JPH05505312A - サルモネラ属の細菌を検出するための細菌学的分析方法及び培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サルモネラ属の細菌を検出するための細菌学的分析方法及び培地 本発明は、サルモネラ（Ｓａｔ■ｏｎｅｌｌａ）属の細菌の特定又は単離に関す るものであって、前記細菌を含むと推定される接種材料（ｉｎｏｃｕｌｕ■）を 特定の培地に接種し、該培地上で前記細菌を増殖させ、次いで細菌探索（ｂａｃ ｔｅｒｉａ　ｓｏｕｇｈｔ）に特有の生化学的特性の１つ又はそれ以上を使用す る色素産生性又は弗素産生性（Ｎｕｏｒｉｇｅｎｊｃ）特性決定現象（ｃｈａｒ ａｃｔｅｒｉｓａｔｌｏｎ　ｐｈｅｎｏｍｅｎａ）の１つ又はそれ以上を発現さ せることによってサルモネラ属の細菌を特定又は単離すること関する。

サルモネラ菌はグラム陰性腸内細菌であって、一般的に下記の生化学的特徴： サルモネラ属だけに帰属し得る生化学的特徴が存在しないので、サルモネラ属の 細菌の特定は一般的に複数の生化学的試験又は多数の生化学的試験さえも必要と し、適当な場合には免疫学的試験又は形態学的検査により補足される。

しかしながら、サルモネラ菌に選択的であるとして提供され、しかも少なくとも ２種類の生化学的試験（それぞれ色の有無に基づく）を使用する寒天培地が商業 的に入手し得る。

これらの寒天培地は、一般的にグラム陽性菌及びある種のグラム陰性菌の阻害剤 （Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含有する。

通常的に使用される阻害剤の中で、胆汁塩（デオキシコール酸ナトリウム等）、 クエン酸ナトリウム及びブリリアントグリーンが挙げられる。

これらの寒天培地上でのサルモネラ菌の検出は下記によって：すなわち −１種又はそれ以上の炭水化物（ラクトース等）の発酵が存在しないこと、 −Ｈ２Ｓの産生、すなわちサルモネラ菌に一般的に存在する生化学的特性につい ての調査（この検出は培地中にチオ硫酸ナトリウムと第２鉄塩を配合することに よって行われる） によって可能である。

サルモネラ菌の検出に使用される主な寒天培地としては下記のものがある、すな わち −５ｏｃＩｅｔ＆　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｐａ５ｔｅｕｒ製のり、Ｃ，Ｌ、 寒天−５ｏｃｉ６ｔ６　ＢＩｏＭ６ｒ１ｅｕｘ及び５ｏｃｉ６ｔ６　Ｄｌａｇｎ ｏｓｔｉｃｓＰａｓｔｅｕｒ製のり、Ｃ，Ｌ、Ｓ、寒天−Ｓｏｃ１Ｍ６　Ｂｊｏ Ｍ６ｒｌｅｕｘ及び５ｏｃ１６ｔ６　ＤＩａｇｎＯ８ｔ４Ｃ８Ｐａｓｔｅｕｒ製 のｌ１ｅｋｔｏｅｎ寒天−５ｏｃ１６ｔ６　ＢＩｏＭＭｒｌｅｕｘ及び５ｏｃｌ ｅｔ６　ＤｌａｇｎｏｓｔｌｃｓＰａｓｔｅｕｒ製のＳ、Ｓ、寒天 −５ｏｃｉ６ｔ６　ＤｌａｇｎＯ８ｔｌＣ８Ｐａ５ｔｅｕｒ製のＫｒ１ｓｔｅｎ ｓｅｎ寒天 −５ｏｃｌ１３ｔｂ　ＢＩｏＭＭｒｌｅｕｘ及び５ｏｃｉｅｔ６　Ｄｉａｇｎｏ ｓｔｔｃｓＰａｓｔｅｕｒ製のＸＬＤ寒天 がある。

しかしながら、これらの寒天培地は、サルモネラ菌を特定するための原理（ｔｈ ｅ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）に関連したある種の制限を有する。すなわち、無色の コロニー（炭水化物の発酵がないことを示す）及び／又は黒色中心ヲモツコロニ ー（Ｈ２Ｓの産生を示す）がサルモネラの疑いのあるものとみなされる。

実際に、これらの寒天培地はサルモネラ菌について極めて非特異的である。事実 、幾つかの細菌種が、発育できしかもサルモネラ菌の特徴と同じ特徴をもつコロ ニー、スナワチ下記コロニーニ ー　無色コロニー〔ラクトース（−））：特表千５−５０５３１２　（３） −黒色中心（ｃｅｎｔｒｅ）をもつ：＋ｏユニー１：Ｈ２Ｓ　（＋）　〕を産生 できる。

さらに、これらの寒天培地上でのＨ２Ｓの産生は必ずしも一定であるとは限らな い。これらの変化は、種々の因子例えばｐＨ１コロニーの回りの酸素濃度等に関 連し得る。

従って、多数のサルモネラ菌コロニーは、Ｈ２ｓ陽性の性状を示さず、結果とし て黒色中心を有さず、無色のままである。

このことは“生化学的同定ギヤラリ−（ｇａｌ　Ｉｅｒｉｅｓ）”及び凝集血清 を使用する多数の不必要な確認作業を惹起し、時間のロスを招き、しかも検査の 経費を増大させる。

結局、サルモネラ菌について特異株が無いということはエラーの原因となり得る 。実際に、疑わしいコロニーを見逃すことは極めて容易である。このことは、コ ロニーが無色であるか又は培地の色と同じ色を持つ場合にはなお一層当てはまる 。

言い換えれば、前記の寒天培地は全てはそれら自体、一方ではこれらサルモネラ 菌の存在を示すのに使用される特徴のない（ｎｏｎ＋Ｈｓｔｉｎｃｔｌｖｅ）色 により、他方ではこれらサルモネラ菌の存在を特定し得る色の現象又は形状の宿 主（ｔｈｅ　ｈｏｓｔ）により、サルモネラ菌の検出に関して十分な信頼性を与 えない。

下記文献（ｐｕｂｌ　１ｃａｔｉｏｎ）　：すなわちＡｌａｌｎ　ＲＡＭＢＡＣ Ｈの論文：　＾ｐｐＨｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏ ｂｌｏｌｏｇｙ、５６．３０１−８０３（１９９０年１月）「サルモネラ種をプ ロテウス種及び他の腸内細菌と容易に区別するための新規な平板培地」 により、サルモネラ属の細菌の培養及び選択的検出用の培地であって −前記の細菌により代謝される栄養素、−前記細菌によって産生される酵素β− ガラクトシダーゼにより加水分解され得る発色用の色素産生性化合物、この場合 にはβ−ガラクトシダーゼによる酵素的加水分解の影響下で青色を発色する５− ブロモ−４−クロロ−３−インドリル　β−ガラクトピラノシド、−ｐＨ指示薬 例えばニュートラルレッドを伴ったプロピレングリコール、 を含有してなる培地が提案されている。

この場合には、サルモネラ菌の検出に使用される主な生化学試験はサルモネラ菌 によるプロピレングリコールの酸性発酵にあり、該発酵はニュートラルレッドに より検出される。そして、この主試験（ｐｒｉｎｃｉｐａｌｔｅｓｔ）はβ−ガ ラクトシダーゼの試験により補足される。この酵素はサルモネラ菌中には存在し ないので、サルモネラ菌は色素産生性化合物を加水分解しない。

全体として、下記の範囲の色は下記の解釈：すなわち −あざやかな赤色：プロピレングリコール（＋）及びβ−ガラクトシダーゼ（− ）を示す細菌が存在する、従ってサルモネラ菌が存在する、 −青色：プロピレングリコール（−）及びβ−ガラクトシダーゼ（＋）を示す細 菌が存在する、従ってサルモネラ菌が存在しない、 −紫色：プロピレングリコール（＋）及びβ−ガラクトシダーゼ（＋）を示す細 菌が存在する、従ってサルモネラ菌が存在しない、 −無色：プロピレングリコール（−）及びβ−ガラクトシダーゼ（−）を示す細 菌が存在する、従ってサルモネラ菌が存在しない という解釈を与え得る。

実際問題として、本出願人が前記のＲａ■ｂａｃｈ培地を使用して行った細菌学 的分析によれば、３３の細菌株又は細菌種（これらはサルモネラ１２菌株及びサ ルモネラ以外の属に属する２１菌株に区分できる）について次の結果が得られた 。すなわち、 −サルモネラ（１２菌株）： ｓｕｒｌｕｍ）　１菌株、サルモネラ・パラチフィＢ　（Ｓ、　ｐａｒ予期した 青い色を発色した； は無色のままであった； −サルモネラ以外の菌株： という結果が得られた。

Ｒａ５ｂａｃｈによって既に認められたようにサルモネラ・チフィ（Ｓ、　ｔｙ ｐｈｉ）　４菌株が無色のままであるということは正常であるが、一方、別のサ ルモネラ種５菌株〔その内の２株は家畜（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ）種〈サルモネ ラ験を得ることは正常ではない。さらにまた、サルモネラ以外の１菌株は陽性の 結果をもたらす。

要約すると、Ｒａ５ｂａｃｈによって提案された検出培地は下記の通り、すなわ ち 特表千５−５０５３１２　（４） −他の細菌特にシュードモナス・エルジノーザが同じ試験に応答するので、サル モネラには非特異的である、 −特にサルモネラ・チフィ　（Ｓ、　ｔｙｐｈｉ）種が提案された試験に応答す るので、サルモネラ属の中の幾つかの菌株又は種に選択的である、 −臨床起源のサルモネラ菌よりも食品又は家畜起源のサルモネラ菌に適当である 、 と思われる。

しかしながら、腸チフスの原因であるサルモネラ・チフィ（Ｓ、　ｔｙｐｈｉ） を含めてサルモネラ菌が人間にもたらし得る重い病気（ｓｅｒｉｏｕｓ　ｓｙｎ ｄｒｏｍｅ）を仮定すれば、はとんど全てのサルモネラの識別を可能にする培地 の開発が現在真に必要とされる。

本発明は前記の不都合を克服することを特徴とする特に、本発明の課題は、比較 的低い検出限界値でもって、細菌学的検査の間に実際に遭遇するサルモネラ種の ほとんどについて比較的信頼できる特定用の培地である。

本発明は、下記の知見：すなわち −グルクロン酸を発酵するがβ−ガラクトシダーゼを産生じない細菌種が極めて 少数しかない；これらｒｄｓｉｅｌｌａ　ｈｏｓｈｌｎａｅ　）　、エドワージ エラ・タルク（Ｅｄ−上記の後者３菌株は極めて希にしか単離されない；従って 、これらをサルモネラと間違える可能性が実際問題として極めて少ない、 去し得る、 という知見から生じる。

従って、本発明により、グルクロン酸又はその塩とｐＨ指示薬とを、培地とそれ に加えてβ−ガラクトシダーゼにより加水分解され得る色素産生性又は弗素産生 性の化合物と組み合わせることにより、単離する際に直接に、サルモネラ・アリ シネ（Ｓ、　ａｒｉｚｏｎｅ）を除いたサルモネラ菌を選択的に検出することが 可能である。

色素産生性又は弗素産生性の化合物は、標識（ｍａｒｋｅｒ）であってその分子 が少なくとも１種の特異酵素の存在下において加水分解され得るか又は２つの部 分すなわち色素非産生性又は弗素非産生性の部分と、色素産生性又は弗素産生性 の部分とに切断され得る標識を意味すると理解される。上記の色素産生性又は弗 素産生性の部分は、肉眼で又は紫外線下で直接又は間接に、すなわち指示薬と呼 ばれる追加的化学物質の作用により目で見ることができる色を発色できる。

本発明による前記の選択された生化学対（ｂｉｏｃｈｅｍｌｃａｔ　ｃｏｕｐｌ ｅ）の効果は、それが属する大部分の炭水化物と異なって、グルクロン酸が、β −ガラクトシダーゼ（但し、本発明の培地上で発現しないセラチア属の細菌によ って産生されるβ−ガラクトシダーゼを除く）を阻害しないという意味で予想外 のことであると思われる。

本発明の培地は、β−ガラクトシダーゼで加水分解可能な色素産生性又は弗素産 生性の化合物を含有してなり、該化合物は次の化合物：すなわちｐ−ニトロフェ ニル　β−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−メチルウンベリフェリル　β−Ｄ−ガ ラクトピラノシド及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル　β−Ｄ−ガラ クトピラノシドから選択し得る。

本発明の培地の好ましい態様においては、前記の色素産生性化合物は５−ブロモ −４−クロロ−３−インドリルβ−ローガラクトピラノシドであり、その重量含 有量は培地１リツトル当たりにつき０．０１ｇ〜１ｇであるのが好ましい。この 化合物はβ−ガラクトシダーゼ産生性細菌のコロニーを青色に着色し、しかもそ の色を培地中に拡散させることなくコロニーに限定するという利点を有する。

本発明の培地の特定の組成によれば、該培地はβ−ガラクトシダーゼ誘発剤を含 有し、該誘発剤はラクトース及びイソプロピル　β−Ｄ−チオガラクトピラノシ ドから選択し得る。

好ましいイソプロピル　β−Ｄ−チオガラクトピラノシドの重量含有量は０〜１ ００ｍｇである。

本発明の培地は、サルモネラ種に属さない細菌の増殖阻害剤を少なくとも１種含 有していてもよい。この阻害剤は同時にサルモネラの増殖活性化剤であってもよ い。該阻害剤はブリリアントグリーン、デオキシコール酸ナトリウム及び胆汁塩 混合物から選択し得る。

ブリリアントグリーン及びデオキシコール酸ナトリウムの好ましい含有量は、そ れぞれ培地１リツトル当たり０〜ｏ、ｉｇ及び０〜ｌＯｇである。

本発明の培地中の栄養素は、細菌の発育に必須である慣用の諸成分からなる。本 発明の培地の具体的な調製方法によれば、前記栄養素はペプトンと酵母エキスと ＮａＣｌからなり、これら重量含有量は培地１リツトル当たりそれぞれ１〜２０ ｇ　、　０〜ｌＯｇ及び０〜ｌＯｇであるのが好ましい。

本発明の特定の態様によれば、培地は固体寒天の影響で提供され、その場合には 該培地は寒天を含有してなり、その重量含有量は培地１リツトル当たり５〜２５ ｇであるのが好ましい。

本発明の培地はグルクロン酸又はその塩を含有する。

該培地はグルクロン酸ナトリウムを含有するのが好ましく、その重量含有量は培 地１リツトル当たり１〜３０ｇであるのが好ましい。

特表平５−５０５３１２　（５） 培地中に存在するｐＨ指示薬はフェノールレッド、ブロモチモールブルー、ブロ モクレゾールパープル及びニュートラルレッドから選択される。

本発明の培地の好ましい組成においては、ｐＨ指示薬はニュートラルレッドであ り、その重量含有量は培地１リツトル当たり５〜１００１ｇであるのが好ましい 。

本発明の同定培地のｐｌは、６〜８であるのが好ましい。

若干の場合には、サルモネラ含有試料を本発明の培地上で２４時間培養した後に 、サルモネラ菌に関して得られた特定の色は培地の再アルカリ性化により変化し 得る。特に、ｐＨ指示薬がニュートラルレッドである場合には、得られた赤色（ これはβ−ガラクトシダーゼが存在せずしかもグルクロン酸又はその塩が発酵す るという生化学的特性の特徴である）は黄色に変化し得る。

本発明の培地を改良するためには、サルモネラ菌により発酵され得る糖のうちの 少なくとも１種を添加することが必要であるということが認められた。この糖は メリビオース、ソルビトール、ズルシトール、マンニトール、グルコース、グル クロン酸及びそれらの混合物から培地１リツトル当たり１〜ｌＯｇの量で選択さ れる。

本発明の培地の好ましい組成によれば、培地はソルビトールを培地１リツトル当 たり５〜ｌＯｇ　、都合良くは培地１リツトル当たり８ｇの量で含有してなる。

この後者の組成においては、培地に補足されたソルビトールはセラチア属の細菌 を偽陽性として示され得る。

事実、これらセラチア属の細菌、すなわちグルクロン酸を発酵せずしかもβ−ガ ラクトシダーゼ（これはソルビトールの不存在下では本発明の培地上で発現され ない）を産生ずる細菌は、前記培地上では無色のままであるが、該細菌は本発明 の培地がソルビトールを含有する場合には赤色に着色し得る。培地１リツトル当 たり２０ｇに相当するか又はそれよりも少ないグルクロン酸組成物（ｃｏｍｐｏ ｓｉｔｉｏｎ）については、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル　β−Ｄ −ガラクトピラノシド（エスクリン）がソルビトール含有培地に対して培地１リ ツトル当たり０．０１〜０．０５ｇ　（好ましくはｏ、０２５ｇ）の量で加えら れる。エスクリンは存在し得るセラチア菌コロニーに対して藤色（ｍａｕｖｅ） 又は栗色（ｃｈｅｓｔｎｕｔｃｏｌｏｒ）を与える。

ソルビトールの存在下では、プロテウス属及びモルガネラ属の細菌の増殖阻止剤 の効果が低減されるので、胆汁塩の量を増やすべきである。この量は培地１リツ トル当たりにつきデオキシコール酸ナトリウム１〜５ｇ都合良くは３〜４ｇであ る。

本発明の培養及び検出培地の調製、実施（Ｉ■ｐｌｅ■ｅｎｔａｔｌｏｎ）及び 利点を下記の実施例により説明する。

実施例１一本発明の培地の調製 本発明の培地の組成は下記の通りである。

−バイオトリブチケース（ｂｉｏＭ６ｒｌｅｕｘ社製）　５．００ｇ−酵母エキ ス（Ｄｌｆｃｏ社製）　３．００ｇ−ＮａＣｌ　５．ＯＯｇ −ニュートラルレッド　０　、０３ｇ −デオキシコール酸ナトリウム　３．００．ｇ−ブリリアントグリーン　Ｏ，Ｏ ｌｇ −グルクロン酸ナトリウム　１２．００ｇ−５−ブロモ−４−クロロ−３−イン ドリルβ−ローガラクトピラノシド　ｏ、ｔｏｇ−イソプロピル　β−Ｄ−チオ ガラクトピラノシド　０゜Ｇｉｇ −寒天　１５．ＯＯｇ −ｐＨ７，６ グルクロン酸ナトリウム以外の上記諸成分を、攪拌しながら培地を沸点で１分間 保つことにより蒸留水に溶解した。

このようにして得られた溶液を通常の滅菌法に従って加圧滅菌した（例えば１２ ０℃で１５分）。

加圧滅菌した後に、得られた溶液を冷却し、４５℃に保持した。次いで、グルク ロン酸ナトリウムを加えて、溶解させた。次いで、完成（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）培 地を、滅菌条件下で直径９０■のペトリ皿にペトリ皿当たり２０１の量で供給し た。室温に戻した後に凝固物が得られた。ペトリ皿を使用するまで＋４℃で保存 した。

実施例２一本発明の培地上で培養した後のサルモネラ菌の選択的検出 実施例１に従って上記で調製したベトリ皿に常法により接種した。

３７℃で２４時間培養することによって生成したコロニーを調べた。

得られたコロニーの色によって、細菌の２つの生化学的特徴、すなわちβ−ガラ クトシダーゼの産生又は非産生とグルクロン酸又はその塩の発酵又は非発酵を調 べることが可能であり、下記の通りである。

−あざやかな赤色のコロニー：これらはβ−ガラクトシダーゼを産生ぜずしかも グルクロン酸又はその塩を発酵する細菌に特異的である、 −青色のコロニー：これらはβ−ガラクトシダーゼを産生じしかもグルクロン酸 又はその塩を発酵しない細菌に特異的である、 −紫色のコロニー：これらはβ−ガラクトシダーゼを産生じしかもグルクロン酸 又はその塩を発酵する細菌に特異的である、 −無色のコロニー：これらはβ−ガラクトシダーゼを産生ぜずしかもグルクロン 酸又はその塩を発酵しない細菌に特異的である（但し、β−ガラクトシダーゼを 産生ずるが本発明の培地上では該酵素が発現され特表平５−５０５３１２　（６ ） ないで無色のままであるセラチア属の細菌を除く）。

上記のあざやかな赤色のコロニーはサルモネラ菌であると推定される。

実施例３−２４時間以上培養した後にコロニーを観察することによりサルモネラ を選択的に検出するための本発明の培地の調製 実施例１の培地上で、実施例２の条件下で３７℃で２４時間以上培養すると、得 られたあざやかな赤色をもつコロニーは、ｐＨの再アルカリ性化により黄色にな る傾向があり、それによりサルモネラの選択的検出がより困難になる。

コロニーの色が赤色から黄色に変化することを防止するための、本発明の培地の 好ましい組成は下記の通りである。

−ペブチケース　２〜８ｇ好ましくは３ｇ−千オン（Ｔｈｉｏｎｅ）　２〜８ｇ 好ましくは３ｇ−肉エキス　０〜３ｇ好ましくは３ｇ −酵母エキス　０〜３ｇ好ましくは２ｇ＝　ブリリアントグリーン ０〜０．Ｏｌｇ好ましくは０．００３ｇ−胆汁塩　１〜５ｇ好ましくは４ｇ −ニュートラルレッド　０．０２５ｇ −トリス（Ｔｒｉｓ）　０．６５ｇ −ソルビトール　５〜ｌＯｇ好ましくは８ｇ−グルクロン酸ナトリウム６〜１５ ｇ好ましくは１２ｇ−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−ローガラク トピラノシド０．１７ｇ−イソプロピル　β−Ｄ−チオ ガラクトピラノシド　０．０１ｇ −５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−ローグルコピラノシド ００１〜０゜０５ｇ好ましくは０．０２５ｇ−寒天　１４ｇ 下記の３２菌株を調べた 大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　）　２菌株セラチア・マルセッセン ス　２菌株 （Ｓｅｒｒａｔｉａ　５ａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）シトロバクタ−・フロインディ イ　３菌株（Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｌ）クレブシェラ中ニュ ーモニエ　２菌株 （Ｋｌｅｂｓｌｅｌｌａ　ｐｎｅｕｓｏｎｌａｅ　）クレブシェラ・オキシト力 　２菌株 （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ）サルモネラ・エンテリチジス　４菌 株 （Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｌｔｉｄｉｓ）サルモネラ・チフィ　３菌 株 プロテウス・ブルガリス　３菌株 （Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｌｓ）プロテウス・ミラビリス　３菌株 （Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ　）スタフィロコッカス・アウレウス　 ３菌株（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）ストレプトコッカス ・ピオゲネス　２菌株（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　） エンテロコツカスｅファエ力リス　２菌株（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｅ ｃａｌｌｓ　）各菌株を本発明の培地を入れたペトリ皿上で培養した。各ベトリ 皿を３６℃で２０時間温温室た（ｉｎｃｕｂａｔｅｄ）。

形成したコロニーを肉眼で検査した。

３２分離株のうち、サルモネラ菌株全部しかもこれらの菌株のみが、本発明の培 地上で赤色のコロニーすなわちサルモネラ菌の特徴的外観を与えた。

β−ガラクトシダーゼの存在を示ししかもグルクロン酸の発酵がないことを示す 青い色のコロニーが１菌株すなわちシトロバクタ−φフロインディイの菌株につ いて認められた。

大腸菌３菌株、クレブシェラ４菌株及びシトロバクタ−・フロインディゴ２菌株 は、紫色のコロニーを与えた（２つの試験の組み合わせ）。プロテウス６菌株は 透明なコロニー（β−ガラクトシダーゼが存在せずしかもグルクロン酸の発酵が ないことを示す）の存在を伴って部分的に阻害された。スタフィロコッカス、ス トレプトコッカス及びエンテロコツカスの７菌株はいずれも本発明の培地上で発 育しなかった。

本実施例は本発明の培地の特異性を明確に示す。サルモネラコロニーのみが赤い 着色を示した。

実施例５一本発明のサルモネラ検定培地の選択性と通常的に使用される培地との 選択性の比較実施例１に記載の本発明の培地と、ＤｌａｇｎｏｓｔｉｃｓＰａｓ ｔｅｕｒから市販のＳ、Ｓ、寒天培地との間で比較を行った。後者の培地すなわ ちサルモネラ菌及びシゲラ菌の選択的分離に使用される培地は、炭水化物の発酵 及びＨ２Ｓの産生に関連した細菌の生化学的特徴の検出にもとづいている。

実施例４で調べた３２個の菌株の各々を本発明の培地及びＳ、Ｓ、培地の両方で 培養した。

３７℃で２４時間培養して、得られたコロニーの外観を調べた。

得られたコロニー、すなわち −本発明の培地上で赤色（サルモネラの存在を強く推定）であるコロニー； −Ｓ、Ｓ、培地で無色（ラクトース陰性）であるか又は黒色の中心（Ｈ２Ｓの産 生）をもつコロニー；がサルモネラである疑いがあるとみなされる（ｃｏｌｓｉ ｄｅｒ　ａｓ　５ｕｓｐｅｃｔ）。

特表平５−５０５３１２　（７） 本発明の培地上では７菌株のみがサルモネラ菌であると疑われる赤色のコロニー を与えた。それらは全てサルモネラ菌である。

一方、Ｓ、Ｓ、培地では、１８菌株がサルモネラである可能性があると疑われた 。すなわち、 −サルモネラ　７菌株（黒色中心を伴った無色のコロニー）、 −　セラチア・マルセッセンス　２菌株（無色のコロニー）、 −　シトロバクタ−・フロインディイ　３菌株（黒色中心を伴ったコロニー）、 −　プロテウス　６菌株（黒色中心を伴ったコロニー）がサルモネラである可能 性があると疑われた。

本発明の検定培地の選択性は検定（ｖｅｒｉｔ’１ｃａｔｉｏｎ）数を大きく減 少させることを可能にし、この培地を使用すると慣用の培地を使用する場合に比 べて時間と金（■ｏｎｅｙ）の節約をもたらす。

実施例６一本発明の培地上で培養したサルモネラ菌の検出するための最小限界値 この試験はトリプチケースーダイズ寒天上で分離した下記の４菌株、すなわち ＳＥ−サルモネラ・エンテリチジス ＳＴ−サルモネラ・チフィ ＥＣ−大腸菌 ＰＡ−大腸菌 ＰＡ−シュードモナス・エルジノーザ を使用して行った。

トリプチケースーダイズ寒天上で３７℃で２４時間培養した後に、各菌株につい て生理食塩水に懸濁した懸濁液を調製し、Ｍａｃ　Ｆａｒｌａｎｄ目盛りのポイ ント（１ミリリツトル当たり細菌約２　Ｘ　１０８個に相当する）に調整した。

次いで、これらの懸濁液を上記ＥＣ及びにＰＡついては１０４倍希釈し、ＳＥ及 びＳＴについては１０’　、１０’及び１０６倍希釈した。

次いで、得られたサルモネラの種々の希釈懸濁液をＥＣ又はＰＡの希釈懸濁液と 当容量で混合した。本発明の培地を入れたペトリ皿に、得られた混合物の各々を ｌＯマイクロリットルの検定量を用いて接種した。

３７℃で２４時間培養して、サルモネラコロニーの数と非サルモネラコロニーの 数とを各ベトリ皿について数えた。

得られた結果を下記の表に示す。

これら得られた結果は、本発明の培地中におけるサルモネラについて極めて低い 検出限界値を例証する。

実際、サルモネラ属に属さない細菌のｎ個又はその様なコロニーの中でサルモネ ラ（赤色）の１個のコロニーに至るまで（ｄｏｗｎ　ｔｏ　ｏｎｅ　ｃｏ！ｏｎ ｙ）同定することが容易に可能である。ＥＣコロニーは紫色により検出され、Ｐ Ａコロニーは無色である。さらにまた、サルモネラのコロニーの赤い着色は分離 培地上でコロニーの個数に関わらず一定である。

特表平５−５０５３１２　（８） 要約書 サルモネラ属の細菌を検出するための細菌学的分析方法及び培地 本発明はサルモネラ菌を選択数に検出するための細菌学的分析方法及びそれを遂 行するための培地に関する。

本発明の方法はグルクロン酸又はその塩類の１種を発酵するがβ−ガラクトシダ ーゼを産生じないサルモネラの特異的能力に基づくものである。

本発明の培地はサルモネラ菌によって代謝される栄養素、酵素β−ガラクトシダ ーゼによって加水分解され得る色素産生性又は弗素産生性の化合物、グルクロン 酸又はその塩類の１種、及びｐＨ指示薬を含有してなる。

１、．１１．、．１りＣＴ／ＦＲ９１１０１０７５

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．サルモネラ菌を選択的に検出するための細菌学的分析方法であって、前記細 菌により代謝される栄養素と、酵素β−ガラクトシダーゼにより加水分解するこ とができる色素産生性又は弗素産生性の化合物とを含有してなる同定培地に分析 試料を接触させた状態で置くサルモネラを選択的に検出するための細菌学的分析 方法において、前記同定培地が更にグルクロン酸又はその塩とｐＨ指示薬とを含 有してなることを特徴とするサルモネラを選択的に検出するための細菌学的分析 方法。
2. ２．前記同定培地がグルクロン酸ナトリウムを同定培地１リットル当たり１〜３ ０ｇの量で含有してなることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記同定培地がさらに、サルモネラ菌によって発酵され得る糖であってメリ ビオース、ソルビトール、ズルシトール、マンニトール、グルコース及びグルク ロネートから選ばれる少なくとも１種の糖を、同定培地１リットル当たり１〜１ ０ｇの量で含有してなることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載の方 法。
4. ４．ｐＨを６〜８の値に調整することを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項の いずれか１項に記載の方法。
5. ５．サルモネラ属の細菌により代謝される栄養素と、酵素β−ガラクトシダーゼ により加水分解され得る色素産生性又は弗素産生性の化合物とを含有してなるサ ルモネラ属の細菌の培養及び選択的検出用の培地において、前記培地がさらにグ ルクロン酸又はその塩とｐＨ指示薬とを含有してなることを特徴とするサルモネ ラ属の細菌の培養及び選択的検出用の培地。
6. ６．グルクロン酸又はその塩の量が培地１リットル当たり１〜３０ｇであること を特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．サルモネラ菌によって発酵され得る糖であってメリビオース、ソルビトール 、ズルシトール、マンニトール、グルコース及びグルクロネートから選ばれる少 なくとも１種の糖を培地１リットル当たり１〜１０ｇの量でさらに含有してなる ことを特徴とする請求の範囲第５項記載の培地。
8. ８．前記培地がソルビトールを培地１リットル当たり５〜１０ｇ、好ましくは８ ｇの量で含有してなることを特徴とする請求の範囲第７項記載の培地。
9. ９．さらに５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル　β−Ｄ−グルコピラノシ ドを培地１リットル当たり０．０１〜０．０５ｇ、好ましくは０．０２５ｇの量 で含有してなることを特徴とする請求の範囲第７項記載の培地。
10. １０．前記の色素産生性又は弗素産生性の化合物が次の化合物、すなわちｐ−ニ トロフェニル　β−Ｄ−グルコピラノシド、４−メチルウンベリフェリル　β− Ｄ−グルコピラノシド及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−グ ルコピラノシドから選ばれるものであることを特徴とする請求の範囲第５項記載 の培地。
11. １１．前記の色素産生柱の化合物が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル　 β−Ｄ−グルコピラノシドであることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の培 地。
12. １２．５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル　β−Ｄ−グルコピラノシドの 量が培地１リットル当たり０．０１〜１ｇであることを特徴とする請求の範囲第 １１項記載の培地。
13. １３．サルモネラ以外の属又は種の細菌の増殖阻害剤であってブリリアントグリ −ン、デオキシコール酸ナトリウム及び胆汁塩類の混合物からなる群から選ばれ るサルモネラ以外の属又は種の細菌の増殖阻害剤を含有してなることを特徴とす る請求の範囲第５項記載の培地。
14. １４．０〜１００ｍｇの量のブリリアントグリ−ンと、０〜１０ｇの量のデオキ シコール酸ナトリウムとを含有してなることを特徴とする請求の範囲第１３項記 載の培地。
15. １５．デオキシコール酸ナトリウムの量が培地１リットル当たり１ｇ〜５ｇ、好 ましくは３〜４ｇであることを特徴とする請求の範囲第８項、第１３項及び第１ ４項記載の培地。
16. １６．前記の栄養素がペプトン、酵母エキス及び塩化ナトリウムをそれぞれ１〜 ２０ｇ、０〜１０ｇ及び０〜１０ｇの量で含有してなることを特徴とする請求の 範囲第５項記載の培地。
17. １７．前記ｐＨ指示薬が次の化合物、すなわちフェノールレッド、ブロモチモー ルブルー、ブロモクレゾールパーブル及びニュートラルレッドから選ばれるもの であることを特徴とする請求の範囲第５項記載の培地。
18. １８．前記ｐＨ指示薬が５〜１００ｍｇの量のニュートラルレッドであることを 特徴とする請求の範囲第１７項記載の培地。
19. １９．前記培地がβ−ガラクトシダーゼ誘発剤、すなわちラクトース又はイソプ ロピル　β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含有してなることを特徴とする請求 の範囲第５項記載の培地。
20. ２０．前記β−ガラクトシダーゼ誘発剤が培地１リットル当たり０〜１００ｍｇ の量のイソプロピル　β−Ｄ−チオガラクトピラノシドであることを特徴とする 請求の範囲第１９項記載の培地。
21. ２１．そのｐＨを６〜８の値に調整することを特徴とする請求の範囲第５項〜第 ２０項のいずれか１項に記載の培地。
22. ２２．前記の培地が固体寒天の形態で提供されることを特徴とする請求の範囲第 ５項記載の培地。
23. ２３．請求の範囲第５項〜第２２項のいずれか１項に記載の培地のパッケージか らなる細菌特定用の装置。