JPH05155885A - New substance hp530c2 and its production - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain the subject new substance, having antimicrobial and antitumor actions and expected as an antimicrobial agent or an anticancer agent by culturing a microorganism, belonging to the genus Streptomyces and capable of producing a substance HP530C2 and collecting the resultant product from a culture. CONSTITUTION:A microorganism [e.g. Streptomyces sp. HP530 strain (FERM P-2786)], belonging to the genus Streptomyces and capable of producing a substance HP530C2 is cultured in a culture medium at 30 deg. for 4 days by shaking culture to prepare a primary seed culture solution, which is then inoculated into a culture medium and cultured at 30 deg. for 4 days by shaking culture to afford a secondary seed culture solution. The resultant culture solution is subsequently inoculated into a jar fermenter and cultured at 30 deg. for 4 days by spinner culture with aeration and the prepared culture solution is then subjected to centrifuging and filtering treatment to immerse a cake containing the microbial cells in acetone and carry out extracting treatment. The obtained extract solution is subsequently concentrated and further subjected to extraction treatment with ethyl acetate. The extract is purified by silica get chromatography to afford the objective new substance HP530C2, expressed by the formula and having antimicrobial and antitumor actions.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、新規な抗腫瘍性物質Ｈ
Ｐ５３０Ｃ₂ 物質（以下、ＨＰ５３０Ｃ₂ と省略す
る。）またはその医薬的に許容される塩およびそれらの
製造法に関する。The present invention relates to a novel antitumor substance H.
The present invention relates to a P530C ₂ substance (hereinafter abbreviated as HP530C ₂ ) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a method for producing them.

【０００２】[0002]

【従来の技術】従来より微生物が、広範な化学構造上の
特徴を有する種々の抗腫瘍性物質を生産することが知ら
れている。その中の一群として、強い抗腫瘍性を有する
プルラマイシン群に属する抗腫瘍性物質がいくつか報告
されている。例えば、プルラマイシンＡ（ザ・ジャーナ
ル・オブ・アンティバイオティックス シリーズＡ，９
巻，７５頁，１９５６年）、ネオプルラマイシン（ザ・
ジャーナル・オブ・アンティバイオティックス，２３
巻，３５４頁，１９７０年；同３０巻，１１４３頁，１
９７７年）、キダマイシン（ザ・ジャ−ナル・オブ・ア
ンティバイオティックス，２４巻，５９９頁，１９７１
年）、ヘダマイシン（ヘルベチカ・チミカ・アクタ，６
０巻，８９６頁，１９７１年）、ルビフラビン類（ヘル
ベチカ・チミカ・アクタ，６３巻，２４４６頁，１９８
０年；同７０巻，１２１７頁，１９８７年）、ＳＳ２１
０２０類（特開昭６１−２７７６８２号公報）、アンキ
ノマイシン（ザ・ジャーナル・オブ・アンティバイオテ
ィックス，４２巻，１４９頁，１９８９年）、アルトロ
マイシン（ザ・ジャーナル・オブ・アンティバイオティ
ックス，４３巻，２２３頁，１９９０年）、ＤＣ９２−
Ｂ（ザ・ジャーナル・オブ・アンティバイオティック
ス，４３巻，４８５頁，１９９０年）などが知られてい
る。2. Description of the Related Art It has been conventionally known that microorganisms produce various antitumor substances having a wide range of chemical structural characteristics. As one group among them, some antitumor substances belonging to the pullulamycin group having strong antitumor properties have been reported. For example, pullulamycin A (The Journal of Antibiotics Series A, 9
Vol. 75, 1956), neopururamycin (The ・
Journal of Antibiotics, 23
Volume, 354, 1970; ibid. 30, 1143, 1
977), Kidamycin (The Journal of Antibiotics, 24, 599, 1971).
Year), hedamycin (Helvetica, Chimica, Acta, 6
0, 896, 1971), rubiflavins (Helvetica, Timika Actor, 63, 2446, 198).
0; ibid., 70, 1217, 1987), SS21
020s (JP-A-61-277682), Anquinomycin (The Journal of Antibiotics, 42, 149, 1989), Althromycin (The Journal of Antibiotics, 43, 223, 1990), DC92-
B (The Journal of Antibiotics, 43, 485, 1990) and the like are known.

【０００３】本発明者らは、新規な有用物質を得るため
天然土壌より多くの微生物を分離して抗腫瘍性を有する
物質の検索を行った結果、千葉県市川市の土壌より分離
したストレプトミセス・スピーシーズ（Streptomyces s
p.）・ＨＰ５３０株（微工研条寄第2786号；FERM BP-27
86）が優れた抗腫瘍性を示す新規な化合物ＨＰ５３０
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨ物質を生産すること
を見出し、先に特許出願した（特願平２−６４００８
号、同２−２０９３１０号、同２−２３３３１５号、同
２−３２５８６６号、同２−３２５８６７号）。さら
に、いくつかの誘導体についても特許出願した（特願平
２−３２５８６８号、同３−７２０６２号）。The present inventors have conducted a search for substances having antitumor properties by separating more microorganisms from natural soil in order to obtain novel useful substances, and as a result, Streptomyces isolated from soil in Ichikawa City, Chiba Prefecture.・ Streptomyces s
p.) ・ HP530 strain (Ministry of Industrial Science and Technology Article 2786; FERM BP-27
86), a novel compound HP530 showing excellent antitumor properties
It was found to produce substances A, B, C, D, E, F, G and H, and a patent application was previously filed (Japanese Patent Application No. 2-40008).
No. 2-209310, No. 2-233315, No. 2-325866, No. 2-32567). Furthermore, patent applications have been filed for some derivatives (Japanese Patent Application Nos. 2-325868 and 3-72062).

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】従来の抗腫瘍性物質は
一般に該物質の有する活性の他に毒性が強いという共通
した問題点を持っている。本発明は、常に要求されてい
るところの、公知の抗腫瘍性物質よりも有効な医薬と成
りうる新規抗腫瘍性化合物を提供し、さらにその製造法
を確立することにより、この問題点を解決しようとする
ものである。The conventional antitumor substances generally have the common problem that they are highly toxic in addition to the activity possessed by the substances. The present invention solves this problem by providing a novel antitumor compound, which is always required, and which can be a drug more effective than known antitumor substances, and by establishing a production method thereof. Is what you are trying to do.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべくさらに抗腫瘍性ＨＰ５３０Ａ、Ｂ、Ｃ、
Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨ物質生産菌培養物を検索したとこ
ろ、本菌株は優れた抗腫瘍活性を有する新規なＨＰ５３
０Ｃ₂ を生産することを見出し、その物理化学的性質並
びに生物学的性質を明らかにすることにより本発明を完
成した。[Means for Solving the Problems] In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have further studied antitumor HP530A, B, C,
When the cultures of D, E, F, G and H substance producing bacteria were searched, this strain was found to be a novel HP53 having excellent antitumor activity.
The present invention has been completed by discovering that 0C ₂ is produced and clarifying its physicochemical properties and biological properties.

【０００６】すなわち、本発明は下記の構造式で示され
る新規なＨＰ５３０Ｃ₂ 及びその医薬的に許容される塩That is, the present invention provides a novel HP530C ₂ represented by the following structural formula and pharmaceutically acceptable salts thereof.

【化２】 を提供するものであり、さらにストレプトミセス属に属
するＨＰ５３０Ｃ₂ を生産する微生物を培養し、その培
養物中より上記構造式で示されるＨＰ５３０Ｃ₂ を採取
することを特徴とするＨＰ５３０Ｃ₂ 及びその医薬的に
許容される塩の製造法を提供するものである。[Chemical 2] There is provided a culturing a microorganism producing the HP530C ₂ further belonging to the genus Streptomyces, HP530C ₂ and pharmaceutically and collecting the HP530C ₂ represented by the structural formula below its culture The present invention provides a method for producing an acceptable salt.

【０００７】本発明のＨＰ５３０Ｃ₂ を生産するストレ
プトミセス・スピーシーズ・ＨＰ５３０株は、以下のよ
うな菌学的性質を有する。 (1) 形態的特徴 栄養菌糸は各種培地上でよく発達し、分断は起こさな
い。分枝した栄養菌糸から形成される気菌糸はイエロー
系あるいはホワイト系の色調を呈し10〜50個以上の胞子
の連鎖が認められ、直線状から曲線状をしている。胞子
表面は平滑でその大きさは0.6 ×1 〜1.2 μm で円柱状
である。菌核，胞子のう，遊走子は見出されない。The Streptomyces species HP530 strain producing HP530C ₂ of the present invention has the following mycological properties. (1) Morphological characteristics Vegetative hyphae develop well on various media and do not cause fragmentation. The aerial hyphae formed from branched vegetative hyphae have a yellow or white color tone, and a chain of 10 to 50 or more spores is observed, and they are linear to curved. The spore surface is smooth and its size is 0.6 × 1 to 1.2 μm, and it is cylindrical. No sclerotium, sporangium, or zoospores are found.

【０００８】(2) 各種培地における性状 各種培地上における培養性状を第１表に示す。(2) Properties of various media Table 1 shows the properties of culture on various media.

【０００９】[0009]

【表１】 [Table 1]

【００１０】色調として（ ）内に示す番号は、アイエ
スシーシー・エヌビーエス・カラー・ネーム・チャート
（ISCC-NBS Color-Name chart ）に記載のものを用い、
28℃、２週間目の各培地における観察の結果である。The numbers shown in parentheses () for the color tones are those shown in the ISCC-NBS Color-Name chart.
28 shows the results of observation in each medium at 28 ° C. for 2 weeks.

【００１１】(3) 生理的性状 生育温度範囲（酵母エキス・麦芽エキス寒天、１４日
間培養）： １５〜３７℃ 生育ｐＨ範囲（酵母エキス・麦芽エキス寒天、２８
℃、１４日間培養）： ５. ５〜１１. ４ ゼラチンの液化 ： 陽性 デンプンの加水分解 ： 陽性 脱脂牛乳の凝固 ： 陽性 脱脂牛乳のペプトン化 ： 陽性 硝酸塩の還元 ： 陽性 セルロースの分解 ： 陰性 炭素源の利用性（プリドハム・ゴドリープ寒天、２８
℃、１４日間培養）： 利用する；L-アラビノース、D-
キシロース、L-ラムノース、D-グルコース、D-ガラクト
ース、D-フルクトース、D-マンニトール、サリシン 利用しない；シュークロ−ス、ラフィノース、イノシト
ール(3) Physiological Properties Growth temperature range (yeast extract / malt extract agar, 14 days culture): 15 to 37 ° C. Growth pH range (yeast extract / malt extract agar, 28)
C., 14 days culture): 5.5-11.4 Gelatin liquefaction: Positive starch hydrolysis: Positive Skim milk coagulation: Positive Skim milk peptone conversion: Positive Nitrate reduction: Positive cellulose degradation: Negative carbon source Availability (Pridham-God Reap Agar, 28
C., culture for 14 days): Use; L-arabinose, D-
Xylose, L-rhamnose, D-glucose, D-galactose, D-fructose, D-mannitol, salicin Not used; sucrose, raffinose, inositol

【００１２】(4) 細胞壁組織 全菌体中のジアミノピメリン酸を分析した結果、ＬＬ型
であった。以上、ＨＰ５３０株の菌学的性状を要約する
と、ＬＬ- ジアミノピメリン酸を有し、気菌糸の形態は
直線状または曲線状で、胞子の表面は平滑である。気菌
糸の色調はイエロー系を呈し、栄養菌糸はイエロー系ま
たはパープル系の色調を呈する。可溶性色素は、ペプト
ン・酵母寒天でブラウンからオレンジ系の色素を生産す
る。(4) Cell Wall Tissue As a result of analysis of diaminopimelic acid in whole cells, it was found to be LL type. As described above, the bacteriological properties of the HP530 strain are summarized as follows. It has LL-diaminopimelic acid, the shape of the aerial hyphae is linear or curved, and the surface of spores is smooth. The color tone of aerial hyphae is yellow, and the nutritional hyphae is yellow or purple. Soluble pigments produce brown to orange pigments on peptone-yeast agar.

【００１３】これらの諸性質からＨＰ５３０株は、スト
レプトミセス（Streptomyces）属に属する菌株と考えら
れ、「バージーズ・マニュアル・オブ・デターミナテイ
ブ・バクテリオロジー（ Bergey's Manual of Determin
ative Bacteriology）」第８版及びＩＳＰ報告「インタ
ーナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・
バクテリオロジー（International Journal of Systema
tic Bacteriology）」第１８巻、６９頁、２７９頁（１
９６８年）、同１９巻、３９１頁（１９６９年）、同２
２巻、２６５頁（１９７２年）より検索した結果、スト
レプトミセス・フルオレセンス（Streptomycesfluoresc
ens）、ストレプトミセス・プニセウス（Streptomyces
puniceus ）が近縁種として挙げられる。From these properties, the HP530 strain is considered to be a strain belonging to the genus Streptomyces, and is referred to as "Birgie's Manual of Determinant".
B. Bacteriology (Bergey's Manual of Determin
8th Edition and ISP Report “International Journal of Systematic
Bacteriology (International Journal of Systema
tic Bacteriology) "Vol. 18, pp. 69, 279 (1
968), 19: 391 (1969), 2
As a result of searching from Volume 2, 265 (1972), Streptomyces fluoresc
ens), Streptomyces
puniceus) is a closely related species.

【００１４】しかし、ストレプトミセス・フルオレセン
スは基底菌糸の色調において本菌株とは異なり、ストレ
プトミセス・プニセウスはL-アラビノースを利用せず、
ブルーの可溶性色素を生産する点で異なる。However, Streptomyces fluorescens differs from this strain in the color tone of the basal hyphae, and Streptomyces puniceus does not utilize L-arabinose,
They differ in that they produce a blue soluble pigment.

【００１５】したがって、本菌株はストレプトミセス属
に属する新菌株と考えられる。本菌株はストレプトミセ
ス・スピーシーズ（Streptomyces sp.）・ＨＰ５３０と
命名され、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条
寄第2786号（FERMBP-2786）として寄託されている。Therefore, this strain is considered to be a new strain belonging to the genus Streptomyces. This strain is named Streptomyces sp. HP530 and has been deposited at the Institute of Microbial Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology as Micro Engineering Research Article No. 2786 (FERM BP-2786).

【００１６】本発明におけるＨＰ５３０Ｃ₂ は、上記Ｈ
Ｐ５３０株を、微生物が通常利用できる栄養源を含有す
る培地に接種し、好気培養条件下で培養することによ
り、生産することができる。ＨＰ５３０株は、他の多く
の放線菌に観察されるようにその性状が変化しやすいこ
とから、ＨＰ５３０Ｃ₂ 生産株としては、上記ＨＰ５３
０株に加え、自然変異株、人工変異株（紫外線照射，コ
バルト６０照射，化学変異誘起剤添加等による）、さら
には形質接合体，遺伝子組換え体であっても、ＨＰ５３
０Ｃ₂ を生産する能力を有するものは、すべて本発明に
使用できる。The HP530C ₂ in the present invention is the above H
The P530 strain can be produced by inoculating a medium containing a nutrient source normally used by microorganisms and culturing under aerobic culture conditions. Since the properties of the HP530 strain are likely to change as observed in many other actinomycetes, the HP530C ₂ producing strain is the above-mentioned HP53 strain.
In addition to 0 strains, HP53, natural mutants, artificial mutants (by ultraviolet irradiation, cobalt 60 irradiation, addition of chemical mutagen, etc.)
Anything capable of producing 0C ₂ can be used in the present invention.

【００１７】栄養培地としては、一般に放線菌の培養に
使用される合成培地，半合成培地および天然培地のいず
れも使用可能である。例えば炭素源として、グルコー
ス，フラクトース，グリセリン，澱粉，デキストリン，
糖蜜，動植物油、さらには菌の資化性により、炭化水
素，アルコール類等も単独または適宜組合せて使用する
ことができる。窒素源としては、大豆粉，ペプトン，小
麦胚芽，肉エキス，酵母エキス，綿実粕、コーンスチー
プリカー，オートミール，ファーマメディア（商品
名），硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，硝酸ソー
ダ、硝酸アンモニウム，尿素，グルタミン酸ソーダなど
の天然物あるいは有機、無機の窒素化合物が、単独また
は組合わせて用いられる。As the nutrient medium, any of synthetic medium, semi-synthetic medium and natural medium generally used for culturing actinomycetes can be used. For example, as carbon sources, glucose, fructose, glycerin, starch, dextrin,
Depending on the assimilation ability of molasses, animal and vegetable oils, and fungi, hydrocarbons, alcohols and the like can be used alone or in an appropriate combination. As nitrogen sources, soybean flour, peptone, wheat germ, meat extract, yeast extract, cottonseed meal, corn steep liquor, oatmeal, Pharmamedia (trade name), ammonium sulfate, ammonium chloride, sodium nitrate, ammonium nitrate, urea, sodium glutamate. Natural products such as and organic and inorganic nitrogen compounds are used alone or in combination.

【００１８】そのほか必要に応じ、例えば炭酸カルシウ
ム，塩化ナトリウム，硫酸銅，塩化マンガン，塩化亜鉛
をはじめ、ナトリウム，カリウム，カルシウム，マグネ
シウム，コバルト，塩素，燐酸，硫酸及びその他のイオ
ンを生成することができる無機塩類を、単独または適宜
組合わせることにより、用いることは有効である。さら
に、ＨＰ５３０株の生育を促進する物質やＨＰ５３０Ｃ
₂ の生産を促進する物質、そして一般的な消泡剤シリコ
ーンＫＭ７３（商品名），アデカノール（商品名）など
も適宜添加することができる。In addition, if necessary, for example, calcium carbonate, sodium chloride, copper sulfate, manganese chloride, zinc chloride, sodium, potassium, calcium, magnesium, cobalt, chlorine, phosphoric acid, sulfuric acid and other ions can be generated. It is effective to use the inorganic salts that can be used alone or in an appropriate combination. Furthermore, substances that promote the growth of the HP530 strain and HP530C
A substance that promotes the production of ₂ and a general antifoaming agent such as silicone KM73 (trade name) and Adecanol (trade name) may be added as appropriate.

【００１９】ＨＰ５３０Ｃ₂ 生産菌株の培養法として
は、一般に抗生物質などの生理活性物質生産に用いられ
る方法が利用されるが、好気液体培養法、特に深部撹拌
培養法が最も適している。培養に適当な温度は２５〜３
７℃であるが、一般に３０℃で培養するのが望ましい。
ＨＰ５３０Ｃ₂ の生産は、培地あるいは培養条件により
異なるが、通常３〜６日でその蓄積量が最高に達する。
培養物中のＨＰ５３０Ｃ₂ の蓄積量が最高に達した時点
で培養を停止し、培養物から目的物質を回収・精製す
る。As a method for culturing the HP530C ₂ producing strain, a method generally used for the production of physiologically active substances such as antibiotics is used, but an aerobic liquid culture method, particularly a deep agitation culture method is most suitable. Suitable temperature for culture is 25-3
Although the temperature is 7 ° C, it is generally desirable to culture at 30 ° C.
The production of HP530C ₂ varies depending on the medium or culture conditions, but the accumulated amount usually reaches the maximum in 3 to 6 days.
When the accumulated amount of HP530C ₂ in the culture reaches the maximum, the culture is stopped, and the target substance is recovered and purified from the culture.

【００２０】本発明におけるＨＰ５３０Ｃ₂ の培養物か
らの回収・精製は後記実施例に示すように本物質が脂溶
性であるという特性を考慮して実施することができる。
すなわち、培養物を濾過または遠心分離等により培養濾
液と菌体を含むケーキに分け、それぞれまたはどちらか
一方から各種溶媒（アセトン，クロロホルム，酢酸エチ
ルなど）を用いて本物質の抽出を行う。溶媒に移行した
ＨＰ５３０Ｃ₂ は以下の様な各種手法を用いて単離・精
製することができる。The recovery and purification of HP530C _{2 from} the culture in the present invention can be carried out in consideration of the characteristic that this substance is fat-soluble, as shown in Examples below.
That is, the culture is divided into a culture filtrate and a cake containing cells by filtration or centrifugation, and this substance is extracted from each or either of them by using various solvents (acetone, chloroform, ethyl acetate, etc.). HP530C _{2 that} has been transferred to the solvent can be isolated and purified using various methods as described below.

【００２１】すなわち、合成吸着剤（ダイヤイオンＨＰ
−２０／三菱化成社製、アンバーライトＸＡＤ−２／ロ
−ム・アンド・ハ−ス社製など）、ゲル濾過剤（セファ
デックスＬＨ−２０／ファルマシア社製、トヨパールＨ
Ｗ−４０／東ソー社製など）、さらにシリカゲル，セル
ロース，アルミナ，化学修飾シリカゲルなどの担体を単
独あるいは適宜組合わせることによって有効に行われ
る。That is, a synthetic adsorbent (Diaion HP
-20 / manufactured by Mitsubishi Kasei Co., Amberlite XAD-2 / Rom & Haas Co., etc., gel filtration agent (Sephadex LH-20 / Pharmacia Co., Toyopearl H)
W-40 / manufactured by Tosoh Co., Ltd.), or a carrier such as silica gel, cellulose, alumina, or chemically modified silica gel, alone or in an appropriate combination.

【００２２】以上のような方法により得られたＨＰ５３
０Ｃ₂ は、次のような物理化学的性状を示す。 イ）分子量および分子式 ７５８ ， Ｃ₄₃Ｈ₅₄Ｎ₂ Ｏ₁₀ ロ）マススペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ／Pos ．） （Ｍ＋Ｈ）+ ｍ／ｚ ７５９ ハ）高速液体クロマトグラフィー カプセルパックＣ₁₈カラム(4.6φ×250mm ，資生堂社
製）で0.15% ＫＨ₂ ＰＯ₄(pH3.5 ）／メタノール＝35／
65の系で流速１ml／分の時、保持時間6.7 分で溶出し
た。HP53 obtained by the above method
0C ₂ has the following physicochemical properties. A) Molecular weight and molecular formula 758, C ₄₃ H ₅₄ N ₂ O ₁₀ b) Mass spectrum (FAB-MS / Pos.) (M + H) + m / z 759 c) High performance liquid chromatography Capsule _C18 column (4.6φ ×) 250 mm, made by Shiseido Co., Ltd.) 0.15% KH ₂ PO ₄ (pH 3.5) / methanol = 35 /
Elution with a system of 65 at a flow rate of 1 ml / min with a retention time of 6.7 min.

【００２３】ニ）紫外部吸収スペクトル メタノール溶液中で測定したスペクトルは第１図に示す
とおりである。 ホ）赤外部吸収スペクトル 臭化カリウム錠で測定したスペクトルは第２図に示すと
おりである。 ヘ）水素核核磁気共鳴スペクトル 重クロロホルム溶液中で測定した４００MHz 水素核核磁
気共鳴スペクトルは第３図に示すとおりである。 ト）炭素核核磁気共鳴スペクトル 重クロロホルム溶液中でＴＭＳを基準として測定した１
００MHz 炭素核核磁気共鳴スペクトルは以下に示すとお
りである。D) Ultraviolet absorption spectrum The spectrum measured in a methanol solution is as shown in FIG. E) Infrared absorption spectrum The spectrum measured with a potassium bromide tablet is as shown in FIG. F) Hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum A 400 MHz hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum measured in a deuterated chloroform solution is shown in FIG. G) Carbon Nuclear Nuclear Magnetic Resonance Spectrum Measured in deuterated chloroform solution with TMS as reference 1
The 00MHz carbon nuclear magnetic resonance spectrum is shown below.

【００２４】δ(ppm) ：188.0(s),183.6(s),179.3(s),1
72.3(s),170.6(s),159.3(s),156.4(s),149.6(s),140.5
(s),138.3(s),137.1(s),132.3(s),126.7 (d),126.6(d),
126.3(s),126.1(s),125.4(d),119.2(s),115.9(s),111.3
(d),77.7(d),76.9(d),75.3(d),71.7(d),69.8(d),67.5
(d),64.9(d),57.8(s),41.1(t),40.4(q),40.4(q),39.3
(q),39.3(q),39.0(s),31.6(t),28.7(t),24.2(q),21.3
(q),18.9(q),17.6(q),14.9(q),13.7(q),12.9(q)Δ (ppm): 188.0 (s), 183.6 (s), 179.3 (s), 1
72.3 (s), 170.6 (s), 159.3 (s), 156.4 (s), 149.6 (s), 140.5
(s), 138.3 (s), 137.1 (s), 132.3 (s), 126.7 (d), 126.6 (d),
126.3 (s), 126.1 (s), 125.4 (d), 119.2 (s), 115.9 (s), 111.3
(d), 77.7 (d), 76.9 (d), 75.3 (d), 71.7 (d), 69.8 (d), 67.5
(d), 64.9 (d), 57.8 (s), 41.1 (t), 40.4 (q), 40.4 (q), 39.3
(q), 39.3 (q), 39.0 (s), 31.6 (t), 28.7 (t), 24.2 (q), 21.3
(q), 18.9 (q), 17.6 (q), 14.9 (q), 13.7 (q), 12.9 (q)

【００２５】チ）溶解性 酸性水，メタノール，クロロホルム，ベンゼンに可溶、
ｎ−ヘキサンに不溶 リ）呈色反応 ドラーゲンドルフ試薬に陽性、バニリン硫酸に陽性 ヌ）塩基性、中性、酸性の区別 塩基性 ル）物質の性状および色 黄色アモルファスパウダーH) Solubility Soluble in acidic water, methanol, chloroform, benzene,
Insoluble in n-hexane Li) Color reaction Positive for Dragendorff reagent, positive for vanillin sulfate nu) Basic, neutral, or acidic basic) Basic substance properties and color Yellow amorphous powder

【００２６】上記物理化学的性質より、さらに構造研究
を行った結果、ＨＰ５３０Ｃ₂ の化学構造を前記構造式
のように決定した。以上のような物理化学的性質に一致
する公知の化合物は存在しないことよりＨＰ５３０Ｃ₂
は新規な化合物であると認定される。As a result of further structural studies based on the above physicochemical properties, the chemical structure of HP530C ₂ was determined as in the above structural formula. Since there is no known compound that matches the above physicochemical properties, HP530C ₂
Is certified as a novel compound.

【００２７】本発明のＨＰ５３０Ｃ₂ の塩の具体例とし
ては、酸付加塩として塩酸，硫酸，リン酸などとの無機
塩類あるいは酢酸，乳酸，プロピオン酸，マレイン酸，
オレイン酸，パルミチン酸，クエン酸，コハク酸，酒石
酸，フマル酸，グルタミン酸，パントテン酸，ラウリル
スルホン酸などとの有機酸塩がある。Specific examples of the HP530C ₂ salt of the present invention include inorganic salts with hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid or the like as acid addition salts, or acetic acid, lactic acid, propionic acid, maleic acid,
There are organic acid salts such as oleic acid, palmitic acid, citric acid, succinic acid, tartaric acid, fumaric acid, glutamic acid, pantothenic acid, and laurylsulfonic acid.

【００２８】[0028]

【作用】本発明のＨＰ５３０Ｃ₂ の生物活性は以下の通
りである。 イ）抗菌活性 ＨＰ５３０Ｃ₂ の細菌および真菌に対する最小発育阻止
濃度（ＭＩＣ）を第２表に示す。The biological activity of HP530C ₂ of the present invention is as follows. B) Antibacterial activity Table 2 shows the minimum inhibitory concentration (MIC) of HP530C ₂ against bacteria and fungi.

【００２９】[0029]

【表２】 [Table 2]

【００３０】ロ）抗腫瘍活性 腹腔内にマウス繊維肉腫Ｍｅｔｈ Ａ細胞をマウス
１匹あたり１×１０⁶ 個移植したＣＤＦ1 マウスに対し
て、細胞移植後２４時間後から１日１回、計４回生理食
塩水に溶解したＨＰ５３０Ｃ₂ を腹腔内に投与したとき
の治療効果を延命効果で測定し、第３表に示した。な
お、表中の延命効果は、無処理群の平均生存日数（Ｃ）
に対する治療群の平均生存日数（Ｔ）の比を、百分率を
もって表した。(B) Antitumor activity For CDF1 mice in which 1 × 10 ⁶ mouse fibrosarcoma Meth A cells were intraperitoneally transplanted, once a day from 24 hours after cell transplantation, a total of 4 times The therapeutic effect when HP530C ₂ dissolved in physiological saline was intraperitoneally administered was measured by the life prolonging effect, and the results are shown in Table 3. The life-prolonging effect in the table is the average survival time (C) of the untreated group.
The ratio of the mean survival time (T) of the treatment group to the group was expressed as a percentage.

【００３１】[0031]

【表３】 [Table 3]

【００３２】 ヒト胎児の肺細胞をＳＶ４０ウイルス
により腫瘍転換して得られた株化細胞Ｗ９８に対する細
胞障害活性（ＩＣ₁₀₀ ）を次のようにして調べた。すな
わち、培養液中におけるＷ９８細胞の生育に対し、その
培養液にメタノール溶液として培養液が１０％メタノー
ル溶液となるようにＨＰ５３０Ｃ₂ を加えたときの細胞
障害性をＷ９８細胞に対する１００％生育阻害濃度（Ｉ
Ｃ₁₀₀ ）として測定した。The cytotoxic activity (IC ₁₀₀ ) against cell line W98 obtained by tumor-transforming human fetal lung cells with SV40 virus was examined as follows. That is, with respect to the growth of W98 cells in the culture medium, the cytotoxicity when HP530C ₂ was added to the culture medium as a methanol solution so that the culture medium became a 10% methanol solution, was determined to be 100% growth inhibitory concentration against W98 cells. (I
Was measured as C _100).

【００３３】その結果、Ｗ９８細胞に対するＩＣ
₁₀₀ は、３．９×１０^-3μg ／mlであり、非常に低濃度
で有効であった。 ハ）急性毒性 ＣＤＦ1 マウス３匹を用いた急性毒性試験において腹腔
内投与で２０mg／kgでも毒性を示さなかった。As a result, IC for W98 cells
₁₀₀ was 3.9 × 10 ⁻³ μg / ml, which was effective at a very low concentration. C) Acute toxicity In an acute toxicity test using 3 CDF1 mice, intraperitoneal administration showed no toxicity even at 20 mg / kg.

【００３４】本発明のＨＰ５３０Ｃ₂ を実際に製剤化す
る場合は、前記構造式で表される化合物と医薬的に受容
な賦形剤とからなる。これらは、経口投与用，非経口投
与用のいずれであってもよい。In the actual formulation of HP530C ₂ of the present invention, it comprises the compound represented by the above structural formula and a pharmaceutically acceptable excipient. These may be for oral administration or parenteral administration.

【００３５】経口投与剤としては、通常散剤，錠剤，乳
剤，カプセル剤，顆粒剤，液剤などの形態があり、内服
剤の賦形剤の具体例を挙げると、散剤，その他の内服用
粉末剤における賦形剤としては、乳糖，澱粉，デキスト
リン，リン酸カルシウム，炭酸カルシウム，合成および
天然ケイ酸アルミニウム，酸化マグネシウム，水酸化ア
ルミニウム，ステアリン酸マグネシウム，重炭酸ナトリ
ウムなどが挙げられ、液剤における賦形剤としては、
水，グリセリン，単シロップなどが挙げられる。Oral administration forms are usually in the form of powders, tablets, emulsions, capsules, granules, liquids and the like, and specific examples of excipients for internal use include powders and other powders for internal use. Examples of the excipient include lactose, starch, dextrin, calcium phosphate, calcium carbonate, synthetic and natural aluminum silicate, magnesium oxide, aluminum hydroxide, magnesium stearate, sodium bicarbonate, etc. Is
Examples include water, glycerin, and simple syrup.

【００３６】非経口投与剤としては、注射剤等の形態が
あり、注射剤の場合は、無菌の水性または非水性の溶液
剤，懸濁剤，乳濁剤を包含する。水性の溶液剤，懸濁剤
としては、例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれ
る。非水溶性の溶液剤，懸濁剤としては、例えばプロピ
レングリコール，ポリエチレングリコール，オリーブ油
のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポ
リソルベート８０（商品名）等がある。このような組成
物は、さらに防腐剤，潤滑剤，乳化剤，分散剤のような
補助剤を含んでもよい。これらは、例えばバクテリア保
留フイルターによる濾過、殺菌剤の配合または照射によ
って無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製
造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解し
て使用することもできる。The parenteral administration forms include injections and the like. In the case of injections, sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions and emulsions are included. Examples of the aqueous solution and suspension include distilled water for injection and physiological saline. Examples of non-water-soluble solutions and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, and polysorbate 80 (trade name). Such compositions may further contain adjuvants such as preservatives, lubricants, emulsifiers and dispersants. These are sterilized, for example, by filtration with a bacteria-retaining filter, blending of a bactericide or irradiation. These can also be used by preparing a sterile solid composition and dissolving it in sterile water or a sterile solvent for injection before use.

【００３７】上記の各製剤は常法に従って調製すること
ができる。本発明の前記構造式で表される化合物を製剤
として用いる場合は、通常大人に0.2 〜200 mg／１日が
経口的または非経口的に投与される。Each of the above-mentioned preparations can be prepared according to a conventional method. When the compound represented by the above structural formula of the present invention is used as a preparation, 0.2 to 200 mg / day is orally or parenterally administered to an adult.

【００３８】[0038]

【実施例】以下に実施例を挙げて説明するが、これは一
例であり、本発明を限定するものではない。 実施例１ グルコース0.5 ％ ，オートミール3.0 ％，ファーマメ
ディア（商品名) 1.0％，硫化マグネシウム0.5 ％，塩
化コバルト20ppm,炭酸カルシウム0.3 ％から成る液体培
地をpH7.0 に調整し、この培地100 mlを分注した500ml
容三角フラスコを121 ℃で15分間滅菌し、ストレプトミ
セス・スピーシーズ・ＨＰ５３０株（FERM BP-2786）を
寒天斜面培地上より上記三角フラスコに接種した。３０
℃で４日間振盪培養し、１次種培養液を調製した。EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples, but these are examples and do not limit the present invention. Example 1 A liquid medium containing 0.5% glucose, 3.0% oatmeal, 1.0% Pharmamedia (trade name), 0.5% magnesium sulfide, 20 ppm cobalt chloride and 0.3% calcium carbonate was adjusted to pH 7.0, and 100 ml of this medium was added. Dispensed 500 ml
The Erlenmeyer flask was sterilized at 121 ° C. for 15 minutes, and Streptomyces species HP530 strain (FERM BP-2786) was inoculated into the Erlenmeyer flask from the agar slant medium. Thirty
Culturing was carried out at 4 ° C. for 4 days with shaking to prepare a primary seed culture solution.

【００３９】上記１次種培養液を、同じ培地組成を持つ
培地をそれぞれ500 ml分注した２本の３リットル容三角
フラスコに４％ずつ接種し、30℃で４日間振盪培養し、
２次種培養液とした。２次種培養液を上記種培養液と同
じ培地組成の培地１５リットルを張り込んだ３０リット
ル容ジャーファーメンター２基に３％ずつ植菌し、培養
温度３０℃、撹拌数２５０rpm 、通気量１vvm の条件下
４日間、通気撹拌培養を行った。4% of the above primary seed culture was inoculated into two 3 liter Erlenmeyer flasks each having 500 ml of the medium having the same medium composition dispensed, and shake-cultured at 30 ° C. for 4 days,
It was used as the secondary seed culture. The secondary seed culture was inoculated with 2% of a 30-liter jar fermenter containing 15 liters of a medium having the same composition as the above-mentioned seed culture at a rate of 3% at a culture temperature of 30 ° C., a stirring rate of 250 rpm, and an aeration rate of 1 vvm The aeration-agitation culture was carried out for 4 days under the conditions.

【００４０】培養終了後、培養液をシャープレス型遠心
濾過装置により菌体を含むケーキと濾液とに分離し、得
られた菌体を含むケーキを80％アセトン５リットルに浸
漬した。室温中３時間撹拌後、菌体等固形分を濾過によ
り除去し、アセトン抽出液を得た。抽出液より減圧下ア
セトンを除去、１０倍濃縮し500ml とした。この濃縮液
を1.５リットルのｎ−ヘキサンで洗浄後、残部を1.５リ
ットルの酢酸エチルで抽出を行い、この酢酸エチル層を
無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下で濃縮、油状抽出
物1.８ｇを得た。After the culture was completed, the culture solution was separated into a cake containing the bacterial cells and a filtrate by a Sharpless centrifugal filter, and the obtained cake containing the bacterial cells was immersed in 5 liters of 80% acetone. After stirring at room temperature for 3 hours, solids such as cells were removed by filtration to obtain an acetone extract. Acetone was removed from the extract under reduced pressure and concentrated 10 times to make 500 ml. The concentrated solution was washed with 1.5 liters of n-hexane, and the rest was extracted with 1.5 liters of ethyl acetate. The ethyl acetate layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate and then concentrated under reduced pressure to obtain an oily extract. 1.8 g was obtained.

【００４１】得られた油状抽出物を少量のメタノールに
溶解し、化学修飾シリカゲル（YMCODS-AQ 120-S50, ワ
イエムシィ社製）500ml を充填したカラムにのせ0.15%
ＫＨ₂ ＰＯ₄ (pH3.5)-メタノール混合液（１：１）、0.
15% ＫＨ₂ ＰＯ₄(pH3.5)- メタノール混合液（２：３）
で順次溶出、洗浄した。さらに0.15% ＫＨ₂ ＰＯ₄ (pH
3.5)-メタノール混合液（３：７）、0.15% ＫＨ₂ ＰＯ₄
(pH3.5)- メタノール混合液（１：４）で展開溶出する
クロマトグラフィーを行った。このクロマトグラフィー
においてはＨＰ５３０Ｃ、ＨＰ５３０Ｃ₂ 、次いでＨＰ
５３０Ｂの順に溶出する。このうちＨＰ５３０Ｃ₂ を含
む画分をまとめ、減圧下で濃縮乾固し、油状活性画分を
得た。The obtained oily extract was dissolved in a small amount of methanol, and loaded on a column packed with 500 ml of chemically modified silica gel (YMCODS-AQ 120-S50, manufactured by YMC) 0.15%.
KH ₂ PO ₄ (pH 3.5) -methanol mixture (1: 1), 0.1.
15% KH ₂ PO ₄ (pH 3.5) -methanol mixture (2: 3)
Were sequentially eluted and washed. Further 0.15% KH ₂ PO ₄ (pH
3.5) -methanol mixture (3: 7), 0.15% KH ₂ PO ₄
Chromatography was performed by elution with a (pH 3.5) -methanol mixture (1: 4). In this chromatography, HP530C, HP530C ₂ , then HP
Elute in order of 530B. Of these, the fractions containing HP530C ₂ were combined and concentrated to dryness under reduced pressure to give an oily active fraction.

【００４２】この油状活性画分を少量のクロロホルムに
溶解し、シリカゲル分取用薄層板（シリカゲル 60 ，Ｆ
₂₅₄s,NO. 13794, メルク社製）上にのせ、クロロホルム
- メタノール混合液（９：１，１％アンモニア水を含
む）により展開するクロマトグラフィーを行った。次い
で、薄層板からかきとった本物質を含むシリカゲルよ
り、クロロホルムを用いて溶出を行った。得られたクロ
ロホルム溶液を減圧下濃縮し、メタノールを加えたとこ
ろ、黄色の沈澱が生じた。この沈澱を濾過にて集め、ヘ
キサンで洗浄後、減圧乾燥して純粋なＨＰ５３０Ｃ₂ の
黄色粉末10.6mgを得た。この物質のＷ９８細胞に対する
細胞障害活性及び物理化学的性質は前記した通りであっ
た。This oily active fraction was dissolved in a small amount of chloroform, and a thin layer plate for silica gel separation (silica gel 60, F) was used.
₂₅₄ s, NO. 13794, made by Merck), chloroform
-Chromatography was performed using a mixed solution of methanol (containing 9: 1 and 1% aqueous ammonia). Then, the silica gel containing the substance scraped from the thin plate was eluted with chloroform. When the obtained chloroform solution was concentrated under reduced pressure and methanol was added, a yellow precipitate was produced. The precipitate was collected by filtration, washed with hexane, and dried under reduced pressure to obtain 10.6 mg of pure HP530C ₂ yellow powder. The cytotoxic activity and physicochemical properties of this substance on W98 cells were as described above.

【００４３】実施例２ 実施例１で得られた培養濾液３０リットルを３０リット
ルの酢酸エチルで抽出し、得られた酢酸エチル層を減圧
濃縮してＨＰ５３０Ｃ₂ 物質を含む溶液300mlを得た。
以下、実施例１と同様に処理して純粋なＨＰ５３０Ｃ₂
の黄色粉末2.0mg を得た。Example 2 30 liters of the culture filtrate obtained in Example 1 was extracted with 30 liters of ethyl acetate, and the obtained ethyl acetate layer was concentrated under reduced pressure to obtain 300 ml of a solution containing HP530C ₂ substance.
Thereafter, the same treatment as in Example 1 was performed to obtain pure HP530C ₂
2.0 mg of yellow powder was obtained.

【００４４】[0044]

【発明の効果】本発明におけるＨＰ５３０Ｃ₂ は、前述
したように、抗菌作用及び抗腫瘍作用を示すことより、
抗菌剤，抗癌剤として有用であると考えられるが、特に
その強い抗腫瘍活性より、医療用の抗癌剤としての利用
が期待される。As described above, HP530C ₂ of the present invention exhibits antibacterial action and antitumor action.
Although it is considered to be useful as an antibacterial agent and an anticancer agent, it is expected to be used as a medical anticancer agent because of its strong antitumor activity.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 ＨＰ５３０Ｃ₂ のメタノール溶液での紫外部
（ＵＶ）吸収スペクトル図である。FIG. 1 is an ultraviolet (UV) absorption spectrum of a methanol solution of HP530C ₂ .

【図２】 ＨＰ５３０Ｃ₂ の臭化カリウム錠での赤外部
（ＩＲ）吸収スペクトル図である。FIG. 2 is an infrared (IR) absorption spectrum of HP530C _{2 in} a potassium bromide tablet.

【図３】 ＨＰ５３０Ｃ₂ の、テトラメチルシラン（Ｔ
ＭＳ）を内部標準とした重クロロホルム溶液中での水素
核核磁気共鳴スペクトル図である。FIG. 3: HP530C ₂ tetramethylsilane (T
FIG. 4 is a hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum diagram in a deuterated chloroform solution using MS as an internal standard.

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｄ 311:00） (Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:465） 7804−4Ｂ (72)発明者 内田 秀明 静岡県焼津市岡当目10番地 サッポロビー ル株式会社医薬開発研究所内 (72)発明者 中村 武彦 静岡県焼津市岡当目10番地 サッポロビー ル株式会社医薬開発研究所内 (72)発明者 棟方 正信 静岡県焼津市岡当目10番地 サッポロビー ル株式会社医薬開発研究所内Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification number Office reference number FI technical display location C07D 311: 00) (C12P 17/06 C12R 1: 465) 7804-4B (72) Inventor Hideaki Uchida Yaizu, Shizuoka Prefecture Ichioka Tome No. 10 Sapporo Lobby Co., Ltd. Pharmaceutical Development Laboratory (72) Inventor Takehiko Nakamura Yaizu City, Shizuoka Prefecture Oka Tome No. 10 Sapporo Lobby Co., Ltd. Pharmaceutical Development Laboratory (72) Inventor Masanobu Munakata Okato, Yaizu Shizuoka Prefecture Address 10 Sapporo Lobby Co., Ltd.

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 下記の構造式 【化１】 で表されるＨＰ５３０Ｃ₂ 物質またはその医薬的に許容
される塩。1. The following structural formula: An HP530C ₂ substance represented by or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 【請求項２】 ストレプトミセス属に属し、請求項１記
載のＨＰ５３０Ｃ₂ 物質を生産しうる微生物を培養し、
その培養物中よりＨＰ５３０Ｃ₂ 物質を採取することを
特徴とするＨＰ５３０Ｃ₂ 物質またはその医薬的に許容
される塩の製造法。 _{2. A} microorganism belonging to the genus Streptomyces and capable of producing the HP530C ₂ substance according to claim 1, is cultured,
A method for producing an HP530C ₂ substance or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which comprises collecting the HP530C ₂ substance from the culture. 【請求項３】 ＨＰ５３０Ｃ₂ 物質生産菌が、ストレプ
トミセス・スピーシーズ（Streptomyces sp. ）・ＨＰ
５３０株（微工研条寄第2786号；FERM BP-2786）である
請求項２項記載のＨＰ５３０Ｃ₂ 物質またはその医薬的
に許容される塩の製造法。3. An HP530C ₂ substance-producing bacterium is Streptomyces sp. HP.
The method for producing the HP530C ₂ substance or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to claim 2, which is strain 530 (Mikorokujojo No. 2786; FERM BP-2786).