JPH01181790A - 生理活性物質の固定化方法 - Google Patents
生理活性物質の固定化方法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は、生理活性物質の固定化方法に関し、詳しくは
、生理活性物質の無機担体上への固定化方法に関する。
、生理活性物質の無機担体上への固定化方法に関する。
〈従来技術〉
生理活性物質を無機担体上に固定化する方法としては、
単に物理的吸着により固定化する場合と比較して、より
安定な固定化方法である、米国特許第3652761号
、特開昭54−73185号、特開昭60−23209
0号による方法゛が知られている。すなわち、3−アミ
ノプロピルトリエトキシシランや、N −(2−アミノ
エチル)−3−アミノプロピルトリメトキシシランを用
いて、無機担体を表面処理し。
単に物理的吸着により固定化する場合と比較して、より
安定な固定化方法である、米国特許第3652761号
、特開昭54−73185号、特開昭60−23209
0号による方法゛が知られている。すなわち、3−アミ
ノプロピルトリエトキシシランや、N −(2−アミノ
エチル)−3−アミノプロピルトリメトキシシランを用
いて、無機担体を表面処理し。
次いでアミノ基を手がかりにして、常法により、生理活
性物質を固定化する方法である。
性物質を固定化する方法である。
〈発明が解決しようとする課題〉
生理活性物質が、その活性を発現するためには、活性中
心をとりまく特定の高次構造を保持することが必要であ
る。
心をとりまく特定の高次構造を保持することが必要であ
る。
生理活性物質を固定化して利用する場合には、固定化に
よって、その高次構造が変化し、活性の低下をおこすこ
とが多く、その点においては、上記米国特許第3652
761号などによる方法も例外ではなり1゜ そこで、本発明者は、従来技術の持つ欠点を解消すべく
鋭意研究した結果1本発明に到達した。
よって、その高次構造が変化し、活性の低下をおこすこ
とが多く、その点においては、上記米国特許第3652
761号などによる方法も例外ではなり1゜ そこで、本発明者は、従来技術の持つ欠点を解消すべく
鋭意研究した結果1本発明に到達した。
本発明の目的は、生理活性物質の活性を高度に維持し、
かつ高い固定化量を実現することのできる生理活性物質
の無機担体への固定化方法を提供することにある。
かつ高い固定化量を実現することのできる生理活性物質
の無機担体への固定化方法を提供することにある。
〈課題の解決手段およびその作用〉
前記した本発明の目的は、無機担体を、一般式%式%
(式中、Rは炭素原子数1〜4のアルキル基であり、n
は5〜12の整数である)で示されるアルミノアルキル
アルコキシシランにより処理し、次いで、該アミノ基を
用いて、生理活性物質を化学的に結合させることにより
達成される。
は5〜12の整数である)で示されるアルミノアルキル
アルコキシシランにより処理し、次いで、該アミノ基を
用いて、生理活性物質を化学的に結合させることにより
達成される。
無機担体としては、これまでに酵素、抗体、抗原などの
生理活性物質の固定化に用いられてきた無機担体があげ
られる。それらは、多孔性ガラス、シリカゲル、コロイ
ダルシリカ、アルミナ、カオリナイト、ベントナイト、
ウオラストナイト、ヒドロキシアパタイト、各種金属水
酸化物、各種金属酸化物などである。
生理活性物質の固定化に用いられてきた無機担体があげ
られる。それらは、多孔性ガラス、シリカゲル、コロイ
ダルシリカ、アルミナ、カオリナイト、ベントナイト、
ウオラストナイト、ヒドロキシアパタイト、各種金属水
酸化物、各種金属酸化物などである。
これら無機担体を処理するのに使用される一般式■で示
されるアミノプロピルアルコキシシラン中のRとしては
、メチル基、エチル基、n−プロピル基、n−ブチル基
が例示される。nは5から12までの整数である。一般
式■で示されるアミノプロピルアルコキシシランとして
、N−(6−アミノヘキシル)−3−アミノプロピルト
リメトキシシラン、N−(6−アミノヘキシル)−3−
アミノプロピルトリエトキトトラン、N−(8−アミノ
オクチル)−3−アミノプロピルトリメトキシシラン、
N −(12−アミノドデシル)−3−アミノプロピル
トリプロポキシシランが例示される。
されるアミノプロピルアルコキシシラン中のRとしては
、メチル基、エチル基、n−プロピル基、n−ブチル基
が例示される。nは5から12までの整数である。一般
式■で示されるアミノプロピルアルコキシシランとして
、N−(6−アミノヘキシル)−3−アミノプロピルト
リメトキシシラン、N−(6−アミノヘキシル)−3−
アミノプロピルトリエトキトトラン、N−(8−アミノ
オクチル)−3−アミノプロピルトリメトキシシラン、
N −(12−アミノドデシル)−3−アミノプロピル
トリプロポキシシランが例示される。
一般式■に示されるアミノプロピルアルコキシシランは
、例えば3−クロロプロピルトリアルコキシシランと、
2倍モル以上の下記ジアミンH,N −(CH,)n−
NH2 (式中、nは5〜12の整数である) とを反応させ、生成する塩酸塩を除去し、減圧蒸留によ
り精製することにより容易に製造することができる。こ
こで、nが13以上のジアミンは高価であり入手し難く
、さらに対応する一般弐〇で示されるアミノプロピルア
ルコキシシランの沸点が高くなりすぎて減圧蒸留しにく
くなるため、実用上好ましくない。また、nが小さいと
生理活性物質の活性が高度には維持されず、固定量も高
くない。従って、一般弐ので示されるアミノプロピルア
ルコキシシランのうちでさらに好適なものは、nが6以
上、特には6,8.10のような偶数のものである。こ
れらは、原料であるアルキレンジアミンが安価であり、
入手しやすいからである。
、例えば3−クロロプロピルトリアルコキシシランと、
2倍モル以上の下記ジアミンH,N −(CH,)n−
NH2 (式中、nは5〜12の整数である) とを反応させ、生成する塩酸塩を除去し、減圧蒸留によ
り精製することにより容易に製造することができる。こ
こで、nが13以上のジアミンは高価であり入手し難く
、さらに対応する一般弐〇で示されるアミノプロピルア
ルコキシシランの沸点が高くなりすぎて減圧蒸留しにく
くなるため、実用上好ましくない。また、nが小さいと
生理活性物質の活性が高度には維持されず、固定量も高
くない。従って、一般弐ので示されるアミノプロピルア
ルコキシシランのうちでさらに好適なものは、nが6以
上、特には6,8.10のような偶数のものである。こ
れらは、原料であるアルキレンジアミンが安価であり、
入手しやすいからである。
一般式■で示されるアミノプロピルアルコキシシランは
、同一分子内に異なる二種の官能基を有し、分子内のア
ルコキシシラン部分が無機物質に対する結合性をもち、
分子内の第一級アミノ基部分が、種々の生理活性物質と
結合性を有する。すなわち、アミノプロピルアルコキキ
ランは、無機担体と生理活性物質とを化学的に結合させ
る。−般弐〇で示されるアミノプロピルアルコキキラン
を用いた場合には、従来かかる目的に広く用いられてい
た、3−アミノプロピルトルエトキシシランあるいはN
−(2−アミノエチル)−3−アミノプロピルトルメト
キシシランに比べて、ケイ素原子から第一級アミノ基ま
でのスペーサーアームが長いために、生理活性物質が固
定化された場合にも、生理活性物質がもつ固有の高次構
造への制約が小さく、従って、生理活性が高度に維持さ
れるという特徴を有する。また、ケイ素原子から第一級
アミノ基までのスペーサーアームが長いために、生理活
性物質の固定化量が増加するという特徴を有する。
、同一分子内に異なる二種の官能基を有し、分子内のア
ルコキシシラン部分が無機物質に対する結合性をもち、
分子内の第一級アミノ基部分が、種々の生理活性物質と
結合性を有する。すなわち、アミノプロピルアルコキキ
ランは、無機担体と生理活性物質とを化学的に結合させ
る。−般弐〇で示されるアミノプロピルアルコキキラン
を用いた場合には、従来かかる目的に広く用いられてい
た、3−アミノプロピルトルエトキシシランあるいはN
−(2−アミノエチル)−3−アミノプロピルトルメト
キシシランに比べて、ケイ素原子から第一級アミノ基ま
でのスペーサーアームが長いために、生理活性物質が固
定化された場合にも、生理活性物質がもつ固有の高次構
造への制約が小さく、従って、生理活性が高度に維持さ
れるという特徴を有する。また、ケイ素原子から第一級
アミノ基までのスペーサーアームが長いために、生理活
性物質の固定化量が増加するという特徴を有する。
生理活性物質としては、酵素、抗体、抗原などがある。
酵素としては、一般的命名で分類される広範囲な種類の
酵素が利用される。例えば、酸化還元酵素、加水分解酵
素、転移酵素、脱離酵素、異性化酵素、制限酵素などで
ある。酸化還元酵素としては、グルコースオキシダーゼ
、カタラーゼ、パーオキシダーゼが例示される。加水分
解酵素としては、蛋白質分解酵素のパパイン、トリプシ
ン、キモトリプシン、サーモリシン、エステル加水分解
酵素のリパーゼ、ヌクレアーゼのりボヌクレア−ゼなど
が例示される。抗体、抗原には、各種免疫グロブリン、
ホルモン、蛋白質等の抗原およびそれに対する抗体の全
てが含まれる。
酵素が利用される。例えば、酸化還元酵素、加水分解酵
素、転移酵素、脱離酵素、異性化酵素、制限酵素などで
ある。酸化還元酵素としては、グルコースオキシダーゼ
、カタラーゼ、パーオキシダーゼが例示される。加水分
解酵素としては、蛋白質分解酵素のパパイン、トリプシ
ン、キモトリプシン、サーモリシン、エステル加水分解
酵素のリパーゼ、ヌクレアーゼのりボヌクレア−ゼなど
が例示される。抗体、抗原には、各種免疫グロブリン、
ホルモン、蛋白質等の抗原およびそれに対する抗体の全
てが含まれる。
かかる生理活性物質を無機担体に固定するには、まず、
無機担体を、従来知られている方法によって、一般式■
で示されるアミノプロピルアルコキシシランを用いて表
面処理する。通常、一般式■で示されるアミノプロピル
アルコキキランを、トルエン、キシレンなどの有機溶媒
に溶解し、この溶液で無機担体を表面処理する。好まし
くは、約0.1〜40重量%の濃度の溶液を用いて、昇
温下、例えば50〜110℃で数時間処理する。これに
より、無機担体表面に存在する水酸基と、一般式ω中の
ケイ素に結合したアルコキシ基とが脱アルコール縮合す
る。あるいは、上記溶液の代りに、水溶液を用いてもよ
い。
無機担体を、従来知られている方法によって、一般式■
で示されるアミノプロピルアルコキシシランを用いて表
面処理する。通常、一般式■で示されるアミノプロピル
アルコキキランを、トルエン、キシレンなどの有機溶媒
に溶解し、この溶液で無機担体を表面処理する。好まし
くは、約0.1〜40重量%の濃度の溶液を用いて、昇
温下、例えば50〜110℃で数時間処理する。これに
より、無機担体表面に存在する水酸基と、一般式ω中の
ケイ素に結合したアルコキシ基とが脱アルコール縮合す
る。あるいは、上記溶液の代りに、水溶液を用いてもよ
い。
かくして得られた処理済み無機担体は、一般式■中の第
一級アミノ基をもとにして、生理活性物質と共有結合さ
せる。それには、一般によく知られた基本的反応を使用
すればよい。たとえば、グルタルアルデヒドのようなド
アルデヒドで処理して、反応性に富んだアルデヒド基を
導入し、ついで生理活性物質と結合させる。あるいは、
P−二り トロベンゾイル−ロリドで処理後、還元することによっ
て芳香族アミノ基を導入し、これをジアゾ化するか、ヒ
ドラジン誘導体としてから、生理活性物質を結合させる
。あるいは、無水コハク酸で処理してカルボキシル基を
導入し、カルボジイミドを用いて生理活性物質のアミノ
残基と脱水縮合させる。
一級アミノ基をもとにして、生理活性物質と共有結合さ
せる。それには、一般によく知られた基本的反応を使用
すればよい。たとえば、グルタルアルデヒドのようなド
アルデヒドで処理して、反応性に富んだアルデヒド基を
導入し、ついで生理活性物質と結合させる。あるいは、
P−二り トロベンゾイル−ロリドで処理後、還元することによっ
て芳香族アミノ基を導入し、これをジアゾ化するか、ヒ
ドラジン誘導体としてから、生理活性物質を結合させる
。あるいは、無水コハク酸で処理してカルボキシル基を
導入し、カルボジイミドを用いて生理活性物質のアミノ
残基と脱水縮合させる。
かかる一般的方法で、無機担体に結合した一般式ω中に
示される第一級アミノ基と生理活性物質とを結合させる
場合、普通は、生理活性物質を不活性化する傾向のない
pHおよび温度の水性媒体を用いる。また、上記一般的
方法で、生理活性物質を固定化するに当っては、生理活
性物質の活性に不可欠でない生理活性物質上の反能性残
基を利用するような結合手段を選択した方がよい。例え
ば、球状タンパク質である酵素分子の活性中心から離れ
た部位には、リシンのε−アミノ基、N末端のアミノ基
;システィンのスフルヒドリル基;アスパラギン酸やグ
ルタミン酸のカルボキシル残基、C末端のカルボキシル
基フチロジンのフェノール性水酸基;セリンやトレオニ
ンの水酸基;アルギニンのグアジノ基;ヒスチジンのイ
ミダゾール基;トリプトファンのインドール基;メチオ
ニンのチオエーテル基といった反応性のある残基が含ま
れている。特に、アミノ基、カルボキシル基、水酸基の
含量は高いとされているので、酵素の活性部位にも留意
して、これらの反応性基を用いるとよい。
示される第一級アミノ基と生理活性物質とを結合させる
場合、普通は、生理活性物質を不活性化する傾向のない
pHおよび温度の水性媒体を用いる。また、上記一般的
方法で、生理活性物質を固定化するに当っては、生理活
性物質の活性に不可欠でない生理活性物質上の反能性残
基を利用するような結合手段を選択した方がよい。例え
ば、球状タンパク質である酵素分子の活性中心から離れ
た部位には、リシンのε−アミノ基、N末端のアミノ基
;システィンのスフルヒドリル基;アスパラギン酸やグ
ルタミン酸のカルボキシル残基、C末端のカルボキシル
基フチロジンのフェノール性水酸基;セリンやトレオニ
ンの水酸基;アルギニンのグアジノ基;ヒスチジンのイ
ミダゾール基;トリプトファンのインドール基;メチオ
ニンのチオエーテル基といった反応性のある残基が含ま
れている。特に、アミノ基、カルボキシル基、水酸基の
含量は高いとされているので、酵素の活性部位にも留意
して、これらの反応性基を用いるとよい。
しかして、本発明の固定化方法によって、生理活性物質
が、無機担体に化学的に結合された場合には、その結合
のなかだちをする一般弐〇に示されるアミノプロピルア
ルコキシシラン残基が、十分なスペーサーアーム長さを
有しているために、生理活性物質の高次構造が維持され
、高い活性を保ちながら、固定化がなされるという特徴
を示す。
が、無機担体に化学的に結合された場合には、その結合
のなかだちをする一般弐〇に示されるアミノプロピルア
ルコキシシラン残基が、十分なスペーサーアーム長さを
有しているために、生理活性物質の高次構造が維持され
、高い活性を保ちながら、固定化がなされるという特徴
を示す。
本発明によって得られる、無機担体に固定化された生理
活性物質は、バイオリアクター、酵素センサー、免疫セ
ンサー、ラジオイムノアッセイ、化学分析、臨床検査、
治療などの多くの分野で有効に使用される。
活性物質は、バイオリアクター、酵素センサー、免疫セ
ンサー、ラジオイムノアッセイ、化学分析、臨床検査、
治療などの多くの分野で有効に使用される。
〈実施例〉
以下に本発明の実施例を示す。
実施例1
粒度10tIM、比表面積100m/gのシリカゲルを
、N−(8−アミノオクチル)−3−アミノプロピルト
リメトキシシランの10重量%トルエン溶液に入れ、1
00℃で3時間加熱してシラン処理した。
、N−(8−アミノオクチル)−3−アミノプロピルト
リメトキシシランの10重量%トルエン溶液に入れ、1
00℃で3時間加熱してシラン処理した。
このものをメタノール、次いでイオン交換水で洗浄した
。次に、グルタルアルデヒド5重量%水溶液中に入れ、
4時間混合して、アルデヒド基を導入し、再びイオン交
換水で洗浄した。
。次に、グルタルアルデヒド5重量%水溶液中に入れ、
4時間混合して、アルデヒド基を導入し、再びイオン交
換水で洗浄した。
このものをグルコースオキシダーゼ2g/Qを含む0.
05M酢酸ナトリウム緩衝液に入れ、12時間反応させ
、次いで緩衝液で洗浄してグルコースオキシダーゼのシ
リカゲルへの固定化を行った。
05M酢酸ナトリウム緩衝液に入れ、12時間反応させ
、次いで緩衝液で洗浄してグルコースオキシダーゼのシ
リカゲルへの固定化を行った。
0.21mMの0−ジアニシジンを含む上記緩衝液2.
4ml!、10%W/UのD−グルコース水溶液0.5
nil、60U/−のペルオキシダーゼ水溶液0.1
mQの混合液に、該固定化酵素を加え、波長500nm
の吸光度変化を測定することによって、該固定化酵素の
活性を求めた。このシリカゲル固定化グルコースオキシ
ダーゼの活性は、担体1g当り3.OUであった。
4ml!、10%W/UのD−グルコース水溶液0.5
nil、60U/−のペルオキシダーゼ水溶液0.1
mQの混合液に、該固定化酵素を加え、波長500nm
の吸光度変化を測定することによって、該固定化酵素の
活性を求めた。このシリカゲル固定化グルコースオキシ
ダーゼの活性は、担体1g当り3.OUであった。
比較例1
実施例1に示したN−(8−アミノオクチル)−3−ア
ミノプロピルトリメトキシシランの代りに、3−アミノ
プロピルトリエトキシシランを用いた他は、同様の条件
でシリカゲルへのグルコースオキシダーゼの固定化を行
ったところ、シリカゲル固定化グルコースオキシダーゼ
の活性は、担体1g当り1.8Uであった。
ミノプロピルトリメトキシシランの代りに、3−アミノ
プロピルトリエトキシシランを用いた他は、同様の条件
でシリカゲルへのグルコースオキシダーゼの固定化を行
ったところ、シリカゲル固定化グルコースオキシダーゼ
の活性は、担体1g当り1.8Uであった。
実施例2
細孔610人、細孔容積0.53cc/gの多孔質ガラ
ス破砕体を、N−(6−アミノヘキシル)−3−アミノ
プロピルトリメトキシシランの7重量%トルエン溶液に
入れ、102℃で3時間熱処理してシラン処理した。こ
のシラン処理した多孔質ガラス破砕体を、トルエン、次
いでメタノールで洗浄し、真空乾燥した。次に、これを
グルタルアルデヒドの16.7重量%水溶液中に入れ、
2時間混合して、アルデヒド基を導入し、次いで、イオ
ン交換水で洗浄した。
ス破砕体を、N−(6−アミノヘキシル)−3−アミノ
プロピルトリメトキシシランの7重量%トルエン溶液に
入れ、102℃で3時間熱処理してシラン処理した。こ
のシラン処理した多孔質ガラス破砕体を、トルエン、次
いでメタノールで洗浄し、真空乾燥した。次に、これを
グルタルアルデヒドの16.7重量%水溶液中に入れ、
2時間混合して、アルデヒド基を導入し、次いで、イオ
ン交換水で洗浄した。
このものを、サーモリシン10g/Jを含む、5M−N
aBr、16.6mM CaCl2.0.025MTr
is−HCflから成る緩衝液(PH7,5)に加え、
室温で一晩混合してサーモリシンを多孔質ガラス破砕体
に固定化させた。 その後、16.6+aM CaCl
2..0.025M Tris −HCQ緩衝液で洗浄
し、さらに1重量%N a B H4水溶液中に15分
間入れて多孔質ガラス破砕体固定化サーモリシンを得た
。
aBr、16.6mM CaCl2.0.025MTr
is−HCflから成る緩衝液(PH7,5)に加え、
室温で一晩混合してサーモリシンを多孔質ガラス破砕体
に固定化させた。 その後、16.6+aM CaCl
2..0.025M Tris −HCQ緩衝液で洗浄
し、さらに1重量%N a B H4水溶液中に15分
間入れて多孔質ガラス破砕体固定化サーモリシンを得た
。
この固定化酵素の活性は、礼装カゼインに35℃で作用
するときに、反応初期の1分間に、1Mモルのチロシン
に相当する非たんばく性のFolin呈色物質の増加量
をもたらす酵素量をIUとして求めた。上記固定化酵素
の活性は、担体1g当り1.87Uであった。
するときに、反応初期の1分間に、1Mモルのチロシン
に相当する非たんばく性のFolin呈色物質の増加量
をもたらす酵素量をIUとして求めた。上記固定化酵素
の活性は、担体1g当り1.87Uであった。
比較例2
実施例2に示したN−(6−アミノヘキシル)−3−ア
ミノプロピルトリメトキシシランの代りに、N−(2−
アミノエチル)−3−アミノプロピルトリメトキシシラ
ンを用いた他は、同様実施例2と条件で多孔質ガラス破
砕体へのサーモライシンの固定化を行ったところ、固定
化酵素の活性は、担体1g当り0.66Uであった。
ミノプロピルトリメトキシシランの代りに、N−(2−
アミノエチル)−3−アミノプロピルトリメトキシシラ
ンを用いた他は、同様実施例2と条件で多孔質ガラス破
砕体へのサーモライシンの固定化を行ったところ、固定
化酵素の活性は、担体1g当り0.66Uであった。
実施例3
塩化第一鉄0.25モル/Qと塩化第二鉄0.50モル
/Qとを含有する水溶液に、水酸化ナトリウム20重量
%水溶液を加えてpH11,5とし、60℃で2分間熟
成させることにより、微細なマグネタイトを生成させた
。次いで、イオン交換水を用いてデカンテーションをく
り返し、電解質とアルカリを除去した。
/Qとを含有する水溶液に、水酸化ナトリウム20重量
%水溶液を加えてpH11,5とし、60℃で2分間熟
成させることにより、微細なマグネタイトを生成させた
。次いで、イオン交換水を用いてデカンテーションをく
り返し、電解質とアルカリを除去した。
生成したマグネタイトの平均径は、TEMにより測定し
たところ100人であった。
たところ100人であった。
上記マグネタイトの懸濁液に、10重量%の濃度で、N
−(6−7ミノヘキシル)−3−アミノプロピルトリメ
トキシシランを加え、95℃で3時間加熱してシラン処
理した。シラン処理したマグネタイトをイオン交換水で
洗浄後、グルタルアルデヒドの10重量%水溶液中に入
れ、4時間混合して、アルデヒド基を導入し、再び、イ
オン交換水で洗浄した。
−(6−7ミノヘキシル)−3−アミノプロピルトリメ
トキシシランを加え、95℃で3時間加熱してシラン処
理した。シラン処理したマグネタイトをイオン交換水で
洗浄後、グルタルアルデヒドの10重量%水溶液中に入
れ、4時間混合して、アルデヒド基を導入し、再び、イ
オン交換水で洗浄した。
このものを、サーモリシンLog/Ωを含む5M−Na
Br、16.6mMCa(122,0,025M Tr
is−HCQから成る緩衝液(pH7,5)に加え、室
温で一晩混合して、サーモリシンをマグネタイト上に固
定化させた。その後、16.6m M Ca CQ 2
.0.025M T ris−HCffi緩衝液で洗浄
した。
Br、16.6mMCa(122,0,025M Tr
is−HCQから成る緩衝液(pH7,5)に加え、室
温で一晩混合して、サーモリシンをマグネタイト上に固
定化させた。その後、16.6m M Ca CQ 2
.0.025M T ris−HCffi緩衝液で洗浄
した。
L−アスパラギン酸とL−フェニルアラニンメチルエス
テルを、各80mMと160mMの濃度で加え、40℃
の温度で振どう下、ジペプチド(N−Cbz−L−アス
パルチル−L−フェニルアラニンメチルエステル)の合
成を行った。
テルを、各80mMと160mMの濃度で加え、40℃
の温度で振どう下、ジペプチド(N−Cbz−L−アス
パルチル−L−フェニルアラニンメチルエステル)の合
成を行った。
2時間後、分媒液から磁気によって酵素固定化マグネタ
イトを分離し、ジペプチドの生成量をHPLCにて調べ
た。ジペプチドの生成量は、マグネタイト担体1g当り
0.3m+++oleであった。
イトを分離し、ジペプチドの生成量をHPLCにて調べ
た。ジペプチドの生成量は、マグネタイト担体1g当り
0.3m+++oleであった。
実施例4
実施例3のシラン処理したマグネタイトの懸濁液に、無
水グルタル酸を3重量%の濃度で添加し、混合すること
により、該シランのアミノ基末端を、カルボキシル基末
端に転化させた。次いで、イオン交換水で洗浄した。
水グルタル酸を3重量%の濃度で添加し、混合すること
により、該シランのアミノ基末端を、カルボキシル基末
端に転化させた。次いで、イオン交換水で洗浄した。
カルボキシル基末端をもつマグネタイトの懸濁液2mQ
に、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピルカ
ルポジイミドを60■/Q、サーモリシンを10g/Q
の濃度で含む緩衝液2IIIQを加え、3時間、振とう
して、サーモリシンをマグネタイト上に固定化させた。
に、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピルカ
ルポジイミドを60■/Q、サーモリシンを10g/Q
の濃度で含む緩衝液2IIIQを加え、3時間、振とう
して、サーモリシンをマグネタイト上に固定化させた。
次いで16.6+iM CaCQ□、0 、025 M
T ris −HCQ緩衝液で洗浄した。
T ris −HCQ緩衝液で洗浄した。
このものについて実施例3と同様の方法にて、分課液を
置換し、ジペプチドの合成反応を試みたところ、ジペプ
チドの生成量は、マグネタイト担体1g当り0.25m
moleであった。
置換し、ジペプチドの合成反応を試みたところ、ジペプ
チドの生成量は、マグネタイト担体1g当り0.25m
moleであった。
も高いという特徴がある。
実施例5
実施例3のアルデヒド基を導入したマグネタイトの懸濁
液に、抗ヒトIgGを加えて5時間振とうさせることに
より、抗ヒトIgGを固定化させた後、洗浄した。抗ヒ
トIgG固定化量は、洗浄液中に残存するIgGの量を
L owry法により求めた。マグネタイト1g当り5
0■の抗ヒトIgGが固定化されていた。
液に、抗ヒトIgGを加えて5時間振とうさせることに
より、抗ヒトIgGを固定化させた後、洗浄した。抗ヒ
トIgG固定化量は、洗浄液中に残存するIgGの量を
L owry法により求めた。マグネタイト1g当り5
0■の抗ヒトIgGが固定化されていた。
このものは、標識化されたIgGおよびIgGを含む試
料の混合液に加えて、競争的に抗体と結合させ、次いで
磁気的にB/F分離を行うことにより、試料中のIgG
量の定量に用いることができた。
料の混合液に加えて、競争的に抗体と結合させ、次いで
磁気的にB/F分離を行うことにより、試料中のIgG
量の定量に用いることができた。
〈発明の効果〉
本発明の方法によって、生理活性物質が無機担体に固定
化された場合には、生理活性物質と無機担体の結合のな
かだちをする一般式■により示されるアミノプロピルア
ルコキシシランの残基が。
化された場合には、生理活性物質と無機担体の結合のな
かだちをする一般式■により示されるアミノプロピルア
ルコキシシランの残基が。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 無機担体を一般式 (RO)_3SiCH_2CH_2CH_2NH(CH
_2)_nNH_2(1)(式中、Rは炭素原子数1〜
4のアルキル基であり、nは5〜12の整数である)で
示されるアミノアルキルアルコキシシランにより処理し
、次いで該アミノ基を用いて生理活性物質を化学的に結
合させることを特徴とする、無機担体上への生理活性物
質の固定化方法。 2 生理活性物質が、酵素、抗体、または抗原である請
求項1記載の固定化方法。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63007680A JPH01181790A (ja) | 1988-01-18 | 1988-01-18 | 生理活性物質の固定化方法 |
CA000588318A CA1336508C (en) | 1988-01-18 | 1989-01-16 | Method of immobilizing physiologically active substances |
US07/297,793 US5002884A (en) | 1988-01-18 | 1989-01-17 | Immobilization of physiologically active substances on an inorganic support |
EP89300394A EP0325404B1 (en) | 1988-01-18 | 1989-01-17 | Method of immobilizing physiologically active substances |
DE68917324T DE68917324T2 (de) | 1988-01-18 | 1989-01-17 | Methode zur Immobilisierung von physiologisch aktiven Substanzen. |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63007680A JPH01181790A (ja) | 1988-01-18 | 1988-01-18 | 生理活性物質の固定化方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01181790A true JPH01181790A (ja) | 1989-07-19 |
Family
ID=11672504
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63007680A Pending JPH01181790A (ja) | 1988-01-18 | 1988-01-18 | 生理活性物質の固定化方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5002884A (ja) |
EP (1) | EP0325404B1 (ja) |
JP (1) | JPH01181790A (ja) |
CA (1) | CA1336508C (ja) |
DE (1) | DE68917324T2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03164174A (ja) * | 1989-08-25 | 1991-07-16 | Kanzaki Paper Mfg Co Ltd | 固定化酵素およびそれを用いる測定装置 |
JP2014133677A (ja) * | 2013-01-09 | 2014-07-24 | Shimane Univ | 水溶性超常磁性ナノ粒子 |
JP2017061473A (ja) * | 2007-11-07 | 2017-03-30 | ロイコケア・アクチェンゲゼルシャフト | 生物学的物質の固定化のための生体適合性三次元マトリクス |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US5514601A (en) * | 1991-02-22 | 1996-05-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Detection of target species in a sample or liquid flow using diodes and an electrical signal |
CH686518A5 (de) * | 1993-10-05 | 1996-04-15 | Asahi Optical Co Ltd | Granulares Polymerkomposit, Herstellungsverfahren fur dieses und diagnostische Mittel. |
ATE221660T1 (de) * | 1994-01-19 | 2002-08-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Biotinsilan-verbindungen und diese verbindungen enthaltende bindematrix |
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US6033719A (en) * | 1996-04-25 | 2000-03-07 | Medtronic, Inc. | Method for covalent attachment of biomolecules to surfaces of medical devices |
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US6319674B1 (en) | 1999-09-16 | 2001-11-20 | Agilent Technologies, Inc. | Methods for attaching substances to surfaces |
US6802966B2 (en) * | 2001-08-14 | 2004-10-12 | W. R. Grace & Co. Conn. | Solid compositions for selective adsorption from complex mixtures |
US6987079B2 (en) | 2001-08-14 | 2006-01-17 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Supported catalyst systems |
JP4740598B2 (ja) * | 2003-03-28 | 2011-08-03 | カウンシル・オブ・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ | 熱安定酵素の製造方法 |
DE10330204A1 (de) * | 2003-07-03 | 2005-02-03 | Universität Tübingen | Verfahren zum Aufbringen von Substanzen auf unporöse Kieselgel-Nanopartikel |
NL1027360C2 (nl) * | 2004-10-28 | 2006-05-01 | Clea Technologies B V | Werkwijze voor de bereiding van vernette enzymaggregaten met verbeterde eigenschappen. |
US8835143B2 (en) | 2004-10-28 | 2014-09-16 | Clea Technologies Bv | Method for preparing hybrid cross-linked enzyme-silica aggregates |
WO2009009188A2 (en) * | 2007-04-19 | 2009-01-15 | 3M Innovative Properties Company | Uses of water-dispersible silica nanoparticles for attaching biomolecules |
EP2140264A1 (en) * | 2007-04-19 | 2010-01-06 | 3M Innovative Properties Company | Methods of use of solid support material for binding biomolecules |
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US3669841A (en) * | 1970-02-11 | 1972-06-13 | Monsanto Co | Attachment of enzymes to siliceous materials |
JPS609070B2 (ja) * | 1974-08-21 | 1985-03-07 | 日本原子力研究所 | 熱硬化性樹脂組成物の製法 |
FR2407937A1 (fr) * | 1977-11-04 | 1979-06-01 | Dynamit Nobel Ag | Procede pour l'immobilisation d'enzymes sur une matiere de support minerale et application des produits d'enzymes immobilises a la saponification enzymatique selective de n-acylaminoacides |
JPS6015560A (ja) * | 1983-07-07 | 1985-01-26 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 免疫学的測定用成形品の製造法 |
US4683203A (en) * | 1984-04-14 | 1987-07-28 | Redco N.V. | Immobilized enzymes, processes for preparing same, and use thereof |
-
1988
- 1988-01-18 JP JP63007680A patent/JPH01181790A/ja active Pending
-
1989
- 1989-01-16 CA CA000588318A patent/CA1336508C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-01-17 EP EP89300394A patent/EP0325404B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-17 DE DE68917324T patent/DE68917324T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-17 US US07/297,793 patent/US5002884A/en not_active Expired - Lifetime
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Also Published As
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---|---|
EP0325404B1 (en) | 1994-08-10 |
DE68917324T2 (de) | 1995-03-16 |
EP0325404A2 (en) | 1989-07-26 |
US5002884A (en) | 1991-03-26 |
DE68917324D1 (de) | 1994-09-15 |
EP0325404A3 (en) | 1990-03-28 |
CA1336508C (en) | 1995-08-01 |
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