剤で緩衝化溶液中で処理する。緩衝液系に プロテアーゼ抑制薬（フッ化フェニルメチルスルホニル、ＥＤＴＡ、アプロチニ ンを含む）を含んで、可溶化の間またはその後のレセプター分解を防止する。洗 浄剤による膜の処理の後、非可溶化膜を高速での遠心（１００，０００ｘｇで１ 時間）によって沈殿させ、可溶化されたレセプターを含有する得られた上清を上 記に従って放射性標識メトラゾンの結合についてアッセイする。ポリエチレンイ ミン塗布フィルター上での濾過によって可溶化されたレセプターを収集すること ができる［ブランズ、アール・エフ（Ｂｒｕｎｓ、　Ｒ，Ｆ、）ら、アナリティ カル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　）、１３２　： 　７４−８１（１９８３）］。別法として、ポリエチレングリコールとの沈殿、 ゲル濾過または平衡透析のような方法によって可溶化されたレセプターを収集す る。可溶化されたレセプターの結合特性（例えば、アミリン、Ｃ０ＲＰおよびカ ルシトニンに対する親和性）が評価され、それは膜局在性レセプターの特性と一 致すべきである。

アミリン・レセプターを可溶化し、可溶化されたレセプターをアッセイするのに 適している条件を決定した後、アミリンを結合した支持体上での親和性クロマト グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、レクチンアガロースクロマトグラ フィー、ゲル濾過および疎水性相互作用クロマトグラフィーのようなりロフトグ ラフィー法によって、これらの可溶化されたレセプターを他の可溶化された膜蛋 白から精製する。レセプターを含有するピークおよび精製の程度を同定するため に、蛋白含量への特異的アミリン・レセプター結合についてクロマトグラフィー カラム溶出液を試験する。最終精製プロトコルにおける含有の前に、各クロマト グラフィ一工程を試験して、蛋白１冒ｇ当たりの特異的放射性標識アミリン結合 の増加によって測定されるように、レセプター精製に寄与する程度を測定する。

所望により、部分的にまたは完全に精製したアミリン・レセプターを得るために 、出発物質を多量に使用して、所望のクロマトグラフィ一工程を逐次組み合わせ る。

この方法で部分的にまたは完全に精製したレセプターを使用して、診断（変えら れたアミリン・レセプター密度、分布、または抗原性による疾患状態）で使用す るための、およびアミリン・レセプター発現のための組換えライブラリーをスク リーニングするのに使用するためのアミリン・レセプター特異的抗体を得る。

精製したレセプター調製物を使用して、部分的な配列情報を得ることもでき、こ れは、アミリン・レセプター・コード化遺伝子配列について組換えライブラリー をスクリーニングするためのオリゴヌクレオチドプローブを調製するのに有用で ある。

本発明のレセプター結合アッセイスクリーニング法の詳細な具体例を以下の実施 例で例示する。これらの実施例は如何なる場合も明細書および請求の範囲内に記 載された本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。

実施例１ 膜の調製 雄性ＷｉｓｔａｒまたはＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｖｌｅｙラット（２００〜２５０ ９）から膜を調製した。断頭した後、肝臓、ヒラメ筋および脳領域を、４℃でリ ン酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳＸｐＨ７，４）に取り出した。次いで、組織を計量 し、組織１ｇ当たり５ｍｌの水冷した２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，４） 中に！き、セツティング４で１０秒間ポリトロン（Ｐ　ｏｌｙｔｒｏｎ）でホモ ジナイズした。冷却ＨＥＰＥＳをさらに３０ｍ１添加し、ホモジネートを４８． ０００ｘｇで１５分間遠心した。上清液を捨てた後、前記のとおり、膜ペレット を新しいＨＥＰＥＳ緩衝液４緩衝液４刀する。

エタノール９０．２Ｍ貯蔵溶液からの使用直前に添加した０．２ｍＭ　ＰＭＳＦ を含有するある量の２０■Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液中で最終膜ペレットを再懸濁し た。

約０〜約２０冨９初期組織７ｍｌの濃度を産するのに充分な量の緩衝液を使用し た。

実施例２ １２Ｘ７５冨鳳のガラスまたはポリプロピレン管にＨＢＢＭ緩衝液（１諷ｇ／鳳 ｌバシトラシン、１１１ｇ／ｘｉブｏｙ７ーゼー７！Ｊ　ＢＳＡ分画Ｖ，４ｍＭ 　ＭｇＣ４を含有する２ｏ翼Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））１５０μｌ を添加し、使用直前に、これに０．２露ＭＰＭＳＦを添加した。

この溶液に、１Ｏ−ＩＩ〜１０−’Ｍの濃度のＨＢＢＭ緩衝液で希釈した非標識 ペプチド５０μｌを添加した。対照管はＨＢＢＭだけを含有した。この溶液に５ 〜７　ｆｍｏｌの１２５１−ｈ　ＣＧＲＰまたはＨｌｌ　Ｉ−　ｒアミリンを含 有するＨＢＢＭ　５０μｌを添加した。初期重量４露９の組織由来の膜を含有す る緩衝液２５０μｌの添加によってインキュベーションを開始し、室温（２４℃ ）で６０分間続けた。

次イテ、ブランデル（Ｂｒａｎｄｅｌ）Ｍ　−　２　４ハーベスタ−中でＧＦ／ Ｂガラス繊維フィルター（０．３％ＰＥＩ中で５時間予め浸漬した）を通して懸 濁液を濾過した。

使用直前にフィルターを冷却ＰＢ８５ｍＡ’で洗浄し、濾過直後に冷却ＰＢＳ　 １５ｍ１で洗浄した。次いで、フィルターをガンマ・カウンターで計数した。

”Ｉ−ｈ　ＣＧＲＰの結合を１〜１５０ｐＭで測定して全結合を得、再度、１１ ００ｎ非標識ｈ　ＣＧＲＰの存在下で非特異的結合を得た。添加した全リガンド から全結合を引いて遊離リガンドの濃度を誘導した。

以下のとおり、スキャッチャード競争曲線分析を行った。

肝臓膜 １０−’Ｍ　ｈ　ＣＧＲＰの不在および存在下で１．３〜１５０ｐＭ　”Ｉ−ｈ 　ＣＧＲＰのラット肝臓膜への結合を測定して飽和曲線を得た。このデータのス キャッチャード分析によって、以下の運動定数：Ｋｄ＝１９．ｌｐＭおよびＢｍ ａｘ＝４９。

４　ｆｍｏｌ，／ｓ＋ｇ蛋白を有する単一の明確な結合部位を得た（第１図）。

競争曲線（第２図）は、結合部位のプロフィルが、第１表に示したＩＣ５ｏおよ びヒルスロープ値を有するｈ　ＣＧＲＰ＞ｈ　ＣＧＲＰｇ−３７＞ｒ　アミリン であったことを示した。

第１表 ”’Ｉ−ＣＧＲｐの肝１１ｊｌへのＭ合は２ｍＭ　Ｍｇ（Ｊｚ（’）存在下テ約 ２．８倍増加した。

１５ｐＭ”Ｉ−ｒ　アミリンのラット肝臓膜への特異的結合は、置換ペプチドと して１μＭ　ｈ　ＣＧＲＰまたは１μＭｒ　アミリンのいずれを用いてもこれら の条件下では検出されなかった。

Ｌ６ミオサイト膜 これらの膜は、肝臓膜において測定したものと同一の薬理学的プロフィル、すな わち、ＣＧＲＰ＞ＣＧＲＰ＠−Ｈ＞７　ミ’）：／を有する”Ｉ−ｈ　ＣＧＲＰ 結合部位を示し、肝臓膜におけるようにこの組織におけるペプチド・レセプター がヒラメ筋におけるグリコーゲン代謝へのレセプター媒介性アミリン効果を刺激 しないトイウ決定［アミリン≧ＣＧＲＰ＞ＣＧＲＰトｓ７］を反映した。しかし 、このレセプターは、ＣＧＲＰアゴニスト類およびアンタゴニスト類についてス クリーニングする方法において、またはアミリン・レセプターに関して全体的に または部分的に選択されるアミリン・アゴニスト類およびアンタゴニスト類を同 定するのに有用である。

ラットのヒラメ筋膜 これらの膜も特異的な＋２５７−ｈ　ＣＧＲＰレセプター部位を示した。この結 合部位についての競争時のｒアミリンの効力（ＩＣｇｏ＝６．２ｎＭ）は肝臓膜 における””Ｉ−ｈ　ＣＧＲＰ部位についての競争時のその効力（１０，５ｎＭ 、第１表）と似ている。

標識ｒアミリンをこれらの膜で直接試験した後、非常に低い密度の特異的な結合 部位（１０ｐＭ　１２５１−ｒ　アミリンで０．００９　ｆｍｏｌ／ｍｇ組織） を得、全結合のうちの少量だけ（１５％）が１μＭ非標識ｒアミリンによって置 換可能であった。

ラット肝臓およびラットのヒラメ筋膜による実験は、所定の条件下で１２５１− ｈ　ＣＧＲＰを使用して検出可能な大部分のレセプターが６〜１０ｎＭのｒアミ リンに関する結合親和性（Ｋｉ）を有することを示す。肝臓膜において測定した 場合、このレセプターでＣＧＲＰはｈ　ＣＧＲＰａ−＊ｔの４倍の効力があり、 ｒアミリンの約２００倍の効力がある。この親和性はアミリンがＣ０ＲＰよりも 有効であるヒラメ筋におけるグリコーゲン代謝へのレセプター媒介アミリン効果 と一致しない［リートン（Ｌ　ｅｉｇｈｔｏｎ）ら、１９８８　：ヤング（Ｙｏ ｕｎｇ）ら、アミリン・コーポレイション（Ａｍｙｌｉｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ ｏｎ）（未発行）コ。

高血糖症を生じさせるための断食して麻酔したラットに注射したアミリンおよび ＣＧＲＰに対する効力比と一致しない。１および１０μ９の投与量で、アミリン はより有効な高血糖症薬（第３図）であり、すなわち、アミリンは関連レセプタ ー部位でより有効であることが明らかである。したがって、これらの実験におい て測定したＣ０ＲＰ結合部位は、Ｃ０ＲＰおよびアミリンによって生じたインス リン拮抗作用よりもむしろ、レセプター媒介血管拡張作用を示すと思われる。

実施例３ 脳膜による結合アッセイ ラット脳の腹側面から、嗅管（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ　ｔｒａｃｔｓ）によって横 方向に結合され、かつこれらの管から中央に４５°で延びている視床下部まで口 ばし状に切断した。

倒産核および周辺領域を含むこの組織を収集し、計量し、実施例１の記載に従っ て膜を調製した。上記のとおり組織を収集した領域は、ここで、基底前脳と称さ れ、倒産核および周辺領域を含む。

ｌ！ａＩ−ｈ　ＣＧＲＰ 実施例２の記載に従って結合アッセイを行った。ラット肝臓膜による結果に対し て、”’Ｉ−ｈ　ＣＧＲＰの倒産核および周辺領域への結合の抑制は、明らかに 、各々、２６ｐＭおよび５．９ｎＭの２つの部位に関するＩＣ，。値を有する（ 第２表）二相性であった（第４図Ｂ）。

第２表 少量から不在量までの種々のＣ０ＲＰレセプター・サブタイプが倒産核に存在す るが、小脳の領域は高密度のＣ０ＲＰレセプターを含有するので、小脳膜も試験 した（セフストン（Ｓｅｘｔｏｎ）ら、１９８８）。小脳への”’Ｉ−ｈ　ＣＧ ＲＰ結合の抑制は、アミリンに対するより低い親和性（５ｎＭ）を有する部位だ けを示した（第４図Ａおよび第２表）。

１２８１−ｒアミリン 倒産核領域における”Ｉ−ｈ　ＣＧＲＰによって標識されたレセプターの１つの サブポピユレーションに対するアミリンの高親和性を示した後、本発明者らは、 Ｉ２５■　、アミリンの、ラット脳のこの領域由来の膜レセプターに結合する能 力を試験した。これらの実験について、より少量のアッセイ容量を使用し、予備 実験によって、Ｍｇ２−が＋２５１　、アミリンの結合を減少させることが判明 したので、インキュベーション混合物からＭｇＣ１，を除去した。ＭｇＣＡ’、 を有しないが、ＨＢＢＭ（実施例１におけるような）と同一の緩衝液をＨＢＢＰ （ＨＥＰＥＳ、バシトラシン、ＢＳＡ、ＰＭＳＡ）と称する。

上記のＷｉｓｔａｒまたはＳ　ｐｒａｇｕｅ−Ｄ　ａｗｌｅｙラット脳から基底 前脳腹を調製した。

組織ホモジネートの遠心後、最終膜ペレットを、５０１１９初期組織／ｍｌの濃 度を得るのに充分に量の２０＋＋ＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ＰＭＳＦを含まない）に 再懸濁した。

以下の方法で競争曲線を得た。１２Ｘ７５露菖ポリプロピレン管に、ＨＢＢＭ緩 衝液混合物Ｑ、ｌｘ／およびＨＢＢＰ中１０引〜１０−’Ｍの濃度の非標識ペプ チド２０μｌを添加した。対照管はＨＢＢＰ緩衝液だけを含有した。次いで、Ｈ ＢＢＰ中３　ｆｍｏｌの１２５ｉ−、アミリンを含有する３０μｌを添加し、初 期重量２．５畔の組織由来の膜を含有する５０μ！の添加によって該反応を開始 した。実施例２の記載に従って、インキュベーションを行い、反応混合物を処理 した。

飽和結合実験について、＋２５１−ｒ　アミリンの倒産核層への結合を１．２． ４．９．１８．３５．７０および１４０ｐＭで測定して全結合を得、再度、１１ ００ｎ非標識サーモン・カルシトニンの存在下で非特異的結合を得た。飽和等温 線データのスキャッチャード・プロットは一相性であった（第５図）。この部位 に関する結合定数は：Ｋｄ＝２７．１±２．１ｐＭ；　Ｂ、、、＝０．９７６± ０．０９６ｆｍｏｌ／ｍｇ組織（平均±ＳＥＭ）であった。これらの数字は、倒 産核および周辺領域を含む基底前脳組織が高親和性および高結合部位密度を有す るアミリンを結合するレセプターを含有するという本発明者らの発見を支持する 。

これらのレセプターの薬理学的プロフィルを、いくつかの非標識ペプチドのラッ ト基底前脳膜へのＩ２５■−アミリン結合について競争する能力を測定すること によって評価した。Ｈ５ｉ−アミリンは１４ｐＭの濃度でインキュベーション中 に存在し、ペプチドを１０−”Ｍから１０−’Ｍまで変化する１０種類の濃度で 試験した。インキュベーション定数（Ｋ、）を第３表に示す。これは　ＬＨエニ ーミリンのに４に関して２７．１ｐＭの値を使用して、チャンープルソッフ方程 式（Ｃｈａｎｇ−Ｐ　ｒｕｓｏｆｆ　ｅｑｕａｔｉｏｎ）　［Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ 、　Ｐ　ｈａｒｍａｃｏｌ、、２２　：　３０９９−３１０８（１９７３）］に 従ってＩＣｓ。から算出した。

第３表 ラット基底前脳膜へのＩＩＪ　、アミリン結合の抑制結果は、ＩＱ−Ｉ＋から１ ０−’Ｍまで変化する各ペプチドの１０種類の濃度を使用して、３〜５個の個別 実験の平均上標準誤差である。

結果は、ラット・アミリンが、飽和曲線のスキャッチャード分析から得られたに −（２７，１ｏＭ）に非常に近接していると認められるに１を有する最も有効な 化合物であったことを示す。ウナギおよびサーモンのカルシトニンはアミリンよ りも非常に僅かに有効であった。ラットおよびヒトβ−ＣＯＲＰはアミリンより も３倍および５倍低い効力であり、一方、α−ＣＧＲＰはβ−ＣＧＲＰよりも若 干低い効力であった。ラット・カルシトニンは非常に弱い抑制薬であり、このレ セプターがラットにおいて循環するカルシトニンに応答しないことを示す。

このレセプターに関してＣＧＲＰよりも高いアミリンの親和性は、単離したヒラ メ筋における糖原形成の抑制時のこれらのペプチドの相対的な効力と関連する。

ウナギおよびサーモンのカルシトニンの高親和性は、硬骨魚カルシトニンがイン スリン刺激糖原形成の有効な抑制薬であるという意外な可能性を示唆した（実施 例５参照）。

アミリンの糖調節薬作用のアンタゴニストを同定する上記アミリン・レセプター ・アッセイの能力をさらに評価するために、ｈ　ＣＧＲＰａ−ｓ７を競争的阻害 薬として試験した。このｈ　ＣＧＲＰのトランケート・アナログは、以下のとお り、ヒラメ筋におけるアミリンのインスリン阻害薬作用を拮抗することを示した 。倒産核へのｕｓｅ−ｒアミリン結合に関するｈ　ＣＧＲＰｍ−ｓ７のに１は３ ｏＭであった。このアミリン・レセプター・アッセイは、したがって、ｈ　ＣＧ ＲＰ８−３７が神経アミリン・・レセプターに対して中程度の親和性を有するこ とを示し、このペプチドがアミリンよりも約１００倍大きい濃度で存在する場合 に有効であろうと予測する。以下のとおり、本発明のアッセイによって測定され たアミリン・レセプターの薬理学的プロフィルは、骨格筋（例えば、ヒラメ筋） におけるインスリン刺激グリコーゲン分解の抑制を媒介するレセプターのプロフ ィルと一致する。

実施例４ 脳におけるアミリン・レセプターの分布実施例２のレセプター・ベース・アッセ イによって、３匹のＳ　ｐｒａｇｕｅ−Ｄ　ａｖｌｅｙラットからプールした脳 領域から実施例３の方法によって単離した膜への１２５Ｉ−ｒ　アミリン（１７ ｐＭ）の結合を測定した。２．５Ｘ１０−’Ｍ非標識ｒアミリンの存在下で非特 異的結合を測定した。第６図に示す値は、単一の組織試料を使用して３本の管の 平均±ＳＥＭを示す。

倒産核および周辺領域はｒアミリンに関する最高密度のレセプターを含有した（ 第６図）。

実施例５ レセプター・アッセイの予測される用途アミリン・レセプター結合アッセイの１ つの用途は、アミリン・レセプターでの作用を介するアミリン／インスリン効果 に影響を及ぼすことができる化合物の同定においてである。硬骨魚カルシトニン を、倒産核領域膜アッセイにおけるアミリン・レセプターに結合する能力につい て評価し、アミリン・レセプターに対する高親和性を見いだした（実施例３）。

これらの予想外の結果は、これらのペプチドホルモンが骨格筋におけるアミリン ・レセプターで有効なアゴニスト類またはアンタゴニスト類であるという本発明 者らの決定を導いた。したがって、ラットのヒラメ筋インスリン拮抗アッセイで ウナギおよびサーモンのカルシトニンを試験した。

以下の変形を伴って、ジートン・ビー（Ｌｅｉｇｈｔｏｎ　Ｂ、）およびクーパ ー、ジー・ジエイ・ニス（Ｃｏｏｐｅｒ、Ｇ、　Ｊ　、　Ｓ、　）、ネイチャー （Ｎ　ａｔｕｒｅ）、３３５：６３２−６３５（１９８８）の記載に従って、イ ン・ビトロでラットのヒラメ筋におけるグリコーゲン合成を刺激するインスリン の能力を測定した。ラットを殺す前に４時間断食した。筋肉はクリップで伸ばさ なかった、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＨＥＰＥＳをアッセイ媒体から 除去した：使用したインスリン濃度は１０００μＵ／ｍｌであった。

ｒアミリンは８３±１．９ｏＭ（６つの実験の平均±ＳＥＭ）のＩ　ｃｓｏでイ ンスリンによるグリコーゲン合成の刺激を抑制した。この効果を生じるｈα−Ｃ ＯＲＰのＩＣ，。は２４ｏＭ（２つの実験の平均）、すなわち３倍低い効力であ った。

ウナギ・カルシトニンのＩＣ，。は０．４ｏＭであり、サーモン・カルシトニン のＩＣ５０は０．３８ｏＭであった。

結果は、ウナギおよびサーモンのカルシトニンが共にサブナノメーター濃度でこ の組織におけるインスリン刺激性糖原形成を有効な低下させるので、ウナギおよ びサーモンの両方のカルシトニンがラット骨格筋におけるアミリン・レセプター で有効なアゴニストであったことを示した。この発見によって、周辺組織におけ る糖調節薬効果を媒介するアミリン・レセプターで活性な化合物を同定するため のレセプター・ベース・スクリーニング・アッセイ発明の有用性のさらに強い証 拠が得られる。

以下の方法に従って、ラットのヒラメ筋糖原形成系におけるｈ　ＣＧＲＰａ−ｓ ｙの効果を測定した。グリコーゲン合成を最大に抑制するために１１００ｎラツ ト・アミリンの存在下で上記に従って、インスリン刺激性グリコーゲン合成を測 定した。高濃度のｈｃＧＲＰａ−３，を添加して、アミリンを拮抗する能力、す なわち、これらの条件下でグリコーゲン合成を増加させる能力を試験した。この 結果は、このｈ　ＣＧＲＰのトランケート・アナログが６．６±０．９μＭ（４ つの実験の平均±ＳＥＭ）のＩＣ５ｏで骨格筋における糖原形成のインスリン刺 激への１１００ｎアミリンの影響を拮抗したことを示した。この値は、ｒアミリ ン自体のＥＣ５゜よりも約８００倍高い。ｒアミリンはヒラメ筋アッセイにおけ るそのＥＣＭ。よりも１２倍多い濃度で存在した。これはｈＣＧＲＰｓ−ｓｙが 骨格筋において関連レセプターでｒアミリンよりも約７０倍低い親和性を有する ことを示した。この結果は、ｈ　ＣＧ　ＲＰ　８−３７がｒアミリンよりも効力 が１００倍低いアミリン・レセプター・アッセイにおいて示されたｈ　ＣＧＲＰ ｓ−ｓ７およびラット・アミリンの相対的な親和性と一致する（実施例３）。

試験した全ペプチドが、少なくとも一部分、無傷のヒラメ筋の細胞の全てに対す る外因的に存在するペプチドの制限された評価、３７℃で無傷組織の筋肉プロテ アーゼによってペプチドの増大した代謝、および膜断片におけるよりも低い無傷 細胞へのレセプターに関するリガンドの有効な親和性に左右され得る単離した膜 レセプター結合アッセイにおけるよりもラットのヒラメ筋アッセイにおけるほう がより低い測定された効力を有したことが観察された。

Ｆ／Ｇ、／。

濃度（ＩｏｇＭ） Ｆ／Ｇ、３゜ 静脈内ペプチド投与量（ｕｐ） Ｆ／Ｇ、　４ａ。

１度（ｌｏｇＭ） 層５゜ ［＋２５］１−ラット・７ミリン結合（ｆｅｏｌ）要　約　書 アミリンに対して特異的なレセプターを含有する調製物を利用する結合アッセイ からなる、既知または候補のアミリンのアゴニスト類およびアンタゴニスト類を 同定、またはスクリーニング、または特徴付け、またはアッセイ、または単離す るための方法。アミリンに対する高密度のレセプターを含有する脳由来の膜が本 発明の方法に、アミリン・レセプターの供給源として、特に有用である。

国際調査報告

Claims (62)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）１種類以上の試験化合物を含有する試験試料およびアミリンに結合で きるアミリン・レセプター蛋白を含有するアミリン・レセプター調製物を一緒に し、 （ｂ）アミリンをアミリン・レセプター蛋白に結合させる条件下で該試験試料お よび該アミリン・レセプター調製物をインキュベートし、（ｃ）レセプター蛋白 に検出可能に結合する１種類以上の試験化合物を含有するこれらの試験試料を同 定する 工程からなる、アミリンのアゴニスト類またはアンタゴニスト類について同定ま たはスクリーニングする際に使用するためのアッセイ方法。
2. ２．さらに、 （ｄ）該レセプター蛋白に検出可能に結合する試験試料を、アミリン・レセプタ ー媒介活性のイン・ビトロまたはイン・ビボ刺激または抑制についてスクリーニ ングし、 （ｅ）アミリンのアゴニスト類またはアンタゴニスト類として作用するこれらの 試験試料を同定する ことからなる請求項１記載のアッセイ方法。
3. ３．アミリン・レセプター調製物がアミリン・レセプターを担持する単離細胞か らなる請求項１記載のアッセイ方法。
4. ４．アミリン・レセプター調製物がアミリン・レセプターを担持する単離膜から なる請求項１記載のアッセイ方法
5. ５．アミリン・レセプター調製物が単離アミリン・レセプター蛋白からなる請求 項１記載のアッセイ方法。
6. ６．アミリン・レセプター蛋白に検出可能に結合する試験試料が、該試験試料に よるアミリン・レセプター調製物からの標識第一リガンドとの置換を測定し、次 いで、測定した該試験試料によるアミリン・レセプター調製物からの第一標識リ ガンドの置換と測定した１種類以上の既知の第二リガンドによるアミリン・レセ プター調製物からの第一標識リガンドの置換とを比較することによって同定され る請求項１記載のアッセイ方法。
7. ７．標識第一リガンドがアミリンである請求項６記載のアッセイ方法。
8. ８．標識第一リガンドがアミリン・アゴニストである請求項６記載のアッセイ方 法。
9. ９．標識第一リガンドがアミリン・アンタゴニストである請求項６記載の方法。
10. １０．第一リガンドが放射性同位体、非放射性同位体、蛍光性分子、ケミルミネ ッセンス分子、およびビオチン化分子からなる群から選択されるもので標識され る請求項６記載のアッセイ方法。
11. １１．アミリンがラット・アミリンである請求項７記載のアッセイ方法。
12. １２．ラット・アミリンが１２５Ｉラット・アミリンである請求項１１記載のア ッセイ方法。
13. １３．既知の第二リガンドまたはリガンド類がアミリン、カルシトニン、α−Ｃ ＧＲＰおよびβ−ＣＧＲＰからなる群から選択される請求項６、７、８、９また は１０記載のアッセイ方法。
14. １４．既知の第二リガンドまたはリガンド類がヒト・アミリン、イヌ・アミリン 、ラット・アミリン、ヒト・カルシトニン、ラット・カルシトニン、ウナギ・カ ルシトニン、サーモン・カルシトニン、ヒトα−ＣＧＲＰ、ヒトβ−ＣＧＲＰ、 ラットα−ＣＧＲＰおよびラットβ−ＣＧＲＰからなる群から選択される請求項 ６、７、８、９または１０記載のアッセイ方法。
15. １５．試験試料が１種類よりも多ぐの試験化合物を含有し、さらに、（ｄ）さら なる試験試料が調製された試験試料よりも少数の種類の試験化合物を含有するこ とを特徴とする２種類以上のさらなる試験試料を試験試料から調製し、（ｅ）工 程（ａ）〜（ｄ）を、アミリン・レセプター蛋白に結合する試験化合物または化 合物類が同定されるまでな必要な回数繰り返す工程からなる請求項６記載のアッ セイ方法。
16. １６．アミリン・レセプターに検出可能に結合する試験試料が、該試験試料によ るアミリン・レセプター調製物からの標識第一リガンドの置換を測定し、測定し た試験試料によるアミリン・レセプター調製物からの第一標識リガンドの置換と 測定した１種類以上の既知の第二リガンドによるアミリン・レセプター調製物か らの第一標識リガンドの置換とを比較することによって同定される請求項２記載 のアッセイ方法。
17. １７．試験試料が１種類よりも多くの試験化合物を含有し、さらに、（ｆ）さら なる試験試料が輿製された試験試料よりも少数の種類の試験化合物を含有するこ とを特徴とする２種類以上のさらなる試験試料を試験試料から調製し、（ｅ）工 程（ａ）〜（ｆ）を、アミリン・レセプター蛋白に結合する試験化合物または化 合物類が同定されるまでに必要な回数繰り返す工程からなる請求項１６記載のア ッセイ方法。
18. １８．試験試料が１種類以上の既知の試験化合物からなる請求項１、２または６ 記載のアッセイ方法。
19. １９．試験試料が１種類以上の未知の化合物からなる請求項１、２または６記載 のアッセイ方法。
20. ２０．アミリン・レセプターを担持する細胞が脳細胞である請求項３記載のアッ セイ方法。
21. ２１．脳細胞がラット基底前脳由来である請求項２０記載のアッセイ方法。
22. ２２．アミリン・レセプターを担持する膜が脳細胞から単離される請求項４記載 のアッセイ方法。
23. ２３．脳細胞かラット基底前脳由来である請求項２２記載の方法。
24. ２４．アミリン・レセプター蛋白が脳細胞から単離される請求項５記載の方法。
25. ２５．脳細胞がラット基底前脳由来である請求項２４記載の方法。
26. ２６．アミリン・アゴニストがＣＧＲＰ、サーモン・カルシトニンおよびウナギ ・カルシトニンからなる群から選択される請求項８記載の方法。
27. ２７．アミリン・アンタゴニストがＣＧＲＰ８−３７である請求項９記載の方法 。
28. ２８．（ａ）アミリンに結合できるアミリン・レセプター蛋白を含有するアミリ ン・レセプター調製物への結合について化合物の標識リガンドに対して競争する 能力を評価または測定するか； （ｂ）ＣＧＲＰに結合できるＣＧＲＰレセプター蛋白を含有するＣＧＲＰレセプ ター調製物への結合について化合物の標識リガンドに対して競争する能力を評価 または測定するか；または （ｃ）カルシトニンに結合できるＣＧＲＰレセプター蛋白を含有するカルシトニ ン・レセプター調製物への結合について化合物の標識リガンドに対して競争する 能力を評価または測定するか；あるいは（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を共に行 い、（ｅ）化合物について決定しようとするレセプター結合特性を決定する工程 からなる、既知または候補のアミリン・アゴニストまたはアンタゴニスト化合物 について決定しようとする１種類以上のレセプター結合特性を評価するためのア ッセイ方法。
29. ２９．化合物について決定しようとする結合特性がアミリン・レセプター結合親 和性である請求項２８記載のアッセイ方法。
30. ３０．化合物について決定しようとする結合特性がアミリン・レセプター結合特 異性である請求項２８記載のアッセイ方法。
31. ３１．ＣＧＲＰレセプター調製物が肝細胞からなる請求項２８記載のアッセイ方 法。
32. ３２．ＣＧＲＰレセプター調製物が肝細胞膜からなる請求項２８記載のアッセイ 方法。
33. ３３．肝細胞が一次細胞培養物または樹立細胞株からなる請求項３１記載のアッ セイ方法。
34. ３４．肝細胞が樹立細胞株からなり、樹立肝細胞細胞株がＨｅｐ　Ｇ２細胞様で ある請求項３３記載のアッセイ方法。
35. ３５．ＣＧＲＰレセプター調製物がミオサイトからなる請求項２８記載のアッセ イ方法。
36. ３６．ＣＧＲＰレセプター調製物がミオサイト膜からなる請求項２８記載のアッ セイ方法。
37. ３７．ミオサイトが一次細胞培養物または樹立細胞株からなる請求項３５記載の アッセイ方法。
38. ３８．ミオサイトが樹立細胞株からなり、該樹立細胞株がＬ６細胞様である請求 項３６記載のアッセイ方法。
39. ３９．（ａ）試験試料およびアミリンに結合できるアミリン・レセプター蛋白を 含有するアミリン・レセプター調製物を一緒にし、（ｂ）アミリン・レセプター 調製物への結合について該試験試料の標識リガンドに対して競争する能力を測定 し、所望により、（ｃ）試験試料中のアミリン・レセプター結合化合物の量と、 工程（ａ）および（ｂ）に従ってアミリン・レセプター結合化合物を全く含まな いことが知られている対照試料について測定したアミリン・レセプター結合化合 物の量とを比較し、および／または、試験試料中のアミリン・レセプター結合化 合物の量と、工程（ａ）および（ｂ）に従って既知量のアミリン・レセプター結 合化合物を含有する対照試料について測定したアミリン・レセプター結合化合物 の量とを比較して、試験試料中のアミリン・レセプター結合化合物の存在または 量を決定する工程からなる、アミリン・レセプター結合化合物についてアッセイ されるべき試験試料中の該アミリン・レセプター結合化合物の存在または量を決 定するためのアッセイ方法。
40. ４０．アミリン・レセプター結合化合物がアミリンである請求項３９記載のアッ セイ方法。
41. ４１．アミリン・レセプター結合化合物がアミリン・アゴニストである請求項３ ９記載のアッセイ方法。
42. ４２．アミリン・レセプター結合化合物がアミリン・アンタゴニストである請求 項３９記載のアッセイ方法。
43. ４３．標識リガンドがアミリンである請求項３９記載のアッセイ方法。
44. ４４．標識リガンドがアミリン・アゴニストである請求項３９記載のアッセイ方 法。
45. ４５．標識リガンドがアミリン・アンタゴニストである請求項３９記載のアッセ イ方法。
46. ４６．アミリン・レセプター結合化合物がアミリンであり、標識リガンドがアミ リンである請求項３９記載のアッセイ方法。
47. ４７．アミリン・レセプター結合化合物がアミリン・アゴニストであり、標識リ ガンドがアミリン・アゴニストである請求項３９記載のアッセイ方法。
48. ４８．アミリン・レセプター結合化合物がアミリン・アンタゴニストであり、標 識リガンドがアミリン・アンタゴニストである請求項３９記載のアッセイ方法。
49. ４９．試験試料が生物学的液体である請求項３９記載のアッセイ方法。
50. ５０．生物学的液体が血液、血漿、尿、髄液、およびリンパ液からなる群から選 択されるものである請求項４９記載のアッセイ方法。
51. ５１．試験試料がアミリン調製物である請求項３９記載のアッセイ方法。
52. ５２．アミリン調製物の安定性を評価するための請求項３９記載のアッセイ方法 の使用からなる方法。
53. ５３．アミリン調製物の効力を評価するための請求項３９記載のアッセイ方法の 使用からなる方法。
54. ５４．アミリン調製物の溶解度を評価するための請求項３９記載のアッセイ方法 の使用からなる方法。
55. ５５．（ａ）アミリン・レセプター調製物で動物を免疫し、（ｂ）該免疫動物か らＢリンパ球を回収し、（ｃ）回収したＢリンパ球を悪性細胞と融合してハイブ リドーマを生産し、（ｄ）アミリン・レセプターを結合する抗体を生産するハイ ブリドーマを回収し、（ｅ）工程（ｄ）で選択された１以上のハイブリドーマか ら抗体を回収する工程からなる、アミリン・レセプターに結合するモノクローナ ル抗体を生産する方法。
56. ５６．（ａ）アミリン・レセプター調製物で動物を免疫し、（ｂ）血清が抗アミ リン・レセプター抗体を含有するこれらの動物を選択し、（ｃ）選択された動物 から抗アミリン・レセプター抗体を含有する血清を回収する 工程からなる、アミリン・レセプターに対する抗体を生産する方法。
57. ５７．アミリン・レセプター調製物が基底前脳膜調製物および単離アミリン・レ セプター蛋白調製物からなる群から選択されるものである請求項５５または５６ のいずれか記載の方法。
58. ５８．（ａ）試料および固体支持体に結合したアミリン・レセプター蛋白分子か らなるアミリン・レセプター調製物を一緒にし、（ｂ）未結合の試験試料の残り からアミリン・レセプター調製物に結合されるアミリン・レセプター結合化合物 を分離する工程からなる、試料からアミリン・レセプター結合化合物を分離する 方法。
59. ５９．（ａ）生物学的物質と第一アミリン・レセプター結合化合物とを一緒にし 、（ｂ）生物学的物質と第二アミリン・レセプター結合化合物とを一緒にし、（ ｃ）所望により、生物学的物質と１種類以上のさらなるアミリン・レセプター結 合化合物とを一緒にし、 （ｄ）生物学的物質におけるレセプターに対するアミリン・レセプター結合化合 物の相対的な結合親和性を決定する 工程からなる、アミリン・レセプターの存在について生物学的物質をスクリーニ ングする方法。
60. ６０．生物学的物質が細胞株である請求項５９記載の方法。
61. ６１．生物学的物質が単離細胞からなる請求項５９記載の方法。
62. ６２．アミリン・レセプター結合化合物がアミリン、カルシトニン、α−ＣＧＲ Ｐおよびβ−ＣＧＲＰからなる群から選択される請求項５９記載の方法。