JPH05339169A - Oral vaccine - Google Patents
Oral vaccineInfo
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- JPH05339169A JPH05339169A JP4036493A JP4036493A JPH05339169A JP H05339169 A JPH05339169 A JP H05339169A JP 4036493 A JP4036493 A JP 4036493A JP 4036493 A JP4036493 A JP 4036493A JP H05339169 A JPH05339169 A JP H05339169A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、経口投与後効率的に抗
体を産生せしめる経口ワクチンに関する。本発明の経口
ワクチンは、生体に経口投与後、保持した抗原に対する
抗体を効率的に産生せしめ、感染防御効果が得られるも
のである。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to an oral vaccine capable of efficiently producing an antibody after oral administration. The oral vaccine of the present invention is capable of efficiently producing an antibody against the retained antigen after oral administration to a living body and obtaining an infection protective effect.
【０００２】[0002]
【従来の技術】現行のワクチンのほとんどは皮下に接種
する注射剤であるが、少頻度で起こる副作用や投与時の
疼痛が臨床上問題となっている。これを改良するための
様々な投与方法の検討がなされてはいるが、経口ワクチ
ンは安全性と投与方法の便利さから、その早期開発が最
も望まれている剤形である。2. Description of the Related Art Most of current vaccines are injections that are subcutaneously inoculated, but side effects that occur infrequently and pain during administration have become clinical problems. Although various administration methods have been studied to improve this, the oral vaccine is the most desired dosage form for its early development because of its safety and convenience of administration method.
【０００３】経口ワクチンの検討は、従来より緩衝剤、
腸溶コーティング錠剤、マイクロパーティクル、ナノパ
ーティクル、アジュバント物質などを用いて行われてき
たが、未だ成功には至っていない(International Journ
al of Pharmaceutics,75, 1(1991)、Journal of Clinica
l Pharmacy and Therapeutics,16,309 (1991))。また、
これら総説においては、オーソドックスな膜組成のリポ
ソームを用いた経口ワクチンへの応用例も紹介されては
いるが、多少の抗体価の上昇は認められたものの、実用
化にはほど遠いことが記されている。Conventionally, oral vaccines have been investigated by using buffering agents,
It has been done with enteric-coated tablets, microparticles, nanoparticles, adjuvant substances, etc., but has not yet been successful (International Journ
al of Pharmaceutics, 75, 1 (1991), Journal of Clinica
Pharmacy and Therapeutics, 16, 309 (1991)). Also,
In these reviews, although an example of application to an oral vaccine using liposomes having an orthodox membrane composition was also introduced, although some increase in antibody titer was observed, it was noted that it was far from practical use. There is.
【０００４】いずれにしても、従来技術においては、経
口投与後、抗体を効率的に産生せしめる手段はなかった
といえる。In any case, it can be said that in the prior art, there was no means for efficiently producing the antibody after oral administration.
【０００５】ホスファチジルセリンで膜を修飾したリポ
ソームを静脈注射した例は知られており（Cancer Resea
rch, 40,4460 (1980))、また、マンノース誘導体または
マンナン誘導体で膜を修飾したリポソームが肝臓や肺に
集積性があるとの報告がある(Biochimica et Biophysic
a Acta 632,562 (1980) 、 病態生理 6, 771 (1985))。An example of intravenous injection of liposomes whose membrane is modified with phosphatidylserine is known (Cancer Resea
rch, 40, 4460 (1980)), and a liposome whose membrane is modified with a mannose or mannan derivative has been reported to accumulate in the liver and lung (Biochimica et Biophysic).
a Acta 632,562 (1980), Pathophysiology 6, 771 (1985)).
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、生体に経口
投与後、保持した微生物抗原もしくは弱毒化微生物等の
抗原に対する抗体を効率的に産生することができる経口
ワクチンを提供することを目的とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide an oral vaccine capable of efficiently producing an antibody against a retained microbial antigen or an antigen such as an attenuated microorganism after oral administration to a living body. To do.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明は、抗原と脂質の
複合体である経口投与用ワクチンに関するが、この複合
体は、脂質としてマンノースを結合している糖脂質およ
び／またはホスファチジルセリンである燐脂質を含んで
いることにより経口投与によっても抗体価を上げること
ができる。The present invention relates to a vaccine for oral administration which is a complex of an antigen and a lipid, and this complex is a glycolipid and / or a phosphatidylserine having mannose as a lipid. By including the phospholipid, the antibody titer can be increased by oral administration.
【０００８】複合体は、抗原である蛋白質や糖蛋白質と
脂質とが疎水結合および／または水素結合により不規則
に配列した集合体である場合と脂質膜構造体である場合
とに分けることができる。The complex can be divided into a case where it is an aggregate in which a protein or glycoprotein as an antigen and a lipid are irregularly arranged by a hydrophobic bond and / or a hydrogen bond, and a case where it is a lipid membrane structure. ..
【０００９】本発明の脂質膜構造体は広い意味で解釈す
べきであり、脂質を有し脂質が膜を形成している場合ま
たは油成分と水成分が境界として膜を形成している場合
があり、両親媒性脂質の極性基が界面の水相側に向かっ
て配列した膜構造を有する粒子ということもでき、具体
的にはリポソーム、エマルジョンあるいは水溶性ミセル
が例示される。本発明は、この複合体が脂質としてマン
ノースを結合している糖脂質および／またはホスファチ
ジルセリンである燐脂質を含んでいることにより、上記
課題を解決できるとの知見に基づいてなされたのであ
る。The lipid membrane structure of the present invention should be construed in a broad sense, and it may be the case where a lipid has a lipid and forms a membrane, or where an oil component and a water component form a boundary. It can be said that the particles have a membrane structure in which the polar groups of the amphipathic lipid are arranged toward the aqueous phase side of the interface, and specific examples thereof include liposomes, emulsions and water-soluble micelles. The present invention has been made based on the finding that the above-mentioned problems can be solved by the inclusion of a mannose-bound glycolipid and / or a phosphatidylserine phospholipid as a lipid.
【００１０】本発明のワクチンは、場合によっては更に
アジュバント物質が添加されていてもよい。The vaccine of the present invention may further contain an adjuvant substance depending on the case.
【００１１】ワクチンに使用する抗原はこの分野の研究
者が良く理解しているものであるが、例えば微生物の抗
原もしくは弱毒化微生物としては、インフルエンザウイ
ルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、インフルエン
ザウイルスＣ型、ロタウイルス、サイトメガロウイル
ス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、エイズウイルス
（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ
型肝炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペス
ウイルス１型・２型、ＡＴＬ（成人型Ｔ細胞白血病）ウ
イルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、突
発性発疹ウイルス（ＨＨＶ−６）、麻疹ウイルス、風疹
ウイルス、ムンプス（おたふくかぜ）ウイルス、ポリオ
ウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイルスなどのウ
イルス類、虫歯連鎖球菌、コレラ菌、インフルエンザ
菌、肺炎球菌、百日咳菌、ジフテリア菌、破傷風菌など
の菌類、クラミジアなどのリケッチア類、マラリア病原
虫などの原虫類等の微生物の蛋白質抗原、もしくはこれ
ら微生物そのものの病原性を弱めた弱毒化微生物等を挙
げることができる。なお、微生物の蛋白質抗原として
は、インフルエンザウイルスの場合には、ヘマグルチニ
ン（ＨＡ）やノイラミニダーゼ（ＮＡ）の単品もしくは
混合物を、本発明の経口ワクチンに保持させるものとし
て例示することができる。The antigens used in vaccines are well understood by researchers in this field. For example, the antigens for microorganisms or attenuated microorganisms are influenza virus type A, influenza virus type B, and influenza virus type C. , Rotavirus, cytomegalovirus, RS virus, adenovirus, AIDS virus (HIV), hepatitis C virus, hepatitis A virus, B
Hepatitis B virus, varicella zoster virus, herpes simplex virus type 1 and type 2, ATL (adult T cell leukemia) virus, coxsackie virus, enterovirus, exanthema subitum virus (HHV-6), measles virus, rubella virus, mumps ( Viruses such as mumps virus, poliovirus, Japanese encephalitis virus, rabies virus, Streptococcus bacillus, cholera, influenza, pneumococcus, pertussis, diphtheria, tetanus, etc., rickettsiae such as chlamydia, malaria Examples thereof include protein antigens of microorganisms such as protozoa such as pathogens, and attenuated microorganisms in which the pathogenicity of these microorganisms is weakened. In the case of influenza virus, hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) can be exemplified as the protein antigens of the microorganisms by allowing the oral vaccine of the present invention to hold a single substance or a mixture thereof.
【００１２】これらの抗原は、微生物から加工、精製す
る等の方法で得ることができるが、合成によって得るこ
ともでき、さらに遺伝子工学的に製造することもでき
る。[0012] These antigens can be obtained from microorganisms by methods such as processing and purification, but they can also be obtained synthetically or genetically engineered.
【００１３】また、本発明の経口ワクチンが保持しうる
抗原は、脂質膜構造体の種類によっても異なる。例え
ば、リポソームが保持しうるものとしては特に制限がな
く、水溶性あるいは脂溶性の微生物抗原もしくは弱毒化
微生物等を挙げることができる。またエマルジョンの場
合には脂溶性の抗原を、ミセルの場合には水難溶性の抗
原を保持可能なものとして挙げることができる。The antigens that the oral vaccine of the present invention can carry also differ depending on the type of lipid membrane structure. For example, what the liposome can hold is not particularly limited, and examples thereof include water-soluble or fat-soluble microbial antigens and attenuated microorganisms. In the case of an emulsion, a fat-soluble antigen can be mentioned, and in the case of a micelle, a poorly water-soluble antigen can be mentioned.
【００１４】本発明にかかわるホスファチジルセリンと
しては、大豆、卵黄等の天然物に由来するホスファチジ
ルセリン、これらを水素添加した水素添加ホスファチジ
ルセリン、または、大豆、卵黄等の天然物に由来するホ
スファチジルコリンから半合成により得られるホスファ
チジルセリン、これらを水素添加した水素添加ホスファ
チジルセリン、さらに半合成もしくは全合成のジミリス
トイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファ
チジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン等
が挙げられるが、好ましくは水素添加ホスファチジルセ
リン、ジパルミトイルホスファチジルセリンおよびジス
テアロイルホスファチジルセリンである。The phosphatidylserine according to the present invention includes phosphatidylserine derived from natural products such as soybean and egg yolk, hydrogenated phosphatidylserine obtained by hydrogenating these, or phosphatidylcholine derived from natural products such as soybean and egg yolk. Phosphatidylserine obtained by synthesis, hydrogenated phosphatidylserine obtained by hydrogenating these, further semi-synthetic or fully synthetic dimyristoylphosphatidylserine, dipalmitoylphosphatidylserine, distearoylphosphatidylserine and the like, but preferably hydrogenated phosphatidylserine. , Dipalmitoylphosphatidylserine and distearoylphosphatidylserine.
【００１５】本発明にかかわるマンノースを結合してい
る糖脂質としては、マンノース残基を有するホスファチ
ジルエタノールアミンの誘導体（Biocheimica et Bioph
ysica Acta, 632 562 (1980)) やコレステロールの誘導
体 (Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77,4430 (1980)) 、ジ
マンノシルジグリセリド (Biochemical and Biophysica
l Research Communications, 110,140 (1983))、マンノ
ビオース脂肪酸エステル及びアミド（特開平 1-104088
号）、ホスファチジルマンノース等、多糖であるマンナ
ンに脂肪酸やコレステロールが部分的に置換された誘導
体（病態生理、6,771 (1985)）等を挙げることができ
る。さらに具体的な化合物としては、4-0-(6-O- エイコ
サノイル- β-D- マンノピラノシル)-D-マンノピラノー
スおよびN-(2-N'-コレステリルカルボキシメチル）カル
バミルメチルマンナンを挙げることができる。The mannose-bonded glycolipid according to the present invention is a phosphatidylethanolamine derivative having a mannose residue (Biocheimica et Bioph).
ysica Acta, 632 562 (1980)) and cholesterol derivatives (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4430 (1980)), dimannosyl diglyceride (Biochemical and Biophysica).
l Research Communications, 110, 140 (1983)), mannobiose fatty acid ester and amide (JP-A-1-04088).
No.), phosphatidyl mannose and the like, and derivatives thereof in which a fatty acid or cholesterol is partially substituted in the polysaccharide mannan (pathophysiology, 6,771 (1985)) and the like. More specific compounds include 4-0- (6-O-eicosanoyl-β-D-mannopyranosyl) -D-mannopyranose and N- (2-N'-cholesterylcarboxymethyl) carbamylmethylmannan. be able to.
【００１６】これら膜成分としての燐脂質（ホスファチ
ジルセリン）および糖脂質は、単品もしくは混合物とし
て、ホスファチジルコリン類（レシチン）、スフィンゴ
ミエリン等の他の膜成分を主体とした脂質膜構造体に添
加すれば良いが、これらのみで脂質膜構造体を形成して
も良い。If these phospholipids (phosphatidylserine) and glycolipids as the membrane components are added individually or as a mixture to a lipid membrane structure mainly composed of other membrane components such as phosphatidylcholines (lecithin) and sphingomyelin. It is good, but the lipid membrane structure may be formed by only these.
【００１７】即ち、ホスファチジルセリン類はこれ単独
でもリポソームやエマルジョンを形成することは可能で
あるし、マンノースを結合している糖脂質（マンノビオ
ース脂肪酸エステルやアミド）はこれ単独でエマルジョ
ンやミセルを形成することが可能である。したがって、
本発明においては、本脂質膜構造体に膜成分として用い
られるホスファチジルセリン、マンノースを結合してい
る糖脂質の添加比率は上限においては何ら限定されるも
のではない。下限については、全脂質膜成分に対しモル
分率で１％以上とするのがよく、 5〜50％添加すること
が望ましい。That is, the phosphatidylserines can form liposomes and emulsions by themselves, and the glycolipids (mannobiose fatty acid esters and amides) having mannose bound thereto form emulsions and micelles. It is possible. Therefore,
In the present invention, the addition ratio of phosphatidylserine and glycolipid having mannose used as a membrane component in the present lipid membrane structure is not limited to the upper limit. The lower limit is preferably 1% or more in terms of molar fraction with respect to all lipid membrane components, and it is desirable to add 5 to 50%.
【００１８】他の膜成分としては、ホスファチジルコリ
ン類（レシチン）、例えば、ホスファチジルコリン、大
豆や卵黄等の天然物由来のホスファチジルコリンに水素
添加した水素添加ホスファチジルコリン、半合成もしく
は全合成ジミリストイルホスファチジルコリン、半合成
もしくは全合成ジパルミトイルホスファチジルコリンお
よび半合成もしくは全合成ジステアロイルホスファチジ
ルコリン等や、スフィンゴミエリン等の脂質を挙げるこ
とができる。Other membrane components include phosphatidylcholines (lecithin), for example, phosphatidylcholine, hydrogenated phosphatidylcholine obtained by hydrogenating phosphatidylcholine derived from natural products such as soybean and egg yolk, semisynthetic or fully synthetic dimyristoylphosphatidylcholine, semisynthetic or Examples thereof include total synthetic dipalmitoylphosphatidylcholine, semisynthetic or total synthetic distearoylphosphatidylcholine, and lipids such as sphingomyelin.
【００１９】また、他の脂質として荷電脂質を加えてリ
ポソームの物理的安定化を図ることもできる。荷電脂質
の例としては、ジアルキルホスフェート、ジアシルホス
ファチジン酸、ステアリルアミン、ホスファチジルグリ
セロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジ
ルエタノールアミンまたはイオン性界面活性化剤（酸性
または塩基性）を示すことができる。It is also possible to add a charged lipid as another lipid to physically stabilize the liposome. Examples of charged lipids can include dialkyl phosphates, diacylphosphatidic acids, stearylamines, phosphatidylglycerols, phosphatidylinositols, phosphatidylethanolamines or ionic surfactants (acidic or basic).
【００２０】さらに、リポソームの物理的および生物学
的安定を図るためにコレステロール等のステロール類を
加えることもある。Further, sterols such as cholesterol may be added in order to stabilize the physical and biological stability of the liposome.
【００２１】本発明において、場合によっては更にアジ
ュバント物質を添加することもできる。アジュバント物
質としては、例えば、結核菌の細胞壁にあるアジュバン
ト物質の最少有効物質である(N-アセチルムラモイル)-L
-アラニル-D-イソグルタミン（ムラミルジペプチド、Ｍ
ＤＰ）並びにその誘導体、例えば、6-O-(2-テトラデシ
ルヘキサデカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-アラニ
ル-D-イソグルタミン（Ｂ30−ＭＤＰ）、6-O-(2-テトラ
デシルヘキサデカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-ア
ラニル-D-グルタムアミド（Ｂ30−ＭＤＰアミド体）、N
2-[(N-アセチルムラモイル)-L-アラニル-D-イソグルタ
ミニール]-N6-ステアロイル-L-リジン（ＭＤＰ−Lys[L1
8]）等を挙げることができる。水溶性であるムラミルジ
ペプチドの場合には、脂質膜構造体としてはリポソーム
が適用でき、リポソームの内水相に保持させれば良い。
このムラミルジペプチドの添加量は何ら限定されるもの
ではなく、水性溶媒への飽和溶解度まで添加可能であ
る。また脂溶性であるムラミルジペプチド誘導体の場合
には、脂質膜構造体としてはリポソーム、エマルジョ
ン、ミセルが適用できる。全脂質膜成分に対する添加比
率は何ら限定されるものではないが、モル分率で0.1 ％
以上とするのがよく、 1〜30％添加することが好まし
い。In the present invention, if necessary, an adjuvant substance may be added. As the adjuvant substance, for example, the least effective substance of the adjuvant substance in the cell wall of Mycobacterium tuberculosis (N-acetylmuramoyl) -L
-Alanyl-D-isoglutamine (muramyl dipeptide, M
DP) and its derivatives such as 6-O- (2-tetradecylhexadecanoyl) -N-acetylmuramoyl) -L-alanyl-D-isoglutamine (B30-MDP), 6-O- (2- Tetradecylhexadecanoyl) -N-acetylmuramoyl) -L-alanyl-D-glutamamide (B30-MDP amide), N
2 - [(N-acetylmuramoyl) -L- alanyl -D- iso glutaminyl Minnie le] -N 6 - stearoyl -L- lysine (MDP-Lys [L1
8]) and the like. In the case of water-soluble muramyl dipeptide, liposome can be applied as the lipid membrane structure, and it may be retained in the inner aqueous phase of the liposome.
The amount of muramyl dipeptide added is not limited in any way, and can be added up to the saturated solubility in an aqueous solvent. In the case of a fat-soluble muramyl dipeptide derivative, liposome, emulsion or micelle can be applied as the lipid membrane structure. The ratio of addition to the total lipid membrane components is not limited at all, but the molar fraction is 0.1%.
It is preferable that the amount is above, and it is preferable to add 1 to 30%.
【００２２】本発明のワクチンは、経口投与によって抗
体価をあげ感染を防御することに特徴を有するが、用量
としては成人一人一回当りインフルエンザワクチンで50
μg乃至 5mg、通常は 200μ乃至 2mg である。これを
一回投与するか、または一週間間隔で２回投与するか、
二週間間隔で２回投与するか、三週間間隔で２回投与す
るか、もしくは一か月間隔で２回投与するように応用す
ることもできる。さらに、同様な間隔で３回投与、４回
投与、５回投与、６回投与することもある。通常は単回
投与または一か月間隔での２〜４回投与である。また、
Ｂ型肝炎ワクチンの場合には用量としては成人一人一回
当たり20μg 乃至5mg 通常は50μg 乃至2mg である。用
法としては注射用ワクチンと同様に考えることができ
る。これ以外の抗原に対するワクチンに関しても、注射
用のワクチンの同量から20倍量で、用法もこれらに準じ
て適宜投与すれば良い。もちろん、投与される個人の免
疫応答性や年令等に応じて適宜増減する場合があっても
よい。The vaccine of the present invention is characterized by increasing the antibody titer by oral administration to protect against infection, but the dose is 50 times per adult adult vaccine.
μg to 5 mg, usually 200 μ to 2 mg. Do this once, or twice at weekly intervals,
It can also be applied such that it is administered twice at two-week intervals, twice at three-week intervals, or twice at one-month intervals. Further, the same dose may be administered three times, four times, five times, or six times. Usually, it is a single dose or 2 to 4 doses at monthly intervals. Also,
In the case of hepatitis B vaccine, the dose is 20 μg to 5 mg per adult, usually 50 μg to 2 mg per adult. The usage can be considered similar to the injection vaccine. With respect to vaccines against other antigens, the same amount to 20 times the amount of the vaccine for injection may be used, and the dosage may be appropriately administered according to these. Of course, the dose may be increased or decreased depending on the immune responsiveness of the individual to whom the drug is administered, the age, and the like.
【００２３】本発明で使用するホスファチジルコリン、
ホスファチジルセリンおよびコレステロール等は生体成
分であることから毒性は低いと考えられる。Y.M.Rustum
らが卵黄由来のホスファチジルコリン、ホスファチジル
セリンおよびコレステロールで調製したリポソームの急
性毒性を試験しているが、50% 致死毒性は5.5g/kg 以上
である(Cancer Research 39,1390〜1395 (1979) 参
照）。次に本発明のワクチンの製造法を説明する。Phosphatidylcholine used in the present invention,
Since phosphatidylserine and cholesterol are biological components, they are considered to have low toxicity. YMRustum
Have tested the acute toxicity of liposomes prepared from egg yolk-derived phosphatidylcholine, phosphatidylserine, and cholesterol, with a 50% lethal toxicity of 5.5 g / kg or more (see Cancer Research 39, 1390-1395 (1979)). .. Next, a method for producing the vaccine of the present invention will be described.
【００２４】ａ）リポソーム型ワクチンの製造法 微生物の抗原もしくは弱毒化微生物そのものと、ホスフ
ァチジルセリン類（レシチン）、スフィンゴミエリン等
の膜成分物質と、ホスファチジルセリン及び／またはマ
ンノースを結合している糖脂質と、場合によっては更に
アジュバント物質とを用いて、公知の方法（例えば、Ann
ual Review of Biophysics and Bioengeneering, 9, 46
7 (1980))に従いリポソームの水分散液を調製する。か
かるリポソームには安定化剤としてコレステロール等の
ステロール類、ジアルキルホスフェート、ジアシルホス
ファチジン酸、ステアリルアミン等の荷電脂質及びα−
トコフェロール等の酸化防止剤を含ませても良い。A) Method for producing liposome-type vaccine A glycolipid that binds phosphatidylserine and / or mannose to an antigen of a microorganism or an attenuated microorganism itself, a membrane component substance such as phosphatidylserine (lecithin) and sphingomyelin And optionally an adjuvant substance, using known methods (eg Ann
ual Review of Biophysics and Bioengeneering, 9, 46
7 (1980)) to prepare an aqueous dispersion of liposomes. In such liposomes, sterols such as cholesterol as a stabilizer, charged lipids such as dialkyl phosphate, diacylphosphatidic acid and stearylamine, and α-
An antioxidant such as tocopherol may be included.
【００２５】ｂ）エマルジョン型ワクチンの製造法 微生物の抗原もしくは弱毒化微生物そのものと、レシチ
ン、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Twe
en) 等の両親媒性物質と、大豆油等の油脂と、ホスファ
チジルセリンおよび／またはマンノースを結合している
糖脂質と、場合によっては更にアジュバント物質とを用
い、公知のエマルジョン調製方法に従ってエマルジョン
を調製する。B) Method for producing emulsion-type vaccine Antigen of microorganism or attenuated microorganism itself and lecithin, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (Twe
en) and other amphipathic substances, soybean oil and other fats and oils, phosphatidylserine and / or mannose-bonded glycolipids, and optionally an adjuvant substance, and an emulsion is prepared according to a known emulsion preparation method. Prepare.
【００２６】ｃ）ミセル型ワクチンの製造法 微生物の抗原もしくは弱毒化微生物そのものと、ポリオ
キシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Tween) 、脂肪
酸ナトリウム、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等のミ
セル形成界面活性物質（ミセル形成臨界濃度以上の濃度
で水性溶媒に加える）と、ホスファチジルセリンおよび
／またはマンノースを結合している糖脂質と、場合によ
っては更にアジュバント物質とを用い、公知のミセル調
製方法に従ってミセルの水分散液を調製する。C) Method for Producing Micellar Vaccine The antigen of the microorganism or the attenuated microorganism itself and micelle-forming surface substances such as polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (Tween), fatty acid sodium, polyoxyethylene hydrogenated castor oil (micelle formation) An aqueous dispersion of micelles is added according to a known micelle preparation method using a glycolipid having phosphatidylserine and / or mannose bound thereto, and optionally an adjuvant substance. Prepare.
【００２７】[0027]
【発明の効果】本発明の経口ワクチンは、生体に経口投
与後、保持した抗原に対する抗体を効率的に産生せしめ
るものである。したがって、従来経口では吸収されず、
その抗体産生が不可能であった微生物抗原もしくは弱毒
化微生物の経口ワクチンを可能ならしめたのである。INDUSTRIAL APPLICABILITY The oral vaccine of the present invention is capable of efficiently producing an antibody against the retained antigen after oral administration to a living body. Therefore, conventionally not absorbed orally,
It enabled an oral vaccine of microbial antigens or attenuated microorganisms for which antibody production was impossible.
【００２８】[0028]
【実施例】本発明を、微生物の蛋白質抗原のモデルとし
て牛血清アルブミン（ＢＳＡ）並びにインフルエンザウ
イルス抗原およびＢ型肝炎ウイルス抗原を用いて実施例
及び試験例により説明するが、本発明はこれによって限
定されるものではない。なお、実施例において、脂質膜
構造体に封入されることなく、脂質膜構造体と遊離して
抗原蛋白の存在する場合あるいは別な形の複合体が存在
することもあるが、必要に応じてこれを超遠心分離法、
ゲル濾過法等の操作により除去して用いても、除去せず
に用いてもかまわない。EXAMPLES The present invention will be described by way of Examples and Test Examples using bovine serum albumin (BSA) and influenza virus antigens and hepatitis B virus antigens as models of microbial protein antigens, but the present invention is not limited thereto. It is not something that will be done. In the examples, without encapsulation in the lipid membrane structure, the lipid membrane structure may be present in the presence of the antigen protein or in the presence of a complex of another form, but if necessary, This is the ultracentrifugation method,
It may be used after being removed by an operation such as a gel filtration method, or may be used without being removed.
【００２９】実施例１〜４：牛血清アルブミン(BSA) を
保持したリポソーム型経口ワクチン ａ）ＢＳＡ封入リポソームの調製 膜組成比がジステアロイルホスファチジルコリン(DSP
C)：水素添加ホスファチジルセリン (H-PS)：コレステ
ロール (Chol) ＝1:1:2（モル比）からなる脂質160mg
に、クロロホルム：メタノール＝9:1 混液を20ml加えて
溶解し、ロータリーエバポレーターを用いて37℃で加温
しながら溶媒を留去した。更に真空下で２時間乾燥し、
リピドフィルムを調製した。これに生理食塩液に溶解し
たそれぞれの濃度のＢＳＡ（表１参照）を 4ml加え、ボ
ルテックスミキサーで50℃、10分間の撹拌を行い、多重
層リポソーム (MLV 、multilamellar vesicle) を調製し
た。引きつづき、遠心分離(35,000 ×ｇ、 4℃、20分）
を行い、上清を除去し、沈澱物に生理食塩液4ml を加え
て再懸濁した。この遠心分離操作を３回繰り返し、遊離
のＢＳＡを除去した。このように調製したリポソーム懸
濁液を0.1 μｍのポリカーボネート製メンブランフィル
ターを用いて３リットルの生理食塩液に対して１２時間
透析を行い、粒子径が0.1 μｍ以下のリポソームを除去
して、最終的に表１右に示すＢＳＡ封入リポソーム型経
口ワクチンとした。Examples 1 to 4: bovine serum albumin (BSA)
Retained liposomal oral vaccine a) Preparation of BSA-encapsulated liposomes The membrane composition ratio was distearoylphosphatidylcholine (DSP).
C): Hydrogenated phosphatidylserine (H-PS): Cholesterol (Chol) = 160: 1 lipid consisting of 1: 2 (molar ratio)
Then, 20 ml of a mixed solution of chloroform: methanol = 9: 1 was added and dissolved, and the solvent was distilled off while heating at 37 ° C. using a rotary evaporator. Further dry under vacuum for 2 hours,
A lipid film was prepared. 4 ml of each concentration of BSA (see Table 1) dissolved in physiological saline was added thereto, and the mixture was stirred at 50 ° C. for 10 minutes with a vortex mixer to prepare multilamellar liposomes (MLV, multilamellar vesicles). Continuously, centrifuge (35,000 xg, 4 ℃, 20 minutes)
Then, the supernatant was removed, and the precipitate was resuspended by adding 4 ml of physiological saline. This centrifugation operation was repeated 3 times to remove free BSA. The liposome suspension thus prepared was dialyzed for 12 hours against 3 liters of physiological saline using a 0.1 μm polycarbonate membrane filter to remove liposomes having a particle size of 0.1 μm or less, and finally The BSA-encapsulated liposome oral vaccine shown on the right side of Table 1 was used.
【００３０】[0030]
【表１】 [Table 1]
【００３１】最終リポソーム懸濁液：DSPC/H-PS/Chol＝
54.4/51.2/54.4 (mg) マウス１匹あたり１回 0.5ml投与するので、脂質投与量
は10μmol、ＢＳＡ投与量は50μg（実施例１）〜400 μ
g （実施例４）となる。Final liposome suspension: DSPC / H-PS / Chol =
54.4 / 51.2 / 54.4 (mg) Since 0.5 ml is administered once per mouse, the lipid dose is 10 μmol and the BSA dose is 50 μg (Example 1) to 400 μm.
g (Example 4).
【００３２】ｂ）免疫試験 調製したＢＳＡ封入リポソーム懸濁液もしくは対照例と
してのＢＳＡ単独水溶液（ＢＳＡ投与量をリポソーム群
と一致させた）を表２に示すスケジュールに従い、胃ゾ
ンデを用いてＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、７週齢）に１回
あたり0.1ml ずつ経口投与した（１群６匹）。血中及び
唾液中の抗体価を測定するために、血液は眼窩採血によ
り採取し、唾液は、マウスに12mg/ml のペントバルビタ
ールを0.1ml腹腔内投与して麻酔し、0.2mg/mlピロカル
ピンを腹腔内投与した後、パスツールピペットを口内に
挿入し採取した。B) Immunization test The prepared BSA-encapsulated liposome suspension or a BSA single aqueous solution as a control example (the BSA dose was matched with the liposome group) according to the schedule shown in Table 2 using a gastric sonde, BALB / C mice (male, 7 weeks old) were orally administered with 0.1 ml each (6 mice per group). To measure the antibody titer in blood and saliva, blood was collected by orbital blood sampling, and saliva was anesthetized by intraperitoneal injection of 0.1 ml of 12 mg / ml pentobarbital into mice and 0.2 mg / ml pilocarpine. After intraperitoneal administration, a Pasteur pipette was inserted into the mouth and collected.
【００３３】[0033]
【表２】 [Table 2]
【００３４】ｃ）抗体価測定 血清中のＩｇＧ、ＩｇＡ及び唾液中のＩｇＡ抗体価は下
に示すＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。C) Measurement of antibody titer IgG, IgA in serum and IgA antibody titer in saliva were measured by the ELISA method shown below.
【００３５】［ＥＬＩＳＡ法］炭酸緩衝液(pH 9.4)に溶
解した 100μg/mlのＢＳＡをマイクロプレートの各ウエ
ルに50μl ずつ加え、４℃で一夜放置し抗原であるＢＳ
Ａをマイクロプレートに固定した後、0.05％のTween 20
を含むリン酸緩衝液(PBST) 100μl/wellで３回洗浄し余
分なＢＳＡを除去する。次に、３％スキムミルクでブロ
ッキングを行い、ＰＢＳＴで３回洗浄し余分なスキムミ
ルクを除去した後、マウスから採取した血清をＰＢＳＴ
で倍倍希釈したものを50μl/wellずつ加え、25℃で２時
間インキュベーションする。ＰＢＳＴ 100μl/wellで３
回洗浄して血清を除去し、500ng/mlの濃度の抗マウス抗
体ＩｇＧ、あるいはＩｇＡコンジュゲート・ホースラデ
イッシュ・パーオキシダーゼ50μl を各ウエルに加え、
２５℃で２時間インキュベーションする。ＰＢＳＴ 10
0 μl/well で３回洗浄し、余分な抗マウス抗体を除去
し、0.015 ％過酸化水素を含む2,2'-アジノ−ビス(3-エ
チルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）(500ng/ml)を50
μl/well加え、37℃で20分間インキュベーション後、マ
イクロプレートリーダーで405nm における吸光度を測定
する。抗体価(antibody titer)は、吸光度が血清では0.
2、唾液では0.1 を越える最大の希釈倍率を 2nとし、ｌ
ｏｇ22n で表す。[ELISA] 50 μl of 100 μg / ml BSA dissolved in a carbonate buffer (pH 9.4) was added to each well of the microplate, and the mixture was allowed to stand overnight at 4 ° C. as the antigen BS.
After fixing A to the microplate, 0.05% Tween 20
Excess BSA is removed by washing three times with 100 μl / well of phosphate buffer solution (PBST) containing After blocking with 3% skim milk and washing with PBST three times to remove excess skim milk, the serum collected from the mouse was PBST.
50 μl / well is added after doubling the dilution with and the mixture is incubated at 25 ° C for 2 hours. PBST 100 μl / well 3
The serum was removed by washing twice to add 50 μl of anti-mouse antibody IgG at a concentration of 500 ng / ml or IgA-conjugated horseradish peroxidase to each well,
Incubate at 25 ° C for 2 hours. PBST 10
Wash 3 times with 0 μl / well to remove excess anti-mouse antibody, 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) containing 0.015% hydrogen peroxide (500 ng / ml ) To 50
Add μl / well, incubate at 37 ℃ for 20 minutes, and measure the absorbance at 405 nm with a microplate reader. The antibody titer is 0 when the absorbance is serum.
2. For saliva, the maximum dilution ratio over 0.1 is 2n,
It is represented by og 2 2 n .
【００３６】ｄ）試験結果 表２に示すスケジュールで試験した時の血清中ＩｇＧ、
ＩｇＡ抗体価並びに唾液中のＩｇＡ抗体価を表３−１〜
４及び表４−１〜３に示す。試験例１の５日間連続投与
の場合（表３−１〜４）、対照例のＢＳＡ水溶液経口投
与群では血清中ＩｇＧ抗体価は若干の上昇傾向が認めら
れたものの、実施例の経口ワクチン投与群の方が明らか
にその抗体価の上昇は大きかった。また血清中ＩｇＡ抗
体価については、ＢＳＡ水溶液群では投与量を増加させ
ても全くその変化が認められなかったが、経口ワクチン
投与群では確実な抗体価の上昇を認めることができた。D) Test results IgG in serum when tested according to the schedule shown in Table 2,
Table 3-1 shows the IgA antibody titer and the IgA antibody titer in saliva.
4 and Tables 4-1 to 3-4. In the case of continuous administration for 5 days in Test Example 1 (Tables 3-1 to 4), although a slight increase in serum IgG antibody titer was observed in the BSA aqueous solution oral administration group of Control Example, oral vaccine administration of Example The increase in the antibody titer was obviously greater in the group. Regarding the IgA antibody titer in serum, no change was observed in the BSA aqueous solution group even when the dose was increased, but a reliable increase in the antibody titer could be observed in the oral vaccine administration group.
【００３７】[0037]
【表３】 [Table 3]
【００３８】[0038]
【表４】 [Table 4]
【００３９】[0039]
【表５】 [Table 5]
【００４０】[0040]
【表６】 [Table 6]
【００４１】試験例２の１週間ごと５回投与の場合（表
４−１〜３）の結果は以下の通りであった。即ち、対照
例のＢＳＡ水溶液経口投与群では、血清中ＩｇＧ抗体価
は試験例１と同様の若干の上昇傾向しか認められず、投
与方法に基づく差も特に認められなかった。これに対し
て、実施例のリポソーム経口投与群では、試験例２の投
与スケジュールの方が更にその抗体価が上昇する傾向が
認められ、対照のＢＳＡ水溶液群と比較して明らかに抗
体価が高かった。また血清中ＩｇＡ抗体価については、
ＢＳＡ水溶液群では、試験例１と同様、投与量を増加さ
せても全くその変化が認められなかったが、リポソーム
投与群では確実な抗体価の上昇を認めることができた。
唾液中ＩｇＡ抗体価についても、ＢＳＡ水溶液投与群に
比べ、明らかにリポソーム投与群の方が高い価が得られ
た。The results of Test Example 2 in which administration was performed 5 times per week (Tables 4-1 to 3) were as follows. That is, in the BSA aqueous solution oral administration group of the control example, the serum IgG antibody titer showed only a slight upward tendency similar to that of Test Example 1, and no particular difference was observed depending on the administration method. On the other hand, in the liposome oral administration group of Example, the antibody titer tended to further increase in the administration schedule of Test Example 2, and the antibody titer was clearly higher than that of the control BSA aqueous solution group. It was Regarding serum IgA antibody titer,
In the BSA aqueous solution group, similar to Test Example 1, no change was observed even when the dose was increased, but in the liposome administration group, a reliable increase in antibody titer could be observed.
Regarding the IgA antibody titer in saliva, the titer of the liposome administration group was obviously higher than that of the BSA aqueous solution administration group.
【００４２】[0042]
【表７】 [Table 7]
【００４３】[0043]
【表８】 [Table 8]
【００４４】[0044]
【表９】 [Table 9]
【００４５】以上から、モデル抗原として牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）を用いて製造された本発明のワクチン
は、経口投与することにより、生体に対して効率的に抗
体を産生せしめることが明らかとなった。From the above, it has been clarified that the vaccine of the present invention produced using bovine serum albumin (BSA) as a model antigen is capable of efficiently producing an antibody in a living body when orally administered. ..
【００４６】実施例５〜８： ａ）インフルエンザＨＡ抗原封入リポソーム型経口ワク
チンの調製 膜組成比がジステアロイルホスファチジルコリン(DSP
C)：水素添加ホスファチジルセリン(H-PS)：コレステロ
ール(Chol)＝1:1:2（モル比）からなる脂質160mgに、ク
ロロホルム：メタノール＝9:1混液を20ml加えて溶解
し、ロータリーエバポレーターを用いて37℃で加温しな
がら溶媒を留去する。更に真空下で２時間乾燥し、リピ
ドフィルムを調製する。これにリン酸緩衝化生理食塩液
（ＰＢＳ、pH7.4)に分散したそれぞれの濃度のインフル
エンザＨＡ抗原（表５参照）を4ml 加え、ボルテックス
ミキサーで10分間の撹拌を行い、多重層リポソーム(ML
V、multilamellar vesicle) を調製する。最終的には、
これらをＰＢＳにより3.5 倍希釈して、表５右に示すイ
ンフルエンザＨＡ抗原封入リポソーム型経口ワクチンと
する。Examples 5 to 8: a) Preparation of Influenza HA Antigen-Encapsulated Liposomal Oral Vaccine A membrane composition ratio of distearoylphosphatidylcholine (DSP) was used.
C): Hydrogenated phosphatidylserine (H-PS): Cholesterol (Chol) = 1: 1: 2 (molar ratio) To 160 mg of lipid, 20 ml of a mixture of chloroform: methanol = 9: 1 was added and dissolved. The solvent is distilled off while heating at 37 ° C. with. Further, it is dried under vacuum for 2 hours to prepare a lipid film. 4 ml of each concentration of influenza HA antigen (see Table 5) dispersed in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) was added to this, and the mixture was stirred for 10 minutes with a vortex mixer to form multilamellar liposomes (ML).
V, multilamellar vesicles) are prepared. Eventually,
These are diluted 3.5 times with PBS to obtain the influenza HA antigen-encapsulated liposome oral vaccine shown on the right of Table 5.
【００４７】[0047]
【表１０】 [Table 10]
【００４８】最終リポソーム懸濁液：DSPC/H-PS/Chol＝
54.4/51.2/54.4 (mg) マウス１匹あたり１回0.5ml 投与するので、脂質投与量
は10μmol 、ＨＡ抗原投与量は10μg （実施例５）〜80
μg （実施例８）となる。Final liposome suspension: DSPC / H-PS / Chol =
54.4 / 51.2 / 54.4 (mg) Since 0.5 ml is administered once per mouse, the lipid dose is 10 μmol and the HA antigen dose is 10 μg (Example 5) -80
μg (Example 8).
【００４９】ｂ）免疫試験 調製したインフルエンザＨＡ抗原入リポソーム懸濁液も
しくは対照例としてのＨＡ抗原単独のＰＢＳ液（ＨＡ抗
原投与量をリポソーム群と一致させる）を表６に示すス
ケジュールに従い、胃ゾンデ用いてＢＡＬＢ／ｃマウス
（雄、７週齢に１回あたり0.5ml ずつ経口投与する（１
群６匹）。血中及び唾液中の抗体価を測定するために、
血液は眼窩採血により採取し、唾液は、マウスに12mg/l
のペントバルビタールを0.1ml 腹腔内投与して麻酔し、
0.2mg/mlピロカルピンを腹腔内投与した後、パスツール
ピペットを口内に挿入し採取する。B) Immunization test A prepared influenza HA antigen-containing liposome suspension or a control HA antigen alone PBS solution (HA antigen dose is matched with liposome group) was prepared according to the schedule shown in Table 6 and the stomach tube was used. Using BALB / c mice (male, 0.5 ml is orally administered once every 7 weeks (1
Group 6). To measure the antibody titer in blood and saliva,
Blood was collected by orbital blood sampling and saliva was applied to mice at 12 mg / l.
Anesthetized with 0.1 ml of pentobarbital
After intraperitoneally administering 0.2 mg / ml pilocarpine, a Pasteur pipette is inserted into the mouth and collected.
【００５０】[0050]
【表１１】 試験例３のＨＡ抗原投与量：10、20、40、80 μg/１回／マ
ウス[Table 11] HA antigen dose of Test Example 3: 10, 20, 40, 80 μg / once / mouse
【００５１】ｃ）抗体価測定 血清中のＩｇＧ、ＩｇＡ及び分泌型のＩｇＡ抗体価の測
定は、ＢＳＡ封入リポソーム型ワクチンの場合と同様に
行い、ＨＡ抗原封入リポソームの抗体価の上昇が優れて
いることが認められる。C) Measurement of antibody titer IgG, IgA and secretory IgA antibody titers in serum are measured in the same manner as in the case of BSA-encapsulated liposome type vaccine, and the increase in antibody titer of HA antigen-encapsulated liposome is excellent. Is recognized.
【００５２】実施例９〜１１： ａ）インフルエンザウイルス抗原またはＢ型肝炎ウイル
ス抗原封入リポソーム型経口ワクチンの調製 ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)19.3mg、コ
レステロール(Chol)19.3mgおよび水素添加大豆ホスファ
チジルセリン(HSPS) 18.2mg にクロロホルム：メタノー
ル混液(9:1 体積比) を50ml加えて溶解し、ロータリー
エバポレーターを用いて50℃に加温しながら溶媒を留去
した。次いで真空下で２時間乾燥しリピドフィルムを調
製した。これにリン酸緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ）に懸
濁した抗原（表７参照）を 2ml加え、ボルテックスミキ
サーで50℃、10分間撹拌した。これを50℃に加温しつ
つ、孔径0.6 μのポリカーボネート製メンブランフィル
ターで２回加温濾過し、多重層リポソームを調製した。Examples 9 to 11: a) Preparation of liposomal oral vaccine containing influenza virus antigen or hepatitis B virus antigen Distearoylphosphatidylcholine (DSPC) 19.3 mg, cholesterol (Chol) 19.3 mg and hydrogenated soybean phosphatidylserine (HSPS) ) To 18.2 mg, 50 ml of a chloroform: methanol mixed solution (9: 1 volume ratio) was added and dissolved, and the solvent was distilled off while heating to 50 ° C using a rotary evaporator. Then, it was dried under vacuum for 2 hours to prepare a lipid film. To this, 2 ml of the antigen (see Table 7) suspended in phosphate buffered saline (PBS) was added, and the mixture was stirred with a vortex mixer at 50 ° C for 10 minutes. While heating this at 50 ° C., it was filtered by heating twice with a polycarbonate membrane filter having a pore size of 0.6 μm to prepare multilamellar liposomes.
【００５３】[0053]
【表１２】 [Table 12]
【００５４】得られたリポソーム型経口ワクチンの粒子
径を準弾性光散乱法（ダイナミック光散乱計DLS-700、
大塚電子株式会社製）により測定した。結果を表８に示
す。抗原蛋白の不在下で調製したリポソームを対照例と
した。The particle size of the obtained liposomal oral vaccine was determined by the quasi-elastic light scattering method (dynamic light scattering meter DLS-700,
Otsuka Electronics Co., Ltd.). The results are shown in Table 8. A liposome prepared in the absence of the antigen protein was used as a control.
【００５５】[0055]
【表１３】 [Table 13]
【００５６】これらの経口ワクチンの形態をネガティブ
染色法により染色し、透過型電子顕微鏡観察を行った。
実施例と対照例ともリポソームとしての形態をしている
ことを確認した。The forms of these oral vaccines were stained by the negative staining method and observed with a transmission electron microscope.
It was confirmed that both Examples and Controls were in the form of liposomes.
【００５７】ホスファチジルセリンとして、水素添加卵
黄ホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジ
ルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパ
ルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホス
ファチジルセリンもしくは牛脳由来のホスファチジルセ
リンを用いた経口ワクチンも同様に調製できる。An oral vaccine using hydrogenated egg yolk phosphatidylserine, dimyristoylphosphatidylserine, dimyristoylphosphatidylserine, dipalmitoylphosphatidylserine, distearoylphosphatidylserine or bovine brain-derived phosphatidylserine can be similarly prepared as phosphatidylserine.
【００５８】実施例１２：4-0-(6-O-エイコサノイル-
β-D- マンノピラノシル)-D-マンノピラノース 6.4mg、
ジステアロイルホスファチジルコリン 32.0mg、コレステ
ロール 19.3mg、ジセチルホスフェート 5.5mgを、抗原と
してA/PR/8(H1N1)由来のインフルエンザウイルス不活化
抗原(2mg/ml)を2ml 用いて実施例９と同様にして多重層
リポソームを調製した。Example 12: 4-0- (6-O-eicosanoyl-
β-D-mannopyranosyl) -D-mannopyranose 6.4 mg,
Distearoylphosphatidylcholine 32.0 mg, cholesterol 19.3 mg, dicetyl phosphate 5.5 mg were used in the same manner as in Example 9 using 2 ml of A / PR / 8 (H1N1) -derived influenza virus inactivating antigen (2 mg / ml). Multilamellar liposomes were prepared.
【００５９】実施例１３：膜成分にマンナン誘導体を含
有する経口ワクチンの調製 ジステアロイルホスファチジルコリン32.0mg、コレステ
ロール19.3mgおよびジセチルリン酸5.5mg を、抗原とし
てA/PR/8(H1N1)由来のインフルエンザウイルス不活化抗
原(2mg/ml)を2ml 用いて実施例９と同様にして多重層リ
ポソームを調製した。Example 13 Preparation of Oral Vaccine Containing Mannan Derivative in Membrane Component Distearoylphosphatidylcholine 32.0 mg, cholesterol 19.3 mg and dicetylphosphate 5.5 mg were used as antigens for influenza virus A / PR / 8 (H1N1) -derived influenza virus. Multilayer liposomes were prepared in the same manner as in Example 9 using 2 ml of the activated antigen (2 mg / ml).
【００６０】ＰＢＳ10mlにN-(2-N'-コレステリルカルボ
キシアミノメチル）カルボキシメチルマンナン 10.0mg
を溶解し、これを上記のリポソーム懸濁液に加え、液温
を20℃に保ちながら２時間攪拌し、膜成分にマンナン誘
導体を含有するリポソーム型経口ワクチンを得た。10.0 mg of N- (2-N'-cholesterylcarboxyaminomethyl) carboxymethylmannan in 10 ml of PBS
Was dissolved and added to the above-mentioned liposome suspension and stirred for 2 hours while maintaining the liquid temperature at 20 ° C. to obtain a liposomal oral vaccine containing a mannan derivative as a membrane component.
【００６１】実施例１２および１３で得た経口ワクチン
の粒子径を前記と同様にして測定した。重量平均粒子径
±標準偏差(nm)は実施例１２が443.7 ±208 (nm)実施例
１３が450.7 ±211 (nm)であった。また、透過型電子顕
微鏡観察を同様に行ってリポソームとしての形態を取っ
ていることを確認した。The particle size of the oral vaccines obtained in Examples 12 and 13 was measured in the same manner as described above. The weight average particle diameter ± standard deviation (nm) was 443.7 ± 208 (nm) in Example 12 and 450.7 ± 211 (nm) in Example 13. In addition, it was confirmed that the cells were in the form of liposomes by the same observation with a transmission electron microscope.
【００６２】マンノース誘導体として、マンノース残基
を有するホスファチジルエタノールアミンの誘導体、マ
ンノース残基を有するコレステロールの誘導体、ジマン
ノシルジグリセリド、ホスファチジルマンノースを用い
る経口ワクチンも同様に調製できる。As a mannose derivative, an oral vaccine using a phosphatidylethanolamine derivative having a mannose residue, a cholesterol derivative having a mannose residue, dimannosyl diglyceride, or phosphatidyl mannose can be similarly prepared.
【００６３】実施例１４：膜成分にマンノース誘導体ま
たはマンナン誘導体およびホスファチジルセリンを含有
する経口ワクチンの調製 水素添加大豆ホスファチジルセリン20.0mg、ジステアロ
イルホスファチジルコリン20.0mgおよびコレステロール
19.3mgを用いて実施例９と同様にして多重層リポソーム
を製した。Example 14: Preparation of oral vaccine containing mannose derivative or mannan derivative and phosphatidylserine as membrane components Hydrogenated soybean phosphatidylserine 20.0 mg, distearoylphosphatidylcholine 20.0 mg and cholesterol
Multilayer liposomes were produced in the same manner as in Example 9 using 19.3 mg.
【００６４】N-(2-N'-コレステリルカルボキシメチル）
カルバミルメチルマンナン10.0mgをＰＢＳ 10 mlに溶解
し、これを上記のリポソーム懸濁液中に添加し、液温を
20℃に保ちながら、２時間撹拌し経口ワクチンを得た。N- (2-N'-cholesteryl carboxymethyl)
Dissolve 10.0 mg of carbamylmethylmannan in 10 ml of PBS, add this to the above-mentioned liposome suspension, and adjust the liquid temperature.
While maintaining the temperature at 20 ° C., the mixture was stirred for 2 hours to obtain an oral vaccine.
【００６５】得た経口ワクチンの重量平均粒子径±標準
偏差は476.9 ±206 (nm)であった。また、透過型電子顕
微鏡観察によりリポソームとしての形態を取っているこ
とを確認した。The weight average particle diameter ± standard deviation of the obtained oral vaccine was 476.9 ± 206 (nm). Further, it was confirmed by transmission electron microscope observation that it was in the form of a liposome.
【００６６】実施例１５： ａ）アジュバント物質を添加した経口ワクチンの調製 (6-O-(2-テトラデシルヘキサデカノイル)-N-アセチルム
ラモイル)-L-アラニル-D-グルタミン 10mg 、水素添加
大豆ホスファチジルセリン20.0mg、ジステアロイルホス
ファチジルコリン20.0mgおよびコレステロール19.3mgを
実施例９と同様に処理し多重層リポソームを調製した。
重量平均粒子径±標準偏差は461.2 ±210 (nm)であっ
た。また、透過型電子顕微鏡観察によりリポソームとし
ての形態を取っていることを確認した。Example 15: a) Preparation of an oral vaccine supplemented with adjuvant substances (6-O- (2-tetradecylhexadecanoyl) -N-acetylmuramoyl) -L-alanyl-D-glutamine 10 mg, hydrogen The added soybean phosphatidylserine (20.0 mg), distearoylphosphatidylcholine (20.0 mg) and cholesterol (19.3 mg) were treated in the same manner as in Example 9 to prepare multilamellar liposomes.
The weight average particle diameter ± standard deviation was 461.2 ± 210 (nm). Further, it was confirmed by transmission electron microscope observation that it was in the form of a liposome.
【００６７】アジュバント物質として、(6-O-(2-テトラ
デシルヘキサデカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-ア
ラニル-D-グルタムアミドおよびN2-[N-アセチルムラモ
イル)-L-アラニル-D-イソグルタミニール]-N6-ステアロ
イル-L-リジンを用いて同様に経口ワクチンを調製でき
る。As adjuvant substances, (6-O- (2-tetradecylhexadecanoyl) -N-acetylmuramoyl) -L-alanyl-D-glutamamide and N 2- [N-acetylmuramoyl) -L- An oral vaccine can be similarly prepared using alanyl-D-isoglutaminyl] -N 6 -stearoyl-L-lysine.
【００６８】ｂ）免疫試験 実施例９で得たインフルエンザウイルス不活化抗原(ina
ctivated whole virusparticles、0.05%ホルマリンで固
定）入りリポソーム懸濁液を表９に示すスケジュールに
従い、マウス用胃ゾンデを用いてBALB/cCr Slcマウス
（雌、７週齢）に１回あたり0.2ml ずつ経口投与した
（１群５匹）。免疫投与開始３週後（21または22日）に
各群のマウスから血清および腸管洗浄液を採取し、それ
らの投与した抗原に特異的なＩｇＧおよびＩｇＡ抗体価
をＥＬＩＳＡを用いて測定した。B) Immunological test Influenza virus inactivating antigen (ina) obtained in Example 9
The liposome suspension containing ctivated whole virus particles (fixed with 0.05% formalin) was orally administered to BALB / cCr Slc mice (female, 7 weeks old) 0.2 ml each time according to the schedule shown in Table 9 using a gastric tube for mice. It was administered (5 animals per group). Three weeks after the start of immunization (21 or 22 days), serum and intestinal lavage fluid were collected from each group of mice, and IgG and IgA antibody titers specific to the administered antigens were measured by ELISA.
【００６９】血清および腸管洗浄液の調製は以下の手
順、手法を用いた。エーテル麻酔下、マウスの腋下静脈
を切断し採血した。得た血液は3000rpm で10分間遠心し
て血清分離し、抗体測定に供した。採血後、同一マウス
を開腹し、腸を摘出し、回腸と盲腸の結合部で腸を切断
した。胃、十二指腸結合部から25針付き注射筒(10ml
用) でサンプリング液(ELISAmate: ＫＰＬ社のDiluent/
BlokingSolution) 5ml をゆっくり注入し、回腸末端部
から出てくる腸管洗浄液をシャーレに受けた。その洗浄
液を2000rpm で10分間遠心後、上清を抗体測定に供し
た。各サンプルは測定時まで-20 ℃に保存した。The following procedures and procedures were used for the preparation of serum and intestinal lavage fluid. Under ether anesthesia, the axillary vein of the mouse was cut to collect blood. The obtained blood was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to separate serum, and the blood was subjected to antibody measurement. After blood collection, the same mouse was subjected to laparotomy, the intestine was extracted, and the intestine was cut at the junction between the ileum and the cecum. Syringe with 25 needles (10 ml from stomach, duodenum junction)
Sampling liquid (ELISAmate: KPL Diluent /
Bloking Solution) (5 ml) was slowly injected, and the intestinal lavage fluid coming out from the terminal ileum was received in a petri dish. The washing solution was centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was subjected to antibody measurement. Each sample was stored at -20 ° C until the time of measurement.
【００７０】[0070]
【表１４】 [Table 14]
【００７１】ｃ）抗体価測定 血清中および腸管洗浄液の、投与した抗原に特異的なＩ
ｇＧおよびＩｇＡ抗体価測定は、ＫＰＬ社 (Kirlegaard
& Perry Lab.Inc.)のＥＬＩＳＡ測定用キット(ELISAma
te) を用い、そのプロトコールに記載してある方法に準
じておこなった。C) Measurement of antibody titer I specific to the administered antigen in serum and intestinal lavage fluid
The antibody titers for gG and IgA were measured by KPL (Kirlegaard
& Perry Lab. Inc.) ELISA measurement kit (ELISAma
te) was used according to the method described in the protocol.
【００７２】その結果、血清中に抗原に特異的なＩg
Ａ、Ｉg Ｇの産生が、腸管洗浄液中にＩg Ａの産生が認
められた。As a result, Ig specific to the antigen was found in serum.
The production of A and IgG was found, and the production of IgG was found in the intestinal lavage fluid.
【００７３】［ＥＬＩＳＡ法］コーティング緩衝液に溶
解した2.5 μg/mlの抗原を96穴マイクロプレートの各ウ
エルに50μlずつ加え、室温で１時間静置し、抗原をマ
イクロプレートに固定する。各ウエルの液を捨て、ペー
パータオル上でプレートを良くはたいて完全に液を除去
した後、ブロッキング液100 μl ずつを各ウエルに加
え、室温で５分間静置する。ウエルの液を除去後、マウ
スから調製した、血清および腸管洗浄液の２倍段階希釈
液各50μl ずつを各ウエルに加え、室温で１時間静置す
る。ウエルの液を除去後、洗浄液 200〜300 μl で４回
洗浄を繰り返す。ウエルの液を除去後、ペルオキシダー
ゼ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体あるいはペルオキシダ
ーゼ標識抗マウスＩｇＡ（α）抗体の200 倍希釈液、50
μl ずつを各ウエルに加え、室温で１時間静置する。ウ
エルの液を除去し、 200〜300 μl の洗浄液で４回洗浄
後、洗浄液でウエルを満たし、室温でさらに５分間静置
する。ウエルの液を除去後、ペルオキシダーゼ基質溶液
50μl ずつを各ウエルに加え、室温で20分静置後、ペル
オキシダーゼ反応停止液50μl ずつを各ウエルに加えて
反応を停止し、プレートミキサーで撹拌する。各ウエル
の405nm における吸光度をELISA READER(Multiskan PLU
S: Titertek社）で測定する。抗体価は、同時に測定す
る標準サンプル（抗体価が既知のサンプル) の各希釈で
の吸光度を式１に示すlogit-log変換式でＹを求め、縦
軸にlogit Y を横軸に抗体価の対数値をプロットし、標
準直線を引き、その標準直線を基に、 各サンプルの抗体
価を算出する。[ELISA method] 50 μl of 2.5 μg / ml antigen dissolved in a coating buffer was added to each well of a 96-well microplate, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour to immobilize the antigen on the microplate. After discarding the solution in each well and thoroughly removing the solution by thoroughly striking the plate on a paper towel, 100 μl of blocking solution is added to each well and left at room temperature for 5 minutes. After removing the solution from the wells, 50 μl each of 2-fold serial dilutions of serum and intestinal lavage solution prepared from mice are added to each well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After removing the well solution, repeat washing 4 times with 200-300 μl of washing solution. After removing the liquid from the wells, a 200-fold diluted solution of peroxidase-labeled anti-mouse IgG (γ) antibody or peroxidase-labeled anti-mouse IgA (α) antibody, 50
Add 1 μl of each to each well and incubate at room temperature for 1 hour. After removing the solution from the wells, the wells are washed four times with 200 to 300 μl of the washing solution, the wells are filled with the washing solution, and the plate is allowed to stand at room temperature for 5 minutes. After removing the well solution, peroxidase substrate solution
Add 50 μl each to each well, leave it at room temperature for 20 minutes, add 50 μl peroxidase reaction stop solution to each well to stop the reaction, and stir with a plate mixer. The absorbance at 405 nm of each well was measured by ELISA READER (Multiskan PLU
S: Titertek). For the antibody titer, the absorbance at each dilution of a standard sample (sample whose antibody titer is known) to be measured at the same time is calculated by the logit-log conversion formula shown in Equation 1, and Y is obtained. Plot the logarithmic values, draw a standard line, and calculate the antibody titer of each sample based on the standard line.
【００７４】[0074]
【式１】 [Formula 1]
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 47/24 Ｄ 7433−4Ｃ 47/36 Ｄ 7433−4Ｃ (72)発明者 菊池 寛 東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号 第 一製薬株式会社東京研究開発センタ−内 (72)発明者 谷内 清人 東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号 第 一製薬株式会社東京研究開発センタ−内 (72)発明者 池内 澄 東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号 第 一製薬株式会社東京研究開発センタ−内Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification number Office reference number FI Technical display location A61K 47/24 D 7433-4C 47/36 D 7433-4C (72) Inventor Hiroshi Kikuchi Kita Kasai, Edogawa-ku, Tokyo 1-16-13 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Tokyo Research and Development Center (72) Inventor Kiyoto Yani 1-16-13 Kitakasai, Edogawa-ku, Tokyo Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Tokyo Research and Development Center (72) ) Inventor Sumi Ikeuchi 1-16-13 Kita Kasai, Edogawa-ku, Tokyo Dai-ichi Pharmaceutical Co., Ltd. Tokyo R & D Center
Claims (34)
質としてマンノースを結合している糖脂質および／また
はホスファチジルセリンである燐脂質を含んでいること
を特徴とする経口投与用ワクチン1. A vaccine for oral administration, which is a complex consisting of an antigen and a lipid, and contains a glycolipid having mannose bound thereto as a lipid and / or a phospholipid which is phosphatidylserine.
経口投与用ワクチン2. The vaccine for oral administration according to claim 1, wherein the complex is a lipid membrane structure.
２の経口投与用ワクチン3. The vaccine for oral administration according to claim 2, wherein the lipid membrane structure is a liposome.
項２の経口投与用ワクチン4. The vaccine for oral administration according to claim 2, wherein the lipid membrane structure is an emulsion.
経口投与用ワクチン5. The vaccine for oral administration according to claim 2, wherein the lipid membrane structure is a micelle.
0-(6-O-エイコサノイル-β-D-マンノピラノシル)-D-マ
ンノピラノースまたはN-(2-N'-コレステリルカルボキシ
メチル）カルバミルメチルマンナンである請求項１乃至
請求項５の経口投与用ワクチン6. The mannose-bonded glycolipid is 4-
Oral administration of claim 1 to claim 5, which is 0- (6-O-eicosanoyl-β-D-mannopyranosyl) -D-mannopyranose or N- (2-N'-cholesterylcarboxymethyl) carbamylmethylmannan. Vaccine
糖脂質および／またはホスファチジルセリンである燐脂
質のほかに更に他の脂質を含有することを特徴とする請
求項２乃至請求項６の経口投与用ワクチン7. Oral administration according to claims 2 to 6, characterized in that, in addition to the glycolipid binding mannose and / or the phospholipid which is phosphatidylserine as a membrane component, another lipid is further contained. Vaccine
ホスファチジルコリン、水素添加ホスファチジルコリ
ン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミト
イルホスファチジルコリンまたはジステアロイルホスフ
ァチジルコリンであるホスファチジルコリン類および／
または荷電脂質類および／またはスフィンゴミエリン類
である請求項７の経口投与用ワクチン8. A phosphatidylcholine in which other lipid is phosphatidylcholine derived from soybean or egg yolk, hydrogenated phosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine or distearoylphosphatidylcholine and / or
Or a vaccine for oral administration according to claim 7, which is a charged lipid and / or a sphingomyelin.
は請求項８の経口投与用ワクチン9. The vaccine for oral administration according to claim 7, wherein the other lipid is a charged lipid.
ジアシルホスファチジン酸、ステアリルアミン、ホスフ
ァチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、
ホスファチジルエタノールアミンまたはイオン性界面活
性化剤である請求項９の経口投与用ワクチン10. The charged lipid is a dialkyl phosphate,
Diacylphosphatidic acid, stearylamine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol,
The vaccine for oral administration according to claim 9, which is a phosphatidylethanolamine or an ionic surfactant.
ン、卵黄由来ホスファチジルコリン、水素添加ホスファ
チジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンも
しくはジパルミトイルホスファチジルコリン、およびホ
スファチジルセリン、場合によっては更にコレステロー
ルである請求項１乃至請求項１０の経口投与用ワクチン11. A vaccine for oral administration according to claim 1, wherein the lipid is soybean-derived phosphatidylcholine, egg yolk-derived phosphatidylcholine, hydrogenated phosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine or dipalmitoylphosphatidylcholine, and phosphatidylserine, and optionally cholesterol.
生物である請求項１乃至請求項１１の経口投与用ワクチ
ン12. The vaccine for oral administration according to claim 1, wherein the antigen is a microbial antigen or an attenuated microorganism.
Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原またはＣ
型肝炎ウイルス抗原である請求項１乃至請求項１２の経
口投与用ワクチン13. The antigen is an influenza virus antigen,
Hepatitis A virus antigen, hepatitis B virus antigen or C
The vaccine for oral administration according to claim 1, which is a hepatitis C virus antigen.
である請求項１乃至請求項１３の経口投与用ワクチン14. The vaccine for oral administration according to claim 1, wherein the antigen is influenza hemagglutinin.
が添加された請求項１乃至請求項１４の経口投与用ワク
チン15. The vaccine for oral administration according to claim 1, further comprising an adjuvant substance in addition to the antigen and the lipid.
ド（ＭＤＰ）の誘導体であるる請求項１５の経口投与用
ワクチン16. The vaccine for oral administration according to claim 15, wherein the adjuvant substance is a derivative of muramyl dipeptide (MDP).
モイル)-L-アラニル-D-イソグルタミン、6-O-(2-テトラ
デシルヘキサデカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-ア
ラニル-D-イソグルタミン、6-O-(2-テトラデシルヘキサ
デカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-アラニル-D-グ
ルタムアミドまたはN2-[(N- アセチルムラモイル)-L-ア
ラニル-D-イソグルタミニール]-N6-ステアロイル-L-リ
ジンである請求項１５乃至請求項１６の経口投与用ワク
チン17. The adjuvant substance is (N-acetylmuramoyl) -L-alanyl-D-isoglutamine, 6-O- (2-tetradecylhexadecanoyl) -N-acetylmuramoyl) -L-alanyl- D-isoglutamine, 6-O- (2-tetradecylhexadecanoyl) -N-acetylmuramoyl) -L-alanyl-D-glutamamide or N 2 -[(N-acetylmuramoyl) -L-alanyl- D-isoglutaminyl] -N 6 -stearoyl-L-lysine. The vaccine for oral administration according to claims 15 to 16.
脂質としてマンノースを結合している糖脂質および／ま
たはホスファチジルセリンである燐脂質を含んでいる経
口投与用ワクチンを経口投与し、投与された個体の免疫
性を上げる方法18. A complex comprising an antigen and a lipid,
A method for orally administering a vaccine for oral administration containing a glycolipid having mannose bound thereto as a lipid and / or a phospholipid that is phosphatidylserine, and increasing the immunity of the administered individual
８の方法19. The complex is a lipid membrane structure.
8 ways
項１８の方法20. The method of claim 18, wherein the lipid membrane structure is a liposome.
求項１８の方法21. The method of claim 18, wherein the lipid membrane structure is an emulsion.
８の方法22. The lipid membrane structure is a micelle.
8 ways
4-0-(6-O-エイコサノイル-β-D-マンノピラノシル)-D-
マンノピラノースまたはN-(2-N'-コレステリルカルボキ
シメチル）カルバミルメチルマンナンである請求項１８
乃至請求項２２の方法23. The glycolipid having mannose bound thereto,
4-0- (6-O-Eicosanoyl-β-D-mannopyranosyl) -D-
19. Mannopyranose or N- (2-N'-cholesterylcarboxymethyl) carbamylmethylmannan.
To the method of claim 22
る糖脂質および／またはホスファチジルセリンである燐
脂質のほかに更に他の脂質を含有する脂質膜構造体であ
る請求項１８乃至請求項２３の方法24. The method according to claim 18, which is a lipid membrane structure further containing another lipid in addition to the glycolipid having mannose bound thereto as a membrane component and / or the phospholipid which is phosphatidylserine.
リン、卵黄由来のホスファチジルコリン、水素添加ホス
ファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリ
ン、ジパルミトイルホスファチジルコリンまたはジステ
アロイルホスファチジルコリンであるホスファチジルコ
リン類および／または荷電脂質類および／またはスフィ
ンゴミエリン類である請求項２４の方法25. Phosphatidylcholines and / or charged lipids and / or sphingomyelins in which other lipids are soybean-derived phosphatidylcholine, egg yolk-derived phosphatidylcholine, hydrogenated phosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine or distearoylphosphatidylcholine and / or charged lipids and / or sphingomyelins. The method of claim 24, wherein
または請求項２５の方法26. The other lipid is a charged lipid.
Or the method of claim 25
ジアシルホスファチジン酸、ステアリルアミン、ホスフ
ァチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、
ホスファチジルエタノールアミンまたはイオン性界面活
性化剤である請求項２５または請求項２６の方法27. The charged lipid is a dialkyl phosphate,
Diacylphosphatidic acid, stearylamine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol,
27. The method of claim 25 or claim 26 which is a phosphatidylethanolamine or an ionic surfactant.
ン、卵黄由来ホスファチジルコリン、水素添加ホスファ
チジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンも
しくはジパルミトイルホスファチジルコリン、およびホ
スファチジルセリン、場合によっては更にコレステロー
ルである請求項１８または請求項１９の方法28. The method according to claim 18 or 19, wherein the lipid is soybean-derived phosphatidylcholine, egg yolk-derived phosphatidylcholine, hydrogenated phosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine or dipalmitoylphosphatidylcholine, and phosphatidylserine, optionally further cholesterol.
生物である請求項１８乃至請求項２８の方法29. The method according to claim 18, wherein the antigen is a microbial antigen or an attenuated microorganism.
Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原またはＣ
型肝炎ウイルス抗原である請求項１８乃至請求項２９の
方法30. The antigen is an influenza virus antigen,
Hepatitis A virus antigen, hepatitis B virus antigen or C
30. The method according to claim 18 to 29, which is a hepatitis C virus antigen.
である請求項１８乃至請求項３０の方法31. The method according to claim 18, wherein the antigen is influenza hemagglutinin.
が添加されている請求項１８乃至請求項３１の方法32. The method according to claim 18, wherein an adjuvant substance is added in addition to the antigen and the lipid.
チド（ＭＤＰ）の誘導体であるる請求項３２の方法33. The method of claim 32, wherein the adjuvant substance is a derivative of muramyl dipeptide (MDP).
モイル)-L-アラニル-D-イソグルタミン、6-O-(2-テトラ
デシルヘキサデカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-ア
ラニル-D-イソグルタミン、6-O-(2- テトラデシルヘキ
サデカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-アラニル-D-
グルタムアミドまたはN2-[(N-アセチルムラモイル)-L-
アラニル-D-イソグルタミニール]-N6-ステアロイル-L-
リジンである請求項３２乃至請求項３３の方法34. The adjuvant substance is (N-acetylmuramoyl) -L-alanyl-D-isoglutamine, 6-O- (2-tetradecylhexadecanoyl) -N-acetylmuramoyl) -L-alanyl- D-isoglutamine, 6-O- (2-tetradecylhexadecanoyl) -N-acetylmuramoyl) -L-alanyl-D-
Glutamamide or N 2 -[(N-acetylmuramoyl) -L-
Alanyl-D-isoglutaminyl] -N 6 -Stearoyl-L-
34. The method of claims 32 to 33 which is lysine.
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040706 |