JPH01502195A - 細胞毒性結合物の増強法 - Google Patents
細胞毒性結合物の増強法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
細胞毒性結合物の増強法
発明の背景
1肌へ11
この発明は一般に癌の治療に関し、より詳しくは免疫毒素の細胞毒的性質の第二
の結合していないモノクローナル抗体の同時投与による増強または増加に関する
。
結腸直腸癌は西側世界における悪性腫瘍による第二の最も一般的な死亡原因であ
る。米国癌学会は1985年において138.000人の結腸直腸癌の新たな発
生があり、又この病気により59,900人の患者が死亡したと推定している。
結腸直腸癌の患者については、過去30年間において5年間の生存率が30%台
であるという実態は変わっていない、これに寄与する主要な要因は、治癒の唯一
の期待を与えるのは病気の初期の段階における外科手術であることにより一旦腸
壁を越えて拡がると、有効な治療法のないことである。
不幸にして、大部分の患者は最初の外科手術の時に、主として明白な又は潜在的
な肝臓及びリンパ節転移を伴う拡がった疾病を持っている。
化学療法の多数の試みにもかかわらず、何等かの有意な効果を持つことを示した
唯一の薬剤は5−フルオロウラシルであるが、その反応速度は不十分であり、そ
れによる治療が最終結果に影響することはまれである。lIみ合わせ治療と肝動
脈注入が研究されているが、現在では有効な治療法を表していない。
卵巣癌は婦人のすべての癌の約5%であり、婦人の第六番目の主要な癌である。
病気が十分初期に発見されれば外科手術により治療可能であるが、この疾病の死
亡率は過去25年間に目立って改善されていない。
超音波・腹腔鏡検査法(laparoscopy又はper i toneos
copy)及びCAT(コンピューター化断層撮影)検査法は卵巣癌の診断にあ
る程度の価値を持つ、癌性胎児抗原と胎盤アルカリホスファターゼ並びに幾つか
の新しく定義された抗原のような血清標識はある腺癌患者の血液に見出だされる
が、9遍的な標識はない。
生検を伴う外科手術が卵巣癌を診断する唯一の明確な方法である。
外科手術は現在唯一の卵巣癌治療法であり、腫瘍が拡がっていない場合のみ治療
可能である。放射性同位元素の挿入、X線照射及び化学療法は卵巣癌の処置のた
めの限定された用途である。
最も重要な前兆的兆候は診断と外科手術時の腫瘍の拡がりの大きさである。第1
期卵巣腫瘍(卵巣に限定された増殖)は全体的にほぼ80%の5年間生存率を持
ち、第■期(骨盤への拡大を伴う卵巣を含む増殖)は40%の5年間生存率を持
ち、第■期(小鵬と網膜への拡大を伴う卵巣を含む増殖)は10%の5帆間生存
率を持ち、又第■期(遠方転移)は5%以下の5年間生存率を持つ、卵巣腫瘍の
相対的5年間生存率は1973〜80年に37%であり、1960〜63年の3
2%と同じである。
放射性同位元素で標識化したモノクローナル抗体(MoAbs>による卵巣腫瘍
を画像化する研究は人間及び動物体である程度行われた0人間卵巣腫瘍の外来移
植片を持つマウスの直径1−一の小さな腫瘍が画像化された。又、同じ研究によ
り10人の卵巣癌患者中8人で腫瘍が検出された。
骨肉II(OS)は最も普通の主要な骨の腫瘍である。この病気は十分初期に発
見されれば外科手術により治癒可能であるが、患者の80〜85%におけるこの
病気の経過は多発性肺転移及び診断から2年以内の死亡に至る。これらの転移は
しばしば主要な腫瘍の診断時に存在しても通常は見えるほど大きくはない。
切断は骨肉腫のすぐれた治療法である。ブロック切除と補綴置換のような肢回収
法が行われる。肢回収の全体の生存率は切断のように乏しいか更に不良である。
放射線治療は骨肉腫転移を防御することは認められなかった。
より最近の試みでは広範囲の別種付加法により治療した患者は5年目に50%を
越す生存率を記録した。これらの広範囲の治療の別種形態のすべてが有効なのか
、又は病気の自然史に何か変化があったのかが疑問である。
放射性同位元素で標識付けしたモノクローナル抗体により骨肉腫を画像化する研
究は人間と動物体である程度行われた0人間の骨肉腫の外来移植片は131■で
標識化した抗骨肉腫モノクローナル抗体を使用してヌードマウスで画像化された
。
生転移性疾患を治療するための新しい組成物と方法が必要である。
艮立ヌIIバ11
RamakrishnanとHaustonは5cience(1984年)、
223巻。
58〜61ページにおいて、クロロキンによる人間の急性リンバ芽球白血病に向
けた免疫毒素の増強について記述している。
AkiyamaらはCanncer Re5(1985年)45巻、1005〜
1007ページにおいて、シュードモナス(P seudmonms)外毒素の
抗転移受容体抗体又は表皮性成長促進物質と毒性結合物の人間腫瘍細胞に対する
細胞毒性活性は、カルシウム拮抗物質ベラパミル、D−600とジルチアゼム並
びに趨すソシーム剤β−グリシルフェニルナフチルアミドにより10〜20倍ま
で増強されると報告されている。
U ckunらはBlut(1985年)50巻、1つ一23ページにおいて、
ヤマゴボウ抗ウイルス蛋白(PAP)を含むTffl胞の指示する免疫毒素のエ
クス・ビボ(ex vivo)効果のマホスファアミド(ASTA Z 755
7)による増強について記述している。
EhrlichらはM ixing two monoclonal anti
bodiesyields enhanced afTinity for a
ntigen(抗体に対する親和力増加が得られる2つのモノクローナル抗体の
混合)”(J、lm5un、(1982年)128巻、2709〜2713ペー
ジ)という報告において、モノクローナル抗体の混合物を使用する抗体結合試験
における感度の増加について記述している。
Moyleらは”Quantitative explanation for
1ncreasedaffinity shown dy m1xtures
or son oclonal antib −odies:importa
nee of a circular complex(モノクローナル抗体の
混合物によって示される親和力増加の定量的説明:環状側合体の重要性)”(M
olec、I mmun、 (1983年)20巻。
439〜452ページ)という報告において、免疫グロブリンGl(IgG1)
マウスモノクローナル抗体の対を人間の植毛ゴナドトロピンと混合した場合に形
成される中間物質の量を予言する数学モデルについて記述している。
Wellerson R、とKaplan、P、は“Enhanced bin
dingactivity observed between anti−c
arcinoe +sbryonicmonoclonal antibodi
es(複数の癌性胎児モノクローナル抗体面に見られる結合活性の増加)”(H
ybrido曽a(1986年)5巻。
199〜213ページ)という報告において、抗原をモノクローナル抗体の特別
の混合物にさらした場合の結合の増加について記述している。
発明の要約
記述した発明は毒素に結合した抗体すなわち免疫毒素の細胞毒性の増強に関する
。細胞毒素の増加は免疫毒素が結合する同一抗原の第二のエピトープに結合する
同一抗原の第二のエピトープに結合する第二の免疫グロブリンが添加される前記
免疫毒素を含む細胞毒性カクテルによって証明される。
より特別には、ここには細胞表面抗原好ましくはMgIIを伴う抗原に対して向
いており、毒素と結合している第一の免疫グロブリンから成る免疫毒素の細胞毒
性を増加する方法であって、前記方法は抗原を表現する標的細胞を免疫毒素と前
記免疫毒素の増強するのに十分な量の第二の免疫グロブリンとにさらすことから
成り、前記第二の免疫グロブリンは抗原上の前記第一の免疫グロブリンが結合す
るのとは異なるエピトー1に結合することができる方法が記述されている。第一
と第二の免疫グロブリンは癌性胎児抗原上のエピトープと結合できるのが望まし
い。
第二の免疫グロブリンによって結合されるエピトープは癌性胎児抗原の正常交差
反応抗原の小部分の中にあるのが望ましい。
正常及び白血病性の両方のT細胞に結合する免疫グロブリンは開示の方法に有用
である。特に有用なのはCD−5抗原に対する免疫グロブリンである。この発明
に使用する特別の且つ好ましいモノクローナル抗体とそのハイブリドーマもここ
に開示されている。
上の方法の外に、ここには細胞表面抗原好ましくは腫瘍を伴う抗原上のエピトー
プと結合することができる第一の免疫グロブリンと結合している毒素と、抗原上
の前記第一の免疫グロブリンが結合するのとは異なるエピトープに結合すること
ができる第二の免疫グロブリンとを含む結合物から成る細胞毒性活性用カクテル
が記述されている。細胞毒性治療用カクテルは癌性胎児抗原上のエピトープと結
合することができる第一と第二の免疫グロブリンを包含するのが好ましい、第二
の免疫グロブリンは癌性胎児免疫グロブリンの正常交差反応抗原の小部分の巾に
あるエピトープに結合しているのが最も好ましい、正常及び白血病性の両方のT
細胞に結合する免疫グロブリンを含有するカクテルはこの発明に有用である。特
に有用なのはCD−5抗原に対する免疫グロブリンである。免疫毒素と第二の免
疫グロブリンは物理的に結合している必要があることに注意すべきである。別々
の投与もここに定義したカクテルに含まれる。
上の方法とカクテルの外に、ここには腫瘍を伴う抗原に対して向いており、毒素
と結合している第一の免疫グロブリンから成る免疫毒素の細胞毒性と増加するこ
とにより人間の癌細胞を殺す方法であって、前記方法は抗原を表現する癌細胞を
免疫毒素と抗原上の前記第一の免疫グロブリンが結合するのとは異なるエピトー
プに結合することのできる前記毒素を増強するのに十分な量の第二の免疫グロブ
リンにさらすことから成る方法が記述されている。第一と第二の免疫グロブリン
は癌性胎児抗原のエピトープに結合できることも好ましい、第二の免疫グロブリ
ンが結合するエピトープは癌性胎児抗原の正常交差反応抗原の小部分の中にある
のが最も好ましい、この方法は結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、膵臓癌細胞、肺癌細
胞、及び乳癌細胞から成る群から選ばれる癌細胞に有用である。正常及び白血病
性の両方のT細胞に結合する免疫グロブリンは開示の方法に有用である。特にC
D−5抗原に対する免疫グロブリンが有用である。
好ましい投与量は1日当たり宿主体重kg当たり約0.01mg〜20、OBで
あり、最も好ましいのは1日当たり宿主体重に、当たり0.05B〜5.0mg
である。前記免疫毒素に対する前記第二の免疫グロブリンの比率は重量で10,
000〜0.001:1であり最も好ましい前記免疫毒素に対する前記第二の免
疫グロブリンの比率は重量で100〜0.01: 1である。
第二のエピトープは2つの抗体がそれらの標的抗原上の物理的に異なる位置に結
合していることを意味する。結合は競争的でないのが好ましいが密接な接近によ
る小量の競争は受け入れられる。増強は量で示すことができ、競争の影響は免疫
毒素の免疫グロブリンに対する比率を適当に変化させることにより相殺させるこ
とができる。モノクローナル抗体はこの発明で使用するのが好ましい。
図面の簡単な説明
第1図は結腸直腸癌LS174T細胞外来移植片の増殖に珂する遊離RTAとX
MMCO−228−RTAの影響を示すグラフ区である。
好ましい実施態様の詳細な説明
この発明は結腸直腸癌、卵巣癌及び骨肉腫を含む種々な種顕の癌の治療に細胞毒
素結合物を使用する。これらの新規な結合物は細胞毒素に結合したモノクローナ
ル抗体又はその結合断片、集団的に名づけな免疫グロブリンから成る。これらの
組成物は癌細胞を殺す一方正常組織に対する損害は最小限にするために癌細胞宿
主に投与される。
この発明の免疫グロブリンは細胞宿主中の特異的癌細胞に細胞毒物質を向けるた
めの標的物質として使用される。この発明により、72キロダルトン(KD)の
糖蛋白質抗原上でエピトープを限定する免疫グロブリンと癌性胎児抗原(CEA
)上でエピトープを限定する免疫グロブリンは標的物質として使用することがで
きる。これらの抗原の1つ又は両方は結腸直腸癌、卵巣癌及び骨肉腫を含むがそ
れに限定されない種々な癌に存在する。
種々な細胞毒物質が免疫毒素としての使用に適している。この発明で考えられる
細胞毒物質はヨード−131,イツトリウム−90,レニウム−188及びビス
マス−212のような放射性核種;ビンデシン、メソトレキセート、アドリアマ
イシン及びシスプラチヌムのような多数の化学療法剤;及びヤマゴボウ抗ウイル
ス蛋白質、アブリン及びリシン(又はそのAM)を含むリポソーム不活性化蛋白
質、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素A又は組み換え誘導体、などのよう
な細胞毒蛋白質を含むことができる。一般にはrcbis+eric Toxi
ns」(キメラ状毒素)、01snee and Ph11. ”Pharmi
c、 Ther”、25巻。
355〜381ページ(1982年)、及びrMonoclonaAntibo
dies for Cancer Detection and Therap
y」(癌検出と治療のためのモノクローナル抗体)、BoldwinとB ye
rs著、159〜179ページ、224〜266ページ、Academic P
ress(1985年刊)を参照することができ、この両文献の記述は本明細
書に組み入れるものとする。
この発明で毒性レクチンは特に関心がある。毒性レクチンの細胞作用、特にリジ
ンとアブリンのそれはよく研究されている。
毒性レクチンはジスルフィド・ブリッジ(1つ又は複数)により連結される2つ
のポリペプチド鎖であるAとBから成っている。
細胞毒性はA鎖に付随しており、その有核細胞中での蛋白合成の阻害を伴ってい
る。B鎖は細胞表面の多糖類ユニットを認識し、そのようなユニットと高度の親
和性相互作用を作り出す。
一旦B鎖が細胞表面の多W顕ユニットに結合すると、A鎖は細胞内に取り入れら
れ、リポソーム蛋白質合成を阻害し、最終的には細胞死に至らしめる。リシンA
の使用はこの発明にとって好ましく、その使用は米国特許第4.590,071
号に開示されており、前記文献は参考例に組み入れる。
後に示される実施例には使用してないが、この発明に使用するためのりシン毒素
A鎖の好ましい形態は実質的に純粋なRTA−30が使用されているそれである
。用語rRTA−30、はFulton等の(J、Biol、Chew、(19
85年)、281巻、5314〜5319ページ)及びVidal等(InL、
J。
C5neer(1985年)、36巻、705〜711ページ)によって詳細に
記述されているようなほぼ30kDの分子量を持っリシン毒素Aの種類を指す、
この発明の目的のためには、RTA−30の約75%又はそれ以上の濃度を含む
RTAi整試料は実質的に純粋と見なす、MoAbとの結合に使用される実質的
に純粋なRTA−30の調製は米国特許願第074,824号に記述されており
、前記文献の記述は本明細書に組み入れる。
免疫グロブリンと毒素は一般に共有結合、より詳しくはジスルフィド結合で結合
するが如何なる化学結合によっても結合可能であり、それによって毒素が免疫グ
ロブリンと共に、標的細胞に選ばれるのを可能にする。そのような結合を達成す
る他の方法は当該技術分野で公知である。唯一の基準は結合は免疫グロブリンの
そのエピトープとの親和性を著しく減少させないように達成されなければならな
いということである。
この細胞毒性結合物は単独又は2つの又はそれ以上の結合物の組成物、他の化学
療法剤、組成物などを含むカクテルとして癌細胞宿主に投与することができる。
カクテルは多種の抗原を標的とすることが重要である不均一な腫瘍細胞を治療す
る場合に特に重要である。
この発明の細胞毒性結合物はいずれかの便利な方法で癌細胞宿主に投与すること
ができる0課題の結合物を使用する医薬組成物は非経口的、すなわち静脈内、腹
腔内などに投与することができる。従って、この発明は受容可能な担体、好まし
くは水性担体中に溶解した無パイロジエンの、細胞毒性結合物の溶液、又はその
カクテルから成る非経口投与用の組成物を提供する。
種々な水性担体、たとえば水、緩衝液、o、4g食塩水0.3zグリシンなどを
使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般に粒子物質を含まない
、これらの組成物は通常の公知のr過滅菌法により無菌化することができる。こ
の組成物は適当な生理的条件のために要求されるpH調節剤及び緩衝剤、毒性調
節剤などのような医薬的に受容しえる補助物質たとえば酢酸ナトリウム、塩化ナ
トリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含むことがで
きる。
この発明の組成物は保存と使用前適当な担体で再構成するために凍結乾燥するこ
とができる。この技術は通常の免疫グロブリンに有効であることが示されており
、公知の凍結乾燥と再構成の方法を使用することができる。凍結乾燥と再構成は
種々な程度の抗体活性の損失を生じ、使用量はそれらを補うように調節しなけれ
ばならないことは当業者に理解されるであろう。
組成物の単−又は多重投与を医師の選択する投与水準と型と共に実行することが
できる。いずれの場合も、医薬処方は癌細胞宿主を有効に治療するのに十分なこ
の発明の結合物(1つ又は複数)の量を与えるべきである。結合物又は結合物カ
クテルの投与量は大きく変えることができ、一般には約0.OIB/kg/日〜
20.0醜y/ky/日であり、又より具体的には0.05曽g/kg/日〜5
.0any/ky/日である。
結合していない免疫グロブリンの投与量は使用する免疫毒素、結合していない免
疫グロブリンの選択、腫瘍の性質と拡がり等によって大きく変動する。投与量は
一般にO/ OO1why/ kg/日〜100.00H/kf/日であり、通
常は約0.01my/ky/日〜10.0m1F/に97日であり、又より特別
には約0.1〜1ady/kg/日である。結合していない免疫グロブリンの結
合物に体する比率も大きく変動し、一般に約10,000〜0.001:1であ
り、通常は約1000〜0.01:1であり、又より特別に約100〜0.1:
1である。
課題の結合物又はカクテルを使用するためにキットを与えることもできる。かく
して、課題の組成物は通常は凍結乾燥形態で、単独又は癌治康用の付加的化学療
法剤と組み合わせて与えることができる。これらのキットはリンa緩衝剤添加食
塩水のような緩衝剤、他の不活性成分などを含むことができる。又このキットは
課題の組成物を癌細胞宿主に添加するために示唆するプロトコルを含む特別な指
示を含むこともできる。
エンドサイトシス(endocytosis)の実際の機作はよく分かっていな
いが、すべてではないにしても大部分の免疫毒素は有効であるためには標的細胞
表面抗原に結合した後取り込まれなければならない、エンドサイトシスは受容体
が表面抗原に結合することが引き金になると信じられている。
この発明により、課題の免疫毒素組成物の効果は課題の免疫毒素と共に結合して
いない免疫グロブリンを同様な径路で同時投与することにより増強することがで
きる。増強とは標的細胞を殺すという免疫毒素の効果が与えられた免疫毒素の投
与量で増加することを意味する。
次の理論はこの発明の制限と考えるべきではないが、増加した細胞毒素は第二の
免疫グロブリンの結合により生ずる抗原への増加する親和性によると信じられる
。この論拠は標的細胞抗原が限定され、関連するエピトープへの抗体結合を利用
できる場合免疫結合物の使用に広範囲の効果を持つであろう。
次の実施例は例示のために提示するのであって制限のためでBa1b/cマウス
(Bantin & King+man、U、 K、 )を詰賜癌肝臓転移の過
塩素酸抽出液から誘導した癌性胎児抗1ii(CEA)で免疫した。免疫の予定
は完全フロインドアジュバント(CFA)中10μsのCEAを0日と7日に腹
腔内に、又20μgのCEA(同じ(CFA中)を25日、56日及び63日に
腹腔内投与することから成る。
最終抗原投与の3日後、免疫したマウスから牌臓細胞を無菌的に除く、別報(G
alfre外、Nature(I 977年)、266巻。
550ページに記述されており、前記文献の記述は本明a書に組み入れる。)に
概説した方法に従って、10′の牌m細胞を106のしボキサンチンーメントレ
キセートーチミジン(HMT)感受性ネズミ骨髄腫セルライン、P3−NS I
−Ag4−1(A、T、C,C,利用番号TIB−18)と細胞融合させた。
ポリエチレングリコール(PEG)を用い、交雑細胞を96室培養板(Cast
er、Gambridge、M A # 3596 )中のラット腹腔滲出細胞
のフィーダ一層(2,5×103N胞7室)を含む培地上に置いた。
細胞は15%牛脂児血清(Fetal Ca1f Serum)(Myoelo
ne。
G 1bco、 P aisley、 U 、 K 、 )とヒボキサンチン(
10−’M)、チミジン(1,6×10−5M)(共にSigma、Dorse
t、U、 K、から購入)とメソトレキセート(10−5M)(Lederle
、 Hawpshire。
U、に、”)を含むダルベコ(D ulbecco)の改変イーグル培地(Mo
dified Eagle’s Medium)(F low Labs、I
rvine。
U、に、)で培養した。
融合f&2週間以内に、交雑細胞の培養をエンザイムイムノアッセ−(EIA)
により抗体結合を試験した。陽性の培養を96室培養板中で1〜3細胞/室を平
板培養する限定希釈を用いるクローニングを行った。1コロニーのみを含む室を
ま微鏡試験により確認し、次いでCEAと正常結腸抗原(N CA ’)との反
応性をETAとラジオイムノアッセー(RI A)により、又−次結腸直腸腫瘍
と正常結腸からの核外膜との反応性をEIAにより試験した。XMMCO−22
8と標示したクローンは安定に免疫グロブリンを分泌することが認められ、前記
免疫グロブリンは標準方法を用いる固相RIAによりIH02gのサブクラスで
あると決定された。ハイブリドーマXMMCO−228は12301 Park
lown Dr、 、Rockville、MD 20852゜tJsAに所在
するAmerican Type Cu1ture Co11ection(A
、T、C,C,)に寄託されている。寄託は1986年8月14日に行い、A、
T、C,C,寄託番号HB 9174が与えられた。
6〜10週令のBa1b/cマウス(Banten & K ing+man。
U、に、)を用いハイブリドーマを腹腔内で培養した。3週間早(0,5mNの
ブリスタン(pristane)(A ldidge、G 1llir+gha
−。
Dorset、U、 K、 )を腹腔内(i、 p、 )に注射して前処理した
マウスにほぼ107ハイブリドーマ細胞を注射した。生ずる腹水をハイブリドー
マ注射後3週間に集め、これをPr1ceとBoldwinの方法(I CR3
Med、 Sei、 (1984年)12巻。
1000〜01ページに記述されており、前記文献の記述は本明m書に組み入れ
る。)により免疫グロブリンの測により5my7’alの抗体を含んでいた。
腹水中の抗体は当業者に公知の方法を用いるS epharase −P ro
teinAを使用するアフィニティークロマトグラフに精製した。
ハイブリドーマはプラスチック8300mlのボトルに入れた10%牛脂児血清
(Myoclone、Gibco、Pa1sley、U、 K、 )としホキサ
ンチン(10−4M)、チミジン(1,6×1O−58)(共にSigma。
Dorset、U 、 K 、から購入)とメソトレキセート(10−’M)(
Leder!e、Hampsbire、U、 K、 )を含むダルベコの最小必
須培地(へfini偕al Es5ential Mediu蓋)(Fiow
Labs、Irvine。
U、に、)でイン、ビトロで増殖させた0m胞濃度は4〜5日の培養期間にわた
って105細胞7’al・培地であり、モノクローナル抗体の濃度は4μg/s
rl・培地、ダブリング・タイムは12時間であった。
XMMCO−228のMKN45al胞の結合を当業者に公知であり、上に記述
したフロー・サイトメトリー(flowcyromeLry)により測定した。
胃癌セルライン、MKN45はXMMCO−791モノクローナル抗体と反応す
る72kDの抗原とXMMCO−228と反応するCEA抗原を表現する。
B14は乳癌に対して向けられたモノクローナル抗体であり、CEA抗原の正常
交差反応抗原(NCA)の小部分と反応する。
それは実施例■に記述されている。正常のマウス血清を対照として使用した。結
果を第1表に要約する。
籠上民
フロー イトメト1−によるMKN45 の叶ムモノ ローナル 王立1光光支
X M M CO−228987
1に4′:A る
XMMCO−228つつき間接イムノパーオキシダーゼ結合物法を用いて正常細
胞との交差反応性を評価した。対照として、組織を精製したネズミのモノクロー
ナル抗体で同一濃度で同時に試験した。この目的に使用した対照の免疫グロブリ
ンはI gG 2マウス骨髄腫蛋白質(UPC10,LittonBionet
ics、Kensington、MD)又はヒツジ赤血球細胞(SRBC)に反
応性を持つモノクローナル抗体であった。
新鮮な組織切片(厚さ2〜3mm、幅2c+sまで)をオブチマル・カッティン
グ、テンベレーチャー・コンパウンド(OptimalCutting Tem
perature Compound)(OCT)(A’mes Co、。
E 1khar、 I ndiana)でゆったり覆い、アルミニウム箔で包ん
だ。
標本は液体窒素冷却イソペンタン(2−メチルブタン、VWR。
Norwald、CA)中で制御された温度(−120”C〜−150”C)で
10〜15秒瞬間凍結した0組織は組織の蒸発と乾燥を防ぐため気密に密閉した
容器中で一70℃で長期間、−20”C短期間凍結保存された。
凍結組繊は凍結片の切り出しに先立ち、−35℃の凍結庫に於いて一夜かけてゆ
っくり平衡させる。切片は染色に先立ち室温で一夜乾燥した。
ダイヤモンド・ペンシルを用いて各スライドグラスの切片の周りを円形にエツチ
ングする。次いでスライドはアセトン中で1分間固定し、次にリン酸緩衝液添加
食塩水(PBS)で10分間洗浄した。過剰の液体を除き、組織を覆い乾燥しな
いように確保しながら、−次抗体を1時開に渡って塗布し、次いでPBSで10
分間洗浄した。
過剰の液体を除き、パーオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウス免疫グロブリンG(T
ago/商品コード6450)(PBS中で1=10に希釈)330分間塗布し
、次いで10分間PBSで洗浄した。
スライドをアミノエチルカルバゾール
メチルホルムアミド中1201のAECの保存液の0.5mj!,9.5ーlの
酢酸塩緩衝液(79mlの0.1M酢酸ナトリウム、21社の0.IN酢酸)、
及び0 、05mfの3%H20□)中で5分間発色し、次いで5分間水で洗浄
した.次いでスライドは新鮮なマイヤーのヘマトキシリン(Mayer’s H
aematoxylin)で5分間逆染色し、次いで流水中で5分間洗浄し、グ
リセリンマウント培地でそっと覆った.第■表はその結果の要約である。
イムノパーオキシダーゼにより測定した抗体の正常組織への ム
結腸直腸癌 515染色陽性の群の約9ozは強く染色55 は 、に い7
剖検組織 陰性組織−
腎臓
膵臓
筋肉
肝臓
皮膚
心臓
翠丸
膵臓
を髄
腎
大動脈
小脳
リンパ節
疑問(+/−)
肺臓
陽性−
1+
注: グルコース・オキシダーゼ法では抗体228は顆粒球は染色しないことが
示された.我々が研究したCEAと類似のはとんとすべてが他の抗体は顆粒球を
染色した。
XMMCO−228が顆粒球に結合しないのは重要なことである.正常な結腸抗
[(NCA)は正常な結腸、顆粒球及び先祖の骨髄細胞のような多様な組織に現
れる,CEA抗原はNCA小片を持つので、抗CEAモノクローナル抗体は種々
な正常組識上でNCAを結合するが、XMMCO−228モノクローナル抗体は
そうしない。
D.XMMCO−228リシン毒−A RTA+ムリジンのAMの精製を含む結
合法は米国特許第4.590。
071号に開示されており、前記開示は本明細書に組み入れらXMMCO−22
8−RTA結合物のイン・ビトロでの細胞毒性を75Se−セレノメチオニン分
析法により測定した.胃癌から誘導したMKN45細胞の単細胞悲濁液に免疫毒
素又はRTAを15分間接種し、洗浄し、平底微量測定板に10%牛脂児血清を
含むRPMI培地中免疫毒素又はRTAの0.2dに対して105の細胞の濃度
で添加した.免疫毒素の種々な量を各室に添加した.24時間後、?SSeーセ
レノメチオニンを各室に添加した.培養を更に16時間室温保持し、洗浄し、室
の底面上で乾燥し、室をガンマ計数器で計算した.結果は50%阻害濃度で表す
第■表に要約されている。
第n
MKN451 に るイン・ビトロ6
1−1 1旦上工吐/加■
RT A 2238
XMMCO−228−RTA 600
1−I IC0モル゛庁1
RTA I X 10−”M
XMMCO−228−RTA lXl0−”M1等価のRTAモル濃度に調節し
た。
F、u タ − −のXMMCO−228−RTAによる血I
各データ時点で、7〜10匹のヌードマウスに人間結腸腺癌から誘導したセルラ
イン(A、T、C,C,寄託番号CL188)であるLS174T細胞を移植し
た。移if後3日目に治療化合物の最初の投与を行い引き続いて予定投与が完了
するまで10〜20回の投与な行った。結果は第■表に要約されており、対照(
治療せず)マウスの腫瘍重量で除した治療マウスの腫瘍重量の比で表している。
平均腫瘍直径で表した結果は第1表にグラフで要約しである。
剃り夫
X M M CO−228−RT Aに る 日 夕 の゛ 2、応答
外来移植 予定投与 治療区の腫瘍重量2 LS 174T XMHCO−22
8801,183LS 174T XMMCO−228−RTA 56 0 、
3にれらの結果は人間腫瘍外来移植片の治療におけるXMMCO−228−RT
Aの結果を実証している。
II:XMMCO−791−RTAとX M M CO−228−RTAの −
ル
A、XMMCO−791−RTA+XMMCO−228−RTA士ム −ル
XMMCO−228RTA(Scand、J、Immuno。
(1983年)18巻、411〜420ページ)とX M M C○−228−
RTAのカクテルは、XMHCO−791−R,TAとX M M C○−22
8−RTAの任官の比率の混合物から成り、癌細胞宿主に対して約0.01m1
9/に1?/日〜20.OB/kg/日の投与範囲で投与することができる。カ
クテルはリン酸緩衝液添加食塩水などのような適当な媒体中で、非経口的、一般
的には静脈内注入又は腹腔内注射により投与される。
B、ま七′ クールのイン・ビトロでのJfflX M M C○−228−R
TA結合物のイン・ビトロ細胞毒性を75Se−セレノメチオニン分析法により
測定した。胃癌から誘導したMKN45細胞の単細胞懸濁液に免疫毒素又はRT
Aを15分分間様し、洗浄し、平底微量測定板に10%牛脂児血清を含むRPM
I培地中免疫毒素又はRTAの0.2mlに対して105の:f3胞の濃度で添
加した。免疫毒素の種々な量を各室に添加した。24時間後、1 S S e−
セレノメチオニンを各室に添加した。培養を更に16時面室温保持し、洗浄し、
室の底面上で乾燥し、室3ガンマ計数器で計算した。結果は50%阻害濃度で表
す第■表に要約されている。
これらのデータはXMMCO−791−RTAとX M M C0−228−R
TAを「カクテル」形態で投与した場合、細胞毒性は少なくとも相加的、そして
恐らく相乗的であることを示している。又それらは、RT A単独と比較した免
疫毒素(又は抗体)が指導するR T Aの効果も示している。
C−8のXMMCO−791−RTA+XMMCO−228−RTA″にム ク
ールによる5、各データ時点で、7〜10匹のヌードマウスに誘導したセルライ
ンであるMKN45細胞を移植した。移植後38目に治療化合物の最初の投与を
行い、引き続いて予定投与が完了するまで10〜20回の投与を行った。結果は
第7表に要約されており、対照(治療せず)マウスの腫瘍重量で除した治療マウ
スの腫瘍重量の比で表している。
lL友
XMMCO−228−RTAによる人間腫瘍外来移植片−一員裏五胎瀝
応答
外来移植 治療 予定投与 治療区の腫瘍重量!!−仙倉1−旺乙−−肚乱殴!
I MKN 45 XMMCO−228−RTA25 0.74χMMCO−2
28− 25 1.1
2 HKN 45 XMMCO−228−RTA軍 0.56%MMCO−79
1−RTA
1各々25 mLi/ klFのXMMCO−228−RTAとXMMCO−7
91−RTAを混合物として投与した。
これらのデータはX!LMCO−791−RTAとXMMCo−228−RTA
を「カクテル」形態で投与した場合、細胞毒性は少なくとも相加的、そして恐ら
く相乗的であることを示している。それらはXMMCO−791−RTAとX
M M CO−228−4TAから成るカクテルの宿主における腫瘍細胞の効果
も示している。
: XMMCO−228−RTAのX M M B R−B14モノクローナル
都ζL乞11
A、XMF、1BR−B14バイブ史上:づト列耳ズーBa1b/cマウスを腹
水症胸部転移から誘導された521AM全細胞で免疫した。免疫予定は1週間間
隔で105の細胞を6回腹腔内注射することから成っている。!&終の3X10
’の細胞の静脈内投与は融合の3日前に行った。最終抗原投与の3日後、免疫し
たマウスの膵臓細胞を無菌的に除いた。単細胞懸濁液を80メツシユW4状ふる
い#1985−00080(Belleo)を使用して得た。細胞をイスコーブ
ス完全培地(I scovesComplete Mediun)(Grand
l5land、N、Y、、N、Y、)で洗浄して計数した。ヒボキサンチン−
アミノプリテン−チミジン(HAT)感受性ネズミ骨髄腫セルラインであるS
p 2 / A g14RB胞(A、T、C,C,利用番号CRL1581)を
3回洗浄し計数した。30%(V/V)のポリエチレングリコール(PEG40
00 Merck)、10%のジメチルスルホキシド及び60%のイスコーブス
培地を用いて、骨髄腫細胞1に対して膵臓細胞2の比率で細胞融合させた。融合
生成物を105骨髄腫細胞/室の濃度で96室培養平板に添加した。細胞は20
%牛胎児血清とHAT培地(ヒポキサンチン136my/ 100ral。
アミノプテリン0.018B/ 100 ml、チミジン136B/100論1
)を含むβメルカプトエタノールを添加したイスコーブス培地で培養した。
融合後2週間以内に、ハイブリドーマ細胞の培養を反応性を試験すためV ec
tor L ads A B Cキットを用いて200μgをニトロセルロース
膜に点状に添加することにより521AM腫瘍細胞に対する抗体結合を試験した
。次いで青色の点を示した室に付き、同一患者の腺維芽細胞膜抽出液に対して選
別試験を行った。陽性の培養を96室培養板中で1〜3細胞/室を平板培養する
限定希釈を用いるクローニングを行った。1コロニーのみを含む室を顕微鏡試験
により確認し、次いで反応性を調べた。XMMBR−B14と標示したクローン
は安定に免疫グロブリンを分泌することが認められ、前記免疫グロブリンはIg
G1のサブクラスであると決定された。ハイブリドーマXMMBR−B14は現
在12301 Parklawn Dr、 。
Rockville、MD 20852 、U SAに所在するAll1eri
canType Cu1ture Co11ection(A、 T、 C,C
,)に寄託されている。寄託は1987年1月14日行われ、A、T、C,C。
寄託番号HB 9308が与えられた。
6〜10週令のB alb/マウス(Bantin & Kingman、U/
に/)を用い、ハイブリドーマを腹腔内で培養した。3週間早(0,5mlのブ
リスタン(pristane) (A Idridge、 G if l in
gham。
Dorset、U、 K、 )を腹腔内(i、 p、 )に注射して前処理した
マウスにほぼ107のハイブリドーマ細胞を注射した。生ずる腹水をハイブリド
ーマ注射後3週間に集め、これをPr1ceとBoldwinの方法(ICR3
Med、Sei、(1984年)12巻。
1000〜01ページに記述されおり、前記文献は参考例に組み入れる。)によ
り免疫グロブリンの測定により5tsg/va1の抗体な含んでいた。
腹水中の抗体は当業者に公知の方法を用いるS epharase −P ro
tein Aを使用するアフィニティー・クロマトグラフにより精製した。
ハイブリドーマはプラスチック製300社のボトルに入れた20%牛脂児血清と
βメルカプトエタノールを添加したイスコーブス培地中でイン・ビトロで増殖さ
せクローニングした。細胞濃度は4〜5日の培養期間にわたって105細胞/社
・培地であり、モノクローナル抗体の濃度は4μg7’nl・培地、ダブリング
タイムは12時間であった。
B、フロー イトメトリーによ したイン・ビトロ・のXMMBR−B14の−
への仕ム
XMMBR−814のセルラインと一次癌誘導細胞への結合を当業者に公知であ
り上に記述したフロー・サイトメトリーにより測定した。XMMBR−B14は
乳癌と結腸癌セルライン上で表現される抗原を検出することが試験(第■表)に
より示された。精製した蛋白質調製試料を用いた別の研究は、XMMBR−81
4で限定されたエピトープはCEA/NCA(癌性胎児抗原/正常交差反応抗y
K)と名づけな分類の抗原上に認められることを証明した。これはさらした正常
交差反応抗原とも交差反応するCEA分子の部分である。それは2つの一次結腸
癌から誘導された細胞とも反応する。正常マウス免疫グロブリン(NMl、)又
は正常マウス血清(NMS)を対照として用いた。
策l民
フロー・ イトメト1−に 々t への4′4:A蛍 光
皿善JLIII m 五」μ」i 【直上ム
結腸癌C170NMIg 19.3 −(Low CEA) B14B8 60
.4±結腸癌LS174T NM IE 22.2 −(Line 1) 81
4B8 2641.74+結騙癌LS174T NM rg 18.6 −(L
ine 2) 814BS 1665.63÷乳癌BT474−3 NM Ig
17.3 −814B8 316.41−2+
2、−゛″疹−
C212NMS 31.4−
814B8 607.53+
C213NMS 33.8−
814B!3 836.84+
C,エン イムイム・ ツセーEIAによ したXMMBR−B 4の44:
、 F 4+ のXMMBR−B14につき当技術分野で公知の標準のEIA法
を用いて一次結腸癌膜と正常結腸粘膜との反応性を試験した。
第1表に要約した試験はXMMBR−B14が結腸癌膜と反応することを示して
いる。
第1JL
EIAによる4+“ への仕4
皮1l−−ELIS^ユニ・・ト0DCEA調製試料正常結賜膜 結腸癌膜
(NP、) (TP、) (T186) (B2O33)XMMBR−B14
0.130 0.581 0.758 0.665TP、−プールした一次結腸
癌からの膜調製試料NP、−プールした正常結腸粘膜からの膜調製試料(結腸癌
患者がらの)
T186一−次結賜癌T186からの膜調製試料CEAB4058−仕、Pの
か 制CE^・ ;D、XMMBR−B14のCEA NCAへの ムXMMB
R−B14のCEAとNCA調製試料との反応性を固相ラジオイムノアッセーに
より測定した。簡単にいうと、抗原調製試料を微量測定板の室内で被覆した0次
いでモノクローナル抗体を添加し、1〜2時間室温保持し、よく洗浄した0次い
で結合したネズミのモノクローナル抗体を検出するため125工で標識付けした
ウサギ抗マウスIgGのF (ab) 2 I!7r片を添加した。第1表。
最初の試験で半精製したC E A (Ro(ers)とN CA (B399
1)へのモノクローナル抗体の結合を比較した。XMMBR−B14はNCAと
CEAの両方に結合した(N CA :CE Aの比率は1.2ニア)。
第1=
XMMBR−B14のCEA NCAへの仕ム抗 体 平均結合CPM士標準偏
差
−バッ −ランド
CEA Ro ers NCA(B3991抗CE^ 1427±222 44
3±48XMMBR−8142558±114 955±140E0MNK45
4 に・ るX M M CO−228−RT Aの細へのXMMBR−B14
の 応“
第1表はXMMBR−B14の添加量と増加した搗きのMNK45細胞に対する
X M M CO228RT A免疫毒素の細胞毒性の増加を示している。
1 ny/ va1〜100 ng/ mlにわたるXMMCO−228−RT
Aの濃度を使用して6つの異なる曲線が生じた。これらの濃度に対して0〜10
μ3/m1にわたるXMMBR−814の種々な量を添加した。各々の曲線につ
いて計算したIC5o値を第1表に示す。
第JAIL
XMMBR−814が生産するモノクローナル抗体のXMMCO−228−RT
AMI胞毒性に対する用量応答MNK45 Cells
XMMBR−814t)’)U−fk抗体 MKN45細胞ニ対t ルXMMC
O−228−RTA(μy/mi’) の細胞毒性 (ICso ny/m/)
0.001 113
0.00 155
この発明の種々な癌の治療に有効で新規な配合物と方法を提供する。細胞毒性結
合物はある種の結合してないモノクローナル抗体とのカクテル形態又はその存在
下で特に有効である。
この発明は明瞭な理解の目的のために例証と実施例によりある程度詳細に記述し
たが添付の請求の範囲の範囲内で一定の変化と修正を行い得ることは明らかであ
る。
謄嶌披徨傷時馨(日)
国際調査報告
Claims (24)
- 1.抗原を表現する標的細胞を免疫毒素と前記免疫毒素を増強するのに十分な量 の、前記抗原上の第一の免疫グロブリンが結合するのとは異なるエピトーブに若 合することができる第二の免疫グロブリンとにさらすことから成る、前記標的細 胞上の細胞表面抗原に対して向いており、毒素と結合している前記第一の免疫グ ロブリンから成る前記免疫毒素細胞毒性を増強する方法。
- 2.抗原は腫瘍を伴う抗原である請求の範囲第1項記載の方法。
- 3.第一と第二の免疫グロブリンは癌性胎児抗原を表現する腫瘍細胞上のエピト ープに結合することができる請求の範囲第2項記載の方法。
- 4.第二の免疫グロブリンが結合するエピトープは癌性胎児抗原の正常交差反応 抗原の中にある請求の範囲第3項記載の方法。
- 5.第一の免疫グロブリンはRTAに結合したXXMMCO−228であり、第 二の免疫グロブリンはXXMBR−B14である請求の範囲第4項記載の方法。
- 6.第一と第二の免疫グロブリンはT細胞上の抗原に結合することができる請求 の範囲第1項記載の方法。
- 7.抗原はCD−5である請求の範囲第1項記載の方法。
- 8.抗原は白血病性T細胞上にある請求の範囲第1項記載の方法。
- 9.細胞表面抗原上のエピトーブと結合することのできる第一の免疫グロブリン と結合している毒素と、抗原上の前記第一の免疫グロブリンが結合するのとは異 なるエピトーブに結合することができる第二の免疫グロブリンとを含む結合物か ら成る細胞毒性治療カクテル。
- 10.抗原は腫瘍を伴う抗原である請求の範囲第9項記載のカクテル。
- 11.第一と第二の免疫グロブリンは癌性胎児抗原を表現する腫瘍細胞上のエヒ トーブに結合することができる請求の範囲第9項記載のカクテル。
- 12.第二の免疫グロブリンが結合するエピトーブは癌性胎児抗原の正常交差反 応抗原の中にある請求の範囲第11項記載のカクテル。
- 13.第一の免疫グロブリンはRTAに結合したXXMMCO−228であり、 第二の免疫グロブリンはXXMBR−B14である請求の範囲第12項記載のカ クテル。
- 14.第一と第二の免疫グロブリンはT細胞上の抗原に結合することができる請 求の範囲第9項記載のカクテル。
- 15.抗原はCD−5である請求の範囲第14項記載のカクテル。
- 16.腫瘍を伴う抗原を表現する癌細胞を免疫毒素と前記免疫毒素を増強するの に十分な量の、前記腫瘍を伴う抗原上の第一の免疫グロブリンが結合するのと異 なるエピトーブに結合することができる第二の免疫グロブリンとにさらすことか ら成る、前記腫瘍を伴う抗原に対して向いており、毒素と結合している前記第一 の免疫グロブリンから成る前記免疫毒素の細胞毒性を増強することにより人間の 癌を殺す方法。
- 17.第一と第二の免疫グロブリンは癌性胎児抗原を表現する腫瘍細胞上のエピ トーブに結合することができる請求の範囲第16項記載の方法。
- 18.第二の免疫グロブリンが結合するエピトーブは癌性胎児抗原の正常交差反 応抗原の小部分の中にある請求の範囲第17項記載の方法。
- 19.第一の免疫グロブリンはRTAに結合したXXMMCO−228であり、 第二の免疫グロブリンはXXMBR−B14である請求の範囲第18項記載の方 法。
- 20.癌細胞は結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、膵臓癌細胞、肺癌細胞及び乳癌細胞 から成る群より選ばれる請求の範囲第16項記載の方法。
- 21.第一と第二の免疫グロブリンはT細胞上の抗原に結合することができる請 求の範囲第16項記載の方法。
- 22.抗原はCD−5である請求の範囲第21項記載の方法。
- 23.抗原は白血病性T細胞上にある請求の範囲第21項記載の方法。
- 24.第二の免疫グロブリンの第一の免疫グロブリンに対する比率は重量で10 0〜0.01:1である請求の範囲第16項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US704587A | 1987-01-27 | 1987-01-27 | |
US007,045 | 1987-01-27 |
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---|---|
JPH01502195A true JPH01502195A (ja) | 1989-08-03 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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