JPH05507401A - 組換えにより産生される血液因子及びその血液因子の発現方法並びにその方法に使用されるワクシニアウイルス組換え体 - Google Patents
組換えにより産生される血液因子及びその血液因子の発現方法並びにその方法に使用されるワクシニアウイルス組換え体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
組換えにより産生される血液因子及びその血液因子の発現方法並びにその方法に
使用されるワクシニアウィルス組換え体本発明は、組換えにより産生される血液
因子、特にビタミンに依存性血液凝固因子、ワクシニアウィルス組換え体、及び
上記の血液因子の発現方法に関する。本発明は特に、組換えプロトロンビン及び
トロンビン、並びにプロトロンビンからトロンビンの種々の変種までの経路上の
異なったプロセッシング機構により生成される中間生成物の調製を開示する。
いかなる感染性又は毒性物質によっても汚染されていないVIH因子、II因子
、フォノ・ビルプラント因子、及びプラスミノーゲンのような高度に精製された
血液因子がめられる。遺伝子工学は、このような予防的又は治療的に有意のタン
パク質を、比較的高い収量で並びにHIV及び肝炎ウィルスのような病原性ウィ
ルスの非存在下で産生ずる方法を提供する。真核発現系は、ヒトの身体で産生さ
れる物質に非常に類似した又は同一の糖タンパク質が得られるように、タンパク
質部分での翻訳後修飾を実行するというさらなる利点を提供する。
いくつかのビタミンに依存性ヒト血液凝固因子が、種々の組換え体系で発現され
ている。ヒト血液凝固因子■xの発現は、Nature316、268−270
(1985)の中でH,de ia 5alle等、及びNature 315
゜683−865 (1985)の中でり、S、 Anson等が肝癌細胞及び
マウス繊維芽細胞において、Nature 316,271−273(1985
)の中でBusby等が乳仔ハムスター腎細胞において、並びにCe1l 4L
Ht5−191(1987)の中でN、 J。
Jorgensen等がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において報
告している。これらの研究から、肝臓及び腎臓由来細胞株のようなある種の細胞
型のみが有効なカルボキシル化系を有することが公知である。さらに、遺伝子増
幅によるCHO細胞におけるIX因子の過剰発現は通常タンパク質抗原レベルの
上昇を引き起こすが、しかしながらその特異的活性が急激に低下し、プレプロタ
ンパク質から成熟形態へのプロセッシングが不十分となることが観察されている
(A、Ba1land et al、、 Eur、 J、 Biochem、1
72,565−572[198g] )。
別のビタミンに依存性因子であるヒトプロティンCは、ヒト293胎児腎細胞系
で発現された。この系において、完全カルボキシル化プロティンCの高レベルの
発現が達成された(J、D、Walls et aL、。
Gene 81,139−149[1989] ) −しかしながら、293細
胞株がスケールアップ及び発酵に適しているとは思えない。
組換え体研究は、プロトロンビンを用いても実施されている。
ビタミンに依存性血液凝固因子であるプロトロンビンは、分子量72、000の
血漿糖タンパク質である。肝臓で合成されるこのタンパク質は、血液凝固の最終
段階に関与する。分泌前に、それは、例えばグリコジル化、最初の10個のアミ
ン末端グルタミン酸残基のビタミンに依存性カルボキシル化、並びにプレー及び
プロペプチドの切断といったようないくつかの翻訳後修飾を受ける。ヒトプロト
ロンビンの遺伝子及びその相補的DNAのクローニング(S、 J、 F、 D
egenet al、、Biochemistry 26,6165−6177
(19871)は、適切な細胞系における発現研究の可能性を切り開いた。シグ
ナルペプチド領域及びプロ配列(プレプロープロトロンビンをコードする)を含
むプロトロンビンの全長cDNAに関しては、MacGillivray、 R
,T、 A、 、 IrwLn。
D、M、Guinto、R,E、and 5tone、J、C,1987,r
トロンビンの機能的マツピングへの組換え遺伝学的アプローチ」、Annals
of the New YorkAcademy of 5ciences
485,73−79で言及されている。活性のあるヒトプロトロンビンの発現は
、M、J、Jorgensen et al、 (J、Biol。
Chew、 262.6729−6734(198?))により、チャイニーズ
ハムスター卵巣(CHO)細胞、及び乳仔ハムスター腎臓(B HK)細胞で達
成された。遺伝子増幅によりCHO細胞におけるプロトロンビンの発現を増強す
ると、高度の発現レベルが得られたが、しかしながら物質の60%が十分にカル
ボキシル化されたに過ぎなかった。BHK細胞におけるプロトロンビンの発現は
活性のあるプロトロンビンを産生じたが、しかしながら発現レベルは比較的低か
った。
ワクシニアウィルスベースのベクター系は、例えばり、 M、 Glover編
のrDNAクローニング:実際的アプローチJ IRL Press。
0xford、 p、 191−221 (1985)におけるM、Macke
tt et al、から公知である。欧州特許第243,029号では、組換え
体ワクシニアウィルスがHIV envタンパク質の発現に関して記載されてい
る。
ワクシニアウィルスは、感染性ウィルス粒子中にパッケージされた、ウィルスに
コードされたRNAポリメラーゼによって認識される、それ自身の転写調節配列
を進化させた。さらに、ワクシニアウィルスは大型ゲノム(185キロ塩基対の
二重11DNA)を有するが、これはin vitroクローニング技術で取り
扱うことができない。したがって、ツクシニアウイルスゲノムへの外来DNAの
挿入は、一般的相同組換えの原理を利用することによりin vivoでのみ達
成し得る。
ワクシニアウィルスは、哺乳類細胞における遺伝子発現研究のための有用な手段
であることが立証されている。利点としては、感染性の保持、広範な宿主範囲、
大DNA容量、並びにタンパク質の正確な合成、折りたたみ、プロセッシング、
及び運搬が含まれる。
したがって、組換え体ワクシニアウィルスは、正確な翻訳後修飾を実施し得る、
そしてさらに(適切な宿主細胞と合同して)所望のタンパク質を有効に分泌中の
細胞株をスクリーニングするための迅速な手段を提供する。これは、ビタミンに
依存性血液凝固因子のような大規模に修飾される分泌タンパク質の発現が考えら
れる場合に、特に重要である。
本発明の目的は、血液因子、特にビタミンに依存性血液凝固因子、例えばプロト
ロンビン及びトロンビン変異体のための発現系、そして高い翻訳後能力及び安定
なウィルス組換え体による非常に再現性の高い発現条件を提供することにおいて
、今までのところ公知の発現系よりも改良されている発現系を提供することであ
る。
さらに本発明の目的は、生物学的活性形態の対抗原形態に対する比率が高い組換
えによって調製された血液因子又はその誘導体を提供することである。
上記の目的は、その生物学的活性形態の対抗原形態に対する比率が少なくとも5
0%、好ましくは60〜90%の範囲、最も好ましくは70〜80%の範囲であ
る組換えによって産生された血液因子により解決される。
タンパク質の全部又は一部アミノ酸配列、並びに少なくとも一つのアミノ酸の置
換、欠失又は挿入によるその誘導体を包含し得るこれらの血液因子の中から、■
因子、VIII因子、XII因子、XIII因子、フォノ・ビルプラント因子、
プラスミノーゲン、及びビタミンに依存性血液因子、例えばVII因子、IX因
子、X因子、プロティンC、プロティンS、及び特にプロトロンビン、並びにそ
の変異体が挙げられる。
本発明はさらに、所望の糖タンパク質の発現に必要な挿入プラスミド及びワクシ
ニアウィルス組換え体を包含する。
さらに、他の組換え体ポックスウィルス、例えばニワトリポックスウィルスの使
用が示唆される。
挿入プラスミドは、所望の血液因子及び少な(とも一つのレプリコンをコードす
る外来cDNA配列、少なくとも一つの選択マーカー、多重クローニング部位、
少なくとも一つのプロモーター、並びにプロモーター及び外来DNA配列と隣接
するワクシニアウィルスからのDNA配列を包含する。
ウィルス組換え体又はそれを含有する細胞の選択は、選択マーカーの使用により
促進される。このマーカーの発現は、強力な、連続的に活性のあるプロモーター
、例えばワクシニアウィルスからのP7.5の制御下にあるのが好ましい。好適
な選択マーカーの一例としては、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼをコードするgpt遺伝子がある。gpt遺伝子を保有する組換え体ウ
ィルスのみが、ミコフェノール酸の存在下で哺乳類細胞培養中で増殖する(F、
G、Falkner and B、Mo5s、 J、Virol、62.184
9−1854F198g] ”) 。
発現される外来遺伝子がポックスウィルスプロモーターの制N下にあることが最
も重要なことである一方、このポックスウィルスプロモーター、例えばワタシニ
アプロモーターが発現される外来遺伝子配列に極めて接近していることも等しく
重要である。ポックスウィルスプロモーターと発現される外来遺伝子配列との間
に位置する非翻訳コード領域が発現レベルの低減を引き起こすことは、多数の例
で示されている。したがって、プロモーターの3′−末端とその下流に続く5′
外来遺伝子配列は、適正なリーディングフレームに整列され、それによって非翻
訳コドンの不必要な領域をなくすということに、特に注意すべきである。これを
達成するための一つの可能性は、適切な制限部位を選択し、同一の制限部位が形
成されるような方法でコドンを付加又は欠失することにより、外来遺伝子配列(
おそらくあらゆるプレー又はブレブロー配列を含む)の5′−末端を修飾するこ
とである。この方法において、プロモーターの3′−末端と外来遺伝子の5′−
末端の重複する末端は、所望の組立てを可能にする。
ワクシニアウィルス発現系における適切なプロモーターの選択は、非常に重要で
ある。通常、感染周期の後期に活性な、又は初期及び後期に活性なウィルスプロ
そ一ターが、タンパク質発現のために用いられる。合成後期プロモーター、又は
合成初期及び後期プロモーターを用いてもよい。
ワクシニアウィルスの特に好ましいプロモーターは、後期11にプロモーターで
ある。このプロモーターは、転写及び翻訳の開始部位と重複する機能的に重要な
保存配列要素を含有する(B、MO3S etal、 、 Ann、 Rev、
Immunol、 5.305−324 [1987]参照)。有効な発現を
得るために、本発明者は、この領域を変えないことを選択した。したがって、下
記の実施例においては、プロトロンビンcDNAは、図3に示すように、IIK
ポリペプチドの開始コドンのすぐ下流の天然EcoR1部位中に部位−ニングし
た。
実験の項でさらに詳しく記載するように、プロモーターとプロトロンビンコード
領域との的確な融合は、プロトロンビン遺伝子の開始コドン下流のオリゴヌクレ
オチド指定突然変異誘発による新規のEcoRI部位の導入によって得られた。
選択されたストラテジーは、2つの付加的アミノ酸(Asn及び5er)のシグ
ナルペプチドへの導入をもたらした(図3参照)、シグナルペプチド切断部位は
約40アミノ酸離れて位置するため、この突然変異は成熟ポリペプチド鎖の正確
なプロセッシング及び分泌を妨害しない。
ワクシニアウィルスDNAが細胞質中で転写されるという事実のために、宿主細
胞のスプライシング装置は使用されない。したがって、ウィルス組換え体を構築
する場合には、イントロン無含有のDNA又はcDNAを用いなければならない
。有効な発現及び分泌のためには、このDNAがシグナル配列も包含することが
好ましい。
いくつかの目的のためには、発現される外来DNA配列の部分配列又は修正配列
のみを組換え体ウィルス中に挿入するのが望ましい。この方法においては、血液
因子の誘導体又は突然変異体又は活性化形態が得られる。
挿入プラスミドはさらに、ワクシニアウィルスのフランキングDNA配列を包含
するが、これはチミジンキナーゼ遺伝子、又は赤血球凝集素配列に、あるいはワ
クシニアウィルスDNAのあらゆる非必須領域に相当し得る。
外来cDNA配列の挿入に適したオーブンリーディングフレームベクターは、F
、 G、 Falkner及びB、Mo5s (J、Virol、1988.6
2.1849−1854)が記載したようなpTKgpt−oFlsである。
このオーブンリーディングフレームベクターを用いて、挿入プラスミドpTKg
pt−PTHBa及びpTKgpt−PTHBbを調製した(図1及び図2)、
プロトロンビンに関して記載されたものと同様の方法で、血液因子をコードする
あらゆる他の望ましい外来遺伝子を、pHプロモーターに極めて近接するプラス
ミドpTKgpt −oFl s中に挿入し得る。
このような挿入プラスミドを用いて、野生型ワクシニアウィルスとのin vi
vo相同組換えによって、ワクシニアウィルス組換え体が得られる。プロトロン
ビンの発現に関して実験の項に記載されるワクシニアウィルス組換え体は、vP
THBa及びvPTHBb (図1及び2)、並びに下記のvPT6/2、vT
Kemc−PT2、vHA−PTa、及びvHA−PTbである。
これらの種子ウィルスを用いて、次に補乳類細胞培養を感染させて、所望の糖タ
ンパク質の発現に関してスクリーニングする。
鋪乳類宿主細胞としては、最も十分な翻訳後修飾を提供するので、肝臓及び腎臓
細胞が好ましい。宿主細胞として最も好ましいのは、発現レベル及び翻訳後修飾
の点からみて、Vero、CVI、B5C1腎細胞、並びにBHK細胞であるこ
とが示された。
その他の有用な宿主細胞は、RK13細胞である。これらの細胞は上澄中に所望
のタンパク質を分泌しないが、しかしそれらは莫大な量でタンパク質を発現する
能力を有する。この場合、タンパク質を回収するためには、細胞を破壊しなけれ
ばならない。したがって、この場合には、いかなるシグナル配列も持たない所望
のタンパク質を発現するのが有益であろう。
所望の組換え体血液因子の産生方法は、高い生物学的活性を存するタンパク質を
得るために、好ましくはビタミンにの存在下で実施する。
本発現系のさらなる改良は、感染を実施する場合に細胞の相を観察することによ
り達成される。細胞が感染前に集密状態に達している場合に、最高の結果が得ら
れることが立証された。
宿主細胞の感染に必要なワクシニアウィルス組換え体の量に関しては、それが好
ましくは0.1〜20 pfuの範囲、最も好ましくは0.1〜l pfuの範
囲にあると確定された。感染にこれより多量のウィルス組換え体を用いても、発
現レベルがさらに上昇するわけではなかった。
微粒子担体培養、又はホローファイバー系のような高密度系を用いることによっ
て、発現レベルはさらに増大された。
このようにして産生されるタンパク質含有物質は、当業界で公知のあらゆる好適
な方法により、細胞上澄から又は細胞から収穫され、タンパク質化学の一般的方
法を用いて精製される。
ワクシニアウィルス組換え体は、効率的な分泌及び正確な翻訳後修飾に関しての
細胞株の迅速なスクリーニングを可能にするという点で、従来技術の組換え体系
よりも有意の利点を有する。この方法では、どの細胞株が大量の活性タンパク質
を分泌可能であるか、(一方、他の株はその細胞質中に大量に蓄積する)、そし
てどの細胞株がその正確な翻訳後修飾によって最も活性なタンパク質を産生ずる
か、を容易に確立することができる。したがって、形質転換細胞株を構築する前
に、ワクシニアウィルス組換え体を用いた感染試験により、必要な機能に関して
異なる細胞型をスクリーニングすることが有用である。
血液媒介性のウィルス、例えば、HIV又はNANB肝炎ウィルスのようなウィ
ルスを含まない、組換えにより産生されたヒトプロトロンビンを用いて、プロト
ロンビンから調製されるヒトトロンビンによる血液凝固系におけるある種の疾患
、例えば敗血症性ショックを治療することができる。ヒトトロンビン、及び/又
はヒトトロンビン−トロンボモジュリンとプロティンCの相乗混合物はさらに、
抗凝結物質療法及び敗血症性ショックの有用な薬剤であると考えられる。
さらなる適用は、一般に用いられるウシトロンビンの代わりとしての、ヒト組換
えプロトロンビンから産生されるトロンビンのフィブリンシーラント中での使用
である。このフィブリンシーラントは、ある種の形態の手術に広く用いられる。
ウシトロンビンをヒトトロンビンに置換すると、ある種のウィルス感染並びにア
レルギー反応の危険を減らすことができる。
図1〜7により、本発明をさらに説明する。
図1は、ワクシニアウィルス挿入ベクターpTKgpt−PTHBaの構築を示
す。この挿入プラスミドは、組換え体ウィルスvPTHBaを構築するためにi
n vivo組換えに用いた。略語の意味を以下に示す:
PTHB=プロトロンビン配列; tetr=テトラサイクリン耐性遺伝子;5
sDNA=一本1IDNA; tk=ワクシニアウィルスチミジンキナーゼ配列
; g pt = E、coliキサンチングアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子、pH=ワクシニアウィルス主要後期11にポリペプチドのプロ
モーター、P7.5=ワクシニアウイルス7.5kDaポリペプチドのプロモー
ター、MC5=多重クローニング部位。矢印は転写の方向を示す。
図2は、ワクシニアウィルス挿入ベクターpTKgpt−PTHBbの構築を示
す。この挿入プラスミドは、ワクシニアウィルス組換え体vPTHBbを構築す
るために用いた。略語は、図1で上記に説明したとおりである。
図3は、プロトロンビンコード領域とワクシニアウィルス後期pHプロモーター
(pHWT)との融合を示す。ワクシニアウィルス組換え体vPTHBa及びv
PTHBbにおいて、ヒトプロトロンビンのコード領域を、IIKポリペプチド
の翻訳開始コドンの真後ろに融合する。オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発に
よる新規のEcoRI制限エンドヌクレアーゼ切断部位の挿入のために、プロト
ロンビンシグナルペプチドは2つの付加的アミノ酸(Asn及び5er)を含有
する。組換え体vPTHBbにおいてはさらに、ポリ(A)尾部(cDNA及び
組換え体vPTHBa中に存在する60A残基)、及び14C残基のオリゴ(C
)ストレッチを、第二のEcoRI部位の挿入とその後の切断により除去した。
図4は、ワクシニアウィルス挿入プラスミドpHAgpt−oFa及びpHAg
pt−oFbの構築模式図を示す。HA=赤血球凝集素;他の略語は前記の図か
ら得られる。制限エンドヌクレアーゼに関しては、共通の略語を用いた。その他
の説明は、実施例IIIをも参照されたい。
図5は、挿入プラスミドpHAgpt−PTa及びpHAgpt−PTbの構築
模式図を示す。略語に関しては、前記の図を参照されたい。
図6は、ワクシニアウィルス挿入プラスミドpTKemc−PT2の構築模式図
を示す、Amp’ =アンピシリン耐性遺伝子;emc=脳心筋炎ウィルス配列
のリーダー配列、T7P=T7ポリメラーゼ配列。
その他の略語は、前記の図及び実施例IVを参照されたい。
図7は、Vero細胞においてプロトロンビンを発現する異なるウィルス組換え
体により誘導される発現レベルの比較を示す。本実験のために、宿主細胞をそれ
ぞれのウィルス組換え体を用いて1細胞当たり1 pfuで感染させ(T7ベー
スベクターの場合は、T7ボリメラーゼ提供ウィルス及びT7プロモーター標的
遺伝子ウィルスを各々1 pfu用いた)、ビタミンに1の存在下で血清無含有
培地中で増殖させた。72時間後に上澄を収穫し、実施例1に記載されているよ
うにして、生物学的活性を測定した。
以下では、ワクシニアウィルス挿入プラスミド、ウィルス組換え体の調製、血液
凝固因子プロトロンビンの発現のための実験、並びにこの発現の最適化のための
実験を記載する。以下の実験は、本発明をさらに説明するのに役立つが、本発明
を限定するものではない。
実施例工:
77組換え体vPTHBa及びvPTHBbの調製並びにプロトロンビンの発現
1、ワクシニアウィルス挿入プラスミドの構築a)pTKgpt−PTHBaの
構築
プロトロンビンcDNAの1.6kbPstサブ断片(R,T、 A。
MacGillLvray、 D、 M、 Irwin、 R,E、 Guin
to and J、 C,5toneが「トロンビンの機能的マツピングへの組
換え遺伝学的アプローチ」、Annalsof New York Acade
my of 5ciences 485.73−79(1987)に記載したよ
うに、プラスミドpIIH13から切り出した)を、−重鎖ファージM13mp
1g中にクローニングし、ホスホチオネートベースの突然変異誘発手法(Ame
rsham、 Inc、)を用いたオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発により
、EcoRI部位を導入した。オリゴヌクレオチドoPT1 (5′−TCG
GACGTG CGCGGAΔエエ ΩAT AGT GTG TCA−3′)
を突然変異誘発のために用いた(EcoRr部位に下線を施す)、オリゴヌクレ
オチドoPT2 (5′−CTG TGCACA AGG CTACAC−3’
)は約60 bp下流に位置し、突然変異を制御するためのシーフェンス決定用
プライマーとして役立つ。次に、新規のEcoRI −Pst I断片をオーブ
ンリーディングフレーム発現ベクターpTKgpt−oF I S中にクローニ
ングしたが、これはF、 G、 Falkner及びB、Mo5sがJ、Vir
ol、62.1849−1854(19118)に記載している。プロトロンビ
ンコード領域を完全なものにするために、プロトロンビンcDNAの0.4kb
Pst Xサブ断片を中間体プラスミドpTKgpt−PTHBIの単−Pst
I部位中にクローニングし、プラスミドp’rKgpt−PTHBaを生じた
。この挿入プラスミドの構築を、図1に模式的に示す。
b)pTKgpt−PTHBbの構築
この場合は、プロトロンビンcDNAの0.4kb Pst Xサブ断片(pI
IH13から切り出され、シグナル配列及びプロ配列を包含する)を、M13m
p1g中にクローニングし、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発により、停止
コドンの70 bp上下流EcoRI部位を導入した。オリゴヌクレオチドoP
T3 (5′−GTTTCT AAA ACT AGA ATT CCCAAT
AAA AGT−3′)を突然変異誘発のために用いた。オリゴヌクレオチドo
PT5(5”−ATT CTG GGCTCCTGG A−3′)は突然変異の
約60 bp上下流位置し、突然変異を制御するためのシーフェンス決定用プラ
イマーとして役立った。
修飾された0、4kbPSt I断片を中間体プラスミドpTKgpt−PTH
BIの単−Pst r部位中にクローニングした(上記のpTKgpt−PTH
Baの構築を参照)。ポリ(A)配列を伴わないプロトロンビンcDNAを含有
する2、0kbのEcoRI断片をpTKgpt−oFl sの単−EcoRI
部位中にクローニングして、プラスミドpTKgpt−PTHBbを生じた。こ
の挿入プラスミドの構築を、図2に模式的に示す。
上記のプラスミドの両方において、プロトロンビンコード領域をIIKポリペプ
チドの開始コドンの後ろに正確に融合する。この正確な融合を得るための模式図
を、図3に示す。図3から推測されるように、オリゴヌクレオチド指定突然変異
誘発による新規のEcoRI部位の導入のために選択されたストラテジーは、プ
ロトロンビンのシグナルペプチド中への2つの付加的アミノ酸(Asn及び5e
r)の組込みをもたらした。シグナルペプチド切断部位は約40アミノ酸離れて
位置するため、この突然変異は正確なプロセッシング及び成熟ポリペプチド鎖の
分泌を妨害しないと思われる。
pTKgpt−PTHBbにおいては、さらに、プロトロンビンcDNAのポリ
(A)尾部、及び14 bp G/C配列を、プロトロンビン遺伝子の3′末端
に第二のEcoR1部位を導入し、その後切断することにより除去したが、一方
、pTKgpt−PTHBaにおいては、ポリ(A)尾部及び14 bp G/
C配列は依然として存在することが、図3から推測される。
2、ワクシニアウィルス組換え体vPTHBa及びvPTHBbの構築
In vivo組換えのために、 M、Macket et al、が「外来遺
伝子を発現するワクシニアウィルス組換え体の構築と特徴づけJ 、 D、M。
Glover編r D N Aクローニング:実際的アプローチJ 、IRL
Press。
0xford(1985)、 p、191−211に記載した手法を、以下の修
正を加えて実施した:
5 x 10’ CVI細胞(集密的単層)を0.2 pfu/細胞のワクシニ
ア野生型ウィルスで感染させた。感染2時間後に、1mlのカルシウムDNA沈
殿物(5ugのpTKgpt−PTHBa又は1)TKgpt−PTHBbの超
らせんプラスミドDNA、1μgのワクシニアウィルス野生型DNA、及び14
μgの剪断ニシン***DNAから成る)を細胞に付加した。室温で15分間イン
キュベートした後、9mlの培地(DMEM、8%FBS及び抗生物質入り)を
加えた。4時間後に培地を変え、インキュベーションをさらに48時間継続した
。
細胞を収穫し、1+1培地中に再懸濁し、ウィルス粗製ストックを調製した。
3、gpt”ワクシニアウィルス組換え体の選択gpt”突然変異体の単離のた
めに、B5C1細胞上でのプラーク検定を以下のように実施した:集密状態のB
5Cl細胞をgpt選択培地(DMEM、2.5% FBS、抗生物質、254
tg/mlのMPA、250 μg /1111のキサンチン、及び15μg/
+nlのヒボキサンチン)中で14〜24時間、ブレインキュベートした。ウィ
ルス粗製ストック(0,5mlの再懸濁細胞を3回凍結、解氷し、等容量の0.
25mg/mlのトリプシンを添加した。混合液を+37℃で30分消化し、2
0秒間音波破砕した)の104.10−’ 、及び10−S希釈液を用いて、B
5Cl細胞を感染させた。+37℃で1.5時間インキュベーション後、細胞に
、1%の低融点アガロースを含有するgpt選択培地を1贋した。2日間インキ
ュベーション後、細胞をニュートラルレッドで染色した。−夜インキュベーショ
ン後、プラークが見え易くなった。F、G、Falkner et aL、がJ
、 Vfrol、62.1849−1854.1988に記載しているようにプ
ラーク精製を実施した。
4、プロトロンビン発現組換え体ウィルスのスクリーニングa)種子ウィルスに
よる細胞の感染
サル腎細胞(Cvl及びVero細胞)を抗生物質及びグルタミンを加えたDM
EM、10%ウシ胎仔血清中で増殖させた。集密状態に達する1日前に、ビタミ
ンに、を20LLg/mlの最終濃度で添加したくビタミンに+はシグマから購
入した#V−3501で、エタノール中に溶解した5o+g/mlストック溶液
として+4℃で貯蔵した)。単層が集密状態に達したら、それらをM g 2−
及びCa”を含有するリン酸緩衝生理食塩水中で2回洗浄し、その後、0.1〜
lOプラ一ク形成単位(pfu>の精製ウィルスで感染させた。1時間のウィル
ス吸着後、血清無含有培地(DMEM)及びビタミンKを添加した。
細胞を2日間増殖させ、その後、下記のように、アルカリホスファターゼを結合
した細胞上澄のタンパク質を沈殿させて、ヒトプロトロンビンに対する抗体を用
いてウェスターンブロッティングにより分析した:
b)細胞培養上澄のアセトン沈殿
上澄を3000gで10分間遠心分離して細胞砕片を除去し、2容量のアセトン
で沈殿させて、氷上で30分インキュベートした。8000gで10分間遠心分
離後、ベレットを0.25m1の0.OIN N a OH中に再溶解し、70
℃で3分間加熱して、遠心分離し、未溶解物質を除去した。
上澄を20μmのIM)−リス/塩酸、 pH7,0で中和し、2容量のアセト
ンで再び沈殿させた。その結果生じたベレットを40μmのSDS試料緩衝液中
に溶解した。連室、10μmをゲル上に載せた。
C)ウェスターンプロット分析
手法は、本質的にはH,Towbin et al、がProc、 Natl、
Acad、 Sci、 USA83.6672−6676 (1979)に記載
した通りに実施し、以下の修正を加えた:タンパク質を10%5DS−ポリアク
リルアミドゲル上で分離し、12.5mM トリス、96a+M グリシン p
H8,3、及び10%メタノールを含有するトランスファー緩衝液中でHoef
er TEシリーズTransphor電気泳動ユニットで200mAで1時間
、ニトロセルロース膜(Amersham Hybond C)上にプロットし
た。膜をウェスターン緩衝液(WB、リン酸緩衝生理食塩水、0.1%トゥイー
ン(Tween)20 )中に2D分間3回浸漬し、10%正京ヒツジ血清を含
有するWB 20m1中でブレインキュベートした。1時間後、40μmのアル
カリホスファターゼと結合したヒツジ抗ヒトプロトロンビン抗体(Serote
c AHP06A)を添加(その結果抗血清の1 : 500希釈液を生じる)
し、インキュベーションを一夜継続した。膜をWB中で10分間、3回、アルカ
リホスファターゼ(AP)緩衝液(0,1M)−リス/CHIpH9,5,0,
IM NaC1,5mM MgC1a)中で3分間、1回、洗浄し、その後66
μmニトロブルーテトラゾリウム(NBT;70%ジメチルホルムアミド中に5
0μg / ml)及び33μm5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホス
フェート(BCiPニジメチルホルムアミド中に50μg / 011)を含有
する10m1のAP緩衝液中で3〜10分間、発色させた。
全試料において、精製プロトロンビン対照と弁移動する新規のタンパク質バンド
が容易に観察されたが、このバンドは非感染又は野生型感染細胞には存在しなか
った。このスクリーニング工程に基いて、陽性ウィルスvPTHBa及びvPT
HBbを大量に増殖させて、精製した。
d)ウィルス組換え体のゲノム特性
組換え体ウィルスにおけるプロトロンビン遺伝子の存在及び組込みパターンを調
べるために、制限酵素切断、及びその後サザーンプロット分析を実施した。精製
組換え体vPTHBa及びvPTHBbのDNAを制限エンドヌクレアーゼHi
ndIII 及 びEcoRIで消化し、1%アガロースゲル中を電気泳動し、
ニトロセルロースフィルター上にプロットした。フィルターを先ずチミジンキナ
ーゼプローブ(tk−プローブ)で、その後プロトロンビン遺伝子プローブ(P
THB−プローブ)でハイブリダイズした:tk−プローブでハイブリダイズし
たH i n d III消化試料においては、チミジンキナーゼ遺伝子を含有
する野生型ウィルスHindIIIJ断片は、約5.Okbのバンドとして見え
た。両組換え体ウィルスは約6.0 kbの予測されたバンドと、tk配列を含
有する約1.Okbの小型化したバンドを含有した。プロトロンビンプローブを
用いた場合、6.Okbのバンドのみが観察された。得られたパターンは、プロ
トロンビンcDNAのウィルスtk−遺伝子座への組み込みを確証する。
tk−プローブでハイブリダイズしたEcoRr消化試料においては、野生型ウ
ィルスのチミジンキナーゼ遺伝子は約7.0及び8.Okbの2つの断片に分割
された。vPTHBa試料では、プロトロンビン遺伝子の組み込みのために、約
9.0及び10.0kbの2つの予測された大型化した断片が現れた。vPTH
Bbでは、第二のEcoRr部位が導入され、これはEcoRI消化時にプロト
ロンビン遺伝子の切り出しを生じる。したがって、vPTHBbパターンは、1
0. Okb断片(vPTHBa試料にも認められる)及び7.1)kb断片(
野生型DNAにも認められる)を示した。プロトロンビンプローブを用いた場合
、vPTHBaでは予期された9、0kb断片が、vPTHBbでは、2.0
kbの切り出されたプロトロンビン遺伝子が検出された。分析により、2つの組
換え体ウィルスの予期された組み込みパターンが確証された。
5、プロトロンビンを分泌する好ましい細胞株の選択例えば増殖、基材への付着
、分泌及び翻訳後修飾といったようなある種の機能に関する細胞のポテンシャル
は、細胞の種類によって変化する。以下の実験は、ワクシニアウィルス宿主範囲
内にあって、許容可能な増殖特性を有し、活性のあるビタミンに依存性タンパク
質を分泌可能な細胞株をスクリーニングし、同定するのに役立つ。
プロトロンビン欠損血漿を用いて、凝固検定でプロトロンビン活性を測定した。
既知の濃度(免疫FII、IX、 X−CPK標準)のヒトプロトロンビンを用
いて、標準曲線を作成した。
表1に示した実験に関しては、細胞なりPTHBaで感染させた。48時間後に
収穫した上澄及び総細胞タンパク質を、5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分析し、クマシーブルー染色したゲル中で既知量の精製プロトロンビン
に対して定量した。
肝細胞株(Hep G2 及びH4−11−E−C3)の他に、腎細胞(例えば
、BHK及びMDCK)及び卵巣細胞(CHO)も、活性のあるガンマカルボキ
シル化タンパク質を産生ずることが示された。これらの細胞株の公知の特性、及
び生物学的に活性のあるプロトロンビンの発現のための要求に基いて、表1に列
挙した細胞株を、プロトロンビン発現試験用に選択した。
表1
プロトロンビン分泌細胞株の選択
細胞株 供給源 48時間上澄 細胞内部 カルボキシル化B5Cl 腎臓、
AGM 十++ + n、d。
(CCL 261
CVI 腎臓、AGM +++ ++ 認められた(CCL 701
Vero 腎臓、AGM +++ 十 認められた(CCL 811
RK 13 腎臓、ウサギ + + + + n、d。
(CCL 371
143B 骨肉腫 −+ n、d。
(CRL 83031
293 腎臓、ヒト + 十 認められた(CRL 15731
BHK−21腎臓、ハムスター + ++ 認められた(CCL 101
+ =目に見えるプロトロンビンバンド(約50ng) ++ = J: <見
える(約500〜100 ng)
+++=強力なバンド(>200 ng)−=プロトロンビンバンドなし
AGM =アフリカミドリザル
n、d、=測定しなかった
表1から、アフリカミドリザル腎細胞株B5Cl、Cvl、及びVero細胞が
最も十分にプロトロンビンを分泌することが分かる。ウサギ腎細胞株RK13に
関しては、それが大量のタンパク質を細胎内に蓄積することが示された。プロト
ロンビンの分泌及び蓄積は、本発明の組換え体ウィルスで感染させた場合、腎細
胞株293及びBHK−21にも見出された。
本発明のワクシニアウィルス組換え体は、血液因子、特にビタミンに依存性血液
凝固因子の発現に関する、細胞株の迅速なスクリーニングを可能にする。同一サ
イズ範囲における移動は、ワクシニアウィルス感染細胞に由来する組換えプロト
ロンビンが血液由来タンパク質と同程度のグリコジル化を示すことを示唆する。
6、生物学的に活性のあるプロトロンビンの発現の最適化上記の実験が、感染C
v1及びVero細胞の上澄中のプロトロンビンレベルが、試験した他の細胞株
よりも有意に高いことを示し、予備血液凝固検定は上澄が生物学的に非常に活性
であることを示したために、これら2つの細胞株を以下の実験用に選択した。
a)第一の実験において、プロトロンビン発現ウィルスによる感染の用量への細
胞培養上澄の活性の依存性を測定した。細胞当り0.1〜20プラーク形成単位
の範囲のvPTHBa又はvPTHBaでは、48時間上澄におけるプロトロン
ビンレベルは、有意に相異しなかった。したがって、細胞当たり 0.1〜3、
好ましくは0.1〜1プラ一ク形成単位が、Cvl及びVero細胞の両方にお
いて、最大量の分泌されたII因子を得るのに十分であることが推測される。
b)以下の実験は、インキュベーション時間の増加に伴う分泌タンパク質の蓄積
に関する。感染CVI細胞の細胞培養上澄を、感染後12.24.48.60.
72及び96時間目に調べた。分泌されたプロトロンビンの連続的増加が、72
時間までの範囲の時間に亘って観察された。これらの試験を、ゲル電気泳動及び
ウェスターンプロット分析と共に行なった。長時間に亘って、他の分泌タンパク
質の増加も認められることが観察された6分泌されたプロトロンビンの最大は、
60〜72時間であることが示された。
C)プロトロンビン発現の細胞周期依存性本発明の系における有効な発現のため
の別の不可欠のパラメーターは、感染細胞の細胞周期の相であることが判明した
。この実験のためには、感染前にCv1細胞を、ビタミンに、の存在下でそれら
がちょうど集密状態に達するまで、又はさらに1.2もしくは3日間増殖させた
。感染後48及び72時間目にII因子活性に関して、上澄を調べた。
細胞が集密状態に達した直後(1日)に感染を実施した場合、中等度の活性レベ
ルが得られることが観察された。しかしながら、集密的単層の加齢に伴って、プ
ロトロンビンの連続的増大が観察された。プロトロンビン活性の最大は、集密状
態に達したCVI細胞を感染後に得られた。感染前の細胞を静止期に止めると最
高の結果が得られることが、反復実験で示された。発現レベルの増大は、一部は
細胞密度の増加に依っているが、しかし密度の増大のみでは全体的発現増大を説
明するのに十分でない。
7、発現レベルの算出
Cvl及びB5Cl細胞において上記の実験で得られたような発現レベルは、8
.0μg / mlまでのプロトロンビン抗原を産生じたと決定した。
8、生物学的活性の測定
組換えプロトロンビンの生物学的活性が培地1al当たり50〜70ミリユニツ
トであることを決定し、したがって、生物学的活性形態の抗原形態に対する比率
がVero細胞では70%まで、Cv1細胞では60%までである組換えプロト
ロンビンを産生じた。
実施例 II:
ワクシニアウイルス組換え体v P T 6 / 2の構築及びプロトロンビン
の発現
組換え体ウィルスv P T 6 / 2を構築するために、図2に示すような
挿入プラスミドpTKgpt−PTHBbをワクシニアウィルスWR6/2株で
組換えた(Moss et al、 : r非必須ポリペプチドをコードするツ
クシニアウイルスゲノムの9,000 bp断片の欠失」;J、 VLrol、
40.1981.387−395;この株は、NTl5を介して公的に入手可
能である)。この株は、通常用いられるWR株と比較してさらに弱毒化されてお
り(マウスモデルでは106倍; Buller et al、 : r組換え
ワクシニアウィルス発現ベクターの減少された悪性度はチミジンキナーゼ陰性の
表現型と関連しているJ HNature 317.1985,813−81.
5 ) 、産生ずるにはより安全なベクターである。
プロトロンビンの発現のために、実施例Iに記載されたと同様の方法で、v P
T 6 / 2を用いた。Vero細胞におけるプロトロンビンの生物学的活
性の生成力は、図7から得られる。その他の条件に関しては、図7の凡例を参照
されたい。
実施例HI :
プロトロンビンcDNAのワクシニアウィルス赤血球凝集素遺伝子座への挿入の
ためのプラスミド
実施例工及びIIに記載されているようなプロトロンビン発現組換え体において
、プロトロンビンcDNAをウィルスチミジンキナーゼ遺伝子座に組み込んだ。
ウィルスtk遺伝子の不活性化はウィルスを弱毒するため、この弱毒化はさらに
発現される外来遺伝子の発現レベルの低減を引き起こすと考えられる。
したがって、ワクシニアウィルスの赤血球凝集素遺伝子座に組み込まれた外来遺
伝子を有する2つのウィルス組換え体を構築した。
1、ワクシニアウィルス挿入プラスミドpHAgpt−oFa及びpHAgpt
−oFbの構築
ワクシニア赤血球凝集素遺伝子の1.6kb Hi n c II断片(Shi
da H,: rワクシニアウィルス赤血球凝集素の塩基配列」;Virolo
gy 150,451−562 )をp T Z 19 R(Pharmaci
a、 Inc、 )の大型PvuIIベクター断片と連結することにより、基本
ベクターpHAを構築した。HA遺伝子の供給源は、プラスミドpvy5(B、
Mo5sから入手)であった、 pHAの単−NruI部位に、プラスミドpT
Kgpt−oF1sの1.7kb HpaI−DraI遺伝子カセットを挿入し
た(Falkner、F、G、、Mo5s B、 : I’大腸菌gpt遺伝子
はワクチニアウィルスオーブンリーディングフレーム発現ベクターのための優性
選択マーカーを提供するJ ;J、Virol、 1988;62:1849−
1854 ) 、カセットは、多重クローニング部位を含むpHプロモーター、
及びワクシニアウィルスP7.5プロモーターによって駆動されるgpt遺伝子
から成る。2つの考え得る配向け、pHAgpt−oFa及びpHAgpt−o
Fbを示した。これらのプラスミドを、図4に示す。
2.ワクシニアウィルス挿入プラスミドpHAgpt−PTa及びpHAgpt
−PTbの構築
pTKgpt−PTHBbの2.0kbEcoRI断片をEcoRIで線状化し
、ホスファターゼ処理したプラスミドpHAgpt−OFa中に挿入することに
より、プラスミドpHAgpt−PTaを構築した。
同様に、上記の2.Okb EcoRI断片を、EcoRIで線状化したプラス
ミドpHAgpt−oFb中に挿入することにより、プラスミドpHAgpt−
PTbを構築した。
図5に示す上記のプラスミドを用いて、ワクシニア野生型ウィルスによるin
vivo組換えによって組換え体ウィルスvHA−PTa及びvHA−PTbを
生成した。
Vero細胞を、実施例IIに記載されているのと同様の方法で、上記の組換え
体ウィルスに感染させた。他のウィルス組換え体と比較した場合のプロトロンビ
ンの発現レベルは、図7から推測される。
実施例■■:
ワクシニアウイルス組換え体vTKemc−PT2の構築及びプロトロンビン発
現のためのその使用
プロトロンビン発現のレベルを改良するために、非常に有効なハイブリッドワク
シニアウィルス発現系に基いた、新規のワタシニアウイルス組換え体を構築した
。この系では、あるウィルスはバクテリオファージエフポリメラーゼを発現し、
第二のウィルスは転心筋炎(EMC)ウィルスのリーダー配列を後ろに持ってい
るT7プロモーターの制御下で、標的遺伝子(プロトロンビン)を発現する(E
lroy−3tein et al、 : r転心筋炎ウィルス5′配列によっ
て付与されるmRNAのキャップ非依存性翻訳はワクシニアウィルス/バクテリ
オファージエフハイブリッド発現系の功績を改良する」Proc、Natl、A
cad、Sci、 (LISA)、1989;8B、 6126−6130 )
、このEMCリーダーは、T7転写物にキャップ非依存性翻訳を付与し、した
がって翻訳効率を増大する。
1、ワクシニアウィルス挿入プラスミドpTKemc−PT2の構築
プロトロンビンcDNAを含有するプラスミドpTKgpt−PTHBbの2.
0kbEcoRI断片(図2)を、ベクターpTM3の単−EcoRI部位に挿
入した。その結果生じたプラスミドpTKemc−PTxに、プロトロンビンc
DNAを、ベクターpTM3によって提供される開始コドンの後ろにフレームを
ずらして挿入する。コード領域を開始コドンと正確に融合するために、pTKe
mc−PTx−重鎖DNA及びオリゴヌクレオチドoPT9 (5′−AGCC
TCGGA CGT GCGCCA TGG TAT TAT CGT−3′)
を用いて、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を実施した。プラスミドをE、
coli NM522株中にトランスフェクトし、ヘルパーファージM13 K
O7で重感染することにより、pTKemc−PTxから一本鎖DNAを得た。
その結果生じたプラスミドpTKemc−PT2において、開始コドン周囲の融
合部位の正確な一次構造を、プライマーoPT2(5′−CTG TGCACA
AGGCTA CAC−2’)を用いたシーケンス決定により確証した。
この方法により、プロトロンビンの野生型配列をプラスミドpTKemc−PT
2中に回復する。
次に、実施例 Iに記載されているようなin vLv□組換え法、及びその後
の組換え体ウィルスの優性選択によって、組換えウィルスvTKemc−PT2
を得た。
図1 νl)TH82
図2 Y/=nHaコ
図6 ワタシニアウイルス挿入プラスミドpTKemc−PT2の溝築(q式図
図7
要 約
組換えにより産生される血液因子、並びにその調整方法を記載する。上記血液因
子は、少な(とも50%、好適には60〜90%の範囲の生物学的活性形態の抗
原形態に対する比率を有する。また、上記の方法に使用される組換え体ワクシニ
アウィルスをも開示する。本発明の方法は、安定な発現条件下で高い翻訳後能力
を持つ改良された発現系を提供する。
補正書の写しく翻訳文)提出書(特許法第184条の8)平成4年7月24日
Claims (45)
- 1.組換え的に産生される血液因子、並びに少なくとも一つのアミノ酸の置換、 欠失、又は挿入によるその誘導体であって、少なくとも50%の生物学的活性形 態の抗原形態に対する比率を有する血液因子。
- 2.上記比率が60〜90%の範囲内である請求項1記載の血液因子。
- 3.上記比率が70〜80%の範囲である請求項1記載の血液因子。
- 4.プロトロンビンの全部又は部分配列を表す請求項1〜3のいずれか一に記載 の血液因子。
- 5.VII因子、IX因子、X因子、プロテインC、及びプロテインSの群から 選択されるビタミンK依存性血液因子の全部又は部分配列を表す請求項1〜3の いずれか一に記載の血液因子。
- 6.V因子、VIII因子、XII因子、XII因子、フォン・ピルブラント因 子、又はプラスミノーゲンの全部又は一部のアミノ酸配列を包含する請求項1〜 3のいずれか一に記載の血液因子。
- 7.請求項1〜6記載の血液因子並びに少なくとも一つのレプリコンをコードす る外来cDNA配列、少なくとも一つの選択マーカー、クローニング部位、及び 少なくとも一つのプロモーターを包含する挿入プラスミドであって、ワクシニア ウイルスのDNA配列が上記プロモーター及び外来cDNAに隣接するプラスミ ド。
- 8.ブランキングDNA配列がワクシニアウイルスの非必須領域に対応する請求 項7記載のプラスミド。
- 9.ワクシニアウイルスのフランキングDNA配列がチミジンキナーゼ配列に対 応する請求項7記載のプラスミド。
- 10.ワクシニアウイルスのフランキングDNA配列が赤血球凝集素配列に対応 する請求項7記載のプラスミド。
- 11.上記プロモーターが後期ワクシニアウイルスプロモーターである請求項7 記載のプラスミド。
- 12.上記ワクシニアウイルスプロモーターが後期11K−プロモーターである 請求項11記載のプラスミド。
- 13.上記ワクシニアウイルスプロモーターが合成後期プロモーターである請求 項11記載のプラスミド。
- 14.上記ワクシニアウイルスプロモーターが合成初期及び後期プロモーターで ある請求項11記載のプラスミド。
- 15.外来cDNAが11Kポリペプチドのプロモーターの、又は請求項7〜1 4記載のプロモーターのいずれかの下流に、及び極めて接近して挿入される請求 項7〜14のいずれか一に記載のプラスミド。
- 16.ポックスウイルスプロモーターの3′末端、及び下流に続く発現さるべき 外来DNA配列の5′末端が極めて接近して存在し、外来DNA配列の5′末端 が一つ又はそれ以上のヌクレオチド又はコドンにより延長又は短縮され、したが ってそれがポックスウイルスプロモーターの3′末端の同一に工学的処理された 又は天然の制限部位に対応する制限部位を形成することを特徴とする請求項7〜 15のいずれか一に記載のプラスミド製造方法。
- 17.外来cDNA配列が請求項1〜6記載の血液因子をコードする請求項7〜 15記載のプラスミド。
- 18.外来cDNA配列がプロトロンビン、又はその機能的等価物をコードする 請求項17記載のプラスミド。
- 19.5′末端の2つの付加的アミノ酸Asn及びSerをコードするDNA配 列を適正な挿入のためにプロトロンビンシグナル配列が包含するように修正する ことによる新規のEcoRI制限エンドヌクレアーゼ切断部位を包含する請求項 15記載のプラスミド。
- 20.下記の部分プロモーター−外来cDNA配列:【配列があります】 を包含する請求項19記載のプラスミド。
- 21.下記の部分プロモーター−外来cDNA配列:【配列があります】 を包含する請求項19記載のプラスミド。
- 22.請求項1〜6のタンパク質をコードする外来cDNA配列がプロモーター に極めて接近してプラスミドpTKgpt−oFlsのオーブンリーディングフ レーム中にクローニングされた請求項19記載のプラスミド。
- 23.図1に示すようなプラスミドpTKgpt−PTHBa。
- 24.図2に示すようなプラスミドpTKgpt−PTHBb。
- 25.図4に示すようなプラスミドpHAgpt−oFa及びpHAgpt−o Fb。
- 26.請求項1〜6のタンパク質をコードする外来cDNA配列が発現される外 来DNAを制御するプロモーターに極めて接近してオーブンリーディングフレー ム中にクローニングされた請求項25記載のプラスミド。
- 27.図5に示すようなプラスミドpHAgpt−PTa及びpHAgpt−P Tb。
- 28.図6に示すようなプラスミドpTKemc−PT2。
- 29.請求項7〜15、及び17〜28記載のプラスミドによる野生型ワクシニ アウイルスのin vivo相同組換えによって得られる組換え体ワクシニアウ イルス。
- 30.請求項23及び24記載のプラスミドによる野生型ワクシニアウイルスの in vivo相同組換えによって得られる組換え体ワクシニアウイルスvPT HBa及びvPTHBb。
- 31.請求項7〜15、及び17〜28記載のプラスミドによるワクシニアウイ ルスWR6/2株のin vivo相同組換えによって得られる組換え体ワクシ ニアウイルスvPT6/2。
- 32.請求項28記載のプラスミドによる野生型ワクシニアウイルスのin v ivo相同組換えによって得られる組換え体ワクシニアウイルスvTKemc− PT2。
- 33.請求項29〜32記載の組換え体ワクシニアウイルスによる宿主細胞の感 染によって得られる請求項1〜6記載の血液因子の発現のための脊椎動物細胞培 養。
- 34.宿主細胞が哺乳類肝臓又は腎臓細胞である請求項33記載の細胞培養。
- 35.宿主細胞がVero、CV1、BSC1、BHK、又はRK13細胞であ る請求項34記載の細胞培養。
- 36.請求項29〜32記載の組換え体ワクシニアウイルスによる哺乳類宿主細 胞の感染、上記細胞の培養、所望の血液因子の発現、及びその回収を包含する請 求項1〜6のいずれか一に記載の血液因子の組換えによる製造方法。
- 37.上記宿主細胞がVero、CV1、BSC1、BHK、又はRK13細胞 である請求項36記載の方法。
- 38.宿主細胞RK13を用い、外来遺伝子がシグナル配列を欠く請求項37記 載の方法。
- 39.感染前に細胞が集密状態(confluency)に達している請求項3 6記載の方法。
- 40.宿主細胞の感染が0.1〜20pfu、好ましくは0.1〜1 pfuの 組換え体ワクシニアウイルスを用いて実施される請求項36及び39記載の方法 。
- 41.細胞の培養及び/又は所望の血液因子の発現がビタミンKの存在下で実施 される請求項36記載の方法。
- 42.上記感染細胞の培養が高密度系で実施される請求項36記載の方法。
- 43.上記感染細胞の培養が微粒子担体培養又はホローファイバー系で実施され る請求項36記載の方法。
- 44.所望の血液因子が細胞又は上澄から回収される請求項36記載の方法。
- 45.血液因子の回収が感染後48〜96時間、好ましくは60〜72時間で実 施される請求項36記載の方法。
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Cited By (1)
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---|---|---|---|---|
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DE69229126T2 (de) * | 1991-12-31 | 1999-12-30 | Zymogenetics, Inc. | Verfahren zur Herstellung von Thrombin |
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DE4430204A1 (de) * | 1994-08-26 | 1996-02-29 | Behringwerke Ag | Arzneimittel, welches als Gegenmittel für Blut-Antikoagulanzien geeignet ist und seine Verwendung |
AT403167B (de) * | 1994-11-14 | 1997-11-25 | Immuno Ag | Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems |
AT404357B (de) * | 1995-06-13 | 1998-11-25 | Immuno Ag | Prothrombin-derivate |
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EP1136553A1 (en) * | 2000-03-22 | 2001-09-26 | Octagene GmbH | Production of recombinant blood clotting factors in human cell lines |
AU5471501A (en) * | 2000-03-22 | 2001-10-03 | Octagene Gmbh | Production of recombinant blood clotting factors in human cell lines |
US7812132B2 (en) | 2000-04-28 | 2010-10-12 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
US7220837B1 (en) | 2000-04-28 | 2007-05-22 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
US20030211094A1 (en) | 2001-06-26 | 2003-11-13 | Nelsestuen Gary L. | High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides |
AU2003221469A1 (en) | 2002-04-30 | 2003-11-17 | Bayer Healthcare Llc | FACTOR VII OR VIIa POLYPEPTIDE VARIANTS |
AU2004221761B2 (en) | 2003-03-20 | 2010-01-07 | Bayer Healthcare Llc | FVII or FVIIa variants |
NZ573412A (en) | 2003-06-19 | 2010-09-30 | Maxygen Holdings Ltd | Factor VII or VIIa Gla domain variants |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02131593A (ja) * | 1988-04-19 | 1990-05-21 | Immuno Ag Chem Med Prod | 組換体アビポックスウィルスベクターを用いた単離された蛋白様物質の産生 |
Family Cites Families (5)
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---|---|---|---|---|
GB8508845D0 (en) * | 1985-04-04 | 1985-05-09 | Hoffmann La Roche | Vaccinia dna |
EP0289586A4 (en) * | 1986-11-17 | 1990-04-10 | New England Medical Ct | INCREASING GAMMA CARBOXYLATION OF RECOMBINANT, VITAMIN K-DEPENDENT PROTEINS. |
JPH03501921A (ja) * | 1987-05-18 | 1991-05-09 | インテグレイテッド・ジェネティクス・インク | 改良タンパク質分子、並びにその製造及び活性化方法 |
FR2619314B1 (fr) * | 1987-08-11 | 1990-06-15 | Transgene Sa | Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant |
FR2638643B1 (fr) * | 1988-11-09 | 1991-04-12 | Transgene Sa | Sequence d'adn codant pour le facteur ix humain ou une proteine analogue, vecteur d'expression, cellules transformees, procede de preparation du facteur ix et produits obtenus correspondants |
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02131593A (ja) * | 1988-04-19 | 1990-05-21 | Immuno Ag Chem Med Prod | 組換体アビポックスウィルスベクターを用いた単離された蛋白様物質の産生 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016178932A (ja) * | 2016-04-27 | 2016-10-13 | バクスアルタ・イノベイションズ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングBaxalta Innovations GmbH | 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用 |
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