JPH053855B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、白血球を活性化して抗腫瘍免疫細胞
を誘導する機能を持つ癌治療用白血球刺激材に関
する。

（従来の技術） 周知のように、生体の悪性腫瘍に対する免疫監
視機構を担う抗腫瘍免疫細胞としては、キラーＴ
細胞、NK細胞、活性化マクロフアージ、Ｋ細胞
等が重要な役割をはたしていることが報告されて
いる［福沢正洋：医学のあゆみ、126，420（，
83）］。したがつて、悪性腫瘍に対する免疫学的療
法としては、癌患者免疫細胞（白血球）を活性化
して、これらの抗腫瘍免疫細胞を効率的に誘導活
性化することが考えられる。しかしながら、実際
の癌患者体内においては、このような悪性腫瘍に
対する免疫監視機構の存在にもかかわらず、腫瘍
細胞が増殖する。

その主要なメカニズムの１つとして、腫瘍細胞
による免疫抑制性細胞（サプレツサーＴ細胞、サ
プレツサーマクロフアージ等）の誘導活性化が報
告されている。［藤本重義ら、ジヤーナル・オ
ブ・イムノロジイ（S.Fujimoto etal，J.
Immunol.）116，791（，76）］。

かかる免疫抑制性細胞は、腫瘍細胞を障害する
機能を担う種々の抗腫瘍免疫細胞の誘導活性化を
抑制し、ために腫瘍細胞の増殖を許し、ますます
腫瘍に対する免疫応答能の低下をまねくと考えら
れる。また、その他のメカニズムとして、腫瘍細
胞による免疫抑制性因子の産生により、腫瘍細胞
に対する免疫応答が抑制されている可能性も報告
されており［ジエー・エー・ロスら、ジヤーナ
ル・オブ・イムノロジイ（J.A.Roth etal：J.
Immunol.）128，1955（，82）］、かかる免疫抑制
状態下にある癌患者体内においては、効率的な抗
腫瘍免疫細胞の誘導活性化は困難であると言わな
ければならない。

したがつて、免疫抑制のない抗腫瘍免疫細胞誘
導活性化に最適な条件を体外に設定し、癌患者か
ら取り出した白血球を刺激活性化して、強力な抗
腫瘍免疫細胞を誘導し、これを元の患者にもどす
ことによつて癌を治療しようとする方法は、効果
の高い新しい癌免疫療法となる可能性を有すると
考えられる。

（発明が解決しようとする問題点） 体外に取り出した白血球を刺激活性化して抗腫
瘍免疫細胞を誘導活性化し、これを担癌生体に投
与して癌を治療する試みは、現在活発に研究が行
なわれているが、白血球の刺激活性化に担癌生体
より抽出した腫瘍細胞を用いており、非常に操作
が煩雑である。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、前記の問題点を解決するために
鋭意研究した結果、驚くべきことに、OK432を
不溶性担体に共有結合で固定した刺激材で白血球
を刺激活性化することにり、強力な抗腫瘍免疫細
胞が誘導されることを見い出し、本発明を完成す
るに至つた。

すなわち、本発明は、OK432を不溶性担体に
共有結合で結合してなることを特徴とする癌治療
用白血球刺激材に係る。

本発明で用いられる不溶性担体は、親水性担
体、疎水性担体いずれも使用できるが、疎水性担
体を用いる場合には、特に担体への血清成分の非
特異的吸着が生じるため、親水性担体の方が好ま
しい結果を与える。不溶性担体の形状は、粒子
状、繊維状、中空糸状、膜状のいずれの公知の形
状も用いることができる。

不溶性担体の材質としては、リガンドを固定化
するために、担体が活性化でき、担体の活性化反
応、固定化反応などを含めた全工程を通じて物理
的に安定であればよい。具体的には、無機ベース
のものにあつては、活性炭、ガラス等およびその
誘導体であり、天然高分子由来担体には、セルロ
ース、セフアローズ、デキストラン、デンプン、
アルギン酸、キチン等の単純多糖類およびその誘
導体、寒天、ペクチン、コンニヤク、アラビアゴ
ム等の複合多糖類およびその誘導体、羊毛、絹蛋
白質等の蛋白質およびその誘導体があるが、これ
らは必要に応じ、架橋反応等の不溶化処理をした
後、担体に用いる。

また、合成高分子にあつては、ビニル系高分子
には、スチレン、酢酸ビニル、メタクリル酸エス
テル、アクリル酸エステル、ハロゲン化ビニル、
ハロゲン化ビニリデン、アクリロニトリル、アク
リルアミド、メチルビニルケトン、ビニルピロリ
ドン、２−ビニルピリジン、エチレン、プロピレ
ン、ブタジエン、イソプレン等およびその誘導体
の重合体および共重合体が例示できる。

OK432をリガンドとして不溶性担体の表面に
固定する方法としては、共有結合、イオン結合、
物理吸着等のあらゆる公知の方法を用いることが
できるが、溶出性から考えると、共有結合で固定
して用いることが望ましい。そのためには通常固
定化酵素、アフイニテイクロマトグラフイで用い
られる公知の方法を用いることができる。たとえ
ば、不溶性担体をエポキシ活性化し、これにリガ
ンドを結合させる方法等を用いることができる。
また、必要に応じて、不溶性担体とリガンドの間
に任意の長さの分子（スペーサー）を導入して使
用することもできる。

本発明の刺激材の製造方法は、上記方法に限定
されるものではなく、たとえばビニルモノマーに
リガンドを結合させ、これを重合させる方法、ま
た、たとえばリガンドを活性化して担体に結合さ
せる方法等の方法を用いることができ、本発明
は、刺激材の製造方法に規定されるものではな
い。

本発明における白血球とは、血液細胞のうち赤
血球および血小板を除いた、いわゆる白血球を指
すが、この白血球より顆粒球あるいはＢ細胞を除
去した細胞分画も、本発明における白血球の概念
に含まれる。本発明において活性化を行う白血球
は、公知の連続遠心分離法にて末稍血より採取し
た白血球分画を用いてもよく、また、公知のフイ
コールパーク重層遠心分離法にて分離した単核細
胞分画でもよく、あるいは末稍血単核細胞より公
知のノイラミニダーゼ処理羊赤血球とのロゼツト
形成で分離濃縮したＴ細胞分画を使用しても、強
力な腫瘍障害性細胞の誘導が可能である。

本発明において誘導活性化する腫瘍障害性細胞
は、白血球の中で顆粒球、単球、マクロフアージ
を除くリンパ球分画に属し、とりわけＴ細胞の性
質を有している。

刺激材による末稍血白血球の活性化は、血清成
分含有培地もしくはこれにインターリユーキン２
を添加した培地で行うと強力な腫瘍障害性細胞の
誘導が可能である。すなわち、牛胎児血清、牛血
清、馬血清等の動物血清あるいはヒト血清を２〜
20％含有した培地を調製する。好ましくはヒト血
清を２〜20％含有した培地を調製する。この場合
の培地は、動物細胞培養に一般的に用いられる培
地、たとえば、RPMI1640培地、MEM培地等が
使用できる。また、血清成分たとえば、血清アル
ブミンを添加したRPMI1640培地でも使用が可能
である。

調製した培地中に、種々の方法で採取した末稍
血白血球を0.5〜３×10⁶個／mlの細胞濃度で浮遊
させ、これに適当量の刺激材を添加し、温度25〜
45℃で培養を行う。温度25℃以下ではほとんど有
効な白血球の活性化が起こらず、温度45℃以上で
は白血球の生存率が低下する。培養は市販の細胞
培養用のプラスチツク製容器を使用し、CO₂イン
キユベーター中で行えば簡便である。１日ないし
数日培養を行つた後、活性化白血球を回収する。
もしくはインターリユーキン２含有培地で長期培
養を行つてもよい。

このようにして得た活性化白血球は、腫瘍細胞
を強力に殺すことが判明した。

（発明の効果） 本発明の刺激材は、以上述べてきたように、白
血球を刺激活性化して、安全かつ操作性よく、強
力な抗腫瘍免疫細胞を誘導するものであり、胃
癌、肺癌、乳癌等の癌治療および検査診断、研究
等に用いようとするものである。

実施例 OK432（中外製薬ピシバニール）１mgをリガン
ドとして公知の方法によつて市販のCNBr活性化
セフアロース（フアルマシア社製）１mlに結合さ
せ、刺激材を作成した。なお、このリガンドの保
持量を求めるために、結合反応後の上清および洗
浄液中のリガンド量を求め、添加量から減じて計
算したところ、95％のリガンドが保持された。

ヒト白血球は次のようにして得た。すなわち、
採血したヒト末稍血をハンクス液で２倍希釈し、
フイコールパーク液（フアルマシア社製）に重層
し、2000rpmで20分間遠心分離した後、中間層の
白血球層を分離して、これをハンクス液で洗つた
後、自己血清を10％添加したRPMI1640培地（ニ
ツスイ）に２×10⁶／mlの細胞濃度で浮遊させる。
この細胞浮遊液を１mlずつ、細胞培養用の２mlウ
エル（フアルコンNo.3047）に分注し、これに刺激
材を50μずつ添加し、CO₂インキユベーター中
で温度37℃で培養を行う。３日間培養を行つた
後、ピペツテイングを行つて静置すると、担体は
容器の底に沈澱するので、上清血清をとり、これ
をハンクス液で洗つた後、自己血清10％添加
RPMI1640培地に５×10⁶／mlの細胞濃度で浮遊
させる。

この活性化白血球が腫瘍細胞障害性を有するか
どうかは、次のようなキラー活性測定法を用いて
評価した。培養プレートに付着して増殖する種々
のヒト癌細胞株を標的細胞として、５×10⁴／ml
の細胞濃度で10％牛胎児血清添加RPMI1640培地
に浮遊させ、これを10μずつ10μ容テラサキ
プレートに分注し、CO₂インキユベーター中で温
度37℃で培養する。24時間培養を行うと、癌細胞
は培養プレート底面に強く付着する。これを培養
液で洗つた後、活性化白血球浮遊液10μを添加
し、37℃で４時間、CO₂インキユベーター中で培
養し、プレートに付着している癌細胞を障害させ
る。障害を受けた癌細胞は、プレート底面への付
着性を喪失し、ハンクス液で洗うと活性が白血球
とともに除去される。生残してプレート底面に付
着している癌細胞をアセトンで固定し、ギムザ液
で染色した後、顕微鏡で計数する。キラー活性は
次式により計算する。

キラー活性＝｛１−［（活性化白血球を添加した
場合の生存腫瘍細胞数）／（活性化白血球を添加
しない場合の生残腫瘍細胞数）］｝×100（％） このような方法を用いて、刺激材で活性化した
免疫細胞の腫瘍細胞障害活性を測定したところ、
MKN−１ヒト胃癌細胞に対する障害活性50％
で、MKN−１ヒト胃癌細胞に対して強力な障害
活性を示した。

比較例 刺激材無添加あるいは不溶性担体（セフアロー
ス）のみを添加して、実施例と同様にして実験を
行つたところ、抗腫瘍免疫細胞はほとんど誘導さ
れなかつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ OK432を不溶性担体に共有結合で結合して
   なることを特徴とする癌治療用白血球刺激材。