JPH05507401A - 組換えにより産生される血液因子及びその血液因子の発現方法並びにその方法に使用されるワクシニアウイルス組換え体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 組換えにより産生される血液因子及びその血液因子の発現方法並びにその方法に 使用されるワクシニアウィルス組換え体本発明は、組換えにより産生される血液 因子、特にビタミンに依存性血液凝固因子、ワクシニアウィルス組換え体、及び 上記の血液因子の発現方法に関する。本発明は特に、組換えプロトロンビン及び トロンビン、並びにプロトロンビンからトロンビンの種々の変種までの経路上の 異なったプロセッシング機構により生成される中間生成物の調製を開示する。

いかなる感染性又は毒性物質によっても汚染されていないＶＩＨ因子、ＩＩ因子 、フォノ・ビルプラント因子、及びプラスミノーゲンのような高度に精製された 血液因子がめられる。遺伝子工学は、このような予防的又は治療的に有意のタン パク質を、比較的高い収量で並びにＨＩＶ及び肝炎ウィルスのような病原性ウィ ルスの非存在下で産生ずる方法を提供する。真核発現系は、ヒトの身体で産生さ れる物質に非常に類似した又は同一の糖タンパク質が得られるように、タンパク 質部分での翻訳後修飾を実行するというさらなる利点を提供する。

いくつかのビタミンに依存性ヒト血液凝固因子が、種々の組換え体系で発現され ている。ヒト血液凝固因子■ｘの発現は、Ｎａｔｕｒｅ３１６、２６８−２７０ （１９８５）の中でＨ，ｄｅ　ｉａ　５ａｌｌｅ等、及びＮａｔｕｒｅ　３１５ ゜６８３−８６５　（１９８５）の中でり、Ｓ、　Ａｎｓｏｎ等が肝癌細胞及び マウス繊維芽細胞において、Ｎａｔｕｒｅ　３１６，２７１−２７３（１９８５ ）の中でＢｕｓｂｙ等が乳仔ハムスター腎細胞において、並びにＣｅ１ｌ　４Ｌ Ｈｔ５−１９１（１９８７）の中でＮ、　Ｊ。

Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において報 告している。これらの研究から、肝臓及び腎臓由来細胞株のようなある種の細胞 型のみが有効なカルボキシル化系を有することが公知である。さらに、遺伝子増 幅によるＣＨＯ細胞におけるＩＸ因子の過剰発現は通常タンパク質抗原レベルの 上昇を引き起こすが、しかしながらその特異的活性が急激に低下し、プレプロタ ンパク質から成熟形態へのプロセッシングが不十分となることが観察されている （Ａ、Ｂａ１ｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１ ７２，５６５−５７２［１９８ｇ］　）。

別のビタミンに依存性因子であるヒトプロティンＣは、ヒト２９３胎児腎細胞系 で発現された。この系において、完全カルボキシル化プロティンＣの高レベルの 発現が達成された（Ｊ、Ｄ、Ｗａｌｌｓ　ｅｔ　ａＬ、。

Ｇｅｎｅ　８１，１３９−１４９［１９８９］　）　−しかしながら、２９３細 胞株がスケールアップ及び発酵に適しているとは思えない。

組換え体研究は、プロトロンビンを用いても実施されている。

ビタミンに依存性血液凝固因子であるプロトロンビンは、分子量７２、０００の 血漿糖タンパク質である。肝臓で合成されるこのタンパク質は、血液凝固の最終 段階に関与する。分泌前に、それは、例えばグリコジル化、最初の１０個のアミ ン末端グルタミン酸残基のビタミンに依存性カルボキシル化、並びにプレー及び プロペプチドの切断といったようないくつかの翻訳後修飾を受ける。ヒトプロト ロンビンの遺伝子及びその相補的ＤＮＡのクローニング（Ｓ、　Ｊ、　Ｆ、　Ｄ ｅｇｅｎｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６，６１６５−６１７７ （１９８７１）は、適切な細胞系における発現研究の可能性を切り開いた。シグ ナルペプチド領域及びプロ配列（プレプロープロトロンビンをコードする）を含 むプロトロンビンの全長ｃＤＮＡに関しては、ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙ、　Ｒ ，Ｔ、　Ａ、　、　ＩｒｗＬｎ。

Ｄ、Ｍ、Ｇｕｉｎｔｏ、Ｒ，Ｅ、ａｎｄ　５ｔｏｎｅ、Ｊ、Ｃ，１９８７，ｒ　 トロンビンの機能的マツピングへの組換え遺伝学的アプローチ」、Ａｎｎａｌｓ 　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　 ４８５，７３−７９で言及されている。活性のあるヒトプロトロンビンの発現は 、Ｍ、Ｊ、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　２６２．６７２９−６７３４（１９８？））により、チャイニーズ ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及び乳仔ハムスター腎臓（Ｂ　ＨＫ）細胞で達 成された。遺伝子増幅によりＣＨＯ細胞におけるプロトロンビンの発現を増強す ると、高度の発現レベルが得られたが、しかしながら物質の６０％が十分にカル ボキシル化されたに過ぎなかった。ＢＨＫ細胞におけるプロトロンビンの発現は 活性のあるプロトロンビンを産生じたが、しかしながら発現レベルは比較的低か った。

ワクシニアウィルスベースのベクター系は、例えばり、　Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ編 のｒＤＮＡクローニング：実際的アプローチＪ　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ。

０ｘｆｏｒｄ、　ｐ、　１９１−２２１　（１９８５）におけるＭ、Ｍａｃｋｅ ｔｔ　ｅｔ　ａｌ、から公知である。欧州特許第２４３，０２９号では、組換え 体ワクシニアウィルスがＨＩＶ　ｅｎｖタンパク質の発現に関して記載されてい る。

ワクシニアウィルスは、感染性ウィルス粒子中にパッケージされた、ウィルスに コードされたＲＮＡポリメラーゼによって認識される、それ自身の転写調節配列 を進化させた。さらに、ワクシニアウィルスは大型ゲノム（１８５キロ塩基対の 二重１１ＤＮＡ）を有するが、これはｉｎ　ｖｉｔｒｏクローニング技術で取り 扱うことができない。したがって、ツクシニアウイルスゲノムへの外来ＤＮＡの 挿入は、一般的相同組換えの原理を利用することによりｉｎ　ｖｉｖｏでのみ達 成し得る。

ワクシニアウィルスは、哺乳類細胞における遺伝子発現研究のための有用な手段 であることが立証されている。利点としては、感染性の保持、広範な宿主範囲、 大ＤＮＡ容量、並びにタンパク質の正確な合成、折りたたみ、プロセッシング、 及び運搬が含まれる。

したがって、組換え体ワクシニアウィルスは、正確な翻訳後修飾を実施し得る、 そしてさらに（適切な宿主細胞と合同して）所望のタンパク質を有効に分泌中の 細胞株をスクリーニングするための迅速な手段を提供する。これは、ビタミンに 依存性血液凝固因子のような大規模に修飾される分泌タンパク質の発現が考えら れる場合に、特に重要である。

本発明の目的は、血液因子、特にビタミンに依存性血液凝固因子、例えばプロト ロンビン及びトロンビン変異体のための発現系、そして高い翻訳後能力及び安定 なウィルス組換え体による非常に再現性の高い発現条件を提供することにおいて 、今までのところ公知の発現系よりも改良されている発現系を提供することであ る。

さらに本発明の目的は、生物学的活性形態の対抗原形態に対する比率が高い組換 えによって調製された血液因子又はその誘導体を提供することである。

上記の目的は、その生物学的活性形態の対抗原形態に対する比率が少なくとも５ ０％、好ましくは６０〜９０％の範囲、最も好ましくは７０〜８０％の範囲であ る組換えによって産生された血液因子により解決される。

タンパク質の全部又は一部アミノ酸配列、並びに少なくとも一つのアミノ酸の置 換、欠失又は挿入によるその誘導体を包含し得るこれらの血液因子の中から、■ 因子、ＶＩＩＩ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩＩ因子、フォノ・ビルプラント因子、 プラスミノーゲン、及びビタミンに依存性血液因子、例えばＶＩＩ因子、ＩＸ因 子、Ｘ因子、プロティンＣ、プロティンＳ、及び特にプロトロンビン、並びにそ の変異体が挙げられる。

本発明はさらに、所望の糖タンパク質の発現に必要な挿入プラスミド及びワクシ ニアウィルス組換え体を包含する。

さらに、他の組換え体ポックスウィルス、例えばニワトリポックスウィルスの使 用が示唆される。

挿入プラスミドは、所望の血液因子及び少な（とも一つのレプリコンをコードす る外来ｃＤＮＡ配列、少なくとも一つの選択マーカー、多重クローニング部位、 少なくとも一つのプロモーター、並びにプロモーター及び外来ＤＮＡ配列と隣接 するワクシニアウィルスからのＤＮＡ配列を包含する。

ウィルス組換え体又はそれを含有する細胞の選択は、選択マーカーの使用により 促進される。このマーカーの発現は、強力な、連続的に活性のあるプロモーター 、例えばワクシニアウィルスからのＰ７．５の制御下にあるのが好ましい。好適 な選択マーカーの一例としては、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフ ェラーゼをコードするｇｐｔ遺伝子がある。ｇｐｔ遺伝子を保有する組換え体ウ ィルスのみが、ミコフェノール酸の存在下で哺乳類細胞培養中で増殖する（Ｆ、 Ｇ、Ｆａｌｋｎｅｒ　ａｎｄ　Ｂ、Ｍｏ５ｓ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２．１８４ ９−１８５４Ｆ１９８ｇ］　”）　。

発現される外来遺伝子がポックスウィルスプロモーターの制Ｎ下にあることが最 も重要なことである一方、このポックスウィルスプロモーター、例えばワタシニ アプロモーターが発現される外来遺伝子配列に極めて接近していることも等しく 重要である。ポックスウィルスプロモーターと発現される外来遺伝子配列との間 に位置する非翻訳コード領域が発現レベルの低減を引き起こすことは、多数の例 で示されている。したがって、プロモーターの３′−末端とその下流に続く５′ 外来遺伝子配列は、適正なリーディングフレームに整列され、それによって非翻 訳コドンの不必要な領域をなくすということに、特に注意すべきである。これを 達成するための一つの可能性は、適切な制限部位を選択し、同一の制限部位が形 成されるような方法でコドンを付加又は欠失することにより、外来遺伝子配列（ おそらくあらゆるプレー又はブレブロー配列を含む）の５′−末端を修飾するこ とである。この方法において、プロモーターの３′−末端と外来遺伝子の５′− 末端の重複する末端は、所望の組立てを可能にする。

ワクシニアウィルス発現系における適切なプロモーターの選択は、非常に重要で ある。通常、感染周期の後期に活性な、又は初期及び後期に活性なウィルスプロ そ一ターが、タンパク質発現のために用いられる。合成後期プロモーター、又は 合成初期及び後期プロモーターを用いてもよい。

ワクシニアウィルスの特に好ましいプロモーターは、後期１１にプロモーターで ある。このプロモーターは、転写及び翻訳の開始部位と重複する機能的に重要な 保存配列要素を含有する（Ｂ、ＭＯ３Ｓ　ｅｔａｌ、　、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、 　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　５．３０５−３２４　［１９８７］参照）。有効な発現を 得るために、本発明者は、この領域を変えないことを選択した。したがって、下 記の実施例においては、プロトロンビンｃＤＮＡは、図３に示すように、ＩＩＫ ポリペプチドの開始コドンのすぐ下流の天然ＥｃｏＲ１部位中に部位−ニングし た。

実験の項でさらに詳しく記載するように、プロモーターとプロトロンビンコード 領域との的確な融合は、プロトロンビン遺伝子の開始コドン下流のオリゴヌクレ オチド指定突然変異誘発による新規のＥｃｏＲＩ部位の導入によって得られた。

選択されたストラテジーは、２つの付加的アミノ酸（Ａｓｎ及び５ｅｒ）のシグ ナルペプチドへの導入をもたらした（図３参照）、シグナルペプチド切断部位は 約４０アミノ酸離れて位置するため、この突然変異は成熟ポリペプチド鎖の正確 なプロセッシング及び分泌を妨害しない。

ワクシニアウィルスＤＮＡが細胞質中で転写されるという事実のために、宿主細 胞のスプライシング装置は使用されない。したがって、ウィルス組換え体を構築 する場合には、イントロン無含有のＤＮＡ又はｃＤＮＡを用いなければならない 。有効な発現及び分泌のためには、このＤＮＡがシグナル配列も包含することが 好ましい。

いくつかの目的のためには、発現される外来ＤＮＡ配列の部分配列又は修正配列 のみを組換え体ウィルス中に挿入するのが望ましい。この方法においては、血液 因子の誘導体又は突然変異体又は活性化形態が得られる。

挿入プラスミドはさらに、ワクシニアウィルスのフランキングＤＮＡ配列を包含 するが、これはチミジンキナーゼ遺伝子、又は赤血球凝集素配列に、あるいはワ クシニアウィルスＤＮＡのあらゆる非必須領域に相当し得る。

外来ｃＤＮＡ配列の挿入に適したオーブンリーディングフレームベクターは、Ｆ 、　Ｇ、　Ｆａｌｋｎｅｒ及びＢ、Ｍｏ５ｓ　（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、１９８８．６ ２．１８４９−１８５４）が記載したようなｐＴＫｇｐｔ−ｏＦｌｓである。

このオーブンリーディングフレームベクターを用いて、挿入プラスミドｐＴＫｇ ｐｔ−ＰＴＨＢａ及びｐＴＫｇｐｔ−ＰＴＨＢｂを調製した（図１及び図２）、 プロトロンビンに関して記載されたものと同様の方法で、血液因子をコードする あらゆる他の望ましい外来遺伝子を、ｐＨプロモーターに極めて近接するプラス ミドｐＴＫｇｐｔ　−ｏＦｌ　ｓ中に挿入し得る。

このような挿入プラスミドを用いて、野生型ワクシニアウィルスとのｉｎ　ｖｉ ｖｏ相同組換えによって、ワクシニアウィルス組換え体が得られる。プロトロン ビンの発現に関して実験の項に記載されるワクシニアウィルス組換え体は、ｖＰ ＴＨＢａ及びｖＰＴＨＢｂ　（図１及び２）、並びに下記のｖＰＴ６／２、ｖＴ Ｋｅｍｃ−ＰＴ２、ｖＨＡ−ＰＴａ、及びｖＨＡ−ＰＴｂである。

これらの種子ウィルスを用いて、次に補乳類細胞培養を感染させて、所望の糖タ ンパク質の発現に関してスクリーニングする。

鋪乳類宿主細胞としては、最も十分な翻訳後修飾を提供するので、肝臓及び腎臓 細胞が好ましい。宿主細胞として最も好ましいのは、発現レベル及び翻訳後修飾 の点からみて、Ｖｅｒｏ、ＣＶＩ、Ｂ５Ｃ１腎細胞、並びにＢＨＫ細胞であるこ とが示された。

その他の有用な宿主細胞は、ＲＫ１３細胞である。これらの細胞は上澄中に所望 のタンパク質を分泌しないが、しかしそれらは莫大な量でタンパク質を発現する 能力を有する。この場合、タンパク質を回収するためには、細胞を破壊しなけれ ばならない。したがって、この場合には、いかなるシグナル配列も持たない所望 のタンパク質を発現するのが有益であろう。

所望の組換え体血液因子の産生方法は、高い生物学的活性を存するタンパク質を 得るために、好ましくはビタミンにの存在下で実施する。

本発現系のさらなる改良は、感染を実施する場合に細胞の相を観察することによ り達成される。細胞が感染前に集密状態に達している場合に、最高の結果が得ら れることが立証された。

宿主細胞の感染に必要なワクシニアウィルス組換え体の量に関しては、それが好 ましくは０．１〜２０　ｐｆｕの範囲、最も好ましくは０．１〜ｌ　ｐｆｕの範 囲にあると確定された。感染にこれより多量のウィルス組換え体を用いても、発 現レベルがさらに上昇するわけではなかった。

微粒子担体培養、又はホローファイバー系のような高密度系を用いることによっ て、発現レベルはさらに増大された。

このようにして産生されるタンパク質含有物質は、当業界で公知のあらゆる好適 な方法により、細胞上澄から又は細胞から収穫され、タンパク質化学の一般的方 法を用いて精製される。

ワクシニアウィルス組換え体は、効率的な分泌及び正確な翻訳後修飾に関しての 細胞株の迅速なスクリーニングを可能にするという点で、従来技術の組換え体系 よりも有意の利点を有する。この方法では、どの細胞株が大量の活性タンパク質 を分泌可能であるか、（一方、他の株はその細胞質中に大量に蓄積する）、そし てどの細胞株がその正確な翻訳後修飾によって最も活性なタンパク質を産生ずる か、を容易に確立することができる。したがって、形質転換細胞株を構築する前 に、ワクシニアウィルス組換え体を用いた感染試験により、必要な機能に関して 異なる細胞型をスクリーニングすることが有用である。

血液媒介性のウィルス、例えば、ＨＩＶ又はＮＡＮＢ肝炎ウィルスのようなウィ ルスを含まない、組換えにより産生されたヒトプロトロンビンを用いて、プロト ロンビンから調製されるヒトトロンビンによる血液凝固系におけるある種の疾患 、例えば敗血症性ショックを治療することができる。ヒトトロンビン、及び／又 はヒトトロンビン−トロンボモジュリンとプロティンＣの相乗混合物はさらに、 抗凝結物質療法及び敗血症性ショックの有用な薬剤であると考えられる。

さらなる適用は、一般に用いられるウシトロンビンの代わりとしての、ヒト組換 えプロトロンビンから産生されるトロンビンのフィブリンシーラント中での使用 である。このフィブリンシーラントは、ある種の形態の手術に広く用いられる。

ウシトロンビンをヒトトロンビンに置換すると、ある種のウィルス感染並びにア レルギー反応の危険を減らすことができる。

図１〜７により、本発明をさらに説明する。

図１は、ワクシニアウィルス挿入ベクターｐＴＫｇｐｔ−ＰＴＨＢａの構築を示 す。この挿入プラスミドは、組換え体ウィルスｖＰＴＨＢａを構築するためにｉ ｎ　ｖｉｖｏ組換えに用いた。略語の意味を以下に示す： ＰＴＨＢ＝プロトロンビン配列；　ｔｅｔｒ＝テトラサイクリン耐性遺伝子；５ ｓＤＮＡ＝一本１ＩＤＮＡ；　ｔｋ＝ワクシニアウィルスチミジンキナーゼ配列 ；　ｇ　ｐｔ　＝　Ｅ、ｃｏｌｉキサンチングアニンホスホリボシルトランスフ ェラーゼ遺伝子、ｐＨ＝ワクシニアウィルス主要後期１１にポリペプチドのプロ モーター、Ｐ７．５＝ワクシニアウイルス７．５ｋＤａポリペプチドのプロモー ター、ＭＣ５＝多重クローニング部位。矢印は転写の方向を示す。

図２は、ワクシニアウィルス挿入ベクターｐＴＫｇｐｔ−ＰＴＨＢｂの構築を示 す。この挿入プラスミドは、ワクシニアウィルス組換え体ｖＰＴＨＢｂを構築す るために用いた。略語は、図１で上記に説明したとおりである。

図３は、プロトロンビンコード領域とワクシニアウィルス後期ｐＨプロモーター （ｐＨＷＴ）との融合を示す。ワクシニアウィルス組換え体ｖＰＴＨＢａ及びｖ ＰＴＨＢｂにおいて、ヒトプロトロンビンのコード領域を、ＩＩＫポリペプチド の翻訳開始コドンの真後ろに融合する。オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発に よる新規のＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位の挿入のために、プロト ロンビンシグナルペプチドは２つの付加的アミノ酸（Ａｓｎ及び５ｅｒ）を含有 する。組換え体ｖＰＴＨＢｂにおいてはさらに、ポリ（Ａ）尾部（ｃＤＮＡ及び 組換え体ｖＰＴＨＢａ中に存在する６０Ａ残基）、及び１４Ｃ残基のオリゴ（Ｃ ）ストレッチを、第二のＥｃｏＲＩ部位の挿入とその後の切断により除去した。

図４は、ワクシニアウィルス挿入プラスミドｐＨＡｇｐｔ−ｏＦａ及びｐＨＡｇ ｐｔ−ｏＦｂの構築模式図を示す。ＨＡ＝赤血球凝集素；他の略語は前記の図か ら得られる。制限エンドヌクレアーゼに関しては、共通の略語を用いた。その他 の説明は、実施例ＩＩＩをも参照されたい。

図５は、挿入プラスミドｐＨＡｇｐｔ−ＰＴａ及びｐＨＡｇｐｔ−ＰＴｂの構築 模式図を示す。略語に関しては、前記の図を参照されたい。

図６は、ワクシニアウィルス挿入プラスミドｐＴＫｅｍｃ−ＰＴ２の構築模式図 を示す、Ａｍｐ’　＝アンピシリン耐性遺伝子；ｅｍｃ＝脳心筋炎ウィルス配列 のリーダー配列、Ｔ７Ｐ＝Ｔ７ポリメラーゼ配列。

その他の略語は、前記の図及び実施例ＩＶを参照されたい。

図７は、Ｖｅｒｏ細胞においてプロトロンビンを発現する異なるウィルス組換え 体により誘導される発現レベルの比較を示す。本実験のために、宿主細胞をそれ ぞれのウィルス組換え体を用いて１細胞当たり１　ｐｆｕで感染させ（Ｔ７ベー スベクターの場合は、Ｔ７ボリメラーゼ提供ウィルス及びＴ７プロモーター標的 遺伝子ウィルスを各々１　ｐｆｕ用いた）、ビタミンに１の存在下で血清無含有 培地中で増殖させた。７２時間後に上澄を収穫し、実施例１に記載されているよ うにして、生物学的活性を測定した。

以下では、ワクシニアウィルス挿入プラスミド、ウィルス組換え体の調製、血液 凝固因子プロトロンビンの発現のための実験、並びにこの発現の最適化のための 実験を記載する。以下の実験は、本発明をさらに説明するのに役立つが、本発明 を限定するものではない。

実施例工： ７７組換え体ｖＰＴＨＢａ及びｖＰＴＨＢｂの調製並びにプロトロンビンの発現 １、ワクシニアウィルス挿入プラスミドの構築ａ）ｐＴＫｇｐｔ−ＰＴＨＢａの 構築 プロトロンビンｃＤＮＡの１．６ｋｂＰｓｔサブ断片（Ｒ，Ｔ、　Ａ。

ＭａｃＧｉｌｌＬｖｒａｙ、　Ｄ、　Ｍ、　Ｉｒｗｉｎ、　Ｒ，Ｅ、　Ｇｕｉｎ ｔｏ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｃ，５ｔｏｎｅが「トロンビンの機能的マツピングへの組 換え遺伝学的アプローチ」、Ａｎｎａｌｓｏｆ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅ ｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　４８５．７３−７９（１９８７）に記載したよ うに、プラスミドｐＩＩＨ１３から切り出した）を、−重鎖ファージＭ１３ｍｐ １ｇ中にクローニングし、ホスホチオネートベースの突然変異誘発手法（Ａｍｅ ｒｓｈａｍ、　Ｉｎｃ、）を用いたオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発により 、ＥｃｏＲＩ部位を導入した。オリゴヌクレオチドｏＰＴ１　（５′−ＴＣＧ　 ＧＡＣＧＴＧ　ＣＧＣＧＧＡΔエエ　ΩＡＴ　ＡＧＴ　ＧＴＧ　ＴＣＡ−３′） を突然変異誘発のために用いた（ＥｃｏＲｒ部位に下線を施す）、オリゴヌクレ オチドｏＰＴ２　（５′−ＣＴＧ　ＴＧＣＡＣＡ　ＡＧＧ　ＣＴＡＣＡＣ−３’ ）は約６０　ｂｐ下流に位置し、突然変異を制御するためのシーフェンス決定用 プライマーとして役立つ。次に、新規のＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片をオーブ ンリーディングフレーム発現ベクターｐＴＫｇｐｔ−ｏＦ　Ｉ　Ｓ中にクローニ ングしたが、これはＦ、　Ｇ、　Ｆａｌｋｎｅｒ及びＢ、Ｍｏ５ｓがＪ、Ｖｉｒ ｏｌ、６２．１８４９−１８５４（１９１１８）に記載している。プロトロンビ ンコード領域を完全なものにするために、プロトロンビンｃＤＮＡの０．４ｋｂ Ｐｓｔ　Ｘサブ断片を中間体プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＰＴＨＢＩの単−Ｐｓｔ 　Ｉ部位中にクローニングし、プラスミドｐ’ｒＫｇｐｔ−ＰＴＨＢａを生じた 。この挿入プラスミドの構築を、図１に模式的に示す。

ｂ）ｐＴＫｇｐｔ−ＰＴＨＢｂの構築 この場合は、プロトロンビンｃＤＮＡの０．４ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｘサブ断片（ｐＩ ＩＨ１３から切り出され、シグナル配列及びプロ配列を包含する）を、Ｍ１３ｍ ｐ１ｇ中にクローニングし、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発により、停止 コドンの７０　ｂｐ上下流ＥｃｏＲＩ部位を導入した。オリゴヌクレオチドｏＰ Ｔ３　（５′−ＧＴＴＴＣＴ　ＡＡＡ　ＡＣＴ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＣＣＣＡＡＴ ＡＡＡ　ＡＧＴ−３′）を突然変異誘発のために用いた。オリゴヌクレオチドｏ ＰＴ５（５”−ＡＴＴ　ＣＴＧ　ＧＧＣＴＣＣＴＧＧ　Ａ−３′）は突然変異の 約６０　ｂｐ上下流位置し、突然変異を制御するためのシーフェンス決定用プラ イマーとして役立った。

修飾された０、４ｋｂＰＳｔ　Ｉ断片を中間体プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＰＴＨ ＢＩの単−Ｐｓｔ　ｒ部位中にクローニングした（上記のｐＴＫｇｐｔ−ＰＴＨ Ｂａの構築を参照）。ポリ（Ａ）配列を伴わないプロトロンビンｃＤＮＡを含有 する２、０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をｐＴＫｇｐｔ−ｏＦｌ　ｓの単−ＥｃｏＲＩ 部位中にクローニングして、プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＰＴＨＢｂを生じた。こ の挿入プラスミドの構築を、図２に模式的に示す。

上記のプラスミドの両方において、プロトロンビンコード領域をＩＩＫポリペプ チドの開始コドンの後ろに正確に融合する。この正確な融合を得るための模式図 を、図３に示す。図３から推測されるように、オリゴヌクレオチド指定突然変異 誘発による新規のＥｃｏＲＩ部位の導入のために選択されたストラテジーは、プ ロトロンビンのシグナルペプチド中への２つの付加的アミノ酸（Ａｓｎ及び５ｅ ｒ）の組込みをもたらした。シグナルペプチド切断部位は約４０アミノ酸離れて 位置するため、この突然変異は正確なプロセッシング及び成熟ポリペプチド鎖の 分泌を妨害しないと思われる。

ｐＴＫｇｐｔ−ＰＴＨＢｂにおいては、さらに、プロトロンビンｃＤＮＡのポリ （Ａ）尾部、及び１４　ｂｐ　Ｇ／Ｃ配列を、プロトロンビン遺伝子の３′末端 に第二のＥｃｏＲ１部位を導入し、その後切断することにより除去したが、一方 、ｐＴＫｇｐｔ−ＰＴＨＢａにおいては、ポリ（Ａ）尾部及び１４　ｂｐ　Ｇ／ Ｃ配列は依然として存在することが、図３から推測される。

２、ワクシニアウィルス組換え体ｖＰＴＨＢａ及びｖＰＴＨＢｂの構築 Ｉｎ　ｖｉｖｏ組換えのために、　Ｍ、Ｍａｃｋｅｔ　ｅｔ　ａｌ、が「外来遺 伝子を発現するワクシニアウィルス組換え体の構築と特徴づけＪ　、　Ｄ、Ｍ。

Ｇｌｏｖｅｒ編ｒ　Ｄ　Ｎ　Ａクローニング：実際的アプローチＪ　、ＩＲＬ　 Ｐｒｅｓｓ。

０ｘｆｏｒｄ（１９８５）、　ｐ、１９１−２１１に記載した手法を、以下の修 正を加えて実施した： ５　ｘ　１０’　ＣＶＩ細胞（集密的単層）を０．２　ｐｆｕ／細胞のワクシニ ア野生型ウィルスで感染させた。感染２時間後に、１ｍｌのカルシウムＤＮＡ沈 殿物（５ｕｇのｐＴＫｇｐｔ−ＰＴＨＢａ又は１）ＴＫｇｐｔ−ＰＴＨＢｂの超 らせんプラスミドＤＮＡ、１μｇのワクシニアウィルス野生型ＤＮＡ、及び１４ μｇの剪断ニシン***ＤＮＡから成る）を細胞に付加した。室温で１５分間イン キュベートした後、９ｍｌの培地（ＤＭＥＭ、８％ＦＢＳ及び抗生物質入り）を 加えた。４時間後に培地を変え、インキュベーションをさらに４８時間継続した 。

細胞を収穫し、１＋１培地中に再懸濁し、ウィルス粗製ストックを調製した。

３、ｇｐｔ”ワクシニアウィルス組換え体の選択ｇｐｔ”突然変異体の単離のた めに、Ｂ５Ｃ１細胞上でのプラーク検定を以下のように実施した：集密状態のＢ ５Ｃｌ細胞をｇｐｔ選択培地（ＤＭＥＭ、２．５％　ＦＢＳ、抗生物質、２５４ ｔｇ／ｍｌのＭＰＡ、２５０　μｇ　／１１１１のキサンチン、及び１５μｇ／ ＋ｎｌのヒボキサンチン）中で１４〜２４時間、ブレインキュベートした。ウィ ルス粗製ストック（０，５ｍｌの再懸濁細胞を３回凍結、解氷し、等容量の０． ２５ｍｇ／ｍｌのトリプシンを添加した。混合液を＋３７℃で３０分消化し、２ ０秒間音波破砕した）の１０４．１０−’　、及び１０−Ｓ希釈液を用いて、Ｂ ５Ｃｌ細胞を感染させた。＋３７℃で１．５時間インキュベーション後、細胞に 、１％の低融点アガロースを含有するｇｐｔ選択培地を１贋した。２日間インキ ュベーション後、細胞をニュートラルレッドで染色した。−夜インキュベーショ ン後、プラークが見え易くなった。Ｆ、Ｇ、Ｆａｌｋｎｅｒ　ｅｔ　ａＬ、がＪ 、　Ｖｆｒｏｌ、６２．１８４９−１８５４．１９８８に記載しているようにプ ラーク精製を実施した。

４、プロトロンビン発現組換え体ウィルスのスクリーニングａ）種子ウィルスに よる細胞の感染 サル腎細胞（Ｃｖｌ及びＶｅｒｏ細胞）を抗生物質及びグルタミンを加えたＤＭ ＥＭ、１０％ウシ胎仔血清中で増殖させた。集密状態に達する１日前に、ビタミ ンに、を２０ＬＬｇ／ｍｌの最終濃度で添加したくビタミンに＋はシグマから購 入した＃Ｖ−３５０１で、エタノール中に溶解した５ｏ＋ｇ／ｍｌストック溶液 として＋４℃で貯蔵した）。単層が集密状態に達したら、それらをＭ　ｇ　２− 及びＣａ”を含有するリン酸緩衝生理食塩水中で２回洗浄し、その後、０．１〜 ｌＯプラ一ク形成単位（ｐｆｕ＞の精製ウィルスで感染させた。１時間のウィル ス吸着後、血清無含有培地（ＤＭＥＭ）及びビタミンＫを添加した。

細胞を２日間増殖させ、その後、下記のように、アルカリホスファターゼを結合 した細胞上澄のタンパク質を沈殿させて、ヒトプロトロンビンに対する抗体を用 いてウェスターンブロッティングにより分析した： ｂ）細胞培養上澄のアセトン沈殿 上澄を３０００ｇで１０分間遠心分離して細胞砕片を除去し、２容量のアセトン で沈殿させて、氷上で３０分インキュベートした。８０００ｇで１０分間遠心分 離後、ベレットを０．２５ｍ１の０．ＯＩＮ　Ｎ　ａ　ＯＨ中に再溶解し、７０ ℃で３分間加熱して、遠心分離し、未溶解物質を除去した。

上澄を２０μｍのＩＭ）−リス／塩酸、　ｐＨ７，０で中和し、２容量のアセト ンで再び沈殿させた。その結果生じたベレットを４０μｍのＳＤＳ試料緩衝液中 に溶解した。連室、１０μｍをゲル上に載せた。

Ｃ）ウェスターンプロット分析 手法は、本質的にはＨ，Ｔｏｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、がＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８３．６６７２−６６７６　（１９７９）に記載 した通りに実施し、以下の修正を加えた：タンパク質を１０％５ＤＳ−ポリアク リルアミドゲル上で分離し、１２．５ｍＭ　トリス、９６ａ＋Ｍ　グリシン　ｐ Ｈ８，３、及び１０％メタノールを含有するトランスファー緩衝液中でＨｏｅｆ ｅｒ　ＴＥシリーズＴｒａｎｓｐｈｏｒ電気泳動ユニットで２００ｍＡで１時間 、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｈｙｂｏｎｄ　Ｃ）上にプロットし た。膜をウェスターン緩衝液（ＷＢ、リン酸緩衝生理食塩水、０．１％トゥイー ン（Ｔｗｅｅｎ）２０　）中に２Ｄ分間３回浸漬し、１０％正京ヒツジ血清を含 有するＷＢ　２０ｍ１中でブレインキュベートした。１時間後、４０μｍのアル カリホスファターゼと結合したヒツジ抗ヒトプロトロンビン抗体（Ｓｅｒｏｔｅ ｃ　ＡＨＰ０６Ａ）を添加（その結果抗血清の１　：　５００希釈液を生じる） し、インキュベーションを一夜継続した。膜をＷＢ中で１０分間、３回、アルカ リホスファターゼ（ＡＰ）緩衝液（０，１Ｍ）−リス／ＣＨＩｐＨ９，５，０， ＩＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＭｇＣ１ａ）中で３分間、１回、洗浄し、その後６６ μｍニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ；７０％ジメチルホルムアミド中に５ ０μｇ　／　ｍｌ）及び３３μｍ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホス フェート（ＢＣｉＰニジメチルホルムアミド中に５０μｇ　／　０１１）を含有 する１０ｍ１のＡＰ緩衝液中で３〜１０分間、発色させた。

全試料において、精製プロトロンビン対照と弁移動する新規のタンパク質バンド が容易に観察されたが、このバンドは非感染又は野生型感染細胞には存在しなか った。このスクリーニング工程に基いて、陽性ウィルスｖＰＴＨＢａ及びｖＰＴ ＨＢｂを大量に増殖させて、精製した。

ｄ）ウィルス組換え体のゲノム特性 組換え体ウィルスにおけるプロトロンビン遺伝子の存在及び組込みパターンを調 べるために、制限酵素切断、及びその後サザーンプロット分析を実施した。精製 組換え体ｖＰＴＨＢａ及びｖＰＴＨＢｂのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨｉ ｎｄＩＩＩ　及　びＥｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲル中を電気泳動し、 ニトロセルロースフィルター上にプロットした。フィルターを先ずチミジンキナ ーゼプローブ（ｔｋ−プローブ）で、その後プロトロンビン遺伝子プローブ（Ｐ ＴＨＢ−プローブ）でハイブリダイズした：ｔｋ−プローブでハイブリダイズし たＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ消化試料においては、チミジンキナーゼ遺伝子を含有 する野生型ウィルスＨｉｎｄＩＩＩＪ断片は、約５．Ｏｋｂのバンドとして見え た。両組換え体ウィルスは約６．０　ｋｂの予測されたバンドと、ｔｋ配列を含 有する約１．Ｏｋｂの小型化したバンドを含有した。プロトロンビンプローブを 用いた場合、６．Ｏｋｂのバンドのみが観察された。得られたパターンは、プロ トロンビンｃＤＮＡのウィルスｔｋ−遺伝子座への組み込みを確証する。

ｔｋ−プローブでハイブリダイズしたＥｃｏＲｒ消化試料においては、野生型ウ ィルスのチミジンキナーゼ遺伝子は約７．０及び８．Ｏｋｂの２つの断片に分割 された。ｖＰＴＨＢａ試料では、プロトロンビン遺伝子の組み込みのために、約 ９．０及び１０．０ｋｂの２つの予測された大型化した断片が現れた。ｖＰＴＨ Ｂｂでは、第二のＥｃｏＲｒ部位が導入され、これはＥｃｏＲＩ消化時にプロト ロンビン遺伝子の切り出しを生じる。したがって、ｖＰＴＨＢｂパターンは、１ ０．　Ｏｋｂ断片（ｖＰＴＨＢａ試料にも認められる）及び７．１）ｋｂ断片（ 野生型ＤＮＡにも認められる）を示した。プロトロンビンプローブを用いた場合 、ｖＰＴＨＢａでは予期された９、０ｋｂ断片が、ｖＰＴＨＢｂでは、２．０　 ｋｂの切り出されたプロトロンビン遺伝子が検出された。分析により、２つの組 換え体ウィルスの予期された組み込みパターンが確証された。

５、プロトロンビンを分泌する好ましい細胞株の選択例えば増殖、基材への付着 、分泌及び翻訳後修飾といったようなある種の機能に関する細胞のポテンシャル は、細胞の種類によって変化する。以下の実験は、ワクシニアウィルス宿主範囲 内にあって、許容可能な増殖特性を有し、活性のあるビタミンに依存性タンパク 質を分泌可能な細胞株をスクリーニングし、同定するのに役立つ。

プロトロンビン欠損血漿を用いて、凝固検定でプロトロンビン活性を測定した。

既知の濃度（免疫ＦＩＩ、ＩＸ、　Ｘ−ＣＰＫ標準）のヒトプロトロンビンを用 いて、標準曲線を作成した。

表１に示した実験に関しては、細胞なりＰＴＨＢａで感染させた。４８時間後に 収穫した上澄及び総細胞タンパク質を、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動により分析し、クマシーブルー染色したゲル中で既知量の精製プロトロンビン に対して定量した。

肝細胞株（Ｈｅｐ　Ｇ２　及びＨ４−１１−Ｅ−Ｃ３）の他に、腎細胞（例えば 、ＢＨＫ及びＭＤＣＫ）及び卵巣細胞（ＣＨＯ）も、活性のあるガンマカルボキ シル化タンパク質を産生ずることが示された。これらの細胞株の公知の特性、及 び生物学的に活性のあるプロトロンビンの発現のための要求に基いて、表１に列 挙した細胞株を、プロトロンビン発現試験用に選択した。

表１ プロトロンビン分泌細胞株の選択 細胞株　供給源　４８時間上澄　細胞内部　カルボキシル化Ｂ５Ｃｌ　腎臓、　 ＡＧＭ　十＋＋　＋　ｎ、ｄ。

（ＣＣＬ　２６１ ＣＶＩ　腎臓、ＡＧＭ　＋＋＋　＋＋　認められた（ＣＣＬ　７０１ Ｖｅｒｏ　腎臓、ＡＧＭ　＋＋＋　十　認められた（ＣＣＬ　８１１ ＲＫ　１３　腎臓、ウサギ　＋　＋　＋　＋　ｎ、ｄ。

（ＣＣＬ　３７１ １４３Ｂ　骨肉腫　−＋　ｎ、ｄ。

（ＣＲＬ　８３０３１ ２９３　腎臓、ヒト　＋　十　認められた（ＣＲＬ　１５７３１ ＢＨＫ−２１腎臓、ハムスター　＋　＋＋　認められた（ＣＣＬ　１０１ ＋　＝目に見えるプロトロンビンバンド（約５０ｎｇ）　＋＋　＝　Ｊ：　＜見 える（約５００〜１００　ｎｇ） ＋＋＋＝強力なバンド（＞２００　ｎｇ）−＝プロトロンビンバンドなし ＡＧＭ　＝アフリカミドリザル ｎ、ｄ、＝測定しなかった 表１から、アフリカミドリザル腎細胞株Ｂ５Ｃｌ、Ｃｖｌ、及びＶｅｒｏ細胞が 最も十分にプロトロンビンを分泌することが分かる。ウサギ腎細胞株ＲＫ１３に 関しては、それが大量のタンパク質を細胎内に蓄積することが示された。プロト ロンビンの分泌及び蓄積は、本発明の組換え体ウィルスで感染させた場合、腎細 胞株２９３及びＢＨＫ−２１にも見出された。

本発明のワクシニアウィルス組換え体は、血液因子、特にビタミンに依存性血液 凝固因子の発現に関する、細胞株の迅速なスクリーニングを可能にする。同一サ イズ範囲における移動は、ワクシニアウィルス感染細胞に由来する組換えプロト ロンビンが血液由来タンパク質と同程度のグリコジル化を示すことを示唆する。

６、生物学的に活性のあるプロトロンビンの発現の最適化上記の実験が、感染Ｃ ｖ１及びＶｅｒｏ細胞の上澄中のプロトロンビンレベルが、試験した他の細胞株 よりも有意に高いことを示し、予備血液凝固検定は上澄が生物学的に非常に活性 であることを示したために、これら２つの細胞株を以下の実験用に選択した。

ａ）第一の実験において、プロトロンビン発現ウィルスによる感染の用量への細 胞培養上澄の活性の依存性を測定した。細胞当り０．１〜２０プラーク形成単位 の範囲のｖＰＴＨＢａ又はｖＰＴＨＢａでは、４８時間上澄におけるプロトロン ビンレベルは、有意に相異しなかった。したがって、細胞当たり　０．１〜３、 好ましくは０．１〜１プラ一ク形成単位が、Ｃｖｌ及びＶｅｒｏ細胞の両方にお いて、最大量の分泌されたＩＩ因子を得るのに十分であることが推測される。

ｂ）以下の実験は、インキュベーション時間の増加に伴う分泌タンパク質の蓄積 に関する。感染ＣＶＩ細胞の細胞培養上澄を、感染後１２．２４．４８．６０． ７２及び９６時間目に調べた。分泌されたプロトロンビンの連続的増加が、７２ 時間までの範囲の時間に亘って観察された。これらの試験を、ゲル電気泳動及び ウェスターンプロット分析と共に行なった。長時間に亘って、他の分泌タンパク 質の増加も認められることが観察された６分泌されたプロトロンビンの最大は、 ６０〜７２時間であることが示された。

Ｃ）プロトロンビン発現の細胞周期依存性本発明の系における有効な発現のため の別の不可欠のパラメーターは、感染細胞の細胞周期の相であることが判明した 。この実験のためには、感染前にＣｖ１細胞を、ビタミンに、の存在下でそれら がちょうど集密状態に達するまで、又はさらに１．２もしくは３日間増殖させた 。感染後４８及び７２時間目にＩＩ因子活性に関して、上澄を調べた。

細胞が集密状態に達した直後（１日）に感染を実施した場合、中等度の活性レベ ルが得られることが観察された。しかしながら、集密的単層の加齢に伴って、プ ロトロンビンの連続的増大が観察された。プロトロンビン活性の最大は、集密状 態に達したＣＶＩ細胞を感染後に得られた。感染前の細胞を静止期に止めると最 高の結果が得られることが、反復実験で示された。発現レベルの増大は、一部は 細胞密度の増加に依っているが、しかし密度の増大のみでは全体的発現増大を説 明するのに十分でない。

７、発現レベルの算出 Ｃｖｌ及びＢ５Ｃｌ細胞において上記の実験で得られたような発現レベルは、８ ．０μｇ　／　ｍｌまでのプロトロンビン抗原を産生じたと決定した。

８、生物学的活性の測定 組換えプロトロンビンの生物学的活性が培地１ａｌ当たり５０〜７０ミリユニツ トであることを決定し、したがって、生物学的活性形態の抗原形態に対する比率 がＶｅｒｏ細胞では７０％まで、Ｃｖ１細胞では６０％までである組換えプロト ロンビンを産生じた。

実施例　ＩＩ： ワクシニアウイルス組換え体ｖ　Ｐ　Ｔ　６　／　２の構築及びプロトロンビン の発現 組換え体ウィルスｖ　Ｐ　Ｔ　６　／　２を構築するために、図２に示すような 挿入プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＰＴＨＢｂをワクシニアウィルスＷＲ６／２株で 組換えた（Ｍｏｓｓ　ｅｔ　ａｌ、　：　ｒ非必須ポリペプチドをコードするツ クシニアウイルスゲノムの９，０００　ｂｐ断片の欠失」；Ｊ、　ＶＬｒｏｌ、 　４０．１９８１．３８７−３９５；この株は、ＮＴｌ５を介して公的に入手可 能である）。この株は、通常用いられるＷＲ株と比較してさらに弱毒化されてお り（マウスモデルでは１０６倍；　Ｂｕｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　：　ｒ組換え ワクシニアウィルス発現ベクターの減少された悪性度はチミジンキナーゼ陰性の 表現型と関連しているＪ　ＨＮａｔｕｒｅ　３１７．１９８５，８１３−８１． ５　）　、産生ずるにはより安全なベクターである。

プロトロンビンの発現のために、実施例Ｉに記載されたと同様の方法で、ｖ　Ｐ 　Ｔ　６　／　２を用いた。Ｖｅｒｏ細胞におけるプロトロンビンの生物学的活 性の生成力は、図７から得られる。その他の条件に関しては、図７の凡例を参照 されたい。

実施例ＨＩ　： プロトロンビンｃＤＮＡのワクシニアウィルス赤血球凝集素遺伝子座への挿入の ためのプラスミド 実施例工及びＩＩに記載されているようなプロトロンビン発現組換え体において 、プロトロンビンｃＤＮＡをウィルスチミジンキナーゼ遺伝子座に組み込んだ。

ウィルスｔｋ遺伝子の不活性化はウィルスを弱毒するため、この弱毒化はさらに 発現される外来遺伝子の発現レベルの低減を引き起こすと考えられる。

したがって、ワクシニアウィルスの赤血球凝集素遺伝子座に組み込まれた外来遺 伝子を有する２つのウィルス組換え体を構築した。

１、ワクシニアウィルス挿入プラスミドｐＨＡｇｐｔ−ｏＦａ及びｐＨＡｇｐｔ −ｏＦｂの構築 ワクシニア赤血球凝集素遺伝子の１．６ｋｂ　Ｈｉ　ｎ　ｃ　ＩＩ断片（Ｓｈｉ ｄａ　Ｈ，：　ｒワクシニアウィルス赤血球凝集素の塩基配列」；Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ　１５０，４５１−５６２　）をｐ　Ｔ　Ｚ　１９　Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ、　Ｉｎｃ、　）の大型ＰｖｕＩＩベクター断片と連結することにより、基本 ベクターｐＨＡを構築した。ＨＡ遺伝子の供給源は、プラスミドｐｖｙ５（Ｂ、 Ｍｏ５ｓから入手）であった、　ｐＨＡの単−ＮｒｕＩ部位に、プラスミドｐＴ Ｋｇｐｔ−ｏＦ１ｓの１．７ｋｂ　ＨｐａＩ−ＤｒａＩ遺伝子カセットを挿入し た（Ｆａｌｋｎｅｒ、Ｆ、Ｇ、、Ｍｏ５ｓ　Ｂ、　：　Ｉ’大腸菌ｇｐｔ遺伝子 はワクチニアウィルスオーブンリーディングフレーム発現ベクターのための優性 選択マーカーを提供するＪ　；Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　１９８８；６２：１８４９− １８５４　）　、カセットは、多重クローニング部位を含むｐＨプロモーター、 及びワクシニアウィルスＰ７．５プロモーターによって駆動されるｇｐｔ遺伝子 から成る。２つの考え得る配向け、ｐＨＡｇｐｔ−ｏＦａ及びｐＨＡｇｐｔ−ｏ Ｆｂを示した。これらのプラスミドを、図４に示す。

２．ワクシニアウィルス挿入プラスミドｐＨＡｇｐｔ−ＰＴａ及びｐＨＡｇｐｔ −ＰＴｂの構築 ｐＴＫｇｐｔ−ＰＴＨＢｂの２．０ｋｂＥｃｏＲＩ断片をＥｃｏＲＩで線状化し 、ホスファターゼ処理したプラスミドｐＨＡｇｐｔ−ＯＦａ中に挿入することに より、プラスミドｐＨＡｇｐｔ−ＰＴａを構築した。

同様に、上記の２．Ｏｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＩで線状化したプラス ミドｐＨＡｇｐｔ−ｏＦｂ中に挿入することにより、プラスミドｐＨＡｇｐｔ− ＰＴｂを構築した。

図５に示す上記のプラスミドを用いて、ワクシニア野生型ウィルスによるｉｎ　 ｖｉｖｏ組換えによって組換え体ウィルスｖＨＡ−ＰＴａ及びｖＨＡ−ＰＴｂを 生成した。

Ｖｅｒｏ細胞を、実施例ＩＩに記載されているのと同様の方法で、上記の組換え 体ウィルスに感染させた。他のウィルス組換え体と比較した場合のプロトロンビ ンの発現レベルは、図７から推測される。

実施例■■： ワクシニアウイルス組換え体ｖＴＫｅｍｃ−ＰＴ２の構築及びプロトロンビン発 現のためのその使用 プロトロンビン発現のレベルを改良するために、非常に有効なハイブリッドワク シニアウィルス発現系に基いた、新規のワタシニアウイルス組換え体を構築した 。この系では、あるウィルスはバクテリオファージエフポリメラーゼを発現し、 第二のウィルスは転心筋炎（ＥＭＣ）ウィルスのリーダー配列を後ろに持ってい るＴ７プロモーターの制御下で、標的遺伝子（プロトロンビン）を発現する（Ｅ ｌｒｏｙ−３ｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　：　ｒ転心筋炎ウィルス５′配列によっ て付与されるｍＲＮＡのキャップ非依存性翻訳はワクシニアウィルス／バクテリ オファージエフハイブリッド発現系の功績を改良する」Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＬＩＳＡ）、１９８９；８Ｂ、　６１２６−６１３０　） 　、このＥＭＣリーダーは、Ｔ７転写物にキャップ非依存性翻訳を付与し、した がって翻訳効率を増大する。

１、ワクシニアウィルス挿入プラスミドｐＴＫｅｍｃ−ＰＴ２の構築 プロトロンビンｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＰＴＨＢｂの２． ０ｋｂＥｃｏＲＩ断片（図２）を、ベクターｐＴＭ３の単−ＥｃｏＲＩ部位に挿 入した。その結果生じたプラスミドｐＴＫｅｍｃ−ＰＴｘに、プロトロンビンｃ ＤＮＡを、ベクターｐＴＭ３によって提供される開始コドンの後ろにフレームを ずらして挿入する。コード領域を開始コドンと正確に融合するために、ｐＴＫｅ ｍｃ−ＰＴｘ−重鎖ＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドｏＰＴ９　（５′−ＡＧＣＣ ＴＣＧＧＡ　ＣＧＴ　ＧＣＧＣＣＡ　ＴＧＧ　ＴＡＴ　ＴＡＴ　ＣＧＴ−３′） を用いて、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を実施した。プラスミドをＥ、 ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２株中にトランスフェクトし、ヘルパーファージＭ１３　Ｋ Ｏ７で重感染することにより、ｐＴＫｅｍｃ−ＰＴｘから一本鎖ＤＮＡを得た。

その結果生じたプラスミドｐＴＫｅｍｃ−ＰＴ２において、開始コドン周囲の融 合部位の正確な一次構造を、プライマーｏＰＴ２（５′−ＣＴＧ　ＴＧＣＡＣＡ 　ＡＧＧＣＴＡ　ＣＡＣ−２’）を用いたシーケンス決定により確証した。

この方法により、プロトロンビンの野生型配列をプラスミドｐＴＫｅｍｃ−ＰＴ ２中に回復する。

次に、実施例　Ｉに記載されているようなｉｎ　ｖＬｖ□組換え法、及びその後 の組換え体ウィルスの優性選択によって、組換えウィルスｖＴＫｅｍｃ−ＰＴ２ を得た。

図１　νｌ）ＴＨ８２ 図２　Ｙ／＝ｎＨａコ 図６　ワタシニアウイルス挿入プラスミドｐＴＫｅｍｃ−ＰＴ２の溝築（ｑ式図 図７ 要　約 組換えにより産生される血液因子、並びにその調整方法を記載する。上記血液因 子は、少な（とも５０％、好適には６０〜９０％の範囲の生物学的活性形態の抗 原形態に対する比率を有する。また、上記の方法に使用される組換え体ワクシニ アウィルスをも開示する。本発明の方法は、安定な発現条件下で高い翻訳後能力 を持つ改良された発現系を提供する。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年７月２４日

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. １．組換え的に産生される血液因子、並びに少なくとも一つのアミノ酸の置換、 欠失、又は挿入によるその誘導体であって、少なくとも５０％の生物学的活性形 態の抗原形態に対する比率を有する血液因子。
2. ２．上記比率が６０〜９０％の範囲内である請求項１記載の血液因子。
3. ３．上記比率が７０〜８０％の範囲である請求項１記載の血液因子。
4. ４．プロトロンビンの全部又は部分配列を表す請求項１〜３のいずれか一に記載 の血液因子。
5. ５．ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、プロテインＣ、及びプロテインＳの群から 選択されるビタミンＫ依存性血液因子の全部又は部分配列を表す請求項１〜３の いずれか一に記載の血液因子。
6. ６．Ｖ因子、ＶＩＩＩ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩ因子、フォン・ピルブラント因 子、又はプラスミノーゲンの全部又は一部のアミノ酸配列を包含する請求項１〜 ３のいずれか一に記載の血液因子。
7. ７．請求項１〜６記載の血液因子並びに少なくとも一つのレプリコンをコードす る外来ｃＤＮＡ配列、少なくとも一つの選択マーカー、クローニング部位、及び 少なくとも一つのプロモーターを包含する挿入プラスミドであって、ワクシニア ウイルスのＤＮＡ配列が上記プロモーター及び外来ｃＤＮＡに隣接するプラスミ ド。
8. ８．ブランキングＤＮＡ配列がワクシニアウイルスの非必須領域に対応する請求 項７記載のプラスミド。
9. ９．ワクシニアウイルスのフランキングＤＮＡ配列がチミジンキナーゼ配列に対 応する請求項７記載のプラスミド。
10. １０．ワクシニアウイルスのフランキングＤＮＡ配列が赤血球凝集素配列に対応 する請求項７記載のプラスミド。
11. １１．上記プロモーターが後期ワクシニアウイルスプロモーターである請求項７ 記載のプラスミド。
12. １２．上記ワクシニアウイルスプロモーターが後期１１Ｋ−プロモーターである 請求項１１記載のプラスミド。
13. １３．上記ワクシニアウイルスプロモーターが合成後期プロモーターである請求 項１１記載のプラスミド。
14. １４．上記ワクシニアウイルスプロモーターが合成初期及び後期プロモーターで ある請求項１１記載のプラスミド。
15. １５．外来ｃＤＮＡが１１Ｋポリペプチドのプロモーターの、又は請求項７〜１ ４記載のプロモーターのいずれかの下流に、及び極めて接近して挿入される請求 項７〜１４のいずれか一に記載のプラスミド。
16. １６．ポックスウイルスプロモーターの３′末端、及び下流に続く発現さるべき 外来ＤＮＡ配列の５′末端が極めて接近して存在し、外来ＤＮＡ配列の５′末端 が一つ又はそれ以上のヌクレオチド又はコドンにより延長又は短縮され、したが ってそれがポックスウイルスプロモーターの３′末端の同一に工学的処理された 又は天然の制限部位に対応する制限部位を形成することを特徴とする請求項７〜 １５のいずれか一に記載のプラスミド製造方法。
17. １７．外来ｃＤＮＡ配列が請求項１〜６記載の血液因子をコードする請求項７〜 １５記載のプラスミド。
18. １８．外来ｃＤＮＡ配列がプロトロンビン、又はその機能的等価物をコードする 請求項１７記載のプラスミド。
19. １９．５′末端の２つの付加的アミノ酸Ａｓｎ及びＳｅｒをコードするＤＮＡ配 列を適正な挿入のためにプロトロンビンシグナル配列が包含するように修正する ことによる新規のＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を包含する請求項 １５記載のプラスミド。
20. ２０．下記の部分プロモーター−外来ｃＤＮＡ配列：【配列があります】 を包含する請求項１９記載のプラスミド。
21. ２１．下記の部分プロモーター−外来ｃＤＮＡ配列：【配列があります】 を包含する請求項１９記載のプラスミド。
22. ２２．請求項１〜６のタンパク質をコードする外来ｃＤＮＡ配列がプロモーター に極めて接近してプラスミドｐＴＫｇｐｔ−ｏＦｌｓのオーブンリーディングフ レーム中にクローニングされた請求項１９記載のプラスミド。
23. ２３．図１に示すようなプラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＰＴＨＢａ。
24. ２４．図２に示すようなプラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＰＴＨＢｂ。
25. ２５．図４に示すようなプラスミドｐＨＡｇｐｔ−ｏＦａ及びｐＨＡｇｐｔ−ｏ Ｆｂ。
26. ２６．請求項１〜６のタンパク質をコードする外来ｃＤＮＡ配列が発現される外 来ＤＮＡを制御するプロモーターに極めて接近してオーブンリーディングフレー ム中にクローニングされた請求項２５記載のプラスミド。
27. ２７．図５に示すようなプラスミドｐＨＡｇｐｔ−ＰＴａ及びｐＨＡｇｐｔ−Ｐ Ｔｂ。
28. ２８．図６に示すようなプラスミドｐＴＫｅｍｃ−ＰＴ２。
29. ２９．請求項７〜１５、及び１７〜２８記載のプラスミドによる野生型ワクシニ アウイルスのｉｎ　ｖｉｖｏ相同組換えによって得られる組換え体ワクシニアウ イルス。
30. ３０．請求項２３及び２４記載のプラスミドによる野生型ワクシニアウイルスの ｉｎ　ｖｉｖｏ相同組換えによって得られる組換え体ワクシニアウイルスｖＰＴ ＨＢａ及びｖＰＴＨＢｂ。
31. ３１．請求項７〜１５、及び１７〜２８記載のプラスミドによるワクシニアウイ ルスＷＲ６／２株のｉｎ　ｖｉｖｏ相同組換えによって得られる組換え体ワクシ ニアウイルスｖＰＴ６／２。
32. ３２．請求項２８記載のプラスミドによる野生型ワクシニアウイルスのｉｎ　ｖ ｉｖｏ相同組換えによって得られる組換え体ワクシニアウイルスｖＴＫｅｍｃ− ＰＴ２。
33. ３３．請求項２９〜３２記載の組換え体ワクシニアウイルスによる宿主細胞の感 染によって得られる請求項１〜６記載の血液因子の発現のための脊椎動物細胞培 養。
34. ３４．宿主細胞が哺乳類肝臓又は腎臓細胞である請求項３３記載の細胞培養。
35. ３５．宿主細胞がＶｅｒｏ、ＣＶ１、ＢＳＣ１、ＢＨＫ、又はＲＫ１３細胞であ る請求項３４記載の細胞培養。
36. ３６．請求項２９〜３２記載の組換え体ワクシニアウイルスによる哺乳類宿主細 胞の感染、上記細胞の培養、所望の血液因子の発現、及びその回収を包含する請 求項１〜６のいずれか一に記載の血液因子の組換えによる製造方法。
37. ３７．上記宿主細胞がＶｅｒｏ、ＣＶ１、ＢＳＣ１、ＢＨＫ、又はＲＫ１３細胞 である請求項３６記載の方法。
38. ３８．宿主細胞ＲＫ１３を用い、外来遺伝子がシグナル配列を欠く請求項３７記 載の方法。
39. ３９．感染前に細胞が集密状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に達している請求項３ ６記載の方法。
40. ４０．宿主細胞の感染が０．１〜２０ｐｆｕ、好ましくは０．１〜１　ｐｆｕの 組換え体ワクシニアウイルスを用いて実施される請求項３６及び３９記載の方法 。
41. ４１．細胞の培養及び／又は所望の血液因子の発現がビタミンＫの存在下で実施 される請求項３６記載の方法。
42. ４２．上記感染細胞の培養が高密度系で実施される請求項３６記載の方法。
43. ４３．上記感染細胞の培養が微粒子担体培養又はホローファイバー系で実施され る請求項３６記載の方法。
44. ４４．所望の血液因子が細胞又は上澄から回収される請求項３６記載の方法。
45. ４５．血液因子の回収が感染後４８〜９６時間、好ましくは６０〜７２時間で実 施される請求項３６記載の方法。