JPH05502160A - Ｄｎａ、構造体、細胞及びこれらから誘導した植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡ、構造体、細胞及びこれらから誘導しｆｃ橿物技前分野 この出願′（・よ新規なりＮＡ　構造体、これらを含有する植物細胞及びこれら から誘導した植物に関する。特にこの出願は植物における形質発現を調節する組 換えＤＮＡ技法の使用を伴なう。

背景技術 本発明を生起する研究においては本発明者はトマトの熟成に関与する酵素を発現 する遺伝子（ｇｅｎｅ　）を同定した。この遺伝子はクローン化され且つ特徴付 けられている。本発明者は今般該遺伝子がカロチノイドの合成に関与しているこ とを示した。電接遺伝子はクローンｐＴＯＭｓ中に殆んど完全にエンコード（ｅ ｎｃｏｄｅｄ）されており、Ｒａｙら（ＮｕｃＬｅｉｃ　Ａｃ１ｄａ　Ｒｅａｅ ａｒｃｈ、　１５゜１０５８７、１９８９）によって開示されている。

カロチノイドの生合成経路は本明細書の第４図に概略的に示されている。ｐＴＯ Ｍ５遺伝子はゲラニルゲラニルビロリン酸とフィトエンとの間の合成経路の１つ 又はそれ以上の工程に関与すると本発明者は考える。合成経路のこの分枝路によ って製造された生成物のうらニハカロテン、ルティン、キサントフィル及びリコ ｇ／の如き色素がある。本発明は植物中でか＼る化合物の合成を改変することを 提案する。

発明の開示 本発明だよると、植物中で作用する転写開始領破で先導されるクローンｐＴＯＭ ５により二／コード化した遺伝子の若干又は全てと相同性のＤＮＡ塩基配列を含 有してなるＤＮＡ構造体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ　）であってこうして該構造体 が植物中でｍ　ＲＮ　Ａを生成し得るようにしたＤＮＡ構造体が提供される。本 発明者は更に本発明の構造体で植物を形質転換することにより植物中のカロチノ イド（即ちカロチノイド）の製造を改質する方法を提供する。本発明者は更に、 カロチノイドの生合成を改変するのに適したＤＮＡで植物を形質転換させ、か− る形質転換した植物又はそれらの子孫碩物会生長させてカロチノイド含量が改変 した植物部分（例えば葉片、花弁又は果実）を製造することにより植物中のカロ チノイドの製造を改質する方法を提供する。適当なりＮＡは就中本発明の構造体 を包含してなるが、カロチノイド合成経路の別の部分に作用する別のＰ１様な構 造体も使用できる。か＼る構造体はカロチノイド（例えばリコＲン）の製造を促 進させるか又は植物によるか＼る製造を阻害するのに適用し得る。

周知の通り、細琶は、遺伝子のＤＮＡを夕／／ξり質に転写宮せてメンセンジャ ーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ　）を製造し、次いでこのｍＲＮＡを例えばイントロン部 分の切り出しにより加工（プロセッシング）し最後にリポソームによりタンパク 質中に翻訳することによりタンノミク質を製造するものである。この過程は細胞 中に”アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）　ＲＮＡ　”の存在によって阻害さ ｎてしまう。このアンチセンスＲＮＡなる用語は当Ｍ　ｍＲＮＡ中の塩基の配列 と相補的なＲＮＡ配列を意味し；アンチセンス（逆方向の）配列（３′〜５′の 方向で読み取る）甲の各々の塩基又は塩基の大部分が５′〜３′の方向に読み取 ったｍ　ＲＮＡ配列中の対応の塩基（Ｃに対してはＧ、Ｕに対してはＡ）と対合 （ｐａｉｒｉｎｇ）を行ない得る意味で相補的なＲＮＡ配列を意味する。この阻 害は２本の相補的なＲＮＡ鎖同志間での複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）の生成によっ て生起し、タンパク質の形成を妨害すると思われる。

しかしながらこの研究は不確定であジ；複合体は更なる転写、プロセッシング、 輸送又は翻訳を妨害してしまい又はｍＲＮＡを分解してしまい又はこれらの作用 の１つ以上を有してしまう。か＼るアンチセンスＲＮＡは、関連する遺伝子の（ 又はこれと実質的な相ｒｆｆＪ性を示すＤＮＡ塩基配列の）コード化ＤＮＡ　’ ｄ　（ｃｏｄｉｎｇ　５ｔｒａｎｄ）　（鋳型ＤＮＡ　鎖と相対して）の後方部 分を転写するように設けた適当なりＮＡ構造体で形質転換することにより細胞中 に製造できる。

特異的な植物遺伝子の発現をダウンレギュレート（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ） するのにこの技法を使用することは、例えば米国特許出願第１１９６１４号に対 応する欧州特許公開第２７１９８８号に記載されている。形質発現の減少は植物 の表現型の変化を生記し：この変化は全体の眼で見うる表現型の差異のレベルで 例えば色のついた花升の代りに無色となるＲチュニアの花弁におけおアンドンア ニン生産の欠如で（ｖａｎ　ｄｅｒ　ＫｒｏｌらのＮａｔｕｒｅ。

しくルで例えばトマト果実の成熟中にポリガラクンロナーゼの量の変化及びＲク チ／の解重合の減少で（行われる。即ちアンチセンスＲＮＡは植物における形質 発現のダウンレギュレーション（ｄｏｗｎｒｅｇｕ　ｆａｔ　１ｏｎ）を達成す るのに有用であることが判明された。

別の要旨においては、４本発明はｐ　ＴＯＭ　５の遺伝子によって土竜した酵素 をエンコードするｍ　ＲＮ　Ａと実質的７ケ相同性を示す塩基の配列に相補的な ＲＮＡをエンコードするＤＮＡ塩基配列を転写するのに定置された、獲物中で作 用する転写開始領域と含有してなるＤＮＡ構造体を提供する。本発明はまｆｃ不 全発明ＤＮＡ薄造体を含有する植物細胞、改質した特性例えば果実の色を示す植 物細胞由来の植物、及びか−る植物の果実及び種子を包含する。

本発明のＤＮＡ薄造体ｔゴｐＴＯＭ５酵素の生産を調節するのに植物中に挿入で きる。ＤＮＡ構造体の性状に応じて、ｐＴＯＭ５酵素の生産は植物の一生涯に亘 って又は植物の寿命の特定の段１階で増大又は減少させ得る。一般に、予期され る櫟に、酵素の生産は実質的に完全な遺伝子と相同性のＤＮＡを含有す乙薄造体 によってのみ促進される。更に鵞くべきことは、完全な遺伝子に相当するＤＮＡ 塩基配列よりも実質的に短かい不完全なりＮＡ塩基配列を含有する構造体はそれ らがセンス又はアンチセンスＲＮＡを発現するように設けられ之かに拘らず酵素 の発現を一般に阻害するものである。

カロチノイド合成経路（第４図参照）におけるｐＴＯＭ５遺伝子の機能に対する 別の証拠ばｐＴＯＭ５塩基配列の翻訳から予測されるポリＲプチドとロード・２ クテル・カブスレイタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　７　）、紅色硫黄無含町グ ラム婆性菌からｃｒｔＢ遺伝子によってエンコードされたタン・ξり質との間の 有意な程度の相同性（２７％の同一性：１７チの類似性）である。ａｒｔ　Ｂ遺 伝子生成物はケラニルゲラニルピロリン酸の尾−尾二量化を触媒さぞてプレスイ トエンピロリン酸を形成す：ｏ。この酵素、プレフィトエノンンテターゼは他の イノブレノイド代謝からのカロチノイド生合成の分岐点である。更には、カブシ クム　アヌウム（Ｃａｐｓ　ｉ　ｃｕｍａ、ｎｎｕｕｍ）の果実有色体から酵素 が単離され、該酵素はプレスイトエンピロリン酸の合成とフイエンへのその次後 の転換との両方を触媒させると思われる。この酵素は、ｐＴＯＭ５タン、９り質 の予測された大きさく４８．０００　）と密接に一致して４７　、５００の分子 量を有する。

色の産生と同様に、他の重要な機能は本発明の方法によって改質できる。即ちβ −カロチン（ビタミンＡの前駆体）及び他のカロチノイドは人間の健康にとって 重要であり、成る病気に対して保護効果を頁すると主張されていた。食用植物は 本発明の構造体で形質転換することにより改質できこうして食用植物は高含量の か＼る化合物全有し、あるいは別の植物も改質できこうして該植物はか５る化合 物を抽出し得る供給源として作用できる。カロチノイドは高度の光度損傷に対し て植物を保護するのに役割りを演すると考えられ、こうしてか―る化合物を高含 量で有する植物は何らかの地球規模の気候変動の影響を克服するのに個値があり 得る。

本発明の別の可能な用途はスボロボレニン合成を調節するものである。この重合 体はカロチノイド生合成の産物であると思われる。スポロポレニンは花粉の生成 及び成熟中に重要であり、特に胞子生殖の初期段階中に重要である。胞子の９膜 における本発明のｐＴＯＭｓｉ伝子の発現を改質することば、特に胞子のり膜の 生成、発達又は機能を変化きせることによって花粉の生成を妨害すると予期され る。即ちスポロポレニ／の抑制はカロチノイドに関与する経路によってスポロボ レニンを生産する全ての植物で行われる。従って本発明を用いて形質転換した植 物の花粉生成を阻止できる。

こうして製造した植物は雄性不稔性であシ、均質な雑種（ハイブリッド）の工業 的製造に有用なものである。

この用途については、胞子のう膜に機能性であるプロモーター例えば花粉プロモ ーターＭＦＳ１４を含有スる構造体を使用するのが重要である。構成プロモータ ーの全てが胞子のり膜に作用するものではない（例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモー ターは作用しない）。

本発明を応用し得る植物（では、商業的に重要な果実囮持櫂物特にトマトがある 。この様にして、カロチンイド生合成経路及び特に色素のリコはンの促進又は阻 害により改質した色を有する植物を生成できる。

本発明を使用してリコはンに伴なう赤色の生成を促進又は阻害できる。トマト果 実にこの赤色を抑制すること（例えばアンチセンス構造体での形質転換により） は魅力的な色合いの黄色（成るコシヨウの様な）の果実を与える。同様な黄色の トマトは知られているが、本発明は、同時に他の特徴を変化させるかもしれない 延長した養育予定なしに％徴をエリートライン（ｅｌｊｔ＠１ｉｎｅ　）に乗換 える手段と提供する。リコばン生成を促進するとより深みのある赤色のトマト果 実を生成でき、これは特には−スト及びスープの如き加工した材料の形で消費者 にとってより魅力的であると思われる。本発明をまた使用して果実以外の植物の 部分に赤色を導入できる。リコズンの促進は植物中で機能性のプロモーターの調 節下に遺伝子ＣＤＮＡ又は全長遺伝子の１つ又はそれ以上の機能性コピーを挿入 することにより生起できる。リコはンが植物中に天然に発現されるならば、プロ モーターを選択して天然のプロモーターによって与えられる発現よシも高度の発 現を与えることができる。

本発明のアンチセンスＤＮＡ構造体はきわめて短かぐあり得る。該構造体は相同 性の塩基配列として長さが少なくとも１０個の塩基を含有してなるのが好ましい 。

塩基配列については理論上の上限はなく、細胞によって生産された腎連あるｍＲ ＮＡ程長くあｐ得るが、便宜上長さにつき１００〜２０００個の塩基間の塩基配 列を用いるのが適当であると一般に見出されるものである。

本発明で用いるに好ましいＤＮＡはクローンｐＴＯ，ＶＩ５由来のＤＮＡである 。アンチセンスＲＮＡをエンコードする所要のＤＮＡは幾つかの方法で得ること ができ即ち、か＼るＤＮＡの適当な配列を制限酵素で切断することにより、各々 の末端で適当な制限部位を与えるような仕方でアニールされ次いで互いに連結反 応される合成オリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡフラグメントを合成することに より、　、＋？リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＢ）において合成オリゴヌクレオチド を用いて各々の末ｍＫ適当な制限部位を有する所要の７ラグメントを生成するこ とによ、！ｌｌｌ得ることができる。次いで所要のＤＮＡを、上流側のプロモー ター配列と下流側のターミネータ−配列とを含有する（フタ−（ｖｅｃｔｏｒ　 ）中にりｏ　−７化し、該クローン化（ａｔｏｎｉｎｇ）はＤＮＡ配列がそれを 切断するＤＮＡ鎖中でその配向江関して反転するように行なう。

アンチセンス（逆方向）　ＲＮＡを発現する新規なベクターにおいては、以前は 鋳型ＤＮＡ鎮であったＤＮＡ知（ストランド）は暗号用（コード用）ストランド となり、又はその逆であり得る。かくして新規な（フタ−は９７０Ｍ５　ｍＲＮ Ａの配列に相補的である塩基配列中にＲＮＡをエンフードするものである。かく して２本のＲＮＡ鎖はそれらの塩基配列においてのみならずそれらの配向（５′ 〜３′）においても相補性である。

転写用のＤＮＡ塩基配列の供＠源としては、９７０Ｍ５の如きｃＤＮＡクローン を使用するのが都合良い。９７０Ｍ５の塩基配列は第１図に記載される。このク ローンは、寄託番号ＮＣＩＢ　４０１９１により犬＊Ｍ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ）中 のプラスミドとして、現在スコツトランドの２３　Ｓｔ、　ＭｉｃｈａｒＤｒｉ ｖｅ、　Ａｂｅｒｄｅｅｎ　ＡＢ２　ＬＲＹに在る舒託機関ｔｈｅ　Ｎａｔｉ− ｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍ ａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅ−ｒｉａに１９８９年９月１日に寄託されている。別の 場合には、９７０Ｍ５と同様なｃ　ＤＮＡクローンはスレーターラのプラントモ レキュラーバイオロン−（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕ−１，を と〃・きる。この様にして９７０Ｍ５によって生産されたｍＲＮＡの全体又は実 質的に全体についてコードする塩基配列を得ることができる。こうして得られた Ｃ　ＤＮＡの適当な長さは制限酵素により使用するのに切断できる。

前述した如く、本発明で使用するのに逆方向ＲＮＡの好ましい供給源はクローン Ｉ）ＴＯＭＳ　（４０１９１としてＮＣＩＭＢ（て寄託した、前述参照）により エンコードシた遺伝子と相同性を示すＤＮＡである。９７０Ｍ５は完熟トマトＲ ＮＡから単産したｃＤＮＡライブラリーから由来するン（ｐＴＯＭ４５．　ｐＴ ＯＭ９１．　ｐＴＯＭ１０４）は交叉雑種形成（ｃｒｏｓｓ−ｈｙｂｒｉｄｉｓ ｅ　）　して９７０Ｍ５となり、恐らくは関連する配列を含有している。９７０ Ｍ５は大索４ｓｋＤのタンノξり質をエンフードするハイブリッド選択覇訳によ って特徴付けられる（スレータ−らのＰ　１ａｎｔ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏ ｌｏｇｙ　５．１３７〜１４７．１９８５）。ＤＮＡ配列を分析するとクロー　 ンｐ　’Ｉ’　０Ｍ５は４６．７ｋＤノ４９−’！フｆ　ｈ’ｆｘンコ−ドする 読み取ｐ枠を有する１６００個の塩基の長さである。

９７０Ｍ５がコードしているｍ　ＲＮ　Ａは成熟しているトマト果実で発現して いることを不発明者は示した。未成熟のトマト果実では発現は検出できなかった 。９７０Ｍ５は成熟の全赤黄色段階で最も強く発現される。次いでｍＲＮＡのし くルは、成熟している果実の生合成能力の一般的な下落と一致して下落する。ｐ ’ｒｏＶｉｓの発現は成熟した緑色の果実を外来のエチレンに暴露することによ っても誘発させ得る。ｐ　ＴＯＭ　５の発現は成熟阻害剤（Ｒｉｐｅｎｉｎｇ　 １ｎｈｉｂｉｔｏｒ；ｒｉｎ）とネバーライブ（Ｎｅｖｅｒｒ−ｉｐｅ　；　Ｎ ｒ　）とのトマト果実成熟変異体中で減少され、該変異体を工きわめて緩慢に成 熟させしかも通常のトマト果実に伴なう完全な赤色を決して達成しない。

９７０Ｍ５と相同性の配列のトマト中のケ゛ツム位置はＲＦ［、Ｐマツピングを 用いて同定された　染色体２及び染色体３上の２つの位ｆｆ１ｉはそれぞｎｐ’ ｒｏｎｓと相同性の配列を担持する。遺伝子は小さな多重遺伝子族として存在し 得ることがサチン法によっても示された。２本の個々の遺伝子を表わすゲノムク ローンは単馳されしかもＤＮＡ配列分析によって特徴付けられた。ｇ’ｒＯＭ５ はｐＴＯＭ　５と同一のニキンン配列を再する遺伝子を表わす。

クローンＦは９７０Ｍ５と同様だが同一ではない配列を含有する。配列及び発現 のデータはクローンＦが未転写の偽遺伝子をエンコードしていると水製している 。

ｐＴＯＭ５遺伝子族の構造及び発現についてがなりの量の情報があるけれども、 このクローンの生化学的機能は今まで知られていなかった。

転写用の塩基配列についてＤＮＡの別の供給源はｐＴＯＭ５＃素をエンコードす る適当な遺伝子である。この遺伝子はイントロンが存在し得る点で９７０Ｍ５の ｃ　ＤＮＡとは異なっている。イントロ／はｒｎＲＮＡ　’Ｐ　Ｋ　Ｅ写されな い（又はこうして転写されたとしても、イントロンは次後に切り落される）。か ＼る遺伝子を転写用の部分塩基配列の供給源として使用する時には、イントロ／ 領域又はエキンン領域の何れかを使用できる。

転写用の適当７！’　ＤＮＡ塩基配列を得る別の仕方は、例えば手引きとして第 １図を用いて適当な塩基から非経験的にＤＮＡ塩基配列を合成するものである。

本発明の組換えＤＮＡ及びベクターは次の如く生成できる、転写用の所望の塩基 配列を含有する適当なベクター（例えばｐＴＯＭ５　）を制限酵素で処理して配 列を切断する。こうして得られたＤＮＡ４ｉｊＩ（ストランド）は、所望のプロ モーター配列例えばカリフラワーのモザイクウィルス３５Ｓプロモーター又はト マトのポリガラクソロナー七遺伝子プロモーター配列（ＢｉｒｄらのＰｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１１　、６５１〜６６２．１９８８　 ）と所望のターミネータ−配列（例えｉｉ′細菌のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの）／！！リン／／ターゼ遺伝子の３′配列、ｎｏｓ　 ３′末端）とを含有する第２の（フタ−中にクローン化される（所望ならば逆の 配向で）。

本発明によると、事情が要求するように構成プロモーター（例え（ｆカリフラワ ーのモザイクウィルス３５ｓ）と誘導性又は発生的に調節したプロモーター（例 えば成熟果実の特異的ポリガラクソロナーセブロモーター）との両方を使用する ことを提案する。構成プロモーターを使用すると植物の全ての部分での機能に作 用する傾向があり　然るに組織％異性のプロモーターを使用することにより、機 能はより選択的に調節できる。即ち本発明を例えばトマトに応用する際には、Ｐ Ｇ−を伝子のプロモーター（Ｂｉｒｄらの前記文献、１９８８参照）を用いるの が都合良いと見出される。少なくともトマトにこのプロモーターを使用すると組 換えＲＮＡの製造は塾成−４異性プロモーターの制御下にあるという利点がある 。即ち組換えＲＮＡはその作用が必要とされる器官でのみ生産される。この事実 により特定の器官がその色を変性させ得ることを意味する。観賞物として用いる べき植物（多数あるけれども）に対して、構成プロモーターを使用することによ り植物全体にカロチノイドの生産を誘発させて全体に変性した色部ら赤味がかっ た／黄色がかった色を植物に与えることができるが、通常は組織特異性の又は発 生的に調節したプロモーター例えば前記したＰＧ遺伝子プロモーターを使用する ことにより特定の部位（例えば果実、花卉又は塊茎）にカロチノイドの生産を限 定するのが好ましいものである。使用し得る他の成熟用−特異−的プロモーター にはＥ８プロモーター（Ｄｉｅｋｍａｎ　＆　ＦｉｓｃｈｅｒのＥＭＢ’０Ｊｏ ｕｒｎａｌ、　７．３３１５〜３３２０．１９８８）及び米国特許第４．９４３ ゜８７４号に記載のトマト由来の２Ａ１１プロモーターがある。

本発明のベクターを使用して所望に応じて植物を形質転換させることができ、か くして本発明の植物を形成できる。トマトの如き双子葉植物は例えば１３ｅｖａ ｎのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１２．８７１１〜８７２ １　（１９８４）により記載される如＜Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔｉプラ スミド技法によって形質転換させることができる。か５る形質転換した里物は有 性的に又は細胞培養により又は組織培養により生殖させ得る。

碩物細胞中のＲＮＡの作製程度は、プロモーター配列の適当な選択により又は植 物ゲ゛ツム中に誇導される不発明のＤＮＡ配列の榎表（コピー）の個数又／′ｉ 組込みの座位を選択することにより調節することができる。この様１でして色の 生成をより大きな又はより小さな程に改質することができる。

本発明の！遺体を使用して、技術的に知られた種々の仕方で単子葉植物と双子葉 植物との両方の細胞を形質転換させ得る。多くの場合に、か＼る植物細胞（特に 該細胞が双子葉植物の細胞である時）を培養して全植物を再生でき、続いて生殖 して遺伝子的に改質した植物の連続世代を与える。

本発明の遺伝子的に改質した植物の例は、トマトと同様に例えばマンゴ−１桃、 リンゴ、ナソ、イチゴ、バナナ及びメロンの果実を包含する、か−る植物の果実 はそこに赤色を誘発又は強化することによりよシ魅力的とさせ得る（又は少なく とも有用とさせ得る）、本発明の方法によって改質させ得る他の植物には・・ツ カダイコン、カブラ及びポテトの如き塊茎並びにトウモロコシ（コーン）、小麦 、大麦及び稲の如き穀物がある。改質した色の花及び赤色又は赤味がかった全体 の又は赤色の種子類を育する観賞用草類を製造できる６本発明の方法によって久 造した植物はまた他の組み撓え構造体例えば果実の熟成に別の作用を肩する構造 体を含！できる。特に本発明の増大した色のトマト＋工、ボリカラクノロナーゼ 及びイクチンステラーゼの如き酵素の生産を阻害する構造体又はエチレンの産生 を妨害する構造体（例えばｐＴＯＭ１３がら、１９９０年７月１２日提出のＰＣ Ｔ出願９０　／　０１０７２号参照）を含有できる。か＼るトマトは慣用のトマ トよりも高い固形分含量を有することがでさしかも果実の重量単位当りょシ多い トマトに一ストを製造できる。か＼るトマトにおける余分のリコベノ生産はもし そうでなければか＼るば一ストに見られるかもしれない色の軽減を防止するのに 望ましい。組み換え構造体の両型式を含有するトマトは連続的な形質転換により 又は構造体のうちの１つを各々が含有する２種の品質を交叉させ、両構造体を含 有する品種について所産（ｐｒｏｇｅｎｙ）のうちから選択することによシ形成 できる。

本発明を添附図面を参照しながら更に以下に記載する： 第１図はクローンｐＴＯＭ５の塩基配列を示し；第２図は、ポリメラーゼ連鎖反 応にょシ合成できしかも本発明のベクターの構成に使用できるｐＴＯＭ５壇基配 列の領斌を示し； 第３図は第２図に例示したフラグメントを合成するホＩＪメラーゼ連鎖反応用の プライマーとして使用したオリゴヌクレオチドの塩基配列を示し。

第４図はカロチノイドの合成経路の図式であり；第５図はＤＮＡベクターｐｃＢ １７の図式であシ；第６図はＤＮＡベクターｐｃＢ１９の図式であシ；第７図は 構造体ｐＪＲＥｘ５を製造する図式を表わし。

第８図は構造体ｐＣＢＥＸ５を製造する図式を表わす。

次の実施例は本発明の詳細な説明する。

実施例Ｉ ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを有するｐＴＯＭ５アンチセンスＲＮＡ　＜フタ− の構成 第２図に示した如＜　ｐＴＯＭｓ　ｃＤＮＡの異なった長さに対応する配列を用 いて３遣の（フタ−を構成できる。

１、塩基１〜１８７　−　ｐＪＲ１５Ａ２、塩基１〜７９４　−　ｐＪＲ１５Ｂ ３、塩基　１〜１５９８（完全なｃＤＮＡ　）　−ｐＪＲ１５ｃプライマーとし て第２図に示した合成オリゴヌクレオチドＴ５ＡＳ−１及びＴ５ＡＳ−３及び鋳 型としてｐＴＯＭ５ｃＤＮＡと共にポリメラーゼ連鎖反応を用いてｐＪＲ１５Ｂ を試験管内で合成した、合成オリゴヌクレオチドブライマーは、ＢａｍＨＩ制限 部泣を７ラグメ／トの５′末端に組入れＫｐｎＩ制限部位を７２グメ／トの３′ 末端に組入れるように意１１Ｆ　した。Ｂａｒｒ＋ＨＩ及びＫｐｎＩでの切断（ ｃｌｅａｖ−ａｇｅ）後に、該フラグメントをＫｐｎｌ及びＢａｍＨＩで前もっ て切断しておいたベクターｐＪＲ１にクローン化した。

ｐＪＲｌ　（Ｓｍ１ｔｈらのＮａｔｕｒｅ　３３４．７２４〜７２６　、１９８ ８）ばＢ１ｎ１９　（ＢｅｖａｎのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ、　１２．８７１１〜８７２１．１９８４　）基質のくフタ−であり、これ ＆ｉｃａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にアンチセンスＲＮＡの発現を可能と させる。この（フタ−はノパリンンンターセ（ｎｏｓ）　３’末端終結配列を包 含する。

ベクターｐＪＲ１５Ｂの合成後に、ｐＴＯＭ５配列の構造及び配向はＤＮＡ配列 分析により確認した。

ベクターｐＪＲ１５Ａ及びｐＪＲ１５ｃは第２図及び第３図に示した構成図式に 従って、同様に形成した。

実施例２ ポリガラクソロナーゼプロモーターと共にｐＴＯＭ５了ンチセンスＲＮＡ−＜フ タ−の構成 実万例１に記載したｐＴＯＭｓ　ｃＤＮＡの７ラグメントをベクターｐＪＲ２中 にクローン化して次のクローンを得る １、塩基１〜１８７　−　ｐＪＲ２５Ａ２、　塩基　１〜７９４　−　ｐＪＲ２ ５Ｂ３、　垣奉　１〜１５９８　−　ｐＪＲ２５ＣｐＪＲ２ばＢ１ｎ１９基質の ベクターであり、トマトのポリガラクソロナーゼプロモーターの制御下にアンチ センスＲＮＡを発現し得る。このベクターはノ・ξリノンンターゼ（ｎｏｓ）　 ３’末端終結配列を包含する。このベクターはプロモーターとターミネータ−配 列との間のＫｐｎＩ又はＢａｍＨＩ部位を含有しない、従って、ＰＣＲ合成フラ グメントはＫｐｎｌ及びＢａｍＨＩで消化され、切断末端はＴ４．＋？リメラー ゼでフラソ７ユ（ｆ　１ｕｓｈ　）させ仄いでｐＪＲ２のＨｉｎｃ［１部位中ン てクローン化される。

合成後に、ｐＴＯＭ５配列の正確な配向を耳するベクターはＤＮＡ配列分析１・ でより同定される６ＣｔｈＭＶ　３５Ｓプロモーターと共にｐＴＯＭセノスＲＮ Ａベクターの構成 ′４４％２に記載したｐＴＯＭｓ　ｃＤＮＡのフラグメントをセンス配向で（ク ターｐＪＲＩ中にクローン化して次のクローンを得る。

１、塩基１〜１８７　−　ｐＪＲ１５Ａｓ２、塩基１〜７９４　−　ｐＪＲ１５ Ｂｓ３、塩基１〜１５９８　−　ｐＪＲ１５ｃｓＰＣＲ生成フラグメントｆ：Ｋ ｐｎｌ及びＢａｍＨＩで消化し、切断末端をＴ４ポリメラーゼでフラッシュさせ 、次いでｐＪＲｌのＨｉｎｃ１１部位中にクローン化した。合成後に、ｐＴＯＭ ５配列のセンス配向を有するベクターはＤＮＡ配列分析により同定された。

実施ψ］　４ ベクターｐＪＲ１５Ｂで形質ｆ、換した植物の世代及び分析 ｐＪＲ１５Ｂベクターをアグロバクテリウム　ソメファンエ／ス（Ａｇｒｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４　ＣＦｌ物のバイオ チクノロレストに広く入手し得る微生物）に転移させ、これを用いてトマト植物 を形質転換した。トマトの茎分節片の形質転換は標準の生化学記録書に従った（ 例えばＢｉｒｄらのＰｉａｎｔ　：Ｖｆｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１ １゜６５１〜６６２　、１９８８　）　ｏ形質転換した徨物は抗生物質のカナマ イ／ノを含有する培地上で生長する能力により同定した。４１本の、固々の植物 を再生し、成熟するまで生長させた。これらの植物のうち３７本が赤色に変化す るよりもひしろ黄色に変化した果実を生成し１これらは熟れ過き゛の時でさえ赤 色に戻らなかった。他の４本の植物からの果実は世赤色に変化した。

黄色の果実を有する植物の花は淡い花冠を有した。

花における黄色色素の集積は個々の形質転換細胞同志間で変化し、その際若干の 花は殆んど白色である。

予備的な分析が示す所によれば黄色果実中のカロチノイド集積は非形質転換対照 体中のカロチノイド集積量の大体６％であった。リコはノは殆んど検出されなか った（標準果実中の集積量のく２％）；残留カロチノイドの大部分はルティン及 びβ−カロチンであり、そのどちらも対照の果実中におけるよりも有意な程に大 きな製置には集積さｎていなかった。黄色来貢色素の大部分は表皮中に在り、メ タノールによっては抽出できなかった。即ちカロチノイドであるとはありそうも ない。

黄色果実を与える形質転換細胞の３つと、赤色果実を与える形質転換細胞の２つ ととポリメラーゼ連鎖反応分析にかけた。この分析によりｐＪＲ１５Ｂアンチセ ンス薄造体は全ての５つに存在し且つ完全なものであることを示した。ＤＮＡプ ロット分析は挿入複製数（１ｎｓｅｒｔｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ　）が１〜４で ろることを示した。

黄色果実を有するコードしたＥ６４Ｃ８の形質転換済み植物を自己化（５ｅｌｆ ｅｄ　）　して子孫植物を生産した。これによりメンデルの厘理に応じて黄色の 花と白色の花との分離を示し、植物がアンチセンス構造体の機能性コピーを含有 し且つ表現型が安定に継承されていることを示している。

実施例５ ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと共にｐＴＯＭ５発現（フタ−の構成 ｐＪＲＥＸ５の構成 発現ベクターｐＪＲＥＸ５は第７図に示した図式により生体中で合成される。１ ４６８　ｂｐ　５ｓｐＩフラグメントをｐＴＯＭ５から単離し、切断末端をＴ４ ．？？リメラーセでフラッシュさせ、次いで得られる生成物をプラスミドｐ、ｒ ＲｔＯ３ｒｎａ　Ｉ座位千にクローン化させる。

合成後にｐＴＯＭ５フラグメントをセンス及ヒア／チセノス配向させたベクター をＤＮＡ配列分析により同定した。

実施例６ トマトのポリガラクンロナーゼ　プロモーターと共にｐＴＯＭ５発現ベクターの 機成 Ａ、　ｐｃＢｌ７の構成 トマトＰＧ遺伝子の３′末端からの１．６　ｋｂ　ｑ域を、ｐｃＢｌ　中の）／ ξリノ／／ターセ　ポリアデニル化配列の代６５１〜６６２．１９８８）。

ｇＴＯＭ２３中のラムダＥＭＢ［，３の右腕に隣接する５、８　ｋｂＳａ　１　 ｒ　／ＢａｍＨＩフラグメントをｐＵＣ８のＳａ　ｌ　Ｉ　／ＢａｍＨＩ座位中 にクローン化させてプラスミドｐＧＴＯＭ２３．５．８を得た。

９０７０Ｍ２３．５．８から１．６　ｋｂ　Ｂｇ［フラグメントを単離し、ｐＵ ｃ１９のＢａｍＨｒ座位中に座位−ン化した。１．６　ｋｂ　Ｂｇｌ挿入部を正 確に配向したプラスミドは５５０　ｂｐ　ＸｂａＩ／ＢｓｔＥＵ　７ラグメント を含有した。か＼る１つのクローンをＡ３／１と呼ぶ。

２．２　ｋｂ　Ｈｉｎｄｌ／ＰｖｕＩをｐｃＢｌからのフラグメントとして息離 した。これは１．４５　ｋｂ　ＰＧプロモーターフラグメントとクロラムフェニ コールアセチル　トランスフエラーセ（ＣＡＴ）遺伝子とを含有した。これをＢ １ｎ１９　（ＢｅｖａｎのＮｕｃＬｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　 １９８４．１２．８７１１〜８７２１　）中にクローン化さく、Ｂ１ｎ１９は５ ａｌＩで切断されており伏いてＴ４ＤＮＡ、＋？リメラーゼで付着端を装填し、 次後にＨｉｎｄｕで消化してあったｏ　２．２　ｋｂ　Ｈｉｎｄｕ／Ｐｖｕｌフ ラグメントを有するプラスミドは２．２　ｋｂ　Ｈｉｎｄ［／Ｘｂａｌフラグメ ントを含有した。これらのクローンのウチの１つをＸｂａＩ及びＫｐｎｌで消化 させ、Ａ３／１からの１．６　ｋｂＸｂａｌ／ＫｐｎＩフラグメントと連結反応 させた０形質転換後に、正確な挿入部を有する１つのクローンをｐｃＢｌ７（第 ５１ｇ）と呼称する。

ｐｃＢｌ７の正確な構成はＣＡＴ遺伝子とＰＧ　３’フラグメントとの１間の境 界でプラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列分析により点検した。Ｂ１ｎ１９７　 ’）　’）ンカーの予期せぬ領域がこの接合部で残存していることが見出された 。

これはプラスミドの正確な機能化を妨害しそうもないものと判断された。この領 域におけるｐｃＢｌ７の配列は次の通りである。

ＣＡＴ　ＢＩＮ１９　、＋？リリンカー　ＰＧ　３’・・ＣＣＧＴＣＣＣＣＧＴ ＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＡＴＡ ＴＡＴＡＧ−・ＸｂａＩ Ｂ、　ｐｃＢｌ９の構成 プラスミドｐｃＢ１７中のＰＧプロモーター領域はケノムクローンｇＴＯＭ２３ 　（ＮＣＩ畑受理番号１２３７３　）からの３５ｋｂフラグメントの付加により 延長さぜた。

９０７０Ｍ２３．７．８からの３．５　ｋｂ　Ｈｉｎｄ！フラグメントをｐｃＢ ｌ７中のＨｉｎｄｆ座位中に座位−ン化させたｏ３５ｋｂＨｉｎｄ　ＡＹＥ挿入 部を正確に配向させたプラスミドは４９ｋｂ　５ａｆｆ／ＢａｍＩフラグメント を含有した。かメる１つのクローンをｐｃＢｌ９と呼称した（第６図）Ｃ，ｐｃ Ｂｌ９の構成 第８図に示した図式により発現（フタ−ｐＣＢＥＸ５を試験管中で合成する。１ ４６Ｅｊ　ｂｐ　５ｓｐＩフラグメントをｐＴＯＭ５から単離させ、切断末端を Ｔ４ポリメラーゼでフジップユさぜる。次いで得らｎるｐｃＢｌ９中にクローン 化すぞ、ｐｃＢｌ９からクロラムフエニコールアセチルトラノスフエラーゼをエ ンコードするＢａｍＨｒ　−Ｘｂ　ａｌ　７ラグメントを削除しておき、しかも 切断末端をＴ４　、＋？リメラーゼでフラノ／ユさせである０ 合成後に、ｐＴＯＭ５フラグメントをセンス及びアンチセンス配向させた（フタ −はＤＮＡ配列分析により同定センスベクターｐＪＲＥＸ５及びｐＣＢＥＸ５を 可する形質転換した植物の世代 所要のセンス発現ベクター（実施例５又は６で製造した）をＡｇｒｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４　（Ｆｊｉ物のバイオテク ノロジストには広く入手し得る微生物）に転移させしかもこれを用いてトマトを 形質転換させる。トマトの茎分節片の形質転換は標準の生化学記録書に従かう（ 例えばＢｉｒｄらのＰｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ　−ｏｇｙ、　 １１．６５１〜６６２．１９８８　）。形質転換した植物は、抗生物質のカナマ イシンを含有する培地上で生長する能力により及びケ゛ツムＤＮＡのＤＮＡ−Ｄ ＮＡプロット分析を検定することによシ同定された。成熟している果実をリコに ン及び他のカロチノイドの濃度について分析する。通常のリコはン濃度よりも嵩 いリコはン濃度の植物を別の用途及び研究用に選択する。

ＦＩＧ　１ ０＋ｆｌ　／ 浄書ｒ内容に変更なし） 要　約　書 構造体ｐＴＯＭ５の遺伝子は、カロチン、ルティン、キサントフィル及びリコＲ ンの如き色素を産生ずるカロチノイド生合成経路に関与する。本発明は、植物プ ロモーターで先導されるクローンｐ　ＴＯＭ　５によりエンコード化した遺伝子 の若干又は全てと相同性のＤＮＡ塩基配列を含有してなる新規なりＮＡ構造体を 用いて、植物中のか＼る化合物の合成を改質（抑制又は促進）することを提案す る。特に、植物部分特に果実の色を改質できる。黄色のトマトを開示する。

手続補正書（的） 平成４年６月２６日

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．植物中で作用する転写開始領域で先導される、クローンｐＴＯＭ５によりエ ンコード化した遺伝子生成物に対して遺伝子の少なくとも若干と相同性を示すＤ ＮＡ塩基配列を含有してなるＤＮＡ構造体であつてこうして該構造体が植物細胞 中でｍＲＮＡを生成し得るようにしたＤＮＡ構造体。
2. ２．ｐＴＯＭ５の遺伝子によつて生産した酵素をエンコードするｍＲＮＡと実質 的な相同性を示す塩基配列に相補的なＲＮＡをエンコードするＤＮＡ塩基配列を 転写するのに定置された、植物中で作用する転写開始領域を含有してなる特許請 求の範囲１記載のＤＮＡ構造体。
3. ３．ホン訳してｐＴＯＭ５の遺伝子によつて生産された酵素を与え得るｍＲＮＡ を与えるのにＤＮＡ塩基配列を転写するのに定置された、植物中て作用する転写 開始領域を含有してなる特許請求の範囲１記載のＤＮＡ構造体。
4. ４．ｐＴＯＭ５の遺伝子によつて生産された酵素をエンコードするｍＲＮＡの一 部のみと実質的な相同性を示すＲＮＡをエンコードするＤＮＡ塩基配列を転写す るのに定置された、植物中で作用する転写開始領域を含有してなる特許請求の範 囲１記載のＤＮＡ構造体。
5. ５．転写開始領域はＣａＭＶ３５Ｓの如き構成プロモーターである特許請求の範 囲１記載のＤＮＡ構成体。
6. ６．転写開始領域は誘導プロモーター又は発生的に調節したプロモーター又は組 織特異性のプロモーターである特許請求の範囲１記載のＤＮＡ構成体。
7. ７．カロチノイドの生合成を改質するのに適したＤＮＡで植物を形質転換させ、 かゝる形質転換した植物又はそれらの子孫植物を生長させて改質したカロテノイ ド含量の植物部分を製造することにより、植物中のカロチノイドの製造を改質す る方法。
8. ８．ＤＮＡは特許請求の範囲１〜６の何れかに記載の構造体である特許請求の範 囲７記載の方法。
9. ９．植物中のリコペンの製造を改質するのに適したＤＮＡで植物を形質転換させ 、かゝる形質転換した植物又はそれらの子孫植物を生長させて色の変化した植物 部分を製造することからなる、改質した色の部分を有する植物の製造方法。
10. １０．植物はリコペンを自然に産生し、構造体はリコペンの産生を抑制するのに 適する特許請求の範囲９記載の方法。
11. １１．ＤＮＡ構造体は特許請求の範囲２又は４の何れかに記載の構造体である特 許請求の範囲１０記載の方法。
12. １２．植物部分中の赤色を産生又は強化するため構造体がリコペンの産生を促進 するのに適している特許請求の範囲９記載の方法。
13. １３．構造体は特許請求の範囲３に記載の構造体である特許請求の範囲１０〜１ ２の何れかに記載の方法。
14. １４．植物はトマトである特許請求の範囲７〜１３の何れかに記載の方法。
15. １５．特許請求の範囲７〜１３の何れかの方法で製造した形質転換済み植物。
16. １６．植物が果実例えばトマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナ ナ、メロン又は柑橘類の果実である、特許請求の範囲１５記載の植物。
17. １７．植物が塊茎例えばハツカダイコン、カブラ及びポテトである特許請求の範 囲１５記載の植物。
18. １８．植物が殻物例えばトウモロコシ（コーン）、小麦、大麦及び稲である特許 請求の範囲１５記載の植物。
19. １９．植物が機能上観賞用である例えば花である特許請求の範囲１５記載の植物 。
20. ２０．特許請求の範囲１５〜１９の何れかに記載の植物から収穫した、色の改変 した植物部分。
21. ２１．特許請求の範囲１５〜１９の何れかに記載の植物の果実及び種子。
22. ２２．ポリガラクツロナーゼ又はペクチンメチルエステラーゼの産生を阻止する 組換え構造体を追加的に含有してなる特許請求の範囲１４記載のトマト。