JPH05117165A - 抗癌剤 - Google Patents
抗癌剤Info
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- JPH05117165A JPH05117165A JP3303845A JP30384591A JPH05117165A JP H05117165 A JPH05117165 A JP H05117165A JP 3303845 A JP3303845 A JP 3303845A JP 30384591 A JP30384591 A JP 30384591A JP H05117165 A JPH05117165 A JP H05117165A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 既存の抗癌剤，特に抗癌性抗生物質を利用
し、標的癌細胞に対して該抗癌剤を集中移行させること
により、副作用を広く軽減させ安全性と癌治療効果を向
上せしめるシステムを提供する。 【構成】 癌遺伝子Ｃ−ｅｒｂＢ−２産物の蛋白質アミ
ノ酸配列中の細胞外親水部位の部分ペプチドを抗原とし
て得られたモノクローナル抗体を、腺癌細胞の膜蛋白質
を認識する抗体として利用し、この抗体にアドレアマイ
シンを接合させることにより得られた抗体接合抗癌剤を
有効成分とする抗癌剤。 【効果】 本抗癌剤は、腺癌細胞，特に癌遺伝子Ｃ−ｅ
ｒｂＢ−２の産物を産生する癌細胞に効果的に作用す
る。
し、標的癌細胞に対して該抗癌剤を集中移行させること
により、副作用を広く軽減させ安全性と癌治療効果を向
上せしめるシステムを提供する。 【構成】 癌遺伝子Ｃ−ｅｒｂＢ−２産物の蛋白質アミ
ノ酸配列中の細胞外親水部位の部分ペプチドを抗原とし
て得られたモノクローナル抗体を、腺癌細胞の膜蛋白質
を認識する抗体として利用し、この抗体にアドレアマイ
シンを接合させることにより得られた抗体接合抗癌剤を
有効成分とする抗癌剤。 【効果】 本抗癌剤は、腺癌細胞，特に癌遺伝子Ｃ−ｅ
ｒｂＢ−２の産物を産生する癌細胞に効果的に作用す
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗癌剤に関するもので
あり、更に詳細には、腺癌細胞、特に癌遺伝子ｃ−ｅｒ
ｂＢ−２の産物を産生する癌細胞に効果的な抗癌剤に関
するものである。
あり、更に詳細には、腺癌細胞、特に癌遺伝子ｃ−ｅｒ
ｂＢ−２の産物を産生する癌細胞に効果的な抗癌剤に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】アドレアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉ
ｎ）が放線菌ストレプトミセス・ピューセチウス・バル
・ケシウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔ
ｉｕｓｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓ）から生産される抗生物
質であって、抗腫瘍作用を有することは既知であり（宮
野成二ほか２名訳、「医薬品化学（II）−臨床薬学と薬
の構造活性相関−」広川書店（昭５５−９−２０）ｐ．
４７４−４７５）、腺癌の治療には、主としてこのアド
レアマイシンが使用されている。
ｎ）が放線菌ストレプトミセス・ピューセチウス・バル
・ケシウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔ
ｉｕｓｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓ）から生産される抗生物
質であって、抗腫瘍作用を有することは既知であり（宮
野成二ほか２名訳、「医薬品化学（II）−臨床薬学と薬
の構造活性相関−」広川書店（昭５５−９−２０）ｐ．
４７４−４７５）、腺癌の治療には、主としてこのアド
レアマイシンが使用されている。
【０００３】しかしながら、アドレアマイシンに限らず
従来用いられている抗癌剤は、一般的に副作用が強く、
***、増殖の旺盛な正常細胞にも損傷を与える。そのた
め、投与量を制限せざるを得ず、したがって効果的な治
療ができないのが現状である。
従来用いられている抗癌剤は、一般的に副作用が強く、
***、増殖の旺盛な正常細胞にも損傷を与える。そのた
め、投与量を制限せざるを得ず、したがって効果的な治
療ができないのが現状である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はすぐれ
た抗癌剤を開発することであるが、新規な抗癌性物質を
新たに開発するのではなく、既存の抗癌剤を利用しなが
らその副作用を広く軽減せしめるシステムを新たに開発
することを目的とするものである。
た抗癌剤を開発することであるが、新規な抗癌性物質を
新たに開発するのではなく、既存の抗癌剤を利用しなが
らその副作用を広く軽減せしめるシステムを新たに開発
することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、体内に投与された
抗癌剤が特異的に癌細胞に集中移行すれば少量の抗癌剤
でも有効な治療が可能となり、副作用の問題も軽減され
るとの観点から、抗癌剤を癌細胞に対して特異的に集中
せしめるシステムを開発することにより、上記目的を達
成することとした。
成するためになされたものであって、体内に投与された
抗癌剤が特異的に癌細胞に集中移行すれば少量の抗癌剤
でも有効な治療が可能となり、副作用の問題も軽減され
るとの観点から、抗癌剤を癌細胞に対して特異的に集中
せしめるシステムを開発することにより、上記目的を達
成することとした。
【０００６】そこで各方面から検討の結果、腺癌、特に
乳癌において過剰に発現している、癌遺伝子ｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２の発現産物、すなわち細胞膜貫通性の蛋白質に着
目し、この腺癌の細胞外親水部位を認識する抗体を作製
し、これと抗癌剤との接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を
作製したところ、癌細胞、特に腺癌細胞に対して非常に
有効な抗癌剤であることが確認され、本発明の完成に至
ったものである。
乳癌において過剰に発現している、癌遺伝子ｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２の発現産物、すなわち細胞膜貫通性の蛋白質に着
目し、この腺癌の細胞外親水部位を認識する抗体を作製
し、これと抗癌剤との接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を
作製したところ、癌細胞、特に腺癌細胞に対して非常に
有効な抗癌剤であることが確認され、本発明の完成に至
ったものである。
【０００７】すなわち本発明は、抗体を接合する抗癌剤
と、腺癌細胞の膜蛋白質を認識する抗体との接合体を有
効成分とする抗癌剤を、その基本的技術思想とするもの
である。
と、腺癌細胞の膜蛋白質を認識する抗体との接合体を有
効成分とする抗癌剤を、その基本的技術思想とするもの
である。
【０００８】本発明においては、腺癌細胞の膜蛋白質を
認識する抗体を使用するが、それには膜蛋白質及び／又
は部分ペプチドを抗原とし、必要あればキャリアー蛋白
質と結合した後、これを抗原として常法にしたがって抗
体を調製すればよい。
認識する抗体を使用するが、それには膜蛋白質及び／又
は部分ペプチドを抗原とし、必要あればキャリアー蛋白
質と結合した後、これを抗原として常法にしたがって抗
体を調製すればよい。
【０００９】上記のように抗原としては、該膜蛋白質及
び／又はその部分ペプチドが広く使用できるが、例えば
癌遺伝子ｃ−ｅｒｂＢ−２の発現産物も抗原として有利
に使用できる。癌遺伝子ｃ−ｅｒｂＢ−２は、乳癌や胃
癌といった腺癌組織において増幅されており、その産物
には分子量１８５ｋＤａの膜貫通性の蛋白質が含まれて
いるので、これをそのまま又はその部分ペプチドを抗原
として使用することができる。
び／又はその部分ペプチドが広く使用できるが、例えば
癌遺伝子ｃ−ｅｒｂＢ−２の発現産物も抗原として有利
に使用できる。癌遺伝子ｃ−ｅｒｂＢ−２は、乳癌や胃
癌といった腺癌組織において増幅されており、その産物
には分子量１８５ｋＤａの膜貫通性の蛋白質が含まれて
いるので、これをそのまま又はその部分ペプチドを抗原
として使用することができる。
【００１０】後者については、ｃ−ｅｒｂＢ−２産物の
蛋白質アミノ酸配列の中で、細胞外の部分に相当する親
水性部位のペプチド（アミノ酸残基数約１０〜２０）を
合成し、得られた親水性ペプチドを（キャリアー蛋白質
に結合させて）抗原とし、常法にしたがって処理すれば
ポリクローナル抗体を得ることができる。このポリクロ
ーナル抗体も、後記するところからも明らかなように、
癌細胞を特異的に認識することができるので、各種抗癌
剤と接合せしめることによって本発明に係るすぐれた抗
癌剤を製造するのに利用することができる。また、更に
抗体の特異性を高めて更に有効な抗癌剤を製造するた
め、上記抗原を用いて常法にしたがってモノクローナル
抗体を調製し、これを各種抗癌剤と接合せしめて、目的
とする抗癌剤を製造することも可能である。
蛋白質アミノ酸配列の中で、細胞外の部分に相当する親
水性部位のペプチド（アミノ酸残基数約１０〜２０）を
合成し、得られた親水性ペプチドを（キャリアー蛋白質
に結合させて）抗原とし、常法にしたがって処理すれば
ポリクローナル抗体を得ることができる。このポリクロ
ーナル抗体も、後記するところからも明らかなように、
癌細胞を特異的に認識することができるので、各種抗癌
剤と接合せしめることによって本発明に係るすぐれた抗
癌剤を製造するのに利用することができる。また、更に
抗体の特異性を高めて更に有効な抗癌剤を製造するた
め、上記抗原を用いて常法にしたがってモノクローナル
抗体を調製し、これを各種抗癌剤と接合せしめて、目的
とする抗癌剤を製造することも可能である。
【００１１】抗原ペプチドとしては、例えば後記する参
考例において示すペプチドの内、５のペプチドが最も有
利に使用できるが、これのみに限定されるものではな
く、１〜４のペプチドも有利に使用することができる。
考例において示すペプチドの内、５のペプチドが最も有
利に使用できるが、これのみに限定されるものではな
く、１〜４のペプチドも有利に使用することができる。
【００１２】このような抗原から得た抗体は、各種の抗
癌剤と接合せしめて目的とする接合抗癌剤を製造するの
であるが、接合方法は、ジアゾ法、ペプチド法、アルキ
ル化法、架橋法等の共有結合法のほかイオン結合法、そ
の他既知の接合方法がすべて利用できる。
癌剤と接合せしめて目的とする接合抗癌剤を製造するの
であるが、接合方法は、ジアゾ法、ペプチド法、アルキ
ル化法、架橋法等の共有結合法のほかイオン結合法、そ
の他既知の接合方法がすべて利用できる。
【００１３】本発明にしたがって腺癌細胞の膜蛋白質を
認識する抗体と接合せしめる抗癌剤としては、アドレア
マイシンやその類縁体であるダウノルビシン等抗生物質
系抗癌剤のほかすべてのタイプの抗癌剤が使用でき、そ
の非限定的例としては次のものが挙げられる：アクチノ
マイシンＣ、同Ｄ、アドレアマイシン、カルチノスタチ
ン、カルチノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイ
シン、ダウノルビシン、マイトマイシン、ネオカルチノ
スタチン、ミスラマイシン、ブレオマイシン、ストレプ
トマイシンその他。
認識する抗体と接合せしめる抗癌剤としては、アドレア
マイシンやその類縁体であるダウノルビシン等抗生物質
系抗癌剤のほかすべてのタイプの抗癌剤が使用でき、そ
の非限定的例としては次のものが挙げられる：アクチノ
マイシンＣ、同Ｄ、アドレアマイシン、カルチノスタチ
ン、カルチノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイ
シン、ダウノルビシン、マイトマイシン、ネオカルチノ
スタチン、ミスラマイシン、ブレオマイシン、ストレプ
トマイシンその他。
【００１４】
【作用】本発明の制癌システムの作用機序の詳細につい
ては今後の研究にまたねばならないが、現時点では次の
ように推定される。すなわち、本発明において使用する
抗体は、癌細胞の細胞内ではなく膜を貫通して細胞外に
出た遺伝子産物部位を認識するものであるため、特異性
が極めて高く癌細胞を正確且つ迅速に認識することがで
きるという特性を有するものである。したがって、本発
明に係る接合体は、まずはじめに抗体部分が迅速的確に
癌細胞を識別し、次いで癌細胞上に存在する抗原（細胞
外部に貫通した遺伝子産物部位）と複合体を形成し、そ
してその複合体が細胞内に陥入し、それと同時に抗体と
接合しているアドレアマイシン等の抗癌剤も細胞内に侵
入し、この侵入した抗癌剤が癌細胞の増殖を阻害するも
のと推定される。
ては今後の研究にまたねばならないが、現時点では次の
ように推定される。すなわち、本発明において使用する
抗体は、癌細胞の細胞内ではなく膜を貫通して細胞外に
出た遺伝子産物部位を認識するものであるため、特異性
が極めて高く癌細胞を正確且つ迅速に認識することがで
きるという特性を有するものである。したがって、本発
明に係る接合体は、まずはじめに抗体部分が迅速的確に
癌細胞を識別し、次いで癌細胞上に存在する抗原（細胞
外部に貫通した遺伝子産物部位）と複合体を形成し、そ
してその複合体が細胞内に陥入し、それと同時に抗体と
接合しているアドレアマイシン等の抗癌剤も細胞内に侵
入し、この侵入した抗癌剤が癌細胞の増殖を阻害するも
のと推定される。
【００１５】本発明に係る薬剤組成物は、抗体を接合す
る抗癌剤と抗体との接合体を有効成分としてこれに常用
される無機又は有機の担体を加えて、固体、半固体又は
液体の形で、経口投与剤のほか、外用剤等の非経口投与
剤に製剤化する。
る抗癌剤と抗体との接合体を有効成分としてこれに常用
される無機又は有機の担体を加えて、固体、半固体又は
液体の形で、経口投与剤のほか、外用剤等の非経口投与
剤に製剤化する。
【００１６】経口投与のための製剤としては、錠剤、丸
剤、顆粒剤、軟・伸カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、
乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、ペレット剤、エリキシル
等が挙げられる。非経口投与のための製剤としては、注
射剤、点滴剤、輸液、軟膏、ローション、トニック、ス
プレー、懸濁剤、油剤、乳剤、坐剤等が挙げられる。本
発明の有効成分を製剤化するには、常法にしたがえばよ
く、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安
定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張剤その他常用される佐薬を
適宜使用する。
剤、顆粒剤、軟・伸カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、
乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、ペレット剤、エリキシル
等が挙げられる。非経口投与のための製剤としては、注
射剤、点滴剤、輸液、軟膏、ローション、トニック、ス
プレー、懸濁剤、油剤、乳剤、坐剤等が挙げられる。本
発明の有効成分を製剤化するには、常法にしたがえばよ
く、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安
定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張剤その他常用される佐薬を
適宜使用する。
【００１７】本発明に係る薬剤組成物の投与量は、その
種類、治療ないし予防対象癌の種類、投与方法、患者の
年令、患者の症状、処理時間等によって相違するが、静
脈投与の場合は成人ひとり当り１日に有効成分（本物
質）を０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．
１〜１００ｍｇ／ｋｇ投与する。
種類、治療ないし予防対象癌の種類、投与方法、患者の
年令、患者の症状、処理時間等によって相違するが、静
脈投与の場合は成人ひとり当り１日に有効成分（本物
質）を０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．
１〜１００ｍｇ／ｋｇ投与する。
【００１８】本発明において使用する抗体は、これをマ
ウスに対して投与した場合、少なくとも１００ｍｇ／マ
ウスまでは、体重及び寿命のいずれにおいても変化は認
められなかった。また、アドレアマイシンについては、
その投与量は、一般に成人の場合、４０ｍｇを８回投与
し、最大投与の許容量は５００ｍｇであり、マウスの場
合は５００μｇが最大許容量であり、したがって本発明
に係る接合体の急性毒性はこれらの値以上ということと
なり、本接合体は非常に安全性が高いものである。 以
下、本発明を参考例及び実施例により更に詳しく説明す
る。
ウスに対して投与した場合、少なくとも１００ｍｇ／マ
ウスまでは、体重及び寿命のいずれにおいても変化は認
められなかった。また、アドレアマイシンについては、
その投与量は、一般に成人の場合、４０ｍｇを８回投与
し、最大投与の許容量は５００ｍｇであり、マウスの場
合は５００μｇが最大許容量であり、したがって本発明
に係る接合体の急性毒性はこれらの値以上ということと
なり、本接合体は非常に安全性が高いものである。 以
下、本発明を参考例及び実施例により更に詳しく説明す
る。
【００１９】
【参考例１】ｃ−ｅｒｂＢ−２癌遺伝子によってコード
された産物の親水性部位をＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎの方
法を用いて検索し、それらのいくつかについて、その合
成ペプチドを作成し、キャリアー蛋白質に結合し、それ
を抗原としてマウスを免疫した。得られた抗血清につい
て、ｃ−ｅｒｂＢ−２の発現が認識されている乳癌細胞
株ＳＫ−ＢＲ−IIIに対する反応性を、細胞を固相化し
たＥＬＩＳＡ法で調べ、下記表１で示される第１表の結
果を得た。
された産物の親水性部位をＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎの方
法を用いて検索し、それらのいくつかについて、その合
成ペプチドを作成し、キャリアー蛋白質に結合し、それ
を抗原としてマウスを免疫した。得られた抗血清につい
て、ｃ−ｅｒｂＢ−２の発現が認識されている乳癌細胞
株ＳＫ−ＢＲ−IIIに対する反応性を、細胞を固相化し
たＥＬＩＳＡ法で調べ、下記表１で示される第１表の結
果を得た。
【００２０】
【表１】
【００２１】上記結果から明らかなように、ｃ−ｅｒｂ
Ｂ−２癌遺伝子産物の蛋白質アミノ酸配列中の細胞外親
水部位の部分ペプチドは、いずれも、すぐれた抗原であ
り、第１表５のペプチドが最も好ましいが他のペプチド
も好適であることが確認された。
Ｂ−２癌遺伝子産物の蛋白質アミノ酸配列中の細胞外親
水部位の部分ペプチドは、いずれも、すぐれた抗原であ
り、第１表５のペプチドが最も好ましいが他のペプチド
も好適であることが確認された。
【００２２】
【実施例１】ｃ−ｅｒｂＢ−２癌遺伝子によってコード
された産物のＮ端４９５から５０９までの残基のペプチ
ド（上記第１表５の合成ペプチド）を抗原とし、それに
より免疫したマウス脾細胞と、マウス骨髄腫細胞（ＳＰ
２／０）を細胞融合させ、ハイブリドーマを作製するこ
とにより、モノクローナル抗体が得られる。作製手順の
概要は以下である。
された産物のＮ端４９５から５０９までの残基のペプチ
ド（上記第１表５の合成ペプチド）を抗原とし、それに
より免疫したマウス脾細胞と、マウス骨髄腫細胞（ＳＰ
２／０）を細胞融合させ、ハイブリドーマを作製するこ
とにより、モノクローナル抗体が得られる。作製手順の
概要は以下である。
【００２３】抗原ペプチドは、アミノ酸配列がＨＴＡＮ
ＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬである合成ペプチドと、キャリ
アー蛋白質として、キーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ）をグルタルアルデヒドを用いて架橋させて作
製した。作製の方法は、Ｇ．Ｗａｌｔｅｒ等の方法（Ｐ
ｒｏ Ｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，．７７．６１
９７、１９８０）に準じた。次に、免疫は、上記を抗原
としＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。また、細胞融合は、
Ｂｅｈｚａｄｉａｎ，Ｍ．Ａ．等の方法（Ｃｅｌｌ
Ｓｔｒｕｃｔ，Ｆｕｎｃｔ．，１０，２１９、１９８
５）に準じて行なった。スクリーニングはＥＬＩＳＡ法
を用いた。
ＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬである合成ペプチドと、キャリ
アー蛋白質として、キーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ）をグルタルアルデヒドを用いて架橋させて作
製した。作製の方法は、Ｇ．Ｗａｌｔｅｒ等の方法（Ｐ
ｒｏ Ｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，．７７．６１
９７、１９８０）に準じた。次に、免疫は、上記を抗原
としＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。また、細胞融合は、
Ｂｅｈｚａｄｉａｎ，Ｍ．Ａ．等の方法（Ｃｅｌｌ
Ｓｔｒｕｃｔ，Ｆｕｎｃｔ．，１０，２１９、１９８
５）に準じて行なった。スクリーニングはＥＬＩＳＡ法
を用いた。
【００２４】得られたモノクローナル抗体はヒトｃ−ｅ
ｒｂＢ−２産物を認識する。なお、このモノクローナル
抗体が、ｃ−ｅｒｂＢ−２産物に対するものであるか否
かは、ｃ−ｅｒｂＢ−２の発現が確認されている乳癌細
胞株ＳＫ−ＢＲ−IIIの蛋白質を35Ｓ−ｍｅｔｈｉｏｎ
ｉｎで放射標識したものを可溶化し免疫沈澱を行ない、
ＳＤＳ電気泳動法で展開後、そのオートラジオグラフィ
ーを分析することにより、確認された。
ｒｂＢ−２産物を認識する。なお、このモノクローナル
抗体が、ｃ−ｅｒｂＢ−２産物に対するものであるか否
かは、ｃ−ｅｒｂＢ−２の発現が確認されている乳癌細
胞株ＳＫ−ＢＲ−IIIの蛋白質を35Ｓ−ｍｅｔｈｉｏｎ
ｉｎで放射標識したものを可溶化し免疫沈澱を行ない、
ＳＤＳ電気泳動法で展開後、そのオートラジオグラフィ
ーを分析することにより、確認された。
【００２５】
【００２６】
【（１）抗原蛋白質の調製】前記ペプチドの合成は、自
動ペプチド合成装置による固相法で行なった。さらに、
１ｍｇ ＫＬＨと３ｍｇペプチドを０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．２）中で、２．５％グルタルアルデヒドで
架橋反応を行なった。さらに、フリーのグルタルアルデ
ヒドを除くために、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ中で透析を行なった。
動ペプチド合成装置による固相法で行なった。さらに、
１ｍｇ ＫＬＨと３ｍｇペプチドを０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．２）中で、２．５％グルタルアルデヒドで
架橋反応を行なった。さらに、フリーのグルタルアルデ
ヒドを除くために、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ中で透析を行なった。
【００２７】
【（２）免疫】１００μｇ抗原蛋白質とフロインド不完
全アジュバンドを、Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下に１４日
間隔で３回投与した。ペプチドに対する抗血清が得られ
ているか否かは、ペプチドを９６穴プレートに固定しＥ
ＬＩＳＡ法で調べた。この時、抗マウスＩｇＧに酵素Ｐ
ＯＸを接合したものを用いた。基質としてはＯＰＤであ
る。
全アジュバンドを、Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下に１４日
間隔で３回投与した。ペプチドに対する抗血清が得られ
ているか否かは、ペプチドを９６穴プレートに固定しＥ
ＬＩＳＡ法で調べた。この時、抗マウスＩｇＧに酵素Ｐ
ＯＸを接合したものを用いた。基質としてはＯＰＤであ
る。
【００２８】
【（３）細胞融合】免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスの脾
臓を摘出し、ＲＰＭＩ １６４０培地中で脾細胞を押し
出す。マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０を脾細胞数の１／５
〜１／１０量加え、ＲＰＭＩを遠心で除いた後、ポリエ
チレングリコール（分子量４０００、シグマ）で細胞融
合を行なった。ポリエチレングリコールの排除、融合の
確実性を得るために、直ちに遠心を行ない、ＨＡＴ培地
にて培養した。約一週間後血清培地にて限界希釈法にて
クローニングを行なった。スクリーニングはＥＬＩＳＡ
法にて行なった。
臓を摘出し、ＲＰＭＩ １６４０培地中で脾細胞を押し
出す。マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０を脾細胞数の１／５
〜１／１０量加え、ＲＰＭＩを遠心で除いた後、ポリエ
チレングリコール（分子量４０００、シグマ）で細胞融
合を行なった。ポリエチレングリコールの排除、融合の
確実性を得るために、直ちに遠心を行ない、ＨＡＴ培地
にて培養した。約一週間後血清培地にて限界希釈法にて
クローニングを行なった。スクリーニングはＥＬＩＳＡ
法にて行なった。
【００２９】
【（４）モノクローナル抗体の調製】得られたハイブリ
ドーマを、１５％ ＦＣＳ、グルタミン酸、インシュリ
ンを含んだＲＰＭＩ １６４０培地で増殖し、Ｘ線処
理、プリスタン投与したＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に
細胞（１０7／匹）を投与する。約３週間後、腹水を取
り遠心分離を行ない、上清からＤＥＡＥセルロースカラ
ムを用いて抗体を精製した。
ドーマを、１５％ ＦＣＳ、グルタミン酸、インシュリ
ンを含んだＲＰＭＩ １６４０培地で増殖し、Ｘ線処
理、プリスタン投与したＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に
細胞（１０7／匹）を投与する。約３週間後、腹水を取
り遠心分離を行ない、上清からＤＥＡＥセルロースカラ
ムを用いて抗体を精製した。
【００３０】
【II．ｃ−ｅｒｂＢ−２産物に対するモノクローナル抗
体の性質】
体の性質】
【００３１】
【（１）抗体のサブクラスの同定】Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏ
ｎｙ法に準じて行なった。抗マウスＩｇＭ又は抗マウス
ＩｇＧと、得られたモノクローナル抗体を１％寒天中で
反応させ、沈降線を生ずるか否かで調べた結果、モノク
ローナル抗体はＩｇＭと確認された。
ｎｙ法に準じて行なった。抗マウスＩｇＭ又は抗マウス
ＩｇＧと、得られたモノクローナル抗体を１％寒天中で
反応させ、沈降線を生ずるか否かで調べた結果、モノク
ローナル抗体はＩｇＭと確認された。
【００３２】
【（２）分子量】セファクリルＳ−３００ｓｕｐｅｒｆ
ｉｎｅを用いてカラムクロマトグラフィーで調べた。
ｉｎｅを用いてカラムクロマトグラフィーで調べた。
【００３３】
【（３）抗体の免疫特性】35Ｓ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎで
蛋白質を放射標識したＳＫ−ＢＲ−III細胞を可溶化
し、それにモノクローナル抗体を加え反応させ、遠心に
よる沈澱物の数回の洗浄後、ＳＤＳ電気泳動（７．５
％）で展開し、そのゲルのオートラジオグラフィーを取
ったところ、１８５ｋＤａ付近に一本のバンドが観察さ
れた。この分子量はヒトｃ−ｅｒｂＢ−２産物と同じで
あり、この抗体がｃ−ｅｒｂＢ−２産物を認識している
ことは明らかである。
蛋白質を放射標識したＳＫ−ＢＲ−III細胞を可溶化
し、それにモノクローナル抗体を加え反応させ、遠心に
よる沈澱物の数回の洗浄後、ＳＤＳ電気泳動（７．５
％）で展開し、そのゲルのオートラジオグラフィーを取
ったところ、１８５ｋＤａ付近に一本のバンドが観察さ
れた。この分子量はヒトｃ−ｅｒｂＢ−２産物と同じで
あり、この抗体がｃ−ｅｒｂＢ−２産物を認識している
ことは明らかである。
【００３４】
【実施例２】
【００３５】
【（１）アドレアマイシンの調整】メタノール又はジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＤ）液中で、アドレアマイシ
ンと３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スク
シンイミジル（ＳＰＤＰ）を等モル比で混合し、３〜６
時間反応させて、アドレアマイシンを修飾した。
チルスルホキシド（ＤＭＳＤ）液中で、アドレアマイシ
ンと３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スク
シンイミジル（ＳＰＤＰ）を等モル比で混合し、３〜６
時間反応させて、アドレアマイシンを修飾した。
【００３６】
【（２）アドレアマイシンと抗体との接合体の調製】実
施例１で調製したモノクローナル抗体とＳＰＤＰとをモ
ル比で３０〜１５０：１の割合で混合し、３０℃で３０
分間反応させた。ここでＳＰＤＰの最終濃度は５〜１０
ｍＭになるように調整し、未反応のＳＰＤＰはＰＤ−１
０カラムで除いた。
施例１で調製したモノクローナル抗体とＳＰＤＰとをモ
ル比で３０〜１５０：１の割合で混合し、３０℃で３０
分間反応させた。ここでＳＰＤＰの最終濃度は５〜１０
ｍＭになるように調整し、未反応のＳＰＤＰはＰＤ−１
０カラムで除いた。
【００３７】このようにしてＳＰＤＰで修飾したモノク
ローナル抗体と上記第（１）項で得たＳＰＤＰ修飾アド
レアマイシンとを、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリエチルア
ミン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミ
ンテトラ酢酸液中で、４℃で９０分間反応させた。未反
応のＳＰＤＰあるいはアドレアマイシンはＰＤ−１０カ
ラムで除去し、接合体を得た。
ローナル抗体と上記第（１）項で得たＳＰＤＰ修飾アド
レアマイシンとを、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリエチルア
ミン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミ
ンテトラ酢酸液中で、４℃で９０分間反応させた。未反
応のＳＰＤＰあるいはアドレアマイシンはＰＤ−１０カ
ラムで除去し、接合体を得た。
【００３８】
【実施例３】実施例２で調製したアドレアマイシンと抗
体との接合体の殺細胞効果を次の方法で確認した。本例
で用いた細胞は、次の３種類の乳腺癌細胞であって、Ｓ
Ｋ−ＢＲ−III、ＢＴ−４７４、ＭＣＦ−７、この順序
で細胞の癌遺伝子ｃ−ｅｒｂＢ−２の発現量も少なくな
っていた。
体との接合体の殺細胞効果を次の方法で確認した。本例
で用いた細胞は、次の３種類の乳腺癌細胞であって、Ｓ
Ｋ−ＢＲ−III、ＢＴ−４７４、ＭＣＦ−７、この順序
で細胞の癌遺伝子ｃ−ｅｒｂＢ−２の発現量も少なくな
っていた。
【００３９】
【（１）方法】殺細胞効果は、除菌した本接合体及びア
ドレアマイシンを、対数増殖期にある供試細胞の培養液
中に投与し、投与後７２時間して生存細胞数を計測して
判定評価した。
ドレアマイシンを、対数増殖期にある供試細胞の培養液
中に投与し、投与後７２時間して生存細胞数を計測して
判定評価した。
【００４０】細胞増殖抑制率は、上記によって測定した
生存細胞数から、細胞増殖抑制率＝（Ｃ0−Ｃ1）／Ｃ0
×１００の式にしたがって算出した。上式において、Ｃ
0は供試癌細胞に生理食塩水を投与したときの生存細胞
数、Ｃ1は前記計測生存細胞数をそれぞれ示す。
生存細胞数から、細胞増殖抑制率＝（Ｃ0−Ｃ1）／Ｃ0
×１００の式にしたがって算出した。上式において、Ｃ
0は供試癌細胞に生理食塩水を投与したときの生存細胞
数、Ｃ1は前記計測生存細胞数をそれぞれ示す。
【００４１】
【（２）結果】ＳＫ−ＢＲ−IIIに対するアドレアマイ
シン濃度と細胞増殖抑制率との関係を示すと図１のとお
りであった。図中、ａは本接合体、ｂはアドレアマイシ
ン単独投与（対照）を表わす。
シン濃度と細胞増殖抑制率との関係を示すと図１のとお
りであった。図中、ａは本接合体、ｂはアドレアマイシ
ン単独投与（対照）を表わす。
【００４２】また供試癌細胞において、抗癌剤の５０％
細胞増殖抑制率を示す抗癌剤濃度ＩＣ50を求めた結果、
下記する表２の結果が得られた。
細胞増殖抑制率を示す抗癌剤濃度ＩＣ50を求めた結果、
下記する表２の結果が得られた。
【００４３】
【表２】
【００４４】
【（３）結論】上記結果から明らかなように、本実施例
で用いた抗癌剤ａ、ｂの殺細胞効果は、癌遺伝子ｃ−ｅ
ｒｂＢ−２の発現量に依存しており、この作用機序はそ
の発現産物を介したものであることを示唆している。
で用いた抗癌剤ａ、ｂの殺細胞効果は、癌遺伝子ｃ−ｅ
ｒｂＢ−２の発現量に依存しており、この作用機序はそ
の発現産物を介したものであることを示唆している。
【００４５】またｂ／ａの項から、本発明に係る接合体
は、ＳＫ−ＢＲ−III細胞では、アドレアマイシン単独
投与に比べて約２０分の１の少量で同等のＩＣ50値が得
られることが理解される。このことは、本発明に係る接
合体がアドレアマイシン単独に比べて約２０倍の殺細胞
効果を示すものである。
は、ＳＫ−ＢＲ−III細胞では、アドレアマイシン単独
投与に比べて約２０分の１の少量で同等のＩＣ50値が得
られることが理解される。このことは、本発明に係る接
合体がアドレアマイシン単独に比べて約２０倍の殺細胞
効果を示すものである。
【００４６】更に、ＢＴ−４７４細胞で、アドレアマイ
シン単独投与では10‐7M以下の濃度では殺細胞効果は確
認されないが、本発明に係る接合体では充分な効果を示
した。このことは、アドレアマイシン単独投与で効果を
示さなくても、本発明にしたがって接合体にすることに
よって充分に効果が期待できる場合があることを示唆す
るものである。
シン単独投与では10‐7M以下の濃度では殺細胞効果は確
認されないが、本発明に係る接合体では充分な効果を示
した。このことは、アドレアマイシン単独投与で効果を
示さなくても、本発明にしたがって接合体にすることに
よって充分に効果が期待できる場合があることを示唆す
るものである。
【００４７】
【実施例４ 注射剤の製造】下記の表３に示す（１）〜
（４）の全成分を蒸留水１０００ｍｌに溶解した後、ア
ンプルに１ｍｌずつ分注して、注射剤１０００本を製造
した。
（４）の全成分を蒸留水１０００ｍｌに溶解した後、ア
ンプルに１ｍｌずつ分注して、注射剤１０００本を製造
した。
【００４８】
【表３】
【００４９】
【発明の効果】本発明は、以上述べたように、癌遺伝子
ｃ−ｅｒｂＢ−２の産物を産生する癌細胞に対して、ア
ドレアマイシン等抗癌剤単独よりも非常に有効な殺細胞
効果を示し、副作用を軽減した安全にして効果の高い新
しい抗癌剤を提供することができる。
ｃ−ｅｒｂＢ−２の産物を産生する癌細胞に対して、ア
ドレアマイシン等抗癌剤単独よりも非常に有効な殺細胞
効果を示し、副作用を軽減した安全にして効果の高い新
しい抗癌剤を提供することができる。
【図１】乳癌細胞ＳＫ−ＢＲ−IIIにおける細胞増殖抑
制率と抗癌剤濃度との関係を示したグラフである。
制率と抗癌剤濃度との関係を示したグラフである。
ａ：本発明に係る接合体 ｂ：アドレアマイシン単独投与（対照）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＤＵ 8415−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/18 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ
Claims (5)
- 【請求項１】 抗体を接合する抗癌剤と、腺癌細胞の膜
蛋白質を認識する抗体との接合体を有効成分とすること
を特徴とする抗癌剤。 - 【請求項２】 抗体を接合する抗癌剤が抗癌性抗生物質
であることを特徴とする請求項１の抗癌剤。 - 【請求項３】 抗体を接合する抗癌剤がアドレアマイシ
ンであることを特徴とする請求項２の抗癌剤。 - 【請求項４】 癌遺伝子ｃ−ｅｒｂＢ−２産物の蛋白質
アミノ酸配列中の細胞外親水部位の部分ペプチドを抗原
として得られたモノクローナル抗体を、腺癌細胞の膜蛋
白質を認識する抗体として用いることを特徴とする請求
項１〜請求項３のいずれか１項の抗癌剤。 - 【請求項５】 抗原が下記の化１で示されるアミノ酸配
列を有するペプチドであることを特徴とする請求項４の
抗癌剤。 【化１】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3303845A JPH05117165A (ja) | 1991-10-24 | 1991-10-24 | 抗癌剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3303845A JPH05117165A (ja) | 1991-10-24 | 1991-10-24 | 抗癌剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05117165A true JPH05117165A (ja) | 1993-05-14 |
Family
ID=17925999
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3303845A Pending JPH05117165A (ja) | 1991-10-24 | 1991-10-24 | 抗癌剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05117165A (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1236740A1 (de) * | 2001-02-28 | 2002-09-04 | Bio Life Science Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. | Vakzine gegen Krebserkrankungen, die mit dem HER-2/neu Onkogen assoziiert sind |
| US6627196B1 (en) | 1999-08-27 | 2003-09-30 | Genentech, Inc. | Dosages for treatment with anti-ErbB2 antibodies |
| US7041292B1 (en) | 1999-06-25 | 2006-05-09 | Genentech, Inc. | Treating prostate cancer with anti-ErbB2 antibodies |
| US7166694B2 (en) | 2000-04-13 | 2007-01-23 | Christoph Zielinski | Vaccine against cancerous diseases which is based on mimotopes of antigens expressed on tumor cells |
| EP1844788A1 (en) * | 2006-04-13 | 2007-10-17 | Bio Life Science Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. | HER-2/neu multi-peptide vaccine |
| US7371376B1 (en) | 1996-10-18 | 2008-05-13 | Genentech, Inc. | Anti-ErbB2 antibodies |
| US20130316380A1 (en) * | 2008-12-01 | 2013-11-28 | Laboratory Corporation Of America Holdings | Methods and Assays for Measuring p95 and/or p95 Complexes in a Sample and Antibodies Specific for p95 |
| US10416162B2 (en) | 2007-12-20 | 2019-09-17 | Monogram Biosciences, Inc. | Her2 diagnostic methods |
-
1991
- 1991-10-24 JP JP3303845A patent/JPH05117165A/ja active Pending
Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US10280228B2 (en) | 1999-08-27 | 2019-05-07 | Genentech, Inc. | Treatment with anti-ErbB2 antibodies |
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| US10160811B2 (en) | 1999-08-27 | 2018-12-25 | Genentech, Inc. | Treatment with anti-ErbB2 antibodies |
| US7371379B2 (en) | 1999-08-27 | 2008-05-13 | Genentech, Inc. | Dosages for treatment with anti-ErbB2 antibodies |
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| AU2002251032B2 (en) * | 2001-02-28 | 2008-01-31 | Biolife Sciences QLD Limited | Vaccine against cancer diseases that are associated with the HER-2/neu oncogene |
| EP1236740A1 (de) * | 2001-02-28 | 2002-09-04 | Bio Life Science Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. | Vakzine gegen Krebserkrankungen, die mit dem HER-2/neu Onkogen assoziiert sind |
| US7348010B2 (en) | 2001-02-28 | 2008-03-25 | Christoph Zielinski | Vaccine against cancer diseases that are associated with the her-2/neu oncogene |
| WO2002068474A1 (de) * | 2001-02-28 | 2002-09-06 | Bio Life Science Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. | Vakzine gegen krebserkrankungen, die mit dem her-2/neu onkogen assoziiert sind |
| WO2007118660A3 (en) * | 2006-04-13 | 2007-12-13 | Bio Life Science Forschungs & Entwicklungsgesellschaft Mbh | Her-2/neu multi-peptide vaccine |
| WO2007118660A2 (en) * | 2006-04-13 | 2007-10-25 | Bio Life Science Forschungs- Und Entwicklungsges M.B.H. | Her-2/neu multi-peptide vaccine |
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