JPH05306295A - Angiotensin i converting enzyme-inhibitory tripeptide and its production - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide a peptide capable of inhibiting angiotensin I converting enzyme having hypertensive activity with renin-angiotensin system, to be used for suppressing hypertension. CONSTITUTION:The objective peptide having Ile-Arg-Pro structure has been synthesized using solid phase or liquid phase method, a chemical synthesis method for peptides. This peptide, at a concentration of 1.8muM, can inhibit, at a level of 50%, angiotensin I converting enzyme. Thus, the objective peptide having hypotensive activity can easily be provided.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、アンジオテンシンＩ変
換酵素阻害ペプチドとその製造方法に関する。より詳し
くは、血圧を上昇させる働きのあるアンジオテンシンＩ
ＩをアンジオテンシンＩから変換する酵素であるアンジ
オテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドとその製造方法に関
する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide and a method for producing the same. More specifically, angiotensin I, which works to raise blood pressure
The present invention relates to an angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide that is an enzyme that converts I from angiotensin I, and a method for producing the same.

【０００２】[0002]

【従来の技術】高血圧症は、最大血圧が160mmHg 以上
か、最小血圧が95mmHg以上または両者がそれ以上の状態
である。わが国では患者数が約2000万人であるといわ
れ、り患率の高い疾病である。高血圧症は、脳出血、脳
梗塞、クモ膜下出血、狭心症、心筋梗塞、腎硬化症、腎
不全、網膜静膜閉息症など広範囲の臓器にわたってさま
ざまな合併症を生じることが知られており、有効な治療
薬が望まれている。2. Description of the Related Art Hypertension is a condition in which the maximum blood pressure is 160 mmHg or higher, the minimum blood pressure is 95 mmHg or higher, or both. In Japan, it is said that the number of patients is about 20 million, which is a highly prevalent disease. Hypertension is known to cause various complications across a wide range of organs such as cerebral hemorrhage, cerebral infarction, subarachnoid hemorrhage, angina, myocardial infarction, nephrosclerosis, renal failure, and retinal sillosis. Therefore, effective therapeutic agents are desired.

【０００３】生体内において血圧を調節するメカニズム
の一つとして、昇圧系であるレニン、アンジオテンシン
系と、降圧系であるカリクレイン、キニン系がある。レ
ニン、アンジオテンシン系では酵素レニンが腎臓の旁糸
球体細胞（Ｊ．Ｇ細胞）で生成され、血管でレニン基質
であるところのアンジオテシノ−ゲンに作用してアンジ
オテンシンＩを生成する。このアンジオテンシンＩをア
ンジオテンシンＩＩに変換する酵素がアンンジオテンシ
ンＩ変換酵素であり、生じたアンジオテンシンＩＩは細
動脈に作用して収縮を起こさせる。As one of the mechanisms for controlling blood pressure in the living body, there are a repressor system such as renin and angiotensin system and a hypotensive system such as kallikrein and quinine system. In the renin-angiotensin system, the enzyme renin is produced in renal glomerular cells (JG cells), and acts on angiotensinogen, which is a renin substrate in blood vessels, to produce angiotensin I. The enzyme that converts angiotensin I into angiotensin II is an angiotensin I converting enzyme, and the resulting angiotensin II acts on arterioles to cause contraction.

【０００４】また、アンジオテンシンＩＩは副腎皮質に
も作用してアルドステロンの合成と分泌を促し、腎臓で
のナトリウムの再吸収を促進し、体液量を保持する働き
もある。このようにしてアンジオテンシンＩＩによって
血圧が上昇する。一方、カリクレイン・キニン系では、
蛋白分解酵素であるカリクレインが、基質であるところ
のキニノ−ゲンに作用してキニンを生じる。キニンは血
管を拡張させ、血圧を下げる働きを有するが、キニナ−
ゼＩＩによって分解を受ける。キニナ−ゼＩＩはアンジ
オテンシンＩ変換酵素と同一物質であることが知られて
いる。[0004] Angiotensin II also acts on the adrenal cortex, promotes synthesis and secretion of aldosterone, promotes reabsorption of sodium in the kidney, and retains body fluid volume. Thus, angiotensin II raises blood pressure. On the other hand, in the kallikrein-quinine system,
The proteolytic enzyme kallikrein acts on the substrate, kininogen, to produce quinine. Kinin has the function of dilating blood vessels and lowering blood pressure.
It undergoes decomposition by ZE II. It is known that kininase II is the same substance as angiotensin I converting enzyme.

【０００５】以上のことから、アンジオテンシンＩ変換
酵素を阻害することによる高血圧の治療が考えられ、現
在までにカプトプリル、エナラプリル、アラセプリル、
デラプリル等が開発されている。また、カゼインやツエ
イン、ゼラチン、魚肉などに由来するペプチドも、アン
ジオテンシンＩ変換酵素を阻害する働きがあることが知
られている。（特開昭５９−４４３２４号、特開昭６４
−５４９７号、特開平０１−３１３４９８号）。From the above, treatment of hypertension by inhibiting angiotensin I converting enzyme is considered, and to date, captopril, enalapril, alacepril,
Delapril and others are being developed. It is also known that peptides derived from casein, zein, gelatin, fish meat, etc. have a function of inhibiting angiotensin I converting enzyme. (JP-A-59-44324 and JP-A-64)
-5497, JP-A 01-313498).

【０００６】しかし、カプトプリルは強力な血圧降下作
用を有するが、高価であり、安易に入手することは難し
い。その上、用量が不適当であると腎機能障害や低血圧
をもたらす。また、分子内に存在するＳＨ基のため、発
疹や、味覚異常を引き起こすともいわれている。カゼイ
ンやツエイン、魚肉などに由来するペプチドは、天然物
を原料とするものであり、製造工程で多くの未利用物を
生成し、その処理に莫大な費用がかかるだけでなく、廃
棄による環境汚染の心配がある。例えば、魚肉のみを原
料に使った場合、内臓が未利用物として残る。一方、水
産加工業では魚介類の肉部を主に加工しており、大量に
生成する内臓は未利用物として廃棄されることが多く、
環境汚染の原因となる可能性もあり、新たな有効利用法
が求められている。また、他のアンジオテンシンＩ変換
酵素阻害ペプチドが求められている。[0006] Although captopril has a strong antihypertensive effect, it is expensive and difficult to obtain easily. Moreover, inadequate dosage results in renal dysfunction and hypotension. Further, it is said that the SH group existing in the molecule causes rash and dysgeusia. Peptides derived from casein, zein, fish meat, etc. are derived from natural products, and produce many unused substances in the manufacturing process, which not only costs a huge amount of processing but also causes environmental pollution due to disposal. I have a concern. For example, when only fish meat is used as a raw material, the internal organs remain as an unused material. On the other hand, in the seafood processing industry, the meat portion of seafood is mainly processed, and the large amounts of internal organs are often discarded as unused materials,
It may cause environmental pollution, and new effective utilization methods are required. There is also a need for other angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides.

【０００７】[0007]

【発明が解決しようとする課題】したがって、安価に入
手でき、副作用が少ないアンジオテンシンＩ変換酵素の
阻害剤が求められている。また、未利用物である魚介類
の内臓を有効に利用する方法も望まれている。Therefore, there is a need for an angiotensin I converting enzyme inhibitor that can be obtained at low cost and has few side effects. In addition, a method for effectively utilizing the unused internal organs of seafood is also desired.

【０００８】[0008]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために種々検討した結果、本発明を完成する
に至った。すなわち、本発明は、安価で簡単に合成でき
るアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドとその製造
方法に関する。Means for Solving the Problems The present inventors have completed the present invention as a result of various studies for solving the above problems. That is, the present invention relates to an angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide which is inexpensive and can be easily synthesized, and a method for producing the same.

【０００９】本発明で言うアンジオテンシンＩ変換酵素
阻害ペプチドＩｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏは、魚介類の頭や
内臓を自己消化し、分離精製するか、または化学合成法
で得られる。すなわち、水産加工業などで生成する魚介
類の内臓をクラッシャーで粉砕し、２０〜７０℃で自己
消化を行わせる。反応時間は１〜６時間が適当である。
しかる後，９０℃以上で加熱し、酵素を失活させ、遠心
分離または濾過により、固形物を除去する。そして逆相
系分配・吸着クロマトグラフィーの充填剤であるＯＤＳ
充填剤（シリカゲルにオクタデシル基を化学結合させた
もの）に吸着させて水洗後、アセトニトリル１５％液で
溶出したものを陽イオン交換体ＳＰ（担体にスルホプロ
ピル基を結合させたもの）に吸着させ、ｐＨ６．０のバ
ッファーで洗浄した後、ｐＨ９．０の溶液で溶出する。
その後、逆相系液体クロマトグラフィー、ゲル濾過クロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより
精製する。本発明で使用できる魚種は、鰹節工業で大量
に内臓が生成するカツオが利用しやすいが、イワシやマ
グロなどの他の魚種も使用できる。The angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide Ile-Arg-Pro referred to in the present invention is obtained by autolyzing the head and internal organs of seafood, separating and purifying it, or by a chemical synthesis method. That is, the internal organs of seafood produced in the seafood processing industry are crushed with a crusher and self-digested at 20 to 70 ° C. A reaction time of 1 to 6 hours is suitable.
Then, it is heated at 90 ° C. or higher to inactivate the enzyme, and the solid matter is removed by centrifugation or filtration. And ODS, a packing material for reversed-phase partition / adsorption chromatography
After being adsorbed on a packing material (silica gel to which octadecyl group is chemically bonded) and washed with water, what is eluted with a 15% acetonitrile solution is adsorbed on a cation exchanger SP (carrier to which a sulfopropyl group is bonded). After washing with pH 6.0 buffer, elute with pH 9.0 solution.
Then, it is purified by reverse phase liquid chromatography, gel filtration chromatography, and ion exchange chromatography. As the fish species that can be used in the present invention, skipjack, which produces a large amount of internal organs in the bonito flakes industry, is easy to use, but other fish species such as sardines and tuna can also be used.

【００１０】また、本ペプチドは各種化学合成法、例え
ば、固相法、液相法を使用して製造することができる。
すなわち、Ｂｏｃ（ターシャリーブチルオキシカルボ
ニル）−アミノ酸をＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジ
イミド）、ＨｏＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル）とともにＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中で反応
させる方法や、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｄ法で不溶性担体上に
アミノ酸を縮合させる方法が使用できる。Further, the present peptide can be produced by various chemical synthesis methods such as solid phase method and liquid phase method.
That is, Boc (tertiary butyloxycarbonyl) -amino acid is reacted with DCC (dicyclohexylcarbodiimide) and HoBt (1-hydroxybenzotriazole) in DMF (dimethylformamide), or the amino acid is condensed on an insoluble carrier by the Merriified method. The method can be used.

【００１１】本ペプチドの使用にあたっては、経口投
与、静脈注射のいずれも使用でき、ペプチドは塩酸やト
リフルオロ酢酸などの各種塩の形でも使用できる。In using the present peptide, either oral administration or intravenous injection can be used, and the peptide can also be used in the form of various salts such as hydrochloric acid and trifluoroacetic acid.

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples.

【００１２】実施例１ カツオの内臓１Ｋｇをクラッシャーで粉砕し、５００ｇ
の水を加え、緩やかに攪拌しながら５０℃で３時間自己
消化反応を行わせた。その後、２０分間煮沸し、遠心分
離により固形物を除去し、旭化成工業（株）のラボモジ
ュールＳＩＰ−１０１３を用い、限外濾過を行なった。
濾液のペプチドを逆相系前処理カートリッジセップパッ
クＣ₁₈ＥＮＶ（ウォ−ターズ製）に吸着させ、蒸留水８
ｍｌで洗浄後、アセトニトリル１５％液８ｍｌで溶出し
た。この処理を４回繰り返し、１３６ｍｇのペプチドを
処理した。アセトニトリル１５％液で溶出したものは、
溶媒を減圧下で除去した後、１０ｍＭリン酸バッファー
（ｐＨ６．０）で平衡化したイオン交換系前処理カート
リッジ、トヨパックＩＣ−ＳＰ（Ｍ）（東ソー製）に吸
着させた後、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）
４ｍｌで洗浄し、１０ｍＭリン酸第一水素カリウム液４
ｍｌで溶出し、ＨＰＬＣ条件１で示した条件で逆相系高
速液体クロマトグラフィーで分離した。この時の結果を
図１に示した。図１のピーク１をさらに逆相系高速液体
クロマトグラフィーで、ＨＰＬＣ条件２の条件で分離し
た。その結果を図２に示した。図２のピーク２をさらに
ゲル濾過系高速液体クロマトグラフィーで、ＨＰＬＣ条
件３で分離した。結果を図３に示した。図３のピーク３
をさらにゲル濾過高速液体クロマトグラフィーを用い
て、ＨＰＬＣ条件４の条件で分離した。その結果が図４
で、図４のピーク４はさらにＨＰＬＣ条件５でイオン交
換分離し、図５ピーク５を得た。最後にピーク５をＨＰ
ＬＣ条件６で逆相系分離を行い、図６を得た。図６には
ピーク６に強いアンジオテンシンＩ変換酵素阻害能が認
められたので、脱塩後、アプライドバイオシステム社気
相プロテインシーケンサ４７０Ａで構造解析をしたとこ
ろ、Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの構造であることが分かっ
た。Example 1 1 kg of bonito offal was crushed with a crusher to give 500 g.
Water was added and the autolysis reaction was carried out at 50 ° C. for 3 hours while gently stirring. Then, it boiled for 20 minutes, the solid substance was removed by centrifugation, and ultrafiltration was performed using a laboratory module SIP-1013 manufactured by Asahi Kasei Corporation.
The peptide of the filtrate was adsorbed on a reverse phase pretreatment cartridge Seppak C ₁₈ ENV (manufactured by Waters) and distilled water 8
After washing with ml, it was eluted with 8 ml of a 15% acetonitrile solution. This treatment was repeated 4 times to treat 136 mg of peptide. What was eluted with 15% acetonitrile solution,
After the solvent was removed under reduced pressure, it was adsorbed to an ion exchange system pretreatment cartridge, Toyopack IC-SP (M) (manufactured by Tosoh Corporation) equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 6.0), and then 10 mM phosphate buffer. (PH 6.0)
Wash with 4 ml, 10 mM potassium dihydrogen phosphate solution 4
It was eluted with ml and separated by reverse phase high performance liquid chromatography under the conditions shown in HPLC condition 1. The result at this time is shown in FIG. The peak 1 in FIG. 1 was further separated by reverse phase high performance liquid chromatography under the condition of HPLC condition 2. The results are shown in Fig. 2. The peak 2 in FIG. 2 was further separated by gel filtration high performance liquid chromatography under HPLC condition 3. The results are shown in Fig. 3. Peak 3 in Figure 3
Was further separated by gel filtration high performance liquid chromatography under the condition of HPLC condition 4. The result is shown in Figure 4.
Then, peak 4 in FIG. 4 was further subjected to ion exchange separation under HPLC condition 5 to obtain peak 5 in FIG. Finally HP for peak 5
Reversed phase separation was performed under LC condition 6 to obtain FIG. In FIG. 6, a strong angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity was observed at peak 6, so after desalting, structural analysis with a gas phase protein sequencer 470A of Applied Biosystems revealed that it had a structure of Ile-Arg-Pro. I understood.

【００１３】アンジオテンシンＩ変換酵素阻害の測定
は、カッシュマンらの方法（バイオケミカル・ファ−マ
コロジ−２０巻１６３７〜１６４８頁（１９７１））を
改良した丸山らの方法（アグリカリチュアル・バイオロ
ジカル・ケミストリー４６巻５号１３９３〜１３９４頁
（１９８２））にしたがった。The measurement of angiotensin I converting enzyme inhibition is carried out by the method of Maruyama et al., Which is an improved version of the method of Kashman et al. (Biochemical Pharmacolodji 20: 1637-1648 (1971)) (Agricultural Biological. Chemistry 46, No. 5, pp. 1393-1394 (1982)).

【００１４】すなわち、試験管に本発明ペプチド水溶液
３０μｌと酵素基質としてＬ−ヒプリルヒスチジルロイ
シン（シグマ製）と塩化ナトリウムを含有したｐＨ８．
３のホウ酸バッファ−２５０μｌを加え、３７℃で１０
分間プレインキュベ−ションした。その後、アンジオテ
ンシンＩ変換酵素含有液１００μｌを加え、酵素反応を
開始した。この時ホウ酸バッファ−の濃度は０．１Ｍ、
Ｌ−ヒプリルヒスチジルロイシン濃度は５ｍＭ、塩化ナ
トリウム３００ｍＭであり、阻害がかからない場合の酵
素活性は８ｍＵである。３７℃、ｐＨ８．３で３０分間
振動しつつ反応せしめた後、１Ｎ塩酸２５０μｌを加
え、反応を停止させた。酢酸エチル１．５ｍｌを加え、
１５秒間振とうさせて酵素反応で生じた馬尿酸を抽出
し、２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して酢酸エチル
層１．０ｍｌを試験管に採取した。酢酸エチルをホット
ドライバスの中で１２０℃，３０分間加温して完全に除
去した後、室温で５分間放置した。そして、蒸留水を加
え、生成した馬尿酸の量を２２８ｎｍの吸光度を測定し
て求めた。酵素反応に使用したアンジオテンシンＩ変換
酵素含有液は、ラビットアセトンパウダ−（シグマ製）
１ｇを０．１Ｍホウ酸バッファ−（ｐＨ８．３）１０ml
に溶かし、よく攪拌した後、４℃、４００００ｇで４０
分間遠心分離した上清を０．１Ｍホウ酸バッファ−で希
釈して作成した。That is, a test tube containing 30 μl of the peptide aqueous solution of the present invention, L-hipryl histidyl leucine (manufactured by Sigma) as an enzyme substrate, and sodium chloride was added at pH 8.
Add 250 μl of borate buffer 3 of 3 and add 10
Pre-incubated for minutes. Then, 100 μl of a solution containing angiotensin I converting enzyme was added to start the enzymatic reaction. At this time, the concentration of borate buffer is 0.1M,
The L-hypril histidyl leucine concentration is 5 mM and sodium chloride is 300 mM, and the enzyme activity in the absence of inhibition is 8 mU. After reacting with shaking at 37 ° C. and pH 8.3 for 30 minutes, 250 μl of 1N hydrochloric acid was added to stop the reaction. Add 1.5 ml of ethyl acetate,
Hippuric acid generated by the enzymatic reaction was extracted by shaking for 15 seconds, and centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes to collect 1.0 ml of an ethyl acetate layer in a test tube. Ethyl acetate was heated in a hot dry bath at 120 ° C. for 30 minutes to completely remove it, and then left at room temperature for 5 minutes. Then, distilled water was added, and the amount of hippuric acid produced was determined by measuring the absorbance at 228 nm. The angiotensin I-converting enzyme-containing solution used in the enzymatic reaction was a rabbit acetone powder (manufactured by Sigma).
1 g of 0.1 M borate buffer (pH 8.3) 10 ml
Dissolve in water and stir well, then 40 at 40,000g at 4 ℃.
It was prepared by diluting the supernatant after centrifugation for 0.1 minutes with 0.1 M borate buffer.

【００１５】また、酵素反応後の代わりに酵素反応前に
塩酸を添加して同様な操作を行なったものをブランクと
して作成した。Further, instead of after the enzymatic reaction, hydrochloric acid was added before the enzymatic reaction and the same operation was performed to prepare a blank.

【００１６】阻害率は下記数１を使用して求めた。The inhibition rate was determined using the following equation 1.

【数１】 阻害率＝｛１−（Ｂ−Ｄ）÷（Ａ−Ｃ）｝×１００ （％） Ａ：蒸留水添加時の吸光度 （２２８ｎｍ） Ｂ：阻害剤添加時の吸光度 （２２８ｎｍ） Ｃ：蒸留水添加時の吸光度ブランク （２２８ｎｍ） Ｄ：阻害剤添加時の吸光度ブランク （２２８ｎｍ） この方法で、上記ペプチドは１．８μＭの濃度でアンジ
オテンシンＩ変換酵素の活性を５０％阻害した。## EQU1 ## Inhibition rate = {1- (BD) ÷ (AC)} × 100 (%) A: Absorbance when distilled water is added (228 nm) B: Absorbance when inhibitor is added (228 nm) C : Absorbance blank upon addition of distilled water (228 nm) D: Absorbance blank upon addition of inhibitor (228 nm) By this method, the peptide inhibited the activity of angiotensin I converting enzyme by 50% at a concentration of 1.8 μM.

【００１７】ＨＰＬＣ条件１ カラム：ＲＰ−１８（ｅ） １．０×２５ｃｍ （メル
ク社製） 移動相：Ａ ０．０５％トリフルオロ酢酸液 Ｂ ０．０５％トリフルオロ酢酸、３０％アセトニトリ
ル液 グラジエント条件はＡ液１００％から１２０分後にＢ液
１００％になる直線グラジエント 流速：４．０ｍｌ／分 検出：２１０ｎｍHPLC condition 1 Column: RP-18 (e) 1.0 × 25 cm (manufactured by Merck) Mobile phase: A 0.05% trifluoroacetic acid solution B 0.05% trifluoroacetic acid, 30% acetonitrile solution Gradient The condition is a linear gradient from 100% of solution A to 100% of solution B after 120 minutes Flow rate: 4.0 ml / min Detection: 210 nm

【００１８】ＨＰＬＣ条件２ カラム：ＲＰ−１８（ｅ） ０．４６×２５ｃｍ （メ
ルク社製） 移動相：Ａ ０．０５％トリフルオロ酢酸液 Ｂ ０．０５％トリフルオロ酢酸、３０％アセトニトリ
ル液 グラジエント条件はＡ液１００％から１２０分後にＢ液
１００％になる直線グラジエント 流速：１．０ｍｌ／分 検出：２１０ｎｍHPLC condition 2 Column: RP-18 (e) 0.46 × 25 cm (manufactured by Merck) Mobile phase: A 0.05% trifluoroacetic acid solution B 0.05% trifluoroacetic acid, 30% acetonitrile solution Gradient The condition is a linear gradient from 100% of solution A to 100% of solution B after 120 minutes Flow rate: 1.0 ml / min Detection: 210 nm

【００１９】ＨＰＬＣ条件３ カラム：ＧＳ−２２０ ０．７６×５０ｃｍ （旭化成
工業（株）製） 移動相：５０ｍＭ酢酸アンモニウム液 流速：１．０ｍｌ／分 検出：２１０ｎｍHPLC condition 3 Column: GS-220 0.76 × 50 cm (manufactured by Asahi Kasei Corporation) Mobile phase: 50 mM ammonium acetate solution Flow rate: 1.0 ml / min Detection: 210 nm

【００２０】ＨＰＬＣ条件４ カラム：ＧＳ−３２０ ０．７６×５０ｃｍ （旭化成
工業（株）製） 移動相：５０ｍＭ酢酸アンモニウム液 流速：１．０ｍｌ／分 検出：２１０ｎｍHPLC condition 4 Column: GS-320 0.76 × 50 cm (manufactured by Asahi Kasei Corporation) Mobile phase: 50 mM ammonium acetate solution Flow rate: 1.0 ml / min Detection: 210 nm

【００２１】ＨＰＬＣ条件５ カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−２ＳＷ ０．４６×２５
ｃｍ （東ソー製） 移動相：Ａ ２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐ
Ｈ６．０） Ｂ ２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー＋０．５Ｍ塩
化ナトリウム（ｐＨ６．０） Ａ１００％で１０分流した後４０分後にＢ液１００％に
なるような直線グラジエント 流速：０．８ｍｌ／分 検出：２１０ｎｍHPLC condition 5 Column: TSKgel SP-2SW 0.46 × 25
cm (manufactured by Tosoh Corporation) Mobile phase: A 20 mM sodium phosphate buffer (p
H6.0) B 20 mM sodium phosphate buffer + 0.5 M sodium chloride (pH 6.0) A linear gradient such that 100% of A was allowed to flow for 10 minutes and then B solution was 100% after 40 minutes Flow rate: 0.8 ml / min Detection: 210 nm

【００２２】ＨＰＬＣ条件６ カラム：ＲＰ−１８（ｅ） ０．４６×２５ｃｍ （メ
ルク社製） 移動相：０．０５％トリフルオロ酢酸、７％アセトニト
リル液 流速：１．０ｍｌ／分 検出：２１０ｎｍHPLC condition 6 Column: RP-18 (e) 0.46 × 25 cm (manufactured by Merck) Mobile phase: 0.05% trifluoroacetic acid, 7% acetonitrile solution Flow rate: 1.0 ml / min Detection: 210 nm

【００２３】実施例２ Ｂｏｃ−Ｉｌｅ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ、Ｂｏｃ−Ｐｒｏを用
いて、アプライドバイオシステム社のモデル４３０Ａペ
プチドシーケンサをにより、Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの
構造のペプチドを合成した。合成したペプチドは、ワイ
エムシイ社のＹＭＣ−ＯＤＳ−Ｒ５カラムにより、０．
１％トリフルオロ酢酸液１００％から５０分後に０．１
％トリフルオロ酢酸含有７０％アセトニトリル液１００
％になるような直線グラジエントで、流速１．０ｍｌで
精製した。なお、検出は波長２１０ｎｍの吸収で行っ
た。Example 2 Boc-Ile, Boc-Arg, and Boc-Pro were used to synthesize a peptide having a structure of Ile-Arg-Pro by a model 430A peptide sequencer manufactured by Applied Biosystems. The synthesized peptide was analyzed by YMC-ODS-R5 column manufactured by YMC Co., Ltd.
1% trifluoroacetic acid solution 100% to 0.1 after 50 minutes
70% acetonitrile solution containing 100% trifluoroacetic acid
Purification was carried out with a linear gradient to give a flow rate of 1.0 ml. The detection was carried out by absorption at a wavelength of 210 nm.

【００２４】[0024]

【発明の効果】以上説明したとおり、本発明によれば、
血圧上昇を抑える作用を有するアンジオテンシンＩ変換
酵素阻害ペプチドを、未利用物である魚介類の内臓から
安価に得ることができる。As described above, according to the present invention,
An angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide having an action of suppressing an increase in blood pressure can be obtained at low cost from the unused internal organs of fish and shellfish.

【配列表】[Sequence list]

配列番号：１ 配列の長さ：３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ） 配列の種類：ペプチド（peptide) 起源：生物名 カツオナス ペラミス（katsuwonas pel
amis) SEQ ID NO: 1 Sequence length: 3 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide Origin: Organism name Katsuwonas pelamis (katsuwonas pel)
amis)

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】実施例１においてＨＰＬＣ条件１で分離したチ
ャートを示す。FIG. 1 shows a chart separated under HPLC condition 1 in Example 1.

【図２】図１のピーク１をＨＰＬＣ条件２で分離したチ
ャートを示す。FIG. 2 shows a chart in which peak 1 in FIG. 1 is separated under HPLC condition 2.

【図３】図２のピーク２をＨＰＬＣ条件３で分離したチ
ャートを示す。FIG. 3 shows a chart in which peak 2 in FIG. 2 is separated under HPLC condition 3.

【図４】図３のピーク３をＨＰＬＣ条件４で分離したチ
ャートを示す。FIG. 4 shows a chart in which peak 3 in FIG. 3 is separated under HPLC condition 4.

【図５】図４のピーク４をＨＰＬＣ条件５で分離したチ
ャートを示す。5 shows a chart in which peak 4 in FIG. 4 is separated under HPLC condition 5. FIG.

【図６】図５のピーク５をＨＰＬＣ条件６で分離したチ
ャートを示す。FIG. 6 shows a chart in which peak 5 in FIG. 5 is separated under HPLC condition 6.

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの構造を持つア
ンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチド。ただし、Ｉｌ
ｅはイソロイシン、Ａｒｇはアルギニン、Ｐｒｏはプロ
リンを示す。1. An angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide having a structure of Ile-Arg-Pro. However, Il
e is isoleucine, Arg is arginine, and Pro is proline. 【請求項２】 魚介類を自己消化し、精製することを特
徴とする請求項１記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻
害ペプチドの製造方法。2. The method for producing an angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide according to claim 1, wherein the seafood is autolysed and purified. 【請求項３】 化学的合成法により合成することを特徴
とする請求項１記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害
ペプチドの製造方法。3. The method for producing an angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide according to claim 1, wherein the peptide is synthesized by a chemical synthesis method.