JP6493316B2 - 変異型甲虫ルシフェラーゼ、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、及び変異型甲虫ルシフェラーゼの製造方法 - Google Patents
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Description
[1] 野生型甲虫ルシフェラーゼに変異が導入された変異型甲虫ルシフェラーゼであり、
野生型甲虫ルシフェラーゼをコードするアミノ酸配列において、少なくとも下記(a)、(b)、及び(d)からなる群より選択される1種以上の変異を有しており、
0.9質量%の塩化ナトリウム溶液中におけるルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応による発光強度が、塩化ナトリウム非含有溶液中における発光強度の50%以上であることを特徴とする、変異型甲虫ルシフェラーゼ。
(a)野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における288位のバリンに相当するアミノ酸が、イソロイシンである変異、
(b)野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における376位のロイシンに相当するアミノ酸が、プロリンである変異、及び
(d)野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における488位のグルタミン酸に相当するアミノ酸が、バリンである変異。
[2] 前記野生型甲虫ルシフェラーゼが、野生型北米ホタルルシフェラーゼである、前記[1]の変異型甲虫ルシフェラーゼ。
[3] 前記野生型甲虫ルシフェラーゼが、野生型ヘイケボタルルシフェラーゼであり、
前記野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における288位のバリンは、野生型ヘイケボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における290位のバリンに相当し、
前記野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における376位のロイシンは、野生型ヘイケボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における378位のロイシンに相当し、
前記野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における488位のグルタミン酸は、野生型ヘイケボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における490位のグルタミン酸に相当する、前記[1]の変異型甲虫ルシフェラーゼ。
[4] 前記野生型甲虫ルシフェラーゼが、野生型ゲンジボタルルシフェラーゼであり、
前記野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における288位のバリンは、野生型ゲンジボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における290位のバリンに相当し、
前記野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における376位のロイシンは、野生型ゲンジボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における378位のロイシンに相当し、
前記野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における488位のグルタミン酸は、野生型ゲンジボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における490位のグルタミン酸に相当する、前記[1]の変異型甲虫ルシフェラーゼ。
[5] 前記(a)及び(d)の変異を有する、前記[1]〜[4]のいずれかの変異型甲虫ルシフェラーゼ。
[6] 前記(a)、(b)、及び(d)からなる群より選択される2種以上の変異を有する、前記[1]〜[4]のいずれかの変異型甲虫ルシフェラーゼ。
[7] 0.9質量%の塩化ナトリウム溶液中におけるルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応による発光強度が、野生型甲虫ルシフェラーゼの発光強度よりも大きい、前記[1]〜[6]のいずれかの変異型甲虫ルシフェラーゼ。
[8] 前記[1]〜[7]のいずれかの変異型甲虫ルシフェラーゼをコードする遺伝子。
[9] 前記[8]の遺伝子を含有する組換えベクター。
[10] 前記[9]の組換えベクターを保有する形質転換体。
[11] 前記[10]の形質転換体を培養して、培養物を得る培養工程と、前記培養工程により得られた培養物から変異型甲虫ルシフェラーゼを回収する回収工程と、を有する、変異型甲虫ルシフェラーゼの製造方法。
また、本発明に係る遺伝子、組換えベクター、形質転換体、及び変異型甲虫ルシフェラーゼの製造方法を用いることにより、本発明に係る変異型甲虫ルシフェラーゼを効率よく生産することができる。
本発明に係る変異型甲虫ルシフェラーゼは、野生型甲虫ルシフェラーゼに変異が導入された変異型甲虫ルシフェラーゼであって、0.9質量%の塩化ナトリウム溶液中における発光強度が、塩化ナトリウム非含有溶液中における発光強度の50%以上である変異型甲虫ルシフェラーゼである。本発明に係る変異型甲虫ルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性は、残存活性が50%以上であればよく、60%以上であることが好ましく、70%以上であることがより好ましく、80%以上であることがさらに好ましく、90%以上であることがよりさらに好ましい。
(a)野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における288位のバリンに相当するアミノ酸が、イソロイシン、ロイシン、又はフェニルアラニンである変異。
(b)野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における376位のロイシンに相当するアミノ酸が、プロリンである変異。
(c)野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における455位のグルタミン酸に相当するアミノ酸が、バリン、アラニン、セリン、ロイシン、イソロイシン、又はフェニルアラニンである変異。
(d)野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における488位のグルタミン酸に相当するアミノ酸が、バリン、アラニン、セリン、ロイシン、イソロイシン、又はフェニルアラニンである変異。
(1)野生型甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列に前記(a)、(b)、(c)及び(d)からなる群より選択される1種以上の変異が導入されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
(2)野生型甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列に、前記(a)、(b)、(c)及び(d)からなる群より選択される1種以上の変異と、1又は複数のアミノ酸を欠失、置換又は付加する変異を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
(3)野生型甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列との配列同一性が80%以上であり、前記(a)、(b)、(c)及び(d)からなる群より選択される1種以上の変異を有するアミノ酸配列からなり、かつルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
本発明に係る変異型甲虫ルシフェラーゼをコードする遺伝子(変異型甲虫ルシフェラーゼ遺伝子)は、野生型甲虫ルシフェラーゼ遺伝子を適宜改変することにより得ることができる。本発明に係る変異型甲虫ルシフェラーゼ遺伝子は、野生型甲虫ルシフェラーゼ遺伝子に変異が導入されるように相当するアミノ酸をコードするコドンを改変したものであってもよく、さらに縮重コドンを宿主のコドン使用頻度の高いものに改変したものであってもよい。
本発明に係る組換えベクターは、本発明に係る変異型甲虫ルシフェラーゼ遺伝子を含有する。
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る組換えベクターを保有する。
本発明に係る変異型甲虫ルシフェラーゼの製造方法は、本発明に係る形質転換体を培養して、培養物を得る培養工程と、前記培養工程により得られた培養物から変異型甲虫ルシフェラーゼを回収する回収工程と、を有する。当該製造方法により、本発明に係る変異型甲虫ルシフェラーゼを得ることができる。
野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における288位のバリンがイソロイシンに置換された変異型北米ホタルルシフェラーゼ(変異体(V288I))、野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における376位のロイシンがプロリンに置換された変異型北米ホタルルシフェラーゼ(変異体(L376P))、野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における455位のグルタミン酸がバリンに置換された変異型北米ホタルルシフェラーゼ(変異体(E455V))、野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における488位のグルタミン酸がバリンに置換された変異型北米ホタルルシフェラーゼ(変異体(E488V))、野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における288位のバリンがイソロイシンに、376位のロイシンがプロリンにそれぞれ置換された変異型北米ホタルルシフェラーゼ(変異体(V288I+L376P))、野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における288位のバリンがイソロイシンに、488位のグルタミン酸がバリンにそれぞれ置換された変異型北米ホタルルシフェラーゼ(変異体(V288I+E488V))、野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における288位のバリンがイソロイシンに、376位のロイシンがプロリンに、488位のグルタミン酸がバリンにそれぞれ置換された変異型北米ホタルルシフェラーゼ(変異体(V288I+L376P+E488V))を製造し、そのルシフェラーゼ活性(発光強度)を測定した。
まず、野生型北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子(cDNA)(配列番号5)を市販のプラスミド(pGL2-Basic Vector(プロメガ社製))に組込んだ組換えプラスミドを鋳型とし、制限酵素NcoI認識配列を含有するプライマー(5'-gactccatggaagacgccaaaaac-3'、配列番号6)と制限酵素XhoI認識配列を含有するプライマー(5'-gacactcgagcaatttggactttccgcc-3'、配列番号7)とTITANIUM Taq DNAポリメラーゼ(Clontech社製)を用いてPCRを行い、両端に制限酵素認識配列が付加されている野生型北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するDNA断片を得た。得られたDNA断片の塩基配列は、DTCS Quick Start Master Mix キット及び泳動解析装置CEQ8000(いずれも Beckman Coulter社製)を用いて決定した。当該DNA断片を制限酵素NcoI及びXhoIで切断し、これを、予めNcoI及びXhoIで切断したプラスミド(pET-28a(+) plasmid DNA(Novagen社製))に、DNA Ligation Kit(BioDynamics Laboratory社製)を用いて組み込み、C末端側にヒスチジンタグが付加された野生型北米ホタルルシフェラーゼを発現させるための組換えベクターを製造した。なお、pET-28a(+) は、T7プロモーター及びT7ターミネーターを含有し、発現する目的タンパク質のC末端側にヒスチジンタグが付加されるように、クローニング部位の近傍にヒスチジンタグをコードする遺伝子を含有するベクターである。
各変異型北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換えベクターを、塩化カルシウム法により、ゲノムDNA中にT7 RNAポリメラーゼ遺伝子が組み込まれている大腸菌HMS174(DE3)株(Novagen社製)に導入し、この大腸菌を、30μg/mL カナマイシン含有選択寒天培地上で平板培養し、形質転換大腸菌を選抜した。
カナマイシン選抜された形質転換大腸菌を、振盪培養機(高崎科学器械社製)を用いて、37℃の下、200mLの2×YT培地(30μg/mL カナマイシンを含有する。)中で2.5時間振盪培養した後、培地中のIPTG濃度が0.1mMになるように100mM IPTGを200μL加え、25℃で6時間発現誘導を行った。なお、IPTGは、lacリプレッサーによる発現抑制を解除し、T7 RNAポリメラーゼを誘導する発現誘導物質である。
得られた変異型北米ホタルルシフェラーゼのタンパク質定量は、Bradford法に基づく Bio-Rad Protein Assay(BIORAD社製)を用いて、IgGを標準として行った。変異型北米ホタルルシフェラーゼ(20μg/mL)を含有する反応バッファー50μLを96穴ウェルプレート(Nunc社製 ルミヌンクプレート)に加えた後、マイクロプレートリーダー(Perkin-Elmer社製 ARVO MX)付属のインジェクターを用いて、塩化ナトリウム含有基質バッファー(1.8質量% 塩化ナトリウム、2×10−6M D−ホタルルシフェリン(和光純薬工業社製)、2×10−7M ATP、及び10mM MgCl2を含有する50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4))50μL又は塩化ナトリウム不含基質バッファー(2×10−6M D−ホタルルシフェリン(和光純薬工業社製)、2×10−7M ATP、及び10mM MgCl2を含有する50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4))50μLを加えた。次いで、前記マイクロプレートリーダーで発光強度を測定した。塩化ナトリウム含有基質バッファーを添加した反応溶液の塩化ナトリウムの終濃度は0.9質量%であった。野生型北米ホタルルシフェラーゼについても、変異型北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換えベクターの代わりに、野生型北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子(cDNA)を含有する組換えベクターを用いたこと以外は、変異型北米ホタルルシフェラーゼと同様にして、形質転換大腸菌を作製し、酵素の採取及び精製を行い、酵素の発光強度を測定した。
本発明に係る変異型甲虫ルシフェラーゼについて、ルシフェラーゼ活性に対する塩化ナトリウム濃度の影響を調べた。甲虫ルシフェラーゼとしては、実施例1で調製した野生型北米ホタルルシフェラーゼ、変異体(V288I+L376P)及び変異体(V288I+E488V)を用いた。
本発明に係る変異型甲虫ルシフェラーゼを用いて、エンドトキシンを検出した。甲虫ルシフェラーゼとしては、実施例1で調製した野生型北米ホタルルシフェラーゼ及び変異体(V288I+E488V)を用いた。
Claims (11)
- 野生型甲虫ルシフェラーゼに変異が導入された変異型甲虫ルシフェラーゼであり、
野生型甲虫ルシフェラーゼをコードするアミノ酸配列において、少なくとも下記(a)、(b)、及び(d)からなる群より選択される1種以上の変異を有しており、
0.9質量%の塩化ナトリウム溶液中におけるルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応による発光強度が、塩化ナトリウム非含有溶液中における発光強度の50%以上であることを特徴とする、変異型甲虫ルシフェラーゼ。
(a)野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における288位のバリンに相当するアミノ酸が、イソロイシンである変異、
(b)野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における376位のロイシンに相当するアミノ酸が、プロリンである変異、及び
(d)野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における488位のグルタミン酸に相当するアミノ酸が、バリンである変異。 - 前記野生型甲虫ルシフェラーゼが、野生型北米ホタルルシフェラーゼである、請求項1に記載の変異型甲虫ルシフェラーゼ。
- 前記野生型甲虫ルシフェラーゼが、野生型ヘイケボタルルシフェラーゼであり、
前記野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における288位のバリンは、野生型ヘイケボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における290位のバリンに相当し、
前記野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における376位のロイシンは、野生型ヘイケボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における378位のロイシンに相当し、
前記野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における488位のグルタミン酸は、野生型ヘイケボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における490位のグルタミン酸に相当する、請求項1に記載の変異型甲虫ルシフェラーゼ。 - 前記野生型甲虫ルシフェラーゼが、野生型ゲンジボタルルシフェラーゼであり、
前記野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における288位のバリンは、野生型ゲンジボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における290位のバリンに相当し、
前記野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における376位のロイシンは、野生型ゲンジボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における378位のロイシンに相当し、
前記野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における488位のグルタミン酸は、野生型ゲンジボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における490位のグルタミン酸に相当する、請求項1に記載の変異型甲虫ルシフェラーゼ。 - 前記(a)及び(d)の変異を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異型甲虫ルシフェラーゼ。
- 前記(a)、(b)、及び(d)からなる群より選択される2種以上の変異を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異型甲虫ルシフェラーゼ。
- 0.9質量%の塩化ナトリウム溶液中におけるルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応による発光強度が、野生型甲虫ルシフェラーゼの発光強度よりも大きい、請求項1〜6のいずれか一項に記載の変異型甲虫ルシフェラーゼ。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の変異型甲虫ルシフェラーゼをコードする遺伝子。
- 請求項8に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項9に記載の組換えベクターを保有する形質転換体。
- 請求項10に記載の形質転換体を培養して、培養物を得る培養工程と、
前記培養工程により得られた培養物から変異型甲虫ルシフェラーゼを回収する回収工程と、
を有する、変異型甲虫ルシフェラーゼの製造方法。
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