JPS6229524A - 悪性腫瘍治療用刺激剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血液細胞中の免疫細胞を活性化して抗腫瘍免
疫細胞を誘導する機能を有する免疫細胞刺激材に関する
。

（従来の技術） 周知の如く、生体の悪性腫瘍に対する免疫監視機構をに
なう抗腫瘍細胞としては、キラーＴ細胞、ＮＫ細胞、活
性化マクロファージ、Ｋ細胞等が重要な役割をはたして
いることが報告されている。

したがって、悪性腫瘍に対する免疫学的療法としては、
癌患者免疫細胞（白血球）を活性化して、これらの抗腫
瘍細胞を効率的に誘導することが考えられる。しかしな
がら、癌患者は一般的に、癌の進行とともに免疫能が低
下することが報告されており、癌患者生体中においては
、免疫応答を抑制する免疫抑制因子の存在あるいはサプ
レッサーＴ細胞、サプレッサーマクロファージの誘導活
性化が報告されている。

このような免疫能の抑制状態下にある癌患者生体中にお
いて、効率的な抗腫瘍細胞の誘導は困難であると言わな
ければならない。したがって、免疫抑制状態から解放さ
れた体外に患者白血球を取り出し、体外で効率的な抗腫
瘍細胞誘導活性化を行うことは、効果の高い新しい癌免
疫療法になると考えられる。

キラーＴ細胞は、抗腫瘍細胞の中でも特に抗癌免疫にお
いて主役をはたしていると考えられているが、これを体
外で誘導活性化しようとする研究が精力的になされてき
た。すなわち、体外に取り出した癌患者末梢血白血球に
、摘出した患者腫瘍細胞を感作させ、患者白血球を活性
化して、特異的に患者腫瘍細胞だけを障害し、患者正常
細胞は障害しないキラーＴ細胞を誘導して、これを癌患
者体内にもどすことにより、癌を治療しようとする試み
である。

しかしながら、この方法で誘導したキラーＴ細胞は、治
療効果を期待できるほど強力ではないため、リンフ才力
インの１種であるＴ細胞増殖因子を用いて培養し、大量
に増殖させた後、患者に投与する方法が考えられている
。

（発明が解決しようとする問題点） 前記の方法は、Ｔ細胞増殖因子が遺伝子操作の技術によ
り工業的大量生産が可能となり、大量のＴ細胞増殖因子
が使用できることが現実化してきたために実施可能では
あるが、キラーＴ細胞を体外で長期間培養することによ
る細胞の変質等の問題がある。また、そのほかにも実用
化するには困難な種々の問題点があり、例えば、キラー
１゛細胞の誘導のために患者腫瘍細胞と手術が必要なこ
と、試みた癌患者の一部にのみキラーＴ細胞の誘導が可
能で、金側で誘導されるわけではないこと、操作が非常
に煩雑であること等、解決されなければならない問題点
が多い。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、上記の如き従来技術に基づく抗腫瘍免疫細胞
誘導の問題点に鑑み、従来の方法よりも実用性、操作性
、安全性の点で飛躍的に向上させた抗腫瘍免疫細胞誘導
用刺激材を提供するものである。

本発明者らは、上記目的に沿って鋭意研究した結果、核
酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの化
学修飾誘導体を共有結合で不溶性担体に結合させた刺激
材を、ヒト末梢血白血球またはマウス肺臓細胞白血球に
接触させたところ、強力な腫瘍障害性細胞が誘導される
ことを見出し、先に特許出願した（特願昭５９−２０８
０６６）。

本発明者らは、さらに強力な腫瘍障害性細胞を誘導する
刺激材を見出すため、鋭意研究した結果、ピラゾロ（３
，４−ｄ）ピリミジンおよびその誘導体を共有結合で不
溶性担体に結合させた刺激材を、ヒト末梢血白血球また
はマウス肺臓細胞白血球に接触させたところ、驚くべき
ことに、極めて強力な腫瘍障害性細胞と抗腫瘍ヘルパー
Ｔ細胞が誘導されることを見出し、本発明を完成するに
至った。

すなわち、細胞浮遊液中に溶解した状態では細胞活性化
能を持たないピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン誘導体
が不溶性担体に結合した状態で、ヒトおよびマウスの白
血球を活性化する能力を有し、この活性化白血球を腫瘍
細胞と混合したところ、５時間の培養でほとんどの腫瘍
細胞が障害をうけて破壊され、さらに、この活性化白血
球を腫瘍細胞と活性化されていない白血球の系に加える
と、白血球の腫瘍細胞に対する障害能が増強され、強力
な腫瘍障害性細胞と抗腫瘍ヘルパーＴ細胞が誘導されて
いることを見出したのであり、この知見に基づく本発明
は、ピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンおよびその誘導
体の少なくとも１種を不溶性担体の表面に結合させたこ
とを特徴とする抗腫瘍免疫細胞誘導用刺激材である。

本発明における不溶性担体の表面とは、細胞すなわち白
血球細胞膜表面に存在する細胞表面抗原やレセプターを
はじめとするタンパク質、糖タンパク質、脂質、糖脂貫
と接触可能な担体の材料表面をさしている。

本発明における白血球とは、血液細胞のうち赤血球およ
び血小板を除いた、いわゆる白血球を指すが、梢血に限
らず、リンパ管、リンパ節、肺臓、胸管から得られる白
血球分画も、本発明における白血球の概念に含まれる。

また、この白血球より顆粒球あるいはＢ細胞を除去した
細胞分画も、本発明における白血球の概念に含まれる。

本発明において活性化を行う白血球は、例えば、連続遠
心分離法にて末梢血より採取した白血球分画を用いても
よく、また、フィコールパーク重層遠心分離法にて分離
した単核細胞分画でもよく、あるいは末梢血単核細胞よ
り公知のノイラミニダーゼ処理羊赤血球とのロゼツト形
成で分離濃縮したＴ細胞分画を使用しても、強力な腫瘍
障害性細胞の誘導が可能である。

本発明において誘導活性化する腫瘍障害性細胞は、白血
球の中で顆粒球、単球、マクロファージを除くリンパ球
分画に属し、とりわけＴ細胞の性質を有している。

本発明において用いることのできる不溶性担体に結合す
るピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン誘導体としては、
如何なるものでも使用できる。

すなわち、ピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン、４−ア
ミノピラゾロ（３，４−ｄ）　ピリミジン、６−アミノ
ピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン、４−アミノ−６−
ヒドロキシピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン、４−ア
ミノ−６−メルカプトピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジ
ン等が挙げられる。中でも、４−アミノピラゾロ　（３
，４−ｄ）　　ピリミジン、４−アミノ−６−ヒドロキ
シピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンが最も好ましい結
果を与える。これらを単に一つだけ結合するのではなく
、複数の種類を不溶性担体に結合してもさしつかえない
。

これらの物質は、固定時の取扱いが容易であり、担体か
ら溶出した場合にも、生体に対する安全性は極めて高い
。また、刺激材の滅菌操作も容易に行うことができる。

本発明で用いられる不溶性担体は、親水性担体、疏水性
担体いずれも使用できる。不溶性担体の形状は、粒子状
、繊維状、中空糸状、膜状等いずれの公知の形状も用い
ることができる。粒状もしくは球状不溶性担体としては
、粒径Ｉ〜３０００ミクロ゛ンのものが使用できる。粒
径１ミクロン以下では、活性化白血球との分離困難であ
る。特に粒径５０ミクロン以上であれば、容易に活性化
白血球との濾過分離が可能であり、粒径３０００ミクロ
ン以上では、白血球との担体単位重量あたりの接触面積
が低下するため好ましくない。特に好ましくは、粒径８
０〜２０００ミクロンのものである。また、粒状もしく
は球状不溶性担体の比重が１．０７以上であれば、容易
に活性化白血球との遠心もしくは静置による分離が可能
である。

また、平膜状あるいは中空糸状多孔性担体を使用する場
合、その孔径が、細胞は通過できないが培地成分は自由
に通過できる０、０５〜１０ミクロンのものを使用すれ
ば、膜の一方の面に結合した白血球に膜の他方の面より
栄養を補給でき、高濃度の白血球を刺激活性化すること
が可能である。特に０．１〜５ミクロンの孔径の平膜状
あるいは中空糸状の多孔性担体が良好に使用できる。

繊維状担体を用いる場合には、その繊維径が１〜３００
０ミクロン、より好ましくは５０〜２０００ミクロンの
範囲にあるものがよい。繊維径が大きすぎる場合には、
白血球と繊維との接触頻度が低下し、白血球の充分な活
性化が起こらず、小さすぎる場合には、血球の非特異的
粘着や目づまりを起こしやすい。繊維状の担体としては
、再生セルロース系繊維、ナイロン、アクリル、ポリエ
ステル等公知のものが使用できる。

不溶性担体の材質としては、無機ベースのものにあって
は活性炭、ガラス等およびその誘導体があり、天然高分
子由来担体には、セルロース、セファロース、デキスト
ラン、デンプン等の単純多糖類およびその誘導体がある
。

また、合成高分子にあっては、ビニル系高分子には、ス
チレン、酢酸ビニル、メタクリル酸エステル、アクリル
酸エステル、ハロゲン化ビニル、ハロゲン化ビニリデン
、アクリロニトリル、アクリルアミド、メチルビニルケ
トン、ビニルピロリドン、２−ビニルピリジン、エチレ
ン、プロピレン、ブタジェン、イソプレン等およびその
誘導体の重合体および共重合体があり、環状化合物の開
環重合体には、ジメチルシクロプロパン、スピロ−ジー
〇−キシリレン、ノルボルネン、シクロブテン、トリオ
キサン、ラクチド、シクロポリシロキサン、塩化ホスホ
ニトリル、Ｎ−カルボキシ−α−アミノ酸無水物等およ
びその誘導体の重合体および共重合体、ポリホルムアル
デヒド、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレングリコ
ール、ポリ−３，３−ビス（クロルメチル）オキサシク
ロプタン、ポリテトラヒドロフラン、ポリカプロラクタ
ム等およびその誘導体がある。。

樹脂その他のものにあっては、アクリル樹脂、メタクリ
ル樹脂、フッ素樹脂、エポキシ樹脂、尿素樹脂、アミン
樹脂、スチレン樹脂、メラミン樹脂、ポリウレタン、シ
リコン樹脂、アルキド樹脂等およびその誘導体が例示で
きる。

また、重縮合体には、ポリエステル、ポリアミド、ポリ
アンヒドリド、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリスル
ホンアミド、ポリイミド、ポリベンゾイミダゾール等お
よびその誘導体が挙げられる。

以上に挙げた高分子担体は、必要に応じた適当なコモノ
マー、架橋剤を用い、不溶化担体を得ることができ、架
橋剤にあっては、硫黄、有機過酸化物、フェノール樹脂
、ジイソシアナート、エポキシ化合物、ジエン、グリタ
ルアルデヒド等、被架橋物の官能基に合わせ、種々のも
のを選択できる（大成社、“架橋剤ハンドブック”、Ｐ
３〜７７゜１９８１）。

本発明の不溶性担体の表面は、多孔質構造を有するもの
が、その抗腫瘍細胞誘導活性よりみて好ましく用いられ
る。

不溶性担体表面の多孔質構造は、平均孔径５０人ないし
３０００人の範囲にあるものが好ましいが〜平均孔径が
小さすぎる場合には、細胞表面に存在するタンパク質、
糖タンパク質、脂質、糖脂質等の細胞表面分子と不溶性
担体材料表面の充分な接触が得られず、孔径が大きすぎ
る場合には、不溶性担体の強度が低下するため実用的で
はない。細胞表面分子と充分な接触が得られ、実用的に
用いられる担体の孔径としては、より好ましくは１００
００人いしは２０００人の範囲である。

平均孔径の測定は、水銀圧入式ポロシメーターによって
行うことができる。この方法は多孔性物質に水銀を圧入
してゆき、浸入した水銀量から気孔量を、圧入に要する
圧力から孔径を求める方法であり、４０Å以上の孔を測
定することができる。

平均孔径は、孔径をｒ、ポロシメーターで測定した累積
気孔量をＶとしたとき、ｄｖ／ｄｌｏｇｒの値が最大と
なるときのｒの値とする。

多孔質構造を有する不溶性担体の中でも、架橋共重合体
は、物理特性の面でも耐熱性を有することから、熱滅菌
を可能ならしめ、さらには合成高分子の特性である物理
的機械的強度に優れている。

−例を挙げると、ビニル系モノマーとビニル系またはア
リル系架橋剤との共重合により作ることができる。この
場合のビニル系モノマーとしては、酢酸ビニル、プロピ
オン酸ビニル等のカルボン酸のビニルエステル類、メチ
ルビニルエーテル、エチルビニルエーテル等のビニルエ
ーテル類、ビニレンカーボネート類を例示することがで
きる。

架橋剤としては、トリアリルイソシアヌレート、トリア
リルシアヌレート等のアリル化合物類、エチレングリコ
ールジメタアクリレート、ジエチレングリコールジメタ
アクリレート等のジ（メタ）アクリレート類、ブタンジ
オールジビニルエーテル、ジエチレングリコールジビニ
ルエーテル、テトラビニルグリオキザール等のポリビニ
ルエーテル類、ジアリリデンペンタエリスリット、テト
ラアリロキシエタンのようなポリアリルエーテル類、グ
リシジルメタクリレート等のグリシジルアクリレート類
を用いることができる。また、必要に応じて、他のコモ
ノマーを共重合したものも用いることができる。

ビニル系共重合体の場合には、カルボン酸のビニルエス
テルとイソシアヌレート環を有するビニル化合物（アリ
ル化合物）を共重合し、共重合体を加水分解して得られ
るポリビニルアルコールのトリアリルイソシアヌレート
架橋体が、強度、化学的安定性、耐熱安定性の面で良好
な担体を与える。

以上、ビニル系共重合体の場合を例示したが、本発明は
、これに限定されるものではない。

ピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン誘導体を、不溶性担
体の表面に固定する方法としては、共有結合、イオン結
合、物理吸着等あらゆる公知の方法を用いることができ
るが、溶出性から考えると、共有結合で固定して用いる
ことが望ましい。そのためには通常固定化酵素、アフィ
ニティク口マトグラフィで用いられる方法を用いること
ができる。

例えば、臭化水素（ＣＮＢｒ　）でアガロース、セファ
ロース等を活性化し、あるいはシリカガラスピーズをγ
−アミノプロピルトリエトキシシランと反応させてアル
キルアミノガラスを得、これをグルタルアルデヒドで活
性化し、結合させる等の方法を用いることができる。ま
た、必要に応じて、不溶性担体との間に任意の長さの分
子（スペーサー）を導入して使用することもできる。例
えば、アガロースのヒドロキシル基とへキサメチレンジ
イソシアナートの片側のイソシアナート基を反応結合さ
せ、残ったイソシアナート基とピラゾロ（３，４−ｄ）
ピリミジン誘導体のアミノ基を反応結合させる如〈実施
することができる。

本発明で不溶性担体に結合させるピラゾロ（３，４−ｄ
）ピリミジン誘導体の量は、不溶性担体の比表面積１．
（あたり０．０５　ｐ　ｎｏ　ｌないしは５００１１　
ＩＩＩｏ　ｊ！の範囲であり、より好ましくは０．５μ
ｌｌｌ０！ないしは５０μＩＩＩｏｌの範囲である。

比表面積とは、乾燥架橋共重合体単位重量あたりに吸着
した窒素ガスが占有する表面でもって表示したものであ
る。

本発明の比表面積の測定は、最も一般的な窒素ガスによ
るベント法（ＢＥＴ法）で求めた。

以上の要素よりなる本発明の刺激剤の製造法は、その構
成要素の結合順序を規定したものではない。

具体的には、ピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン誘導体
の導入法において、これらをモノマーに結合して重合を
行う方法や、これらを活性化後、不溶性担体に結合させ
ることも可能である。すなわち、本発明は、基本的には
不溶性担体の表面にピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン
誘導体の１種以上を有すればよいのであり、製造方法に
左右されるものではない。

刺激材による白血球の活性化は、血清成分含有培地で行
うと強力な腫瘍障害性細胞の誘導が可能である。すなわ
ち、牛胎児血清、生血清、馬血清等の動物血清あるいは
ヒト血清を２〜２０％含有した培地を調製する。この場
合の培地は、動物細胞培養に一般的に用いられる培地、
例えば、ＲＰＭｌ　　１６４０培地、ＭＥＭ培地等が使
用できる。また、血清成分、例えば、血清アルブミンを
添加したＲＰＭ１１６４０培地でも使用が可能である。

また・誘導期間中にインタリューキン２を添加しても、
より強力な腫瘍障害性細胞を誘導できる。

調製した培地中に、種々の方法で採取した白血球を０．
５〜３×１０６個／ｌＩＩβの細胞濃度で浮遊させ、こ
れに適当量の刺激材を添加し、温度２５〜４５℃で培養
を行う。温度２５℃以下ではほとんど有効な白血球の活
性化が起こらず、温度４５℃以上では白血球の生存率が
低下する。培養は市販の細胞培養用のプラスチック製容
器を使用し、ＣＯ２インキュベーター中で行えば簡便で
ある。培養数時間で白血球は刺激材に付着し活性化され
る。

このようにして活性化した白血球は、強力な腫瘍障害細
胞と抗腫瘍ヘルパーＴ細胞を含有することを見出した。

すなわち、刺激材で活性化したヒト末梢血白血球をヒト
腫瘍細胞に作用させたところ、ＭＫＮ−１胃癌細胞、Ｐ
（、−１０肺癌細胞を強く障害し、この活性化白血球を
ヒト腫瘍細胞（ＭＫＮ−１胃癌細胞）と活性化してない
ヒト白血球を混合した系に加えることにより、腫瘍細胞
に対する障害能が増強した。また、刺激材で活性化した
Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス肺臓の白血球は、Ｃｏ１
ｏｎ　２６（ＢＡＬＢ／ｃ由来腫瘍細胞）に対して、強
力な腫瘍障害活性と抗腫瘍ヘルパーＴ細胞活性を有して
いた。

（発明の効果） 本発明の刺激材は、以上述べてきたように、患者白血球
を効率よく活性化し、安全にかつ操作性よく、強力な腫
瘍障害性細胞および抗腫瘍ヘルパーＴ細胞を誘導するも
のであり、胃癌、肺癌、乳癌、肝癌等の癌治療はもとよ
り、胆癌患者のリンパ球機能検査や、マウス、ラット、
ウサギ等の動物実験において、抗腫瘍免疫の研究等に用
いようとするものである。

（実施例） 実施例１ 刺激材の調製は、次のようにして行った。すなワチ、ポ
リビニルアルコール系ゲル（ポリビニルアルコールとト
リアリルイソシアナートの共重合体：粒径１４０〜２１
０μｍ）をエビクロロヒドリン法（アフィニティクロマ
トグラフィー、千畑一部署。

講談社すイエンティフィク、　１９７６年、　　Ｐ７１
）によって、エポキシ活性化ゲルとし、これに各種ピラ
ゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン誘導体の５％水酸化カリ
ウム溶液を添加し、５０℃にて２４時間振盪して結合せ
しめ、ｐＨ４，０，１Ｍ酢酸バッファー、ｐＨ８，５炭
酸ナトリウムバツフアーで繰り返し洗浄後、生理食塩水
で洗浄、オートクレーブ滅菌して実験に供した。不溶性
担体のピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン誘導体保持量
は、初めに添加した量より、結合反応後の上滑中の量を
さし引いて結合量を求め計算したところ、不溶性担体１
ｍｌあたり２０μｍｏｆないし２００μｆｆ１ｏ！！で
あった。この不溶性担体の比表面積は、１ｍｌあたり２
０％であるため、比表面積あたりの保持量は１μｍｏβ
ないし１０μｍｏｘに相当する。

ヒト白血球は次のようにして得た。すなわち、採血した
ヒト末梢血をハンクス液で２倍希釈し、フィコールバー
ク液（ファルマシア社製）に重層し、２０００ｒｐｍで
２０分間遠心分離した後、中間層の白血球層を分離して
、これをハンクス液で洗った後、自己血清を１０％添加
したＲＰＭ１１６４０培地にフスイ）に２×１０１１／
ｌｌｌ１の細胞濃度で浮遊させた。この細胞浮遊液を１
ｍＡずつ、細胞培養用の２ＩＩＩｌウエル（フアシヨン
１ｍ　３０４７　）に分注し、これに刺激材を１００μ
ｌずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター中で温度３７℃
で培養を行った。６０時間培養を行った後、培養液をピ
ペッティングして活性化白血球を刺激材表面からはがし
て静置すると、刺激材は容器の底に沈下するので、上清
細胞液を取り、これをハンクス液で洗った後、自己血清
１０％添加ＲＰＭｒ１６４０培地に５　Ｘｌ０６／　ｍ
６の細胞濃度で浮遊させた。

この活性化白血球が腫瘍細胞障害性ををするかどうかは
、次のようなキラー活性測定法を用いて評価した。培養
プレートに付着して増殖する種々のヒト癌細胞株を標的
細胞として、５　ＸＩＯ’　／　ｍｚの細胞濃度で１０
％牛脂児血清添加ＲＰＭ１１６４０培地に浮遊させ、こ
れを１０μβずつ１０μ！容テラサキプレートに分注し
、ＣＯ２インキュベーター中で温度３７℃で培養する。

２４時間培養を行うと、癌細胞は培養プレート底面に強
く付着する。これを培養液で洗った後、活性化白血球浮
遊液１０μβを添加し、３７℃で４時間、ＣＯ２インキ
ュベーター中で培養し、プレートに付着している癌細胞
を障害させる。障害を受けた癌細胞は、プレート底面へ
の付着性を喪失し、ハンクス液で洗うと活性化白血球と
ともに除去される。生残してプレート底面に付着してい
る癌細胞をアセトンで固定し、ギムザ液で染色した後、
顕微鏡で計数する。キラー活性は次式により計算する。

抗腫瘍ヘルパー活性の測定については、活性化白血球に
よる、活性化していない白血球の腫瘍細胞に対する障害
能の増強効果を観察することにより行った。

すなわち、次のような測定法を用いて評価した。

付着性のヒト癌細胞株を標的細胞として、１×１０５７
ｍ１！の細胞濃度で１０％牛脂児血清添加ＲＰＭ１１６
４０培地に浮遊させ、これを１００μβずつ、９６穴培
養プレート（コーニング社製、ＣＥＬＬ畦ＬＬＳＴ１４
２５８６０）に分注し、ＣＯ□インキュベーター中で温
度３７℃で３時間培養する。これに、２　ＸＩＯ’　／
　ｍβの細胞濃度で１０％牛脂児血清添加ＲＰ　Ｍ　Ｉ
　１６４０培地に浮遊させたヒト白血球を５０μβずつ
添加する系と添加しない系を設けて、３時間、３７℃、
５％Ｃ（ｈ条件下で培養後、ｌＸｌ０’ないし１×１０
６１５０μｌの細胞濃度で１０％牛脂児血清添加ＲＰＭ
１１６４０培地に浮遊させたヒト活性化白血球を、上記
の系にそれぞれ添加して、さらに、ＣＯ□インキュヘー
ター中で温度３７℃で６０時間培養する。培養中に、障
害を受けた癌細胞は、プレート底面への付着性を喪失す
る。そのため、キラー活性測定法と同様に、白血球細胞
をハンクス液で洗浄後、生残してプレート底面に付着し
ている癌細胞をアセトンで固定し、ギムザ液で染色した
後、生残癌細胞の有無を検鏡した。

このようにして評価した各種刺激材の抗腫瘍免疫細胞誘
導能を表１および表２に示す。

表２　各利棟１檄材の抗腫瘍ヘルパーＴ博抱沃導能比較
例１ 実施例１の刺激材の調製に用いた不溶性担体（ポリビニ
ルアルコール系ゲル）の抗腫瘍免疫細胞誘導能を、実施
例１と全く同様の方法で評価したが、腫瘍障害性細胞、
抗腫瘍ヘルパー細胞ともに誘導されなかった。

比較例２ １０％牛脂児血清添加ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地に、
２ｍＭの各種ピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン誘導体
を溶解し、これらの培地１ｍｌにヒト末梢血白血球２Ｘ
１０６個を浮遊させて、６０時間培養したが、腫瘍障害
性細胞、抗腫瘍ヘルパー細胞ともに誘導されなかった。

実施例２ 刺激材の調製は、次のようにして行った。１２０／２０
０メソシユ（７５〜１２５ミクロン）の種々の孔径から
なる多孔質ガラスピーズ、ＣＰＧ−１０（フナコシ薬品
株式会社製）を３−グリシドキシプロビルトリメトキシ
シランと反応させて、多孔質ガラスピーズに環状エポキ
シ基を導入し、これに４−アミノビラゾロ（３，４−ｄ
）ピリミジンの０．１Ｍ炭酸緩衝溶液（ｐＨ９，０）を
添加し、５０℃で２４時間振盪して結合させ、実施例１
と同様に洗浄後、オートクレーブ滅菌して実験に供した
。保持量も実施例１と同様の方法で求めたところ、多孔
質ガラスピーズ１ｇあたり１０μｍｏｌないし７０μｍ
ｏｂであった。これら多孔質ガラスピーズの比表面積は
、１ｇあたり２０〜１４０Ｍであるため、比表面積あた
りの保持量は約０．５μｔｅ＋ｏｌに相当する。

マウス白血球は次のようにした。すなわち、Ｂ　Ａ　Ｌ
　Ｂ　／　ｃマウス（４〜６週令）から摘出した肺臓を
ステンレス・メソシュでほぐした後、ハンクス液に浮遊
して静置、肺臓細胞を臓器片と分離後、８００ｒｐｍで
１０分間遠心分離して得た細胞ペレットを赤血球除去の
ため、０．８５％塩化アンモニウム水溶液に懸濁させ、
温度３７℃で２分間インキュベートシた後、直ちに１０
倍量のハンクス液と混合、８００ｒｐｍで１０分間遠心
分離して、牛胎児血清を１０％添加したＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ
　１６４０培地にッスイ）に５Ｘ１０６／ｍｌの細胞濃
度で浮遊させた。この細胞浮遊液を２ｍｌずつ細胞培養
用の２ｍｌウェル（ファルコンｍ　３０４７）に分注し
、これに刺激材を０．５ｇずつ添加し、ＣＯ２インキュ
ベーター中で温度３７℃で培養した。３日間の培養を行
った後、培養液をピペッティングして活性化白血球を刺
激材表面からはがして静置すると、刺激材は容器の底に
沈下するので、上清細胞液を取り、これをハンクス液で
洗った後、牛胎児血清１０％添加ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４
０培地にＩ　Ｘｌ０７７　ｍｌｌの細胞濃度で浮遊させ
た。

この活性化白血球が腫瘍細胞障害性および抗腫瘍ヘルパ
ー活性を有するかどうかは、マウス癌細胞株Ｃｏ１ｏｎ
２６を標的細胞として、実施例１と同様の測定法で評価
した。

各種刺激材の抗腫瘍免疫細胞誘導能を表３と表４に示す
。

表４　　！ｌ檄材の坑腫扁ヘルパーＴｗｖＡル乱能比較
例３ １０％牛脂児血清添加ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地２ｍ
ｉに、実施例２と同様の方法で得たＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／
　ｃマウス白血球１×１０７個を浮遊させ、これに各種
孔径（１２０人、　３５０人、　７００人、１４００人
）の多了し質ガラスピーズ、ＣＰＧ−１０（フナコシ薬
品株式会社製、粒径は７５〜１２５ミクロン）を０．５
　ｇずつ添加し、３日間培養したマウス白血球のＣｏ１
ｏｎ　２６に対するキラー活性は、いずれも１０％以下
であり、抗腫瘍ヘルパー活性も見出されなかった。なお
、キラー活性および抗腫瘍ヘルパー活性の測定は、実施
例２と同様の方法で行った。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンおよびその誘
   導体の少なくとも１種を不溶性担体の表面に結合させた
   ことを特徴とする抗腫瘍免疫細胞誘導用刺激材。
2. （２）不溶性担体の表面が多孔質構造を有する特許請求
   の範囲第１項記載の刺激材。