JPH05345022A

JPH05345022A - 生理活性物質固定化担体とその製法

Info

Publication number: JPH05345022A
Application number: JP4157816A
Authority: JP
Inventors: Kazunori Inamori; 和紀稲森; Masahiro Seko; 政弘世古; Hideyuki Yokota; 英之横田; Masakazu Tanaka; 昌和田中
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1992-06-17
Filing date: 1992-06-17
Publication date: 1993-12-27

Abstract

(57)【要約】【目的】生理活性を有するタンパク質あるいはペプ
チドの活性を失活させたり変性させたりすることのない
水不溶性担体への固定化方法および生理活性物質固定化
担体を提供する。【構成】タンパク質系の生理活性物質を、両末端に
ジグリシジルエーテルを有する親水性スペーサーを用い
て、エポキシ反応により水不溶性担体に導入することを
特徴とする生理活性物質の固定化方法および生理活性物
質固定化担体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は生理活性を有するタンパ
ク質またはペプチドの水不溶性担体への固定化方法およ
び生理活性物質固定化担体に関するものであり、両末端
にジグリシジルエーテルを有する親水性スペーサーを介
することを特徴とするものである。

【０００２】この方法はそのリガンドの有する生理活性
の失活あるいは変性を生ずることの少ない効果的な固定
化方法である。特定の物質を吸着除去することを目的と
した吸着材、特定の化学反応を利用したバイオセンサー
やエンザイムイムノアッセイによる物質の定量、あるい
は連続的に特定の化学反応を行なわせるバイオリアクタ
ーなど実に広範囲な領域において応用が可能なものであ
る。

【０００３】

【従来の技術】酵素，抗体，ホルモン，レクチンなど生
理活性を有する種々のタンパク質やペプチドを担体に、
場合によってはスペーサーを介して固定化を行なう試み
については、特に酵素に関して古くから多くの報告例が
ある。その大部分はタンパク質を構成しているアミノ酸
残基の官能基における反応に方法ものである。たとえば
リジンのε−アミノ基，Ｎ末端のアミノ基，システイン
のスルフィドリル基，アスパラギン酸のβ−カルボキシ
ル基，グルタミン酸のγ−カルボキシル基，Ｃ末端のカ
ルボキシル基，チロシンのフェノール性水酸基，セリン
あるいはトレオニンの水酸基，アルギニンのグアニジノ
基，ヒスチジンのイミダゾリル基，トリプトファンのイ
ンドリル基，メチオニンのメチルメルカプト基などであ
る。特に水酸基，カルボキシル基，アミノ基の含量は多
い。この場合、活性中心部位を形成しているアミノ酸残
基を修飾あるいは変性させる可能性があり、それに伴い
活性を低下あるいは失活させる場合が多い。

【０００４】また一般にこうしたタンパク質系の生理活
性物質は、通常の化学合成において頻繁に用いられる
熱，酸，アルカリ，有機溶媒などの作用により変性を受
けやすい。したがってリガンドである生理活性物質が固
定化前と同等にできる限り近い物理的あるいは化学的性
質を保持できるようにするには、固定化反応条件におい
て様々な面で制約が多くなる。

【０００５】また固定化されたリガンドが種々の塩濃度
や広いｐＨ範囲においてもしっかりと固定化されリガン
ドの漏出が起らないことや、固定化されたリガンドが目
的とする物質と強固に結合できることなどが条件とな
る。種々の生理活性物質の固定化方法を原理的に大別す
ると担体結合法，架橋法，包括法の３種類である。これ
らの方法はそれぞれ長所，短所を有しており、リガンド
の種類や目的に応じて使い分けられている。

【０００６】タンパク質には反応性の強いアミノ酸残基
やイオン性のアミノ酸残基、疎水的な部分を含んでい
る。これらのうちで生理活性の発現に可能な限り悪影響
を与えない部分の特に水酸基，カルボキシル基，アミノ
基を選択して、担体に共有結合，イオン結合，疎水結
合，生化学的特異結合などを介して固定化するものが担
体結合法である。共有結合による固定化には臭化シアン
による活性化、カルボン酸のアジド誘導体化、カルボジ
イミド試薬やＷｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋなどによる縮合反
応、ジアゾカップリング反応、グルタルアルデヒドのよ
うな２つ以上の反応性に富む官能基を有する化合物によ
り架橋する方法などがある。これらの方法は結合が強固
であり、安定性を増す場合があるなどの長所があるが、
タンパク質の変性の恐れや、目的物質との相互作用が起
りにくくなる場合があるなどの短所がある。

【０００７】特開昭５８ー５３７５７にはさらに炭水化
物部位を酸化切断し、アルデヒド基を有する抗体と側鎖
にアミノ基またはヒドラジド基を有する担体とが、−Ｃ
Ｈ₂−ＮＨ−または−ＣＨ₂−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−の構造
を介して固定化する方法が記載されている。しかしこの
方法においても、担体と抗体の結合が直接的であるた
め、抗体の機能を十分に保持し固定化することが困難で
ある。また他のタンパク質の非特異的吸着を防止できな
い。

【０００８】またイオン結合による固定化は操作の簡便
さや再生の可能な点が有利であるが、反応液に用いる緩
衝液の種類，ｐＨ，イオン強度，温度などの影響を受け
やすい。物理的吸着による固定化では結合が一般に弱い
ことが多い。

【０００９】架橋法はグルタルアルデヒド，トルエンジ
イソシアナート，ヘキサメチレンジイソシアナート，シ
アヌルクロリドなどの２つ以上の官能基を有する試薬と
リガンドを反応させて分子間で架橋させて巨大分子とす
る方法である。この方法は微生物菌体の固定化にはしば
しば用いられるが、タンパク質系の生理活性物質の固定
化にはあまり有効なものではない。

【００１０】包括法は高分子ゲル内にリガンドを閉じ込
める方法である。これにはタンパク質や多糖類のような
天然高分子あるいは種々の合成高分子のゲルの内部にリ
ガンドを閉じ込める格子型，半透膜性の高分子被膜によ
りリガンドを包み込むマイクロカプセル型，リン脂質の
ような液体膜にリガンドを包み込むリポソーム型などが
ある。また中空子膜内や限外濾過膜で仕切られた空間中
にリガンドを閉じ込める方法もある。これらの方法は固
定化によりリガンドの修飾が起りにくく、自然な状態を
保ったままで固定化が可能である長所があるが、高分子
量の物質の作用を受けにくいことや条件により失活が起
こるなどの欠点がある。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の従来技
術における種々の欠点を解決し、生理活性を有するタン
パク質あるいはペプチドを効率よく、しかもその生理活
性を低下させたり変性させたりする可能性をできる限り
小さくした生理活性物質の固定化方法を提供しようとす
るものである。また本発明における固定化技術は極めて
広範囲な分野において適用されうるものである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成した本発
明は生理活性を有するタンパク質あるいはペプチドをジ
グリシジルエーテルを両末端に有する親水性スペーサー
を介して水不溶性担体ヘのエポキシ反応による固定化方
法およびそれにより得られる生理活性物質固定化担体を
要旨とするものである。本発明は酵素，抗体，ホルモン
などの種類を特に問わず広範囲なタンパク質系物質への
適用が可能である。

【００１３】また水不溶性担体としては、エポキシ基と
反応性のあるたとえばチオール基，アミノ基，ヒドロキ
シル基，カルボキシル基，ヒドラジド基，フェノール基
のような求核性の官能基を有しているか、あるいは修飾
することによりこれらの官能基が導入されており、しか
もその目的に応じたゲル強度，粒子径，細孔径などの特
徴を有していれば特に限定されるものではないが、たと
えばセルロース，架橋ポリアクリル酸，ポリビニルアル
コール，ポリスチレンおよびその誘導体などが挙げられ
る。担体の形態に関しても特に限定されるものではな
く、その用途や目的に応じてビーズ状，繊維状，膜状
（中空糸膜を含む）などいずれにおいても適用できるも
のである。これらの担体に親水性スペーサーとして化１
に示すような両末端にジグリシジルエーテルを有するポ
リ（オキシエチレン）（以下ＰＥＯエポキシと言う）を
結合させたものに、さらに上記のような生理活性物質を
リガンドとして導入する。

【００１４】

【化１】

【００１５】担体における求核性官能基の含量はある程
度多い方がリガンド導入率の向上に結びつくが、あまり
多過ぎるとゲル強度が低下するので適当ではない。した
がってサクションドライ状態で０．０１ないし０．８０
ｍｅｑ／ｇの範囲になるように導入するのが望ましく、
リガンドや目的物質の大きさに応じてその値を調整する
必要がある。

【００１６】親水性スペーサーの鎖長についてもリガン
ドに結合させる目的物質の大きさや性質に応じて適当に
調整する必要があるが、分子量が２００ないし２０００
０の範囲、好ましくは１０００ないし１５０００、さら
に好ましくは５０００ないし１３０００の両末端にジグ
リシジルエーテルを有するＰＥＯエポキシを用いるのが
適している。親水性スペーサーを導入することにより立
体障害が小さくなり、目的物質との結合性を大きく向上
させることができる。さらに親水性スペーサーの排除体
積効果および親水性の向上により、非特異的な吸着を抑
えることができる。

【００１７】エポキシ基に対する反応性は−ＳＨ＞−Ｎ
Ｈ（−ＮＨ₂）＞−ＯＨの順であり、脂肪酸のヒドロキ
シル基を結合させるときにはｐＨ１１ないし１３の強い
アルカリ性の条件を必要とするが、第一級アミノ基，チ
オール基となるにしたがってそれほどの強アルカリ性条
件である必要性はなくｐＨ９ないし１１での反応が可能
である。したがってアルカリ性条件下で安定な物質の固
定化に有利な方法である。

【００１８】シッフ塩基反応による固定化反応ではリガ
ンドを導入した後に還元反応を行なう必要があり、リガ
ンドの活性を低下させやすくなる。これに対し本発明で
はリガンドを導入後に別な反応を与える必要がない点は
有利である。またシアン化臭素（ＣＮＢｒ）法のように
有毒物質を用いることがなくでないのも安全性の点で有
利である。

【００１９】本発明における水不溶性担体に、ＰＥＯエ
ポキシを介して生理活性を有するタンパク質あるいはペ
プチドをリガンドとして導入するには、上記のような方
法を基本とすれば特に限定されるのもではないが、たと
えばセルロースを担体として抗体を導入する場合には、
以下の方法が好ましい。

【００２０】（１）セルロースの改質平均粒子径が２０ないし２０００μｍ、平均細孔径が２
００ないし３００００Åの粒状多孔質セルロースに、１
規定ないし２規定の水酸化ナトリウム水溶液を加えた後
エピクロルヒドリンをを添加し、２０℃から５０℃好ま
しくは３０℃から４０℃で２時間から６時間好ましくは
４時間から５時間反応させる。上記粒状多孔質セルロー
スのアルカリ水溶液への浴比は１０容量％から３０容量
％好ましくは１５容量％から２５容量％である。上記反
応物を回収し十分に洗浄して、０．１０ないし０．９５
ｍｅｑ／ｇのエポキシ基を有する［エポキシ化セルロー
ス］を得る。

【００２１】上記［エポキシ化セルロース］に２０ない
し３０％のアンモニア水溶液を加えて、２０℃から５０
℃好ましくは３０℃から４０℃で１時間から５時間好ま
しくは２時間から４時間反応させる。上記粒状［エポキ
シ化セルロース］のアルカリ水溶液への浴比は１０容量
％から３０容量％好ましくは１５容量％から２５容量％
である。上記反応物を回収し十分に洗浄して、０．０１
ないし０．８０ｍｅｑ／ｇのアミノ基を有する［アミノ
化セルロース］を得る。

【００２２】（２）親水性スペーサーの導入化１に示したような分子量が２００ないし２００００、
好ましくは１０００ないし１５０００のＰＥＯエポキシ
を、ｐＨ９ないし１２の好ましくはｐＨ１０ないし１１
の炭酸緩衝液に溶解しておく。これに上記（１）で得た
［アミノ化セルロース］をを添加して攪拌しながら１０
℃から５０℃好ましくは２０℃から３０℃で、１０時間
から３０時間好ましくは１５時間から２５時間反応させ
る。上記ＰＥＯエポキシの濃度は０．２重量％から５．
０重量％好ましくは０．４重量％から３．０重量％で、
この溶液への［アミノ化セルロース］の浴比は３容量％
から２０容量％好ましくは５容量％から１５容量％であ
る。この反応混合物を濾過して生成物を回収、水洗して
［ＰＥＯエポキシ］−［セルロース］を得る。

【００２３】（３）抗体の導入ウサギにヒトアルブミン（以下ｈＡｌｂと言う）を免疫
して得られた抗血清を、硫安塩析により精製して得た抗
ｈＡｌｂ抗体１０ないし２０ｍｇを、ｐＨ９ないし１０
の炭酸緩衝液に溶解して、上記（２）で得た［ＰＥＯエ
ポキシ］−［セルロース］３ないし５ｇ（膨潤状態）を
添加し、５℃で２０時間ないし３０時間反応させてシッ
フ塩基を形成させる。この反応混合物を濾過して生成物
を回収し、十分に洗浄して、膨潤状態でｐＨ９．０の炭
酸緩衝液を加え、さらに水素化ホウ素ナトリウムを０．
２ないし１ｇ添加して５℃で５時間ないし２０時間攪拌
により還元反応を行なった。この反応混合物を濾過して
生成物を回収し、十分に洗浄することにより、抗ｈＡｌ
ｂ抗体をＰＥＯエポキシをスペーサーに介してセルロー
スに固定化したものを得る。

【００２４】

【実施例】以下実施例を用いて本発明を説明する。＜実施例１＞プロテアーゼの固定化Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来であり、その培養液をゲル濾
過、アニオンおよびカチオン交換カラムにより精製して
凍結乾燥して得られたプロテアーゼのセルロースへの固
定化を次のようにして実施した。

【００２５】多孔質セルロース（チッソ製セルロファイ
ンＧＣＬ−１０００ｍ）１５ｇに１規定水酸化ナトリウ
ム水溶液１００ｍｌおよびエピクロルヒドリン２５ｍｌ
を加えて、攪拌により２０時間反応させた後、反応混合
物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して［エポキ
シ化セルロース］を得た。エポキシ含量はチオ硫酸ナト
リウムを用いた酸滴定により定量を行ない、０．８７ｍ
ｅｑ／ｇであった。

【００２６】上記［エポキシ化セルロース］に２８％ア
ンモニア水溶液１００ｍｌを加えて室温で５時間攪拌に
より反応させた。上記反応物を回収し十分に洗浄して
［アミノ化セルロース］を得た。アミノ基含量は塩酸に
よる電位差滴定（平沼産業製ＣＯＭＴＩＴＥ１０１を使
用）により定量を行ない、０．６８ｍｅｑ／ｇであっ
た。

【００２７】分子量５０００のＰＥＯエポキシ５０ｇを
ｐＨ１０の炭酸緩衝液に溶解しておく。これを上記［ア
ミノ化セルロース］に添加して攪拌しながら室温で２５
時間攪拌により反応させた。この反応混合物を濾過して
生成物を回収、水洗して［ＰＥＯエポキシ］−［セルロ
ース］を得た。エポキシ含量は先と同様にして定量を行
ない、０．５５ｍｅｑ／ｇであった。

【００２８】上記プロテアーゼを５０ｍｇをｐＨ１０の
炭酸緩衝液に溶解しておく。これを上記［ＰＥＯエポキ
シ］−［セルロース］に添加して攪拌しながら室温で２
５時間攪拌により反応させた。この反応混合物を濾過し
て生成物を回収、水洗して固定化プロテアーゼを得た。
固定化反応の残液にトリクロロ酢酸（以下ＴＣＡとい
う）溶液でタンパク質成分を沈殿させた後に遠心分離し
て上清を除去し、０．１規定水酸化ナトリウム溶液に再
溶解させて、ＢＣＡタンパク質定量用試薬（ピアス社
製）を用いてタンパク質量を定量することにより残存率
を求め（以下ＴＣＡ−ＢＣＡ法という）、固定化量を算
出し２２．３ｍｇが固定化されていた。

【００２９】酵素活性の定量は０．１％濃度のカゼイン
のグリシン緩衝液（ｐＨ１０）溶液中にて、上記固定化
プロテアーゼを固定化量が１０ｍｇに相当するように懸
濁して３０℃で３０分間反応をさせた後、３０％ＴＣＡ
溶液を加えて沈殿させ、その濾液中のタンパク質量を２
８０ｎｍの吸光度測定により定量して行なった。結果は
表１に示す通りである。なお固定化していない遊離状態
のインベルターゼ１０ｍｇにおける同様の実験結果にお
けるプロテアーゼ活性を１００として表示した。

【００３０】

【表１】

【００３１】＜実施例２＞抗ｍＩｇＧ（マウス免疫グ
ロブリン）抗体の固定化ｍＩｇＧ（カッペル社製）を免疫したウサギ抗血清を硫
安塩析により精製して得た抗ｍＩｇＧ抗体のセルロース
への固定化を次のようにして実施した。

【００３２】多孔質セルロース（チッソ製セルロファイ
ンＧＣＬ−１０００ｍ）１５ｇに１規定水酸化ナトリウ
ム水溶液１００ｍｌおよびエピクロルヒドリン２５ｍｌ
を加えて、攪拌により３０時間反応させた後、反応混合
物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して［エポキ
シ化セルロース］を得た。エポキシ含量は実施例１と同
様にして求め、０．９２ｍｅｑ／ｇであった。

【００３３】上記［エポキシ化セルロース］に２８％ア
ンモニア水溶液１００ｍｌを加えて室温で５時間攪拌に
より反応させた。上記反応物を回収し十分に洗浄して
［アミノ化セルロース］を得た。アミノ基含量は実施例
１と同様にして定量を行ない、０．７４ｍｅｑ／ｇであ
った。

【００３４】分子量２０００のＰＥＯエポキシ５０ｇを
ｐＨ１０の炭酸緩衝液に溶解しておく。これを上記［ア
ミノ化セルロース］に添加して攪拌しながら室温で２５
時間攪拌により反応させた。この反応混合物を濾過して
生成物を回収、水洗して［ＰＥＯエポキシ］−［セルロ
ース］を得た。エポキシ含量は実施例１と同様にして定
量を行ない、０．６３ｍｅｑ／ｇであった。

【００３５】上記抗ｍＩｇＧ抗体５０ｍｇをｐＨ１１の
炭酸緩衝液に溶解しておく。これを上記［ＰＥＯエポキ
シ］−［セルロース］に添加して攪拌しながら１０℃で
４０時間攪拌により反応させた。この反応混合物を濾過
して生成物を回収、水洗して固定化抗体を得た。実施例
１と同様にして固定化反応の残液中のタンパク質量をＴ
ＣＡ−ＢＣＡ法により残存率を求め、固定化量を算出し
２１．２ｍｇが固定化されていた。

【００３６】上記抗体を固定化したセルロースゲル１ｍ
ｌをオープンカラム管に充填して、抗原であるｍＩｇＧ
をｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸緩衝液に０．２％濃度で
溶解して１０ｍｌをカラムに供した。カラム通過液の抗
体濃度をＴＣＡ−ＢＣＡ法により定量して、吸着しなか
ったｍＩｇＧ量からカラムへの吸着率を算出した。結果
は表２に示す通りである。

【００３７】

【表２】

【００３８】＜実施例３＞抗ｈＬＤＬ（ヒト低比重リ
ポタンパク質）抗体の固定化ｈＬＤＬ（ケミコン社製）を免疫したウサギ抗血清を硫
安塩析により精製して得た抗ｈＬＤＬ抗体のセルロース
への固定化を次のようにして実施した。

【００３９】多孔質セルロース（チッソ製セルロファイ
ンＣＰＣｍ）１５ｇに１規定水酸化ナトリウム水溶液１
００ｍｌおよびエピクロルヒドリン２５ｍｌを加えて、
攪拌により３０時間反応させた後、反応混合物を濾過し
て生成物を回収し、十分に洗浄して［エポキシ化セルロ
ース］を得た。エポキシ含量は実施例１と同様にして求
め、０．９３ｍｅｑ／ｇであった。

【００４０】上記［エポキシ化セルロース］に２８％ア
ンモニア水溶液１００ｍｌを加えて室温で５時間攪拌に
より反応させた。上記反応物を回収し十分に洗浄して
［アミノ化セルロース］を得た。アミノ基含量は実施例
１と同様にして定量を行ない、０．７６ｍｅｑ／ｇであ
った。

【００４１】分子量６０００のＰＥＯエポキシ５０ｇを
ｐＨ１０の炭酸緩衝液に溶解しておく。これを上記［ア
ミノ化セルロース］に添加して攪拌しながら室温で２５
時間攪拌により反応させた。この反応混合物を濾過して
生成物を回収、水洗して［ＰＥＯエポキシ］−［セルロ
ース］を得た。エポキシ含量は実施例１と同様にして定
量を行ない、０．６４ｍｅｑ／ｇであった。

【００４２】上記抗ｈＬＤＬ抗体５０ｍｇをｐＨ１１の
炭酸緩衝液に溶解しておく。これを上記［ＰＥＯエポキ
シ］−［セルロース］に添加して攪拌しながら１０℃で
４０時間攪拌により反応させた。この反応混合物を濾過
して生成物を回収、水洗して固定化抗体を得た。実施例
１と同様にして固定化反応の残液中のタンパク質量をＴ
ＣＡ−ＢＣＡ法により残存率を求め、固定化量を算出し
２２．６ｍｇが固定化されていた。

【００４３】上記抗体を固定化したセルロースゲル１ｍ
ｌをブタ血清（ＬＤＬ値１６１．２ｍｇ／ｍｌ）３ｍｌ
と２０ｍｌのバイヤル中で混合して、３０℃で３０分間
振盪することによりインキュベートして、遠心上清のＬ
ＤＬ値をβリポ蛋白Ｃテストーワコー（和光純薬工業
製）により定量した。得られた残存ＬＤＬ値からＬＤＬ
吸着率を算出した結果を表３に示す。

【００４４】

【表３】

【００４５】＜比較例１＞プロテアーゼの固定化分子量５０００の両末端にアミノ基を有するポリ（オキ
シエチレン）（以下ＰＥＯアミンという）２０ｇをｐＨ
９．５の炭酸緩衝液１００ｍｌに溶解して、実施例１と
同様にして調整した［エポキシ化セルロース］（エポキ
シ基含量は０．６９ｍｅｑ／ｇ）を加えて室温で３０時
間攪拌してシッフ塩基を形成させ、反応混合物を濾過し
て生成物を回収し十分に洗浄して、［ＰＥＯアミン］−
［セルロース］を得た。

【００４６】２５％グルタルアルデヒド溶液４ｍｌをｐ
Ｈ９．５の炭酸緩衝液１００ｍｌに溶解して、上記［Ｐ
ＥＯアミン］−［セルロース］を加え室温で３０時間攪
拌してアルデヒド基の導入反応を行なった。反応混合物
を濾過して生成物を回収し十分に洗浄を行なった。

【００４７】上記生成物にｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０
ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム５００ｍｇを加えて室温
で１８時間還元反応を行なった。反応混合物を濾過して
生成物を回収し、十分に洗浄して［ＰＥＯアルデヒド］
−［セルロース］を得た。アルデヒド含量はオキシム法
により行ない０．５０ｍｅｑ／ｇであった。

【００４８】実施例１におけるプロテアーゼ５０ｍｇを
ｐＨ１０．０の炭酸緩衝液１００ｍｌに溶解して、上記
［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］を加え、室温で
２５時間攪拌によりシッフ塩基反応を行なった。反応混
合物を濾過して生成物を回収し十分に洗浄を行なった。
上記生成物にｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素化
ホウ素ナトリウム５００ｍｇを加えて室温で１８時間還
元反応を行なった。反応混合物を濾過して生成物を回収
し、十分に洗浄して固定化プロテアーゼを得た。プロテ
アーゼ固定化量は実施例１と同様にして求め、２８．７
ｍｇが固定化されていた。酵素活性について実施例１と
同様にして行なった。結果は表１に示す通りである。

【００４９】＜比較例２＞抗ｍＩｇＧ抗体の固定化分子量２０００の両末端にアミノ基を有するポリ（オキ
シエチレン）（以下ＰＥＯアミンという）２０ｇをｐＨ
９．５の炭酸緩衝液１００ｍｌに溶解して、実施例２と
同様にして調整した［エポキシ化セルロース］（エポキ
シ基含量は０．６４ｍｅｑ／ｇ）を加えて室温で３０時
間攪拌してシッフ塩基を形成させ、反応混合物を濾過し
て生成物を回収し十分に洗浄して、［ＰＥＯアミン］−
［セルロース］を得た。

【００５０】比較例１と同様に、２５％グルタルアルデ
ヒド溶液４ｍｌをｐＨ９．５の炭酸緩衝液１００ｍｌに
溶解して、上記［ＰＥＯアミン］−［セルロース］を加
え室温で３０時間攪拌してアルデヒド基の導入反応を行
なった。反応混合物を濾過して生成物を回収し十分に洗
浄を行なった。

【００５１】比較例１と同様に、上記生成物にｐＨ９．
０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム５０
０ｍｇを加えて室温で１８時間還元反応を行なった。反
応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して
［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］を得た。アルデ
ヒド含量はオキシム法により行ない０．４８ｍｅｑ／ｇ
であった。

【００５２】実施例２における抗ｍＩｇＧ抗体５０ｍｇ
をｐＨ１０．０の炭酸緩衝液１００ｍｌに溶解して、上
記［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］を加え、室温
で２５時間攪拌によりシッフ塩基反応を行なった。反応
混合物を濾過して生成物を回収し十分に洗浄を行なっ
た。上記生成物にｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水
素化ホウ素ナトリウム５００ｍｇを加えて室温で１８時
間還元反応を行なった。反応混合物を濾過して生成物を
回収し、十分に洗浄して固定化抗体を得た。抗体の固定
化量は実施例１と同様にして求め、３１．３ｍｇが固定
化されていた。得られた担体の性能評価を実施例２と同
様にして行なった。結果は表２に示す通りである。

【００５３】＜比較例３＞抗ｈＬＤＬ抗体の固定化分子量６０００の両末端にアミノ基を有するポリ（オキ
シエチレン）（以下ＰＥＯアミンという）２０ｇをｐＨ
９．５の炭酸緩衝液１００ｍｌに溶解して、実施例２と
同様にして調整した［エポキシ化セルロース］（エポキ
シ基含量は０．６４ｍｅｑ／ｇ）を加えて室温で３０時
間攪拌してシッフ塩基を形成させ、反応混合物を濾過し
て生成物を回収し十分に洗浄して、［ＰＥＯアミン］−
［セルロース］を得た。

【００５４】比較例１と同様に、２５％グルタルアルデ
ヒド溶液４ｍｌをｐＨ９．５の炭酸緩衝液１００ｍｌに
溶解して、上記［ＰＥＯアミン］−［セルロース］を加
え１０℃で４０時間攪拌してアルデヒド基の導入反応を
行なった。反応混合物を濾過して生成物を回収し十分に
洗浄を行なった。

【００５５】比較例１と同様に、上記生成物にｐＨ９．
０の炭酸緩衝液１００ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム５
００ｍｇを加えて室温で１８時間還元反応を行なった。
反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して
［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］を得た。アルデ
ヒド含量はオキシム法により行ない０．４９ｍｅｑ／ｇ
であった。

【００５６】実施例３における抗ｈＬＤＬ抗体５０ｍｇ
をｐＨ９．５の炭酸緩衝液１００ｍｌに溶解して、上記
［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］を加え、１０℃
で４０時間攪拌によりシッフ塩基反応を行なった。反応
混合物を濾過して生成物を回収し十分に洗浄を行なっ
た。上記生成物にｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水
素化ホウ素ナトリウム５００ｍｇを加えて室温で１８時
間還元反応を行なった。反応混合物を濾過して生成物を
回収し、十分に洗浄して固定化抗体を得た。抗体の固定
化量は実施例１と同様にして求め、３２．６ｍｇが固定
化されていた。得られた担体の性能評価を実施例３と同
様にして行なった。結果は表３に示す通りである。

【００５７】＜比較例４＞抗ｈＬＤＬ抗体の固定化過ヨウ素酸ナトリウム４００ｍｇを１規定硫酸に溶解し
てＣＰＣｍ１０ｇに加え、室温で２０時間攪拌により反
応させて［アルデヒド］−［セルロース］を調製した。
アルデヒド含量はオキシム法により定量を行ない、０．
５０ｍｅｑ／ｇであった。

【００５８】一方実施例３における抗ｈＬＤＬ抗体５０
ｍｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液１００ｍｌに溶解して、
上記［アルデヒド］−［セルロース］を加えて１０℃で
４０時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応混合物
を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ９．０
の炭酸緩衝液１００ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム４０
０ｍｇを加えて室温で１８時間還元反応を行なった。反
応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して固
定化抗体を得た。抗体の固定化量は実施例３と同様にし
て求め、３７．６ｍｇが固定化されていた。実施例３と
同様にして、ブタ血清におけるＬＤＬ吸着率を求めた。
結果は表３に示す通りである。

【００５９】

【発明の効果】本発明により、種々の生理活性物質をそ
の活性を失活させたりあるいは変性させたりすることな
く水不溶性担体に固定化することが可能となり、固定化
前に近い活性を維持した生理活性物質固定化担体を提供
することが可能となった。本発明は吸着材，アフィニテ
ィクロマト用担体，バイオセンサー，エンザイムイムノ
アッセイ，バイオリアクターなどをはじめ広範囲な領域
において有用なものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者田中昌和滋賀県大津市堅田二丁目１番１号東洋紡績株式会社総合研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生理活性を有するタンパク質またはペプ
チドを、両末端にジグリシジルエーテルを有する親水性
スペーサーを介して、水不溶性担体に固定化したことを
特徴とする生理活性物質固定化担体。
【請求項２】生理活性を有するタンパク質またはペプ
チドを、両末端にジグリシジルエーテルを有する親水性
スペーサーを介して、水不溶性担体に固定化することを
特徴とする生理活性物質固定化担体の製法。
【請求項３】両末端にジグリシジルエーテルを有する
親水性スペーサーの分子量が２００ないし２００００で
ある請求項第２項記載の生理活性物質固定化担体の製
法。