JPH05507626A - トランスジェニック植物におけるシクロデキストリンの生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １８、デンプン分解産物として少なくとも１種のシクロデキストリンを生産する ことができる植物。

１９、請求項８のＤＮＡ構成物を含んで成り、少なくとも１種の機能的なシクロ デキストリングリコジルトランスフェラーゼ酵素を発現することができる、請求 項１８に記載の植物。

２０、前記植物がトウモロコシ、穀実、ワキシーコーン、モロコシ、米、ジャガ イモ、タピオカ、アロールートおよびサゴヤシから成る群から選択される、請求 項１８に記載の植物。

２１、前記植物がトウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ）　、小麦属（Ｔｒｉｔｉｃ ｕｍ種）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ　ｃｅｒｅａｌｅ）　、パン小麦×ライ麦雑種 （Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｕｍ　ｘｓｅｃａｌｅ　ｃｅｒｅａｌｅｌｆ！Ｆ り　、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ）、米（Ｏｒｙｚａ　５ａｔ ｉｖａ）　、馬鈴薯（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）　、サツマイモ（ Ｉｐｏｍｏｅａ　ｂａｔａｔａｓ）　、ヤマノイモ科（Ｄｉｓｃｏｒｅａ種）、 キャラサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ　ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）　、クズウコン科（Ｍａｒ ａｎｔａｃｅａｅ種）、ソテツ科（Ｃｙｃａｄａｃｅａｅ種）、カンナ科（Ｃａ ｎｎａｃｅａｅ種）、ショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ種）、ヤシ科（ Ｐａｌｍａｅ種）およびサゴヤシ科（Ｃｙｃａｄａｌｅｓ種）から成る群から選 択される、請求項１８に記載の植物。

２２、前記シクロデキストリンがα−シクロデキストリン、β−シクロデキスト リンおよびγ−シクロデキストリンから成る群から選択された少なくとも１つの メンバーを含んで成る、請求項１８に記載の植物。

２３、植物中でシクロデキストリンを生産させる方法であって、ａ）５′→３′ 転写方向において、 ｉ）植物細胞中で機能的な転写および翻訳開始領域：並びにｉｉ）少なくとも１ 種のシクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼ酵素をコードする構造遺 伝子を含んで成るＤＮＡ構成物を用いて、少なくとも１種の植物宿主細胞を改変 し、ここで前記ＤＮＡ配列は前記植物宿主の転写調節下にあり：そして ｂ）前記ＤＮＡ構成物を含む植物宿主を、シクロデキストリン生産量のシクロデ キストリングリコジルトランスフェラーゼの発現を許容する条件下に維持する ことを含んで成る方法。

２４、前記転写および翻訳開始領域が、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒ ｏｓｕｍ　）からのパタチン遺伝子の５′側の領域の少なくとも一部分を含んで 成る、請求項２３の方法。

２５、前記転写および翻訳開始領域が、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒ ｏｓｕｍ　）のＫｅｎｎｅｂｅｃ品種からのものである、請求項２４の方法。

２６、前記転写および翻訳開始領域が、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒ ｏｓｕｍ　）のＲｕ５ｓｅｔ　Ｂｕｒｂａｎｋ品種からのものである、請求項２ ４の方法。

２７、前記ＤＮＡ構成物が、 ｉａ）　ｕ記シクロデキストリングリコリルトランスフエラーセコード配列の５ ′末端に読み枠内において連結されたシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列 を更に含んで成り、前記シグナルペプチドは宿主生物体内の少なくとも１つの分 離した場所への前記シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼコード配 列の発現産物の輸送を指令することができる、請求項２３の方法。

２８、前記ＤＮＡ構成物が、 ｉａ）転写および翻訳終結調節領域 を更に含んで成る、請求項２３の方法。

２９、前記植物宿主がトウモロコシ、穀実、ワキシーコーン、モロコシ、米、ジ ャガイモ、タピオカ、アロールートおよびサゴヤシから成る群から選択される、 請求項２３の方法。

３０、前記植物宿主がトウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ）　、小麦属（Ｔｒｉｔ ｉＣＵｍ種）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ　ｃｅｒｅａｌｅ）　、パン小麦×ライ麦 雑種（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｕｍｘｓｅｃａｌｅ　ｃｅｒｅａｌｅ雑種 ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ）　、米（Ｏｒｙｚａ　５ａｔｉ ｖａ）　、馬鈴薯（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐ ｏｍｏｅａ　ｂａｔａｔａｓ）　、ヤマノイモ科（Ｄｉｓｃｏｒｅａ種）、キャ ラサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ　ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、クズウコン科（Ｍａｒａｎ　 ｔａｃｅａｅ種）、ソテツ科（Ｃｙｃａｄａｃｅａｅ種）、カンナ科（Ｃａｎｎ ａｃｅａｅ種）、ショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ種）、ヤシ科（Ｐａ ｌｍａｅ種）およびサゴヤ明　細　書 この出願は、１９９０年６月１１日出願のＵＳＳＮ　０７１５３６．３９２の一 部継続出願である。

技術分野 本発明はシクロデキストリンの生産に関し、より詳しくは、植物におけるシクロ デキストリンの生産を指令するシクロデキストリングリコジルトランスフェラー ゼ構造遺伝子の利用に関する。

発明の背景 シクロデキストリンは、シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼ（Ｃ ＧＴ）酵素と称するアミラーゼの１種による酵素的デンプン分解の生成物である 。シクロデキストリン群は、多数の相同の環状α−１，４−結合グルコピラノー ス単位から構成される３つの主要な環状オリゴ糖と幾つかの少量の環状オリゴ糖 を含む。６グルコピラノ一ス単位を有するシクロデキストリンは、α−シクロデ キストリンと呼ばれている（シャルディンガーのα−デキストリン、シクロマル トヘキサオース、シクロへキサグルカン、シクロへキサアミロース、α−ＣＤ、 ＡＣＤおよびＣ６Ａとしても知られる）。

７単位のシクロデキストリンはβ−シクロデキストリンと呼ばれている（シャル ディンガーのβ−デキストリン、シクロマルトへブタオース、シクロへブタグル カン、β−ＣＤ、ＢＣＤおよびＣ７Ａとしても知られる）。８単位のシクロデキ ストリンはγ−シクロデキストリンと呼ばれている（シャルディンガーのγ−デ キストリン、シクロマルトオクタオース、シクロオクタグルカン、シクロオクタ アミロース、γ−ＣＤ、ＧＣＤおよびＣ８Ａとしても知られる）。

シクロデキストリンの環状性質は、主原子価力に頼ることなくシクロデキストリ ン宿主の疎水性化合物に外来分子が取り込まれている包接体（包接複合体）とし て機能することを可能にする。よって、その成分は幾何学的要因の結果として結 合し、１成分の存在が他の成分の構造に存意な影響を与えない。疎水性化合物と シクロデキストリンとの錯生成は、その疎水性化合物の安定性と溶解性を増加さ せる。この現象の応用は、医薬、食品、化粧品および農薬を含む多数の分野にお いて見出すことができる。

医薬用途では、経口投与用の薬剤とシフ凸デキストリンの錯生成は多数の利点を 有することができる。中でも、液体から錠剤に成形することのできる固体への転 換、揮発や酸化に対する薬剤の安定化、不快な味や臭いの減少、難溶性薬剤の溶 解速度の増加、および水難クロデキストリンと錯生成した薬剤の非経口投与に関 して行われた限定された研究から、経口投与において認められるのと同じ幾つか の利点が観察され得る。シクロデキストリンとの錯生成によって薬剤の望ましく ない副作用を減らすことができる。そのような副作用としては、経口投与からの 胃の刺激、筋肉内注射からの局部刺激および出血領域、並びに点眼薬からの局部 刺激が挙げられる（Ｓｚｅｊｔｌｉ。

Ｊ、、　Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｋｌｕｗｅｒ　 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ。

Ｂｏｓｔｏｎ　（１９８８）、１８６−３０６頁〕。

食料品または化粧品へのシクロデキストリンの添加も多数の効果を存することが できる。香辛料、食品香料または香水香料において、シクロデキストリンは酸化 、揮発、および熱または光による分解に対して保護する（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、 　Ｈ，、”Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓｔｏ　 Ｆｏｏｄ、　Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ　ａｎｄ　０ｔｈｅｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　 ｉｎ　Ｊａｐａｎ’、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｆｏｕｒｔｈ　Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｆ　Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒ ｉｎｓ、０゜ＨｕｂｅｒおよびＪ、　５ｚｅｊｔｌｉｉｉ　（１９８８）　５３ ３−５４３頁〕。シクロデキストリンは不快な臭いや味を取り除くかまたは減少 させ、食品または化粧品の質感を改善する。

農薬をシクロデキストリンと錯生成せしめることは、難混潤性または微溶性の物 質の生体適合性を増加させ、そして揮発性液体または昇華性固体を安定な固体粉 末に転換することができる（Ｓｚｅｊｔｌｉ。

Ｊ、　（１９８８）前掲、　３３５−３６４頁；米国特許第４．９２３．８５３ 号〕。光、熱または酸素分解を受けやすい農薬は、シクロデキストリンとの錯生 成によって安定化することができる。

現在、シクロデキストリンの生産は、適当な微生物、例えばノくシラス・マセラ ンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ）の培養、アミラーゼ酵素の分離、 精製および濃縮を使って開始する。次いで該酵素を使ってデンプン基質を環状デ キストリンと非環状デキストリンの混合物に変換する。その後のシクロデキスト リンの分離および精製が必要である。該酵素を単離する細菌株およびデンプン変 換を進行させる時間の長さが、生産されるシクロデキストリンの主形態を決定す る。

α−シクロデキストリンの生産は、特定のシクロデキストリンを優先的に作るよ うに反応を操作しようと試みているが、このプロセスは容易には制御できず、シ クロデキストリンの混合物が得られる。

現時点では、β−シクロデキストリンが最も広範に市販されているシクロデキス トリンの形態である。というのは、β−形がα−またはγ−シクロデキストリン よりも安価に生産できるからである。

１９８７年、シクロデキストリンの米国市場は２年以内に５０００万ドル／年に 達すると予想された。その数値は、米国食品および医薬品管理当局（Ｕ、Ｓ、　 Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　）が食品中にシ クロデキストリンの使用を認可したならば倍増するであろう（Ｓｅｌｔｚｅｒ。

Ｒ，、Ｃｈｅｍ、　Ｅｎｇ、　Ｎｅｗｓ　（１９８７年５月’り　２４−２５頁 〕。世界市場は米国数値の二倍と見積もられる（Ｓｚｅｊｔｌｉ、　Ｊ、（１９ ８８）前掲、　ｖｉｉｉ頁〕。

シクロデキストリンの潜在的米国市場は２４５００万ドル／年はどの高さに達す ると予想されている（Ａｎｏｎ、、　Ｂｉｏｐｒｏｃ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、、　 １９８７年１１月り。別の生産方法によってシクロデキストリンの原価を下げる ことができれば、利用を待ち望んでいる潜在的に大きな市場がある。

発明の開示 細菌由来のＣＧＴ−媒介シクロデキストリン生産の欠点を認識すると、ＣＧＴが 植物宿主に輸送される組換え遺伝子の発現産物である場所でシクロデキストリン を生産することが望ましいと考えられる。総称的には分子農学として知られるこ の方法では、植物が着目の構造遺伝子により形質転換され、トランスジエニ・ツ ク植物の収獲領域から生産物が抽出・精製される。例えば、ヒト血清アルブミン がトランスジェニックタバコおよびジャガイモから生産されている（Ｓｉｊｍｏ ｎｓ、　Ｐ、Ｃ，ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１９９０）　鉦２１７ −２２１）。

分子農学の発想をシクロデキストリンにまで広げることは、生産費を下げる手段 を提供する。そのような形質転換に特に好ましい１つの宿主植物はジャガイモで ある。というのは、ジャガイモは塊茎中で多量のデンプンを生産するからである 。典型的な塊茎はその生体重の約１６％をデンプンとして含有する（Ｂｕｒｔｏ ｎ、　Ｗ、Ｇ、、　Ｔｈｅ　Ｐｏｔａｔ。

（１９６６）第３版、　Ｌｏｎｇｍａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ａｎｄ　Ｔｅ ｃｈｎｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ。

イギリス、３６１頁〕。塊茎特異的プロモーターおよび細菌性ＣＧＴを例えばア ミロブラストに指し向けるリーダーに連結された細菌性ＣＧＴ構造遺伝子による ポテト植物の形質転換は、塊茎中でシクロデキストリンを生産するための手段を 提供する。

従って、変更植物におけるシクロデキストリンの生産に備えて組換えデオキシリ ボ核酸（ｒＤＮＡ）と関連技術を適用することが望ましいと考えられた。

Ｃｏｈｅｎ　＆　Ｂｏｙｅｒ、米国特許第４．２３７．２２４号の種子研究から 発して、新規ＤＮＡ配列を提供するためおよび形質転換細胞培養物において異種 タンパク質を生産するためにｒＤＮＡ技術が利用できるようになった。一般に、 異なる生物からのＤＮＡの連結は、制限エンドヌクレアーゼを使ったＤＮＡ配列 の切除に頼っている。それらの酵素を使ってドナーＤＮＡを非常に特異的な位置 で切断し、着目のＤＮＡ配列を含む遺伝子断片を生せしめる。あるいは、所望の ペプチドをコードする構造遺伝子と着目の調節配列を合成的に製造してそのよう なりＮＡ断片を形成せしめることも現在は可能である。

それらのＤＮＡ断片は通常、各末端に「粘着末端」と称される短い一重鎖テール を含む。それらの粘着末端を育する断片は、次いで、例えば同じ制限エンドヌク レアーゼでの消化によって予め調製しておいた発現ビヒクル中の相補的断片に連 結せしめることができる。

調節要素に関して正しい方向で着目の構造遺伝子を含む発現ベクターを作製した ら、このベクターを用いて宿主細胞を形質転換し１．利用可能な細胞機構を使っ て所望の遺伝子産物を発現せしめることができる。組換えＤＮＡ技術は、生体内 におけるシクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼの発現とシクロデキ ストリンの生産を可能にするように植物を変更する機会を提供する。

しかしながら、−膜性は要約が簡単であるけれども、所望の構造遺伝子を含む発 現ベクターの作製は難しい工程であり、そして生物活性を保持したままでかなり の量で所望の遺伝子産物を好結果に発現せしめることは簡単には予想できない。

細菌由来の遺伝子産物は、植物系中で発現せしめると生物活性を持たないことが しばしばある。

ｒＤＮＡを使って植物を好結果に変更するためには、普通、天然植物細胞を使っ てその変更を保持している植物を作ることができるような方法で天然植物細胞を 変更しなければならない。うまくいった場合でさえも、この変更が規制を受ける ことはしばしば必須である。すなわち、特定の遺伝子が細胞の分化および植物組 織の成熟に関して調節されることが望ましい。シクロデキストリングリコジルト ランスフェラーゼの場合、生成物が変更植物のデンプン貯蔵領域と接触するよう に差し向けられるであろう部位において変更が行われることも重要である。よっ て、ｒＤＮＡによる植物の遺伝子操作は実質的に困難の度合いを増加させる。

その上、変更細胞から植物を再生する必要性は、遺伝子構成物の有用性を確立で きるまでの期間を大きく引き延ばす。特定の構成物が多種多様な植物種において 有用であることを確立することも重要である。更に、特定の構成物の発現を特定 の細胞型に限局化したいと望むかもしれず、そして遺伝学的に変更された植物が 多数の世代を通してその変更を保持することが望ましい。

本発明は、遺伝学的に変更された植物中でのシクロデキストリンの生産に関する 。−観点では、本発明は、シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼ酵 素の発現をコードする５′末端と３′末端を有する連続したＤＮＡ配列と、前記 シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼをコードする配列の５′末端 かまたは３′末端のいずれかに結合した少なくとも１つの異種ＤＮＡ配列とを含 んで成るＤＮＡ配列に関する。

本発明の別の観点によれば、５′→３′転写方向において、植物細胞中で機能的 な転写および翻訳開始領域、並びにシクロデキストリングリコジルトランスフェ ラーゼ酵素の発現をコードする構造遺伝子、をコードするＤＮＡ配列を含んで成 るＤＮＡ構成物が提供される。所望により、該ＤＮＡ構成物は、前記シクロデキ ストリングリコジルトランスフェラーゼコード配列の５′末端に読み枠内におい てシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列（ここで、前記シグナルペプチドは 、宿主生物中の少なくとも１つの分離した場所への前記シクロデキストリングリ コジルトランスフェラーゼコード配列の発現産物の輸送を指令することができる ）、および／または前記構造遺伝子から３′方向に置かれた転写および翻訳終結 調節領域を更に含むだろう。

本発明の追加の観点は、本発明のＤＮＡ構成物を含む植物細胞、および前記構成 物を使って宿主植物中でシクロデキストリンを生産するための方法を提供する。

図面の簡単な説明 図１は、大豆由来のＳＳＵシグナルペプチドとエントウ由来の成熟ＳＳＵタンパ ク質をコードする４８　ｂｐのＤＮＡをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）と 共に、読み枠によりコードされるアミノ酸配列（配列番号２）（上側の配列）を 示す。

図２は、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　）のＫｅｎｎｅｂ ｅｃ品種（上の配列、配列番号３）（ＰＣＲにより製造）とＭａｒｉｓ　Ｐｉｐ ｅｒ品種（下の配列、配列番号４）由来のバタチン（ｐａｔａｔｉｎ）　５’非 翻訳領域からのＤＮＡ配列の比較を示す。

図３は、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　）のＲｕ５ｓｅｔ 　Ｂｕｒｂａｎｋ品種（上の配列、配列番号５）（ＰＣＨにより製造）とＭａｒ ｉｓ　Ｐｉｐｅｒ品種（下の配列、配列番号４）由来のパラチン５′非翻訳領域 からのＤＮＡ配列の比較を示す。

ｐｎｅｕｍｏｎｅａｅ）シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼ（下 の配列、配列番号６）とＰＣＲ生成ｐＣＧＴ２シクロデキストリングリコジルト ランスフェラーゼ（上の配列、配列番号７）とのＤＮＡ配列の比較を示す（塩基 間に棒線が無いものは２つの配列の相違を示す）。そして （下の配列、配列番号８）とｐＣＧＴ２シクロデキストリングリコジルトランス フェラーゼ（上の配列、配列番号９）とのアミノ酸配列の比較を示す（残基間に 棒線が無いものは２つの配列の相違を示す）。

発明の詳細な説明 本発明は植物中でのシクロデキストリンの生産に関する。

本発明の一観点によれば、デンプン分解生成物の合成を増加させるような宿主植 物の組成の変更を可能にするＤＮＡ構成物および方法が提供される。宿主植物は 、種々の宿主植物中での内因性デンプン貯蔵物からのシクロデキストリンの生産 に備えて、アミラーゼ構造遺伝子、例えばシクロデキストリングリコジルトラン スフェラーゼ酵素の発現のための配列を含むそのようなりＮＡ構成物により、好 結果に形質転換せしめることができることが発見された。

ここで使う時には、シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ ）は、デンプンを１または複数の形態のシクロデキストリンに分解することがで きる任意の等価のアミラーゼ酵素を包含する。デンプンをシクロデキストリンに 変換するために植物中で特定のＣＧＴを使用する時の考慮事項としては、該酵素 の最適ｐＨ並びに該酵素が必要とする基質および補因子の利用可能性が挙げられ る。着目のＣＧＴは、宿主植物細胞中に見つかる生化学的機構と適合する動力学 的パラメーターを存するべきである。例えば、選択されたＣＧＴはデンプン基質 を目当てに他の酵素と競争するであろう。

最も好ましいシクロデキストリン形態はα−１β−またはγ−形であるが、他の シクロデキストリンの高次形態、例えばδ−２ε−１ζ−およびη−形も可能で ある。異なるＣＧＴ酵素は異なる比率でα、βおよび７−ＣＤを生成する。５ｚ ｅｊｔｌｉ、　Ｊ、、ＣｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（Ｋｌ ｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　Ｂｏｓｔｏｎ）　 （１９８８）２６−３３頁および５ｃｔｏｎｉｄ、　Ｇ、、　ＴＩＢＴＥＣＨ（ １９８９）　７：２４４：２４８を参照のこと。加えて、種々のＣＧＴ酵素は、 デンプン基質を特定のシクロデキストリン形の生産に好都合であるように優先的 に分解することができる。あるＣＧＴは主としてβ−ＣＤを生産しくＢｅｎｄｅ ｒ、　Ｈ。

（１９９０）　Ｃａｒｂ、　Ｒｅｓ、２０６：２５７−２６７　：にｉｍｕｒａ ら　（１９８７）　Ａｐｐｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２６：１４９−１５３）　、一 方で下記の実施例で後述されるクレブシェラＣＧＴは、基質としてジャガイモの デンプンを使った時、２０：１の比率で試験管内でα−ＣＤとβ−ＣＤを生産す る（Ｂｅｎｄｅｒ、　Ｈ，（１９９０）前掲）。それらの異なるＣＧＴをトラン スジェニック植物において使用すると、異なるＣＤ分布を生じ、よって異なる有 用性をもたらし得る。例えば、シクロデキストリンはリンゴジュースの褐色化を 抑制する上で有効であり、β−シクロデキストリンはα−またはγ−シクロデキ ストリンよりも良い結果を生じることが報告されている（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 ａｎｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、　Ｌｏｎｄｏｎ（１９８８）１３：４１０）。加え て、本出願の発明者らは、ジャガイモ塊茎切片へのβ−ＣＤの試験管内適用が変 色を抑制し、そしてジャガイモ塊茎全体への試験管内適用が傷によって引き起こ される典型的な黒点反応を防止することを発見した。

選択されたＣＧＴの構造遺伝子は、ｃＤＮＡから、染色体ＤＮＡから誘導するこ とができ、または完全にもしくは部分的に合成してもよい。例えば、所望の遺伝 子は、ＣＧＴの源、例えば原核生物源、例えばバシラス−７セランス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ）　、バシラス・ブラリーを作製することにより、 得ることができる。

ＣＧＴ構造遺伝子は、様々な方法で既知のＣＧＴアミノ酸配列配列誘導すること もできる。該遺伝子は、特に植物が好むコドンを提供することが望ましい場合に は、完全にまたは部分的に合成することができる。よって、ＣＧＴ遺伝子転写解 読枠の全部または一部を、選択された植物宿主が好むコドンを使って合成するこ とかできる。

植物が好むコドンは、例えば、選択した植物宿主種において最大量で発現される タンパク質中に最も高頻度で現れるコドンから決定することができる。

一般に、ＣＧＴ構造遺伝子の一部または全部が生来の遺伝子配列からまたはその ような配列に実質的に相同である遺伝子から誘導されるだろう。しかしながら、 そのような態様においてさえも、生来の遺伝子コドンの全部または一部を、例え ば発現を増強するために、宿主が好むコドンを使用することによって変更するこ とか好ましいかもしれない。

着目の核酸配列を同定する方法は、文献中に広範囲の例示が見つかっているけれ ども、個々の状況において、様飢な程度の困難に出くわすだろう。種々の既知技 術はプローブの使用を含み、この場合ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリー を相補的配列について探索する。加えて、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをポリメ ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における鋳型として使用し、そこから所望のＣＧＴ構 造遺伝子を含む断片を得ることができる。

宿主植物中での特定のＣＧＴの増加発現に備えるために、植物細胞は望ましくは 、（５′→３′転写方向において）（１）宿主植物細胞中で機能的な転写および 翻訳開始領域：（２）少なくとも１つのＣＧＴ酵素をコードし、そして好ましく は５′末端に読み枠内にシグナルペプチドをコードする配列を含む、構造遺伝子 ；並びに（３）宿主植物細胞中で機能的な転写および翻訳終結調節領域、を含ん で成る発現カセットにより形質転換される。

一般に、ＣＧＴ構造遺伝子は植物遺伝子ではないので、宿主植物中での該遺伝子 の発現を得るために、宿主植物細胞中で機能的な転写および翻訳開始および終結 調節領域を提供しなければならない。

開始および終結領域といった調節領域は、植物宿主にとって同種（もとの宿主由 来である）または異種（外来起源に由来するかまたは合成配列である）であるこ とができる。

開始調節領域では、プロモーターおよび／または翻訳開始シグナルを使用するこ とができ、植物宿主における誘導性発現または調節発現に備える、植物宿主また は他の植物種中に見つかるプロモーターを包含する。例えば、プロモーター領域 は、オピンシンターゼ転写開始領域、例えばオクトピンシンターゼプロモーター 、ツバリンシンターゼプロモーター、アグロビンシンターゼプロモーター等を含 むＴｉプラスミドＴ−ＤＮＡから利用することができる。他のプロモーターとし ては、ウィルス性プロモーター、例えばカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭ Ｖ）の領域■または全長プロモーター、３５Ｓ転写開始領域、リブロース−１， ５−二リン酸カルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）遺伝子、例えば小サブユニッ ト（ＳＳＵ）　、ファセオリン、タンパク質貯蔵、セルロース形成等に関係する タンパク質遺伝子、に関連するプロモーターおよび転写開始領域が挙げられる。

発現の時期調節および／または組織特異性は、所望の発現特異性を有する転写調 節領域の使用によって提供することができる。現時点て好ましい本発明の態様に おいて特に着目されるのは、ジャガイモ塊茎中ての優先的発現を表すジャガイモ のパタチン（ｐａｔａｔｉｎ）遺伝子由来の転写開始領域、または他の植物構造 物と比較してデンプン含有組織において同様に優先的に発現される他のプロモー ターである。

生来の配置の構造遺伝子、例えばオピン遺伝子の５′側にある領域により所望の プロモーター領域を同定し、そしてプロモーターを制限マツピングと配列決定に より選択および単離することができる。

同様に、構造遺伝子の３′側の領域として所望のターミネータ−領域を単離する ことができる。

更に、ＣＧＴ酵素の活性を宿主中の特定の組織、細胞小器官または領域に集中す ることが望ましいかもしれない。例えば、ジャガイモ塊茎では、テンブンは主と してアミロブラストに貯蔵されるので、発現されたＣＧＴのアミロブラストへの 輸送を指令するであろうＤＮＡ構成物を提供することが望ましいと考えられる。

宿主の特定領域中への発現されたＣＧＴの輸送は、着目の領域、例えばアミロブ ラストを標的するシグナルペプチドの使用によって達成することができる。シグ ナルペプチドをコードするＤＮＡは、一般に１または複数のプロモーター配列の ３′側で且つＣＧＴ構造遺伝子の５′側に挿入される。シグナルペプチドとプロ セシングシグナルは、細胞質中で発現されそして着目の領域に輸送される任意の 植物タンパク質から誘導することができる。

所望のシグナルペプチドは、特定のタンパク質からの伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に よりコードされるアミノ酸配列を成熟生産物の配列と比較することによって同定 することができる。開始コドン（通常はメチオニン）で始まるｍＲＮＡによりコ ードされそして成熟タンパク質に欠けているアミノ酸配列は、通常はシグナル配 列であろう。

加えて、それらの輸送能力を保持している生来のシグナル配列の断片を使うこと もてきる。本発明において使われるシグナルペプチドは、シグナルペプチドに連 結されたタンパク質を着目の宿主領域への輸送することのできる配列であり、そ のようなものとしては、生来のシグナルペプチド全体、またはそれの機能性断片 もしくは変異体が挙げられる。あるいは、有用な開裂部位を提供するために、シ グナルペプチドをコードするＤＮＡを、別種の成熟タンパク質をコードするＤＮ Ａと組み合わせて使うことができる。この組合せは、同−源からのＤＮＡ、また は２以上の異なる源からのＤＮＡ、例えば大豆からのシグナルペプチドとエント ウからの成熟タンパク質を含むことができる。本発明の態様では、リブロースニ リン酸カルボキシラーゼ（ＲｕＢｉＣｏ）小サブユニット（ＳＳＵ）タンパク質 からのシグナルペプチドをコードするＤＮＡを、エントウ由来の成熟小サブユニ ット（ＳＳＩＪ）タンパク質の１６アミノ酸をコードするＤＮＡと組み合わせて 使用する。あるいは、大豆シグナルペプチドを、エントウ由来のＳＳＵタンパク 質の１アミノ酸をコードするＤＮＡと組み合わせて使うことができる。

転写および／または翻訳終結調節領域は、開始領域を得た構造遺伝子の３′領域 から、または全く別の構造遺伝子から誘導することができる。終結領域は植物遺 伝子またはＴｉ−プラスミドに関連する遺伝子、例えばツバリンシンターゼ（ｎ ｏｓ）終結領域から誘導することができる。

ＣＧＴ構造遺伝子配列を含む種々のＤＮＡ配列は、従来の方法で一緒に連結せし めることができる。該配列をクローニングし、そして適切な方向で連結せしめ、 植物宿主中での構造遺伝子の構成的発現に備えることができる。

配列を合成しそしてそれらの配列を一緒に組み立てる方法は文献において十分に 確立されている。構造遺伝子転写解読枠の一部が合成されそして一部が天然源か ら誘導される場合、合成部分は２つの天然部分の間の橋として働くことができ、 または３′末端および／または５′末端を提供することができる。特にシグナル 配列と特定のＣＧＴをコードする転写解読枠が異なる遺伝子に由来する場合、普 通は合成アダプターが使われるだろう。他の場合、種々の断片が異なる制限部位 のところで挿入されるかまたはポリリンカー中の配列と置換される場合、ポリリ ンカーを使用することができる。

ｌまたは複数のプロモーターを構造遺伝子と連結せしめるために、構造遺伝子の 上流の５′非コード領域をエンドヌクレアーゼ制限によって除去することができ る。便利な制限部位が構造遺伝子の５′末端付近にある場合、構造遺伝子を制限 し、そして構造遺伝子をプロモーター領域に結合するためにアダプターを使用す ることができ、ここで該アダプターは構造遺伝子の失われたヌクレオチドに備え る。

あるいは、便利な制限部位が存在しない場合、ＰＣＲを使って着目の配列の一端 または両端に便利なりローニング用の部位を付加することができる。

本発明の一観点によれば、植物宿主細胞中での異種遺伝子の発現を指令すること のできるプロモーターの調節支配下に、デンプンをオリゴ糖に変換することので きる少なくとも１つのＣＧＴ酵素をコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現カセ ットを用いて、宿主植物細胞が形質転換される。前記ＤＮＡ配列は、着目の組織 の内部の特定領域への標的に備えて、植物宿主により認識されるシグナルペプチ ドをコードするＤＮＡ配列を含むこともできる。

発現カセットを開発する際に、調節領域と転写解読枠を含む様々な断片を種々の プロセシング条件、例えば連結、制限酵素消化、切除、試験管内突然変異誘発、 プライマー修復、リンカ−やアダプターの使用、等にかけることができる。よっ て、調節領域および／または転写解読枠中に使用するＤＮＡ上にヌクレオチドの トランジション、トランスバージョン、挿入、欠失等を実施することができる。

従って発現カセットは全部または一部が天然源に由来し、そして全部または一部 が宿主細胞と相同の源または宿主細胞と非相同の源に由来することができる。更 に本発明の種々のＤＮＡ構成物（ＤＮＡ配列、ベクター、プラスミド、発現カセ ット）は、単離されそして／または精製されるか、あるいは合成され、よって「 天然」ではない。

通常は発現カセットの作製の間に、ＤＮＡの種々の断片が適当なりローニングベ クター中でクローニングされるだろう。このクローニングベクターはＤＮＡの増 幅、ＤＮＡの変更または配列、リンカ−等の連結もしくは除去による操作に備え る。通常、使用するベクターは、発現系、例えばＥ８　コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ ）中で少なくとも比較的高いコピー数に複製することができるであろう。

植物中への発現構成物の導入方法に依存して、別のＤＮＡ配列が必要となること がある。一般に、発現カセットは、単離、配列決定、分析等の目的での発現カセ ットのクローニングを考慮に入れるように、原核生物、特にＥ、コリ中で機能的 な複製系に連結されるだろう。複製系と一緒に含まれるのは、通常は宿主中での 選択を考慮に入れることができるｌまたは複数のマーカーであろう。そのような マーカーは通常、殺生物剤耐性、例えば抗生物質耐性、重金属耐性、細胞毒耐性 、補完等を包含する。ＤＮＡ構成物が宿主細胞中にマイクロインジェクトされる 場合、注入したＤＮＡが組み込まれて機能的となったそれらの細胞の選択を考慮 に入れたマーカーが望ましい。

よって、植物宿主中で検出することができるマーカーが選択されるだろう。

多数のベクターがクローニングのために容易に入手可能であり、そのようなベク ターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３シリーズ等が挙げられる。

選択されたクローニングベクターは、通常、形質転換体の選択に備える１または 複数のマーカーを有するだろう。ベクターとカセットの適当な制限により、そし て適当ならば末端の変更により、平滑末端に備える突出端のチューイングバック またはフィルインにより、リンカ−の付加により、テールを付けることにより、 発現カセットまたはその成分へのベクターの結合と連結のために相補的末端を提 供することができる。

カセットの作製におけるＤＮＡの各操作後に、プラスミドをクローニングしそし て単離し、必要であれば、特定のカセット成分をその配列に関して分析して所望 の配列が得られていること、および該配列が適切な様式で連結されていることを 確かめるだろう。操作の性質に応じて、適当であれば、所望の配列をプラスミド から切り出して異なるベクター中に導入することができ、またはプラスミドを制 限して発現カセット成分を操作することができる。クローニング用の種々のＤＮ Ａ構成物（プラスミドまたはウィルス）によるＥ。

コリの形質転換の方法は、本発明にとって重要でない。接合、形質導入、トラン スフェクションまたは形質転換、例えば塩化カルシウムまたはリン酸カルシウム 媒介形質転換を様々に使用することができる。

ＣＧＴ構造遺伝子を含むＤＮＡ配列は、次いで適当な宿主細胞中への導入のため 広範囲の別のＤＮＡ配列に連結することができる。

この提携配列は、宿主の性質、宿主中にＤＮＡ配列を導入する方法、およびエピ ソーム維持と組み込みのいずれが所望されるかに大部分依存するだろう。

あるいは、構造遺伝子を導入することができる鋳型ウィルスを植物宿主中への導 入に使用してもよい。植物宿主により認識されない調節シグナルを有する源から 構造遺伝子を得た場合、発現のために適当な調節シグナルを導入することが必要 であるかもしれない。

ウィルスまたはプラスミド、例えば腫瘍誘発プラスミドが使用されそしてマツピ ングされている場合、プロモーターから下流にある制限部位を選択することがで き、その制限部位の中にプロモーターから適当な距離において構造遺伝子を挿入 することができる。ＤＮＡ配列が適当な制限部位を提供しない場合、該ＤＮＡ配 列の後方部分をエキソヌクレアーゼ、例えばＢａ１３１で様々な時間消化し、そ して合成制限エンドヌクレアーゼ部位を挿入することができる。ウィルスおよび プラスミドを植物中に導入する方法は文献中に記載され特に着目されるのは、Ｃ ＧＴ構造遺伝子を植物細胞の染色体中に組み込むことができる腫瘍誘発性プラス ミド、例えばＴｉまたはＲｉの使用である。Ｔｉ−ＤＮＡの右および左ボーダー を使用し、このボーダーが植物宿↓により認識される転写および翻訳調節シグナ ルの支配下にＣＧＴ構造遺伝子を含んで成る挿入断片を隣接することにより、該 構成物が植物ゲノム中に組み込まれ、分化の様々な段階で植物細胞中でのＣＧＴ の発現に備えることができる。

本発明の構成物は、様々な方法で種々の植物宿主中に導入することができ、そし て例えば、エピソーム要素として存在するかまたは宿主染色体中に組み込むこと ができる。例えば、該構成物の部分としての構造遺伝子は、宿主ゲノム中への組 換えによる組み込みのため、マイクロピペットインジェクションにより植物細胞 核中に導入することができる。本発明の形質転換植物は、ＤＮＡの試験管内付加 を経験した細胞並びに付加されたＤＮＡを育する子孫を包含する。

ここで植物細胞とは、個々の細胞、組織化された植物または組織化されていない 組織、植物部分および植物全体を意味する。植物細胞は、アグロバクテリウム（ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）との共存培養、エレクトロポレーション、プロ トプラスト融合、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルでの衝 撃等により、試験管内で形質転換せしめることができる。

アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｓ　）中に形質転換され得る植物形質転換に使われるプラスミドは 、しばしばバイナリ−ベクターと呼ばれる。バイナリ−ベクターは、転写調節領 域に加えて、Ａ、ツメファシェンスからのＴｉプラスミドの左ボーダーおよびよ り好ましくは少なくとも右ボーダーを含むことができる。該ベクターは、いずれ かの宿主中で複製することかできるようにＥ、コリとアグロバクテリウム中で活 性な複製開始点を含んでもよい。バイナリ−ベクターを担持している宿主細胞の 選択を考慮に入れるために、選択マーカーを該ベクターのその他の成分（即ちＤ ＮＡ構成物）に連結することができる。このマーカーは、好ましくは抗生物質耐 性マーカー、例えばゲンタマイシン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ア ンピシリン等に対する耐性をコードする遺伝子である。

アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）属には、植物において根 頭癌腫を引き起こすＡ、ツメファシェンス種、および植物において毛根病を引き 起こすＡ、リゾゲネシス種が含まれる。Ａ、ツメファシェンスの毒性はＴｉ（腫 瘍誘導）プラスミドに起因し、Ａ、リゾゲネシスの毒性はＲｉ（毛根誘導）プラ スミドに起因し得る。ＴｉおよびＲｉプラスミドは、宿主植物ゲノム中に組み込 まれるようになりそしてそこから腫瘍または毛根形成を誘導するＴ−ＤＮＡ（Ｔ ｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ＤＮＡ）と呼ばれる領域を有する。便宜上、それらのプ ラスミドは、腫瘍誘発または毛根形成を引き起こすＴ−ＤＮＡ領域の間の領域か 除去されるように「武装解除（ｄｉｓａｒｍｅｄ）」されてもよい。次いで、着 目のＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ領域の間に挿入することができる。そのような構成 物は一般に「発現構成物」と呼ばれる。

この新規ＤＮＡ配列を次いでＴ−ＤＮＡと一緒に植物ゲノムに組み込むと、その ゲノム中にこの着目のＤＮＡ配列を含む植物が得られる。

ＣＧＴ構造遺伝子を含むＤＮＡ構成物は、デンプンを生産する単子葉と双子葉植 物の両方の広範囲の植物中に導入することができる。

特に着目されるのは、望ましくは植物の少な（とも一部分に実質量の内因性デン プンを含む植物中へのＤＮＡ構成物の導入である。そのような宿主植物の代表例 としては、種子中に多量のデンプンを有小麦×ライ麦雑種）等〕、ワキシーコー ン、モロコシ（例えばＳｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ）および米（例えば叶ｙ ｚａ　５ａｔｉｖａ）　、板構造物中に多量のデンプンを有する植物、例えばジ ャガイモ〔例えば馬鈴薯茎中に多量のデンプンを有する植物、例えばヤシ〔例え ばヤシ科（Ｐａｌｍａｅ種）、サゴヤシ科（Ｃｙｃａｄａｌｅｓ種）〕が挙げら れる。デンプンは幾つかの草種果実、例えばトマト、リンゴ、セイヨウナシ等中 にも見つかる。

細胞が一度形質転換されれば、発現構成物と共同したマーカーを使ってトランス ジェニック細胞を選択することができる。発現構成物は普通、形質転換されない 細胞に対する形質転換された植物の選択を考慮に入れてそのようなマーカーと結 合されるだろう。上記の如く、マーカーは通常、抗生物質、例えばカナマシン、 ゲンタマイシン、ヒグロマイシン等、または適度の濃度で植物細胞に毒性である 除草剤、例えばグリフォセート、に対する耐性を提供するだろう。

形質転換後、植物細胞を適当な培地中で増殖させることができる。

プロトプラスト形質転換の場合、適当な浸透圧条件下で細胞壁が再形成されるだ ろう。種子または胚芽の場合、適当な発芽またはカルス誘導培地が使われるだろ う。外植片での形質転換には、適当な再生培地が使われるだろう。

形質転換細胞から生じたカルスは、苗条と根の形成に備える栄養培地中に導入さ れ、そして生じた小植物を栽植し、種子まで生育させる。生育中に、組織を収穫 しそして発現構成物の発現産物の存在についてスクリーニングすることができる 。生育後、形質転換された宿主を収集し、再栽植する。次いで】または複数世代 生育してＣＧＴ構造遺伝子がメンデルの法則に従って遺伝することを確立するこ とができる。

宿主植物の組成を変更することができることは、植物生産物の性質を変更する手 段を与える。本明細書中で使用する時、「植物生産物の組成を変更する」とは、 グルコビラノース単位を含んで成るオリゴ糖による内因性デンプンの置換を期待 する。次いでそれらのオリゴ糖、例えばシクロデキストリンを、他の植物成分か ら精製分離することができる。例えば、選択したＣＧＴを発現する機能的構造遺 伝子を導入することによって作物の植物細胞を変更することにより、シクロデキ ストリンを生産する能力を有する多種多様な作物を提供することができ、そして 望ましくはそのような生産は宿主植物の農業形質を損なうことなく行われるだろ う。こうして、宿主植物におけるデンプン分解の有害作用を最小にしながら、シ クロデキストリンの生産のための原料と労力の相当な節約を達成することができ る。

好ましくは、該遺伝子産物の活性は、宿主植物のデンプン貯蔵細胞小器官、組織 または領域、例えば宿主ジャガイモ塊茎のアミロブラスト中に限局化されるだろ う。ＣＧＴ構造遺伝子は、遺伝学的に変更された宿主植物またはその細胞の少な くとも一部分におけるシクロデキストリンの生産を媒介することにより、その活 性を発揮するだろう。

下記の実施例は、本発明の幾つかの好ましい態様と観点を例示するためのもので あり、その範囲を限定するものと解釈してはならない。

実験 以下の実験の開示において、異なって指摘されない限り、全ての重量はダラム（ ｇ）、ミリグラム（ｍｇ）　、マイクログラム（μｇ）またはボンド（ｌｂ）で 与えられ、全ての濃度は重量パーセント（％）、モル（Ｍ）、ミリモル（ｍＭ） またはマイクロモル（μＭ）で与えられ、そして全ての容量は立方フィート（ｆ ｔ３）、リットル（１）またはミリリットル（ｉｔ’）で与えられる。

本発明に従ったＣＧＴ化合物の利用を証明するために、下記の例はＣＧＴ構造遺 伝子ＤＮＡ構成物の作製および植物発現系へのそのような構成物の導入を説明す る。

一ゼ（ＣＧＴ）遺伝子のコード領域の単離、およびその後のクロ−ニングのため の該コード領域の操作を記載する。

で−晩増殖させることにより、クレブシェラ・ニューモニエＭ５Ａｌ（Ｂｉｎｄ ｅｒら、Ｇｅｎｅ　（１９８６）　４７：２６９−２７７）から全ゲノムＤＮＡ を調製する。４５００　Ｘ　ｇで１０分間の遠心により細菌をペレット化し、上 清を捨て、そしてペレットを２．５ｒｄの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　１ｍＭ　ＥＤ ＴＡ緩衝液に再懸濁する。攪拌しながらこの懸濁液に５■／−のプロナーゼ（Ｐ ｒｏｎａｓｅ　＠）プロテアーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｒａｎｄ　Ｂｉ６ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　：Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）溶液５００μｌと２％ラウ リル硫酸ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ　；　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）　２ｒ ｎｉを添加し、懸濁液を３７°Ｃで５０分間インキュベートする。透明な溶液は 細菌が溶解したことを示す。次いでこの溶液を５−のフェノール、次に５−のフ ェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）　、その後 ５−のクロロホルムで抽出する。１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２容の１０ ０％エタノールを用いて水相から核酸を沈澱させ、そして試験管を室温で１時間 インキュベートする。溶液から核酸を取り出し、１艷の水に再懸濁する。２回目 のエタノール沈澱を行い、核酸を２００μｌのｌＯｍＭＴｒｉｓ、　１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ緩衝液中に再懸濁する。

Ｋ、ニューモニエの２　ｋｂシクロデキストリングリコシルトランスリゴヌクレ オオチドブローブを、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ａ　ＤＮ Ａ合成装置（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ　）上で製造業者の教示に従って 合成する。詳しくは、プローブは下記のものであるニジ加圧 ５ｔｒ３　：　５’　ＡＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＴＡＧＧＡＣＴＡＧＡＴＡＡ ＴＧＡＡＡＡＧＡＡ　３’（配列番号１０） Ｋ、ニューモニエの核酸調製物をＲＮアーゼで処理し、そのＤＮＡを鋳型とし、 ５ｔｒ３と５ｔｒ４をプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） に使う。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ　（Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ） 熱循環器を製造業者の試薬と共にそして製造業者の教示に従って使用する。反応 混合物は、４１，５μｌのＨｚＯ，１０，ＣＺ　ｌのＩＯＸ反応緩衝液、１６μ ｉ’のｄＮＴＰ　［１，２５ｍＭ　ｄＣＴＰ、　ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ　＆　ｄ ＴＴＰ］　、５　ａ　Ｉ！のｓｔｒ３（２０ｍＭ）、５μｍの５ｔｒ４　（２０ ｍＭ）　、　２２ａ　ｌの全に、ニューモニよりＮＡ　（０，０５ａｇ／μｌ） および０．５μｌのｍポリメラーゼを含む。反応は９４°Ｃで１分間の融解（変 性）、３７°Ｃで２分間のアニーリング（ハイブリダイゼーション）および７２ °Ｃで３分間の鎖伸長を使って１５サイクル間行う。次いで９４°Ｃで１分間の 融解、３７℃で２分間のアニーリング、および最初は７２℃で３分１５秒である が最後のサイクルが５分４５秒であるように各サイクル１５秒ずつ時間を増加さ せながらの鎖伸長を使って追加の１０サイクル間反応を実施する。

得られたＰＣＲ生成断片（〜２　ｋｂ）をＷｌとｈｆｆｌＨＩで消化し、そして ｐＣＧＮ６５α３Ｘ（下記参照）のＳａ　１　［／　ＢａｍＨＩ消化物中に連結 せしめる。ｐＣＧＮ６５α３ｘを含む形質転換されたＥ、コリＤＨ５α細胞（Ｂ ＲＬ　；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）を、１．／Ｋｌを充満させそして コロニーの縁の周りからのデンプンの透明化を評価することにより、１％デンプ ンプレート（ＥＣＬＢ＋１％デンプン）上でスクリーニングする。

クローンｌは良好な透明帯を示したので、これを４Ｉと１【で消化し、そして鋤 ■と鎖遅で消化されたｐＵｃ１９　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら、譚朋（１９８５） ２６：１０１−１０６　：　Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ら、Ｇｅｎｅ　（ １９８５）　３３：１０３−１１９）中に連結せしめ、プラスミドｐＣＧＴ２　 （〜４．５　ｋｂ）を得た。ｐＣＧＴ２の配列分析（図４八と配列番号６〜７） は、ＣＧＴ遺伝子全体に渡り無作為に分布した６つの一塩基置換を示した（９９ ．７％相同性）。これは３アミノ酸変化を引き起こした（図４Ｂ：配列番号８〜 ９）。

プラスミドｐＣＧＴ２を抽【で消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片（ フレノウ断片）で処理して平滑末端を生ぜしめ、そしてＢｇｌＩ［リンカ−と連 結せしめた。生じたプラスミドｐＣＧＴ４を、製造業者の教示に従って５ｅｑｕ ｅｎａｓｅ　＠　Ｄ　Ｎ　Ａ配列決定キット（Ｕ、Ｓ、　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　；　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）を使って配列決定し、次のような正し い読み枠を確かめた： 消化してＩａｃＺ’断片を遊離させ、フレノウ断片で処理して平滑末端にし、そ して慇］と５ｐｈｌで予め消化され次いでフレノウ断片で処理されているｐＣＧ Ｎ５６５ＲＢ−Ｈ＋Ｘ　（下記参照）中に１３Ｈｚ’含有断片を連結せしめ、プ ラスミドｐＣＧＮ５６５ＲＢα３Ｘを得る。ｐＣＧＮ５６５ＲＢα３Ｘては、里 プロモーターはＴ−ＤＮＡ右ボーダーに関して遠位である。適当な宿主上で平板 培養した時に２つのクローンとも１ａｃＺ’発現について陽性である。各クロー ンは、Ａｃｃｌ−Ｓｐｈｌ断片（座標１３８００−１３９８９）切片と里Ｚ′遺 伝子を含むｐＣＧＮ５６５ＲＢα３Ｘの７２８　ｂｐ狙■−猟工断片を、狙■と Ｘｈｏ　Ｉで消化されたｐＣＧＮ６５ΔＫＸ−３＋Ｘ中にクローニングし、ｐＣ ＧＮ６５ΔＫＸ−３ＥＸのＢｇｌＩ［−ＸｈｏＩ右ボーダー断片と置き換えテｐ ＣＧＮ６５　ａ　３Ｘを作製する。ｐＣＧＮ６５　ａ　３Ｘ（７）作製は、１９ ８９年７月１９日出願の同時係属米国出願第０７／３８２．１７６号に詳細に記 載されている。

トピンシンターゼ遺伝子の３′非コード領域に融合された約ｌ５５６ｈｐの５′ 非コード領域を含むオクトピン発現カセットを有する。

ｐＴｉ座標は３′領域について１１，２０７〜１２．８２３でありそして５′領 域について１３．６４３〜１５．２０８である（Ｂａｒｋｅｒら（１９８３）前 掲〕。プラスミドｐｃＧＮ４５１をＨｐａ　Ｉで消化し、そして合成油Ｉリンカ −ＤＮＡの存在下で連結してｐＣＧＮ５５を生ぜしめる。ｐＣＧＮ５５のＸｈｏ ＦＳｐｈＩ断片〔座［１３８００−１５２０８、アグロバクテリウム・ツメファ シェンスＴ−ＤＮＡのに連結せしめ、ｐｃＧＮ６０を得る。ｐｃＧＮ６０の１． ４　ｋｂ　ＨｉｎｄＩ［−加ＨＩ断片をＨｉｎｄｌｌＩとＢａｍＨｌで消化され たｐＳＰ６４　（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｉｎｃ、）中に連結せしめ、１）ＣＧＮ１ ０３９を得る。プラスミドｐｃＧＮ１０３９を漉■とμ更■で消化し〔座標１４ ２７３−１５２０８　（Ｂａｒｋｅｒら、　１９７７、前掲）を削除する〕、そ して合成りｇｌｌＩリンカ−ＤＮＡの存在下で連結してｐＣＧＮ１０３９ΔＮＳ を得る。ｐｃＧＮ１０３９ΔＮＳの０．４７ｋｂシ逓Ｒ１−現ｎｄＩ［断片をシ 四ＲＩ　と町ｎｄ■で消化されたｐＣＧＮ５６５中にクローニングし、ｐＣＧＮ ５６５ＲＢを得る。

で置き換え、ｐＣＧＮ５６５ＲＢ−Ｈ＋Ｘを生ぜしめる。

実施例２ニブラスミド輸送配列 この実施例はデンプン含有細胞小器官へのＣＧＴ遺伝子の輸送に使われるシグナ ルペプチドをコードするＤＮＡ配列の調製を記載する。

ＳＳＵ　＋ａｒｏＡシグナルペプチドの作製プラスミドｐｃＧＮ１１３２は、３ ５Ｓプロモーター−リブロースニリン酸カルボキシラーゼ小サブユニット（５’ 　−３５３−３ＳＵ）リーダーと、エントウａｒｏＡ配列からの４８　ｂｐの成 熟小サブユニット（ＳＳＵ）タンパク質〔５−エノールビルビル−３−ホスホシ ンキメートシンセターゼ（ＥＣ２，５，１，１９）をコードする遺伝子座〕とを 含む。それは、ハイブリッドＳＳυタンパク質遺伝子を含むプラスミドであって 、エントウからの成熟ＳＳＵタンパク質をフードするＤＮＡ、並びに該コードｔ ｍｌ　−３’配列を有するプラスミドであるｐｃＧＮｌ　１１５、およびクロラ ムフェニコール耐性遺伝子（Ｃａｍ’　）背景中に３５Ｓプロモーターを有する プラスミドであるｐｃＧＮ１１２９の調製に用いる〕。

切除する。生じたプラスミドｐｃＧＮ１０９４は、大豆クローンのシグナルペプ チドとエントウクローンの成熟部分を有するハイブリッド５ＳＬＩタンパク質を コードし、そして該コード領域の３′に５ｓｔｌとＥｃｏＲ１部位を有する。カ ナマイシン耐性遺伝子をコードするトランスホゾ９５−１３３）の同部位中にク ローニングし、ｐＤＳ７を得る。Ｋａｎ　’遺伝子の３′側のＢｇｌＩＩ部位を 消化し、Ｅ、コリＤＮＡポリメラーゼｌの大断片とデオキシヌクレオチド三リン 酸を用いてフィルインする。

ｐｃＧＮ１０９３を得る。プラスミドｐＰＭＧ３４．３を５ａｉｌで消化し、上 記と同様ば、ｐｃＧＮ１０９６ｔ；！　（５’　−３’　）次の関連する特徴を 有す６　：　５ＳＩＪ遺時係属米国出願第０６１０９７．４９８号にも詳細に記 載されている。

消化してＫａｎ’遺伝子を削除し、平滑末端を提供し、Ｔ４　ＤＮＡリガ一つＫ ａｎ’のコロニーから単離したＤＮＡをＢａｍＨ［と鋤Ｉで消化し、遺伝子の４ ８　ｂｐを保持しており（図１）、そして３′末端はｐｈｅ−ｇｌｕ−ｔｈｒ− １ｅｕ−ｓｅｒから成る。クローン７をＥ、コリア１−１８株（Ｙａｎｉｓｃｈ −Ｐｅｒｒｏｎら（１９８５）前掲〕中に形質転換せしめ、形質転換体から単離 したＤＮＡをジ±■とＣ１ａｒで消化し、成熟タンパク質の４８　ｂｐとａｒｏ Ａ遺伝子の５′末端を含む０．４５ｋｂ断片を除去する。プラスミドｐｃＧＮ１ １０６　（Ｃｏｍａｉ　ら、Ｊ、Ｒｉｏｔ、Ｃｈｅｍ、（１９８８）　２６３： 　１５１０４−１５１０９）も同様にＳｐｈ［とＣ１ａ［で消化し、そして６． ８ｋｂ単離ベクタ一断片をクローン７の０．６５ｋｂ断片と連結せしめ、ｐＣＧ Ｎ１１１５　（５’　−３５３−（Ｃｏｍａｉ　ら（１９８８）前掲〕および２ ５．６ｋｂプラスミドｐＣＧＮ５９４ＣＨｏｕｃｋら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｉ ｎ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｊｃｒｏｂｊｏｌｏｇｙ　（１９９０）　４：１−１７ 　）（ＬＢ−Ｇｅｎｔ’　−ｏｃｓ５’　−Ｋａｎ’　−ｏｃｓ３’　−ＲＢ） 　（ｐＣＧＮ５９４の作製は１９８９年７月１９日出願の同時係属米国出願環０ ７／３８２．８０２号に記載されている）をＨｉｎｄｌｌ［で消化し、そして− 緒に連結せしめて３２．８　ｋｂプラスミドｐｃＧＮ１１０９を得る（ＬＢ−Ｇ ｅｎｔ’　−３５Ｓ　−５ＳＵ　＋７Ｏ−ａｒｏＡ　−ｏｃｓ３’　−ｏｃｓ５ ’　−Ｋａｎ’　−ｏｃｓ３’　−ＲＢ）。

プラスミドＩ）ＣＧＮ１１０９をＥｃｏＲｒで消化し、ＳＳＵリーダー十成熟Ｓ ＳＵ遺伝子の７０　ｂｐ　、　ａｒｏＡ遺伝子およびそれのｏｃｓ３’ターミネ ータ−１ｐｃＧＮＩ　１８０からのＡｍｐ’背景並びにｐＣＧＮ５９４からのｏ ｃｓ５’　−Ｋａｎ’　−カー（ｄＣＣＴＣＧＡＧＧ）　ＣＮｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｉｎｃ、　：　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）をその中に連 結せしめ、ｐｃＧＮ１１２５　（ＬＢ−３５３−’ＲＢ）を得る。

されたＣａｍ　’ベクターｐＣＧＮ７８６と連結せしめる。ｐＣＧＮ７８６は、 制限消化部位ＥｃｏＲ１，５ａ１１．　ＢｇｌＩ［、Ｐｓｔｌ　Ｘｈｏｌ、　Ｂ ａｍＨ［およびＨｉｎｄＩ［Ｉを含む合成リンカ−をｐｃＧＮ５６６中に挿入す ることにより形成されたｐＵＣ由来のクロラムフェニコール耐性ベクターである （　ｐＣＧＮ５６６は、ｐＵｃ１３−ｃｍ　（Ｋ、　ＢｕｃｋｌｅＹ、　１９８ ５．　Ｐｈ、Ｄ、　Ｔｈｅｓｉｓ、サンディエゴのカリＥｃｏＲ［−Ｈｌｎｄｌ ｌ［リンカ−を含む〕。得られた３、２２ｋｂプラスミドｐｃＧＮ１１２８は、 Ｃａｍ　’背景中に３５Ｓプロモーターと３′マルチリン力■部位に変える。

開環させる。それらの２つの消化物を連結すると、５’−３５Ｓ−Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｉｎｃ、　：　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）と連結 せしめてプラスミドｐＣＧＴ４　（実施例１参照）とｐｃＧＮｌ　１３２ＳをＢ ａｍＨＥと５ａｌｔで消化し、−緒に連結せしめる。生じたプラスミドｐＣＧＴ ５は５′＝３５３−３ＳＵ　＋４８−ＣＧＴ　−３’を含む。

この実施例は、２種のジャガイモ品種からのパタチンー５′調節領域のクローニ ングおよびパタチン−５’　−ｎｏｓ−３’発現力セットであるＩ）ＣＧＮ２１ ４３とｐｃＧＮ２１４４の調製を記載する。更に、バクチン−３′調節領域のク ローニングおよびパラチン−５′−パタチンー３′発現カセットであるｐｃＧＮ ２１７３とｐｃＧＮ２１７４の調製も提供する。

Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｏｒｔｅ ｒ　（１９８３）　１（４）：１９−２１に記載された通りに、ジャガイモ（Ｓ ｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のＲｕ５ｓｅｔＢｕｒｂａｎｋ品種とＫｅ ｎｎｅｂｅｃ品種の葉からゲノムＤＮＡを単離する。ただし次の変更を伴う：約 ９ｇの生体重の葉組織を粉砕し、ポリトロン粉砕を行わず、そして最終段階にお いてＤＮＡを３００μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８中 に溶解する。ジャガイモのＭａｒｉｓ　Ｐｉｐｅｒ品種（Ｂｅｖａｎら、ＮＡＲ （１９８６）１４：４６２５−４６３８）から単離されたクラス■パタチン遺伝 子の５′の７０１１）ｐ断片（座標１６１１〜２３１２）の５′領域に相同な２ ４　ｂｐとＮｈｅｌ、　Ｐｓｔ［およびＸｈｏＩ消化部位を含む合成オリゴヌク レオチドｐａｔｔを合成する（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ　３８０ Ａ　ＤＮＡ合成装ｆｔ）。

前記７０１　ｂｐ断片の３′領域に相同な２５　ｂｐとＢａｍＨＩおよび５ｐｅ Ｉ消化部位を含む第二の合成オリゴヌクレオチドｐａｔ２も合成する。

鋳型としてジャガイモゲノムＤＮＡ、並びにプライマーとしてｐａｔｌおよびｐ ａｔ２を使って、製造業者の試薬を使って製造業者の教示に従って、Ｐｅｒｋｉ ｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ熱循環器中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実 施する。反応液は、６２．５μｌのＨ２Ｏ、ｌＯμｌのＩＯＸ反応緩衝液、１６ ｉのｄＮＴＰ　［１，２５ｍ１Ｊ　ｄＣＴＰ、　ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ　＆　ｄ ＴＴＰ］、５、Ｃ１のｐａｔｌ　（２０ｍＭ）　、５　ｔｔ　ｌのｐａｔ２　（ ２０ｍＭ）、ｌμｌのジャガイモゲノムＤ　Ｎ　Ａ　（３μｇ７μＩりおよび０ ．５μｌのごユボリメラーゼを含む。ＰＣＲは９４°Ｃで１分間の融解、３７° Ｃで２分間のアニーリングおよび７２°Ｃで３分間の鎖伸長を使って２５サイク ル間行う。得られたＰＣＲ生成断片（約７００　ｂｐ）をＮｈｅ［と…旧で消化 する。プラスミドｐｃＧＮ１５８６Ｎ　（５’　−Ｄ３５Ｓ−ＴＭＶΩ’　−ｎ ｏｓ　−３’　；　３５Ｓ領域の５′にμ＞ｅ１部位を有するｐｃＧＮ１５８６ 　（後述）〕をＮｈｅＩとＢａｍＨ［で消化してＤ３５Ｓ−Ω′断片を削除する 。Ｎｈｅｒ−ＢａｍＨ［消化されたｐｃＧ８１５８６Ｎ　（これはｎｏｓ−３’ 領域を含む）とＰＣＲ断片との連結は、着目のＤＮＡ配列の挿入のための５′領 域と３′領域との間に５ｐｅＩ、　ＢａｍＨＩ。

ｐｃＧＮ２１４３およびｐｃＧＮ２１４４と命名された２つのクローンの５′領 域を配列決定した。プラスミドｐｃＧＮ２１４３は、長さが７０２　ｂｐてあり 且つ生来の配列（Ｂｅｖａｎ　（１９８６）前掲により報告されたもの〕　（図 ２）に９９．７％相同である、Ｋｅｎｎｅｂｅｃバタチン−５′領域を有する。

Ｒｕ５ｓｅｔＢｕｒｂａｎｋ品種由来のｐｃＧＮ２１４４の５′領域は、長さが ６３６　ｂｐであり、１９７１位から２０４０位までの７１　ｂｐ欠失を含む。

Ｒｕ５ｓｅｔ　Ｂｕｒｂａｎｋクローンの残部は生来の配列（Ｂｅｖａｎ　（１ ９８６）前掲により報告されたもの〕（図３）に９７．０％相同である。

クラスＩバタチン遺伝子の３′側にある８０４　ｉｍｐ領域（Ｂｅｖａｎ　５０ ００〜５８０４）の５′領域に相同な２４　ｂｐを有する合成オリゴヌクレオチ を合成する。このオリゴヌクレオチドはＳｓｔ［制限酵素部位を含んた。

前記８０４　ｂｐ領領域３′領域に相同な２４ｂｐを有する第二のオリゴヌクレ オチドｐａｔ４　： ５’　ＡＣＧＡＣＧ滞歩ＴＣＧ赳ＣＡＴ赳ＴＧＣＡＴＡＴＡＡＧＴＴＣＡＣＡＴ ＴＡＡＴＡＴＧ　３’（配列番号１６） も合成した。それは地α、　Ｘｈｏ［およびＰｓｔ［酵素の消化部位を含む。

鋳型としてＲｕ５ｓｅｔ　ＢｕｒｂａｎｋジャガイモゲノムＤＮＡを使って、上 記の如くポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、９４゛Ｃで１分間の融解、４２° Ｃで２分間のアニーリングおよび７２°Ｃで３分間の鎖伸長を使って２５サイク ル間行う。製造業者の試薬を用いて製造業者の教示に従ってＰｅｒｋｉｎ−Ｅ１ ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ熱循環器を使う。詳しくは、反応液は、５３．５μｉのＨＪ 　、１０μｍのＩＯＸ反応緩衝液、１６μＡ’のｄＮＴＰ　［１，２５ｍＭ　ｄ ＣＴＰ。

ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ　＆　ｄＴＴＰ］、５μｆのｐａｔ３Ｓ　（２０ｍＭ）、 ５１４７のｐａｔ４　（２０ｍＭ）、ｌＯμｌのジャガイモゲノムＤ　Ｎ　Ａ　 （３μｇ／μｉ＞および０．５μｌのりユポリメラーゼを含む。得られた約８０ ０　ｂｐのＰＣＲ生成断片をＮｈｅｌと５ｓｔＩで消化し、そしてｐｃＧＮ１５ ８６Ｎ　（下記参照）中に連結せしめる。

ｐｃＧＮ２１５９と命名した１つのクローンの配列決定は、３′断片が長さ８２ ３　ｂｐてありそしてＢｅｖａｎが報告した配列（Ｂｅｖａｎ　（１９８６）前 掲〕に９３．６％相同であることを示した。

パタチンカセットｐｃＧＮ２１７３およびｐｃＧＮ２１７４のクローニングＫｅ ｎｎｅｂｅｃからの５′パタチン領域とＲｕ５ｓｅｔ　Ｂｕｒｂａｎｋからの３ ′パタチン領域とから成るｐｃＧＮ２１７３と命名されたバタチンカセットを、 次の断片の三元連結により作製した：　ｐｃＧＮ２１４３　（上記参照）のＮｈ ｅ　（−Ｓｓｔ［Ｋｅｎｎｅｂｅｃ　５　’パタチン断片、ｐｃＧＮ２１５９の ５ｓｔＩ−ＮｈｅＩ　Ｒｕ５ｓｅｔＢｕｒｂａｎｋ　３　’パタチン断片、およ びｐｃＧＮ１５９９のＮｈｅｌ−Ｎｈｅｌ　ｐＵｃ背景。

ｐｃＧＮ２１７４と命名された第二のパタチンカセットは、ｐｃＧＮ２１４４　 （上ｐｃＧＮ２１５９のＳｓｔ［−Ｎｈｅ［Ｒｕ５ｓｅｔ　Ｂｕｒｂａｎｋ　３ 　’パタチン断片およびプラスミドｐｃＧＮ２１１３　（６，１ｋｂ）は、二重 ３５Ｓプロモーター（Ｄ３５Ｓ）とｔｍｌ−３’領域を含み、その間に、アンピ シリン耐性遺伝子（Ａｍｐ’　）を持つｐＵＣ由来プラスミド背景中に含まれる 多重クローニング部位を有する。このプロモーター／　ｔｍｌカセットは、容易 な除去のため多重制限部位により隣接されている。プラスミドρＣＧＮ２１１３ を８ｃｏＲＩとＳａｃ　Ｉで消化して２．２ｋｂのｔｍｌ−３’領域を削除する 。プラスミドｐＢ［２２１，１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、Ｒ，Ａ、、Ｐｌａｎｔ　 Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（１９８７）　５：３８７−４０５）を ＥｃｏＲＩ　と５ａｃｌで消化して０．３ｋｂのｎｏｓ　−３’領域を削除する 。消化された１）ＣＧＮ２１１３とｐＢＩ２２１．１　ＤＮＡを一緒に連結せし め、そしてｐｃＧＮ２１１３のｔｍｌ−３’がｎｏｓ−３’により置き換えられ た生成４．２ｋｂ組換えプラスミドをｐｃＧＮ１５７５　（５’　−０３５Ｓ− ｎｏｓ−３′）と命名する。

プラスミドＰＣＧＮ１５７５を５ｐｈｒとＸｂａ　Ｉで消化し、フレノウ断片で の処理により平滑末端を作製し、その両端を一緒に連結せしめる。得られたプラ スミドｐｃＧＮ１５７７では、Ｄ３５Ｓプロモーターの５′側のシ史■。

Ｐｓｔｌ、　５ａｌｔおよびＸｂａ　１部位が削除されている。

プラスミドｐｃＧＮ１５７７をＥｃｏＲ［で消化し、フレノウ断片での処理によ り粘着末端を平滑にし、そして合成りｇｌ　Ｉ［リンカ−（ｄ（ｐＣＡＧＡＴＣ ＴＧ）Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｉｎｃ、　；　Ｂｅｖｅｒｌ ｙ、　ＭＡ）を中に連結せしめる。

ｎｏｓ−３’）は、５　’−ＥｃｏＲＩ、シ（ＩＩＩ、　Ｐｓｔ［、ＢｇｌＩ［ 、Ｐｓｔｉ、　ＢｇＩｎ、　ＥｃｏＲ［−３’から成る３′ポリリンカーを有す る。

ＢｇｌｌＩ、　Ｎｃｏｒ、　ＢａｍＨＩ、　５ａｉｌおよびＳａｃ　［制限部位 を含むタバコモザイクウィルスオメガ’　（ＴＭＶΩ’）＊域（Ｇａｌｌｉｅら 、ＭＡＲ（１９８７）１５をＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３８０Ａ ＤＮＡ合成装置上で合成し、そしてＢｇｌｌＩとシ旦【で消化する。プラスミド ｐｃＧＮ１５７７をＢａｍＨＩ　と５ａｃｒで消化し、５’−Ｄ３５Ｓとｎｏｓ −３’領域の間に合成ＴＭＶΩ′を連結せしめる。生じたプラスミドをｐｃＧＮ １５８６と命名する（Ｄ３５Ｓ−ＴＭＶΩ′−ｎｏｓ−３′）ｏプラスミドｐｃ ＧＮ１５８６Ｎは、ｐｃＧＮ１５８６をＨｉｎｄＩ［Ｉで消化しそしてフレノウ 断片を使って５′突出末端をフィルインしてＤ３５Ｓこの実施例は、（１）ジャ ガイモのＫｅｎｎｅｂｅｃ品種またはＲｕ５ｓｅｔ　Ｂｕｒ−ｂａｎｋ品種のい ずれかからのパラチン−５′領域、（２）大豆ＲｕＢ１５Ｃ。

ＳＳＵタンパク質からのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、（３１エントウ からの成熟ＲｕＢ１５Ｃｏ　ＳＳＵタンパク質の１６アミノ酸をコードす含むバ イナリ−ベクターの作製を記載する。

実施例３に記載のように調製したプラスミドｐｃＧＮ２１４３をシシ【と５ｓｔ ｆで消化し、このプラスミドをパラチン−５′領域とｎｏｓ　−３’領域との間 で開環せしめる。プラスミドｐＣＧＴ５　（実施例２参照）をＸｂａｌと５ｓｔ ｌで消化し、そしてｐｃＧＮ２１４３と連結せしめてｐｃＧＮ２１５１を得る。

プラスミドｐｃＧＮ２１５１は５　’　−Ｋｅｎｎｅｂｅｃパタチン−５ＳＵ　 ＋４８−ＣＰｓｔ［で消化されたｐｃＧＮ１５５８　（下記参照）と連結せしめ る。こうしてバイナリ−ベクターｐｃＧＮ２１６０ａとｐｃＧＮ２１６０ｂを与 える。

ｐｃＧＮ２１６０ａでは、５′−パタチンーＳＳＵ　＋４８　ｂｐ　−ＣＧＴ− ｎｏｓ−３′が３４Ｓ　−Ｋａｎ・−ｔｍｌ遺伝子と反対の方向で転写するよう にｐｃＧＮ１５５８中に挿入されている。ｐｃＧＮ２１６０ｂでは、５′−バタ チンーＳＳＵ　＋４８　ｂｐ　−ＣＧＴ−ｎｏｓ−３’が３５Ｓ　−Ｋａｎ’− ｔｏｉ１遺伝子と同じ方向で転写するようにｆｌｃＧＮ１５５ｇ中に挿入されて いる。

プラスミドｐｃＧＮ２１４４をＳｐｅ　ＩとＳｓｔ［で消化し、プラスミドをパ ラチン−５′領域とｎｏｓ　−３’領域との間で開環せしめる。プラスミドｐＣ ＧＴ５をＸｂａｌと５ｓｔｔで消化し、そしてｐｃＧＮ２１４４と連結せしめて ｐＣＧＮ２１５２を得る。プラスミドｐｃＧＮ２１５２は５　’　−Ｒｕｓｓｅ ｔ　Ｂｕｒｂａｎｋパタチン−５ＳＵ　＋４８−ＣＧＴ−ｎｏｓ　３’から成る 。プラスミドｐｃＧＮ２１５２をＰｓｔ［で消化し、里（で消化されたｐｃＧＮ １５５８　（下記参照）と連結せしめる。こうしてバイナリ−ベクターｐｃＧＮ ２１６１ａとｐｃＧＮ２１６１ｂを与える。ｐＣＧＮ２１６１ａでは、５′−パ タチン−５ＳＵ　＋４８　ｂｐ　−ＣＧＴ　−ｎｏｓ−３’が３５Ｓ　−Ｋａｎ ’−ｔｍｌ遺伝子と反対の方向で転写するようにｐｃＧＮ１５５８中に挿入され ている。ｐｃＧＮ２１６１ｂでは、５′−パタチンーＳＳＵ　＋４８　ｂｐ　− ＣＧＴ　−ｎａｓ−３’が３５３−　Ｋａｎ’−ｔａｉ１遺伝子と同じ方向で転 写するようにｐｃＧＮ１５５８中に挿入されている。

ｐｃＧＮ１５５８の作製 プラスミドｐｃＧＮ１５５８　（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ、 　Ｐｌａｎｔ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　（１９９０）　１４（２７）＋２６９−２７６）は、アグロバクテ リウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅ ｎｓ）オクトピンＴｉプラスミドｐＴｉＡ６　（ＣｕｒｒｉｅｒおよびＮｅ５ｔ ｅｒ、　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　（１９７６）　１２６：１５７−１６５　）の左お よび右Ｔ−ＤＮＡボーダー、ｐＰＨＩＪＩ　（ＨｉｒｓｃｈおよびＢｅｒｉｎｇ ｅｒ。

Ｐｌａｓｍｉｄ　（１９８４）　１２：１３９−１４１）のゲンタマイシン耐性 遺伝子（Ｇｅｎ’　）、ｐＬＪｂＢｌｌ　（Ｊｏｕａｎｉｎ　ら、Ｍｏ１．　Ｇ ｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、（１９８５）　２０１：３７０−３７４　）からのアグロ バクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅ ｓ）Ｒｉプラスミド複製開始点、形質転換植物にカナマイシン耐性を付与するこ とができる３５Ｓプロモーター−Ｋａｎ’　−ｔｍｌ　−３’領域、ｐＢＲ３２ ２（Ｂｏｌｉｖａｒら（１９７７）前掲〕からのＣｏ１Ｅ１複製開始点、および ｐＵｃ１８　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら（１９８５）前掲）からの１ａ ｃＺ’スクリーニング可能マーカー遺伝子を含む。ｐｃＧＮ１５５８の作製は、 １９９０年３月１６日出願の同時係属米国出願第０７／４９４．７２２号に記載 されている。

実施例５ニドランスジエニツク植物の調製この実施例は、本発明に従ったＣＧＴ 遺伝子ＤＮＡ構成物を用いたアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）の形質転換、および宿主細胞を 形質転換しそして生成植物がシクロデキストリンを生産できるようにするための そのようなＡ、ツメファシェンスと植物細胞との共存培養を記載する。

アグロバクテリウム・ツメファシェンスの形質転換アグロバクテリウム・ツメフ ァシェンス株２７６０　（ＬＢＡ４４０４としても知られる；　Ｈｏｅｋｅｍａ ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８３）　３０３：　１７９−１８０）の細胞を、Ｈｏ １ｓｔｅｒｓらの方法ＣＭａ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　（１９７８）　１ ６３：　１８１−１８７）を使って、バイナリ−ベクター、例えばｐｃＧＮ２１ ６０ａ、　ｐｃＧＮ２１６０ｂ。

ｐｃＧＮ２１６１ａおよびｐｃＧＮ２１６１ｂ　（実施例４に記載）により形質 転換せしめる。ＣＧＴ構成物を発現系中に移行させるために、形質転換されたＡ 、ツメファシェンスを植物の共存培養に使用する。

アグロバクテリウムをＡＢ培地（Ｉ！あたり：　６　ｇ　Ｋ２ＨＰＯ４，２，３ ｇＮａＨ＊ＰＯ４−ＨｉＯ，２ｇ　ＮＨ４Ｃｌ　、　３　ｇ　ＫＣＩ　、５　ｇ グルコース、２．５■ＦｅＳＯ４，２４６■ＭｇＳＯ４、！４．７ｎｇ　ＣａＣ １ｚ、１５ｇ寒天）　＋１００　ｔｔｇ／ｌの硫酸ゲンタマイシンおよび１００ μｇ／ｆの硫酸ストレプトマイシン中で４〜５日間増殖させる。単一コロニーを １ＯｒＩＬｌのＭＧルブロス（Ｉ！あたり　５ｇマンニトール、ＩｇＬ−グルタ ミン酸または１．１５ｇグルタミン酸ナトリウム、ｏ、５　ｇ　ＫＨｚＰＯ，， ０，１０ｇ　ＮａＣ１、０，ｔｏ　ｇ　Ｍｇ５Ｏａ・７１（２０，１μｇビオチ ン、５ｇ）リブトン、２．５ｇ酵母エキス：ｐＨを７．０に調整）中に接種し、 そして振盪話中で３０°Ｃ，１８０ｒｐｍで一晩インキユベートする。共存培養 前に、アグロバクテリウム培養物を１２．０００　Ｘ　ｇで１０分間遠心し、そ して２０ｄのムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地（＃５２０−１１１８．　Ｇｉｂ ｃｏ　：　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）中に再懸濁する。

ジャガイモ細胞との共存培養 ＭＳ塩類（＃５１０−１１７．　Ｇｉｂｃｏ　：　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、 　ＮＹ）、１．０■／Ｉ；！のチアミン−ＭＣＩ　、　０．５■／ｌのニコチン 酸、０．５■／ｉのピリドキシン−ＭＣＩ　、３０　ｇ／ｌのショ糖、５μＭの ゼアチンリボシド、３μＭの３−インドールアセチル−ＤＬ−アスパラギン酸を 含む０．８％寒天同時培養培地（ｐＨ５，９）上に０．５１ｎｉのタバコ懸濁培 養物（〜１０’細胞／ｍＩ）をピペットで移すことにより、フィーダープレート を調製する。フィーダープレートは１日前に調製し、２５℃でインキュベートし ておく。タバコ細胞を１日増殖させた後、その上に無菌の３Ｍ濾紙ディスクを置 く。

収獲後ｌ〜６カ月のジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｓｏｕｍ）　Ｒｕ ５ｓｅｔＢｕｒｂａｎｋ品種とＫｅｎｎｅｂｅｃ品種の塊茎の皮をむき、蒸留水 で洗浄する。

その後の全段階は無菌棟術を使ってフローフード中で実施する。表面滅菌のため 、１００　ｄあたり２滴のＩｖｏｒｙ　＠液体石鹸を加えた１０％市販漂白剤（ 過塩素酸ナトリウム）溶液中に１０分間塊茎を浸す。塊茎を無菌蒸留水で６回す すぎ、褐変を防ぐために無菌の液体ＭＳ培地（＃１１１８．　Ｇｉｂｃｏ　：　 Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）中に浸漬しておく。

ジャガイモ塊茎の支柱をｌａｌ＋のコルクポーラ−でくり抜き、その支柱を所望 の厚さにスライスすることにより、塊茎ディスク（厚さ１〜２ｍｍ）を調製する 。完全に湿潤するまで、着目のパイナリーベフターを含む形質転換Ａ、ツメファ シェンスの液体ＭＳ培地培養物（ＩＸＩＯ’〜ｌＸｌ０’細菌／−）中に該ディ スクを置く。ディスクを無菌のペーパータオル上で吸い取らせることにより余分 な細菌を取り除（。該ディスクをフィーダープレート上で細菌と一緒に４８時間 共存培養し、次いで再生培地（共存培養培地＋５００■／ｌのカルベニシリンお よび１００■／ｌのカナマイシン）に移す。３〜４週間のうちにディスクから苗 条が発生する。

苗条が約１ａｏになった時、それらを切り取り、ＭＳ塩、１．０■／１のチアミ ン−ＭＣＩ　、０．５■／ｉのニコチン酸、０．５■／ｌのピリドキシン−ＨＣ ｌ　、　３０　ｇ／ｉのショ糖、２００■／ｌのカルベニシリンおよび１００〜 ２００■／ｌのカナマイシンを含む０．８％寒天発根誘導培地に移す。植物から ２回発根させ、高レベルのカナマイシン（２００■／ｌ）を有する発根誘導培地 上では少なくとも１つの発根が起こる。２回発根した植物を、次いでＮＰＴ［［ プロット活性アッセイ（Ｒａｄｋｅ、　Ｓ、Ｅ、ら、Ｔｈｅｏ、　Ａｐｐｌ、　 Ｇｅｎｅｔ、　（＋９８８）　７５：６８５−６９４）を実施することにより、 形質転換されていることを確かめる。ＮＰ［ｒ活性について陽性でない植物を捨 てる。

セルロース上でポリ（Ａ）”　ＲＮＡを精製する（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８ ２）前掲、により記載された通りに）。ＲＮＡ変性ゲルを流し、ブロッティング する（Ｆａｃｃｉｏｔｔｉ　ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１９８５） 　３：　２４１−２４６により記載され通りに〕。各レーンに当量のポリ（Ａ） ”　ＲＮＡを負荷する。ＣＧＴ遺伝子を含むｐＣＧＴ４の１．９　ｋｐ　Ｂａｍ ＨＩ断片をハイブリダイゼーション用プローブとして使用する。該断片はＧｅｎ ｅ　Ｃ１ｅａｎ■キツト（Ｂｉｏ　１０１．　Ｉｎｃ、；　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、 　ＣＡ）を使ッテ製造業者ノ教示ニ従ってアガロースゲルから単離することがで きる。ニックトランスレーションとハイブリダイゼーションを実施する（　Ｓｈ ｅｗｍａｋｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（１９８５）　星２８１−２８８により 記載された通りであるが、ただし洗浄は５５°Ｃて行う〕。洗浄したプロットを Ｋｏｄａｋ　＠　Ｘ−ＯＭａｔ　”ＡＲＸ線フィルム（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　 ＮＹ）上で一７０℃においてオートラジオグラフ処理する。

ｐｃＧＮ２１６０ａ、　ｐｃＧ８２１６１ｂまたはｐｃＧＮ２１６１ｂのうちの １つで各々形質転換されたＲｕ５ｓｅｔ　Ｂｕｒｂａｎｋジャガイモのオートラ ジオグラムは、形質転換体試料レーンの各々においてバンドを示した。そのバン ドはサイズが２．３ｋｂであり、ＣＧＴ伝令ＲＮＡのサイズと一致する。それら は、非形質転換対照からのＲＮＡを含むレーン中に存在するバンドではなかった 。

実施例６：植物からのシクロデキストリンの回収この実施例では、トランスジェ ニックジャガイモ塊茎中のシクロデキストリンの回収および検出を記載する。

地から生育室（２１″Ｃ１２５０〜３００μＥ／ｍ２／秒の光強度で１６時間の 光周期）へ次のように調製した土壌に移植する。約３４０ガロンについて、８０ ０ポンドの２０／３０砂（約１４立方フイート）、１６立方フイートのＦｉｓｏ ｎｓ”　Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｐｅａｔ　Ｍｏ５ｓＳ１６立方フイートの＃３ひる 石、および約４．５ボンドの水和石灰をＧｌｅａｓｏｎ　Ｏミキサー中で混合す る。ミキサー中で土壌を２時間蒸熱する；その混合物を１５分間間隔で約１５秒 間１時間に渡り混合して土壌全体への加熱を確実にする。蒸熱の最中とその後に 、土壌は少なくとも１８０°Ｆの温度に１時間達する。

次いで翌日までミキサー中で土壌をわかせる。その時点で、必要であれば水和石 灰を添加し、６．３０〜６．８０の範囲になるようにｐＨを調整する。

生育室の相対湿度を２〜４日間７０〜９０％に維持し、その後湿度を４０〜６０ ％に維持する。植物が土壌中に十分定着した時、約２週間口に、それらを温室に 移植する。植物を泥炭：パーライト：ひる石（１１：１：９）の土壌混合物の入 った６、５インチの鉢の中で、昼２４°Ｃ／夜１２°Ｃの平均温度において生育 する。日長は約１２時間であり、光強度レベルは約６００〜１０００μＥ／ｍ” ／秒の範囲内である。

温室への移植後１４週間目に植物から塊茎を収穫する。収穫直後に塊茎を洗浄し 、計量し、それらの比重を測定する。各形質転換体からの３つの代表的塊茎の皮 をむき、蒸留水で洗い、約０．５ｃｍの立方体に刻み、液体窒素中で素早く凍結 させ、そしてアッセイまで約−７０°Ｃで保存する。

シクロデキストリンの抽出 クロマトグラフィー用試料を調製するために、凍結した塊茎組織の立方体をコー ヒーミル（ＫｒｕｐＰ、　Ｃ１ｏｓｔｅｒ、　ＮＪ）中で粉末に粉砕する。各植 物をアッセイするために、塊茎からの抽出液を次のようにして調製する＝５ｇの 凍結ジャガイモ粉末を、５Ｔｎｌの２５％エタノールを使って、予め冷却した乳 鉢と乳棒で粉砕し、次いで少なくとも一晩−７０’Ｃで凍結させる。試料を８５ ００　Ｘ　ｇで１０分間遠心し、上溝をきれいな試験管に移し、１時間の回転蒸 発によりエタノールを除去する。

試料適用前に５−の１００％メタノール、次に５−の水で予め洗浄したＣ１８５ ＥＰ−ＰＡＫカラム（Ｗａｔｅｒｓ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｄｉｖ、 　：　Ｍｉｌｆｏｒｄ。

ＭＡ）中で組織試料からシクロデキストリンを分離する。試料を適用した後、該 カートリッジを１０ｒＩＬｌの蒸留水で洗浄して夾雑物を除去し、そして０．７ ５ｍ１の１００％メタノールを用いてシクロデキストリンを遊離せしめる（最初 の２滴は捨てる）。次いて試料を回転蒸発して乾固せしめ、２０μｌの３０％メ タノールに再溶解する。

シクロデキストリンの検出 ５ｚｅｊｔｌｉ　（Ｓｚｅｊｔｌｉ、Ｊ、　Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ　Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ　（１９８８）　２０−２２頁、　Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍ ｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｂｏｓｔｏｎ）により記載されたように薄層ク ロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行う。試料をシリカゲルＧプレー）　（＃０１０ １１．　Ａｎａｌｔｅｃｈ　；　Ｎｅｗａｒｋ、　ＤＢ　）上にスポットし、乾 燥する。ｎ−ブタノール−エタノール−水（４：３：３）混合物を用いて約３時 間の間１３〜１５ａｏの高さまでクロマトグラムを展開する。乾燥した後、プレ ートをヨウ素蒸気に５〜１０分間暴露してクロマトグラムを可視化する。

α−シクロデキストリン（α−ＣＤ）とβ−シクロデキストリン（β−ＣＤ）の 正の対照を、トランスジェニック組織試料と並んで展開させると、４枚のプレー トについての平均Ｒｆ値はα−ＣＤについて０．３９、β−ＣＤについて０．３ ６であった。α−ＣＤバンドは紫色光に染まり、一方β−ＣＤバンドは黄色に染 まった。２０個の形質転換植物からの塊茎組織をα−ＣＤとβ−ＣＤの存在につ いてスクリーニングした。８個のＲｕ５ｓｅｔ　Ｂｕｒｂａｎｋ植物（Ｒ８２１ ６０ｂ−１１，ＲＢ２１６０ｂ−７，ＲＢ２１６０ｂ−９，Ｒ８２１６０ｂ−２ ，ＲＢ２１６１ｂ−３，ＲＢ２１６１ｂ−５，ＲＢ２１６１ｂ−１１）からの塊 茎組織は、α−ＣＤ対照バンドと同じ色に染まり且つ同様なＲｆ値を有するバン ドを生じた。推定上のα−ＣＤバンドに加え云、２つの植物（ＲＢ２１６０ｂ− ７とＲ８２１６０ｂ−９）からの塊茎は、β−ＣＤ対照バンドと同様なＲｆ値と 色を有するバンドを生成した。

本発明の一観点によれば、適当な調節配列と一緒のシクロデキストリングリコジ ルトランスフェラーゼ構造遺伝子の取り込みによって、宿主植物によりシクロデ キストリンを生産させることができる。

更に、例えば本発明の方法におけるシクロデキストリンの生産に利用することが できるシクロデキストリングリコシルトランスフェラ−ゼをコードするＤＮＡ配 列が提供される。こうして、作物植物の育益性を高めるために、シクロデキスト リンを生産することができる植物が生育される。

本明細書中に引用された全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特 許出願が各々明確に且つ個別的に参考として組み込まれると指摘されたかのよう に、参考として本明細書中に組み込まれる。

明確化と理解の目的で上記の発明を説明と実施例により成る程度詳細に記載して きたけれども、本発明の精神および請求の範囲から逸脱することなく、本発明の 教示を考慮して幾つかの変更および改良を行い得ることは当業者にとって明白で あろう。

ト・・’　５：：５ ０　（ｊ　−Ｇ　０　＜　−＜　Ｏ＜　−＜　０　Ｅ−１−Ｅ−１０＜　−＜　 ＯＥ−！　−Ｅ−＋　ｇ　５　：５　０　Ｑ　−ＣＤ要　約　書 トランスジェニック植物中でのシクロデキストリンの生産本発明は植物中でのシ クロデキストリンの生産に向けられる。より詳しくは、植物の内因性デンプン貯 蔵物をシクロデキストリンに変換するであろうシクロデキストリングリコジルト ランスフェラーゼを発現することができるＤＮＡ配列を用いて宿主植物を好結果 に形質転換せしめることができることが発見された。

ｌＪｉ　祷　シリ　Ｉ　電　官 ＰＣＴ、ｌυ５９１１０６＋１６

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ酵素の発現をコードする ５′末端と３′末端を有する連続した配列と、前記シクロデキストリングリコシ ルトランスフェラーゼコード配列の５′末端または３′末端のいずれかに結合し た少なくとも１つの異種ＤＮＡ配列とを含んで成るＤＮＡ配列。
2. ２．前記コード配列がｃＤＮＡ配列である、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
3. ３．前記コード配列が、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｃｌｌａｐ ｎｅｕｍｏｎｅａｅ）のシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ酵素 の発現をコードする、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
4. ４．前記コード配列が、図４Ａに記載されたクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌ ｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｅａｅ）コード配列またはそれと等価の合成コ ード配列を含んで成る、請求項３に記載のＤＮＡ配列。
5. ５．前記コード配列が、植物宿主細胞中で機能的な複製系に結合されている、請 求項１に記載のＤＮＡ配列。
6. ６．前記異種ＤＮＡ配列が、宿主生物体中の少なくとも１つの分離した場所への 前記コード配列の発現産物の輸送を指令することができるシグナルペプチドをコ ードする配列を含んで成る、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
7. ７．マーカー配列を含む原核細胞において同定および選択が可能であるマーカー をコードするＤＮＡ配列を更に含んで成る、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
8. ８．５′→３′転写方向において、 ａ）植物細胞中で機能的な転写および翻訳開始領域；並びにｂ）シクロデキスト リングリコシルトランスフェラーゼ酵素の発現をコードする構造遺伝子 をコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構成物。
9. ９．前記転写および翻訳開始領域が、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏ ｓｕｍ）からのパタチン遺伝子の５′側の領域の少なくとも一部分を含んで成る 、請求項８に記載のＤＮＡ構成物。
10. １０．前記転写および翻訳開始領域が、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒ ｏｓｕｍ）のＫｅｎｎｅｂｅｃ品種からのものである、請求項９に記載のＤＮＡ 構成物。
11. １１．前記転写および翻訳開始領域が、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒ ｏｓｕｍ）のＲｕｓｓｅｔＢｕｒｂａｎｋ品種からのものである、請求項９に記 載のＤＮＡ構成物。
12. １２．ｃ）転写および翻訳終結調節領域を更に含んで成る、請求項８に記載のＤ ＮＡ構成物。
13. １３．ａ１）前記シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼコード配列 の５′末端に読み枠内において連結されたシグナルペプチドをコードするＤＮＡ 配列を更に含んで成り、前記シグナルペプチドは宿主生物体内の少なくとも１つ の分離した場所への前記シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼコー ド配列の発現産物の輸送を指令することができる、請求項８に記載のＤＮＡ構成 物。
14. １４．マーカー配列を含む原核細胞において同定および選択が可能であるマーカ ーをコードするＤＮＡ配列を更に含んで成る、請求項８に記載のＤＮＡ構成物。
15. １５．少なくとも１種の機能的なシクロデキストリングリコシルトランスフェラ ーゼ酵素を発現することができる請求項８のＤＮＡ構成物を含んで成る植物宿主 細胞。
16. １６．前記植物がトウモロコシ、穀実、ワキシーコーン、モロコシ、米、ジャガ イモ、タピオカ、アロールートおよびサゴヤシから成る群から選択される、請求 項１５に記載の植物宿主細胞。
17. １７．前記植物がトウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ）、小麦属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ 種）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅ）、パン小麦×ライ麦雑種（Ｔｒｉ ｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｕｍ×Ｓｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅ雑種）、モロコシ（Ｓ ｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ）、米（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）、馬鈴薯（Ｓｏ ｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａｂａｔａｔａｓ ）、ヤマノイモ科（Ｄｉｓｃｏｒｅａ種）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔｅｓｃ ｕｌｅｎｔａ）、クズウコン科（Ｍａｒａｎｔａｃｅａｅ種）、ソテツ科（Ｃｙ ｃａｄａｃｅａｅ種）、カンナ科（Ｃａｎｎａｃｅａｅ種）、ショウガ科（Ｚｉ ｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ種）、ヤシ科（Ｐａｌｍａｅ種）およびサゴヤシ科（Ｃ ｙｃａｄａｌｅｓ種）から成る群から選択される、請求項１５に記載の植物宿主 細胞。
18. １８．デンプン分解産物として少なくとも１種のシクロデキストリンを生産する ことができる植物。
19. １９．請求項８のＤＮＡ構成物を含んで成り、少なくとも１種の機能的なシクロ デキストリングリコシルトランスフェラーゼ酵素を発現することができる、請求 項１８に記載の植物。
20. ２０．前記植物がトウモロコシ、穀実、ワキシーコーン、モロコシ、米、ジャガ イモ、タピオカ、アロールートおよびサゴヤシから成る群から選択される、請求 項１８に記載の植物。
21. ２１．前記植物がトウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ）、小麦属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ 種）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅ）、パン小麦×ライ麦雑種（Ｔｒｉ ｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｕｍ×Ｓｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅ雑種）、モロコシ（Ｓ ｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ）、米（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）、馬鈴薯（Ｓｏ ｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａｂａｔａｔａｓ ）、ヤマノイモ科（Ｄｉｓｃｏｒｅａ種）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔｅｓｃ ｕｌｅｎｔａ）、クズウコン科（Ｍａｒａｎｔａｃｅａｅ種）、ソテツ科（Ｃｙ ｃａｄａｃｅａｅ種）、カンナ科（Ｃａｎｎａｃｅａｅ種）、ショウガ科（Ｚｉ ｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ種）、ヤシ科（Ｐａｌｍａｅ種）およびサゴヤシ科（Ｃ ｙｃａｄａｌｅｓ種）から成る群から選択される、請求項１８に記載の植物。
22. ２２．前記シクロデキストリンがａ−シクロデキストリン、β−シクロデキスト リンおよびΥ−シクロデキストリンから成る群から選択された少なくとも１つの メンバーを含んで成る、請求項１８に記載の植物。
23. ２３．植物中でシクロデキストリンを生産させる方法であって、ａ）５′→３′ 転写方向において、 ｉ）植物細胞中で機能的な転写および翻訳開始領域：並びにｉｉ）少なくとも１ 種のシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする構造遺 伝子を含んで成るＤＮＡ構成物を用いて、少なくとも１種の植物宿主細胞を改変 し、ここで前記ＤＮＡ配列は前記植物宿主の転写調節下にあり；そして ｂ）前記ＤＮＡ構成物を含む植物宿主を、シクロデキストリン生産量のシクロデ キストリングリコシルトランスフェラーゼの発現を許容する条件下に維持する ことを含んで成る方法。
24. ２４．前記転写および翻訳開始領域が、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒ ｏｓｕｍ）からのパタチン遺伝子の５′側の領域の少なくとも一部分を含んで成 る、請求項２３の方法。
25. ２５．前記転写および翻訳開始領域が、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒ ｏｓｕｍ）のＫｅｎｎｅｂｅｃ品種からのものである、請求項２４の方法。
26. ２６．前記転写および翻訳開始領域が、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒ ｏｓｕｍ）のＲｕｓｓｅｔＢｕｒｂａｎｋ品種からのものである、請求項２４の 方法。
27. ２７．前記ＤＮＡ構成物が、 ｉａ）前記シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼコード配列の５′ 末端に読み枠内において連結されたシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を 更に含んで成り、前記シグナルペプチドは宿主生物体内の少なくとも１つの分離 した場所への前記シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼコード配列 の発現産物の輸送を指令することができる、請求項２３の方法。
28. ２８．前記ＤＮＡ構成物が、 ｉａ）転写および翻訳終結調節領域 を更に含んで成る、請求項２３の方法。
29. ２９．前記植物宿主がトウモロコシ、穀実、ワキシーコーン、モロコシ、米、ジ ャガイモ、タピオカ、アロールートおよびサゴヤシから成る群から選択される、 請求項２３の方法。
30. ３０．前記植物宿主がトウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ）、小麦属（Ｔｒｉｔｉｃ ｕｍ種）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅ）、パン小麦×ライ麦雑種（Ｔ ｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｕｍ×Ｓｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅ雑種）、モロコシ （Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ）、米（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）、馬鈴薯（ Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｃｒｏｓｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａｂａｔａｔ ａｓ）、ヤマノイモ科（Ｄｉｓｃｏｒｅａ種）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔｅ ｓｃｕｌｅｎｔａ）、クズウコン科（Ｍａｒａｎｔａｃｅａｅ種）、ソテツ科（ Ｃｙｃａｄａｃｅａｅ種）、カンナ科（Ｃａｎｎａｃｅａｅ種）、ショウガ科（ Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ種）、ヤシ科（Ｐａｌｍａｅ種）およびサゴヤシ科 （Ｃｙｃａｄａｌｅｓ種）から成る群から選択される、請求項２３の方法。