JPH05268967A - キメラインターロイキン5受容体/イムノグロブリンポ リペプチド - Google Patents
キメラインターロイキン5受容体/イムノグロブリンポ リペプチドInfo
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Abstract
(57)【要約】 (修正有)
【構成】 2つの部分DNA配列、すなわちヒトインタ
ーロイキン5受容体のα鎖および/またはβ鎖の断片
(該断片または断片の組み合わせはヒトのインターロイ
キン5と結合する) をコードしている1つの部分配列
と、IgG、IgA、IgM、IgEあるいはそれらの
一部のようなヒトイムノグロブリンのH鎖またはL鎖の
定常領域をコードしている他の部分配列と、から成るD
NA配列、該DNA配列を含むベクター、該ベクターで
形質転換された原核または真核宿主細胞、該DNA配列
によってコードされた組換え蛋白、該組換え蛋白を生産
するための方法、及び該組換え蛋白を含有する医薬組成
物に関する。 【効果】 得られたキメラポリペプチドおよびその生理
学上適合される塩は、IL−5が経過に関与している病
気、例えば慢性的な喘息の治療に使用される。
ーロイキン5受容体のα鎖および/またはβ鎖の断片
(該断片または断片の組み合わせはヒトのインターロイ
キン5と結合する) をコードしている1つの部分配列
と、IgG、IgA、IgM、IgEあるいはそれらの
一部のようなヒトイムノグロブリンのH鎖またはL鎖の
定常領域をコードしている他の部分配列と、から成るD
NA配列、該DNA配列を含むベクター、該ベクターで
形質転換された原核または真核宿主細胞、該DNA配列
によってコードされた組換え蛋白、該組換え蛋白を生産
するための方法、及び該組換え蛋白を含有する医薬組成
物に関する。 【効果】 得られたキメラポリペプチドおよびその生理
学上適合される塩は、IL−5が経過に関与している病
気、例えば慢性的な喘息の治療に使用される。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、2つの部分DNA配
列、すなわちヒトのインターロイキン5受容体のα鎖及
び/またはβ鎖の断片をコードしている1つの部分配列
(該断片または断片の組み合わせはヒトのインターロイ
キン5と結合する)とヒトのIgG、IgA、IgMま
たはIgEのようなイムノグロブリンのH鎖またはL鎖
の定常領域またはその一部をコードしている他の部分配
列とから成るDNA配列、該DNA配列を含むベクタ
ー、該ベクターで形質転換された原核または真核宿主細
胞、該DNA配列によってコードされた組換え蛋白、か
かる組換え蛋白の生産方法、および組換え蛋白を含む医
薬組成物に関するものである。
列、すなわちヒトのインターロイキン5受容体のα鎖及
び/またはβ鎖の断片をコードしている1つの部分配列
(該断片または断片の組み合わせはヒトのインターロイ
キン5と結合する)とヒトのIgG、IgA、IgMま
たはIgEのようなイムノグロブリンのH鎖またはL鎖
の定常領域またはその一部をコードしている他の部分配
列とから成るDNA配列、該DNA配列を含むベクタ
ー、該ベクターで形質転換された原核または真核宿主細
胞、該DNA配列によってコードされた組換え蛋白、か
かる組換え蛋白の生産方法、および組換え蛋白を含む医
薬組成物に関するものである。
【0002】
【従来の技術】インターロイキン5 (IL−5またはI
L5) はB細胞と好酸球に対して生物活性を有するT細
胞及びマスト細胞によって分泌されるリンホカインであ
る。B細胞に対する活性はネズミの系に限定されている
ようにみえる。ヒトのB細胞活性化または分化検定系で
は活性が検出されない。
L5) はB細胞と好酸球に対して生物活性を有するT細
胞及びマスト細胞によって分泌されるリンホカインであ
る。B細胞に対する活性はネズミの系に限定されている
ようにみえる。ヒトのB細胞活性化または分化検定系で
は活性が検出されない。
【0003】ネズミの血球造血においては、IL−5は
好酸球系統の増殖と分化の選択的シグナルである[Yama
guchi ら、J. Exp. Med. 167, 43-56 (1988)]。この点
においてIL−5の機能は他の骨髄様細胞系統に対する
コロニー刺激因子と類似している。またヒト (h) IL
−5はヒトの好酸球の活性化に非常に効力がある[Lope
z ら、J. Exp. Med. 167, 219-224 (1988) ; Saitoら、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2288-2292)]。
好酸球系統の増殖と分化の選択的シグナルである[Yama
guchi ら、J. Exp. Med. 167, 43-56 (1988)]。この点
においてIL−5の機能は他の骨髄様細胞系統に対する
コロニー刺激因子と類似している。またヒト (h) IL
−5はヒトの好酸球の活性化に非常に効力がある[Lope
z ら、J. Exp. Med. 167, 219-224 (1988) ; Saitoら、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2288-2292)]。
【0004】インターロイキン5は細胞膜受容体−複合
体を介してその活性を伝達する。この複合体はネズミ及
びヒトの両方の系において物理化学的に特徴づけられて
いる。マウスのプレB細胞系(IL5がその増殖を左右
している)は骨髄から発生しており、IL−5受容体の
分析に使われている[Rolinkら、J. Exp. Med. 169,169
3-1701 (1989)]。ヒトのIL−5受容体は好酸球の分
化に向けて誘導された前駆骨髄細胞系 HL60 のサブクロ
ーンに関して研究されている[Plaetinck ら、J. Exp.
Med. 172, 683-691 (1990)]。
体を介してその活性を伝達する。この複合体はネズミ及
びヒトの両方の系において物理化学的に特徴づけられて
いる。マウスのプレB細胞系(IL5がその増殖を左右
している)は骨髄から発生しており、IL−5受容体の
分析に使われている[Rolinkら、J. Exp. Med. 169,169
3-1701 (1989)]。ヒトのIL−5受容体は好酸球の分
化に向けて誘導された前駆骨髄細胞系 HL60 のサブクロ
ーンに関して研究されている[Plaetinck ら、J. Exp.
Med. 172, 683-691 (1990)]。
【0005】好酸球の分化は酪酸ナトリウムによって開
始される。高親和性 (Kd=30pM) のIL5結合部位のみ
がこの細胞にみられる。しかしながら、交叉結合の研究
によってIL5結合に関わる、ネズミのIL5R−α鎖
及びβ鎖によく似た分子量をもつ2つのポリペプチド鎖
の存在が示されている。可溶性のヒトIL5Rα鎖 (s
hIL5Rα) は慢性喘息あるいはその他の好酸球増加
を伴う病状においてIL−5拮抗剤として使用すること
ができるだろう。さらに、shIL5Rαまたはα鎖そ
れ自体またはα鎖とβ鎖から成っている完全な高親和性
受容体[Tavernierら、Cell 66, 印刷中 (1991) ]はI
L−5拮抗剤をスクリーニングする道具として使用する
ことができるだろう。
始される。高親和性 (Kd=30pM) のIL5結合部位のみ
がこの細胞にみられる。しかしながら、交叉結合の研究
によってIL5結合に関わる、ネズミのIL5R−α鎖
及びβ鎖によく似た分子量をもつ2つのポリペプチド鎖
の存在が示されている。可溶性のヒトIL5Rα鎖 (s
hIL5Rα) は慢性喘息あるいはその他の好酸球増加
を伴う病状においてIL−5拮抗剤として使用すること
ができるだろう。さらに、shIL5Rαまたはα鎖そ
れ自体またはα鎖とβ鎖から成っている完全な高親和性
受容体[Tavernierら、Cell 66, 印刷中 (1991) ]はI
L−5拮抗剤をスクリーニングする道具として使用する
ことができるだろう。
【0006】
【発明が解決しようとする課題及びそれを解決するため
の手段】それ故、本発明の目的は、2つの部分DNA配
列、すなわちhIL5Rのα鎖及び/またはβ鎖の断片
をコードしている1つの部分配列(該断片または断片の
組み合わせはhIL5と結合し、α鎖の断片 (shIL
5Rα) および特に図1に示した配列の全部または一部
を有する断片が好適である)と、ヒトのイムノグロブリ
ンのH鎖またはL鎖の定常領域またはその一部をコード
している他の部分配列(IgG、IgA、IgMまたは
IgE、特にIgG、例えばIgG1及びIgG3のよ
うなヒトイムノグロブリンのH鎖、特に定常領域の第一
の領域を除く全ての領域が好適である)と、の組み合わ
せから成るDNA配列を提供することにある。さらに、
hIL5と結合するhIL5Rのα鎖の断片をコードし
ているDNA配列はまた、hIL5と結合する蛋白をコ
ードしている図1に示したDNA配列にストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズす
るDNA配列から成ることが理解されよう。当業界で習
熟した者は、図1に示したDNA配列に基づいて、また
例えばSambrookらにより開示された当技術の発達段階に
おける標準的な知識に従って、ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件を容易に規定することができる
だろう。さらに、本発明の目的は、このようなDNA配
列を含むベクター、特に真核宿主細胞で発現可能なベク
ター、及びかかるベクターで形質転換された原核または
真核宿主細胞を提供することである。最後に、本発明の
目的は、上記のような形質転換された宿主を適当な培地
で培養し、組換え蛋白を単離することから成る、かかる
DNA配列によってコードされる組換え蛋白の生産方法
を提供することである。
の手段】それ故、本発明の目的は、2つの部分DNA配
列、すなわちhIL5Rのα鎖及び/またはβ鎖の断片
をコードしている1つの部分配列(該断片または断片の
組み合わせはhIL5と結合し、α鎖の断片 (shIL
5Rα) および特に図1に示した配列の全部または一部
を有する断片が好適である)と、ヒトのイムノグロブリ
ンのH鎖またはL鎖の定常領域またはその一部をコード
している他の部分配列(IgG、IgA、IgMまたは
IgE、特にIgG、例えばIgG1及びIgG3のよ
うなヒトイムノグロブリンのH鎖、特に定常領域の第一
の領域を除く全ての領域が好適である)と、の組み合わ
せから成るDNA配列を提供することにある。さらに、
hIL5と結合するhIL5Rのα鎖の断片をコードし
ているDNA配列はまた、hIL5と結合する蛋白をコ
ードしている図1に示したDNA配列にストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズす
るDNA配列から成ることが理解されよう。当業界で習
熟した者は、図1に示したDNA配列に基づいて、また
例えばSambrookらにより開示された当技術の発達段階に
おける標準的な知識に従って、ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件を容易に規定することができる
だろう。さらに、本発明の目的は、このようなDNA配
列を含むベクター、特に真核宿主細胞で発現可能なベク
ター、及びかかるベクターで形質転換された原核または
真核宿主細胞を提供することである。最後に、本発明の
目的は、上記のような形質転換された宿主を適当な培地
で培養し、組換え蛋白を単離することから成る、かかる
DNA配列によってコードされる組換え蛋白の生産方法
を提供することである。
【0007】本発明はまた、このようなDNA配列によ
ってコードされた、特に慢性喘息のような病気の治療の
ための、組換え体のキメラポリペプチドに関する。もち
ろん、アミノ酸が欠失または交換されているが、結果的
にその蛋白の活性が有意に変えられていないようなアミ
ノ酸配列をもつ蛋白も含まれる。このような分子の活性
を一般に変えることのない蛋白やペプチドのアミノ酸交
換は当業界で知られており、例えば「The Proteins」
(アカデミック・プレス社、ニューヨーク市、1979年、
特に14ページの図6を参照) においてH. NeurathとR.
L. Hillによって述べられている。最もよく行われる交
換はAla/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser,Ala/Gly, Al
a/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pr
o, Lys/Arg,Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp
/Gly 及びこれらの逆である。
ってコードされた、特に慢性喘息のような病気の治療の
ための、組換え体のキメラポリペプチドに関する。もち
ろん、アミノ酸が欠失または交換されているが、結果的
にその蛋白の活性が有意に変えられていないようなアミ
ノ酸配列をもつ蛋白も含まれる。このような分子の活性
を一般に変えることのない蛋白やペプチドのアミノ酸交
換は当業界で知られており、例えば「The Proteins」
(アカデミック・プレス社、ニューヨーク市、1979年、
特に14ページの図6を参照) においてH. NeurathとR.
L. Hillによって述べられている。最もよく行われる交
換はAla/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser,Ala/Gly, Al
a/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pr
o, Lys/Arg,Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp
/Gly 及びこれらの逆である。
【0008】このようなキメラポリペプチドはin vivo
で増大した半減期をもつことができる。in vivo での増
大した半減期は、例えばヒトのCD4分子の最初の2つ
の領域あるいはその一部と哺乳類のイムノグロブリンの
H鎖またはL鎖の定常領域の異なる領域とから成るキメ
ラポリペプチドの場合に見られる (Trauneckerら、Natu
re 331, 84-86[1988]及び欧州特許出願公開第394827
号を参照されたい) 。
で増大した半減期をもつことができる。in vivo での増
大した半減期は、例えばヒトのCD4分子の最初の2つ
の領域あるいはその一部と哺乳類のイムノグロブリンの
H鎖またはL鎖の定常領域の異なる領域とから成るキメ
ラポリペプチドの場合に見られる (Trauneckerら、Natu
re 331, 84-86[1988]及び欧州特許出願公開第394827
号を参照されたい) 。
【0009】本発明の目的のために、キメラポリペプチ
ドは二量体形になりうることがさらに理解されよう。す
なわち、二量体形は各サブユニットがhIL5とまだ結
合するIL5Rのα鎖の断片を含む2つのサブユニッ
ト、あるいは2つのサブユニットのうちの1つがIL5
Rのβ鎖の断片を含む2つのサブユニットから成り、そ
の結果二量体ポリペプチドがhIL5と結合するもので
ある。
ドは二量体形になりうることがさらに理解されよう。す
なわち、二量体形は各サブユニットがhIL5とまだ結
合するIL5Rのα鎖の断片を含む2つのサブユニッ
ト、あるいは2つのサブユニットのうちの1つがIL5
Rのβ鎖の断片を含む2つのサブユニットから成り、そ
の結果二量体ポリペプチドがhIL5と結合するもので
ある。
【0010】hIL5Rのα鎖をコードしているDNA
配列のクローニングは次のような方法で達成できる。ネ
ズミのIL−5受容体 (mIL5R) を膜結合型で含む
ネズミ細胞系を当業界で知られた方法、または例えば実
施例2に詳述した方法で培養する。その後、細胞を遠心
により回収し、溶解し、そして膜抽出物を例えばトリト
ン-X-100のような適当な界面活性剤を用いて調製する。
mIL5Rのα鎖を単離するには、遠心によって清澄化
した膜抽出物を免疫親和性マトリックスに通過させる。
かかる免疫マトリックスのための対応する抗体、すなわ
ちmIL5Rのα鎖に対する抗体を調製し、既知の方法
あるいは例えば実施例1〜3に詳述した方法によって適
当なマトリックスに結合させる。mIL5Rのα鎖はさ
らにドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルルアミドゲル
電気泳動 (SDS−PAGE) で精製し、適当なマトリ
ックスにブロットする。
配列のクローニングは次のような方法で達成できる。ネ
ズミのIL−5受容体 (mIL5R) を膜結合型で含む
ネズミ細胞系を当業界で知られた方法、または例えば実
施例2に詳述した方法で培養する。その後、細胞を遠心
により回収し、溶解し、そして膜抽出物を例えばトリト
ン-X-100のような適当な界面活性剤を用いて調製する。
mIL5Rのα鎖を単離するには、遠心によって清澄化
した膜抽出物を免疫親和性マトリックスに通過させる。
かかる免疫マトリックスのための対応する抗体、すなわ
ちmIL5Rのα鎖に対する抗体を調製し、既知の方法
あるいは例えば実施例1〜3に詳述した方法によって適
当なマトリックスに結合させる。mIL5Rのα鎖はさ
らにドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルルアミドゲル
電気泳動 (SDS−PAGE) で精製し、適当なマトリ
ックスにブロットする。
【0011】こうして精製されたネズミIL−5受容体
鎖は、例えばN末端アミノ酸配列決定や酵素的あるいは
化学的ペプチド分解のような当業界で知られたペプチド
化学の方法で、特性決定がなされる。酵素的または化学
的分解によって得られた断片を例えばHPLCのような
通常の方法に従って分離して、その断片自体をさらにN
末端配列決定にかける。
鎖は、例えばN末端アミノ酸配列決定や酵素的あるいは
化学的ペプチド分解のような当業界で知られたペプチド
化学の方法で、特性決定がなされる。酵素的または化学
的分解によって得られた断片を例えばHPLCのような
通常の方法に従って分離して、その断片自体をさらにN
末端配列決定にかける。
【0012】こうして得られたアミノ酸配列情報から出
発して、オリゴヌクレオチドを既知の方法[例えば、Sa
mbrookら、既出を参照]に従って、遺伝暗号の縮重を考
慮に入れて作製することができる。cDNAまたはゲノ
ムDNAのライブラリーは当業界で知られた方法[Samb
rookら、「Molecular Cloning 」第2版、コールド・ス
プリング・ハーバー研究所出版 (1989年) ]により作製
できるが、その場合、cDNAライブラリーは、誘導の
有無によらず、例えば実施例4に詳述するようなネズミ
またはヒトのIL5Rを発現する細胞系からのmRNA
調製物に基づいたものが好適である。その後、そのライ
ブラリーをオリゴヌクレオチドによってスクリーニング
する[Sambrookら、既出]。一旦このような方法で特定
のクローンが同定されると、本発明の目的とするDNA
配列をもったファージが単離され[Sambrookら、既
出]、そして対応する挿入部を制限酵素切断パターン解
析あるいは標準法による配列決定 (Sambrookら、既出)
によって特性決定する。本発明のDNA配列及びIL5
と結合する蛋白をコードしている配列にストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件 (例えばSambrookら;
既出を参照) 下でハイブリダイズするDNA配列も本発
明の目的のために使用できることが理解されよう。かか
るDNA配列は相応する未変異DNA配列から出発し
て、例えば当業界でよく知られた突然変異誘発法(例え
ばSambrookらを参照) によって作製できる。さらに、実
施例12及び13に詳述するように、本発明のDNA配列の
作製のためにポリメラーゼ・チェイン・リアクション
(PCR) を使用することができる。
発して、オリゴヌクレオチドを既知の方法[例えば、Sa
mbrookら、既出を参照]に従って、遺伝暗号の縮重を考
慮に入れて作製することができる。cDNAまたはゲノ
ムDNAのライブラリーは当業界で知られた方法[Samb
rookら、「Molecular Cloning 」第2版、コールド・ス
プリング・ハーバー研究所出版 (1989年) ]により作製
できるが、その場合、cDNAライブラリーは、誘導の
有無によらず、例えば実施例4に詳述するようなネズミ
またはヒトのIL5Rを発現する細胞系からのmRNA
調製物に基づいたものが好適である。その後、そのライ
ブラリーをオリゴヌクレオチドによってスクリーニング
する[Sambrookら、既出]。一旦このような方法で特定
のクローンが同定されると、本発明の目的とするDNA
配列をもったファージが単離され[Sambrookら、既
出]、そして対応する挿入部を制限酵素切断パターン解
析あるいは標準法による配列決定 (Sambrookら、既出)
によって特性決定する。本発明のDNA配列及びIL5
と結合する蛋白をコードしている配列にストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件 (例えばSambrookら;
既出を参照) 下でハイブリダイズするDNA配列も本発
明の目的のために使用できることが理解されよう。かか
るDNA配列は相応する未変異DNA配列から出発し
て、例えば当業界でよく知られた突然変異誘発法(例え
ばSambrookらを参照) によって作製できる。さらに、実
施例12及び13に詳述するように、本発明のDNA配列の
作製のためにポリメラーゼ・チェイン・リアクション
(PCR) を使用することができる。
【0013】このようにして決定された配列及びいくつ
かの受容体のすでに知られている配列に基づいて、可溶
性の受容体サブユニットをコードする部分配列を決定す
ることができ、そして本発明のクローンの特定の挿入c
DNAが例えばcDNAクローン「λgt11−hIL5
Rα12」の場合のようにshIL5Rαをコードしてい
ない場合には、既知の方法[Sambrookら、既出、または
Maliszewski and Fanslow, Tibtech., 8, 324-329 (19
90)も参照]を使って完全な配列から切り出すことがで
きる。
かの受容体のすでに知られている配列に基づいて、可溶
性の受容体サブユニットをコードする部分配列を決定す
ることができ、そして本発明のクローンの特定の挿入c
DNAが例えばcDNAクローン「λgt11−hIL5
Rα12」の場合のようにshIL5Rαをコードしてい
ない場合には、既知の方法[Sambrookら、既出、または
Maliszewski and Fanslow, Tibtech., 8, 324-329 (19
90)も参照]を使って完全な配列から切り出すことがで
きる。
【0014】完全配列またはかかる部分配列はその後原
核生物での増幅及び/または発現のために、当分野で既
に開示されたベクターに既知の方法で組み込むことがで
きる[Sambrookら、既出]。適当な原核宿主生物は、例
えばグラム陰性菌及びグラム陽性菌であり、例えばE.co
li HB 101 ATCC No.33694 、E.coli W3110[ATCC No.
27325]、E.coli MC1061[Casadabam and Cohen; J. Mo
l. Biol. 138, 179-207 (1980 年) といったE.coli株
(後の方の2つは、πVXまたはpshIL5Rα(実施例
9を参照) のようなpCDM8型のベクターが増幅され
る場合に、すでにプラスミド「p3」(Sambrookら、既出)
を保有している) あるいはB. subtilis株である。
核生物での増幅及び/または発現のために、当分野で既
に開示されたベクターに既知の方法で組み込むことがで
きる[Sambrookら、既出]。適当な原核宿主生物は、例
えばグラム陰性菌及びグラム陽性菌であり、例えばE.co
li HB 101 ATCC No.33694 、E.coli W3110[ATCC No.
27325]、E.coli MC1061[Casadabam and Cohen; J. Mo
l. Biol. 138, 179-207 (1980 年) といったE.coli株
(後の方の2つは、πVXまたはpshIL5Rα(実施例
9を参照) のようなpCDM8型のベクターが増幅され
る場合に、すでにプラスミド「p3」(Sambrookら、既出)
を保有している) あるいはB. subtilis株である。
【0015】さらに、このような配列は、例えば酵母、
昆虫細胞、哺乳動物細胞のような真核宿主細胞での発現
のために適当なベクター中に既知の方法を使って組み込
むことができる。哺乳動物細胞のための典型的な発現ベ
クターは、良好な転写速度をもたらす効率的なプロモー
タ要素、発現すべきDNA配列、及び効率的な終止と転
写物のポリアデニル化のための信号を含んでいる。使用
できる追加の要素は再度増強された転写へ導く「エンハ
ンサー」、及び例えばmRNAのより長い半減期をもた
らす配列である。シグナルペプチドをコードしている内
在性の配列断片を欠いている核酸配列の発現のために
は、他の既知の蛋白のシグナルペプチドをコードしてい
るかかる適当な配列を含むベクターが使われる。例えば
Cell, 46, 973-982 (1986)の中でCullen, B.R.が、ある
いはGething, M.J.編「Current Communications in Mol
ecular Biology 」、Cold Spring Harbor Lab.(1985年)
73-78 頁の中でSharma, S.らが開示したベクターpLJ26
8を参照されたい。
昆虫細胞、哺乳動物細胞のような真核宿主細胞での発現
のために適当なベクター中に既知の方法を使って組み込
むことができる。哺乳動物細胞のための典型的な発現ベ
クターは、良好な転写速度をもたらす効率的なプロモー
タ要素、発現すべきDNA配列、及び効率的な終止と転
写物のポリアデニル化のための信号を含んでいる。使用
できる追加の要素は再度増強された転写へ導く「エンハ
ンサー」、及び例えばmRNAのより長い半減期をもた
らす配列である。シグナルペプチドをコードしている内
在性の配列断片を欠いている核酸配列の発現のために
は、他の既知の蛋白のシグナルペプチドをコードしてい
るかかる適当な配列を含むベクターが使われる。例えば
Cell, 46, 973-982 (1986)の中でCullen, B.R.が、ある
いはGething, M.J.編「Current Communications in Mol
ecular Biology 」、Cold Spring Harbor Lab.(1985年)
73-78 頁の中でSharma, S.らが開示したベクターpLJ26
8を参照されたい。
【0016】哺乳動物細胞での特定のDNA配列の一時
的な発現に使われるこれらベクターの殆んどはSV40ウイ
ルスの複製起点を含んでいる。このウイルスのT抗原を
発現する細胞 (例えばCOS細胞) では、これらベクタ
ーが豊富に複製される。しかしながら、例えば実施例10
に記載するような一時的発現はCOS細胞に限られな
い。原理的にはトランスフェクトされ得る哺乳動物細胞
系はどれもこの目的のために使用できる。強力な転写を
起こせるシグナルは、例えばSV40の早期及び後期プロモ
ーター、HCMV (ヒトのサイトメガロウイルス) の
「主要即時型」遺伝子のプロモーター及びエンハンサ
ー、RSV、HIV、MMTVのようなレトロウイルス
のLTR「ロング・ターミナル・リピート」などであ
る。しかしながら、例えばアクチンやコラゲナーゼ遺伝
子のプロモーターのような細胞遺伝子のシグナルも使用
できる。
的な発現に使われるこれらベクターの殆んどはSV40ウイ
ルスの複製起点を含んでいる。このウイルスのT抗原を
発現する細胞 (例えばCOS細胞) では、これらベクタ
ーが豊富に複製される。しかしながら、例えば実施例10
に記載するような一時的発現はCOS細胞に限られな
い。原理的にはトランスフェクトされ得る哺乳動物細胞
系はどれもこの目的のために使用できる。強力な転写を
起こせるシグナルは、例えばSV40の早期及び後期プロモ
ーター、HCMV (ヒトのサイトメガロウイルス) の
「主要即時型」遺伝子のプロモーター及びエンハンサ
ー、RSV、HIV、MMTVのようなレトロウイルス
のLTR「ロング・ターミナル・リピート」などであ
る。しかしながら、例えばアクチンやコラゲナーゼ遺伝
子のプロモーターのような細胞遺伝子のシグナルも使用
できる。
【0017】しかし一方で、ゲノム (染色体) に組み込
まれた特定のDNA配列をもつ安定した細胞系も得るこ
とができる。このためには、DNA配列を、例えばネオ
マイシン、ヒグロマイシン、ジヒドロ葉酸還元酵素 (d
hfr) あるいはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリ
ボシル転移酵素 (hgpt) といった選択マーカーと一
緒にトランスフェクトする。染色体に安定に取り込まれ
たDNA配列は豊富に増幅させることができる。このた
めの適切な選択マーカーは例えばジヒドロ葉酸還元酵素
(dhfr) である。これにより、完全なdhfr遺伝
子を含まない哺乳動物細胞 (例えばCHO細胞) を、ト
ランスフェクションを起こさせた後に、メトトレキセー
トの量を上げながらインキュベートする。この方法で希
望のDNA配列を1000コピー以上含む細胞系が得られ
る。
まれた特定のDNA配列をもつ安定した細胞系も得るこ
とができる。このためには、DNA配列を、例えばネオ
マイシン、ヒグロマイシン、ジヒドロ葉酸還元酵素 (d
hfr) あるいはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリ
ボシル転移酵素 (hgpt) といった選択マーカーと一
緒にトランスフェクトする。染色体に安定に取り込まれ
たDNA配列は豊富に増幅させることができる。このた
めの適切な選択マーカーは例えばジヒドロ葉酸還元酵素
(dhfr) である。これにより、完全なdhfr遺伝
子を含まない哺乳動物細胞 (例えばCHO細胞) を、ト
ランスフェクションを起こさせた後に、メトトレキセー
トの量を上げながらインキュベートする。この方法で希
望のDNA配列を1000コピー以上含む細胞系が得られ
る。
【0018】発現のために使用される哺乳動物細胞は、
例えばヒト細胞系のHela[ATCC CCL2]及び293[ATC
C CRL1573]並びに3T3[ATCC CCL163]及びL細胞、
例えば[ATCC CCL149]、(CHO)細胞[ATCC CCL6
1]、BHK[ATCC CCL10]細胞並びにCV1[ATCC CC
L70]及びCOS細胞系[ATCC CRL1650, CRL1651]など
である。
例えばヒト細胞系のHela[ATCC CCL2]及び293[ATC
C CRL1573]並びに3T3[ATCC CCL163]及びL細胞、
例えば[ATCC CCL149]、(CHO)細胞[ATCC CCL6
1]、BHK[ATCC CCL10]細胞並びにCV1[ATCC CC
L70]及びCOS細胞系[ATCC CRL1650, CRL1651]など
である。
【0019】適当な発現ベクターには、例えばpBC12
MI[ATCC 67109]、pSV2dhfr[ATCC 3714
6]、pSVL[ファルマシア社 スウェーデン ウプ
サラ]、pRSVcat[ATCC 37152]、pMSG[フ
ァルマシア社、スウェーデン ウプサラ]、及び例えば
E. coli MC1061 (プラスミドp3をもつ) に形質転換され
て1991年4月17日に受託番号DSM6479 として東ドイツ共
和国のブラウンシュバイクにあるドイツ微生物・細胞株
集積所 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Z
ellkulturen GmbH:DSM) に特許手続上のブダペスト
条約のもとで寄託されたpshIL5Rα[実施例7を
参照]のようなpCDM8型のプラスミドなどのベクタ
ーが含まれる。プラスミドpshIL5Rαは当業界で
知られるように、そして例えば実施例9に詳述するよう
にして、寄託された形質転換E. coliから単離できる。
本発明のキメラポリペプチドの発現のためには、東ドイ
ツ共和国ブラウンシュバイクにある微生物・細胞株集積
所 (DSM) に寄託され、また欧州特許出願第9010739
3.2号 (公開番号394827) に詳細に記載されているpC
D4−Hμ (DSM 5315) 、pCD4−Hγ1 (DSM 531
4)、pCD4−Hγ3 (DSM5523) のようなpSV2由
来のベクター[例えば「DNAクローニング」第II巻、
Glover, D. M. 編、IRL出版社 (オックスフォード)
1985年版でのGerman,C.の記載を参照]が用いられる。
この欧州特許出願の明細書には、キメラ蛋白の発現のた
めに、またはイムノグロブリン断片を有するキメラ蛋白
の発現のためのベクターの構築のために、これらのベク
ターを使うことに関するデータも含まれている。本発明
の目的のために、これらのベクター中のCD4コード部
分は、既知の方法や例えばSambrookら (既出) に記載さ
れた方法によって、まだhIL5と結合するhIL5R
のα鎖及び/またはβ鎖の断片をコードしているDNA
配列によって置き換えられねばならず、所望により、得
られたかかるベクターにおいて、特定のイムノグロブリ
ンコード部分は希望のイムノグロブリン部分をコードす
るDNA配列によって置き換えることができる。本発明
のキメラポリペプチドの発現に適するベクターは、例え
ばキメラポリペプチドを含んでいるIL5Rのα鎖の断
片の発現のためのpshIL5RαのようなpCDM8
型のベクターである (実施例12及び13を参照) 。上に記
載したように、ヒトイムノグロブリンの定常領域をコー
ドしているDNA配列の供給源は当分野で知られてお
り、例えば EP 394827に記載されているか、またはIg
G1やIgG3のかかる定常領域の場合には例えばElli
son ら[Nucl. Acid Res, 10, 4071-4079 (1982)]また
はHuckら[Nucl. Acid Res. 14, 1779-1789 (1986)]に
よってそれぞれ記載されている。
MI[ATCC 67109]、pSV2dhfr[ATCC 3714
6]、pSVL[ファルマシア社 スウェーデン ウプ
サラ]、pRSVcat[ATCC 37152]、pMSG[フ
ァルマシア社、スウェーデン ウプサラ]、及び例えば
E. coli MC1061 (プラスミドp3をもつ) に形質転換され
て1991年4月17日に受託番号DSM6479 として東ドイツ共
和国のブラウンシュバイクにあるドイツ微生物・細胞株
集積所 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Z
ellkulturen GmbH:DSM) に特許手続上のブダペスト
条約のもとで寄託されたpshIL5Rα[実施例7を
参照]のようなpCDM8型のプラスミドなどのベクタ
ーが含まれる。プラスミドpshIL5Rαは当業界で
知られるように、そして例えば実施例9に詳述するよう
にして、寄託された形質転換E. coliから単離できる。
本発明のキメラポリペプチドの発現のためには、東ドイ
ツ共和国ブラウンシュバイクにある微生物・細胞株集積
所 (DSM) に寄託され、また欧州特許出願第9010739
3.2号 (公開番号394827) に詳細に記載されているpC
D4−Hμ (DSM 5315) 、pCD4−Hγ1 (DSM 531
4)、pCD4−Hγ3 (DSM5523) のようなpSV2由
来のベクター[例えば「DNAクローニング」第II巻、
Glover, D. M. 編、IRL出版社 (オックスフォード)
1985年版でのGerman,C.の記載を参照]が用いられる。
この欧州特許出願の明細書には、キメラ蛋白の発現のた
めに、またはイムノグロブリン断片を有するキメラ蛋白
の発現のためのベクターの構築のために、これらのベク
ターを使うことに関するデータも含まれている。本発明
の目的のために、これらのベクター中のCD4コード部
分は、既知の方法や例えばSambrookら (既出) に記載さ
れた方法によって、まだhIL5と結合するhIL5R
のα鎖及び/またはβ鎖の断片をコードしているDNA
配列によって置き換えられねばならず、所望により、得
られたかかるベクターにおいて、特定のイムノグロブリ
ンコード部分は希望のイムノグロブリン部分をコードす
るDNA配列によって置き換えることができる。本発明
のキメラポリペプチドの発現に適するベクターは、例え
ばキメラポリペプチドを含んでいるIL5Rのα鎖の断
片の発現のためのpshIL5RαのようなpCDM8
型のベクターである (実施例12及び13を参照) 。上に記
載したように、ヒトイムノグロブリンの定常領域をコー
ドしているDNA配列の供給源は当分野で知られてお
り、例えば EP 394827に記載されているか、またはIg
G1やIgG3のかかる定常領域の場合には例えばElli
son ら[Nucl. Acid Res, 10, 4071-4079 (1982)]また
はHuckら[Nucl. Acid Res. 14, 1779-1789 (1986)]に
よってそれぞれ記載されている。
【0020】これらの細胞をトランスフェクトする方法
は選択された発現系やベクター系に左右される。これら
の方法の概略は例えば「Methods in Molecular Biolog
y」の中の Pollardらによる「DNA Transformation of M
ammalian Cells (哺乳動物細胞のDNA形質転換) 」
(Walker J.M.編「Nucleic Acids 」第2巻、1984年、ニ
ュージャージー州クリフトン、 Humana社]に載ってい
る。さらに他の方法が、Chenおよび Okayama[Molecula
r and Cell Biology 7, 2745-2752, 1987 「プラスミド
DNAによる哺乳動物細胞の高効率形質転換」]やFelg
ner [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 7413-7417, 1
989 「リポフェクチン:高度に効率的な脂質を介在させ
たDNAトランスフェクション法」]に載っている。本
発明の適切なプラスミド (ベクター) でトランスフェク
トされた真核宿主細胞、並びにそれらのトランスフェク
ションおよび対応する組換え蛋白の発現に使われるプラ
スミドも本発明の目的である。
は選択された発現系やベクター系に左右される。これら
の方法の概略は例えば「Methods in Molecular Biolog
y」の中の Pollardらによる「DNA Transformation of M
ammalian Cells (哺乳動物細胞のDNA形質転換) 」
(Walker J.M.編「Nucleic Acids 」第2巻、1984年、ニ
ュージャージー州クリフトン、 Humana社]に載ってい
る。さらに他の方法が、Chenおよび Okayama[Molecula
r and Cell Biology 7, 2745-2752, 1987 「プラスミド
DNAによる哺乳動物細胞の高効率形質転換」]やFelg
ner [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 7413-7417, 1
989 「リポフェクチン:高度に効率的な脂質を介在させ
たDNAトランスフェクション法」]に載っている。本
発明の適切なプラスミド (ベクター) でトランスフェク
トされた真核宿主細胞、並びにそれらのトランスフェク
ションおよび対応する組換え蛋白の発現に使われるプラ
スミドも本発明の目的である。
【0021】一連の蛋白の発現のために上首尾ですでに
使用されているバキュロウイルス発現系 (Luckow and S
ummers, Bio/Technology 6, 47-55, 1988 を参照) は
昆虫細胞での発現に使用することができる。組換え蛋白
は標準的な形でまたは融合蛋白として生産される。こう
して生産された蛋白も修飾され、例えばグリコシル化さ
れ得る (Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
82, 8404-8408, 1987) 。目的蛋白を発現する組換えバ
キュロウイルスの作製には、いわゆる「転移ベクター」
が使われる。このもとでは、強力なプロモーター (例え
ばポリヘドロン遺伝子のもの) の制御下に異種DNA配
列を含むプラスミドが考えられ、これによりDNA配列
は両側をウイルス配列で囲まれる。その後、この転移ベ
クターは野生型バキュロウイルスのDNAと共に昆虫細
胞にトランスフェクトされる。相同組換えによって細胞
内に生じる組換えウイルスを同定し、既知の方法に従っ
て単離することができる。バキュロウイルス発現系とそ
れに用いる方法の概略は、LuckowおよびSummers の「バ
キュロウイルスベクターと昆虫細胞培養法に関する方法
のマニュアル」Texas Agricultural Experimental Stat
ion, Texas A & M大学報 No.1555、第2版 (1988年) に
載っている。バキュロウイルス発現系を使った場合の本
発明の実施のためには、イムノグロブリン部分をコード
しているDNA配列がcDNAの形でなければならない
ことが理解されよう。
使用されているバキュロウイルス発現系 (Luckow and S
ummers, Bio/Technology 6, 47-55, 1988 を参照) は
昆虫細胞での発現に使用することができる。組換え蛋白
は標準的な形でまたは融合蛋白として生産される。こう
して生産された蛋白も修飾され、例えばグリコシル化さ
れ得る (Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
82, 8404-8408, 1987) 。目的蛋白を発現する組換えバ
キュロウイルスの作製には、いわゆる「転移ベクター」
が使われる。このもとでは、強力なプロモーター (例え
ばポリヘドロン遺伝子のもの) の制御下に異種DNA配
列を含むプラスミドが考えられ、これによりDNA配列
は両側をウイルス配列で囲まれる。その後、この転移ベ
クターは野生型バキュロウイルスのDNAと共に昆虫細
胞にトランスフェクトされる。相同組換えによって細胞
内に生じる組換えウイルスを同定し、既知の方法に従っ
て単離することができる。バキュロウイルス発現系とそ
れに用いる方法の概略は、LuckowおよびSummers の「バ
キュロウイルスベクターと昆虫細胞培養法に関する方法
のマニュアル」Texas Agricultural Experimental Stat
ion, Texas A & M大学報 No.1555、第2版 (1988年) に
載っている。バキュロウイルス発現系を使った場合の本
発明の実施のためには、イムノグロブリン部分をコード
しているDNA配列がcDNAの形でなければならない
ことが理解されよう。
【0022】その後、本発明のキメラポリペプチドは、
例えば硫安による沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過、イ
オン交換クロマトグラフィー、SDS−PAGE、焦点
電気泳動、免疫アフィニティークロマトグラフィーのよ
うなアフィニティークロマトグラフィー、順相または逆
相系でのHPLCといった当業界で知られている蛋白化
学の方法に従って、細胞塊あるいは培養上清から精製さ
れる。
例えば硫安による沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過、イ
オン交換クロマトグラフィー、SDS−PAGE、焦点
電気泳動、免疫アフィニティークロマトグラフィーのよ
うなアフィニティークロマトグラフィー、順相または逆
相系でのHPLCといった当業界で知られている蛋白化
学の方法に従って、細胞塊あるいは培養上清から精製さ
れる。
【0023】この技術分野で知られている方法に従って
作られる本発明のキメラポリペプチドおよびその生理学
上適合される塩は、IL−5が病気の経過に関与してい
るかかる病気の治療及び/または対応する医薬組成物の
調製に使用することができる。この目的のために、上記
化合物の一つまたはそれ以上が、所望によりまたは必要
に応じて他の薬学的に活性な物質と組み合わせて、慣用
の固体または液体担体物質と一緒に既知の方法で加工さ
れる。かかる製剤の投与は、同じような活性や構造を有
する既存の製剤から類推して、通常の基準を考慮して行
なわれる。このような医薬組成物及び治療のための本発
明化合物の使用も本発明の目的である。
作られる本発明のキメラポリペプチドおよびその生理学
上適合される塩は、IL−5が病気の経過に関与してい
るかかる病気の治療及び/または対応する医薬組成物の
調製に使用することができる。この目的のために、上記
化合物の一つまたはそれ以上が、所望によりまたは必要
に応じて他の薬学的に活性な物質と組み合わせて、慣用
の固体または液体担体物質と一緒に既知の方法で加工さ
れる。かかる製剤の投与は、同じような活性や構造を有
する既存の製剤から類推して、通常の基準を考慮して行
なわれる。このような医薬組成物及び治療のための本発
明化合物の使用も本発明の目的である。
【0024】これまで本発明を一般的に記載してきたの
で、以下の図面及び実施例で本発明を詳細に説明する
が、これによって本発明は制限をうけるものではない。図1 shIL5Rαの核酸配列と推定アミノ酸配列。mIL
5Rαの対応するアミノ酸配列はヒトの配列と異なるア
ミノ酸のみを示すことにより下に示してある。配列はヌ
クレオチドとアミノ酸の標準略号で表わされている。図2 図2はshIL5Rαを使った競合結合検定の結果を示
す。詳細は実施例11を参照されたい。
で、以下の図面及び実施例で本発明を詳細に説明する
が、これによって本発明は制限をうけるものではない。図1 shIL5Rαの核酸配列と推定アミノ酸配列。mIL
5Rαの対応するアミノ酸配列はヒトの配列と異なるア
ミノ酸のみを示すことにより下に示してある。配列はヌ
クレオチドとアミノ酸の標準略号で表わされている。図2 図2はshIL5Rαを使った競合結合検定の結果を示
す。詳細は実施例11を参照されたい。
【0025】
【実施例】実施例1 ネズミのIL5Rに対するモノクローナル抗体の生産 基本的には A. Rolinkら(既出)によって記載されたよ
うにして免疫を行なった。簡単に述べると、0日目に2
×107 のB13細胞[Rolinkら既出]を燐酸緩衝溶液(P
BS−A)で洗い、完全フロインドアジュバント(CF
A)と混合し、Wistarラットの後肢かかとに注射した。
5日目と7日目にフロインドアジュバント(FA)を加
えずにこれを繰り返した。8日目に局所的なリンパ節を
摘出し、細胞懸濁液を調製した。これらの細胞はPEG150
0(ベーリンガー社)を使ってSp2/0-Ag14細胞[ATCC CRL
1581]と5:1.5の割合で融合させた。細胞を500pg/ml
の組換えhIL−6の存在下でマイクロタイタープレー
トにまいた Haegemannら、Europ. J. Biochem, 159, 6
25-632 (1986)]。翌日、ハイブリッド細胞の選択のた
めに2×濃度のアミノプテリンを含む培地を同量加え
た。8日目にアミノプテリンを含まない培地を細胞に再
供給した。ハイブリドーマはmIL5[Tavernier, J.
ら、DNA 8, 491-501 (1989)]、またはマウスインタ
ーロイキン3(mIL3)で促進されるB13細胞の増殖
を阻止するその上清の能力で選択された(当分野で知ら
れた 3Hデオキシシチジン取込みにより測定する)。W
EHI−3細胞(ATCC No. TIB68)からとったコンディ
ション培地がmIL3の供給源として使われた。阻害活
性を示す上清はB13細胞に対する放射性標識した(当業
界で知られた方法に従った)mIL5または「R52」
[IL−5−Rのβ鎖のみを認識するモノクローナル抗
体(Rolinkら、既出)]を用いた競合結合検定で再試験
した。mIL−5−Rのα鎖にのみ反応するモノクロー
ナル抗体はmIL5結合をほぼ完全に阻害する能力及び
対応するmIL−5−R鎖の免疫沈降によって同定され
た。選別されたハイブリドーマは限界希釈法によって再
クローン化された。実施例2 mIL5R−β鎖の免疫アフィニティー精製 大型の回転フラスコで、B13細胞を、5%ウシ胎児血
清、2mMのL−グルタミン、50μg/mlのゲンタマイシ
ン、 100単位/mlの組換えマウスIL−5を含むIscove
の改変ダルベッコ培地(Gibco Laboratories、米国ニュ
ーヨーク州グランドアイランド)で2×106 細胞/mlの
密度になるまで培養した。10Lの培養液から細胞を遠心
で集め、PBSで洗い、1%トリトンX-100と蛋白分解
酵素阻害剤のカクテル(1mMのPMSF, 10mMのベンズ
アミジン塩酸, 100U/mlのアプロチニン)を含む 200ml
のPBS中で溶解した。10分間氷上においた後、溶解液
を10分間、1000×gで遠心分離し、さらに4℃で90分
間、超遠心分離(100,000×g) で透明にした。上清をNa
Clで最終濃度0.5M になるよう希釈し、精製に用いた。
「R52」を Schneiderらの方法[J. Biol. Chem, 257,
10766 (1982)]に従い、プロテインG−セファロース4
Fast Flow (ファルマシア社、LKBバイオテクノロジ
ーAB、スウェーデン、ウプサラ)に5mg/ml (ゲル)
の濃度で共有結合させた。B13細胞の溶解液200ml を4
℃で2mlのプロテインG−セファロース4 Fast Flowの
カラムに通し、次いで2mlのR52結合プロテインG−セ
ファロース4Fast Flow (両方とも1cm径のカラムに充
填した) に通した。通過液は再び両方のカラムにかけ
た。ゲルを50mM Tris-HCl (pH8.2), 1 mM EDTA, 0.
5M NaCl,0.5% NP40を含む緩衝液で十分に(100ml) 洗
い、次いで10mlの0.1%(NP40)で洗った。次に保持さ
れた蛋白を0.1%ノニデットP40(NP40) を含む50mMジエ
チルアミン(pH11)4mlで溶離し、1M の NaH2PO4を添
加して中和し、凍結乾燥によって濃縮した。純度は溶出
液のSDS−PAGEと2.5%のクーマシー染色によっ
て評価した。実施例3 ネズミのIL5Rα鎖の免疫アフィニティー精製 2×1010細胞から得たB13細胞溶解液(実施例2に従っ
てβ鎖ダブレットを精製するために使われた「B52」免
疫アフィニティーカラムの通過画分)を、mIL−5R
のα鎖を認識する10mgのモノクローナル抗体をつけた2
mlのヒドラジド・アビドゲルAX(Bioprobe Int. 社
製)と4℃で一晩混合した。その後、ゲルをカラムに注
ぎ込み、十分な洗浄 (50mMのトリス塩酸、pH8.2, 1 mM
EDTA,0.5M NaCl, 0.5% NP40;次いで0.1% NP40水
溶液)後、 50mM ジエチルアミン、pH11, 0.01% NP40を
使って溶出を行った。選別された画分は直ちに凍結乾燥
し、そしてβ−メルカプトエタノールの存在下に2× L
aemmliバッファーに再懸濁した。試料を1.5mm 10%PA
GE−SDSゲルに通した。そのゲルを10% HAc, 30%
メタノール中で固定し、クーマシー・ブリリアント・ブ
ルーで染色した。60kDa のmIL5Rα鎖を含む切片を
SDSバッファーで処理し、さらに細片化して新しいP
AGE−SDSゲルで電気泳動にかけた。
うにして免疫を行なった。簡単に述べると、0日目に2
×107 のB13細胞[Rolinkら既出]を燐酸緩衝溶液(P
BS−A)で洗い、完全フロインドアジュバント(CF
A)と混合し、Wistarラットの後肢かかとに注射した。
5日目と7日目にフロインドアジュバント(FA)を加
えずにこれを繰り返した。8日目に局所的なリンパ節を
摘出し、細胞懸濁液を調製した。これらの細胞はPEG150
0(ベーリンガー社)を使ってSp2/0-Ag14細胞[ATCC CRL
1581]と5:1.5の割合で融合させた。細胞を500pg/ml
の組換えhIL−6の存在下でマイクロタイタープレー
トにまいた Haegemannら、Europ. J. Biochem, 159, 6
25-632 (1986)]。翌日、ハイブリッド細胞の選択のた
めに2×濃度のアミノプテリンを含む培地を同量加え
た。8日目にアミノプテリンを含まない培地を細胞に再
供給した。ハイブリドーマはmIL5[Tavernier, J.
ら、DNA 8, 491-501 (1989)]、またはマウスインタ
ーロイキン3(mIL3)で促進されるB13細胞の増殖
を阻止するその上清の能力で選択された(当分野で知ら
れた 3Hデオキシシチジン取込みにより測定する)。W
EHI−3細胞(ATCC No. TIB68)からとったコンディ
ション培地がmIL3の供給源として使われた。阻害活
性を示す上清はB13細胞に対する放射性標識した(当業
界で知られた方法に従った)mIL5または「R52」
[IL−5−Rのβ鎖のみを認識するモノクローナル抗
体(Rolinkら、既出)]を用いた競合結合検定で再試験
した。mIL−5−Rのα鎖にのみ反応するモノクロー
ナル抗体はmIL5結合をほぼ完全に阻害する能力及び
対応するmIL−5−R鎖の免疫沈降によって同定され
た。選別されたハイブリドーマは限界希釈法によって再
クローン化された。実施例2 mIL5R−β鎖の免疫アフィニティー精製 大型の回転フラスコで、B13細胞を、5%ウシ胎児血
清、2mMのL−グルタミン、50μg/mlのゲンタマイシ
ン、 100単位/mlの組換えマウスIL−5を含むIscove
の改変ダルベッコ培地(Gibco Laboratories、米国ニュ
ーヨーク州グランドアイランド)で2×106 細胞/mlの
密度になるまで培養した。10Lの培養液から細胞を遠心
で集め、PBSで洗い、1%トリトンX-100と蛋白分解
酵素阻害剤のカクテル(1mMのPMSF, 10mMのベンズ
アミジン塩酸, 100U/mlのアプロチニン)を含む 200ml
のPBS中で溶解した。10分間氷上においた後、溶解液
を10分間、1000×gで遠心分離し、さらに4℃で90分
間、超遠心分離(100,000×g) で透明にした。上清をNa
Clで最終濃度0.5M になるよう希釈し、精製に用いた。
「R52」を Schneiderらの方法[J. Biol. Chem, 257,
10766 (1982)]に従い、プロテインG−セファロース4
Fast Flow (ファルマシア社、LKBバイオテクノロジ
ーAB、スウェーデン、ウプサラ)に5mg/ml (ゲル)
の濃度で共有結合させた。B13細胞の溶解液200ml を4
℃で2mlのプロテインG−セファロース4 Fast Flowの
カラムに通し、次いで2mlのR52結合プロテインG−セ
ファロース4Fast Flow (両方とも1cm径のカラムに充
填した) に通した。通過液は再び両方のカラムにかけ
た。ゲルを50mM Tris-HCl (pH8.2), 1 mM EDTA, 0.
5M NaCl,0.5% NP40を含む緩衝液で十分に(100ml) 洗
い、次いで10mlの0.1%(NP40)で洗った。次に保持さ
れた蛋白を0.1%ノニデットP40(NP40) を含む50mMジエ
チルアミン(pH11)4mlで溶離し、1M の NaH2PO4を添
加して中和し、凍結乾燥によって濃縮した。純度は溶出
液のSDS−PAGEと2.5%のクーマシー染色によっ
て評価した。実施例3 ネズミのIL5Rα鎖の免疫アフィニティー精製 2×1010細胞から得たB13細胞溶解液(実施例2に従っ
てβ鎖ダブレットを精製するために使われた「B52」免
疫アフィニティーカラムの通過画分)を、mIL−5R
のα鎖を認識する10mgのモノクローナル抗体をつけた2
mlのヒドラジド・アビドゲルAX(Bioprobe Int. 社
製)と4℃で一晩混合した。その後、ゲルをカラムに注
ぎ込み、十分な洗浄 (50mMのトリス塩酸、pH8.2, 1 mM
EDTA,0.5M NaCl, 0.5% NP40;次いで0.1% NP40水
溶液)後、 50mM ジエチルアミン、pH11, 0.01% NP40を
使って溶出を行った。選別された画分は直ちに凍結乾燥
し、そしてβ−メルカプトエタノールの存在下に2× L
aemmliバッファーに再懸濁した。試料を1.5mm 10%PA
GE−SDSゲルに通した。そのゲルを10% HAc, 30%
メタノール中で固定し、クーマシー・ブリリアント・ブ
ルーで染色した。60kDa のmIL5Rα鎖を含む切片を
SDSバッファーで処理し、さらに細片化して新しいP
AGE−SDSゲルで電気泳動にかけた。
【0026】イモビロン (Immobilon)−P膜(ミリポア
社)に移行し、アミドブラックで染色した後、60kDa の
バンドを切り出し、その場でトリプシン消化した。ペプ
チドをC4−逆相カラムで分離し、オンライン120A型P
THアミノ酸分析計(アプライド・バイオシステム社、
カリフォルニア州フォスターシティー)を装備した470A
型気相配列決定機を使って配列解析にかけた。アミノ酸
配列(アミノ酸の標準略号)と当分野で知られた方法に
従って合成した相応するオリゴヌクレオチド・プローブ
の配列を以下に示す:ペプチド 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 W G E W S Q P I Y V G K オリゴヌクレオチド−セット 1:32量体 T 5'CCIACGTAAATIGGCTGIGACCACTCICCCCA3' A G T T T 5'CCIACGTAAATIGGCTGACTCCACTCICCCCA3' A G T G Tペプチド 2 1 2 3 4 5 6 7 8 H V D L E Y H V オリゴヌクレオチド−セット 2:23量体 5'ACATGATATTCTAAATCIACATG3' G G C C G G 5'ACATGATATTCIAGATCIACATG3' G G C G G実施例4 単一方向性λGT11のcDNAライブラリーの構築 1. ネズミのプレB細胞B13のcDNAライブラリー mRNAはB13細胞から「迅速トラック (fast-track)
」mRNA単離システム(Invitrogen Corp.)を使っ
て抽出した。このプロトコールにより、ポリ(A)+mRN
Aをオリゴ(dT)セルロースを使って細胞溶解液から直
接抽出した。収量は108 細胞当り約50μg であった。5
mgのポリ(A)+mRNAをオリゴdT-Not1プライマー・ア
ダプターである5'−AATTCGCGGCCGC (T)15
−3'(Promega Corp.)とクローン化した Moloneyネズミ
白血病ウイルスのRNアーゼH- 逆転写酵素(BRL Life
Technologies 社)を使って逆転写した。EcoR1リンカ
ーをつけた二重鎖cDNAを上記の方法(Sambrookら;
既出)を使って作製した。 Not1切断によって特異な3'
接着末端を作り出し、cDNAを1%アガロース・ゲル
で大きさにより選別した(>1000bp)。「遺伝子精製
(gene clean) 」プロトコール(BIO 101社)によっ
て溶出した後、cDNAをλgt11 Sfi-Notベクター(Pro
mega Corp.) のEcoR1−Not1アームに連結した。in vi
troパッケージング後には約40×106個の組換えファージ
が得られた。 2. ヒトのHL60クローン(酪酸塩で誘導された)cDN
Aライブラリー mRNAを精製する前に酪酸塩で誘導されたHL60クロー
ン15細胞[ Fischkoff, Leukemia Res., 12, 679-686
(1988); Plaetinckら, J. Exp. Med., 172, 683-691
(1990);HL60:ATCC No.CCL240]は適当な 125I−hI
L5の結合能を調べた(細胞当り約2000の結合部位をも
つ)。4.1と同じプロトコールを採用し、同程度の収量
の組換えファージを得た。実施例5 ネズミとヒトのcDNAライブラリーのスクリーニング 「オリゴヌクレオチド1」と「オリゴヌクレオチド2」
(実施例3参照)の2組のオリゴヌクレオチド・プロー
ブが、この技術分野で公知の方法 (Sambrookら、前掲)
で用いられるプローブのタイプに応じて、異なるハイブ
リダイゼーション条件下で(以後を参照)スクリーニン
グに用いられた。結果を以下に示す: 1) 2つのcDNAクローン(λgt11−mIL5Rα
2, 3)は、両方の組のオリゴヌクレオチド・プローブ
とのハイブリダイゼーションに基づいて、ネズミのcD
NAライブラリーの一部(1.2×106 個のプラークが調
べられた)から選別された。このために、プラークリフ
トをBiodyne A トランスファーメンブラン(Pall)を用
いて既述の方法(Sambrookら、既出)で調製した。オリ
ゴヌクレオチド1をリン酸化によって放射標識し(Samb
rookら、既出)、「中程度のストリンジェンシー」のハ
イブリダイゼーション条件でハイブリダイズさせた (以
下参照) 。オリゴヌクレオチド2もリン酸化により放射
標識し(Sambrookら、既出)、「低ストリンジェンシ
ー」のハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズさ
せた(以下参照)。
社)に移行し、アミドブラックで染色した後、60kDa の
バンドを切り出し、その場でトリプシン消化した。ペプ
チドをC4−逆相カラムで分離し、オンライン120A型P
THアミノ酸分析計(アプライド・バイオシステム社、
カリフォルニア州フォスターシティー)を装備した470A
型気相配列決定機を使って配列解析にかけた。アミノ酸
配列(アミノ酸の標準略号)と当分野で知られた方法に
従って合成した相応するオリゴヌクレオチド・プローブ
の配列を以下に示す:ペプチド 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 W G E W S Q P I Y V G K オリゴヌクレオチド−セット 1:32量体 T 5'CCIACGTAAATIGGCTGIGACCACTCICCCCA3' A G T T T 5'CCIACGTAAATIGGCTGACTCCACTCICCCCA3' A G T G Tペプチド 2 1 2 3 4 5 6 7 8 H V D L E Y H V オリゴヌクレオチド−セット 2:23量体 5'ACATGATATTCTAAATCIACATG3' G G C C G G 5'ACATGATATTCIAGATCIACATG3' G G C G G実施例4 単一方向性λGT11のcDNAライブラリーの構築 1. ネズミのプレB細胞B13のcDNAライブラリー mRNAはB13細胞から「迅速トラック (fast-track)
」mRNA単離システム(Invitrogen Corp.)を使っ
て抽出した。このプロトコールにより、ポリ(A)+mRN
Aをオリゴ(dT)セルロースを使って細胞溶解液から直
接抽出した。収量は108 細胞当り約50μg であった。5
mgのポリ(A)+mRNAをオリゴdT-Not1プライマー・ア
ダプターである5'−AATTCGCGGCCGC (T)15
−3'(Promega Corp.)とクローン化した Moloneyネズミ
白血病ウイルスのRNアーゼH- 逆転写酵素(BRL Life
Technologies 社)を使って逆転写した。EcoR1リンカ
ーをつけた二重鎖cDNAを上記の方法(Sambrookら;
既出)を使って作製した。 Not1切断によって特異な3'
接着末端を作り出し、cDNAを1%アガロース・ゲル
で大きさにより選別した(>1000bp)。「遺伝子精製
(gene clean) 」プロトコール(BIO 101社)によっ
て溶出した後、cDNAをλgt11 Sfi-Notベクター(Pro
mega Corp.) のEcoR1−Not1アームに連結した。in vi
troパッケージング後には約40×106個の組換えファージ
が得られた。 2. ヒトのHL60クローン(酪酸塩で誘導された)cDN
Aライブラリー mRNAを精製する前に酪酸塩で誘導されたHL60クロー
ン15細胞[ Fischkoff, Leukemia Res., 12, 679-686
(1988); Plaetinckら, J. Exp. Med., 172, 683-691
(1990);HL60:ATCC No.CCL240]は適当な 125I−hI
L5の結合能を調べた(細胞当り約2000の結合部位をも
つ)。4.1と同じプロトコールを採用し、同程度の収量
の組換えファージを得た。実施例5 ネズミとヒトのcDNAライブラリーのスクリーニング 「オリゴヌクレオチド1」と「オリゴヌクレオチド2」
(実施例3参照)の2組のオリゴヌクレオチド・プロー
ブが、この技術分野で公知の方法 (Sambrookら、前掲)
で用いられるプローブのタイプに応じて、異なるハイブ
リダイゼーション条件下で(以後を参照)スクリーニン
グに用いられた。結果を以下に示す: 1) 2つのcDNAクローン(λgt11−mIL5Rα
2, 3)は、両方の組のオリゴヌクレオチド・プローブ
とのハイブリダイゼーションに基づいて、ネズミのcD
NAライブラリーの一部(1.2×106 個のプラークが調
べられた)から選別された。このために、プラークリフ
トをBiodyne A トランスファーメンブラン(Pall)を用
いて既述の方法(Sambrookら、既出)で調製した。オリ
ゴヌクレオチド1をリン酸化によって放射標識し(Samb
rookら、既出)、「中程度のストリンジェンシー」のハ
イブリダイゼーション条件でハイブリダイズさせた (以
下参照) 。オリゴヌクレオチド2もリン酸化により放射
標識し(Sambrookら、既出)、「低ストリンジェンシ
ー」のハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズさ
せた(以下参照)。
【0027】2) 1つのcDNAクローン(λgt11−
hIL5Rα8)は、「オリゴヌクレオチド1」とネズ
ミのλgt11−mIL5Rα2から当分野で知られた方
法により誘導されたcDNA挿入物の両方とハイブリダ
イズさせることにより、ヒトcDNAライブラリーの一
部(2.4×106 個のプラークが調べられた)から選択さ
れた。
hIL5Rα8)は、「オリゴヌクレオチド1」とネズ
ミのλgt11−mIL5Rα2から当分野で知られた方
法により誘導されたcDNA挿入物の両方とハイブリダ
イズさせることにより、ヒトcDNAライブラリーの一
部(2.4×106 個のプラークが調べられた)から選択さ
れた。
【0028】オリゴヌクレオチド1をリン酸化により放
射標識し(Sambrookら、既出)、「低ストリンジェンシ
ー」のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ
させた。λgt11−mIL5Rα2からのcDNA挿入
物はランダムラベリングにより放射標識し(Sambrook
ら、既出)、「中程度のストリンジェンシー」のハイブ
リダイゼーション条件でハイブリダイズさせた。
射標識し(Sambrookら、既出)、「低ストリンジェンシ
ー」のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ
させた。λgt11−mIL5Rα2からのcDNA挿入
物はランダムラベリングにより放射標識し(Sambrook
ら、既出)、「中程度のストリンジェンシー」のハイブ
リダイゼーション条件でハイブリダイズさせた。
【0029】3) さらに別の5つのcDNAクローン
(λgt11−hIL5Rα11→15)は、2) でスクリー
ニングされたヒトcDNAライブラリーの半分からmI
L5Rα2cDNAプローブを使って選別された。ハイ
ブリダイゼーションは「中程度のストリンジェンシー」
の条件で行った。 4) 別の35のcDNAクローン(λgt11−hIL5R
α16→51)は、hILRα8−cDNAプローブを使っ
て、2) でスクリーニングしたヒトcDNAライブラリ
ーの残りの半分から選別した。ハイブリダイゼーション
は「高ストリンジェンシー」条件で行った(以下参
照)。ハイブリダイゼーションの条件 L) 「低ストリンジェンシー」のハイブリダイゼーショ
ン条件: ―プレハイブリダイゼーション:5×SSC(この分野
では知られたクエン酸緩衝化塩溶液、例えばSambrook
ら、(既出)を参照), 5×Denhardt's, 0.1%SD
S, 0.05%ピロリン酸ナトリウム, 100μg/mlの超音波
処理したサケ***DNA;42℃で一晩。
(λgt11−hIL5Rα11→15)は、2) でスクリー
ニングされたヒトcDNAライブラリーの半分からmI
L5Rα2cDNAプローブを使って選別された。ハイ
ブリダイゼーションは「中程度のストリンジェンシー」
の条件で行った。 4) 別の35のcDNAクローン(λgt11−hIL5R
α16→51)は、hILRα8−cDNAプローブを使っ
て、2) でスクリーニングしたヒトcDNAライブラリ
ーの残りの半分から選別した。ハイブリダイゼーション
は「高ストリンジェンシー」条件で行った(以下参
照)。ハイブリダイゼーションの条件 L) 「低ストリンジェンシー」のハイブリダイゼーショ
ン条件: ―プレハイブリダイゼーション:5×SSC(この分野
では知られたクエン酸緩衝化塩溶液、例えばSambrook
ら、(既出)を参照), 5×Denhardt's, 0.1%SD
S, 0.05%ピロリン酸ナトリウム, 100μg/mlの超音波
処理したサケ***DNA;42℃で一晩。
【0030】―ハイブリダイゼーション:プレハイブリ
ダイゼーション緩衝液を放射標識したプローブを含む同
緩衝液と置き換える。 ―洗浄:2×SSC, 0.1%SDSを用いて37℃で4回
くり返して洗浄(各回約30分) I) 「中程度のストリンジェンシー」のハイブリダイゼ
ーション条件: ―プレハイブリダイゼーション:20%フォルムアミド,
5×SSC, 5×Denhardt's, 5mM EDTA, 25mMリン
酸ナトリウム (pH6.5), 0.05%ピロリン酸ナトリウム,
100μg/mlの超音波処理したサケ***DNA:42℃で一
晩。
ダイゼーション緩衝液を放射標識したプローブを含む同
緩衝液と置き換える。 ―洗浄:2×SSC, 0.1%SDSを用いて37℃で4回
くり返して洗浄(各回約30分) I) 「中程度のストリンジェンシー」のハイブリダイゼ
ーション条件: ―プレハイブリダイゼーション:20%フォルムアミド,
5×SSC, 5×Denhardt's, 5mM EDTA, 25mMリン
酸ナトリウム (pH6.5), 0.05%ピロリン酸ナトリウム,
100μg/mlの超音波処理したサケ***DNA:42℃で一
晩。
【0031】―ハイブリダイセーション:プレハイブリ
ダイゼーション緩衝液を放射標識したプローブを含んだ
同緩衝液と置き換える。 ―洗浄:2×SSC, 0.1%SDSを用いて37℃で4回
くり返し洗浄する(各回約30分間)。 H) 「高ストリンジェンシー」のハイブリダイゼーショ
ン条件: ―プレハイブリダイゼーション:6×SSC, 5×Denh
ardt's, 0.5%SDS, 100μg/mlの超音波処理したサ
ケ***DNA, 68℃で一晩。
ダイゼーション緩衝液を放射標識したプローブを含んだ
同緩衝液と置き換える。 ―洗浄:2×SSC, 0.1%SDSを用いて37℃で4回
くり返し洗浄する(各回約30分間)。 H) 「高ストリンジェンシー」のハイブリダイゼーショ
ン条件: ―プレハイブリダイゼーション:6×SSC, 5×Denh
ardt's, 0.5%SDS, 100μg/mlの超音波処理したサ
ケ***DNA, 68℃で一晩。
【0032】―ハイブリダイゼーション:6×SSC,
5×Denhardt's, 0.5%SDS, 5mM EDTA, 100μ
g/mlの超音波処理したサケ***DNA、放射標識したプ
ローブを含む。 ―洗浄:次のような洗浄(各回約30分間)を行った: ―2×SSC, 0.1%SDS、室温で2回。
5×Denhardt's, 0.5%SDS, 5mM EDTA, 100μ
g/mlの超音波処理したサケ***DNA、放射標識したプ
ローブを含む。 ―洗浄:次のような洗浄(各回約30分間)を行った: ―2×SSC, 0.1%SDS、室温で2回。
【0033】―0.1×SSC, 0.1%SDS、68℃で2
回。実施例6 配列決定 全てのcDNAをpGEM7zfタイプのベクター(Pr
omega 社製)にサブクローニングし、ExoIII欠失変異株
を作製した。370A型自動DNA配列決定機で Taqポリメ
ラーゼと単鎖DNAを使用し、かつSanger法に基づくプ
ロトコールを用いて配列決定を行った。実施例7 プラスミド「pshIL5Rα」の構築 プラスミドの構築は次の章に記載するようにして行われ
た。調製のための特定の参考文献も詳細もない場合に
は、Sambrookら(1989年)、「Molecular Colning, A L
aboratory Manual」(第2版)Cold Spring Harbor, ニ
ューヨーク州、Cold Spring Harbor Laboratory 出版に
よる標準的な方法論を採用した。
回。実施例6 配列決定 全てのcDNAをpGEM7zfタイプのベクター(Pr
omega 社製)にサブクローニングし、ExoIII欠失変異株
を作製した。370A型自動DNA配列決定機で Taqポリメ
ラーゼと単鎖DNAを使用し、かつSanger法に基づくプ
ロトコールを用いて配列決定を行った。実施例7 プラスミド「pshIL5Rα」の構築 プラスミドの構築は次の章に記載するようにして行われ
た。調製のための特定の参考文献も詳細もない場合に
は、Sambrookら(1989年)、「Molecular Colning, A L
aboratory Manual」(第2版)Cold Spring Harbor, ニ
ューヨーク州、Cold Spring Harbor Laboratory 出版に
よる標準的な方法論を採用した。
【0034】ファージλgt11−hIL5Rα12(実施
例5を参照)からの挿入部をEcoR1と Not1制限酵素を
用いて切り出した。両方の接着末端をE. coli のDNA
ポリメラーゼ 1 Klenow 断片を用い、4種全てのデオキ
シヌクレオチド三リン酸の存在下で修復し、非パリンド
ロームの BstX1リンカーをT4DNAリガーゼを使って
付加した。このリンカーの配列は次のとおりである: 5’CTTTAGAGCACA3’ 3’GAAATCTC5’ 次の段階では、修飾した挿入部をプラスミドpCDM8
[Seed & Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,
3365 (1987); Aruffo & Seed, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 84, 8573 (1987);Seed, Nature, 329, 840 (198
7)]に連結し、CMV−プロモータに対して適当な方向
をもった構築物を次の分析のために選択した。実施例8 E. coli MC1061(p3)の形質転換 実施例7のプラスミドpshIL5RαによるE. coli
MC 1061(p3) の形質転換はエレクトロポレーション法で
達成された。Bio-Rad 社(米国カリフォルニア州リッチ
モンド)のジーンパルサー (Gene Pulser)を25μF, 2.5
kV, 200オームの設定で製造者の説明書に従って用い
た。実施例9 プラスミドDNAの単離 実施例8に記載した形質転換E. coli MC 1061 からのプ
ラスミドDNAは、細胞のアルカリ溶解と、その後の塩
化セシウム超遠心分離工程に基づく標準法[Birnboim &
Doly, Nucl. Acids Res., 7, 1513 (1979); Sambrook
ら、1989, 既出]を用いて調製した。この方法でプラス
ミドpshIL5Rαをプラスミドp3から分離した。s
hIL5Rαをコードしている挿入部をpshIL5R
αから切り出し、実施例6のようにして配列を決定し
た。shIL5Rαの完全核酸配列と推定されるアミノ
酸配列を図1に示す。実施例10 COS−1細胞でのshIL5Rαの発現 Sambrookら(1989年既出)に記載されたDEAE−デキ
ストランプロトコールを用いてCOS−1細胞をトラン
スフェクトした。簡単にいえば、サブコンフルエント状
態のCOS−1細胞をトリプシン処理で回収し、トラン
スフェクションの24時間前に2.3×104細胞/cm2 の密
度で再プレートした。単層を最少必須培地(MEM)−
へペス(pH7.2)で2回洗浄し、トランスフェクション
混液[10μg の実施例9に記載したようにして単離され
たpshIL5Rα/ 0.5mgのDEAE−デキストラン
(分子量2×106 , Pharmacia 社製、スウェーデン、ウ
プサラ)/1 mlのMEM−ヘペス, pH7.2]と共に30分
間インキュベートした。次いで、細胞に10%ウシ胎児血
清(FCS)と 100μM のクロロキンジホスフェートを
含む予め加温したダルベコ改変イーグル培地(DME
M)の8倍容量を補給して、37℃で4時間インキュベー
トした。それから培地を吸引して除き、細胞の単層をD
MEMで1回洗い、DMEM+10%FCS中で3日間イ
ンキュベートした。実施例11 shIL5Rαの特性決定 実施例10に記載したようにして調製されたプラスミドp
shIL5RαでトランスフェクトされたCOS−1細
胞の上清は、以下のような競合結合検定を用いて、分泌
されたshIL5Rαの存在について調べた。すなわ
ち、実施例5に記載したようなクローンから得られ、そ
して実施例7に記載したようにして構築された、mIL
5Rα(アミノ酸配列は図1を参照)をコードしている
cDNAを含むプラスミドで実施例10に記載したように
してトランスフェクトされたCOS−1細胞を、0.5mM
EDTAと0.02%アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝溶
液 (PBS)で処理することによって剥離させ、0.3ml
の結合培地(DMEM+10%FCS+0.02%アジ化ナト
リウム)当り1.5×105細胞に再懸濁し、そして0.8nMの
125I−mIL5と共に 100倍過剰の非標識mIL5の
非存在(図2;“−”,全結合)または存在(図2;
"+cold", 非特異的結合)下で4℃、1時間インキュベ
ートした。pshIL5Rαでトランスフェクトされた
COS−1細胞の上清(結合培地の80%)は 125I−m
IL5の結合を阻害する能力について調べた(図2;
“shIL5Rα" )。トランスフェクトされていない
COS−1細胞の80%上清の存在下での結合も実施した
(図2;" 対照")。細胞膜に結合した 125I−mIL5
を遊離の放射活性から分離するために、COS−1細胞
をフタレート油のクッションを通して沈降させ、個々の
沈降物について[Plaetinck ら、J. Exp. Med., 172, 6
83-691 (1990)]に記載されているようにしてガンマカ
ウンターで計測した。実施例12 キメラヒトIL5Rα−IgG1分子の構築 第一段階としてポリメラーゼ・チェイン・リアクション
(PCR)を鋳型としてプラスミドpshIL5Rαを
用い、以下のようなプライマーを使って実施した:hI
L5Rα遺伝子の5'非翻訳領域(104→123の位置)に
ある 5'−CATAGACACGACAGACACGG お
よび hIL5Rα可溶型をコードしている領域の最後の17残
基に合致し、Gly-Gly-Ser-Ala 「リンカー」領域をコー
ドしている15残基と Pst1認識部位を付加したプライマ
ーである 5'−TACTGCAGATCCGCCTCTTGAGAACCCCACAT 。PCRはVentポリメラーゼを使い、製造者(New Engl
and BioLabs 社、米国マサチューセッツ州ビバリー)に
より記載された条件で行なった。
例5を参照)からの挿入部をEcoR1と Not1制限酵素を
用いて切り出した。両方の接着末端をE. coli のDNA
ポリメラーゼ 1 Klenow 断片を用い、4種全てのデオキ
シヌクレオチド三リン酸の存在下で修復し、非パリンド
ロームの BstX1リンカーをT4DNAリガーゼを使って
付加した。このリンカーの配列は次のとおりである: 5’CTTTAGAGCACA3’ 3’GAAATCTC5’ 次の段階では、修飾した挿入部をプラスミドpCDM8
[Seed & Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,
3365 (1987); Aruffo & Seed, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 84, 8573 (1987);Seed, Nature, 329, 840 (198
7)]に連結し、CMV−プロモータに対して適当な方向
をもった構築物を次の分析のために選択した。実施例8 E. coli MC1061(p3)の形質転換 実施例7のプラスミドpshIL5RαによるE. coli
MC 1061(p3) の形質転換はエレクトロポレーション法で
達成された。Bio-Rad 社(米国カリフォルニア州リッチ
モンド)のジーンパルサー (Gene Pulser)を25μF, 2.5
kV, 200オームの設定で製造者の説明書に従って用い
た。実施例9 プラスミドDNAの単離 実施例8に記載した形質転換E. coli MC 1061 からのプ
ラスミドDNAは、細胞のアルカリ溶解と、その後の塩
化セシウム超遠心分離工程に基づく標準法[Birnboim &
Doly, Nucl. Acids Res., 7, 1513 (1979); Sambrook
ら、1989, 既出]を用いて調製した。この方法でプラス
ミドpshIL5Rαをプラスミドp3から分離した。s
hIL5Rαをコードしている挿入部をpshIL5R
αから切り出し、実施例6のようにして配列を決定し
た。shIL5Rαの完全核酸配列と推定されるアミノ
酸配列を図1に示す。実施例10 COS−1細胞でのshIL5Rαの発現 Sambrookら(1989年既出)に記載されたDEAE−デキ
ストランプロトコールを用いてCOS−1細胞をトラン
スフェクトした。簡単にいえば、サブコンフルエント状
態のCOS−1細胞をトリプシン処理で回収し、トラン
スフェクションの24時間前に2.3×104細胞/cm2 の密
度で再プレートした。単層を最少必須培地(MEM)−
へペス(pH7.2)で2回洗浄し、トランスフェクション
混液[10μg の実施例9に記載したようにして単離され
たpshIL5Rα/ 0.5mgのDEAE−デキストラン
(分子量2×106 , Pharmacia 社製、スウェーデン、ウ
プサラ)/1 mlのMEM−ヘペス, pH7.2]と共に30分
間インキュベートした。次いで、細胞に10%ウシ胎児血
清(FCS)と 100μM のクロロキンジホスフェートを
含む予め加温したダルベコ改変イーグル培地(DME
M)の8倍容量を補給して、37℃で4時間インキュベー
トした。それから培地を吸引して除き、細胞の単層をD
MEMで1回洗い、DMEM+10%FCS中で3日間イ
ンキュベートした。実施例11 shIL5Rαの特性決定 実施例10に記載したようにして調製されたプラスミドp
shIL5RαでトランスフェクトされたCOS−1細
胞の上清は、以下のような競合結合検定を用いて、分泌
されたshIL5Rαの存在について調べた。すなわ
ち、実施例5に記載したようなクローンから得られ、そ
して実施例7に記載したようにして構築された、mIL
5Rα(アミノ酸配列は図1を参照)をコードしている
cDNAを含むプラスミドで実施例10に記載したように
してトランスフェクトされたCOS−1細胞を、0.5mM
EDTAと0.02%アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝溶
液 (PBS)で処理することによって剥離させ、0.3ml
の結合培地(DMEM+10%FCS+0.02%アジ化ナト
リウム)当り1.5×105細胞に再懸濁し、そして0.8nMの
125I−mIL5と共に 100倍過剰の非標識mIL5の
非存在(図2;“−”,全結合)または存在(図2;
"+cold", 非特異的結合)下で4℃、1時間インキュベ
ートした。pshIL5Rαでトランスフェクトされた
COS−1細胞の上清(結合培地の80%)は 125I−m
IL5の結合を阻害する能力について調べた(図2;
“shIL5Rα" )。トランスフェクトされていない
COS−1細胞の80%上清の存在下での結合も実施した
(図2;" 対照")。細胞膜に結合した 125I−mIL5
を遊離の放射活性から分離するために、COS−1細胞
をフタレート油のクッションを通して沈降させ、個々の
沈降物について[Plaetinck ら、J. Exp. Med., 172, 6
83-691 (1990)]に記載されているようにしてガンマカ
ウンターで計測した。実施例12 キメラヒトIL5Rα−IgG1分子の構築 第一段階としてポリメラーゼ・チェイン・リアクション
(PCR)を鋳型としてプラスミドpshIL5Rαを
用い、以下のようなプライマーを使って実施した:hI
L5Rα遺伝子の5'非翻訳領域(104→123の位置)に
ある 5'−CATAGACACGACAGACACGG お
よび hIL5Rα可溶型をコードしている領域の最後の17残
基に合致し、Gly-Gly-Ser-Ala 「リンカー」領域をコー
ドしている15残基と Pst1認識部位を付加したプライマ
ーである 5'−TACTGCAGATCCGCCTCTTGAGAACCCCACAT 。PCRはVentポリメラーゼを使い、製造者(New Engl
and BioLabs 社、米国マサチューセッツ州ビバリー)に
より記載された条件で行なった。
【0035】フェノール抽出とエタノール沈澱の後、P
CR産物を適当な緩衝液に再懸濁し、T4キナーゼでリ
ン酸化し、そして既述の方法でKlenowポリメラーゼによ
って平滑末端とした。平滑末端化したPCR断片に、次
の配列を有する2つの合成した非パリンドローム性オリ
ゴヌクレオチド: 5'−CTTTAGAGCACAおよび 3'−GAAATCTC を連結することにより、BstX1認識部位を付加した。
CR産物を適当な緩衝液に再懸濁し、T4キナーゼでリ
ン酸化し、そして既述の方法でKlenowポリメラーゼによ
って平滑末端とした。平滑末端化したPCR断片に、次
の配列を有する2つの合成した非パリンドローム性オリ
ゴヌクレオチド: 5'−CTTTAGAGCACAおよび 3'−GAAATCTC を連結することにより、BstX1認識部位を付加した。
【0036】得られた断片はその後BstX1で開環したp
CDM8ベクターに連結した。pCDM8中にCMVプ
ロモータに対してセンス方向にその断片を含む得られた
プラスミドをNot1切断によって開環し、次いで部分的
なPst1制限消化を行った。Pst1−Eag1制限断片をp
BRHIG1プラスミドベクター(Ellison ら、既出)
から精製し、上記のプラスミドベクターに連結した。
CDM8ベクターに連結した。pCDM8中にCMVプ
ロモータに対してセンス方向にその断片を含む得られた
プラスミドをNot1切断によって開環し、次いで部分的
なPst1制限消化を行った。Pst1−Eag1制限断片をp
BRHIG1プラスミドベクター(Ellison ら、既出)
から精製し、上記のプラスミドベクターに連結した。
【0037】Eag1と Not1制限酵素は同じ接着末端を
生成するが、両者の融合は Not1認識部位の欠失をもた
らし、 Eag1認識部位は欠失しないことに留意された
い。それゆえに、目的とする組換え構築物を選ぶため
に、Not 1 対抗選択を行なった。実施例13 キメラヒトIL5Rα−IgG3分子の構築 実施例12と同じプロトコールが以下の例外をもって採用
された:PCR5'リンカーは Met 5'−AAGCTT GGATCCATGATCATCGTGGCGCAT Hind 3 BamH1 であり、hIL5Rαの最初の6アミノ酸に相応するヌ
クレオチドの5'側に示したような2つの追加の制限部位
を創出する。
生成するが、両者の融合は Not1認識部位の欠失をもた
らし、 Eag1認識部位は欠失しないことに留意された
い。それゆえに、目的とする組換え構築物を選ぶため
に、Not 1 対抗選択を行なった。実施例13 キメラヒトIL5Rα−IgG3分子の構築 実施例12と同じプロトコールが以下の例外をもって採用
された:PCR5'リンカーは Met 5'−AAGCTT GGATCCATGATCATCGTGGCGCAT Hind 3 BamH1 であり、hIL5Rαの最初の6アミノ酸に相応するヌ
クレオチドの5'側に示したような2つの追加の制限部位
を創出する。
【0038】PCR 3'リンカーとしては次のようなヌ
クレオチドが使われた: 5'−GAGCTCACCGGATCCGCCTCTTGAGAACCCCAC AT さらに、部分 Sac1消化物を Pst1消化物の代わりに使
用し、pATHIG3(2)(Huckら、既出)をイムノグロ
ブリン遺伝子部分の供給源として使用した。
クレオチドが使われた: 5'−GAGCTCACCGGATCCGCCTCTTGAGAACCCCAC AT さらに、部分 Sac1消化物を Pst1消化物の代わりに使
用し、pATHIG3(2)(Huckら、既出)をイムノグロ
ブリン遺伝子部分の供給源として使用した。
【図1】shIL5Rαの核酸配列と推定アミノ酸配
列、並びにヒトの配列と異なるアミノ酸のみを下に示し
たmIL5Rαの対応するアミノ酸配列を示す図。
列、並びにヒトの配列と異なるアミノ酸のみを下に示し
たmIL5Rαの対応するアミノ酸配列を示す図。
【図2】shIL5Rαを使った競合結合検定の結果を
示す図。
示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 15/13 15/62 C12P 21/02 C 8214−4B (72)発明者 ウォルター フィアース ベルギー国 B−9070 デステルベルゲン ボイケンドリーフ 3 (72)発明者 ジャン タヴェルニア ベルギー国 B−9860 バルゲム ボテル ウェック 2
Claims (11)
- 【請求項1】 2つの部分DNA配列、すなわちヒトの
インターロイキン5受容体のα鎖及び/またはβ鎖の断
片をコードしている1つの部分配列(該断片または断片
の組み合わせはヒトのインターロイキン5と結合する)
と、ヒトのIgG、IgA、IgMまたはIgEのよう
なイムノグロブリンのH鎖またはL鎖の定常領域または
その一部をコードしている他の部分配列と、から成るD
NA配列。 - 【請求項2】 1つの部分DNA配列がヒトインターロ
イキン5になお結合しうるヒトインターロイキン5受容
体のα鎖の断片をコードしている請求項1記載のDNA
配列。 - 【請求項3】 請求項1または2記載のDNA配列を含
むベクター。 - 【請求項4】 真核宿主細胞において発現させることが
できる請求項3記載のベクター。 - 【請求項5】 請求項3または4記載のベクターで形質
転換された原核または真核宿主細胞。 - 【請求項6】 請求項1または2記載のDNAによって
コードされた組換え蛋白。 - 【請求項7】 病気の治療のための請求項6記載の組換
え蛋白。 - 【請求項8】 請求項5記載の形質転換された宿主を適
当な培地で培養し、請求項6記載の蛋白を単離すること
を含む該蛋白の生産方法。 - 【請求項9】 請求項6記載の1つまたはそれ以上の化
合物を、所望により薬学的に活性のある他の物質および
/または毒性がなく、不活性な、治療上適合しうる担体
物質と共に、含有してなる医薬組成物。 - 【請求項10】 病気、特に慢性的な喘息の治療のための
請求項6記載の化合物の使用。 - 【請求項11】 請求項8記載の方法により生産される請
求項6記載の組換え蛋白。
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US7455964B1 (en) | 1996-07-15 | 2008-11-25 | The Hospital For Sick Children | Genes from the 20q13 amplicon and their uses |
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WO1998047923A1 (en) * | 1997-04-18 | 1998-10-29 | Tanox Biosystems, Inc. | Il-5r antagonists for treatment of inflammation, asthma and other allergic diseases |
DK1047781T3 (da) * | 1998-01-23 | 2004-12-06 | Immunex Corp | IL-18-receptorer |
US7083949B2 (en) | 1998-09-25 | 2006-08-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Receptor based antagonists and methods of making and using |
US6472179B2 (en) * | 1998-09-25 | 2002-10-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Receptor based antagonists and methods of making and using |
US6927044B2 (en) | 1998-09-25 | 2005-08-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | IL-1 receptor based cytokine traps |
WO2000027885A1 (fr) * | 1998-11-05 | 2000-05-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Nouveau popypeptide chimerique |
US7109299B1 (en) | 1999-12-16 | 2006-09-19 | Affymax, Inc. | Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor |
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AU2004282984B2 (en) * | 2003-11-13 | 2011-07-14 | Hanmi Science Co., Ltd. | Protein complex using immunoglobulin fragment andmethod for the preparation thereof |
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KR100754667B1 (ko) | 2005-04-08 | 2007-09-03 | 한미약품 주식회사 | 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Fc 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물 |
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WO2010011096A2 (en) | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. | A polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends |
KR102073748B1 (ko) | 2013-01-31 | 2020-02-05 | 한미약품 주식회사 | 재조합 효모 형질전환체 및 이를 이용하여 면역글로불린 단편을 생산하는 방법 |
AR096891A1 (es) | 2013-07-12 | 2016-02-03 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo |
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EP1132471A3 (de) * | 1989-09-12 | 2001-11-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | TNF-bindende Proteine |
DK0835939T3 (da) * | 1990-06-28 | 2006-03-13 | Sanofi Aventis Deutschland | Fusionsproteiner med andele af immunglobulin, deres fremstilling og anvendelse |
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