JPH05268967A - キメラインターロイキン５受容体／イムノグロブリンポ リペプチド - Google Patents
キメラインターロイキン５受容体／イムノグロブリンポ リペプチドInfo
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 ２つの部分ＤＮＡ配列、すなわちヒトインタ
ーロイキン５受容体のα鎖および／またはβ鎖の断片
(該断片または断片の組み合わせはヒトのインターロイ
キン５と結合する) をコードしている１つの部分配列
と、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥあるいはそれらの
一部のようなヒトイムノグロブリンのＨ鎖またはＬ鎖の
定常領域をコードしている他の部分配列と、から成るＤ
ＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を含むベクター、該ベクターで
形質転換された原核または真核宿主細胞、該ＤＮＡ配列
によってコードされた組換え蛋白、該組換え蛋白を生産
するための方法、及び該組換え蛋白を含有する医薬組成
物に関する。 【効果】 得られたキメラポリペプチドおよびその生理
学上適合される塩は、ＩＬ−５が経過に関与している病
気、例えば慢性的な喘息の治療に使用される。
ーロイキン５受容体のα鎖および／またはβ鎖の断片
(該断片または断片の組み合わせはヒトのインターロイ
キン５と結合する) をコードしている１つの部分配列
と、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥあるいはそれらの
一部のようなヒトイムノグロブリンのＨ鎖またはＬ鎖の
定常領域をコードしている他の部分配列と、から成るＤ
ＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を含むベクター、該ベクターで
形質転換された原核または真核宿主細胞、該ＤＮＡ配列
によってコードされた組換え蛋白、該組換え蛋白を生産
するための方法、及び該組換え蛋白を含有する医薬組成
物に関する。 【効果】 得られたキメラポリペプチドおよびその生理
学上適合される塩は、ＩＬ−５が経過に関与している病
気、例えば慢性的な喘息の治療に使用される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、２つの部分ＤＮＡ配
列、すなわちヒトのインターロイキン５受容体のα鎖及
び／またはβ鎖の断片をコードしている１つの部分配列
（該断片または断片の組み合わせはヒトのインターロイ
キン５と結合する）とヒトのＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭま
たはＩｇＥのようなイムノグロブリンのＨ鎖またはＬ鎖
の定常領域またはその一部をコードしている他の部分配
列とから成るＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を含むベクタ
ー、該ベクターで形質転換された原核または真核宿主細
胞、該ＤＮＡ配列によってコードされた組換え蛋白、か
かる組換え蛋白の生産方法、および組換え蛋白を含む医
薬組成物に関するものである。
列、すなわちヒトのインターロイキン５受容体のα鎖及
び／またはβ鎖の断片をコードしている１つの部分配列
（該断片または断片の組み合わせはヒトのインターロイ
キン５と結合する）とヒトのＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭま
たはＩｇＥのようなイムノグロブリンのＨ鎖またはＬ鎖
の定常領域またはその一部をコードしている他の部分配
列とから成るＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を含むベクタ
ー、該ベクターで形質転換された原核または真核宿主細
胞、該ＤＮＡ配列によってコードされた組換え蛋白、か
かる組換え蛋白の生産方法、および組換え蛋白を含む医
薬組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】インターロイキン５ (ＩＬ−５またはＩ
Ｌ５) はＢ細胞と好酸球に対して生物活性を有するＴ細
胞及びマスト細胞によって分泌されるリンホカインであ
る。Ｂ細胞に対する活性はネズミの系に限定されている
ようにみえる。ヒトのＢ細胞活性化または分化検定系で
は活性が検出されない。
Ｌ５) はＢ細胞と好酸球に対して生物活性を有するＴ細
胞及びマスト細胞によって分泌されるリンホカインであ
る。Ｂ細胞に対する活性はネズミの系に限定されている
ようにみえる。ヒトのＢ細胞活性化または分化検定系で
は活性が検出されない。
【０００３】ネズミの血球造血においては、ＩＬ−５は
好酸球系統の増殖と分化の選択的シグナルである［Yama
guchi ら、J. Exp. Med. 167, 43-56 (1988)］。この点
においてＩＬ−５の機能は他の骨髄様細胞系統に対する
コロニー刺激因子と類似している。またヒト (ｈ) ＩＬ
−５はヒトの好酸球の活性化に非常に効力がある［Lope
z ら、J. Exp. Med. 167, 219-224 (1988) ; Saitoら、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2288-2292)］。
好酸球系統の増殖と分化の選択的シグナルである［Yama
guchi ら、J. Exp. Med. 167, 43-56 (1988)］。この点
においてＩＬ−５の機能は他の骨髄様細胞系統に対する
コロニー刺激因子と類似している。またヒト (ｈ) ＩＬ
−５はヒトの好酸球の活性化に非常に効力がある［Lope
z ら、J. Exp. Med. 167, 219-224 (1988) ; Saitoら、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2288-2292)］。
【０００４】インターロイキン５は細胞膜受容体−複合
体を介してその活性を伝達する。この複合体はネズミ及
びヒトの両方の系において物理化学的に特徴づけられて
いる。マウスのプレＢ細胞系（ＩＬ５がその増殖を左右
している）は骨髄から発生しており、ＩＬ−５受容体の
分析に使われている［Rolinkら、J. Exp. Med. 169,169
3-1701 (1989)］。ヒトのＩＬ−５受容体は好酸球の分
化に向けて誘導された前駆骨髄細胞系 HL60 のサブクロ
ーンに関して研究されている［Plaetinck ら、J. Exp.
Med. 172, 683-691 (1990)］。
体を介してその活性を伝達する。この複合体はネズミ及
びヒトの両方の系において物理化学的に特徴づけられて
いる。マウスのプレＢ細胞系（ＩＬ５がその増殖を左右
している）は骨髄から発生しており、ＩＬ−５受容体の
分析に使われている［Rolinkら、J. Exp. Med. 169,169
3-1701 (1989)］。ヒトのＩＬ−５受容体は好酸球の分
化に向けて誘導された前駆骨髄細胞系 HL60 のサブクロ
ーンに関して研究されている［Plaetinck ら、J. Exp.
Med. 172, 683-691 (1990)］。
【０００５】好酸球の分化は酪酸ナトリウムによって開
始される。高親和性 (Kd＝30pM) のＩＬ５結合部位のみ
がこの細胞にみられる。しかしながら、交叉結合の研究
によってＩＬ５結合に関わる、ネズミのＩＬ５Ｒ−α鎖
及びβ鎖によく似た分子量をもつ２つのポリペプチド鎖
の存在が示されている。可溶性のヒトＩＬ５Ｒα鎖 (ｓ
ｈＩＬ５Ｒα) は慢性喘息あるいはその他の好酸球増加
を伴う病状においてＩＬ−５拮抗剤として使用すること
ができるだろう。さらに、ｓｈＩＬ５Ｒαまたはα鎖そ
れ自体またはα鎖とβ鎖から成っている完全な高親和性
受容体［Tavernierら、Cell 66, 印刷中 (1991) ］はＩ
Ｌ−５拮抗剤をスクリーニングする道具として使用する
ことができるだろう。
始される。高親和性 (Kd＝30pM) のＩＬ５結合部位のみ
がこの細胞にみられる。しかしながら、交叉結合の研究
によってＩＬ５結合に関わる、ネズミのＩＬ５Ｒ−α鎖
及びβ鎖によく似た分子量をもつ２つのポリペプチド鎖
の存在が示されている。可溶性のヒトＩＬ５Ｒα鎖 (ｓ
ｈＩＬ５Ｒα) は慢性喘息あるいはその他の好酸球増加
を伴う病状においてＩＬ−５拮抗剤として使用すること
ができるだろう。さらに、ｓｈＩＬ５Ｒαまたはα鎖そ
れ自体またはα鎖とβ鎖から成っている完全な高親和性
受容体［Tavernierら、Cell 66, 印刷中 (1991) ］はＩ
Ｌ−５拮抗剤をスクリーニングする道具として使用する
ことができるだろう。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題及びそれを解決するため
の手段】それ故、本発明の目的は、２つの部分ＤＮＡ配
列、すなわちｈＩＬ５Ｒのα鎖及び／またはβ鎖の断片
をコードしている１つの部分配列（該断片または断片の
組み合わせはｈＩＬ５と結合し、α鎖の断片 (ｓｈＩＬ
５Ｒα) および特に図１に示した配列の全部または一部
を有する断片が好適である）と、ヒトのイムノグロブリ
ンのＨ鎖またはＬ鎖の定常領域またはその一部をコード
している他の部分配列（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたは
ＩｇＥ、特にＩｇＧ、例えばＩｇＧ１及びＩｇＧ３のよ
うなヒトイムノグロブリンのＨ鎖、特に定常領域の第一
の領域を除く全ての領域が好適である）と、の組み合わ
せから成るＤＮＡ配列を提供することにある。さらに、
ｈＩＬ５と結合するｈＩＬ５Ｒのα鎖の断片をコードし
ているＤＮＡ配列はまた、ｈＩＬ５と結合する蛋白をコ
ードしている図１に示したＤＮＡ配列にストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズす
るＤＮＡ配列から成ることが理解されよう。当業界で習
熟した者は、図１に示したＤＮＡ配列に基づいて、また
例えばSambrookらにより開示された当技術の発達段階に
おける標準的な知識に従って、ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件を容易に規定することができる
だろう。さらに、本発明の目的は、このようなＤＮＡ配
列を含むベクター、特に真核宿主細胞で発現可能なベク
ター、及びかかるベクターで形質転換された原核または
真核宿主細胞を提供することである。最後に、本発明の
目的は、上記のような形質転換された宿主を適当な培地
で培養し、組換え蛋白を単離することから成る、かかる
ＤＮＡ配列によってコードされる組換え蛋白の生産方法
を提供することである。
の手段】それ故、本発明の目的は、２つの部分ＤＮＡ配
列、すなわちｈＩＬ５Ｒのα鎖及び／またはβ鎖の断片
をコードしている１つの部分配列（該断片または断片の
組み合わせはｈＩＬ５と結合し、α鎖の断片 (ｓｈＩＬ
５Ｒα) および特に図１に示した配列の全部または一部
を有する断片が好適である）と、ヒトのイムノグロブリ
ンのＨ鎖またはＬ鎖の定常領域またはその一部をコード
している他の部分配列（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたは
ＩｇＥ、特にＩｇＧ、例えばＩｇＧ１及びＩｇＧ３のよ
うなヒトイムノグロブリンのＨ鎖、特に定常領域の第一
の領域を除く全ての領域が好適である）と、の組み合わ
せから成るＤＮＡ配列を提供することにある。さらに、
ｈＩＬ５と結合するｈＩＬ５Ｒのα鎖の断片をコードし
ているＤＮＡ配列はまた、ｈＩＬ５と結合する蛋白をコ
ードしている図１に示したＤＮＡ配列にストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズす
るＤＮＡ配列から成ることが理解されよう。当業界で習
熟した者は、図１に示したＤＮＡ配列に基づいて、また
例えばSambrookらにより開示された当技術の発達段階に
おける標準的な知識に従って、ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件を容易に規定することができる
だろう。さらに、本発明の目的は、このようなＤＮＡ配
列を含むベクター、特に真核宿主細胞で発現可能なベク
ター、及びかかるベクターで形質転換された原核または
真核宿主細胞を提供することである。最後に、本発明の
目的は、上記のような形質転換された宿主を適当な培地
で培養し、組換え蛋白を単離することから成る、かかる
ＤＮＡ配列によってコードされる組換え蛋白の生産方法
を提供することである。
【０００７】本発明はまた、このようなＤＮＡ配列によ
ってコードされた、特に慢性喘息のような病気の治療の
ための、組換え体のキメラポリペプチドに関する。もち
ろん、アミノ酸が欠失または交換されているが、結果的
にその蛋白の活性が有意に変えられていないようなアミ
ノ酸配列をもつ蛋白も含まれる。このような分子の活性
を一般に変えることのない蛋白やペプチドのアミノ酸交
換は当業界で知られており、例えば「The Proteins」
(アカデミック・プレス社、ニューヨーク市、1979年、
特に14ページの図６を参照) においてH. NeurathとR.
L. Hillによって述べられている。最もよく行われる交
換はAla/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser,Ala/Gly, Al
a/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pr
o, Lys/Arg,Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp
/Gly 及びこれらの逆である。
ってコードされた、特に慢性喘息のような病気の治療の
ための、組換え体のキメラポリペプチドに関する。もち
ろん、アミノ酸が欠失または交換されているが、結果的
にその蛋白の活性が有意に変えられていないようなアミ
ノ酸配列をもつ蛋白も含まれる。このような分子の活性
を一般に変えることのない蛋白やペプチドのアミノ酸交
換は当業界で知られており、例えば「The Proteins」
(アカデミック・プレス社、ニューヨーク市、1979年、
特に14ページの図６を参照) においてH. NeurathとR.
L. Hillによって述べられている。最もよく行われる交
換はAla/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser,Ala/Gly, Al
a/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pr
o, Lys/Arg,Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp
/Gly 及びこれらの逆である。
【０００８】このようなキメラポリペプチドはin vivo
で増大した半減期をもつことができる。in vivo での増
大した半減期は、例えばヒトのＣＤ４分子の最初の２つ
の領域あるいはその一部と哺乳類のイムノグロブリンの
Ｈ鎖またはＬ鎖の定常領域の異なる領域とから成るキメ
ラポリペプチドの場合に見られる (Trauneckerら、Natu
re 331, 84-86［1988］及び欧州特許出願公開第394827
号を参照されたい) 。
で増大した半減期をもつことができる。in vivo での増
大した半減期は、例えばヒトのＣＤ４分子の最初の２つ
の領域あるいはその一部と哺乳類のイムノグロブリンの
Ｈ鎖またはＬ鎖の定常領域の異なる領域とから成るキメ
ラポリペプチドの場合に見られる (Trauneckerら、Natu
re 331, 84-86［1988］及び欧州特許出願公開第394827
号を参照されたい) 。
【０００９】本発明の目的のために、キメラポリペプチ
ドは二量体形になりうることがさらに理解されよう。す
なわち、二量体形は各サブユニットがｈＩＬ５とまだ結
合するＩＬ５Ｒのα鎖の断片を含む２つのサブユニッ
ト、あるいは２つのサブユニットのうちの１つがＩＬ５
Ｒのβ鎖の断片を含む２つのサブユニットから成り、そ
の結果二量体ポリペプチドがｈＩＬ５と結合するもので
ある。
ドは二量体形になりうることがさらに理解されよう。す
なわち、二量体形は各サブユニットがｈＩＬ５とまだ結
合するＩＬ５Ｒのα鎖の断片を含む２つのサブユニッ
ト、あるいは２つのサブユニットのうちの１つがＩＬ５
Ｒのβ鎖の断片を含む２つのサブユニットから成り、そ
の結果二量体ポリペプチドがｈＩＬ５と結合するもので
ある。
【００１０】ｈＩＬ５Ｒのα鎖をコードしているＤＮＡ
配列のクローニングは次のような方法で達成できる。ネ
ズミのＩＬ−５受容体 (ｍＩＬ５Ｒ) を膜結合型で含む
ネズミ細胞系を当業界で知られた方法、または例えば実
施例２に詳述した方法で培養する。その後、細胞を遠心
により回収し、溶解し、そして膜抽出物を例えばトリト
ン-X-100のような適当な界面活性剤を用いて調製する。
ｍＩＬ５Ｒのα鎖を単離するには、遠心によって清澄化
した膜抽出物を免疫親和性マトリックスに通過させる。
かかる免疫マトリックスのための対応する抗体、すなわ
ちｍＩＬ５Ｒのα鎖に対する抗体を調製し、既知の方法
あるいは例えば実施例１〜３に詳述した方法によって適
当なマトリックスに結合させる。ｍＩＬ５Ｒのα鎖はさ
らにドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルルアミドゲル
電気泳動 (ＳＤＳ−ＰＡＧＥ) で精製し、適当なマトリ
ックスにブロットする。
配列のクローニングは次のような方法で達成できる。ネ
ズミのＩＬ−５受容体 (ｍＩＬ５Ｒ) を膜結合型で含む
ネズミ細胞系を当業界で知られた方法、または例えば実
施例２に詳述した方法で培養する。その後、細胞を遠心
により回収し、溶解し、そして膜抽出物を例えばトリト
ン-X-100のような適当な界面活性剤を用いて調製する。
ｍＩＬ５Ｒのα鎖を単離するには、遠心によって清澄化
した膜抽出物を免疫親和性マトリックスに通過させる。
かかる免疫マトリックスのための対応する抗体、すなわ
ちｍＩＬ５Ｒのα鎖に対する抗体を調製し、既知の方法
あるいは例えば実施例１〜３に詳述した方法によって適
当なマトリックスに結合させる。ｍＩＬ５Ｒのα鎖はさ
らにドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルルアミドゲル
電気泳動 (ＳＤＳ−ＰＡＧＥ) で精製し、適当なマトリ
ックスにブロットする。
【００１１】こうして精製されたネズミＩＬ−５受容体
鎖は、例えばＮ末端アミノ酸配列決定や酵素的あるいは
化学的ペプチド分解のような当業界で知られたペプチド
化学の方法で、特性決定がなされる。酵素的または化学
的分解によって得られた断片を例えばＨＰＬＣのような
通常の方法に従って分離して、その断片自体をさらにＮ
末端配列決定にかける。
鎖は、例えばＮ末端アミノ酸配列決定や酵素的あるいは
化学的ペプチド分解のような当業界で知られたペプチド
化学の方法で、特性決定がなされる。酵素的または化学
的分解によって得られた断片を例えばＨＰＬＣのような
通常の方法に従って分離して、その断片自体をさらにＮ
末端配列決定にかける。
【００１２】こうして得られたアミノ酸配列情報から出
発して、オリゴヌクレオチドを既知の方法［例えば、Sa
mbrookら、既出を参照］に従って、遺伝暗号の縮重を考
慮に入れて作製することができる。ｃＤＮＡまたはゲノ
ムＤＮＡのライブラリーは当業界で知られた方法［Samb
rookら、「Molecular Cloning 」第２版、コールド・ス
プリング・ハーバー研究所出版 (1989年) ］により作製
できるが、その場合、ｃＤＮＡライブラリーは、誘導の
有無によらず、例えば実施例４に詳述するようなネズミ
またはヒトのＩＬ５Ｒを発現する細胞系からのｍＲＮＡ
調製物に基づいたものが好適である。その後、そのライ
ブラリーをオリゴヌクレオチドによってスクリーニング
する［Sambrookら、既出］。一旦このような方法で特定
のクローンが同定されると、本発明の目的とするＤＮＡ
配列をもったファージが単離され［Sambrookら、既
出］、そして対応する挿入部を制限酵素切断パターン解
析あるいは標準法による配列決定 (Sambrookら、既出)
によって特性決定する。本発明のＤＮＡ配列及びＩＬ５
と結合する蛋白をコードしている配列にストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件 (例えばSambrookら；
既出を参照) 下でハイブリダイズするＤＮＡ配列も本発
明の目的のために使用できることが理解されよう。かか
るＤＮＡ配列は相応する未変異ＤＮＡ配列から出発し
て、例えば当業界でよく知られた突然変異誘発法(例え
ばSambrookらを参照) によって作製できる。さらに、実
施例12及び13に詳述するように、本発明のＤＮＡ配列の
作製のためにポリメラーゼ・チェイン・リアクション
(ＰＣＲ) を使用することができる。
発して、オリゴヌクレオチドを既知の方法［例えば、Sa
mbrookら、既出を参照］に従って、遺伝暗号の縮重を考
慮に入れて作製することができる。ｃＤＮＡまたはゲノ
ムＤＮＡのライブラリーは当業界で知られた方法［Samb
rookら、「Molecular Cloning 」第２版、コールド・ス
プリング・ハーバー研究所出版 (1989年) ］により作製
できるが、その場合、ｃＤＮＡライブラリーは、誘導の
有無によらず、例えば実施例４に詳述するようなネズミ
またはヒトのＩＬ５Ｒを発現する細胞系からのｍＲＮＡ
調製物に基づいたものが好適である。その後、そのライ
ブラリーをオリゴヌクレオチドによってスクリーニング
する［Sambrookら、既出］。一旦このような方法で特定
のクローンが同定されると、本発明の目的とするＤＮＡ
配列をもったファージが単離され［Sambrookら、既
出］、そして対応する挿入部を制限酵素切断パターン解
析あるいは標準法による配列決定 (Sambrookら、既出)
によって特性決定する。本発明のＤＮＡ配列及びＩＬ５
と結合する蛋白をコードしている配列にストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件 (例えばSambrookら；
既出を参照) 下でハイブリダイズするＤＮＡ配列も本発
明の目的のために使用できることが理解されよう。かか
るＤＮＡ配列は相応する未変異ＤＮＡ配列から出発し
て、例えば当業界でよく知られた突然変異誘発法(例え
ばSambrookらを参照) によって作製できる。さらに、実
施例12及び13に詳述するように、本発明のＤＮＡ配列の
作製のためにポリメラーゼ・チェイン・リアクション
(ＰＣＲ) を使用することができる。
【００１３】このようにして決定された配列及びいくつ
かの受容体のすでに知られている配列に基づいて、可溶
性の受容体サブユニットをコードする部分配列を決定す
ることができ、そして本発明のクローンの特定の挿入ｃ
ＤＮＡが例えばｃＤＮＡクローン「λｇｔ11−ｈＩＬ５
Ｒα12」の場合のようにｓｈＩＬ５Ｒαをコードしてい
ない場合には、既知の方法［Sambrookら、既出、または
Maliszewski and Fanslow, Tibtech., ８, 324-329 (19
90)も参照］を使って完全な配列から切り出すことがで
きる。
かの受容体のすでに知られている配列に基づいて、可溶
性の受容体サブユニットをコードする部分配列を決定す
ることができ、そして本発明のクローンの特定の挿入ｃ
ＤＮＡが例えばｃＤＮＡクローン「λｇｔ11−ｈＩＬ５
Ｒα12」の場合のようにｓｈＩＬ５Ｒαをコードしてい
ない場合には、既知の方法［Sambrookら、既出、または
Maliszewski and Fanslow, Tibtech., ８, 324-329 (19
90)も参照］を使って完全な配列から切り出すことがで
きる。
【００１４】完全配列またはかかる部分配列はその後原
核生物での増幅及び／または発現のために、当分野で既
に開示されたベクターに既知の方法で組み込むことがで
きる［Sambrookら、既出］。適当な原核宿主生物は、例
えばグラム陰性菌及びグラム陽性菌であり、例えばE.co
li HB 101 ATCC No.33694 、E.coli W3110［ATCC No.
27325］、E.coli MC1061［Casadabam and Cohen; J. Mo
l. Biol. 138, 179-207 (1980 年) といったE.coli株
(後の方の２つは、πVXまたはｐｓｈＩＬ５Ｒα(実施例
９を参照) のようなｐＣＤＭ８型のベクターが増幅され
る場合に、すでにプラスミド「p3」(Sambrookら、既出)
を保有している) あるいはB. subtilis株である。
核生物での増幅及び／または発現のために、当分野で既
に開示されたベクターに既知の方法で組み込むことがで
きる［Sambrookら、既出］。適当な原核宿主生物は、例
えばグラム陰性菌及びグラム陽性菌であり、例えばE.co
li HB 101 ATCC No.33694 、E.coli W3110［ATCC No.
27325］、E.coli MC1061［Casadabam and Cohen; J. Mo
l. Biol. 138, 179-207 (1980 年) といったE.coli株
(後の方の２つは、πVXまたはｐｓｈＩＬ５Ｒα(実施例
９を参照) のようなｐＣＤＭ８型のベクターが増幅され
る場合に、すでにプラスミド「p3」(Sambrookら、既出)
を保有している) あるいはB. subtilis株である。
【００１５】さらに、このような配列は、例えば酵母、
昆虫細胞、哺乳動物細胞のような真核宿主細胞での発現
のために適当なベクター中に既知の方法を使って組み込
むことができる。哺乳動物細胞のための典型的な発現ベ
クターは、良好な転写速度をもたらす効率的なプロモー
タ要素、発現すべきＤＮＡ配列、及び効率的な終止と転
写物のポリアデニル化のための信号を含んでいる。使用
できる追加の要素は再度増強された転写へ導く「エンハ
ンサー」、及び例えばｍＲＮＡのより長い半減期をもた
らす配列である。シグナルペプチドをコードしている内
在性の配列断片を欠いている核酸配列の発現のために
は、他の既知の蛋白のシグナルペプチドをコードしてい
るかかる適当な配列を含むベクターが使われる。例えば
Cell, 46, 973-982 (1986)の中でCullen, B.R.が、ある
いはGething, M.J.編「Current Communications in Mol
ecular Biology 」、Cold Spring Harbor Lab.(1985年)
73-78 頁の中でSharma, S.らが開示したベクターpLJ26
8を参照されたい。
昆虫細胞、哺乳動物細胞のような真核宿主細胞での発現
のために適当なベクター中に既知の方法を使って組み込
むことができる。哺乳動物細胞のための典型的な発現ベ
クターは、良好な転写速度をもたらす効率的なプロモー
タ要素、発現すべきＤＮＡ配列、及び効率的な終止と転
写物のポリアデニル化のための信号を含んでいる。使用
できる追加の要素は再度増強された転写へ導く「エンハ
ンサー」、及び例えばｍＲＮＡのより長い半減期をもた
らす配列である。シグナルペプチドをコードしている内
在性の配列断片を欠いている核酸配列の発現のために
は、他の既知の蛋白のシグナルペプチドをコードしてい
るかかる適当な配列を含むベクターが使われる。例えば
Cell, 46, 973-982 (1986)の中でCullen, B.R.が、ある
いはGething, M.J.編「Current Communications in Mol
ecular Biology 」、Cold Spring Harbor Lab.(1985年)
73-78 頁の中でSharma, S.らが開示したベクターpLJ26
8を参照されたい。
【００１６】哺乳動物細胞での特定のＤＮＡ配列の一時
的な発現に使われるこれらベクターの殆んどはSV40ウイ
ルスの複製起点を含んでいる。このウイルスのＴ抗原を
発現する細胞 (例えばＣＯＳ細胞) では、これらベクタ
ーが豊富に複製される。しかしながら、例えば実施例10
に記載するような一時的発現はＣＯＳ細胞に限られな
い。原理的にはトランスフェクトされ得る哺乳動物細胞
系はどれもこの目的のために使用できる。強力な転写を
起こせるシグナルは、例えばSV40の早期及び後期プロモ
ーター、ＨＣＭＶ (ヒトのサイトメガロウイルス) の
「主要即時型」遺伝子のプロモーター及びエンハンサ
ー、ＲＳＶ、ＨＩＶ、ＭＭＴＶのようなレトロウイルス
のＬＴＲ「ロング・ターミナル・リピート」などであ
る。しかしながら、例えばアクチンやコラゲナーゼ遺伝
子のプロモーターのような細胞遺伝子のシグナルも使用
できる。
的な発現に使われるこれらベクターの殆んどはSV40ウイ
ルスの複製起点を含んでいる。このウイルスのＴ抗原を
発現する細胞 (例えばＣＯＳ細胞) では、これらベクタ
ーが豊富に複製される。しかしながら、例えば実施例10
に記載するような一時的発現はＣＯＳ細胞に限られな
い。原理的にはトランスフェクトされ得る哺乳動物細胞
系はどれもこの目的のために使用できる。強力な転写を
起こせるシグナルは、例えばSV40の早期及び後期プロモ
ーター、ＨＣＭＶ (ヒトのサイトメガロウイルス) の
「主要即時型」遺伝子のプロモーター及びエンハンサ
ー、ＲＳＶ、ＨＩＶ、ＭＭＴＶのようなレトロウイルス
のＬＴＲ「ロング・ターミナル・リピート」などであ
る。しかしながら、例えばアクチンやコラゲナーゼ遺伝
子のプロモーターのような細胞遺伝子のシグナルも使用
できる。
【００１７】しかし一方で、ゲノム (染色体) に組み込
まれた特定のＤＮＡ配列をもつ安定した細胞系も得るこ
とができる。このためには、ＤＮＡ配列を、例えばネオ
マイシン、ヒグロマイシン、ジヒドロ葉酸還元酵素 (ｄ
ｈｆｒ) あるいはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリ
ボシル転移酵素 (ｈｇｐｔ) といった選択マーカーと一
緒にトランスフェクトする。染色体に安定に取り込まれ
たＤＮＡ配列は豊富に増幅させることができる。このた
めの適切な選択マーカーは例えばジヒドロ葉酸還元酵素
(ｄｈｆｒ) である。これにより、完全なｄｈｆｒ遺伝
子を含まない哺乳動物細胞 (例えばＣＨＯ細胞) を、ト
ランスフェクションを起こさせた後に、メトトレキセー
トの量を上げながらインキュベートする。この方法で希
望のＤＮＡ配列を1000コピー以上含む細胞系が得られ
る。
まれた特定のＤＮＡ配列をもつ安定した細胞系も得るこ
とができる。このためには、ＤＮＡ配列を、例えばネオ
マイシン、ヒグロマイシン、ジヒドロ葉酸還元酵素 (ｄ
ｈｆｒ) あるいはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリ
ボシル転移酵素 (ｈｇｐｔ) といった選択マーカーと一
緒にトランスフェクトする。染色体に安定に取り込まれ
たＤＮＡ配列は豊富に増幅させることができる。このた
めの適切な選択マーカーは例えばジヒドロ葉酸還元酵素
(ｄｈｆｒ) である。これにより、完全なｄｈｆｒ遺伝
子を含まない哺乳動物細胞 (例えばＣＨＯ細胞) を、ト
ランスフェクションを起こさせた後に、メトトレキセー
トの量を上げながらインキュベートする。この方法で希
望のＤＮＡ配列を1000コピー以上含む細胞系が得られ
る。
【００１８】発現のために使用される哺乳動物細胞は、
例えばヒト細胞系のHela［ATCC CCL2］及び２９３［ATC
C CRL1573］並びに３Ｔ３［ATCC CCL163］及びＬ細胞、
例えば［ATCC CCL149］、（ＣＨＯ）細胞［ATCC CCL6
1］、ＢＨＫ［ATCC CCL10］細胞並びにＣＶ１［ATCC CC
L70］及びＣＯＳ細胞系［ATCC CRL1650, CRL1651］など
である。
例えばヒト細胞系のHela［ATCC CCL2］及び２９３［ATC
C CRL1573］並びに３Ｔ３［ATCC CCL163］及びＬ細胞、
例えば［ATCC CCL149］、（ＣＨＯ）細胞［ATCC CCL6
1］、ＢＨＫ［ATCC CCL10］細胞並びにＣＶ１［ATCC CC
L70］及びＣＯＳ細胞系［ATCC CRL1650, CRL1651］など
である。
【００１９】適当な発現ベクターには、例えばｐＢＣ12
ＭＩ［ATCC 67109］、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ［ATCC 3714
6］、ｐＳＶＬ［ファルマシア社 スウェーデン ウプ
サラ］、ｐＲＳＶｃａｔ［ATCC 37152］、ｐＭＳＧ［フ
ァルマシア社、スウェーデン ウプサラ］、及び例えば
E. coli MC1061 (プラスミドp3をもつ) に形質転換され
て1991年４月17日に受託番号DSM6479 として東ドイツ共
和国のブラウンシュバイクにあるドイツ微生物・細胞株
集積所 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Z
ellkulturen GmbH:ＤＳＭ) に特許手続上のブダペスト
条約のもとで寄託されたｐｓｈＩＬ５Ｒα［実施例７を
参照］のようなｐＣＤＭ８型のプラスミドなどのベクタ
ーが含まれる。プラスミドｐｓｈＩＬ５Ｒαは当業界で
知られるように、そして例えば実施例９に詳述するよう
にして、寄託された形質転換E. coliから単離できる。
本発明のキメラポリペプチドの発現のためには、東ドイ
ツ共和国ブラウンシュバイクにある微生物・細胞株集積
所 (ＤＳＭ) に寄託され、また欧州特許出願第9010739
3.2号 (公開番号394827) に詳細に記載されているｐＣ
Ｄ４−Ｈμ (DSM 5315) 、ｐＣＤ４−Ｈγ1 (DSM 531
4)、ｐＣＤ４−Ｈγ３ (DSM5523) のようなｐＳＶ２由
来のベクター［例えば「ＤＮＡクローニング」第II巻、
Glover, D. M. 編、ＩＲＬ出版社 (オックスフォード)
1985年版でのGerman,C.の記載を参照］が用いられる。
この欧州特許出願の明細書には、キメラ蛋白の発現のた
めに、またはイムノグロブリン断片を有するキメラ蛋白
の発現のためのベクターの構築のために、これらのベク
ターを使うことに関するデータも含まれている。本発明
の目的のために、これらのベクター中のＣＤ４コード部
分は、既知の方法や例えばSambrookら (既出) に記載さ
れた方法によって、まだｈＩＬ５と結合するｈＩＬ５Ｒ
のα鎖及び／またはβ鎖の断片をコードしているＤＮＡ
配列によって置き換えられねばならず、所望により、得
られたかかるベクターにおいて、特定のイムノグロブリ
ンコード部分は希望のイムノグロブリン部分をコードす
るＤＮＡ配列によって置き換えることができる。本発明
のキメラポリペプチドの発現に適するベクターは、例え
ばキメラポリペプチドを含んでいるＩＬ５Ｒのα鎖の断
片の発現のためのｐｓｈＩＬ５ＲαのようなｐＣＤＭ８
型のベクターである (実施例12及び13を参照) 。上に記
載したように、ヒトイムノグロブリンの定常領域をコー
ドしているＤＮＡ配列の供給源は当分野で知られてお
り、例えば EP 394827に記載されているか、またはＩｇ
Ｇ１やＩｇＧ３のかかる定常領域の場合には例えばElli
son ら［Nucl. Acid Res, 10, 4071-4079 (1982)］また
はHuckら［Nucl. Acid Res. 14, 1779-1789 (1986)］に
よってそれぞれ記載されている。
ＭＩ［ATCC 67109］、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ［ATCC 3714
6］、ｐＳＶＬ［ファルマシア社 スウェーデン ウプ
サラ］、ｐＲＳＶｃａｔ［ATCC 37152］、ｐＭＳＧ［フ
ァルマシア社、スウェーデン ウプサラ］、及び例えば
E. coli MC1061 (プラスミドp3をもつ) に形質転換され
て1991年４月17日に受託番号DSM6479 として東ドイツ共
和国のブラウンシュバイクにあるドイツ微生物・細胞株
集積所 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Z
ellkulturen GmbH:ＤＳＭ) に特許手続上のブダペスト
条約のもとで寄託されたｐｓｈＩＬ５Ｒα［実施例７を
参照］のようなｐＣＤＭ８型のプラスミドなどのベクタ
ーが含まれる。プラスミドｐｓｈＩＬ５Ｒαは当業界で
知られるように、そして例えば実施例９に詳述するよう
にして、寄託された形質転換E. coliから単離できる。
本発明のキメラポリペプチドの発現のためには、東ドイ
ツ共和国ブラウンシュバイクにある微生物・細胞株集積
所 (ＤＳＭ) に寄託され、また欧州特許出願第9010739
3.2号 (公開番号394827) に詳細に記載されているｐＣ
Ｄ４−Ｈμ (DSM 5315) 、ｐＣＤ４−Ｈγ1 (DSM 531
4)、ｐＣＤ４−Ｈγ３ (DSM5523) のようなｐＳＶ２由
来のベクター［例えば「ＤＮＡクローニング」第II巻、
Glover, D. M. 編、ＩＲＬ出版社 (オックスフォード)
1985年版でのGerman,C.の記載を参照］が用いられる。
この欧州特許出願の明細書には、キメラ蛋白の発現のた
めに、またはイムノグロブリン断片を有するキメラ蛋白
の発現のためのベクターの構築のために、これらのベク
ターを使うことに関するデータも含まれている。本発明
の目的のために、これらのベクター中のＣＤ４コード部
分は、既知の方法や例えばSambrookら (既出) に記載さ
れた方法によって、まだｈＩＬ５と結合するｈＩＬ５Ｒ
のα鎖及び／またはβ鎖の断片をコードしているＤＮＡ
配列によって置き換えられねばならず、所望により、得
られたかかるベクターにおいて、特定のイムノグロブリ
ンコード部分は希望のイムノグロブリン部分をコードす
るＤＮＡ配列によって置き換えることができる。本発明
のキメラポリペプチドの発現に適するベクターは、例え
ばキメラポリペプチドを含んでいるＩＬ５Ｒのα鎖の断
片の発現のためのｐｓｈＩＬ５ＲαのようなｐＣＤＭ８
型のベクターである (実施例12及び13を参照) 。上に記
載したように、ヒトイムノグロブリンの定常領域をコー
ドしているＤＮＡ配列の供給源は当分野で知られてお
り、例えば EP 394827に記載されているか、またはＩｇ
Ｇ１やＩｇＧ３のかかる定常領域の場合には例えばElli
son ら［Nucl. Acid Res, 10, 4071-4079 (1982)］また
はHuckら［Nucl. Acid Res. 14, 1779-1789 (1986)］に
よってそれぞれ記載されている。
【００２０】これらの細胞をトランスフェクトする方法
は選択された発現系やベクター系に左右される。これら
の方法の概略は例えば「Methods in Molecular Biolog
y」の中の Pollardらによる「DNA Transformation of M
ammalian Cells (哺乳動物細胞のＤＮＡ形質転換) 」
(Walker J.M.編「Nucleic Acids 」第２巻、1984年、ニ
ュージャージー州クリフトン、 Humana社］に載ってい
る。さらに他の方法が、Chenおよび Okayama［Molecula
r and Cell Biology 7, 2745-2752, 1987 「プラスミド
ＤＮＡによる哺乳動物細胞の高効率形質転換」］やFelg
ner ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 7413-7417, 1
989 「リポフェクチン：高度に効率的な脂質を介在させ
たＤＮＡトランスフェクション法」］に載っている。本
発明の適切なプラスミド (ベクター) でトランスフェク
トされた真核宿主細胞、並びにそれらのトランスフェク
ションおよび対応する組換え蛋白の発現に使われるプラ
スミドも本発明の目的である。
は選択された発現系やベクター系に左右される。これら
の方法の概略は例えば「Methods in Molecular Biolog
y」の中の Pollardらによる「DNA Transformation of M
ammalian Cells (哺乳動物細胞のＤＮＡ形質転換) 」
(Walker J.M.編「Nucleic Acids 」第２巻、1984年、ニ
ュージャージー州クリフトン、 Humana社］に載ってい
る。さらに他の方法が、Chenおよび Okayama［Molecula
r and Cell Biology 7, 2745-2752, 1987 「プラスミド
ＤＮＡによる哺乳動物細胞の高効率形質転換」］やFelg
ner ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 7413-7417, 1
989 「リポフェクチン：高度に効率的な脂質を介在させ
たＤＮＡトランスフェクション法」］に載っている。本
発明の適切なプラスミド (ベクター) でトランスフェク
トされた真核宿主細胞、並びにそれらのトランスフェク
ションおよび対応する組換え蛋白の発現に使われるプラ
スミドも本発明の目的である。
【００２１】一連の蛋白の発現のために上首尾ですでに
使用されているバキュロウイルス発現系 (Luckow and S
ummers, Bio/Technology ６, 47-55, 1988 を参照) は
昆虫細胞での発現に使用することができる。組換え蛋白
は標準的な形でまたは融合蛋白として生産される。こう
して生産された蛋白も修飾され、例えばグリコシル化さ
れ得る (Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
82, 8404-8408, 1987) 。目的蛋白を発現する組換えバ
キュロウイルスの作製には、いわゆる「転移ベクター」
が使われる。このもとでは、強力なプロモーター (例え
ばポリヘドロン遺伝子のもの) の制御下に異種ＤＮＡ配
列を含むプラスミドが考えられ、これによりＤＮＡ配列
は両側をウイルス配列で囲まれる。その後、この転移ベ
クターは野生型バキュロウイルスのＤＮＡと共に昆虫細
胞にトランスフェクトされる。相同組換えによって細胞
内に生じる組換えウイルスを同定し、既知の方法に従っ
て単離することができる。バキュロウイルス発現系とそ
れに用いる方法の概略は、LuckowおよびSummers の「バ
キュロウイルスベクターと昆虫細胞培養法に関する方法
のマニュアル」Texas Agricultural Experimental Stat
ion, Texas A & M大学報 No.1555、第２版 (1988年) に
載っている。バキュロウイルス発現系を使った場合の本
発明の実施のためには、イムノグロブリン部分をコード
しているＤＮＡ配列がｃＤＮＡの形でなければならない
ことが理解されよう。
使用されているバキュロウイルス発現系 (Luckow and S
ummers, Bio/Technology ６, 47-55, 1988 を参照) は
昆虫細胞での発現に使用することができる。組換え蛋白
は標準的な形でまたは融合蛋白として生産される。こう
して生産された蛋白も修飾され、例えばグリコシル化さ
れ得る (Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
82, 8404-8408, 1987) 。目的蛋白を発現する組換えバ
キュロウイルスの作製には、いわゆる「転移ベクター」
が使われる。このもとでは、強力なプロモーター (例え
ばポリヘドロン遺伝子のもの) の制御下に異種ＤＮＡ配
列を含むプラスミドが考えられ、これによりＤＮＡ配列
は両側をウイルス配列で囲まれる。その後、この転移ベ
クターは野生型バキュロウイルスのＤＮＡと共に昆虫細
胞にトランスフェクトされる。相同組換えによって細胞
内に生じる組換えウイルスを同定し、既知の方法に従っ
て単離することができる。バキュロウイルス発現系とそ
れに用いる方法の概略は、LuckowおよびSummers の「バ
キュロウイルスベクターと昆虫細胞培養法に関する方法
のマニュアル」Texas Agricultural Experimental Stat
ion, Texas A & M大学報 No.1555、第２版 (1988年) に
載っている。バキュロウイルス発現系を使った場合の本
発明の実施のためには、イムノグロブリン部分をコード
しているＤＮＡ配列がｃＤＮＡの形でなければならない
ことが理解されよう。
【００２２】その後、本発明のキメラポリペプチドは、
例えば硫安による沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過、イ
オン交換クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、焦点
電気泳動、免疫アフィニティークロマトグラフィーのよ
うなアフィニティークロマトグラフィー、順相または逆
相系でのＨＰＬＣといった当業界で知られている蛋白化
学の方法に従って、細胞塊あるいは培養上清から精製さ
れる。
例えば硫安による沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過、イ
オン交換クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、焦点
電気泳動、免疫アフィニティークロマトグラフィーのよ
うなアフィニティークロマトグラフィー、順相または逆
相系でのＨＰＬＣといった当業界で知られている蛋白化
学の方法に従って、細胞塊あるいは培養上清から精製さ
れる。
【００２３】この技術分野で知られている方法に従って
作られる本発明のキメラポリペプチドおよびその生理学
上適合される塩は、ＩＬ−５が病気の経過に関与してい
るかかる病気の治療及び／または対応する医薬組成物の
調製に使用することができる。この目的のために、上記
化合物の一つまたはそれ以上が、所望によりまたは必要
に応じて他の薬学的に活性な物質と組み合わせて、慣用
の固体または液体担体物質と一緒に既知の方法で加工さ
れる。かかる製剤の投与は、同じような活性や構造を有
する既存の製剤から類推して、通常の基準を考慮して行
なわれる。このような医薬組成物及び治療のための本発
明化合物の使用も本発明の目的である。
作られる本発明のキメラポリペプチドおよびその生理学
上適合される塩は、ＩＬ−５が病気の経過に関与してい
るかかる病気の治療及び／または対応する医薬組成物の
調製に使用することができる。この目的のために、上記
化合物の一つまたはそれ以上が、所望によりまたは必要
に応じて他の薬学的に活性な物質と組み合わせて、慣用
の固体または液体担体物質と一緒に既知の方法で加工さ
れる。かかる製剤の投与は、同じような活性や構造を有
する既存の製剤から類推して、通常の基準を考慮して行
なわれる。このような医薬組成物及び治療のための本発
明化合物の使用も本発明の目的である。
【００２４】これまで本発明を一般的に記載してきたの
で、以下の図面及び実施例で本発明を詳細に説明する
が、これによって本発明は制限をうけるものではない。図１ ｓｈＩＬ５Ｒαの核酸配列と推定アミノ酸配列。ｍＩＬ
５Ｒαの対応するアミノ酸配列はヒトの配列と異なるア
ミノ酸のみを示すことにより下に示してある。配列はヌ
クレオチドとアミノ酸の標準略号で表わされている。図２ 図２はｓｈＩＬ５Ｒαを使った競合結合検定の結果を示
す。詳細は実施例11を参照されたい。
で、以下の図面及び実施例で本発明を詳細に説明する
が、これによって本発明は制限をうけるものではない。図１ ｓｈＩＬ５Ｒαの核酸配列と推定アミノ酸配列。ｍＩＬ
５Ｒαの対応するアミノ酸配列はヒトの配列と異なるア
ミノ酸のみを示すことにより下に示してある。配列はヌ
クレオチドとアミノ酸の標準略号で表わされている。図２ 図２はｓｈＩＬ５Ｒαを使った競合結合検定の結果を示
す。詳細は実施例11を参照されたい。
【００２５】
【実施例】実施例１ ネズミのＩＬ５Ｒに対するモノクローナル抗体の生産 基本的には A. Rolinkら（既出）によって記載されたよ
うにして免疫を行なった。簡単に述べると、０日目に２
×107 のＢ13細胞［Rolinkら既出］を燐酸緩衝溶液（Ｐ
ＢＳ−Ａ）で洗い、完全フロインドアジュバント（ＣＦ
Ａ）と混合し、Wistarラットの後肢かかとに注射した。
５日目と７日目にフロインドアジュバント（ＦＡ）を加
えずにこれを繰り返した。８日目に局所的なリンパ節を
摘出し、細胞懸濁液を調製した。これらの細胞はPEG150
0(ベーリンガー社）を使ってSp2/0-Ag14細胞［ATCC CRL
1581］と５：1.５の割合で融合させた。細胞を500pg/ml
の組換えｈＩＬ−６の存在下でマイクロタイタープレー
トにまいた Haegemannら、Europ. J. Biochem, 159, 6
25-632 (1986)］。翌日、ハイブリッド細胞の選択のた
めに２×濃度のアミノプテリンを含む培地を同量加え
た。８日目にアミノプテリンを含まない培地を細胞に再
供給した。ハイブリドーマはｍＩＬ５［Tavernier, J.
ら、ＤＮＡ 8, 491-501 (1989)］、またはマウスインタ
ーロイキン３（ｍＩＬ３）で促進されるＢ13細胞の増殖
を阻止するその上清の能力で選択された（当分野で知ら
れた 3Ｈデオキシシチジン取込みにより測定する）。Ｗ
ＥＨＩ−３細胞（ATCC No. TIB68）からとったコンディ
ション培地がｍＩＬ３の供給源として使われた。阻害活
性を示す上清はＢ13細胞に対する放射性標識した（当業
界で知られた方法に従った）ｍＩＬ５または「Ｒ52」
［ＩＬ−５−Ｒのβ鎖のみを認識するモノクローナル抗
体（Rolinkら、既出）］を用いた競合結合検定で再試験
した。ｍＩＬ−５−Ｒのα鎖にのみ反応するモノクロー
ナル抗体はｍＩＬ５結合をほぼ完全に阻害する能力及び
対応するｍＩＬ−５−Ｒ鎖の免疫沈降によって同定され
た。選別されたハイブリドーマは限界希釈法によって再
クローン化された。実施例２ ｍＩＬ５Ｒ−β鎖の免疫アフィニティー精製 大型の回転フラスコで、Ｂ13細胞を、５％ウシ胎児血
清、２mMのＬ−グルタミン、50μg/mlのゲンタマイシ
ン、 100単位／mlの組換えマウスＩＬ−５を含むIscove
の改変ダルベッコ培地（Gibco Laboratories、米国ニュ
ーヨーク州グランドアイランド）で２×106 細胞／mlの
密度になるまで培養した。10Ｌの培養液から細胞を遠心
で集め、ＰＢＳで洗い、１％トリトンＸ-100と蛋白分解
酵素阻害剤のカクテル（１mMのＰＭＳＦ, 10mMのベンズ
アミジン塩酸, 100U／mlのアプロチニン）を含む 200ml
のＰＢＳ中で溶解した。10分間氷上においた後、溶解液
を10分間、1000×ｇで遠心分離し、さらに４℃で90分
間、超遠心分離(100,000×ｇ) で透明にした。上清をNa
Clで最終濃度0.５M になるよう希釈し、精製に用いた。
「Ｒ52」を Schneiderらの方法［J. Biol. Chem, 257,
10766 (1982)］に従い、プロテインＧ−セファロース４
Fast Flow (ファルマシア社、ＬＫＢバイオテクノロジ
ーＡＢ、スウェーデン、ウプサラ）に５mg／ml (ゲル)
の濃度で共有結合させた。Ｂ13細胞の溶解液200ml を４
℃で２mlのプロテインＧ−セファロース４ Fast Flowの
カラムに通し、次いで２mlのＲ52結合プロテインＧ−セ
ファロース４Fast Flow (両方とも１cm径のカラムに充
填した) に通した。通過液は再び両方のカラムにかけ
た。ゲルを50mM Tris-HCl (pH8.2), 1 mM ＥＤＴＡ, 0.
5M NaCl,0.5% NP40を含む緩衝液で十分に(100ml) 洗
い、次いで10mlの0.１％（NP40）で洗った。次に保持さ
れた蛋白を0.１％ノニデットP40(NP40) を含む50mMジエ
チルアミン（pH11）４mlで溶離し、１M の NaH2PO4を添
加して中和し、凍結乾燥によって濃縮した。純度は溶出
液のＳＤＳ−ＰＡＧＥと2.５％のクーマシー染色によっ
て評価した。実施例３ ネズミのＩＬ５Ｒα鎖の免疫アフィニティー精製 ２×1010細胞から得たＢ13細胞溶解液（実施例２に従っ
てβ鎖ダブレットを精製するために使われた「Ｂ52」免
疫アフィニティーカラムの通過画分）を、ｍＩＬ−５Ｒ
のα鎖を認識する10mgのモノクローナル抗体をつけた２
mlのヒドラジド・アビドゲルＡＸ（Bioprobe Int. 社
製）と４℃で一晩混合した。その後、ゲルをカラムに注
ぎ込み、十分な洗浄 (50mMのトリス塩酸、pH8.2, 1 mM
ＥＤＴＡ,0.5M NaCl, 0.5% NP40；次いで0.１% NP40水
溶液）後、 50mM ジエチルアミン、pH11, 0.01% NP40を
使って溶出を行った。選別された画分は直ちに凍結乾燥
し、そしてβ−メルカプトエタノールの存在下に２× L
aemmliバッファーに再懸濁した。試料を1.5mm 10％ＰＡ
ＧＥ−ＳＤＳゲルに通した。そのゲルを10％ HAc, 30％
メタノール中で固定し、クーマシー・ブリリアント・ブ
ルーで染色した。60kDa のｍＩＬ５Ｒα鎖を含む切片を
ＳＤＳバッファーで処理し、さらに細片化して新しいＰ
ＡＧＥ−ＳＤＳゲルで電気泳動にかけた。
うにして免疫を行なった。簡単に述べると、０日目に２
×107 のＢ13細胞［Rolinkら既出］を燐酸緩衝溶液（Ｐ
ＢＳ−Ａ）で洗い、完全フロインドアジュバント（ＣＦ
Ａ）と混合し、Wistarラットの後肢かかとに注射した。
５日目と７日目にフロインドアジュバント（ＦＡ）を加
えずにこれを繰り返した。８日目に局所的なリンパ節を
摘出し、細胞懸濁液を調製した。これらの細胞はPEG150
0(ベーリンガー社）を使ってSp2/0-Ag14細胞［ATCC CRL
1581］と５：1.５の割合で融合させた。細胞を500pg/ml
の組換えｈＩＬ−６の存在下でマイクロタイタープレー
トにまいた Haegemannら、Europ. J. Biochem, 159, 6
25-632 (1986)］。翌日、ハイブリッド細胞の選択のた
めに２×濃度のアミノプテリンを含む培地を同量加え
た。８日目にアミノプテリンを含まない培地を細胞に再
供給した。ハイブリドーマはｍＩＬ５［Tavernier, J.
ら、ＤＮＡ 8, 491-501 (1989)］、またはマウスインタ
ーロイキン３（ｍＩＬ３）で促進されるＢ13細胞の増殖
を阻止するその上清の能力で選択された（当分野で知ら
れた 3Ｈデオキシシチジン取込みにより測定する）。Ｗ
ＥＨＩ−３細胞（ATCC No. TIB68）からとったコンディ
ション培地がｍＩＬ３の供給源として使われた。阻害活
性を示す上清はＢ13細胞に対する放射性標識した（当業
界で知られた方法に従った）ｍＩＬ５または「Ｒ52」
［ＩＬ−５−Ｒのβ鎖のみを認識するモノクローナル抗
体（Rolinkら、既出）］を用いた競合結合検定で再試験
した。ｍＩＬ−５−Ｒのα鎖にのみ反応するモノクロー
ナル抗体はｍＩＬ５結合をほぼ完全に阻害する能力及び
対応するｍＩＬ−５−Ｒ鎖の免疫沈降によって同定され
た。選別されたハイブリドーマは限界希釈法によって再
クローン化された。実施例２ ｍＩＬ５Ｒ−β鎖の免疫アフィニティー精製 大型の回転フラスコで、Ｂ13細胞を、５％ウシ胎児血
清、２mMのＬ−グルタミン、50μg/mlのゲンタマイシ
ン、 100単位／mlの組換えマウスＩＬ−５を含むIscove
の改変ダルベッコ培地（Gibco Laboratories、米国ニュ
ーヨーク州グランドアイランド）で２×106 細胞／mlの
密度になるまで培養した。10Ｌの培養液から細胞を遠心
で集め、ＰＢＳで洗い、１％トリトンＸ-100と蛋白分解
酵素阻害剤のカクテル（１mMのＰＭＳＦ, 10mMのベンズ
アミジン塩酸, 100U／mlのアプロチニン）を含む 200ml
のＰＢＳ中で溶解した。10分間氷上においた後、溶解液
を10分間、1000×ｇで遠心分離し、さらに４℃で90分
間、超遠心分離(100,000×ｇ) で透明にした。上清をNa
Clで最終濃度0.５M になるよう希釈し、精製に用いた。
「Ｒ52」を Schneiderらの方法［J. Biol. Chem, 257,
10766 (1982)］に従い、プロテインＧ−セファロース４
Fast Flow (ファルマシア社、ＬＫＢバイオテクノロジ
ーＡＢ、スウェーデン、ウプサラ）に５mg／ml (ゲル)
の濃度で共有結合させた。Ｂ13細胞の溶解液200ml を４
℃で２mlのプロテインＧ−セファロース４ Fast Flowの
カラムに通し、次いで２mlのＲ52結合プロテインＧ−セ
ファロース４Fast Flow (両方とも１cm径のカラムに充
填した) に通した。通過液は再び両方のカラムにかけ
た。ゲルを50mM Tris-HCl (pH8.2), 1 mM ＥＤＴＡ, 0.
5M NaCl,0.5% NP40を含む緩衝液で十分に(100ml) 洗
い、次いで10mlの0.１％（NP40）で洗った。次に保持さ
れた蛋白を0.１％ノニデットP40(NP40) を含む50mMジエ
チルアミン（pH11）４mlで溶離し、１M の NaH2PO4を添
加して中和し、凍結乾燥によって濃縮した。純度は溶出
液のＳＤＳ−ＰＡＧＥと2.５％のクーマシー染色によっ
て評価した。実施例３ ネズミのＩＬ５Ｒα鎖の免疫アフィニティー精製 ２×1010細胞から得たＢ13細胞溶解液（実施例２に従っ
てβ鎖ダブレットを精製するために使われた「Ｂ52」免
疫アフィニティーカラムの通過画分）を、ｍＩＬ−５Ｒ
のα鎖を認識する10mgのモノクローナル抗体をつけた２
mlのヒドラジド・アビドゲルＡＸ（Bioprobe Int. 社
製）と４℃で一晩混合した。その後、ゲルをカラムに注
ぎ込み、十分な洗浄 (50mMのトリス塩酸、pH8.2, 1 mM
ＥＤＴＡ,0.5M NaCl, 0.5% NP40；次いで0.１% NP40水
溶液）後、 50mM ジエチルアミン、pH11, 0.01% NP40を
使って溶出を行った。選別された画分は直ちに凍結乾燥
し、そしてβ−メルカプトエタノールの存在下に２× L
aemmliバッファーに再懸濁した。試料を1.5mm 10％ＰＡ
ＧＥ−ＳＤＳゲルに通した。そのゲルを10％ HAc, 30％
メタノール中で固定し、クーマシー・ブリリアント・ブ
ルーで染色した。60kDa のｍＩＬ５Ｒα鎖を含む切片を
ＳＤＳバッファーで処理し、さらに細片化して新しいＰ
ＡＧＥ−ＳＤＳゲルで電気泳動にかけた。
【００２６】イモビロン (Immobilon)−Ｐ膜（ミリポア
社）に移行し、アミドブラックで染色した後、60kDa の
バンドを切り出し、その場でトリプシン消化した。ペプ
チドをＣ４−逆相カラムで分離し、オンライン120A型Ｐ
ＴＨアミノ酸分析計（アプライド・バイオシステム社、
カリフォルニア州フォスターシティー）を装備した470A
型気相配列決定機を使って配列解析にかけた。アミノ酸
配列（アミノ酸の標準略号）と当分野で知られた方法に
従って合成した相応するオリゴヌクレオチド・プローブ
の配列を以下に示す:ペプチド １ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ 10 11 12 Ｗ Ｇ Ｅ Ｗ Ｓ Ｑ Ｐ Ｉ Ｙ Ｖ Ｇ Ｋ オリゴヌクレオチド−セット １：32量体 Ｔ 5'ＣＣＩＡＣＧＴＡＡＡＴＩＧＧＣＴＧＩＧＡＣＣＡＣＴＣＩＣＣＣＣＡ3' Ａ Ｇ Ｔ Ｔ Ｔ 5'ＣＣＩＡＣＧＴＡＡＡＴＩＧＧＣＴＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＩＣＣＣＣＡ3' Ａ Ｇ Ｔ Ｇ Ｔペプチド ２ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ Ｈ Ｖ Ｄ Ｌ Ｅ Ｙ Ｈ Ｖ オリゴヌクレオチド−セット ２：23量体 5'ＡＣＡＴＧＡＴＡＴＴＣＴＡＡＡＴＣＩＡＣＡＴＧ3' Ｇ Ｇ Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ 5'ＡＣＡＴＧＡＴＡＴＴＣＩＡＧＡＴＣＩＡＣＡＴＧ3' Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ実施例４ 単一方向性λＧＴ11のｃＤＮＡライブラリーの構築 １. ネズミのプレＢ細胞Ｂ13のｃＤＮＡライブラリー ｍＲＮＡはＢ13細胞から「迅速トラック (fast-track)
」ｍＲＮＡ単離システム（Invitrogen Corp.）を使っ
て抽出した。このプロトコールにより、ポリ(A)+ｍＲＮ
Ａをオリゴ（dT）セルロースを使って細胞溶解液から直
接抽出した。収量は108 細胞当り約50μg であった。５
mgのポリ(A)+ｍＲＮＡをオリゴdT-Not１プライマー・ア
ダプターである5'−ＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣ (T)15
−3'（Promega Corp.)とクローン化した Moloneyネズミ
白血病ウイルスのＲＮアーゼＨ- 逆転写酵素（BRL Life
Technologies 社）を使って逆転写した。EcoR１リンカ
ーをつけた二重鎖ｃＤＮＡを上記の方法（Sambrookら；
既出）を使って作製した。 Not１切断によって特異な3'
接着末端を作り出し、ｃＤＮＡを１％アガロース・ゲル
で大きさにより選別した（＞1000bp）。「遺伝子精製
(gene clean) 」プロトコール（ＢＩＯ 101社）によっ
て溶出した後、ｃＤＮＡをλgt11 Sfi-Notベクター(Pro
mega Corp.) のEcoR１−Not１アームに連結した。in vi
troパッケージング後には約40×106個の組換えファージ
が得られた。 ２. ヒトのHL60クローン（酪酸塩で誘導された）ｃＤＮ
Ａライブラリー ｍＲＮＡを精製する前に酪酸塩で誘導されたHL60クロー
ン15細胞［ Fischkoff, Leukemia Res., 12, 679-686
(1988)； Plaetinckら, J. Exp. Med., 172, 683-691
(1990)；HL60：ATCC No.CCL240］は適当な 125Ｉ−ｈＩ
Ｌ５の結合能を調べた（細胞当り約2000の結合部位をも
つ）。4.１と同じプロトコールを採用し、同程度の収量
の組換えファージを得た。実施例５ ネズミとヒトのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 「オリゴヌクレオチド１」と「オリゴヌクレオチド２」
（実施例３参照）の2組のオリゴヌクレオチド・プロー
ブが、この技術分野で公知の方法 (Sambrookら、前掲)
で用いられるプローブのタイプに応じて、異なるハイブ
リダイゼーション条件下で（以後を参照）スクリーニン
グに用いられた。結果を以下に示す: １) ２つのｃＤＮＡクローン（λｇｔ11−ｍＩＬ５Ｒα
２, ３）は、両方の組のオリゴヌクレオチド・プローブ
とのハイブリダイゼーションに基づいて、ネズミのｃＤ
ＮＡライブラリーの一部（1.２×106 個のプラークが調
べられた）から選別された。このために、プラークリフ
トをBiodyne A トランスファーメンブラン（Pall）を用
いて既述の方法（Sambrookら、既出）で調製した。オリ
ゴヌクレオチド１をリン酸化によって放射標識し（Samb
rookら、既出）、「中程度のストリンジェンシー」のハ
イブリダイゼーション条件でハイブリダイズさせた (以
下参照) 。オリゴヌクレオチド２もリン酸化により放射
標識し（Sambrookら、既出）、「低ストリンジェンシ
ー」のハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズさ
せた（以下参照）。
社）に移行し、アミドブラックで染色した後、60kDa の
バンドを切り出し、その場でトリプシン消化した。ペプ
チドをＣ４−逆相カラムで分離し、オンライン120A型Ｐ
ＴＨアミノ酸分析計（アプライド・バイオシステム社、
カリフォルニア州フォスターシティー）を装備した470A
型気相配列決定機を使って配列解析にかけた。アミノ酸
配列（アミノ酸の標準略号）と当分野で知られた方法に
従って合成した相応するオリゴヌクレオチド・プローブ
の配列を以下に示す:ペプチド １ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ 10 11 12 Ｗ Ｇ Ｅ Ｗ Ｓ Ｑ Ｐ Ｉ Ｙ Ｖ Ｇ Ｋ オリゴヌクレオチド−セット １：32量体 Ｔ 5'ＣＣＩＡＣＧＴＡＡＡＴＩＧＧＣＴＧＩＧＡＣＣＡＣＴＣＩＣＣＣＣＡ3' Ａ Ｇ Ｔ Ｔ Ｔ 5'ＣＣＩＡＣＧＴＡＡＡＴＩＧＧＣＴＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＩＣＣＣＣＡ3' Ａ Ｇ Ｔ Ｇ Ｔペプチド ２ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ Ｈ Ｖ Ｄ Ｌ Ｅ Ｙ Ｈ Ｖ オリゴヌクレオチド−セット ２：23量体 5'ＡＣＡＴＧＡＴＡＴＴＣＴＡＡＡＴＣＩＡＣＡＴＧ3' Ｇ Ｇ Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ 5'ＡＣＡＴＧＡＴＡＴＴＣＩＡＧＡＴＣＩＡＣＡＴＧ3' Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ実施例４ 単一方向性λＧＴ11のｃＤＮＡライブラリーの構築 １. ネズミのプレＢ細胞Ｂ13のｃＤＮＡライブラリー ｍＲＮＡはＢ13細胞から「迅速トラック (fast-track)
」ｍＲＮＡ単離システム（Invitrogen Corp.）を使っ
て抽出した。このプロトコールにより、ポリ(A)+ｍＲＮ
Ａをオリゴ（dT）セルロースを使って細胞溶解液から直
接抽出した。収量は108 細胞当り約50μg であった。５
mgのポリ(A)+ｍＲＮＡをオリゴdT-Not１プライマー・ア
ダプターである5'−ＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣ (T)15
−3'（Promega Corp.)とクローン化した Moloneyネズミ
白血病ウイルスのＲＮアーゼＨ- 逆転写酵素（BRL Life
Technologies 社）を使って逆転写した。EcoR１リンカ
ーをつけた二重鎖ｃＤＮＡを上記の方法（Sambrookら；
既出）を使って作製した。 Not１切断によって特異な3'
接着末端を作り出し、ｃＤＮＡを１％アガロース・ゲル
で大きさにより選別した（＞1000bp）。「遺伝子精製
(gene clean) 」プロトコール（ＢＩＯ 101社）によっ
て溶出した後、ｃＤＮＡをλgt11 Sfi-Notベクター(Pro
mega Corp.) のEcoR１−Not１アームに連結した。in vi
troパッケージング後には約40×106個の組換えファージ
が得られた。 ２. ヒトのHL60クローン（酪酸塩で誘導された）ｃＤＮ
Ａライブラリー ｍＲＮＡを精製する前に酪酸塩で誘導されたHL60クロー
ン15細胞［ Fischkoff, Leukemia Res., 12, 679-686
(1988)； Plaetinckら, J. Exp. Med., 172, 683-691
(1990)；HL60：ATCC No.CCL240］は適当な 125Ｉ−ｈＩ
Ｌ５の結合能を調べた（細胞当り約2000の結合部位をも
つ）。4.１と同じプロトコールを採用し、同程度の収量
の組換えファージを得た。実施例５ ネズミとヒトのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 「オリゴヌクレオチド１」と「オリゴヌクレオチド２」
（実施例３参照）の2組のオリゴヌクレオチド・プロー
ブが、この技術分野で公知の方法 (Sambrookら、前掲)
で用いられるプローブのタイプに応じて、異なるハイブ
リダイゼーション条件下で（以後を参照）スクリーニン
グに用いられた。結果を以下に示す: １) ２つのｃＤＮＡクローン（λｇｔ11−ｍＩＬ５Ｒα
２, ３）は、両方の組のオリゴヌクレオチド・プローブ
とのハイブリダイゼーションに基づいて、ネズミのｃＤ
ＮＡライブラリーの一部（1.２×106 個のプラークが調
べられた）から選別された。このために、プラークリフ
トをBiodyne A トランスファーメンブラン（Pall）を用
いて既述の方法（Sambrookら、既出）で調製した。オリ
ゴヌクレオチド１をリン酸化によって放射標識し（Samb
rookら、既出）、「中程度のストリンジェンシー」のハ
イブリダイゼーション条件でハイブリダイズさせた (以
下参照) 。オリゴヌクレオチド２もリン酸化により放射
標識し（Sambrookら、既出）、「低ストリンジェンシ
ー」のハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズさ
せた（以下参照）。
【００２７】２) １つのｃＤＮＡクローン（λｇｔ11−
ｈＩＬ５Ｒα８）は、「オリゴヌクレオチド１」とネズ
ミのλｇｔ11−ｍＩＬ５Ｒα２から当分野で知られた方
法により誘導されたｃＤＮＡ挿入物の両方とハイブリダ
イズさせることにより、ヒトｃＤＮＡライブラリーの一
部（2.４×106 個のプラークが調べられた）から選択さ
れた。
ｈＩＬ５Ｒα８）は、「オリゴヌクレオチド１」とネズ
ミのλｇｔ11−ｍＩＬ５Ｒα２から当分野で知られた方
法により誘導されたｃＤＮＡ挿入物の両方とハイブリダ
イズさせることにより、ヒトｃＤＮＡライブラリーの一
部（2.４×106 個のプラークが調べられた）から選択さ
れた。
【００２８】オリゴヌクレオチド１をリン酸化により放
射標識し（Sambrookら、既出）、「低ストリンジェンシ
ー」のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ
させた。λｇｔ11−ｍＩＬ５Ｒα２からのｃＤＮＡ挿入
物はランダムラベリングにより放射標識し（Sambrook
ら、既出）、「中程度のストリンジェンシー」のハイブ
リダイゼーション条件でハイブリダイズさせた。
射標識し（Sambrookら、既出）、「低ストリンジェンシ
ー」のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ
させた。λｇｔ11−ｍＩＬ５Ｒα２からのｃＤＮＡ挿入
物はランダムラベリングにより放射標識し（Sambrook
ら、既出）、「中程度のストリンジェンシー」のハイブ
リダイゼーション条件でハイブリダイズさせた。
【００２９】３) さらに別の５つのｃＤＮＡクローン
（λｇｔ11−ｈＩＬ５Ｒα11→15）は、２) でスクリー
ニングされたヒトｃＤＮＡライブラリーの半分からｍＩ
Ｌ５Ｒα２ｃＤＮＡプローブを使って選別された。ハイ
ブリダイゼーションは「中程度のストリンジェンシー」
の条件で行った。 ４) 別の35のｃＤＮＡクローン（λｇｔ11−ｈＩＬ５Ｒ
α16→51）は、ｈＩＬＲα８−ｃＤＮＡプローブを使っ
て、２) でスクリーニングしたヒトｃＤＮＡライブラリ
ーの残りの半分から選別した。ハイブリダイゼーション
は「高ストリンジェンシー」条件で行った（以下参
照）。ハイブリダイゼーションの条件 Ｌ) 「低ストリンジェンシー」のハイブリダイゼーショ
ン条件： ―プレハイブリダイゼーション：５×ＳＳＣ（この分野
では知られたクエン酸緩衝化塩溶液、例えばSambrook
ら、（既出）を参照）, ５×Denhardt's, 0.１％ＳＤ
Ｓ, 0.05％ピロリン酸ナトリウム, 100μg/mlの超音波
処理したサケ***ＤＮＡ；42℃で一晩。
（λｇｔ11−ｈＩＬ５Ｒα11→15）は、２) でスクリー
ニングされたヒトｃＤＮＡライブラリーの半分からｍＩ
Ｌ５Ｒα２ｃＤＮＡプローブを使って選別された。ハイ
ブリダイゼーションは「中程度のストリンジェンシー」
の条件で行った。 ４) 別の35のｃＤＮＡクローン（λｇｔ11−ｈＩＬ５Ｒ
α16→51）は、ｈＩＬＲα８−ｃＤＮＡプローブを使っ
て、２) でスクリーニングしたヒトｃＤＮＡライブラリ
ーの残りの半分から選別した。ハイブリダイゼーション
は「高ストリンジェンシー」条件で行った（以下参
照）。ハイブリダイゼーションの条件 Ｌ) 「低ストリンジェンシー」のハイブリダイゼーショ
ン条件： ―プレハイブリダイゼーション：５×ＳＳＣ（この分野
では知られたクエン酸緩衝化塩溶液、例えばSambrook
ら、（既出）を参照）, ５×Denhardt's, 0.１％ＳＤ
Ｓ, 0.05％ピロリン酸ナトリウム, 100μg/mlの超音波
処理したサケ***ＤＮＡ；42℃で一晩。
【００３０】―ハイブリダイゼーション：プレハイブリ
ダイゼーション緩衝液を放射標識したプローブを含む同
緩衝液と置き換える。 ―洗浄：２×ＳＳＣ, 0.１％ＳＤＳを用いて37℃で４回
くり返して洗浄（各回約30分） Ｉ) 「中程度のストリンジェンシー」のハイブリダイゼ
ーション条件： ―プレハイブリダイゼーション：20％フォルムアミド,
５×ＳＳＣ, ５×Denhardt's, 5mM ＥＤＴＡ, 25mMリン
酸ナトリウム (pH6.5), 0.05％ピロリン酸ナトリウム,
100μg/mlの超音波処理したサケ***ＤＮＡ：42℃で一
晩。
ダイゼーション緩衝液を放射標識したプローブを含む同
緩衝液と置き換える。 ―洗浄：２×ＳＳＣ, 0.１％ＳＤＳを用いて37℃で４回
くり返して洗浄（各回約30分） Ｉ) 「中程度のストリンジェンシー」のハイブリダイゼ
ーション条件： ―プレハイブリダイゼーション：20％フォルムアミド,
５×ＳＳＣ, ５×Denhardt's, 5mM ＥＤＴＡ, 25mMリン
酸ナトリウム (pH6.5), 0.05％ピロリン酸ナトリウム,
100μg/mlの超音波処理したサケ***ＤＮＡ：42℃で一
晩。
【００３１】―ハイブリダイセーション：プレハイブリ
ダイゼーション緩衝液を放射標識したプローブを含んだ
同緩衝液と置き換える。 ―洗浄：２×ＳＳＣ, 0.１％ＳＤＳを用いて37℃で４回
くり返し洗浄する（各回約30分間）。 Ｈ) 「高ストリンジェンシー」のハイブリダイゼーショ
ン条件： ―プレハイブリダイゼーション：６×ＳＳＣ, ５×Denh
ardt's, 0.５％ＳＤＳ, 100μg/mlの超音波処理したサ
ケ***ＤＮＡ, 68℃で一晩。
ダイゼーション緩衝液を放射標識したプローブを含んだ
同緩衝液と置き換える。 ―洗浄：２×ＳＳＣ, 0.１％ＳＤＳを用いて37℃で４回
くり返し洗浄する（各回約30分間）。 Ｈ) 「高ストリンジェンシー」のハイブリダイゼーショ
ン条件： ―プレハイブリダイゼーション：６×ＳＳＣ, ５×Denh
ardt's, 0.５％ＳＤＳ, 100μg/mlの超音波処理したサ
ケ***ＤＮＡ, 68℃で一晩。
【００３２】―ハイブリダイゼーション：６×ＳＳＣ,
５×Denhardt's, 0.５％ＳＤＳ, ５mM ＥＤＴＡ, 100μ
g/mlの超音波処理したサケ***ＤＮＡ、放射標識したプ
ローブを含む。 ―洗浄：次のような洗浄（各回約30分間）を行った: ―２×ＳＳＣ, 0.１％ＳＤＳ、室温で２回。
５×Denhardt's, 0.５％ＳＤＳ, ５mM ＥＤＴＡ, 100μ
g/mlの超音波処理したサケ***ＤＮＡ、放射標識したプ
ローブを含む。 ―洗浄：次のような洗浄（各回約30分間）を行った: ―２×ＳＳＣ, 0.１％ＳＤＳ、室温で２回。
【００３３】―0.１×ＳＳＣ, 0.１％ＳＤＳ、68℃で２
回。実施例６ 配列決定 全てのｃＤＮＡをｐＧＥＭ７ｚｆタイプのベクター（Pr
omega 社製）にサブクローニングし、ExoIII欠失変異株
を作製した。370A型自動ＤＮＡ配列決定機で Taqポリメ
ラーゼと単鎖ＤＮＡを使用し、かつSanger法に基づくプ
ロトコールを用いて配列決定を行った。実施例７ プラスミド「ｐｓｈＩＬ５Ｒα」の構築 プラスミドの構築は次の章に記載するようにして行われ
た。調製のための特定の参考文献も詳細もない場合に
は、Sambrookら（1989年）、「Molecular Colning, A L
aboratory Manual」（第２版）Cold Spring Harbor, ニ
ューヨーク州、Cold Spring Harbor Laboratory 出版に
よる標準的な方法論を採用した。
回。実施例６ 配列決定 全てのｃＤＮＡをｐＧＥＭ７ｚｆタイプのベクター（Pr
omega 社製）にサブクローニングし、ExoIII欠失変異株
を作製した。370A型自動ＤＮＡ配列決定機で Taqポリメ
ラーゼと単鎖ＤＮＡを使用し、かつSanger法に基づくプ
ロトコールを用いて配列決定を行った。実施例７ プラスミド「ｐｓｈＩＬ５Ｒα」の構築 プラスミドの構築は次の章に記載するようにして行われ
た。調製のための特定の参考文献も詳細もない場合に
は、Sambrookら（1989年）、「Molecular Colning, A L
aboratory Manual」（第２版）Cold Spring Harbor, ニ
ューヨーク州、Cold Spring Harbor Laboratory 出版に
よる標準的な方法論を採用した。
【００３４】ファージλｇｔ11−ｈＩＬ５Ｒα12（実施
例５を参照）からの挿入部をEcoR１と Not１制限酵素を
用いて切り出した。両方の接着末端をE. coli のＤＮＡ
ポリメラーゼ 1 Klenow 断片を用い、４種全てのデオキ
シヌクレオチド三リン酸の存在下で修復し、非パリンド
ロームの BstX1リンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼを使って
付加した。このリンカーの配列は次のとおりである： ５’ＣＴＴＴＡＧＡＧＣＡＣＡ３’ ３’ＧＡＡＡＴＣＴＣ５’ 次の段階では、修飾した挿入部をプラスミドｐＣＤＭ８
［Seed & Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,
3365 (1987); Aruffo & Seed, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 84, 8573 (1987)；Seed, Nature, 329, 840 (198
7)］に連結し、ＣＭＶ−プロモータに対して適当な方向
をもった構築物を次の分析のために選択した。実施例８ E. coli MC1061(p3)の形質転換 実施例７のプラスミドｐｓｈＩＬ５ＲαによるE. coli
MC 1061(p3) の形質転換はエレクトロポレーション法で
達成された。Bio-Rad 社（米国カリフォルニア州リッチ
モンド）のジーンパルサー (Gene Pulser)を25μF, 2.5
kV, 200オームの設定で製造者の説明書に従って用い
た。実施例９ プラスミドＤＮＡの単離 実施例８に記載した形質転換E. coli MC 1061 からのプ
ラスミドＤＮＡは、細胞のアルカリ溶解と、その後の塩
化セシウム超遠心分離工程に基づく標準法［Birnboim &
Doly, Nucl. Acids Res., 7, 1513 (1979); Sambrook
ら、1989, 既出］を用いて調製した。この方法でプラス
ミドｐｓｈＩＬ５Ｒαをプラスミドp3から分離した。ｓ
ｈＩＬ５Ｒαをコードしている挿入部をｐｓｈＩＬ５Ｒ
αから切り出し、実施例６のようにして配列を決定し
た。ｓｈＩＬ５Ｒαの完全核酸配列と推定されるアミノ
酸配列を図１に示す。実施例10 ＣＯＳ−１細胞でのｓｈＩＬ５Ｒαの発現 Sambrookら（1989年既出）に記載されたＤＥＡＥ−デキ
ストランプロトコールを用いてＣＯＳ−１細胞をトラン
スフェクトした。簡単にいえば、サブコンフルエント状
態のＣＯＳ−１細胞をトリプシン処理で回収し、トラン
スフェクションの24時間前に2.３×104細胞／cm2 の密
度で再プレートした。単層を最少必須培地（ＭＥＭ）−
へペス（pH7.２）で２回洗浄し、トランスフェクション
混液［10μg の実施例９に記載したようにして単離され
たｐｓｈＩＬ５Ｒα／ 0.5mgのＤＥＡＥ−デキストラン
（分子量２×106 , Pharmacia 社製、スウェーデン、ウ
プサラ）／1 mlのＭＥＭ−ヘペス, pH7.２］と共に30分
間インキュベートした。次いで、細胞に10％ウシ胎児血
清（ＦＣＳ）と 100μM のクロロキンジホスフェートを
含む予め加温したダルベコ改変イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）の８倍容量を補給して、37℃で４時間インキュベー
トした。それから培地を吸引して除き、細胞の単層をＤ
ＭＥＭで１回洗い、ＤＭＥＭ＋10％ＦＣＳ中で３日間イ
ンキュベートした。実施例11 ｓｈＩＬ５Ｒαの特性決定 実施例10に記載したようにして調製されたプラスミドｐ
ｓｈＩＬ５ＲαでトランスフェクトされたＣＯＳ−１細
胞の上清は、以下のような競合結合検定を用いて、分泌
されたｓｈＩＬ５Ｒαの存在について調べた。すなわ
ち、実施例５に記載したようなクローンから得られ、そ
して実施例７に記載したようにして構築された、ｍＩＬ
５Ｒα（アミノ酸配列は図１を参照）をコードしている
ｃＤＮＡを含むプラスミドで実施例10に記載したように
してトランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞を、0.5mM
ＥＤＴＡと0.02％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝溶
液 (ＰＢＳ）で処理することによって剥離させ、0.３ml
の結合培地（ＤＭＥＭ＋10％ＦＣＳ＋0.02％アジ化ナト
リウム）当り1.5×105細胞に再懸濁し、そして0.８nMの
125Ｉ−ｍＩＬ５と共に 100倍過剰の非標識ｍＩＬ５の
非存在（図２；“−”，全結合）または存在（図２；
"+cold", 非特異的結合）下で４℃、１時間インキュベ
ートした。ｐｓｈＩＬ５Ｒαでトランスフェクトされた
ＣＯＳ−１細胞の上清（結合培地の80％）は 125Ｉ−ｍ
ＩＬ５の結合を阻害する能力について調べた（図２；
“ｓｈＩＬ５Ｒα" ）。トランスフェクトされていない
ＣＯＳ−１細胞の80％上清の存在下での結合も実施した
（図２；" 対照")。細胞膜に結合した 125Ｉ−ｍＩＬ５
を遊離の放射活性から分離するために、ＣＯＳ−１細胞
をフタレート油のクッションを通して沈降させ、個々の
沈降物について［Plaetinck ら、J. Exp. Med., 172, 6
83-691 (1990)］に記載されているようにしてガンマカ
ウンターで計測した。実施例12 キメラヒトＩＬ５Ｒα−ＩｇＧ１分子の構築 第一段階としてポリメラーゼ・チェイン・リアクション
（ＰＣＲ）を鋳型としてプラスミドｐｓｈＩＬ５Ｒαを
用い、以下のようなプライマーを使って実施した:ｈＩ
Ｌ５Ｒα遺伝子の５'非翻訳領域（104→123の位置）に
ある ５'−ＣＡＴＡＧＡＣＡＣＧＡＣＡＧＡＣＡＣＧＧ お
よび ｈＩＬ５Ｒα可溶型をコードしている領域の最後の17残
基に合致し、Gly-Gly-Ser-Ala 「リンカー」領域をコー
ドしている15残基と Pst１認識部位を付加したプライマ
ーである ５'−ＴＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＣＡＴ 。ＰＣＲはVentポリメラーゼを使い、製造者（New Engl
and BioLabs 社、米国マサチューセッツ州ビバリー）に
より記載された条件で行なった。
例５を参照）からの挿入部をEcoR１と Not１制限酵素を
用いて切り出した。両方の接着末端をE. coli のＤＮＡ
ポリメラーゼ 1 Klenow 断片を用い、４種全てのデオキ
シヌクレオチド三リン酸の存在下で修復し、非パリンド
ロームの BstX1リンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼを使って
付加した。このリンカーの配列は次のとおりである： ５’ＣＴＴＴＡＧＡＧＣＡＣＡ３’ ３’ＧＡＡＡＴＣＴＣ５’ 次の段階では、修飾した挿入部をプラスミドｐＣＤＭ８
［Seed & Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,
3365 (1987); Aruffo & Seed, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 84, 8573 (1987)；Seed, Nature, 329, 840 (198
7)］に連結し、ＣＭＶ−プロモータに対して適当な方向
をもった構築物を次の分析のために選択した。実施例８ E. coli MC1061(p3)の形質転換 実施例７のプラスミドｐｓｈＩＬ５ＲαによるE. coli
MC 1061(p3) の形質転換はエレクトロポレーション法で
達成された。Bio-Rad 社（米国カリフォルニア州リッチ
モンド）のジーンパルサー (Gene Pulser)を25μF, 2.5
kV, 200オームの設定で製造者の説明書に従って用い
た。実施例９ プラスミドＤＮＡの単離 実施例８に記載した形質転換E. coli MC 1061 からのプ
ラスミドＤＮＡは、細胞のアルカリ溶解と、その後の塩
化セシウム超遠心分離工程に基づく標準法［Birnboim &
Doly, Nucl. Acids Res., 7, 1513 (1979); Sambrook
ら、1989, 既出］を用いて調製した。この方法でプラス
ミドｐｓｈＩＬ５Ｒαをプラスミドp3から分離した。ｓ
ｈＩＬ５Ｒαをコードしている挿入部をｐｓｈＩＬ５Ｒ
αから切り出し、実施例６のようにして配列を決定し
た。ｓｈＩＬ５Ｒαの完全核酸配列と推定されるアミノ
酸配列を図１に示す。実施例10 ＣＯＳ−１細胞でのｓｈＩＬ５Ｒαの発現 Sambrookら（1989年既出）に記載されたＤＥＡＥ−デキ
ストランプロトコールを用いてＣＯＳ−１細胞をトラン
スフェクトした。簡単にいえば、サブコンフルエント状
態のＣＯＳ−１細胞をトリプシン処理で回収し、トラン
スフェクションの24時間前に2.３×104細胞／cm2 の密
度で再プレートした。単層を最少必須培地（ＭＥＭ）−
へペス（pH7.２）で２回洗浄し、トランスフェクション
混液［10μg の実施例９に記載したようにして単離され
たｐｓｈＩＬ５Ｒα／ 0.5mgのＤＥＡＥ−デキストラン
（分子量２×106 , Pharmacia 社製、スウェーデン、ウ
プサラ）／1 mlのＭＥＭ−ヘペス, pH7.２］と共に30分
間インキュベートした。次いで、細胞に10％ウシ胎児血
清（ＦＣＳ）と 100μM のクロロキンジホスフェートを
含む予め加温したダルベコ改変イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）の８倍容量を補給して、37℃で４時間インキュベー
トした。それから培地を吸引して除き、細胞の単層をＤ
ＭＥＭで１回洗い、ＤＭＥＭ＋10％ＦＣＳ中で３日間イ
ンキュベートした。実施例11 ｓｈＩＬ５Ｒαの特性決定 実施例10に記載したようにして調製されたプラスミドｐ
ｓｈＩＬ５ＲαでトランスフェクトされたＣＯＳ−１細
胞の上清は、以下のような競合結合検定を用いて、分泌
されたｓｈＩＬ５Ｒαの存在について調べた。すなわ
ち、実施例５に記載したようなクローンから得られ、そ
して実施例７に記載したようにして構築された、ｍＩＬ
５Ｒα（アミノ酸配列は図１を参照）をコードしている
ｃＤＮＡを含むプラスミドで実施例10に記載したように
してトランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞を、0.5mM
ＥＤＴＡと0.02％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝溶
液 (ＰＢＳ）で処理することによって剥離させ、0.３ml
の結合培地（ＤＭＥＭ＋10％ＦＣＳ＋0.02％アジ化ナト
リウム）当り1.5×105細胞に再懸濁し、そして0.８nMの
125Ｉ−ｍＩＬ５と共に 100倍過剰の非標識ｍＩＬ５の
非存在（図２；“−”，全結合）または存在（図２；
"+cold", 非特異的結合）下で４℃、１時間インキュベ
ートした。ｐｓｈＩＬ５Ｒαでトランスフェクトされた
ＣＯＳ−１細胞の上清（結合培地の80％）は 125Ｉ−ｍ
ＩＬ５の結合を阻害する能力について調べた（図２；
“ｓｈＩＬ５Ｒα" ）。トランスフェクトされていない
ＣＯＳ−１細胞の80％上清の存在下での結合も実施した
（図２；" 対照")。細胞膜に結合した 125Ｉ−ｍＩＬ５
を遊離の放射活性から分離するために、ＣＯＳ−１細胞
をフタレート油のクッションを通して沈降させ、個々の
沈降物について［Plaetinck ら、J. Exp. Med., 172, 6
83-691 (1990)］に記載されているようにしてガンマカ
ウンターで計測した。実施例12 キメラヒトＩＬ５Ｒα−ＩｇＧ１分子の構築 第一段階としてポリメラーゼ・チェイン・リアクション
（ＰＣＲ）を鋳型としてプラスミドｐｓｈＩＬ５Ｒαを
用い、以下のようなプライマーを使って実施した:ｈＩ
Ｌ５Ｒα遺伝子の５'非翻訳領域（104→123の位置）に
ある ５'−ＣＡＴＡＧＡＣＡＣＧＡＣＡＧＡＣＡＣＧＧ お
よび ｈＩＬ５Ｒα可溶型をコードしている領域の最後の17残
基に合致し、Gly-Gly-Ser-Ala 「リンカー」領域をコー
ドしている15残基と Pst１認識部位を付加したプライマ
ーである ５'−ＴＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＣＡＴ 。ＰＣＲはVentポリメラーゼを使い、製造者（New Engl
and BioLabs 社、米国マサチューセッツ州ビバリー）に
より記載された条件で行なった。
【００３５】フェノール抽出とエタノール沈澱の後、Ｐ
ＣＲ産物を適当な緩衝液に再懸濁し、Ｔ４キナーゼでリ
ン酸化し、そして既述の方法でKlenowポリメラーゼによ
って平滑末端とした。平滑末端化したＰＣＲ断片に、次
の配列を有する２つの合成した非パリンドローム性オリ
ゴヌクレオチド： 5'−ＣＴＴＴＡＧＡＧＣＡＣＡおよび 3'−ＧＡＡＡＴＣＴＣ を連結することにより、BstX１認識部位を付加した。
ＣＲ産物を適当な緩衝液に再懸濁し、Ｔ４キナーゼでリ
ン酸化し、そして既述の方法でKlenowポリメラーゼによ
って平滑末端とした。平滑末端化したＰＣＲ断片に、次
の配列を有する２つの合成した非パリンドローム性オリ
ゴヌクレオチド： 5'−ＣＴＴＴＡＧＡＧＣＡＣＡおよび 3'−ＧＡＡＡＴＣＴＣ を連結することにより、BstX１認識部位を付加した。
【００３６】得られた断片はその後BstX１で開環したｐ
ＣＤＭ８ベクターに連結した。ｐＣＤＭ８中にＣＭＶプ
ロモータに対してセンス方向にその断片を含む得られた
プラスミドをNot１切断によって開環し、次いで部分的
なPst１制限消化を行った。Pst１−Eag１制限断片をｐ
ＢＲＨＩＧ１プラスミドベクター（Ellison ら、既出）
から精製し、上記のプラスミドベクターに連結した。
ＣＤＭ８ベクターに連結した。ｐＣＤＭ８中にＣＭＶプ
ロモータに対してセンス方向にその断片を含む得られた
プラスミドをNot１切断によって開環し、次いで部分的
なPst１制限消化を行った。Pst１−Eag１制限断片をｐ
ＢＲＨＩＧ１プラスミドベクター（Ellison ら、既出）
から精製し、上記のプラスミドベクターに連結した。
【００３７】Eag１と Not１制限酵素は同じ接着末端を
生成するが、両者の融合は Not１認識部位の欠失をもた
らし、 Eag１認識部位は欠失しないことに留意された
い。それゆえに、目的とする組換え構築物を選ぶため
に、Not 1 対抗選択を行なった。実施例13 キメラヒトＩＬ５Ｒα−ＩｇＧ３分子の構築 実施例12と同じプロトコールが以下の例外をもって採用
された:ＰＣＲ5'リンカーは Met 5'−ＡＡＧＣＴＴ ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＣＧＣＡＴ Hind 3 BamH１ であり、ｈＩＬ５Ｒαの最初の６アミノ酸に相応するヌ
クレオチドの5'側に示したような２つの追加の制限部位
を創出する。
生成するが、両者の融合は Not１認識部位の欠失をもた
らし、 Eag１認識部位は欠失しないことに留意された
い。それゆえに、目的とする組換え構築物を選ぶため
に、Not 1 対抗選択を行なった。実施例13 キメラヒトＩＬ５Ｒα−ＩｇＧ３分子の構築 実施例12と同じプロトコールが以下の例外をもって採用
された:ＰＣＲ5'リンカーは Met 5'−ＡＡＧＣＴＴ ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＣＧＣＡＴ Hind 3 BamH１ であり、ｈＩＬ５Ｒαの最初の６アミノ酸に相応するヌ
クレオチドの5'側に示したような２つの追加の制限部位
を創出する。
【００３８】ＰＣＲ 3'リンカーとしては次のようなヌ
クレオチドが使われた: 5'−ＧＡＧＣＴＣＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＣ ＡＴ さらに、部分 Sac１消化物を Pst１消化物の代わりに使
用し、ｐＡＴＨＩＧ３(2)(Huckら、既出）をイムノグロ
ブリン遺伝子部分の供給源として使用した。
クレオチドが使われた: 5'−ＧＡＧＣＴＣＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＣ ＡＴ さらに、部分 Sac１消化物を Pst１消化物の代わりに使
用し、ｐＡＴＨＩＧ３(2)(Huckら、既出）をイムノグロ
ブリン遺伝子部分の供給源として使用した。
【図１】ｓｈＩＬ５Ｒαの核酸配列と推定アミノ酸配
列、並びにヒトの配列と異なるアミノ酸のみを下に示し
たｍＩＬ５Ｒαの対応するアミノ酸配列を示す図。
列、並びにヒトの配列と異なるアミノ酸のみを下に示し
たｍＩＬ５Ｒαの対応するアミノ酸配列を示す図。
【図２】ｓｈＩＬ５Ｒαを使った競合結合検定の結果を
示す図。
示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/13 15/62 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (72)発明者 ウォルター フィアース ベルギー国 Ｂ−9070 デステルベルゲン ボイケンドリーフ ３ (72)発明者 ジャン タヴェルニア ベルギー国 Ｂ−9860 バルゲム ボテル ウェック ２
Claims (11)
- 【請求項１】 ２つの部分ＤＮＡ配列、すなわちヒトの
インターロイキン５受容体のα鎖及び／またはβ鎖の断
片をコードしている１つの部分配列（該断片または断片
の組み合わせはヒトのインターロイキン５と結合する）
と、ヒトのＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＥのよう
なイムノグロブリンのＨ鎖またはＬ鎖の定常領域または
その一部をコードしている他の部分配列と、から成るＤ
ＮＡ配列。 - 【請求項２】 １つの部分ＤＮＡ配列がヒトインターロ
イキン５になお結合しうるヒトインターロイキン５受容
体のα鎖の断片をコードしている請求項１記載のＤＮＡ
配列。 - 【請求項３】 請求項１または２記載のＤＮＡ配列を含
むベクター。 - 【請求項４】 真核宿主細胞において発現させることが
できる請求項３記載のベクター。 - 【請求項５】 請求項３または４記載のベクターで形質
転換された原核または真核宿主細胞。 - 【請求項６】 請求項１または２記載のＤＮＡによって
コードされた組換え蛋白。 - 【請求項７】 病気の治療のための請求項６記載の組換
え蛋白。 - 【請求項８】 請求項５記載の形質転換された宿主を適
当な培地で培養し、請求項６記載の蛋白を単離すること
を含む該蛋白の生産方法。 - 【請求項９】 請求項６記載の１つまたはそれ以上の化
合物を、所望により薬学的に活性のある他の物質および
／または毒性がなく、不活性な、治療上適合しうる担体
物質と共に、含有してなる医薬組成物。 - 【請求項10】 病気、特に慢性的な喘息の治療のための
請求項６記載の化合物の使用。 - 【請求項11】 請求項８記載の方法により生産される請
求項６記載の組換え蛋白。
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|---|---|---|---|
| CH91810738:4 | 1991-09-18 | ||
| EP91810738 | 1991-09-18 |
Publications (1)
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|---|---|
| JPH05268967A true JPH05268967A (ja) | 1993-10-19 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP4249922A Pending JPH05268967A (ja) | 1991-09-18 | 1992-09-18 | キメラインターロイキン５受容体／イムノグロブリンポ リペプチド |
Country Status (7)
| Country | Link |
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| EP (1) | EP0533006A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05268967A (ja) |
| AU (1) | AU657788B2 (ja) |
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| EP0533006A1 (en) * | 1991-09-18 | 1993-03-24 | F.Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft | Chimaeric interleukin 5-receptor/immunoglobulin polypeptides |
| US5965362A (en) | 1992-03-04 | 1999-10-12 | The Regents Of The University Of California | Comparative genomic hybridization (CGH) |
| JPH08508889A (ja) * | 1993-06-07 | 1996-09-24 | アムジエン・インコーポレーテツド | ハイブリッドレセプター分子 |
| US5783184A (en) * | 1994-12-23 | 1998-07-21 | Smithkline Beecham Corporation | Method for treatment and diagnosis of IL-5 mediated disorders |
| US5683983A (en) * | 1995-06-07 | 1997-11-04 | Glaxo Group Limited | Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor |
| US5654276A (en) * | 1995-06-07 | 1997-08-05 | Affymax Technologies N.V. | Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor |
| US5668110A (en) * | 1995-06-07 | 1997-09-16 | Affymax Technologies N.V. | Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor |
| US5677280A (en) * | 1995-06-07 | 1997-10-14 | Glaxo Group Limited | Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor |
| CN1200037A (zh) | 1995-10-17 | 1998-11-25 | 韦恩州立大学 | 鸡白细胞介素－15及其用途 |
| US7049424B2 (en) | 1996-07-15 | 2006-05-23 | The Regents Of The University Of California | Genes from the 20Q13 amplicon and their uses |
| US7455964B1 (en) | 1996-07-15 | 2008-11-25 | The Hospital For Sick Children | Genes from the 20q13 amplicon and their uses |
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| US7083949B2 (en) | 1998-09-25 | 2006-08-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Receptor based antagonists and methods of making and using |
| US6472179B2 (en) * | 1998-09-25 | 2002-10-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Receptor based antagonists and methods of making and using |
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| KR100754667B1 (ko) | 2005-04-08 | 2007-09-03 | 한미약품 주식회사 | 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물 |
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| KR102073748B1 (ko) | 2013-01-31 | 2020-02-05 | 한미약품 주식회사 | 재조합 효모 형질전환체 및 이를 이용하여 면역글로불린 단편을 생산하는 방법 |
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