JPH05317086A - カンジダ・アルビカンスの抗菌糸型抗体及び抗酵母型抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 〔構成〕菌糸型のカンジダ・アルビカンスに特異的に反
応するモノクローナル抗体、及び酵母型のカンジダ・ア
ルビカンスに特異的に反応するモノクローナル抗体、並
びに該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
酵母型カンジダ・アルビカンスに特異的に反応するモノ
クローナル抗体としてＹＳＴ−１及びＹＳＴ−２、菌糸
型カンジダ・アルビカンスに特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体としてＭＬＴ−１及びＭＬＴ−２が例示され
る。 〔効果〕カンジダ・アルビカンスによる感染の診断が迅
速かつ正確に行えるので有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、菌糸型のカンジダ・ア
ルビカンスに特異的に反応する抗菌糸型モノクローナル
抗体、酵母型のカンジダ・アルビカンスに特異的に反応
する抗酵母型モノクローナル抗体、及び該モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマに関する。

【従来の技術】近年、抗生物質の普及により細菌による
感染症は減少傾向にある。しかし、深在性真菌症に有効
な抗生物質が少ないために真菌による疾患は増加しつつ
あるのが現状である。このため、真菌の迅速な検出と同
定による真菌症の早期診断が臨床上重要である。カンジ
ダ・アルビカンスは、深在性真菌症の起因菌として最も
高率に分離される真菌であるが、血液培養や病理組織学
的検査によってはカンジダ・アルビカンス等の真菌は効
率よく検出できないので、免疫血清学的方法の開発が望
まれていた。

【０００２】現在利用できる血清学的検出法としては、
抗体、代謝物、又は抗原を検出する方法がある。例え
ば、抗体を検出する方法としてＨＡテスト（ロシュ）等
が知られている。しかし、抗体産生までに潜伏期がある
ので初期の感染が検出できず、宿主が免疫低下した状態
にあるため抗体産生量が少なく検出が非常に困難である
という問題があった。また、代謝物を検出する方法とし
ては、LABOFIT(ナカライテスク) 等のＤ−アラビニトー
ルを測定する方法や、エンドスペシー（生化学工業）等
の（１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定するリムルステ
ストが知られている。さらに、抗原を検出する方法とし
ては、ラテックス凝集反応を用いた CAND-TEC(Ramco)等
が知られている。しかし、カンジダ・アルビカンスは常
在菌であり、健常者においても代謝物および自然抗体が
高率で検出されるという根本的な問題を有していた（臨
床検査、３５巻、８０５−８５９頁、１９９１年）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、カン
ジダ・アルビカンスによる感染を効率良く検出する手段
を提供することを目的とするものである。

【課題を解決するための手段】カンジダ・アルビカンス
は二形性をとり一般的には酵母型として常在するが、内
臓での生育形態は菌糸型である。このため、菌糸型のカ
ンジダ・アルビカンスに特異的に反応するモノクローナ
ル抗体、及び酵母型のカンジダ・アルビカンスに特異的
に反応するモノクローナル抗体を得て、真菌症係数＝
（抗菌糸型モノクローナル抗体による測定値）／（抗酵
母型モノクローナル抗体による測定値）を算出すれば、
カンジダ・アルビカンスによる感染の診断に有用である
ことが期待される。そこで、本発明者は、菌糸型のカン
ジダ・アルビカンス菌体、及び酵母型のカンジダ・アル
ビカンス菌体を抗原として用い、それぞれの抗原に特異
的に反応するモノクローナル抗体を得て、本発明を完成
した。即ち、本発明は、菌糸型のカンジダ・アルビカン
スに特異的に反応するモノクローナル抗体、及び酵母型
のカンジダ・アルビカンスに特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体を提供するものである。また、該モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマも提供される。

【０００４】以下に、本発明を詳細に説明する。本発明
のモノクローナル抗体の製造に使用する菌糸型のカンジ
ダ・アルビカンス菌体は、ポリペプトン、グルコースを
含むＤＳ培地にカンジダ・アルビカンスを接種して２日
間培養することにより調製すればよい。また、酵母型の
カンジダ・アルビカンス菌体は、ポリペプトン、グルコ
ース、イーストエキスを含むＹＥＰＧ培地にカンジダ・
アルビカンスを接種して１日間培養することにより調製
すればよい。抗体産生細胞を得るには、上記の様にして
得られる菌糸型のカンジダ・アルビカンス菌体、及び酵
母型のカンジダ・アルビカンス菌体をそれぞれ菌体懸濁
液として調製し、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウ
マ、ウシ等に接種してこれらの動物を免疫すればよい。
また免疫に際して完全フロイントアジュバント等のアジ
ュバントを使用してもよい。完全フロイントアジュバン
トを使用する場合には該カンジダ・アルビカンス菌体懸
濁液と該アジュバントを１：１−１：１０、好ましくは
約１：１の容量比で使用して、該カンジダ・アルビカン
ス菌体が５×１０⁶ −１×１０⁸ 細胞／ml、好ましくは
２×１０⁷ 細胞／mlとなるように、例えば、約0.２５−
0.５Ｍ食塩水に懸濁して抗原懸濁液を調製することがで
きる。

【０００５】上記の抗原懸濁液を被免疫動物に接種する
ことにより、それぞれ菌糸型または酵母型のカンジダ・
アルビカンス菌体を抗原として免疫された動物が得られ
る。例えばマウスを免疫する場合には、上記の抗原懸濁
液を、１−２週間隔で１−３回、好ましくは２−３回に
わたり、例えば、腹腔内投与することにより効率よくマ
ウスを免疫することができる。上記の様にして得られた
免疫動物から、脾細胞等の抗体産生細胞を分離すること
により、抗体産生細胞を得ることができる。例えば、脾
細胞を抗体産生細胞として使用する場合には、脾臓を摘
出した後に、例えば、ＮＳ−１培地で洗浄し、同培地内
で脾臓を切断し、ステンレスメッシュを通した後、さら
に同培地で遠心洗浄して抗体産生細胞を得ることができ
る。細胞融合に使用するミエローマ細胞としては、マウ
ス、ラット、ウサギ、ヒトなどの種々の動物の細胞株を
使用することができる。例えば、ヒポキサンチン・グア
ニン・ホスホリボシルトランスフエラーゼ(HGPRT) を欠
損するミエローマを使用することができる。このような
ミエローマは、未融合の状態では、HGPRT を欠くため
に、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン (HAT)
培地で、核酸の合成ができずに死滅する。一方、リンパ
球と融合してHGPRT 活性を獲得したハイブリドーマは、
アミノプテリンで核酸の生合成を阻害されてもヒポキサ
ンチンを利用して生育することができるので、融合処理
後にハイブリドーマのみが生育する。本発明に使用する
ミエローマ細胞は、非分泌型の細胞株であることが好ま
しい。この様なミエローマ細胞としては、マウスミエロ
ーマP3/X63-Ag8U1(P3U1),P3/NS-1-Ag4-1(NS-1),P3/X63-
Ag8-6.5.3(X6.3.6.5.3),SP2/0-Ag14(SP2),ラットミエロ
ーマ210. RCY3.Agl.2.3(Y3.Agl.2.3),ヒトミエローマSK
O-007, GM1500TG-A12 等を挙げることができる。

【０００６】細胞融合は、RPMI 1640 等の動物細胞培養
培地中で、１０⁷ −１０⁸ 個のミエローマ細胞に４−１
０倍の数の上記抗体産生細胞を混合して行う。細胞融合
促進物質としては、平均分子量１０００−６０００のポ
リエチレングリコール（PEG)やポリビニルアルコール、
センダイウイルス等が使用できる。融合処理は、通常２
５℃で５−２０分間、好ましくは、２５℃で６分間行え
ばよい。特に、ＰＥＧを用いることが好ましい。細胞融
合処理後の細胞からハイブリドーマを選別するには、選
択培地における選択的増殖を行えばよい。例えば、細胞
をＮＳ−１培地等の培地で５×１０⁶ 個／mlとなるよう
に希釈した後に、マイクロタイタープレート上の各ウェ
ルに１０⁵ −１０⁶ 細胞数／ウエルとなるように細胞を
入れ、その後ＨＡＴ培地等の選択培地を加えて、適当な
間隔、例えば、３日間隔で選択培地を交換して培養すれ
ばよい。例えばミエローマ細胞として P3/X63-Ag8U1(P3
U1) を使用した場合には、ＨＡＴ培地で１０−１４日間
程度培養することにより、ハイブリドーマのみを選別す
ることができる。

【０００７】菌糸型または酵母型のカンジダ・アルビカ
ンスに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを検索するには、例えば、酵素免疫測定法 (ELIS
A)により以下のようにして行えばよい。あらかじめ、菌
糸型のカンジダ・アルビカンス菌体及び酵母型のカンジ
ダ・アルビカンス菌体を、それぞれリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）、炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH9.６）等
の緩衝液に懸濁し、ポリスチレン、ポリビニール、ポリ
カーボネート、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、
シリコン、デキストラン、セルロース等のソフトプレー
トやガラスプレート、ビーズ、シート、ウエル、チュー
ブ等の固相に添加して、例えば４℃で一晩放置して吸着
させる。次に抗原溶液を捨ててＰＢＳで洗浄した後に、
１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳを加え、
例えば４℃で一晩放置して抗原の結合していない部位を
ＢＳＡでブロックする。その後に、ハイブリドーマの上
清を１００μl 加えて、例えば室温で１時間放置してＰ
ＢＳで３回洗浄する。次に、ビオチン化した抗マウスイ
ムノグロブリン抗血清（第２抗体）を加えて、室温で１
時間放置する。ＰＢＳで３回洗浄した後に、アビジンを
結合した酵素を加えて、室温で１５分間静置する。ＰＢ
Ｓで４回洗浄した後に、酵素基質を加えて発色させ、吸
光光度計、蛍光光度計等で測定すれば、菌糸型や酵母型
のカンジダ・アルビカンスに特異的に反応する抗体を産
生しているハイブリドーマが検索される。

【０００８】上記の様にして抗体産生細胞を選別した
後、限界希釈法等によりクローニングを行うことによ
り、単一のハイブリドーマを起源とする抗体産生細胞を
得ることができる。上記のモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマによる抗体産生は、培養フラスコや培養瓶を
用いて、１０−２０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４
０培地又は無血清培地等の動物細胞培養用培地で培養
し、その培養上清液を分離することにより行うことがで
きる。培養方法及び条件は、通常の動物細胞培養方法に
準じ、当業者が容易に選択し得るものである。さらに大
量の抗体を産生する方法としては、例えばハイブリドー
マの親ミエローマ細胞の由来動物と同系動物に、プリス
タン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカ
ン）等の鉱物油を腹腔内に投与した後、ハイブリドーマ
を腹腔内投与して大量に増殖させる方法を採用すること
ができる。該方法によればハイブリドーマは１０−１８
日程度で腹水腫瘍を形成し、血清及び腹水中に高濃度
(約１−２０mg／ml) の抗体が産生される。さらに精製
が必要な場合には、該腹水を硫安分画した後に、ＤＥＡ
Ｅ−セルロースイオン交換クロマトグラフィー、プロテ
インＡあるいはカンジダ・アルビカンス菌体を結合させ
たセファロース４Ｂ等を用いたアフィニティーカラムク
ロマトグラフィー、分子ふるいカラムクロマトグラフィ
ー等によって精製することが可能である。

【０００９】上記の様にして得られるハイブリドーマの
例としては、菌糸型のカンジダ・アルビカンスに特異的
に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マとしてＭＬＴ−１及びＭＬＴ−２株を挙げることがで
き、酵母型のカンジダ・アルビカンスに特異的に反応す
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして
ＹＳＴ−１及びＹＳＴ−２株を挙げることができる。こ
れらのハイブリドーマからは、菌糸型のカンジダ・アル
ビカンス、又は酵母型のカンジダ・アルビカンスに特異
的に反応するモノクローナル抗体が得られる。これらの
ハイブリドーマから得られた各モノクローナル抗体の菌
糸型および酵母型カンジダ・アルビカンス・セルエクス
トラクト(cell extract)との反応性をイムノブロット法
を用いて調べた。ＭＬＴ−１では菌糸型カンジダ・アル
ビカンス・セルエクストラクトに対して分子量２３０ｋ
Ｄａ付近のバンドが染色されたが、酵母型カンジダ・ア
ルビカンス・セルエクストラクトではバンドの染色は認
められなかった。ＭＬＴ−２は、菌糸型カンジダ・アル
ビカンス・セルエクストラクトに対して、ＭＬＴ−１と
同じ分子量２３０ｋＤａ付近のバンドの他に分子量約１
４ｋＤａに強く染色されるバンドが認められた。ＹＳＴ
−１では、酵母型カンジダ・アルビカンス・セルエクス
トラクトに対して分子量約２１０ｋＤａのバンドが検出
されたが、菌糸型カンジダ・アルビカンス・セルエクス
トラクトに対しては、染色されるバンドは認められなか
った。また、これら２１０ｋＤａ及び２３０ｋＤａ付近
のバンドは、アミドブラックで染色されにくく、過ヨウ
素酸−シッフ染色法による強い染色が認められた。

【００１０】上記ハイブリドーマＭＬＴ−１、ＭＬＴ−
２、ＹＳＴ−１、及びＹＳＴ−２株は、平成４年１月９
日付けで、工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号
微工研菌寄第12697 号（ＦＥＲＭ P-12697）、12698 号
（ＦＥＲＭ P-12698）、12699 号（ＦＥＲＭ P-1269
9）、12700 号（ＦＥＲＭ P-12700）としてそれぞれ受
託された。

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、体内で
増殖する菌糸型のカンジタ・アルビカンスと常在型のカ
ンジタ・アルビカンスとを明確に区別し得るので、カン
ジタ・アルビカンスによる真菌症の診断に有用である。

【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されること
はない。 例１ 菌糸型抗原の調製 C.albicans ATCC 10231 株を、ＤＳ液体培地（0.２％ポ
リペプトン、0.５％グルコース、pH6.０）に接種し、２
８℃で２日間培養した。培養終了後、遠心分離(３００
０r.p.m., １０分) により菌体を集めた。生理食塩水に
菌体を懸濁して遠心分離することにより菌体を３回洗浄
した。最後に、菌体を生理食塩水に２×１０⁷ cells/ml
に懸濁して抗原懸濁液として用いた。

【００１１】例２ 酵母型抗原の調製 C.albicans ATCC 10231 株を、ＹＥＰＧ液体培地（１％
イーストエキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、
pH6.４）に接種し、２８℃で一夜培養した。培養終了
後、遠心分離 (３０００r.p.m., １０分) により菌体を
集めた。生理食塩水に菌体を懸濁して遠心分離を行うこ
とにより菌体を３回洗浄した。最後に、菌体を生理食塩
水に２×１０⁷ cells/mlとなるように懸濁し、抗原懸濁
液として用いた。 例３ 抗体産生細胞の調製 上記抗原懸濁液0.２mlをＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬ
Ｃ、８週齢、雌）の腹腔内に投与して感作を行った。こ
の操作を２週間間隔で４回繰り返し、最終の抗原感作の
３日後に、マウスの頸椎を脱臼させて脾臓を無菌的に取
り出した。ＤＭＥＭ培地を含むシャーレに脾臓を入れて
ハサミで細片に切断し、ピペッティングにより組織をほ
ぐした後、ステンレスメッシュを通して脾細胞懸濁液を
得た。次に、この懸濁液を遠心分離 (５００×ｇ、 ７
分) して、脾細胞を新鮮なＤＭＥＭ培地に懸濁した。こ
の洗浄操作を３回繰り返し、最後に脾細胞をトリパンブ
ルーで染色して生細胞数を計数した。

【００１２】例４ 細胞融合及びハイブリドーマの調製 マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１と上記脾細胞とを細胞数１：
４の比率で混合し、遠心分離を行い、上清を除去して細
胞ペレットを得た。５０％ポリエチレングリコール
（Ｍ．Ｗ．３５００）１mlを、細胞ペレットをほぐすよ
うにゆっくりかき混ぜながら１分間かけて加えた。さら
にＤＭＥＭ培地６mlを１分間かけてゆっくりと加えた
後、遠心して上清を除去した。３７℃に保温した２０％
牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地１０mlを１分間かけてゆ
っくりと加えた後、再び遠心して上清を除去した。細胞
ペレットをＩＭＤＭ−ＨＡＴ培地（１×１０^-4Ｍヒポキ
サンチン、４×１０^-7Ｍアミノプテリン、1.６×１０^-5
Ｍチミジンを含むＩＭＤＭ培地）に細胞密度５×１０⁶
cells/mlとなるように懸濁させた。この懸濁液を９６ウ
エルプレート (CORNING)に１００μl ずつ分注し、５％
炭酸ガス培養器中で３７℃で培養した。その後、２−３
日間隔で各ウエル中の培地を新しいＩＭＤＭ−ＨＡＴ培
地に交換して培養を続け、ＩＭＤＭ−ＨＡＴ培地中で増
殖可能なハイブリドーマを選択した。培養開始後１０−
１４日でハイブリドーマの増殖を観察すると共に、培養
上清中の抗体産生を以下の方法で測定した。

【００１３】例５ 抗体産生ハイブリドーマの取得 上記により得られたハイブリドーマについて、培養上清
中の抗体産生の有無を酵素免疫測定法により調べた。例
１あるいは例２で培養した菌糸型及び酵母型のC.albica
ns ATCC 10231株の細胞を、それぞれ１×１０⁶ cells/m
lとなるように0.０５Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナト
リウム緩衝液pH9.６に懸濁し、９６ウエルイムノプレー
ト（ＮＵＮＣ）の各ウエルに１００μl ずつ分注して、
室温で２−３時間あるいは４℃で一晩放置した。次に、
各ウエルをＰＢＳで３回洗浄した後、１％ウシ血清アル
ブミンを含むＰＢＳを２００μl ずつ加え、室温で１時
間にわたりブロッキングを行った。各ウエルを0.０５％
Tween20を含むＰＢＳで３回洗浄した後、被検体（ハイ
ブリドーマの培養上清）１００μl を加え、室温で１時
間反応させた。各ウエルを0.０５％Tween20 を含むＰＢ
Ｓで４回洗浄した後、二次抗体溶液（ペルオキシダーゼ
標識ヤギ抗マウス (IgG+IgM)抗体を１％ＢＳＡを含むＰ
ＢＳで１００００倍に希釈したもの） 100μl を各ウエ
ルに分注し、室温で１時間反応させた。再び各ウエルを
0.０５％Tween20 を含むＰＢＳで５回洗浄した後、２mg
／mlＡＢＴＳ及び0.０１％過酸化水素水を含む0.１Ｍク
エン酸緩衝液（pH5.０）２００μl を各ウエルに加えて
反応させた。反応後、波長４１４nmにおける吸光度を測
定することにより同定を行った。菌糸型抗原に特異的に
反応する抗体は、１０８０ウエル中４個のウエルで、酵
母型抗原に特異的に反応する抗体は、４８０ウエル中２
個のウエルで認められた。

【００１４】次に、抗体産生が認められたウエル中のハ
イブリドーマのクローン化を限界希釈法により行った。
即ち、栄養供給細胞として無処置の８週齢雌性ＢＡＬＢ
／ｃマウスから脾臓を摘出し、例３に記載したのと同様
の方法により脾細胞を得、ＤＭＥＭ−ＨＴ培地で、１×
１０⁶ cells/mlの細胞密度に調製した。この脾細胞懸濁
液を各ウエルに１００μl ずつ分注し、さらに例５で抗
体産生が陽性となったハイブリドーマを１×１０¹ cell
s/mlの濃度で１００μl ずつ加え、５％炭酸ガス培養器
中、３７℃で培養を行った。クローン化の約１０日後、
ハイブリドーマの増殖を観察すると共に、各ウエル中の
培養上清中の抗体の有無を例５に記載の方法に従って検
査した。その結果、複数の抗体産生クローンが得られ
た。この中から、抗体産生能力が優れた安定なクローン
を選んで再びクローン化を行うことにより、最終的に、
菌糸型抗原に対する抗体産生ハイブリドーマＭＬＴ−１
及びＭＬＴ−２、並びに酵母型抗原に対する抗体産生ハ
イブリドーマＹＳＴ−１及びＹＳＴ−２を得た。 例６ ハイブリドーマ培養上清による抗体の産生 ハイブリドーマＭＬＴ−１、ＭＬＴ−２、ＹＳＴ−１及
びＹＳＴ−２をそれぞれ１０％牛胎児血清を含むＤＭＥ
Ｍ培地に懸濁し、９６ウエルプレートによる培養、２５
cm² フラスコ培養、７５cm² フラスコ（CORNING)培養の
順でスケールアップしながら、５％炭酸ガス培養器中で
３７℃で培養して培養上清を集めた。

【００１５】例７ (1) 抗体の特異性 Candida albicans ATCC 10231 の他、同属異種の抗原細
胞としてCandida tropicalis IAM 4904 、異属抗原とし
てSaccharomyces cerevisiae ATCC 24860、 Aspergillu
s niger ATCC 6275 を、例１あるいは例２と同様の方法
で培養し、菌糸型抗原あるいは酵母型抗原を得た。但
し、Candida tropicalis IAM 4904 は、例１の条件下で
は菌糸状形態をとらなかった。例５で得たハイブリドー
マの産生する抗体ＭＬＴ−１、ＹＳＴ−１、の特異性を
酵素免疫測定法（実施例５に記載）を用いて検査した。
その結果を表１及び表２に示した。

【表１】 ＭＬＴ−１の反応性 抗原の形態 菌 株 ────────────── 酵母型 菌糸型 C.albicans − ＋ C.tropicalis − ／ S.cerevisiae − ／ A.niger ／ − ／：試験せず

【００１６】

【表２】 ＹＳＴ−１の反応性 抗原の形態 菌 株 ────────────── 酵母型 菌糸型 C.albicans ＋ − C.tropicalis ＋ ／ S.cerevisiae − ／ A.niger ／ − ／：試験せず (2) 抗体のサブクラス アマシャム社のマウス・モノクローナル抗体アイソタイ
ピングキット(mouse monoclonal antibody isotyping k
it) を用いてＭＬＴ−１及びＭＬＴ−２、並びにＹＳＴ
−１及びＹＳＴ−２の抗体のサブクラスを決定した。そ
の結果、４種全てがκ鎖ＩｇＭのサブクラスの抗体であ
ることが判明した。

【００１７】例８ 免疫螢光学的な抗原の検出 C.albicans ATCC 10231 株の菌糸型あるいは酵母型菌体
溶液１×１０⁷ cells/mlを４０μ１スライドガラスにの
せ、３７℃で１時間乾燥させ、冷メタノールで５分間固
定した。風乾後、ハイブリドーマ培養上清４０μ１をの
せ、３７℃で３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳで３
回洗浄し、１５０倍に希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＩ
ｇＭ抗体溶液４０μ１をのせて３７℃で３０分間反応さ
せた。ＰＢＳで３回洗浄して風乾した後、５０％グリセ
ロール溶液で包埋し、螢光顕微鏡で観察を行つた。その
結果、一次抗体としてポリクローナル抗体である抗マウ
スC.albicans抗血清を用いた場合には、酵母型・菌糸型
両方のC.albicansに対して同様な強い螢光が認められた
のに対し、一次抗体として酵母型C.albicansに特異的に
反応するモノクローナル抗体ＹＳＴ−２を用いた場合に
は、酵母型C.albicansに対しては、強い螢光が認められ
たが、菌糸型 C. albicansにはほとんど反応が認められ
なかった。また、一次抗体として菌糸型C.albicansに特
異的に反応するモノクローナル抗体ＭＬＴ−１を用いた
場合には、酵母型C.albicansに対しては螢光は非常に弱
くほとんど反応は認められなかったが、菌糸型C.albica
nsに対しては強い螢光が認められた。ＭＬＴ−１は菌糸
型C.albicansの厚膜胞子部分には反応しなかった。さら
に一次抗体として菌糸型C.albicansに特異的に反応する
モノクローナル抗体ＭＬＴ−２を用いた場合には、ＭＬ
Ｔ−１と同様に酵母型C.albicansに対してはほとんど反
応は認められなかったが、菌糸型C.albicansに対して強
い螢光が認められた。また、ＭＬＴ−１とは異なり、菌
糸型C.albicansの厚膜胞子に対しても、他の部分と同様
の反応が認められた。

【００１８】例９ （１）ウエスタンブロッドによる抗原の検出 例１あるいは２で培養、調製した C.albicans ATCC 102
31株の細胞を、菌体湿重量の２倍量の10^-3M EDTA（エチ
レンジアミン４酢酸）、10^-6M 2-メルカプトエタノール
を含む 0.05M トリス−塩酸緩衝液 pH 7.5 に懸濁し、
さらに同量のガラスビーズ（0.5 - 0.75mm）を加えた。
この懸濁液を、ボルテックスミキサーで１時間混合し、
遠心分離（12,000 r.p.m.,15分）した。上清をとり、沈
澱に上記緩衝液とガラスビーズを加え、ボルテックスミ
キサーで再び１時間混合した。遠心分離（12,000 r.p.
m.,15分）して上清をとり、残った沈澱にさらに上記緩
衝液とガラスビーズを加えて１時間混合した。遠心分離
（12,000 r.p.m.,15分）した後に得られた上清を、１回
目および２回目の遠心分離で集めた上清と合わせて再び
遠心分離（3,000 r.p.m.,30 分）した。得られた上清
を、それぞれ菌糸型カンジダ・アルビカンス・セルエク
ストラクト、酵母型カンジダ・アルビカンス・セルエク
ストラクトとした。

【００１９】（２）イムノブロット 菌糸型カンジダ・アルビカンス・セルエクストラクトお
よび酵母型カンジダ・アルビカンス・セルエクストラク
トを用いて、 Laemmliの方法（Nature, 227, 680-685
(1970) ）に従ってSDS-PAGE（4-20％ グラジエント）
を行った。さらにTowbin らの方法（Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 76, 4350 (1979))により、以下の様にして
ウエスタンブロッティングを行った。電気泳動の終了し
たポリアクリルアミドゲルを、ニトロセルロース膜上に
トランスブロットした（室温 100V３時間）。分子量マ
ーカーを含むレーンを切断し、総蛋白をアミドブラック
（ 45v/v％メタノール、 10v/v％酢酸、及び 0.1％アミ
ドブラック 10B）で１０分間染色し、染料を含まない上
記溶液中で脱色した。ニトロセルロース膜を20mMトリス
−塩酸緩衝液(pH 7.5)、500nM 塩化ナトリウム、3%ウシ
血清アルブミン（ブロッキング緩衝液）中に２時間浸し
た後、得られた各モノクローナル抗体と共に一晩室温で
インキュベートした。洗浄液（ 20mM トリス−塩酸緩衝
液 pH 7.5 、500nM 塩化ナトリウム、0.05％ Tween 20
）で洗浄した後、ビオチン化したヤギ抗マウス IgG +
IgM (TAGO社）と共に３時間インキュベートした。洗浄
液で洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ接合した
ストレプトアビジン (TAGO社）と共に３時間インキュベ
ートした。さらに洗浄液で洗浄した後、基質（HRP Colo
r Development Solution, Bio Rad Laboratories, Rich
mond, CA）を添加し、発色が完了した後、蒸留水中に浸
すことによって反応を停止した。

【００２０】その結果、ＭＬＴ−１では、菌糸型カンジ
ダ・アルビカンス・セルエクストラクトに対して、分子
量約２３０ｋＤａ付近に染色されるバンドが検出され
た。しかし、酵母型カンジダ・アルビカンス・セルエク
ストラクトに対しては、バンドの染色は認められなかっ
た。ＭＬＴ−２では、菌糸型カンジダ・アルビカンス・
セルエクストラクトに対して、ＭＬＴ−１と同じく分子
量約２３０ｋＤａ付近のバンドの他、さらに分子量約１
４ｋＤａ付近に強く染色されるバンドが検出された。酵
母型カンジダ・アルビカンス・セルエクストラクトに対
しては、染色されるバンドは認められなかった。ＹＳＴ
−１では、酵母型カンジダ・アルビカンス・セルエクス
トラクトに対して、分子量約２１０ｋＤａのバンドが検
出された。菌糸型カンジダ・アルビカンス・セルエクス
トラクトに対しては、染色されるバンドは認められなか
った。なお、これら２１０ｋＤａ及び２３０ｋＤａ付近
のバンドはいずれもアミドブラック染色法では染色され
にくく、過ヨウ素酸−シッフ染色法（Periodic acid- S
chiff staining ）による強い染色が認められた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 菌糸型のカンジダ・アルビカンスに特異
   的に反応するモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 酵母型のカンジダ・アルビカンスに特異
   的に反応するモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 菌糸型のカンジダ・アルビカンスに特異
   的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリド
   ーマ。
4. 【請求項４】 酵母型のカンジダ・アルビカンスに特異
   的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリド
   ーマ。