JPH05244942A - 耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体dna、及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法 - Google Patents
耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体dna、及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法Info
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
において、217位のアミノ酸、又はゲンジボタル若しく
はヘイケボタルのルシフェラーゼの217位と同等位置の
アミノ酸が疎水性アミノ酸に変異されていることを特徴
とする耐熱性ホタルルシフェラーゼ、当該耐熱性ルシフ
ェラーゼをコードする遺伝子、当該耐熱性ルシフェラー
ゼをコードする遺伝子を組み込んだベクター、及び当該
ベクターを用いた耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造方
法。 【効果】 本発明耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子の
発現により得られる耐熱性ホタルルシフェラーゼは、A
TP等の微量検定等において極めて有用である。また本
発明の耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造方法により、
効率よく上記ルシフェラーゼを得ることが可能であり、
産業上極めて有用である。
Description
ラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組
み換え体DNA及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造
法に関する。
ェリンの酸化を触媒して、これを発光させる発光酵素で
ある。そして、ルシフェリンの発光の際にATP等の物
質を必要とする、ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリ
カボタル等由来のホタルのルシフェラーゼは、当該性質
に基づいて、上記ATP等の微量定量に利用されてい
る。
は、熱に対して不安定なため、試薬として保存する際に
失活しやすいという欠点を有する。かかる欠点を克服す
るための手段の一つとして、試薬に塩等を添加して、あ
る程度ルシフェラーゼを安定に保存することは可能であ
る。しかし、この場合にも、ルシフェラーゼの塩による
反応障害が惹起され勝ちであるという欠点が存在する。
熱性を有するホタルルシフェラーゼを開発することを主
たる課題とする。
ついて鋭意検討した結果、野生型ホタルルシフェラーゼ
における特定のアミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に変
換することにより、上記課題を解決し得ることを見出し
た。すなわち、本願は、以下の発明を提供するものであ
る。 (1)野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列にお
いて、 217位のアミノ酸、又はゲンジボタル若しくはヘ
イケボタルのルシフェラーゼの217位と同等位置のアミ
ノ酸が疎水性アミノ酸に変異されているアミノ酸配列を
コードする耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 (2)野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボタル若し
くはゲンジボタルのルシフェラーゼである(1)記載の
耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 (3)疎水性アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、若し
くはバリンである(1)又は(2)記載のホタルルシフ
ェラーゼ遺伝子。 (4)(1)又は(2)記載の耐熱性ホタルルシフェラ
ーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とす
る組み換え体DNA。 (5)(4)記載の組み換え体DNAを含み、耐熱性ホ
タルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に
属する微生物を培地に培養し、培養物より耐熱性ホタル
ルシフェラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ホタ
ルルシフェラーゼの製造法。 (6)野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列にお
いて、 217位のアミノ酸、又はゲンジボタル若しくはヘ
イケボタルのルシフェラーゼの217位と同等位置のアミ
ノ酸が疎水性アミノ酸に変異されていることを特徴とす
る耐熱性ホタルルシフェラーゼ。 (7)野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボタル若し
くはゲンジボタルのルシフェラーゼである(6)記載の
耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
発明における遺伝子の改変による耐熱性ルシフェラーゼ
が提供される前提として、野生型のホタルの遺伝子及び
その組み換え体DNAを調製することが必要である。野
生型ホタルの遺伝子等の種類は、提供が企図される耐熱
性ルシフェラーゼ遺伝子の種類に応じて用いられる。そ
して、ホタル由来のものであれば、如何なるものでも用
いることが可能であり、例えば、ゲンジボタル、ヘイケ
ボタル等由来のものを用いることが可能である。
従って調製される。例えば、野生型ゲンジボタル遺伝子
及びその組み換え体DNAは、特開平1-51086号公報に
記載の方法により調製することが可能である。本発明に
おいて、「ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフ
ェラーゼの217位と同等位置のアミノ酸」とは、確定し
たルシフェラーゼのアミノ酸配列をゲンジボタル若しく
はヘイケボタルのルシフェラーゼのアミノ酸配列を比較
した場合に、ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシ
フェラーゼの217位のアミノ酸に対応するアミノ酸を意
味するものである。
析用ソフト、例えば、Micro GenieT M(ベックマン社
製)により、各々のルシフェラーゼのアミノ酸配列とゲ
ンジボタル若しくはヘイケボタルのアミノ酸配列の相同
性を比較することにより決定される。当該アミノ酸とし
ては、例えば、スレオニン若しくはアラニンが挙げられ
るが、これらに限定されるものではない。
酸」としては、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチ
オニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリ
ン、システイン、又はアラニン等を挙げることができ
る。そして、これらの中でも、イソロイシン、ロイシ
ン、又はバリンは、疎水性値が高いという点で特に好ま
しいものとして挙げることができる。
処理は、企図する変異形態に応じた通常公知の方法で行
ない得る。すなわち、野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝
子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組み換え体DNA
と変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法;紫外線
照射法;遺伝子工学的手法;又は蛋白質工学的手法を駆
使する方法等を広く用いることができる。
剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、N−メチル
−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)、
亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、5−ブロモウラシ
ル等を挙げることができる。この接触・作用の諸条件
は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能
であり、現実に所望の変異を野生型ホタルルシフェラー
ゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定さ
れない。通常、好ましくは0.5〜12Mの上記薬剤濃度に
おいて、20〜80℃の反応温度下で10分間以上、好ましく
は10〜180分間接触・作用させることで、所望の変異を
惹起可能である。
の通り常法に従うことができる(現代化学、pp24〜30、
1989年6月号)。蛋白質工学的手法を駆使する方法とし
ては、一般的に、サイト−スペシフィック ミュータジ
ェネシス (Site-Specific Mutagenesis)として知られる
手法を用いることができる。例えば、Kramer法(Krame
r, W. et al., Nucleic Acids Res, vol.12, pp9441-94
56 (1984):Kramer, W. et al., Methods Enzymol, v
ol.154, pp350-367(1987):Bauer, C. E. et al., Ge
ne, vol.37, pp73-81 (1985)), Eckstein法(Taylor,
J. W. et al., Nucleic Acids Res, vol.13, pp.8749-8
764 (1985):Taylor, J. W. et al., Nucleic Acids Re
s, vol.13, 8765-8785(1985) :Nakamaye, K. L. et a
l., Nucleic Acids Res, vol.14, pp.9679-9698 (198
6)) 、Kunkel法(Kunkel. T. A., Proc. Natl. Acid. S
ci. U.S.A., vol.82, pp488-492 (1985):Kunkel. T.
A. et al., Methods Enzymol, vol.154, pp.367-382 (1
987))等が挙げられる。
法又は酵素合成法により、直接所望の改変ホタルルシフ
ェラーゼ遺伝子を合成し得ることはもちろんである。上
記方法により得られる所望のホタルルシフェラーゼ遺伝
子の塩基配列の決定・確認は、例えばマキサム−ギルバ
ートの化学修飾法〔Maxam-Gilbert, Meth.Enzym., vol.
65, pp.499-560(1980)〕やM13ファージを用いるジデ
オキシヌクレオチド鎮終結法〔Messing et al., Gene,
vol. 19., pp.269-276(1982)〕等により行ない得る。
フェラーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファー
ジ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転
換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各
々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換・
形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エ
ッシェリア属に属する微生物、例えば大腸菌(E.coli)
JM101 (ATCC 33876)、大腸菌(E.coli)DH1(ATCC 338
49)、大腸菌(E.coli)HB 101(ATCC 33694)等を選択
する場合には、ハナハン(Hana-han)の方法〔ディーエ
ヌエイ・クローニング(DNA Cloning)、第1巻、第
109〜135頁(1985)〕等により形質転換するか、あるい
は「モレキュラー・クローニング(Molecular Clonin
g)、第256〜268頁、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory) (198
2)」記載の方法等により形質導入することにより形質
転換株あるいは形質導入株を得ることが可能である。
ェラーゼ生産能を有する菌株をスクリーニングすること
により、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子をベクター
DNAに挿入した組み換え体DNAを含み、耐熱性ホタ
ルルシフェラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属
する菌株を得ることができる。このようにして得られた
菌株より純化された新規な組み換え体DNAを得るに
は、例えばピー・グーリー(P.Guerry)等の方法〔ジェ
イ. バクテリオロジー(J.Bacteriology) 第116巻、第10
64〜1066頁(1973年) 〕、デー・ビー・クレウェル(D.
B.Clewell)の方法〔ジェイ. バクテリオロジー(J.Bact
eriology)第110巻、第667〜676頁(1972年)〕、などに
より得ることができる。
体DNAより耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有
するDNAを得るには、例えば、該プラスミドDNAに
制限酵素、例えばEcoRI及びPstIを温度30〜40℃、好ま
しくは37℃程度で1〜24時間、好ましくは2時間程度作
用させて、反応終了液をアガロースゲル電気泳動法〔モ
レキュラー・クローニング(Molecular Cloning)、第150
頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー (Co
ld Spring Harbor Laboratory)(1982)記載で処理するこ
とにより得ることができる。
シフェラーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入した組み換
え体DNAを含み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能
を有するエッシェリシア属に属する菌株を用いて耐熱性
ホタルルシフェラーゼを生産するには、この菌株を通常
の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養
法を採用して培養するのが好ましい。
例えば酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、
コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふす
まの浸出液等の1種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、
リン酸第1カリウム、リン酸第2カリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化マグネシウム、塩化第2鉄、硫酸第2鉄あ
るいは硫酸マンガン等の無機塩類の1種以上を添加し、
更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したも
のが用いられる。
整するのが適当である。また培養は30〜42℃、好ましく
は37℃前後で4〜24時間、好ましくは6〜8時間で、通
気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施する
のが好ましい。培養終了後、該培養物より耐熱性ホタル
ルシフェラーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を
用いて得ることができる。
理、磨砕処理などするか、または、リゾチーム等の溶菌
酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の
存在下で振盪もしくは放置して自己消化を行わせ本酵素
を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液
を濾過、遠心分離などして固形部分を除去し、必要によ
りストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、硫酸
マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、ア
ルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取
し、粗酵素を得る。
には、例えばセファデックス、ウルトロゲルもしくはバ
イオゲル等を用いるゲル濾過法;イオン交換体を用いる
吸着溶出法;ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳
動法;ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法;蔗糖
密度勾配遠心法等の沈降法;アフィニティクロマト法;
分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適
宜選択し、またこれらを組合わせて実施することによ
り、精製された酵素標品を得ることが出来る。
フェラーゼを得ることができる。そして、当該耐熱性ホ
タルルシフェラーゼは、以下に示す性質を除き、特開平
1-141592号公報記載の野性型ゲンジボタルのルシフェラ
ーゼ、又は特開平1-262791号公報記載のヘイケボタルの
ルシフェラーゼと同様である。 作用適温の範囲:0〜65℃である。 pH、温度等による失活の条件: i) pH4.0 以下又は pH12.0以上で4時間後完全に失
活する。
熱処理により完全に失活する。 熱安定性:温度50℃、20分間の処理で80%以上の残存
酵素活性を有し、温度50℃、60分間の処理でも65%以上
の残存酵素活性を有する。
説明する。なお、以下に述べる項目1〜10には、ホタル
の1種であるフォティナス・ピラリスのルシフェラーゼ
をコードする遺伝子を含有するDNA (該DNAは、ル
シオラ・クルシアタのルシフェラーゼをコードする遺伝
子を含有するDNAを検索する際、プローブとして使用
されるものである。) の調製について述べる。 1.m−RNAの調製 ホタルの1種であるフォティナス・ピラリス(Photinus
pyralis)の乾燥尾部 (シグマ社製) 1gを乳鉢及び乳棒
を用いて充分破砕したものに、溶解緩衝液5ml〔20mMト
リス−塩酸緩衝液(pH7.4)/10mM NaCl/3mM酢酸マグ
ネシウム/5%(w/v) ショ糖/1.2%(V/V) トリトンX
-100/10mMバナジルヌクレオシド錯体 (ニューイングラ
ンド バイオラボ社製) 〕を添加し、更に、上記と同様
に破砕してフォティナス・ピラリス尾部破砕物含有溶液
を得た。
レンダー(日本精機製作所社製)に入れ、5,000r.p.m. で
5分間処理したものに、12mlのグアニジンイソチオシア
ネート溶液 (6Mグアニジンイソチオシアネート/37.5
mMクエン酸ナトリウム(p H7.0)/0.75%(W/V) N−ラ
ウロイルザルコシンナトリウム/0.15M β−メルカプト
エタノール) を添加する。この溶液をさらに上記ブレン
ダーを用い3,000r.p.m. で10分間処理し、3重のガーゼ
を用いて濾過して濾液を得た。次に、超遠心分離機用チ
ューブ (日立工機社製) 4本に、予め1.2mlの5.7Mの
塩化セシウム溶液を夫々重層し、その上に、上記濾液を
重層するように夫々分注し、超遠心分離機 (日立工機社
製、SCP55H)を用いて温度15℃、30,000r.p.m.で16
時間遠心分離して沈澱物を得た。得られた沈澱物を、冷
70%(V/V) エタノールを用いて洗浄し、10mMトリス緩衝
液〔10mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)/5mMEDTA/
1%ドデシル硫酸ナトリウム〕4mlに懸濁したものに、
同量のn−ブタノール及びクロロフォルムを4対1(容
量比)混液を添加して抽出し、常法により3,000r.p.m.
で10分間遠心分離し、水層及び有機溶媒層に分離した。
この有機溶媒層に上記10mMトリス緩衝液4mlを添加し、
上記抽出及び分離操作を行なう操作を2回繰り返した。
得られた水層に、1/10量の3M酢酸ナトリウム(pH5.2)
及び2倍量の冷エタノールを添加したものを温度−20℃
で2時間放置したのち、常法により8,000r.p.m. で20分
間遠心分離し、RNAを沈澱させた。得られたRNAを
4mlの水に溶解し、上記エタノール沈澱操作を行なっ
た。得られたRNAをさらに1mlの水に溶解し、3.75mg
のRNAを得た。
より合計7mgのRNAを調製した。このRNA中よりm
−RNAを選択するために、7mgのRNAを、オリゴ(d
T)−セルロース (ニューイングランドバイオラボ社
製) カラムクロマトグラムにかけた。このカラムクロマ
トグラムにおいて、カラムとして2.5mlテルモシリンジ
(テルモ社製)を用いた。このカラムに、樹脂0.5gを
溶出緩衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.6)/1mMD
ETA/0.1%(W/V) ドデシル硫酸ナトリウム〕で膨潤
させたのち充填し、結合緩衝液〔10mMトリス−塩酸(pH
7.6)/1mMEDTA/0.4M NaCl/0.1%ドデシル硫酸
ナトリウム〕で平衡化して調製した。
ス−塩酸(pH7.6)/1mMEDTA/0.8M NaCl/0.1%
ドデシル硫酸ナトリウム〕を添加し、温度65℃で10分間
加熱処理し、氷中で急冷した。これを前記調製したオリ
ゴ(dT) −セルロースカラムにかけ、結合緩衝液で樹脂
を洗浄し、未結合のr−RNA及びt−RNAを完全に
洗浄し、更に、溶出緩衝液でm−RNAを溶出してm−
RNA40μg を得た。 2.ルシフェラーゼm−RNAの濃縮 次に、ショ糖密度勾配遠心分離法によりルシフェラーゼ
m−RNAを濃縮した。
クマン社製のローターSW41用ポリアロマチューブに40
%(W/V) ショ糖液〔50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)/
20mMNaCl /1mMEDTA/40%(W/V)ショ糖〕0.5ml
を入れ、その上に2.4mlずつ25%(W/V)、20%(W/V)、15
%(W/V) 及び10%(W/V) のショ糖液を重層し、4℃で24
時間放置することにより作製した。このショ糖密度勾配
に、m−RNA30μgを重層し、SW41ローター(ベッ
クマン社製)を用い、常法により30,000r.p.m.、温度18
℃で18時間遠心分離を行なった。遠心分離操作ののち、
0.5mlずつ分画し、エタノール沈澱法によりm−RNA
を回収し、10μLの水に溶解した。
質を調べることにより、ルシフェラーゼのm−RNAが
濃縮されている画分の同定を行なった。分画したRNA
1μL 、ウサギ網状赤血球ライセート (アマシャム社
製) 9μL 及び〔35S〕メチオニン1μL (アマシ
ャム社製)を混合し、30℃で30分間反応させた。これに
150μL のNET緩衝液〔150mM NaCl/5mMEDTA
/0.02% (W/V)NaN3/20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)
/0.05%(W/V) ノニデットP-40(ベセスダリサーチラボ
ラトリー社製、界面活性剤) 〕を添加し、更に、1μL
の抗ルシフェラーゼ血清 (後述のようにして調製した
もの。) を添加し、4℃で18時間放置した。これに10mg
のプロティンAセファロース (ファルマシア社製) を添
加し、温度20℃で30分間放置したものを、常法により1
2,000r.p.m.で1分間遠心分離処理し、樹脂を回収し
た。
で3回洗浄し、次いで、40μL のSDS−PAGE用
サンプル緩衝液〔62.5mMトリス−塩酸緩衝液(pH6.8)/
10%(V/V) グリセロール/2%(W/V) ドデシル硫酸ナト
リウム/5%(V/V) メルカプトエタノール/0.02%(W/
V) ブロムフェノールブルー〕を添加し、温度 100℃で
3分間煮沸し、常法により12,000r.p.m.で1分間遠心分
離処理した。この遠心分離処理で得られた上清を回収
し、全量を7.5%(W/V) ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲルに乗せてラエムリ(Laemmli) の方法
〔「ネーチュアー」(Nature)、第227頁、第680頁(197
0)〕でゲル電気泳動を行った。
/V) の酢酸に30分間浸漬し、蛋白質を固定したのち、水
に30分間浸漬し、更に、1Mサリチル酸ナトリウム溶液
に30分間浸漬し、乾燥して乾燥ゲルを得、次いでX線フ
ィルム (フジ写真フィルム社製、RX)を用いてフルオ
ログラフィーを行なった。以上の操作により、ルシフェ
ラーゼm−RNAの存在する画分のRNAを用いた場合
にのみ、ルシフェラーゼ蛋白質のバンドがX線フィルム
上に認められ、ルシフェラーゼm−RNAの濃縮されて
いる画分が同定できた。 3.抗ルシフェラーゼ血清の調製 精製ルシフェラーゼに対するウサギの抗ルシフェラーゼ
血清は、以下の方法により調製した。
グマ社製ルシフェラーゼを0.5Mグリシルグリシン溶液
(pH7.8)に溶解したもの〕0.7mlを、等量のフロイント
(Freund)完全アジェバントで懸濁したもの2.24mgを、抗
原として体重2kgの日本白色種ウサギの指掌部に投与し
飼育した。飼育2週間経過した後、初回と同量の抗原を
背部皮内へ投与し、更に、飼育1週間経過したのち、同
様の操作を行ない、更に、飼育1週間後全採血を行なっ
た。
間放置したものを、常法により3,000r.p.m. で15分間遠
心分離し、上清として抗ルシフェラーゼ血清を得た。 4.c−DNAの合成 c−DNAの合成は、アマシャム社製キットを用いて行
なった。上述の如くして得られたm−RNA2μg を用
いてアマシャム社の指示する「モル・セル・バイオル」
(Mol.Cell Biol.)、第2巻、第161頁(1982)及び「ジー
ン」(Gene)、第25巻、第263 頁(1983)記載の方法に従い
処理して、 300ngの2本鎖c−DNAを得た。
衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)/1mMEDT
A〕に溶解したものに、11μL の混液〔280mM カコジ
ル酸ナトリウム(pH6.8)/60mM トリス−塩酸緩衝液(p
H6.8)/2mM塩化コバルト〕及び3.8μL のティリン
グ混液〔10mMジチオスレイトール7.5μL /10ng/ml
ポリ (poly) A1μL /5mM dCTP2μL /水 1
10μL 〕を夫々添加し、更に、29ユニットのターミナ
ルトランスフェラーゼ (ベーリンガーマンハイム社製)
を添加し、30℃で10分間反応させ、次いで、2.4μL の
0.25M EDTA及び2.4μL の10%(W/V) ドデシル硫
酸ナトリウムを夫々添加して反応を停止させた。
ールを用いて除蛋白処理を行なった。回収した水層に、
25μL の4M酢酸アンモニウム及び 100μL の冷エ
タノールを夫々添加し、−70℃で15分間放置し、12,000
r.p.m.で10分間遠心分離してc−DNAを回収した。こ
れを10μL のTE緩衝液に溶解し、c−DNA溶解液
を得た。
が付いたc−DNA100ngを得た。 5.ベクターに使用する組み換え体プラスミド pMCE
10DNAの調製 大腸菌W3110株(ATCC 27325)、プラスミド pBR325(B
RL社製)及びプラスミド pBR322 DNA(宝酒造社
製)を用いてティー・マスダ等 (T.Masuda et.al.)「ア
グリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー」(Ag
ricultural Biological Chemistry) 、第50巻、第271〜
279頁 (1986) 記載の方法により作製したプラスミド p
KN305 DNA並びにプラスミド pMC1403-3DNA
(特開昭61-274683 号公報記載) を作製した。夫々のプ
ラスミド1μg を、10μL の混液〔50mMトリス−塩酸
緩衝液(pH7.5)/10mM MgCl2/100mM NaCl/1mMジチオ
スレイトール〕に添加し、更に、これに、HindIII及びS
alI (いずれも宝酒造社製) を夫々2ユニットずつ添加
し、37℃で1時間反応させて切断処理し、常法によるフ
ェノール抽出及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を
得た。この沈澱物を、10μL のライゲーション緩衝液
〔20mM MgCl2/66mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.6)/1mM
ATP/15mMジチオスレイトール〕に溶解し、この溶液
にさらに1ユニットのT4DNAリガーゼ(宝酒造社
製)を添加し、20℃で4時間連結反応を行なった。次い
で、この反応液を用い、「ジェイ・バクテリオロジー
(J.Bacteriology、第119巻、第1072頁〜第1074頁(1974
年)」記載の形質転換法により、大腸菌JM 101(ATCC
33876)株を形質転換し、薬剤耐性 (アンピシリン耐性及
びテトラサイクリン感受性) 及びβ−ガラクトシダーゼ
活性を検討し、形質転換株を得た。この形質転換株に含
まれる組み換え体プラスミドDNAを pMCE10と命名
した。この組み換え体プラスミド pMCE10DNAを含
有する大腸菌JM101 株を、トリプトン1%(W/V) 、酵
母エキス0.5%(W/V) 、及びNaCl0.5 %(W/V) からなる
培地1L に、該培地を用い37℃で16〜24時間前培養し
て得た大腸菌JM101 (pMCE10) の培養液20mlを接種
し、37℃で3時間振盪培養したのち、0.2gのクロラムフ
ェニコールを添加し、更に同一温度で20時間同培養を行
ない、培養液を得た。
r.p.m. で10分間遠心分離して湿潤菌体2gを得た。こ
れを20mlの25%(W/V) ショ糖を含有する350mM トリス−
塩酸緩衝液(pH8.0)に懸濁したのち、更に、これに、リ
ゾチーム10mg、0.25M EDTA溶液(pH8.0)8ml及び20
%(W/V) ドデシル硫酸ナトリウム溶液8mlを夫々添加
し、60℃で30分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。
し、温度4℃で16時間処理したものを常法により15,000
r.p.m.で30分間遠心分離して抽出液を得、常法によりフ
ェノール抽出処理及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱
物を得た。次いで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理し
た後、1mMEDTAを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液
6ml(pH7.5)に溶解し、更に、これに、塩化セシウム6
g及びエチジウムブロマイド溶液(10mg/ml) 0.2mlを添
加した。これを超遠心分離機を用いて常法により39,000
r.p.m.で42時間平衡密度勾配遠心分離処理を行ない、組
み換え体プラスミド pMCE10DNA含有物を単離し
た。次いで組み換え体プラスミド pMCE10DNA含有
物からn−ブタノールを使用してエチジウムブロマイド
を除去したのち、1mMEDTAを含有する10mMトリス−
塩酸緩衝液(pH7.5)に対して透析を行ない純化した組み
換え体プラスミド pMCE10DNA500μg を得た。 6.ベクターDNAの調製 以上の様にして得られた組み換え体プラスミド pMCE
10DNA15μg を、前記項目4記載のTE緩衝液90μL
に溶解しMed緩衝液〔100 mMトリス−塩酸緩衝液(pH
7.5)/100mM MgCl2 /10mMジチオスレイトール/500mM
NaCl〕10μLを添加したのち制限酵素AccI(宝酒造社
製) 30ユニットを更に加え、37℃で1時間切断処理を行
ない切断処理物を得た。この切断処理物に、100μL の
水飽和フェノールを加え除蛋白操作を行なったのち、水
層を回収した。この水層に、1/10量の3M酢酸ナトリウ
ム(pH7.5)及び2倍量の冷エタノールを加え、−70℃で
15分間放置したのち、12,000r.p .m. で10分間遠心分離
し、DNAを回収した。
し、混液〔280mM カコジル酸ナトリウム(pH6.8)/60mM
トリス−塩酸緩衝液(pH6.8)/2mM塩化コバルト〕15μ
Lを加えたのち、更に、ティリング混液(項目4記載)
(5mM dGTPを用いた) 5μL 及びターミナルトラ
ンスフェラーゼ (宝酒造社製) 5ユニットを添加し、37
℃で15分間反応させた。前記項目4記載のc−DNAテ
ィリング反応と同様の後処理を行なうことにより組み換
え体プラスミド pMCE10DNAのAccIサイトにデオ
キシグアノシンのテイルが付いたDNAを調製した。
サイ6にデオキシグアノシンのテイルが付いたDNAの
調製も同時に行なった。プラスミド pUC19DNA (宝
酒造社製)30μg を、 350μL のTE緩衝液に溶解し
たものに、40μL のMed緩衝液及び制限酵素PstI
(宝酒造社製)120ユニットを夫々添加し、37℃で1時間
切断処理したのち、常法によりフェノールによる除蛋白
処理及びエタノール沈澱処理によりDNAを回収した。
に溶解したものに、50μL の混液〔280mM カコジル酸
ナトリウム(pH 6.8) /60mMトリス−塩酸緩衝液(pH6.
8)/1mM塩化コバルト〕、19μL の項目4記載のティ
リング混液(dGTP含有) 並びに60ユニットのターミナ
ルトランスフェラーゼ(宝酒造社製) を夫々添加し、37
℃で10分間反応させたのち、常法によりフェノール処理
及びエタノール沈澱を行なうことによりDNAを回収し
た。 7.アニーリング及び形質転換 合成したc−DNA15ng及び上記の方法で得た二種のベ
クターDNA 200ngを、35μL のアニール緩衝液〔10
mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)/100 mM NaCl/1mME
DTA〕に溶解し、65℃で2分間、46℃で2時間、37℃
で1時間及び20℃で18時間放置する操作によりc−DN
AとベクターDNAをアニールした。
ana-han)の方法〔デイ−エヌエイクローニング(DNA
Cloning) 、第1巻、第109〜135頁(1985)〕により大腸
菌DH1株(ATCC 33849)を形質転換し、プラスミド pU
C19DNA及び組み換え体プラスミド pMCE10DNA
をベクターとしたc−DNAバンクを夫々作製した。 8.ルシフェラーゼc−DNAの検索 組み換え体プラスミド pMCE10DNAのAccI部位
は、大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする部
位にあるので、この部位に組み込まれたc−DNAはβ
−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質を作った。また組み
換え体プラスミドpMCE10のβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子のプロモーターは前述した様に大腸菌トリプトファ
ン遺伝子のプロモーターに変換してある。
ベクターとするc−DNAバンクのコロニー96個をM9
カザミノ酸培地〔「モレキュラー・クローニング」(Mol
ecular Cloning) 、第440〜441 頁、「コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー」(Cold Spring Harbor La
boratory)(1982) 〕にチアミン (10μg/ml) を加えた培
地中、37℃で10時間振盪培養し、常法により集菌したの
ち、前記項目2記載のSDS−PAGE用サンプル緩衝
液 200μL に懸濁し、100℃で5分間煮沸した。
アクリルアミドゲルを用いて、常法により電気泳動を行
なった。泳動終了後、ゲルに展開した蛋白質を、ウエス
タンブロット法〔「アナル・バイオケム」(Anal.Bioch
m.)、第112 巻、第195 頁(1981)〕によりニトロセルロ
ースのフィルターに転写し、このニトロセルロースフィ
ルターをイミューンブロットアッセイキット (バイオラ
ッド社製) を用いて抗ルシフェラーゼ血清で染色した。
この方法は、バイオラッド社の操作法に従った。
ロッキング溶液[TBS緩衝液〔20mMトリス−塩酸緩衝
液/500mM NaCl(pH7.5)〕に3%(W/V) のゼラチンを溶
かした溶液] 100ml中、25℃で、30分間振盪した。次
に、このニトロセルロースフィルターを25mlの一次抗体
溶液〔ルシフェラーゼ抗血清を1%(W/V) のゼラチンを
TBS緩衝液に溶かした溶液で25倍(V/V) に希釈した溶
液〕に移し、25℃で90分間振盪した。これを 100mlのツ
ィーン(Tween) −20洗液〔TBS緩衝液に0.05%(W/V)
のツィーン(Tween) −20を溶かした溶液〕中に移し、25
℃で10分間振盪する操作を2回行なった。次いで、この
ようにして得たニトロセルロースフィルターを60mlの二
次抗体溶液〔西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗
ウサギ抗体(バイオラッド社製) を1%(W/V) のゼラチ
ンをTBS緩衝液に溶かした溶液で3000倍(V/V) に希釈
した溶液〕中に移し、25℃で60分間振盪したのち、 100
mlのツィーン(Tween) −20洗液でニトロセルロースフィ
ルターを洗う上記操作を2回繰り返した。このようにし
て得たニトロセルロースフィルターを、 120mlの発色液
〔60mgの4−クロロ−1−ナフトールを20mlの冷メタノ
ールに溶解した溶液及び60μL の30%(V/V) 過酸化水
素水を 100mlのTBS緩衝液に添加した溶液を混合した
溶液〕中に移し、25℃で10分間発色させた。
としたものの4グループについて、同様の方法を行なっ
たところ、2つのグループでルシフェラーゼ抗血清で染
まる蛋白質バンドが認められた。次に、この2つのグル
ープに属する96個のコロニーを12個のコロニーずつ8グ
ループに分け同様の操作を行なったところ夫々1グルー
プに抗ルシフェラーゼ血清と反応する蛋白質が認められ
た。最後に、このグループに含まれる12個のコロニー
を、1個のコロニーずつ同様の操作を行ないルシフェラ
ーゼ抗血清と反応する蛋白質を作るコロニーを同定し
た。以上の操作によりルシフェラーゼc−DNAをもつ
2個のコロニーが得られた。この2個のコロニーより前
記項目5記載の方法でプラスミドDNAを調製した。得
られた組み換え体プラスミドDNAは、pALf 2B8
及びpALf 3A6と夫々命名した。 9.大きなルシフェラーゼc−DNAの検索−DNAの
プローブの作製 組み換え体プラスミド pALf3A6DNA100 μgを、
330μL のTE緩衝液に溶解し、これに40μL のLow
緩衝液〔100mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)/100mM M
gCl2 /10mMジチオスレイトール〕、130ユニットの Pst
I(宝酒造社製)及び120ユニットのSacI (ベーリンガー
マンハイム社製) を添加し、37℃で1.5時間切断した。
ゲルを用いた電気泳動により分離した。アガロースゲル
電気泳動はティー・マニアテス(T.Maniatis)等の方法
〔「モレキュラー・クローニング」(Molecular Cloning)
、第156〜161頁、「コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー」(Cold Spring Habor Laboratory)(198
4)〕に従って行なった。ルシフェラーゼc−DNAを含
むDNAバンドを切り出し、透析チューブに入れ、2ml
のTE緩衝液を加えたのち、透析チューブをシールし、
電気泳動により、ゲル中より緩衝液中にDNAを溶出し
た。この溶液に等容量の水飽和フェノールを加え、攪拌
したのち、水層を回収し、常法に従いエタノール沈澱に
よりDNAを回収した。
μLのTE緩衝液に溶かし、Med緩衝液16μl及びSau
3AI (宝酒造社製)64 ユニットを加え、37℃で2時間
反応させたのち、その全量を5%(W/V) ポリアクリルア
ミドゲルを用いた電気泳動にかけて、DNA断片の分離
を行なった。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、エイ
・マクサム(A.Maxam)の方法〔「メソズ・イン・エンザイモ
ロジー」(Methodsin Enzymology)、第65巻、第506 頁(1
980)〕に従って行なった。190bp のDNAフラグメント
を前述と同様の方法で単離し、1μg のSau3AIルシ
フェラーゼc−DNAフラグメントが得られた。
を、〔α−32P〕 dCTP (アマシャム社製) を用いて
ニックトランスレーション法により標識した。ニックト
ランスレーションは宝酒造社製のキットを用い、宝酒造
社の指示する〔「ジェイ・モル・バイオル」(J.Mol.Bio
l.) 、第113 巻、第237〜251 頁 (1977) 〕及び〔「モ
レキュラー・クローニング」(Molecular Cloning) 、第
109 〜112 頁、「コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー」(Cold Spring Habor Laboratory)(1982)〕
記載の方法に従って行なった。 10. 大きなルシフェラーゼc−DNAの検索−コロニー
ハイブリダイゼーション 前述の方法で調製した32Pで標識したルシフェラーゼc
−DNA断片を、プローブとして用い、組み換え体プラ
スミド pUC19DNAをベクターとするフォティナス・
ピラリス尾部c−DNAバンクを、コロニーハイブリダ
イゼーション法(「蛋白質・核酸・酵素」、第26巻、第5
75〜579頁(1981))で検索し、ルシフェラーゼc−DN
Aを有するコロニーを得た。そのうちの1個のコロニー
の有する組み換え体プラスミドDNAを pALf 3と命
名し、前記項目5記載の方法でプラスミドDNAを調製
した。該組み換え体プラスミドDNAを含有する大腸菌
を大腸菌DH1(pALf 3)と命名した。なお、該形質転
換大腸菌はATCC67462として寄託されている。
3DNAを、XbaI、HindIII、BamHI、EcoRI及び
PstI (いずれも宝酒造社製) を用いて、単一消化及び
2重消化した。得られたDNA断片をアガロースゲル電
気泳動法により移動度パターン分析し、得られた移動度
パターンとλDNA (宝酒造社製) をHind III により
消化して得られたDNA断片の標準移動度パターンとを
対比した。この結果、得られた分子量は 1,700bpであっ
た。そして、上記プラスミドの制限酵素地図は、図1に
示すとおりであった。 11. ルシオラ・クルシアタ(Luciola cruciata)のm
−RNAの調製 生きたルシオラ・クルシアタ (ゲンジボタル・株式会社
・西武百貨店より購入) 10gを超低温冷凍庫に入れ、凍
結し、はさみを用いて尾部を切り離し、得られた尾部2
gに、18mlのグアニジンイソチオシアネート溶液を添加
し、前記項目1記載の方法に従って1.1mgのRNAを調
製した。このRNA1.1mgを前記項目1記載の方法に従
ってオリゴ(dT) −セルロースのカラムクロマトグラフ
ィーを行ない30μg のルシオラ・クルシアタ尾部m−R
NAを調製した。 12. ルシオラ・クルシアタ尾部c−DNAバンクの作製 c−DNAの合成はアマシャム社より購入したキットを
用い、アマシャム社の指示する「モル・セル・バイオ
ル」(Mol.Cell Biol.)、第2巻、第161 頁(1982)及び
「ジーン」(Gene)、第25巻、第263頁(1983)記載の方法
に従って合成した。
より0.9μg の二本鎖c−DNAが合成された。このc
−DNA0.3μg に前記項目4記載の方法を用いてポリ
デオキシシチジンのテイルを付加した。このc−DNA
20ngと前記項目6で調製したポリグアノシンのテイルを
そのPstI部位に付加した pUC19プラスミドDNA500
ng とを、前記項目7記載の方法でアニールし、得られ
るDNAで大腸菌DH1株 (ATCC 33849) をハナハン(H
anahan) の方法〔「ディエヌエイ・クローニング」(D
NA Cloning): 第1巻、第109〜135頁(1985)〕で形質
転換し、ルシオラ・クルシアタ尾部c−DNAバンクを
作製した。 13. ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼc−D
NAの検索 前記項目10で得られた組み換え体プラスミド pALf 3
DNA10μg を、TE緩衝液90μL に溶解し、Med緩
衝液10μL 、制限酵素EcoRI25ユニット及び制限酵
素のClaI (いずれも宝酒造社製) 25ユニットを添加
し、37℃で2時間反応を行ないDNAを切断した。切断
した組み換え体プラスミド pALf 3DNAよりフォテ
ナス・ピラリス (アメリカホタル) 由来のルシフェラー
ゼc−DNA部分を含む 800bpのEcoRI/ClaIDNA
フラグメントを、前記項目9記載のアガロースゲル電気
泳動法を用いる方法に従って単離し、1μg のEcoRI
/ClaIDNAフラグメントを得た。このDNA1μg
を、〔α−32P〕dCTP三燐酸(アマシャム社製)を
用いて前記項目9記載のニックトランスレーション法に
より32Pで標識した。32Pで標識したEcoRI/ClaID
NAフラグメントをプローブとして、ルシオラ・クルシ
アタ尾部c−DNAバンクを項目10記載のコロニーハイ
ブリダイゼーション法で検索することによりルシオラ・
クルシアタ由来のルシフェラーゼc−DNAを有する大
腸菌を選択した。その結果、プローブとハイブリダイズ
する大腸菌コロニーを数個得た。この中の1コロニーの
有する組み換え体プラスミドDNAを pGLf 1と命名
し、前記項目5記載の方法に従い組み換え体プラスミド
DNAを単離した。該組み換え体プラスミドDNAを含
有する大腸菌を大腸菌DH1(pGLf 1) と命名した。
なお、該形質転換株はATCC67482 として寄託されて
いる。
paI,HindIII, EcoRV, DraI,AflII, HincII,
PstI (いずれも宝酒造社製) 及SspI (ニューイング
ランドバイオラボ社製) を用い、単一消化及び二重消化
した。得られたDNA断片をアガロースゲル電気泳動法
により移動度パターン分析し、得られた移動度パターン
とλファージDNA(宝酒造社製) をHindIIIにより消化
して 得られたDNA断片の標準移動度パターンとを対
比した。その結果、得られた分子量は、 2,000bpであっ
た。そして、上記プラスミドの制限酵素地図は図2に示
す通りである。 14. ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼc−D
NAの塩基配列の解析 組み換え体プラスミド pGLf 1DNA10μg を制限酵
素PstI (宝酒造社製)で切断し、ルシフェラーゼc−D
NAを含む2.0Kb DNA断片を2.5μgを得た。この
DNA断片を、プラスミドpUC119DNA (宝酒造社
製) のPstI部位にクローニングし、得られたプラスミ
ドDNAはc−DNAの挿入方向の違いにより夫々 pG
Lf 2及び pGLf 3と命名した。組み換え体プラスミ
ド pGLf 1DNA及びプラスミド pUC119 DNAの
PstIによる切断処理(前記項目6記載の方法)、ルシフ
ェラーゼc−DNA断片のアガロースゲル電気泳動法を
用いた単離 (前記項目9記載の方法) 、プラスミド pU
C119 DNA及びルシフェラーゼc−DNA断片の連結
反応 (前記項目5記載の方法)、連結反応液を用いた大
腸菌JM101 株(ATCC 33876) の形質転換 (前記項目5
記載の方法) 、並びに組み換え体プラスミド pGLf 2
及び pGLf 3DNAの調製 (前記項目5記載の方法)
は、それぞれ前述の方法に従った。
及び pGLf 3DNAを用いてキロシークエンス用欠失
キット (宝酒造社製) により、ヘニコフ(Henikoff)の方
法〔「ジーン」(Gene)、第28巻、第351 〜359 (1984)〕
に従いルシフェラーゼc−DNAに種々の欠失が導入さ
れたプラスミドDNAを作製した。これらプラスミドD
NAを前記項目5記載の方法で大腸菌JM 101株 (ATCC 3
3876) に導入した。このようにして得られた大腸菌にペ
ルパーファージM13KO7 (宝酒造社製) を感染させ、
メッシング (Messing)の方法〔「メソズ・イン・エンザ
イモロジー」(Methods in Enzymology) 、第101巻、第2
0〜78頁 (1983) 〕に従って1本鎖DNAを調製した。
得られた1本鎖DNAによるシークエンシングは、M13
シークエンシングキット (宝酒造社製) を用いて上記メ
ッシング(Messing) の方法に従い行なった。塩基配列の
解析のためのゲル電気泳動は8%(W/V) ポリアクリルア
ミドゲル (富士写真フィルム社製) を用いて行なった。
フェラーゼc−DNAのみの全塩基配列を配列番号1
に、また、当該c−DNAから翻訳されるポリペプチド
のアミノ酸配列を配列番号2に夫々示した。 15. 組み換え体プラスミド pGLf 37DNAの構築 先ず、N末端より9個のアミノ酸をコードする塩基配列
を欠失し、ルシオラ・クルシアタ由来のルシフェラーゼ
遺伝子及びベクターDNAを含有するDNA断片の調製
について述べる。組み換え体プラスミド pGLf 1DN
A1μg を、水90μLに溶解したものに、Med緩衝液
10μL及びPstI (宝酒造社製) 20ユニットを添加し、
37℃で2時間消化する。得られた消化物に、等量の水飽
和フェノールを添加し、常法による除蛋白処理及びエタ
ノール沈澱処理を行った。得られた沈殿物を前記項目5
に記載の方法にて、ライゲーションし、次いで大腸菌J
M101(ATCC33876)へ形質転換を行った。
の方法によりDNAを単離した。これをSspI、EcoR
V及びPstIの制限酵素で単一又は二重消化して、もと
の組み換え体プラスミド pGLf 1に対してc−DNA
の向きが逆向きになっている組み換え体プラスミドを選
択し、 pGLf 10と命名した。組み換え体プラスミド p
GLf 10DNA10μg を、水90μLに溶解したものに、
Med緩衝液10μL及びSspI (ニューイングランドバイ
オラボ社製) 10ユニットを添加し、37℃で30分処理し、
部分分解物を得た。この部分分解物より前記項目9記載
の方法により、N末端より9個のアミノ酸をコードする
塩基配列を欠失したルシフェラーゼ遺伝子及びベクター
DNAの大部分を含有する4.0Kb のDNA断片2μg
を単離した。
溶解したものに、1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 5μ
L及びアルカリフォスファターゼ (宝酒造社製) 0.3ユ
ニット (1μL) を添加し、65℃で1時間処理し、常法
による除蛋白処理及びエタノール沈澱処理したのち、両
端を脱リン酸した4.0Kb のDNA断片を1μg 得た。
ターを含有するDNA断片の調製法について述べる。ト
リププロモーターを含有するプラスミド pKN206 DN
A〔「アグリク・バイオル・ケム」(Agric.Biol.Che
m.)、第50巻、第271 〜279 頁) (1986年) 記載のも
の〕10μg を、水90μLに溶解し、Med緩衝液10μL及
びClaI (宝酒造社製) 20ユニットを添加し、37℃で2
時間処理し、完全分解物を得た。これに前述のSspI10
ユニットを添加し、温度37℃で30分間処理し、SspIに
よる部分分解物を得た。これを常法による除蛋白処理及
びエタノール沈澱処理したのち、得られた沈澱を100μ
LのTE緩衝液に溶解し、前記項目9記載の方法によ
り、トリププロモーターの大部分を含有する500bのDN
A断片を単離した。
記4.0Kb のDNA断片に含まれるルシフェラーゼ遺伝
子は、塩基配列より推定したところN末端より9個のア
ミノ酸をコードする塩基配列を欠失している。また、上
記500bのDNA断片に含まれるトリププロモーターは、
SDとATG間の塩基配列の一部を欠失している。そこ
で、ルシフェラーゼのN末端より9個のアミノ酸をコー
ドする塩基配列及びトリププロモーターのSD−ATG
間の塩基配列を補うために、以下の2種の合成DNA
(配列番号3及び配列番号4)をベッグマン社製のシス
テム1プラスDNA合成機を用いて合成した。
のネンソルブ・プレプ(NENSORB PREP)を用いることによ
り、20μg の精製された合成DNAを夫々得た。これら
2種の合成DNA1μg を夫々水45μLに溶解し、X10
カイネーション緩衝液〔0.5Mトリス塩酸緩衝液(pH7.
6)/0.1M MgCl250mMジチオスレイトール/10mMAT
P〕5μLを添加し、更に、T4ポリヌクレオチドカイ
ネース (宝酒造社製) 10ユニット (1μL) を添加した
のち温度37℃で1時間処理した。これを常法による除蛋
白処理及びエタノール沈澱処理を行い、5'末端をリン酸
化した合成DNAをそれぞれ1μg ずつ得た。
ラスミドDNAの取得を行った。上記の脱リン酸化した
N末端より9個のアミノ酸をコードする塩基配列を欠失
したルシフェラーゼ遺伝子、ベクターDNAを含む4.0
Kb のDNA断片1μg、上記のトリププロモーターを
含む 500bのDNA断片1μg 及び上記2種のリン酸化
した合成DNA0.1μg を夫々8μLの水に溶解した。
これにX10ライゲーション緩衝液〔200mM MgCl2/660mM
トリス塩酸緩衝液(pH7.6)/10mMATP/150mM ジチオ
スレイトール〕1μLの及びT4DNAライゲース (宝
酒造社製)1ユニット (1μL) を添加し、温度16℃に
て16時間反応を行った。得られた反応液を用いて前記項
目5に記載の方法にて大腸菌JM101(ATCC33876)へ
形質転換を行い、得られた形質転換体より、前記項目5
に記載の方法にてプラスミドDNAを単離し、SspI、
EcoRV及びPstIの制限酵素で単一又は二重消化し
た。これを、0.7%アガロースゲル電気泳動にて展開
し、トリププロモーターによりルシフェラーゼ遺伝子を
完全にコードするルシフェラーゼ遺伝子を発現するプラ
スミドを得、該組み換え体プラスミドを、 pGLf 37と
命名した。また、該プラスミドを含有する大腸菌は大腸
菌JM101 (pGLf 37)と命名した。 16. 組み換え体プラスミド pGLf 37DNAの変異 組み換え体プラスミド pGLf 37DNA30μg を、ヒド
ロキシルアミン溶液〔0.8M 塩酸ヒドロキシルアミン/
0.1M リン酸緩衝液(pH6.0)/1mM EDTA〕100μLに
溶解し、65℃で2時間変異処理したのち、常法によりエ
タノール沈澱を行い沈澱物を回収した。この沈澱物をT
E緩衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)/1mM ED
TA〕に溶解し、ハナハン(Hana-han) の方法〔ディー
エヌエイ・クローニング(DNA Cloning) 、第1巻、
第109〜135頁(1985)〕により、大腸菌JM 101株(ATCC 33
876)を形質転換し、LB-amp寒天培地〔バクトトリプト
ン1%(W/V), 酵母エキス0.5%(W/V), NaCl 0.5%(W/
V), アンピシリン(50μg/ml)及び1.4%(W/V)寒天〕に
接種し、37℃で培養した。12時間後、出現してきたコロ
ニーをLB-amp培地〔バクトトリプトン1%(W/V),酵母
エキス0.5%(W/V),NaCl 0.5%(W/V),及びアンピシリン
(50μg/ml)〕3ml中、37℃で18時間振盪培養を行っ
た。この培養液 0.5mlを10mlの上記LB-amp培地に接種
し、37℃で4時間振盪培養したのち、8000r.p.m で10分
間の遠心分離操作により湿潤菌体を夫々20mgずつ得た。
2mMEDTA、1mMジテオスレイトール、及び 0.2mg/
mlプロタミン硫酸からなる緩衝液 0.9mlに懸濁し、更
に、これに、10mg/mlのリゾチーム溶液100μLを添加
し、氷中に15分間放置した。次に、この懸濁液を、メタ
ノール、ドライアイス浴中で凍結し、次いで温度25℃に
放置し、完全に解凍した。更に、12000r.p.m. で5分間
遠心分離操作を行うことにより、上清として粗酵素1ml
を得た。
含む粗酵素液を50℃で10分間熱処理し、その中の10μl
について、特開平1-141592号公報記載の方法で力価の測
定を行った。その結果野生型ゲンジボタルルシフェラー
ゼより熱安定性に優れているものを得た。更に、この粗
酵素液を特開平1-141592号公報記載の方法で精製し、上
記の方法で熱処理し、力価を測定した結果、野生型の精
製ルシフェラーゼより熱安定性に優れていることが判明
した。以上の如くして得られた耐熱性ルシフェラーゼを
コードする遺伝子の組み込まれた組み換え体プラスミド
DNAを pGLf37 T−M−2と命名し、該組み換え体
プラスミドDNAで形質転換された大腸菌、すなわち大
腸菌 (E. coli) JM101(p GLf37 T−M−2)は工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第3452号(FE
RM BP-3452)として寄託されている。
ルルシフェラーゼは野生型ホタルルシフェラーゼのアミ
ノ酸配列において217 位のスレオニンがイソロイシンに
置換されている。精製した本酵素100キロカウント(Kco
unt)含有する酵素液100 μl〔10%飽和硫酸アンモニウ
ム、0.2mM エチレンジアミン4酢酸2ナトリウム及び0.
2 %(w/v)アルブミンを含有する10mMリン酸緩衝液( p
H 7.6)〕を温度50℃で60分間保持して残存する酵素活
性を測定した。その結果本酵素は上記条件で65%の残存
酵素活性を保持していた。
ーゼについても上記と同様にして残存酵素活性を測定し
たところ活性は確認できなかった。 17. 部位特異的変換 次にゲンジボタルルシフェラーゼの217番目のスレオニ
ンを疎水性のアミノ酸であるバリン及びロイシンに変換
させる方法を記載する。
を制限酵素EcoRI, PstI (いずれも宝酒造社製)で二重
消化し、ルシフェラーゼc−DNAを含む2.1kbDNA
断片2.5μgを得た。このDNA断片をプラスミドpUC119
DNA(宝酒造社製)にサブクローンし、得られたプ
ラスミドDNAをpGPM-1と命名した。次いで組み換え体
プラスミドpGPM-1を項目5記載の方法で大腸菌JM101( AT
CC33876)に導入した。このようにして得られた大腸菌
にヘルパーファージM13K07(宝酒造社製)を感染させる
ことにより、メッシング(Messing)の方法〔メソズ
イン エンザイモロジー(Methods in Enzymology)、
第101巻、第20〜78項(1983)〕に従って1本鎖DNA
を調製した。得られた1本鎖DNAによる部位特異的変
換は、インビトロ ミュータジェネシス システム バ
ージョン2.0(アマシャム社製)を用いて行った。な
お、部位特異的変換のプライマーとして用いる為に、以
下の2種に合成DNAを項目15記載の方法で合成し
た。すなわち、バリン用のプライマーとして配列番号5
に示す合成DNAを、ロイシン用のプライマーとして配
列番号6に示す合成DNAを部位特異的変異に供するプ
ライマーとして夫々用いた。
シングは、ダイプライマー タックシークェンシング
キット(アプライド バイオシステムズ社製)を用いて
反応を行い、ABI373A DNAシーケンサー(アプライド
バイオシステムズ社製)で泳動、解析を行った。この
ようにして得られた部位特異的変換遺伝子は、野生型ホ
タルルシフェラーゼの217番目のアミノ酸がバリン、ロ
イシンに変換されているアミノ酸配列をコードしてお
り、前者をpGPM-1-Val、後者をpGPM-1-Leuと命名した。
びpGPM-1-LeuDNA10μgを制限酵素EcoRI, PstI (い
ずれも宝酒造社製)で二重消化し、ルシフェラーゼc−
DNAを含む2.1kbDNA断片を、夫々2.5μgずつ得
た。これらのDNA断片を夫々組み換え体プラスミドpG
Lf37DNAを制限酵素EcoRI, PstI(いずれも宝酒造社
製)で二重消化して得たルシフェラーゼc─DNAを含
まないベクター部分にクローニングして得られたプラス
ミドDNAをpGLf37-217Val,pGLf37-217Leuと命名し
た。
Val 及びpGLf37-217Leu を項目5記載の方法で大腸菌JM
101株(ATCC 33876)に導入し、大腸菌 (E. coli)JM10
1(pGLf37-217Val)及び大腸菌 (E. coli)JM101 (pGLf
37-217Leu)を得た。なお、これらの形質転換体のう
ち、大腸菌 (E. coli)JM101(pGLf37-217Val)は、微
工研条寄第3647号(FERM BP-3647)として、大腸菌 (E.
coli)JM101 (pGLf37-217Leu)は微工研条寄第3648号
(FERM BP-3648)として、それぞれ工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている。これらの形質転換体よ
り項目16記載の方法により粗酵素液を得、更にこの粗酵
素液を特開平1-141592号公報記載の方法で精製した。こ
のようにして得られた精製ルシフェラーゼを50℃で60分
間熱処理し、その中の10μLについて特開平1-141592号
公報記載の方法で残存する酵素活性を測定したところ、
大腸菌 (E. coli)JM101 (pGLf37-217Val)由来ルシフ
ェラーゼは、65%残存酵素活性を保持し、また、大腸菌
(E. coli)JM101 (pGLf37-217Leu)由来ルシフェラー
ゼは、70%残存酵素活性を保持していた。 18. 組み換え体プラスミド pHLf7DNAの変異 次にヘイケボタル(ルシオラ・ラテラリス(Luciola. l
ateralis) )のルシフェラーゼの 217番目のアラニンを
疎水性のアミノ酸であるバリン、ロイシン及びイソロイ
シンに変換させる方法を記載する。
た組み換え体プラスミド pHLf7を項目5記載の方法で
大腸菌JM101 (ATCC 33876)に導入した。なお、得られた
ルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼc-DNAの
みの全塩基配列を配列番号7に、また、当該c-DNAか
ら選定されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号8
に夫々示した。このようにして得られた大腸菌より項目
17記載の方法で1本鎖DNAを調製した。得られた1本
鎖DNAによる部位特異的変換は、インビトロミュータ
ジェネシスシステム バージョン−2.0 (アマシャム社
製) を用いて行なった。なお部位特異的変換のプライマ
ーとして用いる為に、以下の3種の合成DNAを項目15
記載の方法で合成した。すなわち、バリン用のプライマ
ーとして配列番号9に示す合成DNAを、ロイシン用プ
ライマーとして配列番号10に示す合成DNAを、イソロ
イシン用のプライマーとして配列番号11に示す合成DN
Aを部位特異的変異に供するプライマーとして夫々用い
た。また部位特異的変異遺伝子のシークエンシングは、
ダイプライマー タックシークエンシングキット (アプ
ライドバイオシステムズ社製) を用いて反応を行ない、
ABI 373A DNAシークエンサー (アプライドバイオシ
ステムズ社製) で泳動解析を行なった。このようにして
得られた組み換え体プラスミドにおけるルシフェラーゼ
の部位特異的変換遺伝子は、野生型ヘイケボタルルシフ
ェラーゼの 217番目のアミノ酸に相当する遺伝子部分が
バリン、ロイシン、イソロイシンに変換されているアミ
ノ酸をコードしており、夫々pHLf7-217Val、 pHLf7-217
Leu 、pHLf7-217Ileと命名した。
al、pHLf7-217Leu、pHLf7-217Ileを項目5記載の方法で
大腸菌 JM101株 (ATCC 33876) に導入し、大腸菌 (E. c
oli)JM101 (pHLf7-217Val)、大腸菌 (E. coli)JM101
(pHLf7-217Leu)、及び大腸菌 (E. coli)JM101 (pHLf7-
217Ile)、を得た。なお、これらの形質転換体のうち、
大腸菌 (E.coli) JM101 (pHLf7-217Val)は、微工研条寄
第3839号(FERM BP-3839)として;大腸菌 (E. coli)J
M101 (pHLf7-217Leu)は、微工研条寄第3840号(FERM BP
-3840)として;、大腸菌 (E. coli) JM101 (pHLf7-21
7Ile) は、微工研条寄第3841号(FERM BP-3841)とし
て、夫々工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。これらの形質転換体より項目16記載の方法により
粗酵素液を得、更に、この粗酵素液を特開平1-262791号
公報記載の方法で精製した。このようにして得られた精
製ルシフェラーゼを50℃で60分間熱処理し、その中の10
μl について特開平1-262791号公報記載の方法で残存す
る酵素活性を測定したところ、すべて65%以上の残存活
性を保持していた。
し著しく耐熱性を有するルシフェラーゼであることが判
った。
ゼ遺伝子、この遺伝子を組み換え体DNA及び該組み換
え体DNAを含む微生物により耐熱性ホタルルシフェラ
ーゼを製造する方法並びにそのようにして得られた新規
な耐熱性ホタルルシフェラーゼが提供された。そして、
本発明の方法により、耐熱性ホタルルシフェラーゼを効
率よく生産することができるので、本発明は産業上極め
て有用である。
素による切断地図。
素による切断地図。
Claims (7)
- 【請求項1】 野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸
配列において、217位のアミノ酸、又はゲンジボタル若
しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの217位と同等位
置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異されているアミノ
酸配列をコードする耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝
子。 - 【請求項2】 野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボ
タル若しくはゲンジボタルのルシフェラーゼである請求
項1記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項3】 疎水性アミノ酸がイソロイシン、ロイシ
ン、若しくはバリンである請求項1又は請求項2記載の
ホタルルシフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項4】 請求項1又は請求項2記載の耐熱性ホタ
ルルシフェラーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入したこ
とを特徴とする組み換え体DNA。 - 【請求項5】 請求項4記載の組み換え体DNAを含
み、耐熱性ホタルルシフェラーゼ生産能を有するエッシ
ェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物より
耐熱性ホタルルシフェラーゼを採取することを特徴とす
る耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法。 - 【請求項6】 野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸
配列において、217位のアミノ酸、又はゲンジボタル若
しくはヘイケボタルのルシフェラーゼの217位と同等位
置のアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異されていることを
特徴とする耐熱性ホタルルシフェラーゼ。 - 【請求項7】 野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケボ
タル若しくはゲンジボタルのルシフェラーゼである請求
項6記載の耐熱性ホタルルシフェラーゼ。
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EP92110808A EP0524448B1 (en) | 1991-06-27 | 1992-06-26 | Thermostable luciferase of a firefly, gene of a thermostable luciferase of a firefly, novel recombinant DNA, and process for the preparation of a thermostable luciferase of a firefly |
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