JPH05255390A - オリゴペプチド接合体 - Google Patents

オリゴペプチド接合体

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JPH05255390A
JPH05255390A JP4169843A JP16984392A JPH05255390A JP H05255390 A JPH05255390 A JP H05255390A JP 4169843 A JP4169843 A JP 4169843A JP 16984392 A JP16984392 A JP 16984392A JP H05255390 A JPH05255390 A JP H05255390A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 検出可能なシグナルを与える標識を接合した
ｈＢＧＰについての診断分析において有用なオリゴペプ
チド接合体を提供する。 【構成】 アミノ酸１０個から１６個までのアミノ酸配
列で、末端配列は、末端アミノ酸を含み、１個より多く
ないアミノ酸置換は、ＰｈｅおよびＴｈｒまたはＧｌｕ
およびＧｌａ以外の交換を含むことができることを除い
て、３個までのアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換され
うることを含んでなるｈＢＧＰに対する特異抗体に対し
て、ｈＢＧＰと競争することのできるオリゴペプチドを
ｈＢＧＰについての診断分析において有用な検出可能な
シグナルを提供できる標識と接合してなるオリゴペプチ
ドの接合体。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はオリゴペプチド接合体に
関する。骨Ｇｌａタンパク質（ＢＧＰ）またはｒ−カル
ボキシグルタミン酸を含むタンパク質として以下に参照
するビタミンＫ依存性骨タンパク質に関して、増加しつ
つある知見があり、感度の良い、特異性が増加した分析
が要求される。すなわち抗体が用いられる場合、興味あ
るタンパク質に特異的である抗体および興味あるタンパ
ク質およびその部位、および他のタンパク質間の実質的
に異なる結合親和力をもつ、特に限定されたタンパク質
領域が必要である。結合親和力が大であれぱ、あるほ
ど、すべての他の物が同一であるとき、分析の感度は高
くなる。
【０００２】
【従来の技術】プライスらによって、文献の要約が米国
骨およびミネラル研究学会１９７９年６月に報告され
た。プライスおよびニシモト、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ７７巻：２２３４−２２３８ペ
ージ（１９８１）およびプライスら．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．６６巻：８７８−８８３ページ（１９８
０）は、無傷ＢＧＰ分子から誘導された標識および抗体
を利用するラジオイムノアッセイを記載している。デフ
トスらは、（Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．、
３４巻：１２１−１２４ページ（１９８２））骨疾患の
治療中、ＢＧＰにおける変化の臨床的測定について報告
している。前述の参考文献において、引用した文献にも
注目すべきである。共同（相互）係属中の出願通し番号
２４６，９７２は、ＢＧＰに対するイムノアッセイにお
ける試薬として、少なくても２０アミノ酸のＢＧＰの断
片の使用を示唆する。
【課題を解決するための手段】提供された小さいオリゴ
ペプチドは、ＢＧＰに対して高度に特異抗体の調製用ハ
プテンとして用いることができる。特に、オリゴペプチ
ドは、約１０１６アミノ酸からなり、天然に起こるＢＧ
Ｐのような実質的に同じアミノ酸もしくは同じアミノ酸
配列をもつ。それらは、抗体調製のために用いられ、感
度の良いイムノアッセイにおいて、標識化試薬として用
いられる。新規オリゴペプチドは、生理学的液、特に血
液における骨Ｇｌａタンパク質の検出（前にビタミンＫ
依存性タンパク質として記載された、ＢＧＰ）について
の試薬の調製および試薬としての使用に提供される。Ｂ
ＧＰの高血液レベルは、高骨転換によって特徴づけられ
る疾患を示しうる。従って、血液におけるＢＧＰの量お
よび期間中ＢＧＰの濃度変化、特に骨疾患に対する治療
前および後、を検出できるように定量的方法でＢＧＰを
検出することを可能にせしめるのは重要である。この発
明の化合物は、ＢＧＰの域として実質的に同じまたは同
じアミノ酸配列をもつオリゴペプチドである。ＢＧＰの
部分にのみ良く似ているオリゴペプチドを得ることによ
って、抗体が得られ、ＢＧＰおよび交差−反応性に似て
おりその域、に非常に特異的であり、高い結合力価を提
供する。参考目的のために、ヒトＢＧＰ（ｈＢＧＰ）の
構造を示す、なぜならオリゴペプチドは、この分子の断
片に引用されうる。次にｈＢＧＰのアミノ酸配列を示
す。
【０００３】
【化１】
【０００４】大部分、使用に見られるオリゴペプチド
は、アミノ酸１０個から１６個であり、もっと通常で
は、アミノ酸１０個から１５個であり、好ましくは約１
２個から１５個のアミノ酸である。それらの断片をつな
いだオリゴペプチドを用いることが望ましいいのである
が、配列は、通常アミノ酸断片１−１５；１５−３０；
および３５−４９内にある。大部分、オリゴペプチド
は、ｈＢＧＰの同一なアミノ酸配列をもち、しかし特別
な状況では、１つもしくはそれ以上のアミノ酸が置換さ
れる。たとえば、芳香族アミノ酸が変化させられ、すな
わちチロシンがフェニルアラニンによってまたはその逆
で、置換される。グルタミン酸もｒ−カルボキシグルタ
ミン酸で置換されうる。１つのアミノ酸は、オリゴペプ
チドの性質を変えるために異なったアミノ酸によって置
換されうる。たとえば、チロシンは、酸化感受性また
は、特別な連結グループ、特に活性なアゾ作用性（官能
性）をもつグループ、との接合を促進するための逆置換
を減少するためにフェニルアラニンによって置換され
る。特に興味のあるのは、以下の５個のオリゴペプチド
であり、最後のオリゴペプチドは、特に興味がある。
【０００５】
【化２】
【０００６】本発明のオリゴペプチドは、合成、メリフ
ィールド法を用いること、手動でまたは市販で手に入る
器械のようないろいろの方法で、合成される。調製され
るオリゴペプチドの方法は、本発明に重大ではなく、ど
のような好都合な方法を用いてもよい。オリゴペプチド
の目的に依存して、４個までのアミノ酸は、通常３以上
でなくしかし１以上でなく変化させられ、フェニルアラ
ニンより他のチロシンにまたは反対に、またはｒ−カル
ボキシ基についてのグルタミン酸に変化する。二つの同
様の構造の芳香族アミノ酸は、交換され、そしていくつ
かの例では、置換は全体的に異なるアミノ酸が含まれう
る。実例となる変更には、（Ｔｙｒ１５）ｈＢＧＰ
１５−３０、（Ｐｈｅ１，３）ｈＢＧＰ１−１２、およ
び（Ｔｙｒ３７，Ｐｈｅ４２，４６）ｈＢＧＰ
３７−４９、および（Ｔｙｒ１５，Ｇｌｕ２１，２４）
ｈＢＧＰ１５−３０が含まれる。なぜならば、本発明の
オリゴペプチドは、天然に存在するタンパク質よりも非
常に小さく、容易に合成方法によって合成される。この
ようにして、非常に高収量の生成物が得られ、生理学的
液体におけるＢＧＰを測定するための方法の展開でハプ
テンとして用いられる。更に、鎖における１つもしくは
それ以上のアミノ酸は、置換され、望ましいエピトープ
位特異性は、保たれ、一方オリゴペプチドは、安定性、
接合の容易、交差反応性における減少および類似物のよ
うな変化した性質を提供する。本発明のオリゴペプチド
はハプテンとしての使用が見られる。ハプテンは、抗体
の産生のための接合を提供する免疫原と接合しうるか；
またはハプテンは、適当な標識で標識され、ＢＧＰに対
する分析におけるハプテンの分析の検出を可能にせしめ
る。免疫原接合体を調製するにおいて、広範囲にわたる
方法が用いられる。免疫原およびオリゴペプチドの両方
での有用なアミノ酸に関して、グルタルアルデヒドのよ
うな二作用性試薬を用いる。任意にもっと特異な連結基
として、カルボキシベンゼンジアゾスルフォネート、パ
ラーマレイミド安息香酸、または他の慣例上連結基のよ
うなものが用いられる。特別な免疫原と同じく免疫原に
接合するオリゴペプチドの特別な方法は、本発明にとっ
て重要でない。いろいろの慣例的免疫原が用いられ、免
疫原は、注入された特別のホストに依存する。ありふれ
ている免疫原としては、牛血清アルブミン、牛ガンマグ
ロブリン、ウサギ血清アルブミン、キイホールリンペッ
トヘモシアニンなどが含まれる。望ましいポリクロナル
もしくはモノクロナルのいずれかに依存して、異なるホ
ストが注入される。モノクロナル抗体の調製のために、
特に米国特許番号４，１９６，２６５および４，１７
２，１２４：コーラーおよびミルスタイン、Ｎａｔｕｒ
ｅ（１９７５）、３６５巻：４９５−４９７ページおよ
びケネット編集、“モノクロナル抗体−ハイブリドー
マ：生物学的分析における新しい要素、プレナムプレ
ス．Ｎ．Ｙ．１９８０を参照する。抗体に関連して、標
識化ハプテンは、イムノアッセイに用いられる。広範囲
にわたる標識として、放射能核種酵素、螢光体、磁気粒
子、安定な遊離ラジカル、化学ルミネッセンス体などが
用いられる。実例の標識には、１２５Ｉ、３Ｈ、フルオ
レセイン、ダンシル、ロダミン、アクリジン、ホースラ
デッシュパーオキシダーゼ、アミラーゼ、ライソザイ
ム、グルコース−６−ホスフェネートデヒドロゲナー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、などが含まれる。これらの
いろいろの標識を用いる方法は、米国特許番号Ｒｅ２
９，１６９；Ｒｅ２９，９５５；３，６５４，０９０；
３，６９０，８３４；３，８１７，８３７；３，８６
７，５１７；３，９３５，０７４；３，９７５，５１
１；３，９９６，３４５；および４，０２０，１５１に
見られる。これらの参照は、特許文献において報告され
たイムノアッセイの広範囲の多様性の例証のみである。
いろいろの標識への接合の方法は、特別の標識の性質に
依存する。いくつかの例において、オリゴペプチドまた
は標識のどちらかが他のものと反応するために、活性化
するように、標識は、単作用性である。他の例におい
て、オリゴペプチドを活性化するにもっと好都合である
ように、標識は重作用性、たとえば酵素である。これら
の例の多くにおいて先に記述したように、特殊化試薬を
用いることが望ましい。放射性核種を連結するために、
チロシンは放射活性ヨー化物のようなヨー化剤およびラ
クトパーオキシダーゼを用いて標識化される。標識の性
質に依存する既知の方法に基づいて、分析は行なわれ
る。いろいろの方法は、標識化オリゴペプチドとＢＧＰ
が測定される試料における抗−ＢＧＰに結合するための
ＢＧＰ分析物との間の競争が含まれる。ＢＧＰが分析さ
れうる興味あるいろいろ生理学的液体には、血清、血
漿、尿、脳脊髄液、羊水および唾液が含まれる。前述の
生物学的液に加えて、抽出液、特に骨、歯および病理学
的石灰化（変位石灰化または動脈硬化）のようなヒト組
織からの酸抽出物も興味ある。分析を実施する場合、分
析物標識化オリゴペプチドおよびオリゴペプチドへの抗
体（抗−オリゴペプチド）を含む試料を、水性緩衝化媒
質、通常はｐＨの範囲約６〜９で、いっしょにし、測定
される分析媒質と抗体との間に標識化オリゴペプチドの
分配化をさせる。分析プロトコールおよび試薬の性質に
依存して、分離（“異質”）または非分離（“同質”）
段階が含まれる。相違は、標識化試薬への抗体の結合が
試薬から得られたシグナルに影響するかどうかに依存す
る。たとえば、放射性核種は、結合と未結合標識との分
別を必要とし、一方螢光標識は、分別段階を必要とする
かもしくは必要としない。分析を実施するに、化合物の
添加の順序は、異なりうる。すべての物質を同時にいっ
しょにするかまたは試料をまず初めに抗−オリゴペプチ
ドと結合させ、次いで標識化オリゴペプチドを加える。
培養段階は、いろいろの添加間に含まれ、通常は５分間
より少なくなく約７日間以上であることはない。率また
は平衡測定のどちらかが含まれうる。試料および試薬を
結合させた後、標識化オリゴペプチドに結合した抗−オ
リゴペプチドは、未結合標識化オリゴペプチドから分離
し、異質（不均一）分析が含まれ、シグナルは標識の性
質にもとづいて標識から測定される。分別が要求されな
い場合、シグナルは分析媒質から直接に測定される。測
定される放射線に依存して、ガンマカウンター、シンチ
レーションカウンター、分光測定器、螢光測定器または
類似物が用いられる。次に実施例は、本発明を例示して
おり、本発明を制限するものではない。 実験 １．オリゴペプチドの調製 本発明の１３アミノ酸オリゴペプチドは、バラニイおよ
びメリフィールドに記載された固体相方法（“ペプチ
ド、分析、合成、生物学”における固体相ペプチド合
成、ペプチド合成における特別な方法、パートＡ、２
巻、グロスおよびメレンホーファー編集、アカデミック
プレス、ニューヨーク、１９８０，１−２８４ページ）
を用いて合成する。 ２．オリゴペプチドに対する抗体の調製 オリゴペプチドｈＢＧＰ３７−４９（１．５ｍｇ）は、
室温で、１−エチルジメチルーアミノプロピルカルボジ
イミド（２５０μｇ）の２添加を用いて、リン酸緩衝化
塩化ナトリウムにおいてキイホールリンペットヘモシア
ニン（１．８ｍｇ）と接合させる。２４時間後、物質を
水に対して透析する。ウサギは不完全フロインドアジュ
バントにおける精製した免疫原（５０μｇ）の毎月の多
位皮内注射によって免疫化する。抗体は中心耳動脈から
採血した血液試料から得られる。 ３．放射標識化オリゴペプチドの調製 オリゴペプチドｈＢＧＰ３７−４９（０．５μｇ）を、
β−Ｄ−グルコース（２μｍｏｌｅ）およびグルコース
オキシダーゼ（０．６４ｎｇ；１２５Ｕ／ｍｇ）の存在
下にラクトパーオキシダーゼ（２μｇ）によってＮａＩ
（１ｍＣｉ１２５Ｉ）を用いて０．０５Ｍリン酸緩衝液
でヨウ素化する。混合物を室温で１５分間放置後、全量
を１ｍｌに希釈し、トリクロロ酢酸（６重量％）および
燐タングステン酸（０．２５重量％）においてチトクロ
ームＣ（１００μｇ）とともに共沈させる。ペレットを
洗浄し、０．５Ｍ水酸化ナトリウム（１０−２０μｌ）
で中性化によって再溶解し、タングステン酸塩を０．５
Ｍジエチレントリアミンの１容量と配位によって複合化
する。標識化ペプチドの全比活性は、５００Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌｅ以上である。溶液を２５ｍＭエタノールアミン
−塩酸（ｐＨ９．０）で０．５ｍｌに希釈し、ＰＢＥ９
４（ファーマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージ
ィ）をつめたカラム（０．５×２０ｃｍ）でのアフィニ
ティクロマトグラフィーを用いて、チトクロームＣ１０
ｍｇ／ｍｌを含む２５μＭエタノールアミン−塩酸（ｐ
Ｈ９．０）で、すべて等しく溶出することによって精製
する。ピーク３および４において得られる物質は、ラジ
オイムノアッセイに用いる。 ４．子牛ＢＧＰの調製 ＢＧＰは、子牛骨の鉱質強化法によって、放出されたタ
ンパク質からセファデックス（登録商標）Ｇ１００（フ
ァーマシア）でのゲルろ過、ひき続いてのプライスら
（ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９７６）、７３巻：１４４７−
１４５１ページ）によって記載のようにＤＥＡＥ−セフ
ァデックス（登録商標）Ａ−２５（ファーマシア）から
のグレディエント溶出によって精製される。牛ＢＧＰ
は、アミノ酸３７−４９に対するｈＢＧＰのように同じ
アミノ酸配列を有する。 ５．放射ヨウ素化子牛ＢＧＰの調製 精製した子牛ＢＧＰは、ＢＧＰ１０ｍｇと１２５Ｉ１ｍ
Ｃｉとともに培養することによる固体状態ラクトパーオ
キシダーゼ法（ダヴィドおよびレルスフェルド、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３巻：１０１４−１０２１）に
よって１２５Ｉ（４×１０１８ｃｐｍ／ｍｏｌｅ；アマ
ーシャム）で標識化する。標識化ＢＧＰは、未結合
１２５Ｉから分析物希釈剤（０．１４Ｍ塩化ナトリウ
ム；０．０１Ｍリン酸塩；２５ｍＭ ＥＤＴＡ；０．１
％ゲラチン；０．１％ツゥィーン（登録商標）２０（シ
グマケミカルＣｏ．，セイトルイス．ミズィーリ），ｐ
Ｈ７．４で）平衡化したセファデックス（登録商標）Ｇ
−２５（ファーマシア）カラムで、ゲルろ過で分離す
る。数多くの分析が、実施例２において記載のように調
製された抗体とともにｈＢＧＰ３７−４９放射ヨウ素化
試薬を用いて実施される。分析は、０．２５％牛血清ア
ルブミン、２０ｍＭリン酸塩、ｈＢＧＰ３７−４９の標
準を有する１ｍＭ．ＥＤＴＡプラスＢＧＰ−欠乏血漿に
おいて実施される。トレーサーの付加前３日間、および
後１日培養後、結合トレーサーは、ウサギ抗ＢＧＰ抗体
に対する第二抗体を用いることによって遊離トレーサー
から分離する。分析は、９フェムトモルｈＢＧＰ
３７−４９が検出され、４９フェムトモルで５０％結合
阻害を示す。精製子牛ＢＧＰは、モル基準で、ｈＢＧＰ
３７−４９の５０％反応性を与え、ヒト骨抽出物は、Ｂ
ＧＰの高濃度（１００−３００ｎＭｈＢＧＰ３７−４９
／ｇ）を示す。上皮小体機能亢進症血漿は、ｈＢＧＰ
３７−４９基準に平行な結合阻害を示す。４種の分析で
検査した２０名女性および２０名男性の正常血漿試料
は、１７％の内−分析Ｃ．Ｖ．を示し、血漿ｈＢＧＰレ
ベル（ピコモルｈＢＧＰ３７−４９ｍｌ）女性では５．
８±０．９および男性では７．１±１．３を示す。正常
の上限は２０ピコモル／ｍｌ（Ｎ＝１０３）である。ｈ
ＢＧＰは、上皮小体機能亢進症患者２７名中１６名、パ
ゲット病患者３３名中２４名、および血液透析の慢性腎
不全患者１５名中１２名において増加する。１ｍＭ塩化
マグネシウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムにおけるビオ
ゲルＰ−３０で、血漿ｈＢＧＰを骨からｈＢＧＰととも
に共−溶出し、２０％は、大きい血漿タンパクと非−共
有的に結合している。正常ヒト被検者の血液におけるこ
の領域−特異ＲＩＡによって検出されるｈＢＧＰは、骨
におけるペプチドと同じであり、部分的により大きなタ
ンパク質と非共有的に結合していると結論づけられる。
本分析は、生理学的液体におけるＢＧＰの測定用の非常
に感度の良い方法を提供することである。このように骨
と関連のある広範囲の疾病をもつと考えられる患者を、
鋭敏にモニターでき、特に血漿または他の液体における
ＢＧＰの変動を検出できる。なぜなら、用いられたオリ
ゴペプチドは、実質的に、天然に存在するタンパク質よ
り小さく、常法によって容易に合成できる。付加的に、
特異性の重大な損失なくオリゴペプチドの物理的性質を
増大できる。前述の発明は、実施例によって詳細に記載
したが、理解を明確にするためであり、本発明の範囲が
これらの実施例に限定するものではないということはい
うまでもない。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年６月１８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 オリゴペプチド接合体
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はオリゴペプチド接合体に
関する。骨Ｇｌａタンパク質（ＢＧＰ）またはγ−カル
ボキシグルタミン酸を含むタンパク質として以下に参照
するビタミンＫ依存性骨タンパク質に関して、増加しつ
つある知見があり、感度の良い、特異性が増加した分析
が要求される。すなわち抗体が用いられる場合、興味あ
るタンパク質に特異的である抗体および興味あるタンパ
ク質およびその部位、および他のタンパク質間の実質的
に異なる結合親和力をもつ、特に限定されたタンパク質
領域が必要である。結合親和力が大であれば、あるほ
ど、すべての他の物が同一であるとき、分析の感度は高
くなる。
【０００２】
【従来の技術】プライスらによって、文献の要約が米国
骨およびミネラル研究学会１９７９年６月に報告され
た。プライスおよびニシモト、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ７７巻：２２３４−２２３８ペ
ージ（１９８１）およびプライスら．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．６６巻：８７８−８８３ページ（１９８
０）は、無傷ＢＧＰ分子から誘導された標識および抗体
を利用するラジオイムノアッセイを記載している。デフ
トスらは、（Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．、
３４巻：１２１−１２４ページ（１９８２））骨疾患の
治療中、ＢＧＰにおける変化の臨床的測定について報告
している。前述の参考文献において、引用した文献にも
注目すべきである。係属中米国特許出願第２４６，９７
２号は、ＢＧＰに対するイムノアッセイにおける試薬と
して、少なくても２０アミノ酸のＢＧＰの断片の使用を
示唆する。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明に従えば、ｈＢＧ
Ｐに対する特異抗体に対して、ｈＢＧＰと競争すること
のできるオリゴペプチドであって、以下のhBGPのアミノ
酸配列 Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val （ただし、前記オリゴペプチドの末端配列が前記ｈＢＧ
Ｐ配列の末端アミノ酸を含み、かつ、１個より多くない
アミノ酸置換は、ＰｈｅおよびＴｙｒまたはＧｌｕおよ
びＧｌａ以外の交換を含むことができることを除いて、
前記ｈＢＧＰの３個までのアミノ酸が、異なるアミノ酸
で置換されうる）のアミノ酸10個から16個までのアミノ
酸配列を含んでなる オリゴペプチドをｈＢＧＰについて
の診断分析において有用な検出可能なシグナルを提供で
きる標識と接合せしめてなるオリゴペプチドの接合体が
提供される。
【０００４】本発明に使用するオリゴペプチドは、ＢＧ
Ｐに対して高度に特異抗体の調製用ハプテンとして用い
ることができる。特に、オリゴペプチドは、アミノ酸約
10〜16個からなり、天然に起こるＢＧＰのような実質的
に同じアミノ酸もしくは同じアミノ酸配列をもつ。それ
らは、抗体調製のために用いられ、感度の良いイムノア
ッセイにおいて、標識化試薬として用いられる。
【０００５】新規オリゴペプチドは、生理学的液、特に
血液における骨Ｇｌａタンパク質の検出（前にビタミン
Ｋ依存性タンパク質として記載された、ＢＧＰ）につい
ての試薬の調製および試薬としての使用に提供される。
【０００６】ＢＧＰの高血液レベルは、高骨転換によっ
て特徴づけられる疾患を示しうる。従って、血液におけ
るＢＧＰの量および期間中ＢＧＰの濃度変化、特に骨疾
患に対する治療前および後、を検出できるように、定量
的方法でＢＧＰを検出することを可能にせしめるのは重
要である。
【０００７】この発明の化合物は、ＢＧＰの域として実
質的に同じまたは同じアミノ酸配列をもつオリゴペプチ
ドである。ＢＧＰの部分にのみ良く似ているオリゴペプ
チドを得ることによって、抗体が得られ、ＢＧＰおよび
交差−反応性に似ておりその域、に非常に特異的であ
り、高い結合力価を提供する。
【０００８】参考目的のために、ヒトＢＧＰ（ｈＢＧ
Ｐ）の構造を示す、なぜならオリゴペプチドは、この分
子の断片に引用されうる。次にｈＢＧＰのアミノ酸配列
を示す。
【０００９】
【化１】
【００１０】大部分、使用に見られるオリゴペプチド
は、アミノ酸１０個から１６個であり、もっと通常で
は、アミノ酸１０個から１５個であり、好ましくは約１
２個から１５個のアミノ酸である。それらの断片をつな
いだオリゴペプチドを用いることが望ましいのである
が、配列は、通常アミノ酸断片１−１５；１５−３０；
および３５−４９内にある。
【００１１】大部分、オリゴペプチドは、ｈＢＧＰの同
一なアミノ酸配列をもち、しかし特別な状況では、１つ
もしくはそれ以上のアミノ酸が置換される。たとえば、
芳香族アミノ酸が変化させられ、すなわちチロシンがフ
ェニルアラニンによってまたはその逆で、置換される。
グルタミン酸もγ−カルボキシグルタミン酸で置換され
うる。１つのアミノ酸は、オリゴペプチドの性質を変え
るために異なったアミノ酸によって置換されうる。たと
えば、チロシンは、酸化感受性または、特別な連結グル
ープ、特に活性なアゾ作用性（官能性）をもつグルー
プ、との接合を促進するための逆置換を減少するために
フェニルアラニンによって置換される。
【００１２】特に興味のあるのは、以下の５個のオリゴ
ペプチドであり、最後のオリゴペプチドは、特に興味が
ある。
【００１３】
【化２】
【００１４】本発明のオリゴペプチドは、合成、メリフ
ィールド法を用いること、手動でまたは市販で手に入る
器械のようないろいろの方法で、合成される。調製され
るオリゴペプチドの方法は、本発明に重大ではなく、ど
のような好都合な方法を用いてもよい。
【００１５】オリゴペプチドの目的に依存して、４個ま
でのアミノ酸は、通常３以上でなくしかし１以上でなく
変化させられ、フェニルアラニンより他のチロシンにま
たは反対に、またはγ−カルボキシ基についてのグルタ
ミン酸に変化する。二つの同様の構造の芳香族アミノ酸
は、交換され、そしていくつかの例では、置換は全体的
に異なるアミノ酸が含まれうる。実例となる変更には、
（Ｔｙｒ15）ｈＢＧＰ 15-30 、（Ｐｈｅ1,3 ）ｈＢＧＰ
1-12、および（Ｔｙｒ37，Ｐｈｅ42,46 ）ｈＢＧＰ
37-49 、および（Ｔｙｒ15，Ｇｌｕ21,24 ）ｈＢＧＰ
15-30 が含まれる。
【００１６】なぜならば、本発明のオリゴペプチドは、
天然に存在するタンパク質よりも非常に小さく、容易に
合成方法によって合成される。このようにして、非常に
高収量の生成物が得られ、生理学的液体におけるＢＧＰ
を測定するための方法の展開でハプテンとして用いられ
る。更に、鎖における１つもしくはそれ以上のアミノ酸
は、置換され、望ましいエピトープ位特異性は、保た
れ、一方オリゴペプチドは、安定性、接合の容易、交差
反応性における減少および類似物のような変化した性質
を提供する。
【００１７】本発明のオリゴペプチドはハプテンとして
の使用が見られる。ハプテンは、抗体の産生のための接
合を提供する免疫原と接合しうるか；またはハプテン
は、適当な標識で標識され、ＢＧＰに対する分析におけ
るハプテンの分析の検出を可能にせしめる。
【００１８】免疫原接合体を調製するにおいて、広範囲
にわたる方法が用いられる。免疫原およびオリゴペプチ
ドの両方での有用なアミノ酸に関して、グルタルアルデ
ヒドのような二作用性試薬を用いる。任意にもっと特異
な連結基として、カルボキシベンゼンジアゾスルフォネ
ート、パラ−マレイミド安息香酸、または他の慣例上連
結基のようなものが用いられる。
【００１９】特別な免疫原と同じく免疫原に接合するオ
リゴペプチドの特別な方法は、本発明にとって重要でな
い。いろいろの慣例的免疫原が用いられ、免疫原は、注
入された特別のホストに依存する。ありふれている免疫
原としては、牛血清アルブミン、牛ガンマグロブリン、
ウサギ血清アルブミン、キイホールリンペットヘモシア
ニンなどが含まれる。
【００２０】望ましいポリクロナルもしくはモノクロナ
ルのいずれかに依存して、異なるホストが注入される。
モノクロナル抗体の調製のために、特に米国特許第４，
１９６，２６５号および同第４，１７２，１２４号：コ
ーラーおよびミルスタイン、Ｎａｔｕｒｅ（１９７
５）、３６５巻：４９５−４９７ページおよびケネット
編集、モノクロナル抗体−ハイブリドーマ：生物学的分
析における新しい要素、プレナムプレス．Ｎ．Ｙ．１９
８０を参照する。
【００２１】抗体に関連して、標識化ハプテンは、イム
ノアッセイに用いられる。広範囲にわたる標識として、
放射能核種酵素、螢光体、磁気粒子、安定な遊離ラジカ
ル、化学ルミネッセンス体などが用いられる。実例の標
識には、 125Ｉ、 3Ｈ、フルオレセイン、ダンシル、ロ
ダミン、アクリジン、ホースラデッシュパーオキシダー
ゼ、アミラーゼ、ライソザイム、グルコース−６−ホス
フェネートデヒドロゲナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
などが含まれる。これらのいろいろの標識を用いる方法
は、米国特許Ｒｅ２９，１６９；Ｒｅ２９，９５５；
３，６５４，０９０；３，６９０，８３４；３，８１
７，８３７；３，８６７，５１７；３，９３５，０７
４；３，９７５，５１１；３，９９６，３４５；および
４，０２０，１５１号に見られる。これらの参照は、特
許文献において報告されたイムノアッセイの広範囲の多
様性の例証のみである。
【００２２】いろいろの標識への接合の方法は、特別の
標識の性質に依存する。いくつかの例において、オリゴ
ペプチドまたは標識のどちらかが他のものと反応するた
めに、活性化するように、標識は、単作用性である。他
の例において、オリゴペプチドを活性化するにもっと好
都合であるように、標識は重作用性、たとえば酵素であ
る。これらの例の多くにおいて先に記述したように、特
殊化試薬を用いることが望ましい。放射性核種を連結す
るために、チロシンは放射活性ヨー化物のようなヨー化
剤およびラクトパーオキシダーゼを用いて標識化され
る。
【００２３】標識の性質に依存する既知の方法に基づい
て、分析は行なわれる。いろいろの方法は、標識化オリ
ゴペプチドとＢＧＰが測定される試料における抗−ＢＧ
Ｐに結合するためのＢＧＰ分析物との間の競争が含まれ
る。ＢＧＰが分析されうる興味あるいろいろ生理学的液
体には、血清、血漿、尿、脳脊髄液、羊水および唾液が
含まれる。前述の生物学的液に加えて、抽出液、特に
骨、歯および病理学的石灰化（変位石灰化または動脈硬
化）のようなヒト組織からの酸抽出物も興味ある。
【００２４】分析を実施する場合、分析物標識化オリゴ
ペプチドおよびオリゴペプチドへの抗体（抗−オリゴペ
プチド）を含む試料を、水性緩衝化媒質、通常はpHの範
囲約６〜９で、いっしょにし、測定される分析媒質と抗
体との間に標識化オリゴペプチドの分配化をさせる。
【００２５】分析プロトコールおよび試薬の性質に依存
して、分離（“異質”）または非分離（“同質”）段階
が含まれる。相違は、標識化試薬への抗体の結合が試薬
から得られたシグナルに影響するかどうかに依存する。
たとえば、放射性核種は、結合と未結合標識との分別を
必要とし、一方螢光標識は、分別段階を必要とするかも
しくは必要としない。
【００２６】分析を実施するに、化合物の添加の順序
は、異なりうる。すべての物質を同時にいっしょにする
かまたは試料をまず初めに抗−オリゴペプチドと結合さ
せ、次いで標識化オリゴペプチドを加える。培養段階
は、いろいろの添加間に含まれ、通常は５分間より少な
くなく約７日間以上であることはない。率または平衡測
定のどちらかが含まれうる。
【００２７】試料および試薬を結合させた後、標識化オ
リゴペプチドに結合した抗−オリゴペプチドは、未結合
標識化オリゴペプチドから分離し、異質（不均一）分析
が含まれ、シグナルは標識の性質にもとづいて標識から
測定される。分別が要求されない場合、シグナルは分析
媒質から直接に測定される。測定される放射線に依存し
て、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、
分光測定器、螢光測定器または類似物が用いられる。
【００２８】次に実施例は、本発明を例示しており、本
発明を制限するものではない。 実験
【００２９】１．オリゴペプチドの調製 本発明の１３アミノ酸オリゴペプチドは、バラニイおよ
びメリフィールドに記載された固体相方法（“ペプチ
ド、分析、合成、生物学”における固体相ペプチド合
成、ペプチド合成における特別な方法、パートＡ、２
巻、グロスおよびメレンホーファー編集、アカデミック
プレス、ニューヨーク、１９８０，１−２８４ページ）
を用いて合成する。
【００３０】２．オリゴペプチドに対する抗体の調製 オリゴペプチドｈＢＧＰ37-49 （１．５mg）は、室温
で、１−エチルジメチル−アミノプロピルカルボジイミ
ド（２５０μｇ）の２添加を用いて、リン酸緩衝化塩化
ナトリウムにおいてキイホールリンペットヘモシアニン
（１．８mg）と接合させる。２４時間後、物質を水に対
して透析する。ウサギは不完全フロインドアジュバント
における精製した免疫原（５０μｇ）の毎月の多位皮内
注射によって免疫化する。抗体は中心耳動脈から採血し
た血液試料から得られる。
【００３１】３．放射標識化オリゴペプチドの調製 オリゴペプチドｈＢＧＰ37-49 （０．５μｇ）を、β−
Ｄ−グルコース（２μmole）およびグルコースオキシダ
ーゼ（０．６４ng；１２５Ｕ／mg）の存在下にラクトパ
ーオキシダーゼ（２μｇ）によってＮａＩ（１ｍＣｉ
125Ｉ）を用いて０．０５Ｍリン酸緩衝液でヨウ素化す
る。混合物を室温で１５分間放置後、全量を１mlに希釈
し、トリクロロ酢酸（６重量％）および燐タングステン
酸（０．２５重量％）においてチトクロームＣ（１００
μｇ）とともに共沈させる。ペレットを洗浄し、０．５
Ｍ水酸化ナトリウム（１０−２０μｌ）で中性化によっ
て再溶解し、タングステン酸塩を０．５Ｍジエチレント
リアミンの１容量と配位によって複合化する。標識化ペ
プチドの全比活性は、５００Ｃｉ／ｍ mole 以上であ
る。溶液を２５mMエタノールアミン−塩酸（pH９．０）
で０．５mlに希釈し、ＰＢＥ９４（ファーマシア、ピス
カタウェイ、ニュージャージィ）をつめたカラム（０．
５×２０cm）でのアフィニティクロマトグラフィーを用
いて、チトクロームＣ１０mg／mlを含む２５μＭエタノ
ールアミン−塩酸（pH９．０）で、すべて等しく溶出す
ることによって精製する。ピーク３および４において得
られる物質は、ラジオイムノアッセイに用いる。
【００３２】４．子牛ＢＧＰの調製 ＢＧＰは、子牛骨の鉱質強化法によって、放出されたタ
ンパク質からセファデックス（登録商標）Ｇ１００（フ
ァーマシア）でのゲルろ過、ひき続いてのプライスら
（ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９７６）、７３巻：１４４７−
１４５１ページ）によって記載のようにＤＥＡＥ−セフ
ァデックス（登録商標）Ａ−２５（ファーマシア）から
のグレディエント溶出によって精製される。牛ＢＧＰ
は、アミノ酸３７−４９に対するｈＢＧＰのように同じ
アミノ酸配列を有する。
【００３３】５．放射ヨウ素化子牛ＢＧＰの調製 精製した子牛ＢＧＰは、ＢＧＰ１０mgと 125Ｉ１ｍＣｉ
とともに培養することによる固体状態ラクトパーオキシ
ダーゼ法（ダヴィドおよびレルスフェルド、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，１３巻：１０１４−１０２１）によっ
て 125Ｉ（４×１０18 cpm／mole；アマーシャム）で標
識化する。標識化ＢＧＰは、未結合 125Ｉから分析物希
釈剤（０．１４Ｍ塩化ナトリウム；０．０１Ｍリン酸
塩；２５mMＥＤＴＡ；０．１％ゲラチン；０．１％ツゥ
ィーン（登録商標）２０（シグマケミカルＣｏ．，セイ
トルイス．ミズィーリ），pH７．４で）平衡化したセフ
ァデックス（登録商標）Ｇ−２５（ファーマシア）カラ
ムで、ゲルろ過で分離する。
【００３４】数多くの分析が、実施例２において記載の
ように調製された抗体とともにｈＢＧＰ37-49 放射ヨウ
素化試薬を用いて実施される。分析は、０．２５％牛血
清アルブミン、２０mMリン酸塩、ｈＢＧＰ37-49 の標準
を有する１mM．ＥＤＴＡプラスＢＧＰ−欠乏血漿におい
て実施される。トレーサーの付加前３日間、および後１
日培養後、結合トレーサーは、ウサギ抗ＢＧＰ抗体に対
する第二抗体を用いることによって遊離トレーサーから
分離する。分析は、９フェムトモルｈＢＧＰ37 -49 が検
出され、４９フェムトモルで５０％結合阻害を示す。精
製子牛ＢＧＰは、モル基準で、ｈＢＧＰ37-49 の５０％
反応性を与え、ヒト骨抽出物は、ＢＧＰの高濃度（１０
０−３００nMｈＢＧＰ37-49 ／ｇ）を示す。上皮小体機
能亢進症血漿は、ｈＢＧＰ37-49 基準に平行な結合阻害
を示す。４種の分析で検査した２０名女性および２０名
男性の正常血漿試料は、１７％の内−分析Ｃ．Ｖ．を示
し、血漿ｈＢＧＰレベル（ピコモルｈＢＧＰ37-49 ml）
女性では５．８±０．９および男性では７．１±１．３
を示す。正常の上限は２０ピコモル／ml（Ｎ＝１０３）
である。ｈＢＧＰは、上皮小体機能亢進症患者２７名中
１６名、パゲット病患者３３名中２４名、および血液透
析の慢性腎不全患者１５名中１２名において増加する。
【００３５】１mM塩化マグネシウム、１５０mM塩化ナト
リウムにおけるビオゲルＰ−３０で、血漿ｈＢＧＰを骨
からｈＢＧＰとともに共−溶出し、２０％は、大きい血
漿タンパクと非−共有的に結合している。正常ヒト被検
者の血液におけるこの領域−特異ＲＩＡによって検出さ
れるｈＢＧＰは、骨におけるペプチドと同じであり、部
分的により大きなタンパク質と非共有的に結合している
と結論づけられる。
【００３６】本分析は、生理学的液体におけるＢＧＰの
測定用の非常に感度の良い方法を提供することである。
このように骨と関連のある広範囲の疾病をもつと考えら
れる患者を、鋭敏にモニターでき、特に血漿または他の
液体におけるＢＧＰの変動を検出できる。なぜなら、用
いられたオリゴペプチドは、実質的に、天然に存在する
タンパク質より小さく、常法によって容易に合成でき
る。付加的に、特異性の重大な損失なくオリゴペプチド
の物理的性質を増大できる。
【００３７】前述の発明は、実施例によって詳細に記載
したが、理解を明確にするためであり、本発明の範囲が
これらの実施例に限定するものではないということはい
うまでもない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/68 7055−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 8413−4Ｃ 39/395 Ｎ 8413−4Ｃ 49/02 Ｚ 9164−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 バヤード ディー．キャザーウッド アメリカ合衆国，カリフォルニア，サン ディエゴ，デルフィニス 11037

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アミノ酸１０個から１６個までのアミノ
    酸配列で、末端配列は、末端アミノ酸を含み、１個より
    多くないアミノ酸置換は、ＰｈｅおよびＴｈｒまたはＧ
    ｌｕおよびＧｌａ以外の交換を含むことができることを
    除いて、３個までのアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換
    されうることを含んでなるｈＢＧＰに対する特異抗体に
    対して、ｈＢＧＰと競争することのできるオリゴペプチ
    ドをｈＢＧＰについての診断分析において有用な検出可
    能なシグナルを提供できる標識と接合せしめてなるオリ
    ゴペプチドの接合体。
  2. 【請求項２】 該標識が、放射性核種である請求項１記
    載の接合体。
  3. 【請求項３】 該放射性核種が放射性ヨウ素である請求
    項２記載の接合体。
  4. 【請求項４】 該標識が、螢光体である請求項１記載の
    接合体。
  5. 【請求項５】 該標識が、酵素である請求項１記載の接
    合体。
  6. 【請求項６】 共有的に免疫原と接合し、かつアミノ酸
    １０個から１６個までのアミノ酸配列で、末端配列は、
    末端アミノ酸を含み、１個より多くないアミノ酸置換
    は、ＰｈｅおよびＴｈｒまたはＧｌｕおよびＧ１ａ以外
    の交換を含むことができることを除いて、３個までのア
    ミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されうることを含んで
    なるｈＢＧＰに対する特異抗体に対して、ｈＢＧＰと競
    争することのできるオリゴペプチドを含んでなる免疫原
    接合体。
  7. 【請求項７】 該免疫原が、キイホールリンペットヘモ
    シアニンである請求項５記載の免疫原接合体。
  8. 【請求項８】 請求項５記載の免疫原によるホストの免
    疫化によって調製された抗体。
  9. 【請求項９】 該オリゴペプチドがｈＢＧＰ３７−４９
    である請求項７記載の抗体。
  10. 【請求項１０】 生理学的液体におけるｈＢＧＰを測定
    するに当たり、共有的に免疫原と接合するアミノ酸１０
    個から１６個までのアミノ酸配列で、末端配列は、末端
    アミノ酸を含み、１個より多くないアミノ酸置換は、Ｐ
    ｈｅおよびＴｈｒまたはＧｌｕおよびＧｌａ以外の交換
    を含むことができることを除いて、３個までのアミノ酸
    が、異なるアミノ酸で置換されうることを含んでなるｈ
    ＢＧＰに対する特異抗体に対して、ｈＢＧＰと競争する
    ことのできるオリゴペプチドおよびｈＢＧＰ１−１５、
    ｈＢＧＰ１５−３０、ｈＢＧＰ３５−４９以内にある配
    列をもつアミノ酸１０個から１６個までのアミノ酸で、
    末端配列は末端アミノ酸を含み、１個より多くないアミ
    ノ酸置換は、ＰｈｅおよびＴｒｙまたはＧｌｕおよびＧ
    ｌａ以外の交換を含むことができることを除いて、３個
    までのアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されうること
    を含んでなるｈＢＧＰに対する特異抗体に対してｈＢＧ
    Ｐと競争することのできるオリゴペプチドを含んでなる
    免疫原接合体でホストを免疫化することによって調製さ
    れる抗体および該オリゴペプチドが、ｈＢＧＰについて
    の診断分析において有用な検出可能なシグナルを提供で
    きる標識と接合するアミノ酸１０個から１６個までのア
    ミノ酸配列で、末端配列は、末端アミノ酸を含み、１個
    より多くないアミノ酸置換は、ＰｈｅおよびＴｈｒまた
    はＧｌｕおよびＧｌａ以外の交換を含むことができるこ
    とを除いて、３個までのアミノ酸が異なるアミノ酸で置
    換されうることを含んでなるｈＢＧＰに対する特異抗体
    に対してｈＢＧＰと競争することのできるオリゴペプチ
    ドおよび、ｈＢＧＰ１−１５、ｈＢＧＰ１５−３０、ｈ
    ＢＧＰ３５−４９以内にある配列をもつアミノ酸１０個
    から１６個までのアミノ酸で末端配列は、末端アミノ酸
    を含み、１個より多くないアミノ酸置換はＰｈｅおよび
    ＴｙｒまたはＧｌｕおよびＧ１ａ以外の交換を含むこと
    ができることを除いて、３個までのアミノ酸が、異なる
    アミノ酸で置換されうることを含んでなるｈＢＧＰに対
    する特異抗体に対してｈＢＧＰと競争できるオリゴペプ
    チド、該オリゴペプチドが、ｈＢＧＰ３７−４９である
    オリゴペプチド、該オリゴペプチドがｈＢＧＰ
    １５−３０もしくはｈＢＧＰ１６−３０であるオリゴペ
    プチド、または該オリゴペプチドが、ｈＢＧＰ１−１１
    もしくはｈＢＧＰ１−１２であるオリゴペプチドの標識
    化接合体からなるグループから選択された少なくても１
    つの試薬を用いる方法であり、該方法は、分析媒質にお
    いて、ｈＢＧＰに対して特異抗体、該抗体に対して、ｈ
    ＢＧＰと競争できる標識化接合体を結合させ、該標識が
    検出されうるシグナルを提供し；そして、該資料におけ
    るＢＧＰの測定として該抗体に結合もしくは未結合する
    標識化接合体の量を定量することを含んでなる方法。
  11. 【請求項１１】 該抗体は、ｈＢＧＰ３７−４９の接合
    体で産生され、該標識化接合体は、放射性ヨウ素化ｈＢ
    ＧＰ３７−４９である請求項９記載の方法。
  12. 【請求項１２】 アミノ酸１０個から１６個までのアミ
    ノ酸配列で、末端配列は、末端アミノ酸を含み、１個よ
    り多くないアミノ酸置換は、ＰｈｅおよびＴｈｒまたは
    ＧｌｕおよびＧｌａ以外の交換を含むことができること
    を除いて、３個までのアミノ酸が、異なるアミノ酸で置
    換されうることを含んでなるｈＢＧＰに対する特異抗体
    に対して、ｈＢＧＰと競争することのできるオリゴペプ
    チドに応答して産生する抗体。
  13. 【請求項１３】 該抗体がモノクローナルである請求項
    １２記載の抗体。
JP4169843A 1982-05-27 1992-05-19 オリゴペプチド接合体 Expired - Lifetime JP2644139B2 (ja)

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