JP3318622B2 - Prolyl endopeptidase inhibitor - Google Patents
Prolyl endopeptidase inhibitorInfo
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Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明はプロリルエンドペプチダ
ーゼ阻害剤に関し、さらに詳しくは近年増加の傾向にあ
り対策が望まれている痴呆症の予防及び／または治療に
有用な医薬品又は食品に利用できることが期待されてい
るプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関するものであ
る。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a prolyl endopeptidase inhibitor and, more particularly, to a drug or food useful for the prevention and / or treatment of dementia, which has been increasing in recent years and for which measures are desired. Are concerned with prolyl endopeptidase inhibitors which are expected.
【０００２】[0002]
【従来の技術】プロリルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.2
1.26) は、最初、オキシトシン不活性化酵素として１９
７１年にWalterらによってヒト子宮中に発見され、その
後、子ヒツジやウシ脳から単一に精製された（Science
173 , 827 (1971),Molecular &Cellular Biochemistry
30, 111 (1980), 日本農芸化学会誌 58，1147(198
4))。また、同様の酵素が Flavobacterium属細菌から
も発見されている(J.Biol.Chem. 255 , 4786 (1980) 。
一方、脳内には、バソプレシン及びバソプレシン誘導体
〔pGlu4, Cyt6 〕AVP-(4-9) の存在が確認されている
が、これらのペプチドはステップスルー型受動的回避学
習法で記憶保持活性があるとされている (Science 221,
1310 (1983),Nature 308, 276 (1984))。BACKGROUND ART Prolyl endopeptidase (EC 3.4.2)
1.26) was initially used as an oxytocin inactivating enzyme.
Discovered in the human uterus by Walter et al. In 1971, and subsequently purified solely from lamb and bovine brain (Science
173 , 827 (1971), Molecular & Cellular Biochemistry
30 , 111 (1980), Journal of the Japanese Society of Agricultural Chemistry 58 , 1147 (198
Four)). Similar enzymes have also been found in bacteria of the genus Flavobacterium (J. Biol. Chem. 255 , 4786 (1980)).
On the other hand, the presence of vasopressin and vasopressin derivative [pGlu 4 , Cyt 6 ] AVP- (4-9) in the brain has been confirmed, but these peptides have memory retention activity by the step-through passive avoidance learning method. (Science 221,
1310 (1983), Nature 308, 276 (1984)).
【０００３】芳本と鶴は、記憶の固定場所とされている
脳の海馬部分にプロリルエンドペプチダーゼの高い活性
が観られたことと、脳のプロリルエンドペプチダーゼが
バソプレシンのような１０アミノ酸程度以下のぺプチド
によく作用する点に注目し、通常は脳でのプロリルエン
ドペプチダーゼが正常に働いているが何らかの理由で調
節機構が外れると、バソプレシンが必要以上に分解さ
れ、記憶保持に障害が現れると考え、Z-Gly-Pro-CH2Cl,
Z-Pro-prolinal, Z-Val-prolinal, Boc-Pro-prolinal
などのプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を合成し、こ
れらが抗健忘作用を示すことを確認した（日本農芸化学
会誌 58 (111), 1147 (1984) 、化学と生物 25 (9),
554 (1987)) 。また最近では、微生物や食品成分に由来
するプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤も発見されてい
る（Agric. Biol. Chem. 55, 825(1991)、特開平 3-31
298、1990年薬学会年会講演要旨集 p.119) 。[0003] Yoshimoto and Tsuru reported that high activity of prolyl endopeptidase was observed in the hippocampus of the brain, which is a place where memory was fixed, and that prolyl endopeptidase in the brain was less than about 10 amino acids such as vasopressin. Note that prolyl endopeptidase normally functions normally in the brain, but if for some reason the regulatory mechanism is lost, vasopressin is degraded more than necessary and memory retention is impaired. Thought to appear, Z-Gly-Pro-CH 2 Cl,
Z-Pro-prolinal, Z-Val-prolinal, Boc-Pro-prolinal
We synthesized prolyl endopeptidase inhibitors and confirmed that they show anti-amnesic effect (Journal of the Japanese Society of Agricultural Chemistry 58 (111), 1147 (1984), Chemistry and Biology 25 (9),
554 (1987)). Recently, prolyl endopeptidase inhibitors derived from microorganisms and food components have also been discovered (Agric. Biol. Chem. 55 , 825 (1991);
298, Abstracts of Annual Meeting of the Pharmaceutical Society of Japan, p.119).
【０００４】一方、トウモロコシ、大豆、ニンジンなど
の植物は、プロリンを多く含む蛋白質を生産しており、
それらには Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu, Pro-Pro-Val-Ty
r-Lys, Pro-Pro-Ile-Tyr-Lys, Pro-Pro-Val-Tyr-Thr,
Pro-Pro-Val-His-Lys などアミノ酸５〜６残基のペプチ
ドが繰り返し配列として存在している（The Journalof
Biological Chemistry 262, 8367 (1987)) 。特に、ト
ウモロコシ蛋白質はプロラミンを50〜60％、グルテリン
を35〜40％含み、主成分であるプロラミンはゼイン(zei
n)と呼ばれる。ゼインはα、β、γの３種に分けられ
（J.Cereal Sci.5, 117 (1987))、γ−ゼイン中には Pr
o-Pro-Pro-Val-His-Leuを基本単位とする６回繰り返し
構造及びプロリンが１つ置きに並んだ配列 Pro-Arg-Pro
-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His-Proが含まれている (Nu
cleic Acids Res.13 (5), 1493 (1985))。[0004] On the other hand, plants such as corn, soybeans and carrots produce proteins containing a large amount of proline.
They include Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu, Pro-Pro-Val-Ty
r-Lys, Pro-Pro-Ile-Tyr-Lys, Pro-Pro-Val-Tyr-Thr,
A peptide having 5 to 6 amino acids such as Pro-Pro-Val-His-Lys is present as a repeating sequence (The Journalof
Biological Chemistry 26 2, 8367 (1987)). In particular, corn protein contains 50-60% prolamin and 35-40% glutelin, and the main component prolamin is zein (zei).
n). Zein is classified into three types, α, β, and γ (J. Cereal Sci. 5, 117 (1987)).
o-Pro-Pro-Val-His-Leu as the basic unit, a six-repeat structure, and a sequence in which every other proline is arranged Pro-Arg-Pro
-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His-Pro is included (Nu
cleic Acids Res. 13 (5), 1493 (1985)).
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】本発明はプロリルエン
ドペプチダーゼ阻害作用を有し、従って痴呆症治療及び
／または予防薬として、または日常の摂取を通して痴呆
症等の症状の予防を図る機能性食品として有用であるこ
とが期待される特定のペプチド系プロリルエンドペプチ
ダーゼ阻害剤を提供することを目的とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention provides a functional food having a prolyl endopeptidase inhibitory activity, and therefore, as a therapeutic and / or prophylactic agent for dementia, or for preventing symptoms such as dementia through daily ingestion. An object of the present invention is to provide a specific peptide-based prolyl endopeptidase inhibitor which is expected to be useful as a drug.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】多くのプロリルエンドペ
プチダーゼ阻害剤は分子中にプロリン（Pro)を有し、ま
た幾つかの食用植物は、プロリンを多く含む蛋白質を生
産しており、それらには、Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu, P
ro-Pro-Val-Tyr-Lys, Pro-Pro-Ile-Tyr-Lys,Pro-Pro-Va
l-Tyr-Thr, Pro-Pro-Val-His-Lysなどアミノ酸５〜６残
基のペプチドが繰り返し配列として存在している。本発
明者らはこれらの事実より、植物蛋白質を蛋白質分解酵
素（プロテアーゼ）で処理することにより、プロリルエ
ンドペプチダーゼ阻害剤を安価に大量生産できる可能性
があると考え、上記繰り返し配列に関連した種々のペプ
チドを化学合成し、それらのプロリルエンドペプチダー
ゼに対する作用を調査した。その結果、下記ペプチドが
プロリルエンドペプチダーゼを阻害することを見い出し
た。SUMMARY OF THE INVENTION Many prolyl endopeptidase inhibitors have proline (Pro) in the molecule, and some edible plants produce proline-rich proteins, Is Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu, P
ro-Pro-Val-Tyr-Lys, Pro-Pro-Ile-Tyr-Lys, Pro-Pro-Va
A peptide of 5 to 6 amino acids such as l-Tyr-Thr, Pro-Pro-Val-His-Lys is present as a repeating sequence. Based on these facts, the present inventors consider that there is a possibility that a prolyl endopeptidase inhibitor may be mass-produced inexpensively by treating a plant protein with a protease, and the present inventors have found that the above-mentioned repetitive sequence has been considered. Various peptides were chemically synthesized and their effects on prolyl endopeptidase were investigated. As a result, the following peptides were found to inhibit prolyl endopeptidase.
【０００７】すなわち、本発明はＬ体のアミノ酸から構
成される下記ペプチド及びその酸付加塩のすくなくとも
１種を有効成分として含有するプロリルエンドペプチダ
ーゼ阻害剤： Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro, Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His,
His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-H
is-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, Leu-Pro-Pro-Pro-Val,Pro-Pr
o-Pro-Val, Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His
-Pro, Lys-Pro-Pro-Val, Lys-Pro-Pro-Ile, 及び Thr-P
ro-Pro-Valに関する。That is, the present invention provides a prolyl endopeptidase inhibitor comprising at least one of the following peptides composed of L-form amino acids and an acid addition salt thereof as an active ingredient: Val-His-Leu-Pro-Pro- Pro, Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His,
His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-H
is-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, Leu-Pro-Pro-Pro-Val, Pro-Pr
o-Pro-Val, Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His
-Pro, Lys-Pro-Pro-Val, Lys-Pro-Pro-Ile, and Thr-P
About ro-Pro-Val.
【０００８】ここで酸付加塩は、製薬上許容される酸
（無機酸及び有機酸）付加塩、例えば塩酸塩、臭化水素
酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、マレイン
酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸
塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、トルエンスルホ
ン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等を包含す
る。また付加する酸の当量は、０当量より大からペプチ
ド中の塩基性アミノ酸残基、 His 、Arg 、Lys の総数
＋１と等しい当量まで可能である。Here, the acid addition salt is a pharmaceutically acceptable acid (inorganic acid or organic acid) addition salt, for example, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, acetate, benzoate, maleic acid. Salts, fumarate, succinate, tartrate, citrate, oxalate, methanesulfonate, toluenesulfonate, aspartate, glutamate and the like are included. The equivalent of the acid to be added can be greater than 0 equivalent to an equivalent of the total number of basic amino acid residues, His, Arg and Lys in the peptide + 1.
【０００９】本願の特許請求の範囲中のペプチドは既知
の植物蛋白質の配列中に存在するが、そのフラグメント
であってかつ未だ知られていなかった有用性を有する。
かかる観点からアンジオテンシン変換酵素阻害剤等とし
て既知のものを除いた下記ペプチドは本発明者らの知る
限りにおいて新規化合物である： His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, L
eu-Pro-Pro-Pro-Val, Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gl
n-Pro-His-Pro, Lys-Pro-Pro-Val, Lys-Pro-Pro-Ile 及
び Thr-Pro-Pro-Val。 なお、本願の特許請求の範囲のペプチド中、Val-His-Le
u-Pro-Pro-Pro, Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His及びHis-Leu-
Pro-Pro-Pro-Val は公知である（特開平２−３６１２
７，Agric.Biol. Chem. 53, 1077 (1989))。Although the peptides in the claims of the present application are present in the sequence of known plant proteins, they are fragments thereof and have a previously unknown utility.
In view of this, the following peptides, except those known as angiotensin converting enzyme inhibitors and the like, are novel compounds to the best of our knowledge: His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu-Pro- Pro-Pro-Val, L
eu-Pro-Pro-Pro-Val, Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gl
n-Pro-His-Pro, Lys-Pro-Pro-Val, Lys-Pro-Pro-Ile and Thr-Pro-Pro-Val. Incidentally, in the peptides of the claims of the present application, Val-His-Le
u-Pro-Pro-Pro, Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His and His-Leu-
Pro-Pro-Pro-Val is publicly known (JP-A-2-3612)
7, Agric. Biol. Chem. 53 , 1077 (1989)).
【００１０】本発明で使用するペプチドは通常有機化学
的な合成方法によりアミノ酸を段階的に導入する方法、
または天然蛋白質の酵素加水分解法により製造される
が、また、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド合
成法、遺伝子工学的方法等によって製造することも可能
である。これまで多くのペプチド合成方法が知られてお
り、例えば泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典、
「ペプチド合成の基礎と実験」丸善（株）に詳細に記載
されている。本発明で用いるペプチドはこれらの合成法
のいずれかによって、例えばいわゆる固相ペプチド合成
または液相ペプチド合成によって製造することができ
る。[0010] The peptide used in the present invention is usually a method of introducing amino acids stepwise by an organic chemical synthesis method,
Alternatively, it is produced by an enzymatic hydrolysis method of a natural protein, but it can also be produced by a peptide synthesis method using a reverse reaction of a hydrolase, a genetic engineering method, or the like. Many peptide synthesis methods are known so far, for example, Nobuo Izumiya, Tetsuo Kato, Higashihiko Aoyagi, Michinori Waki,
"Basics and experiments of peptide synthesis" are described in detail in Maruzen Co., Ltd. The peptide used in the present invention can be produced by any of these synthesis methods, for example, by so-called solid phase peptide synthesis or solution phase peptide synthesis.
【００１１】液相ペプチド合成は上述の「ペプチド合成
の基礎と実験」に記載されており、それにしたがって、
たとえば本ペプチドのＣ末端に位置するべきアミノ酸で
あってそのカルボキシル基がベンジル基（Bzl)、ｔ−ブ
チル基（t-Bu) 等で保護されたアミノ酸とＣ末端アミノ
酸に隣接して位置するべきアミノ酸であってそのα−ア
ミノ基がｔ−ブチルオキシカルボニル基(Boc) 、ベンジ
ルオキシカルボニル基(z) 等で保護されたアミノ酸をジ
メチルホルムアミド(DMF) 、ジメチルアセトアミド等に
溶解し、それらをジシクロヘキシルカルボジイミド(DC
C) 及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)の存
在下室温で一夜反応させることによって行うことができ
る。ついで生成物のアミノ保護基の常法による除去の後
に得られるジペプチドをアミノ保護した第３のアミノ酸
と同様に反応してアミノ保護基を除去し、ついで同様な
手順を繰り返して本ペプチドを得る。反応させるアミノ
酸が反応に関与すべきでないα位以外のアミノ基、グア
ニジノ基またはイミダゾリル基を有する場合には、これ
らの基は一般に反応に先立って保護すべきである。アル
コール性ヒドロキシル基の保護基 Bzl等包含し、α位以
外のアミノ基の保護基はα−アミノ基の保護基として述
べたものを包含し、グアニジノ基の保護基はトシル基
(Tos)等を包含し、イミダゾリル基の保護基は Tos等を
包含する。これらの保護基の導入は常法によって、例え
ば上述の「ペプチド合成の基礎と実験」に記載されたよ
うにして行うことができる。最終反応の終了後、これら
の保護基を除去するが、これらの脱保護は常法によっ
て、例えば上述の「ペプチド合成の基礎と実験」に記述
されたようにして行うことができる。例えば、アミノ保
護基については Bocはトリフルオロ酢酸(TFA) またはギ
酸によって、Ｚは接触還元によって、カルボキシル保護
基については、Bzl は、例えば、接触還元によって、ｔ
−Buは TFAまたは HCl／ジオキサンによって除去するこ
とができる。さらに、アルコール性ヒドロキシル基につ
いては、Bzl は、例えば、接触還元またはHFによって、
グアニジノ及びイミダゾリル保護基については TosはNa
/NH3またはHFによって除去することができる。[0011] Liquid phase peptide synthesis is described in the above "Basic and Experimental Peptide Synthesis",
For example, an amino acid to be located at the C-terminus of the present peptide, whose carboxyl group is protected by a benzyl group (Bzl), a t-butyl group (t-Bu) or the like, and an amino acid to be located adjacent to the C-terminal amino acid. Amino acids whose α-amino group is protected with a t-butyloxycarbonyl group (Boc), a benzyloxycarbonyl group (z), etc. are dissolved in dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide, etc., and these are dissolved in dicyclohexyl. Carbodiimide (DC
C) and reaction in the presence of 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) at room temperature overnight. The dipeptide obtained after removal of the amino-protecting group of the product by a conventional method is reacted in the same manner as the amino-protected third amino acid to remove the amino-protecting group, and the same procedure is repeated to obtain the present peptide. If the amino acid to be reacted has amino, guanidino or imidazolyl groups other than the α-position which should not participate in the reaction, these groups should generally be protected prior to the reaction. Protecting group for alcoholic hydroxyl group Bzl, etc., protecting group for amino group other than α-position includes those described as protecting group for α-amino group, and protecting group for guanidino group is tosyl group.
(Tos) and the like, and the protecting group for the imidazolyl group includes Tos and the like. Introduction of these protecting groups can be carried out by a conventional method, for example, as described in the above-mentioned "Basic and Experimental Peptide Synthesis". After completion of the final reaction, these protecting groups are removed, and these deprotection can be carried out by a conventional method, for example, as described in the above-mentioned “Basic and Experimental Peptide Synthesis”. For example, for the amino protecting group, Boc is with trifluoroacetic acid (TFA) or formic acid, for Z with catalytic reduction, for the carboxyl protecting group, Bzl is, for example, with catalytic reduction.
-Bu can be removed by TFA or HCl / dioxane. Further, for alcoholic hydroxyl groups, Bzl may be, for example, by catalytic reduction or HF.
For guanidino and imidazolyl protecting groups Tos is Na
Can be removed by / NH 3 or HF.
【００１２】一方、固相ペプチド合成については、ペプ
チドシンセサイザー（例えばアプライドバイオシステム
ズ社によって生産された４３０Ａ型ペプチドシンセサイ
ザー）を用いる合成が最近広く用いられている。すなわ
ち、この方法においては基本的には、アミノ基が Bocで
保護されたα−アミノ酸（Boc −アミノ酸）を、出発物
質としての、例えば、L-Pro が結合したフェニルアセト
アミドメチル（PAM)樹脂、すなわち、L-Pro-O-CH2 -PAM
( アプライドバイオシステムズ社より入手し得る) のＮ
−側からペプチドと Bocの除去の繰り返しによって段階
的に延長する。Boc-Arg(Mts)(Mtsはメシチレン-2- スル
ホニルである）及び Boc-L-Glnは中間体として１−ヒド
ロキシベンゾトリアゾール(HOBT)を経由する延長反応に
付し、他のBoc-アミノ酸は中間体として DCCを使用する
対称無水物を経由する延長反応に付す。上記 Boc- アミ
ノ酸においては、反応性官能基がある場合には、一般に
それを適当な保護基によって保護するべきである。本発
明に関して保護 Boc- アミノ酸の例は Boc-L-Arg(Mts)
、Boc-L-Lys(Cl-Z)(Cl-Zは4 −クロロベンジルオキシ
カルボニルである）、Boc-L-Thr(Bzl)、Boc-L-His(DNP)
(DNPは２，４−ジニトロフェニルである）等である。On the other hand, for solid phase peptide synthesis, synthesis using a peptide synthesizer (for example, a 430A type peptide synthesizer produced by Applied Biosystems) has recently been widely used. That is, in this method, basically, an α-amino acid whose amino group is protected by Boc (Boc-amino acid) is used as a starting material, for example, a phenylacetamidomethyl (PAM) resin to which L-Pro is bound, That is, L-Pro-O-CH 2 -PAM
N (available from Applied Biosystems)
-Stepwise extension by repeated removal of peptide and Boc from the side. Boc-Arg (Mts) (Mts is mesitylene-2-sulfonyl) and Boc-L-Gln are subjected to an elongation reaction via 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) as an intermediate, while other Boc-amino acids are Subject to an elongation reaction via a symmetrical anhydride using DCC as an intermediate. In the above Boc-amino acids, if there is a reactive functional group, it should generally be protected by a suitable protecting group. An example of a protected Boc-amino acid in the context of the present invention is Boc-L-Arg (Mts)
, Boc-L-Lys (Cl-Z) (Cl-Z is 4-chlorobenzyloxycarbonyl), Boc-L-Thr (Bzl), Boc-L-His (DNP)
(DNP is 2,4-dinitrophenyl) and the like.
【００１３】４３０Ａ型ペプチドシンセサイザーを用い
る合成系においては、アミノ酸物質以外に以下の試薬及
び溶媒を用いる：Ｎ，Ｎ−ジイソプピルエチルアミン
（TFAニュートラライザー), TFA (Boc 切断), MeOH(生
成した尿素化合物の溶解及び除去), HOBT (0.5M HOBT/D
MF), DCC (0.5M DCC/ ジクロロメタン(DCM), DCM 及び
DMF(溶媒, ニュートラライザー (70％ エタノールアミ
ン，29.5％メタノール）（廃液の中和）。アミノ酸物質
及びこれらの試薬及び溶媒を定められた所に装備する。
これらの物質の使用はペプチドシンセサイザーによって
自動的に行われる。反応温度及び時間の設定も自動的に
なされるが、反応温度は通常室温である。上記手段によ
ってペプチド中の反応性官能基が保護されたペプチド -
O-CH2-PAMが得られる。上記固相ペプチド合成の実験の
操作はアプライドバイオシステムズ社による４３０Ａ型
ペプチドシンセサイザーユーザーズマニュアル（Part N
umber 900066, Version 1.3B, July 1, 1988) に従って
行った。In the synthesis system using the 430A peptide synthesizer, the following reagents and solvents are used in addition to the amino acid substance: N, N-diisopropylethylamine (TFA neutralizer), TFA (Boc cleavage), MeOH (produced) Dissolution and removal of urea compounds), HOBT (0.5M HOBT / D
MF), DCC (0.5M DCC / dichloromethane (DCM), DCM and
DMF (solvent, neutralizer (70% ethanolamine, 29.5% methanol) (neutralization of waste liquid). Equip amino acid substances and their reagents and solvents at designated places.
The use of these substances is done automatically by the peptide synthesizer. The reaction temperature and time are also set automatically, but the reaction temperature is usually room temperature. Peptide in which the reactive functional group in the peptide is protected by the above means-
O-CH 2 -PAM is obtained. The operation of the solid phase peptide synthesis experiment is described in Applied Biosystems 430A peptide synthesizer user's manual (Part N
umber 900066, Version 1.3B, July 1, 1988).
【００１４】得られた反応性官能基が保護されたペプチ
ド-O-CH2-PAMを常法に従って、例えば上述の「ペプチド
合成の基礎と実験」または４３０Ａ型ペプチドシンセサ
イザーユーザーズマニュアルに記述されたようにして、
例えば保護基の切断によって生じるカチオンを捕獲する
ためのスカベンジャーとしてのチオアニソール及び／ま
たはエタンジチオールの存在下にトリフルオロメタンス
ルホン酸（TFMSA)をTFMSA の希釈剤としての TFAと共に
用いて処理して樹脂及び保護基を切断しそれによって目
的とするペプチドを得る。上記 TFMSA法において、保護
されたペプチド-O-CH2 -PAMがL-His(DNP)残基を有する
場合には、これをチオフェノールによるDNP の除去の後
上記処理に付す。また、例えば（株）ペプチド研究所製
のフッ化水素装置に反応性官能基が保護されたペプチド
-O-CH2-PAM、アニソール及びフッ化水素を導入し、−２
℃で１時間の反応を行った後、フッ化水素の除去とエー
テルによる洗浄を行うことにより目的とするペプチドを
得ることもできる。The obtained reactive functional group-protected peptide-O-CH 2 -PAM is prepared according to a conventional method, for example, as described in the above-mentioned “Basic and Experimental Peptide Synthesis” or the 430A peptide synthesizer user's manual. And then
For example, treating resin and trifluoromethanesulfonic acid (TFMSA) with TFA as a diluent for TFMSA in the presence of thioanisole and / or ethanedithiol as scavengers to capture cations resulting from cleavage of protecting groups. Cleavage of the protecting group, thereby obtaining the desired peptide. In the TFMSA method, when the protected peptide -O-CH 2 -PAM has a L-His (DNP) residues, which is subjected to the process after the DNP removal by thiophenol. Further, for example, a peptide having a reactive functional group protected by a hydrogen fluoride device manufactured by Peptide Research Institute
-O-CH 2 -PAM, anisole and hydrogen fluoride are introduced, and -2
After performing the reaction at 1 ° C. for 1 hour, the target peptide can be obtained by removing hydrogen fluoride and washing with ether.
【００１５】本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害
剤中の有効成分として使用し得るペプチド中、His-Leu-
Pro-Pro-Pro-Val, His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu-P
ro-Pro-Pro-Val, Leu-Pro-Pro-Pro-Val, Pro-Pro-Pro-V
al, 及び Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His-
Proはトウモロコシ蛋白質γ−ゼインをズブチリシン、
ペプシン、パパインまたは類似の基質を有するプロテア
ーゼで酵素的にあるいは酸で加水分解することによって
も得ることができる。本酵素反応は通常単に水中または
緩衝液（例えは、トリス−HCl 緩衝液またはリン酸緩衝
液) 中で行う。[0015] Among the peptides which can be used as an active ingredient in the prolyl endopeptidase inhibitor of the present invention, His-Leu-
Pro-Pro-Pro-Val, His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu-P
ro-Pro-Pro-Val, Leu-Pro-Pro-Pro-Val, Pro-Pro-Pro-V
al, and Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His-
Pro corn protein γ-zein subtilisin,
It can also be obtained by enzymatic or acid hydrolysis with a protease having pepsin, papain or a similar substrate. The enzymatic reaction is usually performed simply in water or a buffer (for example, Tris-HCl buffer or phosphate buffer).
【００１６】使用するγ−ゼインはγ−ゼイン単独であ
ってもよいし、γ−ゼインの他にα−ゼイン、β−ゼイ
ンを含む混合物であってもよい。これらのゼインは市販
のものでもよいし、またコーンスターチの製造過程で得
られるとうもろこし蛋白質から分離したゼイン、または
それから公知の手法で分離した（Plant Physiol., 8062
3 (1986))γ−ゼインであってもよい。また特開平２−
３６１２７の参考例１にγ−ゼインの製造例が示されて
いる。使用される酵素はズブチリシン、パパインまたは
ペプンである。The γ-zein used may be γ-zein alone or a mixture containing α-zein and β-zein in addition to γ-zein. These zeins may be commercially available, zein separated from corn protein obtained in the process of producing corn starch, or zein separated therefrom by a known method (Plant Physiol., 80 62).
3 (1986)) may be γ-zein. In addition, Japanese Unexamined Patent Publication
Reference Example 1 of No. 36127 shows a production example of γ-zein. The enzyme used is subtilisin, papain or pepun.
【００１７】蛋白質基質の濃度は攪拌及び混合を行うこ
とが可能である限り、特に限定されないが、攪拌を容易
にする、２−２０％（w/v)の範囲にあることが好まし
い。酵素サーモライシンの添加量はその力価によって変
化するが、蛋白質に基づいて通常0.01重量％以上、好ま
しくは0.1 〜10重量％であるのが適当である。酵素の一
部を反応の途中で加えることも可能である。反応のpH及
び温度は使用酵素の至適温度付近であればよく、ズブチ
リシンはpH６〜９、温度30〜70℃、パパイン及びペプシ
ンではpH５〜８、温度30〜60℃が適当である。反応時間
は酵素の種類、添加量、反応温度、反応pHによって異な
るため一定ではないが、通常は１〜40時間程度である。
加水分解反応の停止は公知の方法によって、例えば、加
水分解物の加熱によるかクエン酸、リンゴ酸等の有機
酸、塩酸、リン酸等の無機酸または水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム等のアルカリの添加によるpH変化による
酵素の不活性化によって、または限外濾過膜等を用いる
濾過による分離によって行うことができる。The concentration of the protein substrate is not particularly limited as long as stirring and mixing can be performed, but is preferably in the range of 2 to 20% (w / v) for facilitating stirring. The amount of the enzyme thermolysin to be added varies depending on its titer, but it is usually at least 0.01% by weight, preferably 0.1 to 10% by weight, based on the protein. It is also possible to add a part of the enzyme during the reaction. The pH and temperature of the reaction may be near the optimum temperature of the enzyme used. Subtilisin is suitably at pH 6-9, temperature 30-70 ° C, and papain and pepsin at pH 5-8, temperature 30-60 ° C. The reaction time varies depending on the type of the enzyme, the amount added, the reaction temperature and the reaction pH, and is not constant, but is usually about 1 to 40 hours.
Termination of the hydrolysis reaction by a known method, for example, by heating the hydrolyzate or citric acid, organic acids such as malic acid, hydrochloric acid, inorganic acids such as phosphoric acid or sodium hydroxide,
It can be carried out by inactivating the enzyme by changing the pH by adding an alkali such as potassium hydroxide, or by separation by filtration using an ultrafiltration membrane or the like.
【００１８】得られる加水分解物溶液を次いで固液分離
（例えば、遠心分離または濾過）に付し、得られる液体
を限外濾過、ゲル濾過等によって分画して10000 以下の
分子量を有する液体を得る。この液体は本発明の目的ペ
プチドを含有し、この液体またはその濃縮物( 例えば、
凍結乾燥物) をさらに分画して各目的ペプチドを得る。
本発明においては上記凍結乾燥物をγ−ゼイン凍結乾燥
物と称し、それを用いる場合についてさらに説明する。
γ−ゼイン凍結乾燥物をまずアニオン交換樹脂、例えば
弱塩基性アニオン交換樹脂（例えば、東ソー（株）製 D
EAE トヨパール650M) による処理、またはカチオン交換
樹脂、例えば、弱酸性カチオン交換樹脂( 例えば、東ソ
ー（株）製 SP-トヨパール650M) による処理に付す。The resulting hydrolyzate solution is then subjected to solid-liquid separation (eg, centrifugation or filtration), and the resulting liquid is fractionated by ultrafiltration, gel filtration, or the like to obtain a liquid having a molecular weight of 10,000 or less. obtain. This liquid contains the target peptide of the present invention, and the liquid or a concentrate thereof (for example,
(Lyophilized product) is further fractionated to obtain each target peptide.
In the present invention, the freeze-dried product is referred to as γ-zein freeze-dried product, and the case where it is used will be further described.
First, the lyophilized γ-zein is subjected to an anion exchange resin, for example, a weakly basic anion exchange resin (for example, D
EAE (Toyopearl 650M) or a cation exchange resin, for example, a weakly acidic cation exchange resin (for example, SP-Toyopearl 650M manufactured by Tosoh Corporation).
【００１９】γ−ゼイン凍結乾燥物を最初にアニオン交
換樹脂に通す分画方法においては、各ペプチドを直線濃
度勾配溶出（例えば、DEAET トヨパール 650M 使用の場
合にはトリス緩衝液→適当な濃度の、トリス緩衝液中の
NaCl) によって分画する。溶出液をいくつかの画分に取
り、各々をゲル濾過( 例えば、セファデックスLH-20使
用) 、カチオン交換樹脂処理( 例えば、SP- トヨパール
650M 使用) 、逆相HPLC( 例えば、資生堂（株）製のオ
クタデシルシランの商品名であるカプセルパックC18 ま
たはセンシュウ化学（株）製のオクタデシルシランの商
品名であるセンシュウパック1251-Y) 等に付して個々の
ペプチドに分画する。また、簡単には、後記実施例２に
例示される如く、上記10000 以下の分子量を有する液体
を濃縮し、HPLCによって化学合成した本ペプチドと同位
置に溶出されてくるペプチドを分取することによって各
ペプチドを得ることもできる。In the fractionation method in which the lysate of γ-zein is first passed through an anion exchange resin, each peptide is eluted with a linear gradient (for example, in the case of using DEAET Toyopearl 650M, a tris buffer → an appropriate concentration). In Tris buffer
(NaCl). The eluate is collected in several fractions, each of which is subjected to gel filtration (for example, using Sephadex LH-20), cation exchange resin treatment (for example, SP-Toyopearl)
650M), reverse-phase HPLC (for example, Capsule Pack C18 , a trade name of octadecylsilane manufactured by Shiseido Co., Ltd., or Sensupak 1251-Y, a trade name of octadecylsilane manufactured by Senshu Chemical Co., Ltd.) And fractionated into individual peptides. In brief, as exemplified in Example 2 below, the above-mentioned liquid having a molecular weight of 10,000 or less is concentrated and the peptide eluted at the same position as the present peptide chemically synthesized by HPLC is fractionated. Each peptide can also be obtained.
【００２０】本ペプチドの酸付加塩は常法によって製造
することができる。例えば、酸付加塩は本ペプチドとそ
れに対し０当量より大からそこに含まれる塩基製アミノ
酸残基の総数＋１当量までの量の酸とを水中で反応さ
せ、ついで生成物を凍結乾燥することによって得ること
ができる。また、本発明における製造過程で酸付加塩と
して得られる場合もある。The acid addition salt of the present peptide can be produced by a conventional method. For example, an acid addition salt is obtained by reacting the present peptide with an acid in an amount of from greater than 0 equivalent to the total number of base amino acid residues contained therein to +1 equivalent in water, and then lyophilizing the product. Obtainable. Further, it may be obtained as an acid addition salt in the production process in the present invention.
【００２１】本ペプチド及びその酸付加塩はプロリルエ
ンドペプチダーゼ阻害作用を有し、ヒトの痴呆症の治
療、予防に有効であると期待される。本ペプチド及びそ
の酸付加塩はそのまま、または通常少なくとも１つの製
薬補助剤と製薬組成物にして使用する。本ペプチド及び
その酸付加塩は非経口（すなわち、静脈注射、直腸投与
等）または経口的に投与し、各投与方法に適した形態に
製剤することができる。The present peptide and its acid addition salt have a prolyl endopeptidase inhibitory activity and are expected to be effective in treating and preventing dementia in humans. The present peptide and its acid addition salt are used as they are or usually in a pharmaceutical composition with at least one pharmaceutical auxiliary. The present peptide and its acid addition salt can be administered parenterally (that is, intravenous injection, rectal administration, etc.) or orally, and can be formulated into a form suitable for each administration method.
【００２２】注射剤としての製剤形態は、通常滅菌水水
溶液を包含する。上記形態の製剤はまた緩衝剤pH調節剤
（リン酸水素ナトリウム、クエン酸等）、等張化剤（塩
化ナトリウム、グルコース等）、保存剤（パラオキシ安
息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル等) 等の
水以外の他の製薬補助剤を含有することができる。該製
剤は細菌保持フィルターを通す濾過、組成物への殺菌剤
の混入、組成物の照射や加熱によって滅菌することがで
きる。該製剤はまたは殺菌固体組成物として製造し、用
時滅菌水等に溶解して使用することもできる。The preparation form as an injection usually includes a sterilized aqueous solution. Formulations of the above form also include buffer pH adjusters (sodium hydrogen phosphate, citric acid, etc.), tonicity agents (sodium chloride, glucose, etc.), preservatives (methyl parahydroxybenzoate, propyl p-hydroxybenzoate, etc.) And other pharmaceutical auxiliaries other than water. The preparation can be sterilized by filtration through a bacteria-retaining filter, by mixing a bactericide into the composition, or by irradiating or heating the composition. The preparation can be produced as a sterilized solid composition or dissolved in sterile water or the like before use.
【００２３】経口投与剤は胃腸器官による吸収に適した
形に製剤する。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、粉
末剤は常用の製薬補助剤、例えば結合剤（シロップ、ア
ラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガカント、ポ
リビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース
等）、賦形剤（ラクトース、スクロース、コーンスター
チ、リン酸カルシウム、ソルビット、グリシン等）、滑
沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレ
ングリコール、シリカ等）、崩壊剤（ポテトスターチ、
カルボキシメチルセルロース等）、湿潤剤（ラウリル硫
酸ナトリウム等）を包含することができる。錠剤は常法
によりコーティングすることができる。経口液剤は水溶
液等にしたり、ドライプロダクトにすることができる。
そのような経口液剤は常用の添加剤例えば保存剤（ｐ−
ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、ソルビン
酸等）を包含していてもよい。[0023] Oral formulations are formulated in a form suitable for absorption by the gastrointestinal tract. Tablets, capsules, granules, fine granules and powders are commonly used pharmaceutical auxiliaries such as binders (syrup, gum arabic, gelatin, sorbit, tragacanth, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylcellulose, etc.), excipients (lactose) Sucrose, corn starch, calcium phosphate, sorbite, glycine, etc.), lubricants (magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, etc.), disintegrants (potato starch,
Carboxymethylcellulose) and wetting agents (such as sodium lauryl sulfate). Tablets can be coated by conventional methods. The oral solution can be made into an aqueous solution or the like or a dry product.
Such an oral solution is prepared by using a conventional additive such as a preservative (p-
Methyl or propyl hydroxybenzoate, sorbic acid, etc.).
【００２４】本プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤中の
本ペプチドまたはその酸付加塩の量は種々変えることが
できるが、通常５〜100%(w/w) 、特に10〜60%(w/w)が適
当である。本プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の投与
量は有効成分として10〜200mg/kg/dayが適当である。な
お、本ペプチドの急性毒性はLD50(ICR系マウス、経口投
与）＞3g/kg である。The amount of the present peptide or its acid addition salt in the present prolyl endopeptidase inhibitor can be varied, but is usually 5 to 100% (w / w), particularly 10 to 60% (w / w). Is appropriate. The dose of the present prolyl endopeptidase inhibitor is suitably from 10 to 200 mg / kg / day as an active ingredient. Incidentally, the acute toxicity of the peptides are LD 50 (ICR strain mice, oral administration)> 3g / kg.
【００２５】また、本ペプチドは多量に摂取しても生体
に悪影響を与えない利点を有することから、そのまま、
または種々の栄養分等を加えて、もしくは飲食品中に含
有せしめて抗痴呆作用、痴呆症予防の機能をもたせた機
能性食品、健康食品として食してもよい。すなわち、例
えば各種ビタミン類、ミネラル類等の栄養分を加えて、
例えば栄養ドリンク、豆乳、スープ等の液状の食品や各
種形状の固形食品、さらには粉末状としてそのままある
いは各種食品へ添加して用いることもできる。かかる機
能性食品、健康食品としての本プロリルエンドペプチダ
ーゼ阻害剤中の有効成分の含有量、摂取量はそれぞれ上
記製薬における含有量、投与量と同様でよい。Further, since the present peptide has the advantage that it does not adversely affect the living body even when ingested in large amounts,
Alternatively, it may be added to various nutrients or the like or contained in foods and drinks to be eaten as a functional food or health food having an anti-dementia effect and a function of preventing dementia. That is, for example, by adding nutrients such as various vitamins and minerals,
For example, liquid foods such as nutritional drinks, soy milk, and soups, solid foods of various shapes, and powders can be used as they are or added to various foods. The content and intake of the active ingredient in the present prolyl endopeptidase inhibitor as such a functional food or health food may be the same as those in the above-mentioned pharmaceuticals.
【００２６】[0026]
【実施例】次に本発明を実施例により説明する。実施例１ His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val の合成とプロリル
エンドペプチダーゼ阻害活性 a) His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val の合成 アプライド・バイオシステムズ社製ペプチド合成装置
（４３０Ａ型）に0.5 ミリモルの Boc-Val-O-CH2-PAM樹
脂及び各２ミリモルのBoc-His(Tos), Boc-Leu, Boc-Pro
を充填し、DCC による無水対称法により His-(Tos)-Leu
-Pro-Pro-Pro-Val-O-CH2-PAMを合成した。なお、Tos は
トシル基を示す。次に、ペプチド研究所製フッ化水素装
置に上記合成ペプチド樹脂を導入し、アニソール1.5ml
を添加後、フッ化水素10mlを導入した。−２℃、１時間
の反応後、フッ化水素を減圧下に除去し、ペプチドを無
水エーテル、クロロホルムで交互に３回洗浄し、２Ｎ酢
酸60mlにペプチドを溶解させ、凍結乾燥した。この方法
により His-Leu-Pro-Pro-Pro-Valの白色粉末 130mgを得
た。次いで本ペプチドを高速液体クロマトグラフィー(H
PLC)により精製した。Next, the present invention will be described with reference to examples. Example 1 Synthesis of His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val and prolyl endopeptidase inhibitory activity a) Synthesis of His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val Peptide synthesizer (Model 430A) manufactured by Applied Biosystems ) To 0.5 mmol of Boc-Val-O-CH 2 -PAM resin and 2 mmol each of Boc-His (Tos), Boc-Leu, Boc-Pro
, And His- (Tos) -Leu
The -Pro-Pro-Pro-Val- O-CH 2 -PAM were synthesized. Note that Tos represents a tosyl group. Next, the synthetic peptide resin was introduced into a hydrogen fluoride device manufactured by Peptide Research Institute, and anisole 1.5 ml was added.
After the addition, 10 ml of hydrogen fluoride were introduced. After the reaction at -2 ° C for 1 hour, hydrogen fluoride was removed under reduced pressure, the peptide was washed three times with anhydrous ether and chloroform alternately, and the peptide was dissolved in 60 ml of 2N acetic acid and freeze-dried. By this method, 130 mg of His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val white powder was obtained. Next, the present peptide was subjected to high performance liquid chromatography (H
(PLC).
【００２７】HPLCよる精製条件を下記に示す。 カラム : メルク社製 LiChosorb RP-SelectB (250 x
φ25mm) 溶出液 : 0.1%トリフルオロ酢酸を含む3.5 〜67% アセ
トニトリルのグラジエント 流速 : 6ml/min 本ペプチドの各種分析値を後記表１に示す。なお、アミ
ノ酸分析は6N塩酸 110℃,24 時間の加水分解後、日立８
３５型アミノ酸分析装置により行った。また、質量分析
は日本電子製HX-110型質量分析装置によるFAB-MS法で行
った。The conditions for purification by HPLC are shown below. Column: Merck LiChosorb RP-SelectB (250 x
Eluent: gradient of 3.5 to 67% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid Flow rate: 6 ml / min Various analytical values of this peptide are shown in Table 1 below. Amino acid analysis was performed by hydrolyzing 6N hydrochloric acid at 110 ° C for 24 hours.
The analysis was performed using a 35-type amino acid analyzer. The mass spectrometry was performed by the FAB-MS method using a JEOL HX-110 mass spectrometer.
【００２８】b) Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro, Leu-Pro-P
ro-Pro-Val-His, His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu-Pr
o-Pro-Pro-Val, Leu-Pro-Pro-Pro-Val, Pro-Pro-Pro-Va
l, Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His-Pro, Ly
s-Pro-Pro-Val, Lys-Pro-Pro-Ile, Thr-Pro-Pro-Val の
合成 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val の合成と同様にアプライド・
バイオシステムズ社製ペプチド合成装置（４３０Ａ型）
を使用した DCCによる無水対称法により合成し、フッ化
水素により保護基と樹脂を切断した。ペプチドの精製条
件も前述と同一である。これらのペプチドの各種分析値
を後記表１に示す。B) Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro, Leu-Pro-P
ro-Pro-Val-His, His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu-Pr
o-Pro-Pro-Val, Leu-Pro-Pro-Pro-Val, Pro-Pro-Pro-Va
l, Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His-Pro-Gln-Pro-His-Pro, Ly
Synthesis of s-Pro-Pro-Val, Lys-Pro-Pro-Ile, Thr-Pro-Pro-Val As in the synthesis of His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val,
Biosystems Peptide Synthesizer (Type 430A)
Was synthesized by an anhydrous symmetric method using DCC, and the protecting group and the resin were cleaved with hydrogen fluoride. The conditions for peptide purification are the same as described above. Various analytical values of these peptides are shown in Table 1 below.
【００２９】c) プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性
の測定 以上のようにして得たペプチドのプロリルエンドペプチ
ダーゼ阻害活性を以下のごとく測定した。 c-1) 微生物由来プロリルエンドペプチダーゼに対する
阻害活性の測定 生化学工業（株）より購入したF.meningosepticum 由来
プロリルエンドペプチダーゼを pH7.0の0.1Mリン酸緩衝
液に溶解し、0.1unit/mlの酵素溶液とした。また、２mM
Z-Gly-Pro-pNA（バッケム社製、Ｚはベンジルオキシカ
ルボニル基、pNA はパラニトロアニリドを示す) を上記
リン酸緩衝液(40%ジオキサンを含む) に溶解し基質溶液
とした。上記の各種ペプチドの水溶液をそれぞれ1.5ml
容量のプラスチックチューブに40μl 入れ、これにリン
酸緩衝液80μl 、基質溶液40μl を添加し、30℃で10分
間保温した後、上記プロリルエンドペプチダーゼ溶液40
μl を加えよく混合して、30℃で10分間の反応を行っ
た。その後、１Ｎ HCl 200μl を添加することにより反
応を停止させた。反応停止後、酵素反応により遊離して
くるパラニトロアニリンをHPLCにより定量した。HPLC測
定条件は以下の通りである。C) Measurement of prolyl endopeptidase inhibitory activity The prolyl endopeptidase inhibitory activity of the peptide obtained as described above was measured as follows. c-1) Measurement of inhibitory activity against microbial prolyl endopeptidase F. meningosepticum- derived prolyl endopeptidase purchased from Seikagaku Corporation was dissolved in 0.1 M phosphate buffer at pH 7.0, and 0.1 unit / ml of enzyme solution. Also, 2mM
Z-Gly-Pro-pNA (manufactured by Bachem, Z represents a benzyloxycarbonyl group, and pNA represents paranitroanilide) was dissolved in the above phosphate buffer (containing 40% dioxane) to prepare a substrate solution. 1.5 ml of aqueous solution of each of the above peptides
Put 40 μl in a volume of plastic tube, add 80 μl of phosphate buffer and 40 μl of the substrate solution, and incubate at 30 ° C. for 10 minutes, then add the prolyl endopeptidase solution 40
μl was added, mixed well, and reacted at 30 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the reaction was stopped by adding 200 μl of 1N HCl. After the reaction was stopped, paranitroaniline released by the enzyme reaction was quantified by HPLC. The HPLC measurement conditions are as follows.
【００３０】ＨＰＬＣ測定条件 カラム : ウオーターズ社製 μBondasphere 5 μ C8-
300A (150 x φ3.9mm) 溶出 : 0.1%トリフルオロ酢酸を含む53% アセトニト
リル 検出 : 410nm の吸収 この様な実験を複数行い、阻害率を次の式より算出し
た。 Ａ：阻害剤を含まない場合のパラニトロアニリンのピー
ク面積 Ｂ：阻害剤添加の場合のパラニトロアニリンのピーク面
積 その結果を後記表２に示す。また、阻害率50％のときの
ペプチドの濃度をIC50値とし、それを後記表３に示す。HPLC measurement conditions Column: μBondasphere 5 μC8-, manufactured by Waters
300A (150 x φ3.9mm) Elution: 53% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid Detection: absorbance at 410nm These experiments were performed multiple times, and the inhibition rate was calculated by the following formula. A: Peak area of paranitroaniline without an inhibitor B: Peak area of paranitroaniline with an inhibitor added The results are shown in Table 2 below. The concentration of the peptide at an inhibition rate of 50% was defined as the IC 50 value, and is shown in Table 3 below.
【００３１】c-2) 牛脳由来プロリルエンドペプチダー
ゼに対する阻害活性の測定 牛脳アセトンパウダー( シグマ社製)25gを10mM EDTA 及
び 10mM 2-メルカプトエタノールを含む20mM Tris-HCI
緩衝液(pH7.0)200mlに溶解させ、16,000rpm,20分の遠心
を行い、上清を回収した。次いで、DEAE−トヨパール
（東ソー）によるカラムクロマトグラフィーにてプロリ
ルエンドペプチダーゼを部分精製し、0.1unit/mlの酵素
溶液とした。また、2 mM Z-Gly-Pro-pNAを上記Tris-HCl
緩衝液(40%ジオキサンを含む) に溶解し基質溶液とし
た。上記の各種ペプチドの水溶液をそれぞれ1.5ml 容量
のプラスチックチューブに40μl 入れ、これにリン酸緩
衝液80μl 、基質溶液40μl を添加し、37℃で10分間保
温した後、上記プロリルエンドペプチダーゼ溶液40μl
を加えよく混合して、37℃で10分間の反応させた。以下
の測定条件は微生物由来プロリルエンドペプチダーゼに
対する阻害活性の測定の場合と同一であり、その結果を
後記表４に示す。C-2) Measurement of Inhibitory Activity against Bovine Brain Prolyl Endopeptidase 25 g of bovine brain acetone powder (manufactured by Sigma) containing 20 mM Tris-HCI containing 10 mM EDTA and 10 mM 2-mercaptoethanol
It was dissolved in 200 ml of buffer (pH 7.0), centrifuged at 16,000 rpm for 20 minutes, and the supernatant was collected. Next, prolyl endopeptidase was partially purified by column chromatography using DEAE-Toyopearl (Tosoh) to obtain a 0.1 unit / ml enzyme solution. In addition, 2 mM Z-Gly-Pro-pNA was added to the above Tris-HCl
It was dissolved in a buffer (containing 40% dioxane) to obtain a substrate solution. 40 μl of each of the aqueous solutions of the various peptides described above was placed in a 1.5 ml plastic tube, 80 μl of a phosphate buffer solution and 40 μl of a substrate solution were added thereto, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 10 minutes, and then the prolyl endopeptidase solution 40 μl was added.
Was added and mixed well, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes. The following measurement conditions were the same as those for the measurement of the inhibitory activity on microbial prolyl endopeptidase, and the results are shown in Table 4 below.
【００３２】実施例２ γ−ゼインからのHis-Leu-Pro-
Pro-Pro-Val の生成 γ−ゼイン0.2gを50mM Tris-HCl (pH8.2) 12ml中に分散
させ、これにズブチリシン・カールズベルグ（シグマ社
製）10mgを加えた。37℃18時間の反応後、分子量10,000
の限外濾過膜( ミリポア社製モルカット) に付して通過
する低分子量ペプチドを回収した。これを濃縮して、HP
LCにおいて、化学合成したHis-Leu-Pro-Pro-Pro-Val と
同位置に溶出されてくるペプチドを分取し回収した。HP
LCの条件は以下の通りである。 ＨＰＬＣの分離条件 カラム : メルク社製 Superspher RP-8 (125 x φ4m
m) 溶出 : 0.1%トリフルオロ酢酸を含む７〜63% アセト
ニトリルグラジエント 検出 : 210nm の紫外部吸収 回収したペプチド溶液は、減圧乾固し最終標品とした。Example 2 His-Leu-Pro- from γ-zein
Production of Pro-Pro-Val 0.2 g of γ-zein was dispersed in 12 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 8.2), and 10 mg of subtilisin Carlsberg (manufactured by Sigma) was added thereto. After reaction at 37 ° C for 18 hours, molecular weight 10,000
And passed through an ultrafiltration membrane (Millipore Co., Ltd., Morcut) to recover the low-molecular-weight peptide passing therethrough. Concentrate this, HP
In LC, peptides eluted at the same position as the chemically synthesized His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val were collected and collected. HP
The LC conditions are as follows. HPLC separation column: Merck Superspher RP-8 (125 x φ4m
m) Elution: 7-63% acetonitrile gradient containing 0.1% trifluoroacetic acid Detection: ultraviolet absorption at 210 nm The collected peptide solution was dried under reduced pressure to obtain a final sample.
【００３３】[0033]
【表１】 合成ペプチドの分析値 ──────────────────────────────────── 〔α〕D 25( °) アミノ酸分析値 質量分析値 ペプチド (H2O) ( 組成比) FAB-MS (m/z) ──────────────────────────────────── Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro -192 Val 1.00, His 0.98, 659 (M+H)+ (C=0.4) Leu 1.04, Pro 3.11 Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His -228 Leu 1.00, Pro 3.05, 659 (M+H)+ (C=0.2) Val 1.00, His 1.03 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val -218 His 1.00, Leu 1.08, 659 (M+H)+ (C=0.3) Pro 2.92, Val 1.00 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val- -242 His 0.81, Leu 1.09, 1299 (M+H)+ His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val (C=0.1) Pro 3.09, Val 1.00 Leu-Pro-Pro-Pro-Val -238 Leu 1.00, Pro 3.08, 522 (M+H)+ (C=0.3) Val 1.04 Pro-Pro-Pro-Val -242 Pro 2.94, Val 1.00 409 (M+H)+ (C=0.4) Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His- -203 Pro 6.3 , Arg 0.8 , 1287 (M+H)+ Pro-Gln-Pro-His-Pro (C=0.3) Glu 2.0 , His 1.7 Lys-Pro-Pro-Val -169 Lys 0.89, Pro 2.06 440 (M+H)+ (C=0.4) Val 1.00 Lys-Pro-Pro-Ile -167 Lys 1.00, Pro 1.94 454 (M+H)+ (C=0.3) Ile 1.12 Thr-Pro-Pro-Val -192 Thr 1.00, Pro 2.07 413 (M+H)+ (C=0.5) Val 1.00 ────────────────────────────────────[Table 1] Analysis value of synthetic peptide ──────────────────────────────────── [α] D 25 (°) Amino acid analysis value Mass analysis value Peptide (H 2 O) (Composition ratio) FAB-MS (m / z) ─────────────────────── ───────────── Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro -192 Val 1.00, His 0.98, 659 (M + H) + (C = 0.4) Leu 1.04, Pro 3.11 Leu -Pro-Pro-Pro-Val-His -228 Leu 1.00, Pro 3.05, 659 (M + H) + (C = 0.2) Val 1.00, His 1.03 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val -218 His 1.00 , Leu 1.08, 659 (M + H) + (C = 0.3) Pro 2.92, Val 1.00 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val- -242 His 0.81, Leu 1.09, 1299 (M + H) + His- Leu-Pro-Pro-Pro-Val (C = 0.1) Pro 3.09, Val 1.00 Leu-Pro-Pro-Pro-Val -238 Leu 1.00, Pro 3.08, 522 (M + H) + (C = 0.3) Val 1.04 Pro-Pro-Pro-Val -242 Pro 2.94, Val 1.00 409 (M + H) + (C = 0.4) Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His- -203 Pro 6.3, Arg 0.8, 1287 (M + H) + Pro-Gln-Pro-His-Pro (C = 0.3) Glu 2.0, His 1.7 Lys-Pro-Pro-V al -169 Lys 0.89, Pro 2.06 440 (M + H) + (C = 0.4) Val 1.00 Lys-Pro-Pro-Ile -167 Lys 1.00, Pro 1.94 454 (M + H) + (C = 0.3) Ile 1.12 Thr-Pro-Pro-Val -192 Thr 1.00, Pro 2.07 413 (M + H) + (C = 0.5) Val 1.00 ────────────────────── ──────────────
【００３４】[0034]
【表２】 F.meningosepticum 由来プロリルエンドペプチダーゼに対する阻害活性 ──────────────────────────────────── ペ プ チ ド 濃度（μM) 阻害率（％） ──────────────────────────────────── Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro 800 31 Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His 800 12 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val 400 80 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val- His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val 400 88 Leu-Pro-Pro-Pro-Val 400 39 Pro-Pro-Pro-Val 400 26 Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His- Pro-Gln-Pro-His-Pro 400 14 Lys-Pro-Pro-Val 400 65 Lys-Pro-Pro-Ile 400 52 Thr-Pro-Pro-Val 400 12 ────────────────────────────────────[Table 2] Inhibitory activity against prolyl endopeptidase derived from F. meningosepticum ─ Peptide concentration (μM) Inhibition rate (%) ──────────────────────────────────── Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro 800 31 Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His 800 12 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val 400 80 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val -His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val 400 88 Leu-Pro-Pro-Pro-Val 400 39 Pro-Pro-Pro-Val 400 26 Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His- Pro-Gln- Pro-His-Pro 400 14 Lys-Pro-Pro-Val 400 65 Lys-Pro-Pro-Ile 400 52 Thr-Pro-Pro-Val 400 12 ──────────────── ────────────────────
【００３５】[0035]
【表３】 [Table 3]
【００３６】[0036]
【表４】 牛脳由来プロリルエンドペプチダーゼに対する阻害活性 ──────────────────────────────────── ペ プ チ ド 濃度（μM) 阻害率（％） ──────────────────────────────────── Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro 400 65 Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His 400 68 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val 400 28 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val- His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val 400 64 Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His- Pro-Gln-Pro-His-Pro 400 71 ────────────────────────────────────[Table 4] Inhibitory activity against bovine brain-derived prolyl endopeptidase Peptide concentration (μM) Inhibition rate (%) ──────────────────────────────────── Val -His-Leu-Pro-Pro-Pro 400 65 Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His 400 68 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val 400 28 His-Leu-Pro-Pro-Pro-Pro-Val- His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val 400 64 Pro-Arg-Pro-Gln-Pro-His- Pro-Gln-Pro-His-Pro 400 71 ────────────── ──────────────────────
【００３７】[0037]
【発明の効果】本発明によって新規かつ有用なプロリル
エンドペプチダーゼ阻害剤が提供される。According to the present invention, a novel and useful prolyl endopeptidase inhibitor is provided.
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/08 7/08 Ａ６１Ｋ 37/64 (72)発明者 前田 英勝 茨城県つくば市東１丁目１番３号 工業 技術院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 三吉 新介 千葉県船橋市日の出２丁目20番２号 昭 和産業株式会社 総合研究所内 審査官 田村 聖子 (56)参考文献 特開 平２−36127（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−31298（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−208299（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 38/55 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI C07K 7/06 C07K 7/08 7/08 A61K 37/64 (72) Inventor Hidekatsu Maeda 1-3-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki Pref. Inside the Research Institute of Microorganisms (72) Inventor Shinsuke Miyoshi 2-20-2 Hinode, Funabashi-shi, Chiba Pref. Showa Sangyo Co., Ltd. Examiner at the Research Institute Seiko Tamura (56) References JP-A-2-36127 (JP, A) JP-A-3-31298 (JP, A) JP-A-4-208299 (JP, A) (58) Fields investigated (Int. Cl. 7 , DB name) A61K 38/55 CA (STN) REGISTRY ( STN)
Claims (1)
チド及びその酸付加塩の少なくとも１種を有効成分とし
て含有するプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤： Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro、Leu-Pro-Pro-Pro-Val-His、
His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val、His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-H
is-Leu-Pro-Pro-Pro-Val、Leu-Pro-Pro-Pro-Val及びPro
-Pro-Pro-Val。 1. A prolyl endopeptidase inhibitor comprising at least one of the following peptides composed of L-form amino acids and acid addition salts thereof as an active ingredient: Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro, Leu -Pro-Pro-Pro-Val-His,
His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, His-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-H
is-Leu-Pro-Pro-Pro-Val, Leu-Pro-Pro-Pro-Val and Pro
-Pro-Pro-Val.
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