JPH0550273B2 - - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
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Description
請求の範囲
１ 蛋白質をコードするDNA配列により形質転
換された細胞が増殖する際に、高度に不溶性の凝
集体を形成する、１または２個の表面システイン
残基を有する蛋白質の精製法において、(a)前記形
質転換細胞を破壊し、(b)前記蛋白質をケイオトロ
ープ剤による蛋白質の可溶化によつて抽出し、(c)
前記蛋白質をケイオトロープ剤の急速な希釈もし
くは除去によつて復元させ、かつ(d)前記蛋白質を
チオール樹脂における共有クロマトグラフイーと
それに続く分子寸法決定クロマトグラフイーとに
よつて精製して１または２個の表面システイン残
基を特徴とする構造で前記蛋白質を得る工程から
なることを特徴とする蛋白質の精製法。
換された細胞が増殖する際に、高度に不溶性の凝
集体を形成する、１または２個の表面システイン
残基を有する蛋白質の精製法において、(a)前記形
質転換細胞を破壊し、(b)前記蛋白質をケイオトロ
ープ剤による蛋白質の可溶化によつて抽出し、(c)
前記蛋白質をケイオトロープ剤の急速な希釈もし
くは除去によつて復元させ、かつ(d)前記蛋白質を
チオール樹脂における共有クロマトグラフイーと
それに続く分子寸法決定クロマトグラフイーとに
よつて精製して１または２個の表面システイン残
基を特徴とする構造で前記蛋白質を得る工程から
なることを特徴とする蛋白質の精製法。
２ 蛋白質凝集体が、これを生産する細胞の増殖
に際し包蔵体を形成する請求の範囲第１項記載の
方法。
に際し包蔵体を形成する請求の範囲第１項記載の
方法。
３ 形質転換細胞がイー・コリ（E.coli）細胞で
ある請求の範囲第１項記載の方法。
ある請求の範囲第１項記載の方法。
４ 蛋白質がその本来の構造で得られるヒトγ−
インタフエロン（HuIFN−γ）である請求の範
囲第１項記載の方法。
インタフエロン（HuIFN−γ）である請求の範
囲第１項記載の方法。
５ ケイオトロープ剤がグアニジン塩酸塩である
請求の範囲第１項記載の方法。
請求の範囲第１項記載の方法。
６ ケイオトロープ剤が尿素である請求の範囲第
１項記載の方法。
１項記載の方法。
７ 急速希釈を、例えばリン酸塩緩衝塩水および
炭水化物を含有するような水性生理緩衝液で行う
請求の範囲第１項記載の方法。
炭水化物を含有するような水性生理緩衝液で行う
請求の範囲第１項記載の方法。
８ 炭水化物が蔗糖である請求の範囲第１項記載
の方法。
の方法。
９ 蛋白質を還元剤によつてチオール樹脂から溶
出させる請求の範囲第１項記載の方法。
出させる請求の範囲第１項記載の方法。
１０ 還元剤がジチオスレイトールまたはシステ
インである請求の範囲第９項記載の方法。
インである請求の範囲第９項記載の方法。
１１ ケイオトロープ剤による蛋白質の可溶化の
後、蛋白質の濃度を約１mg／mlに調整して、蛋白
質分子の全ゆる静電相互作用を低減する請求の範
囲第１項記載の方法。
後、蛋白質の濃度を約１mg／mlに調整して、蛋白
質分子の全ゆる静電相互作用を低減する請求の範
囲第１項記載の方法。
１２ ヒトγ−インタフエロンを生成するに際
し、(a)γ−インタフエロンをコードするDNA配
列により形質転換された細胞を破壊し、(b)γ−イ
ンタフエロンをケイオトロープ剤によるγ−イン
タフエロンの可溶化によつて抽出し、(c)得られる
可溶化されたγ−インタフエロンを希釈して約１
mg／mlの濃度とし、(d)γ−インタフエロンをケイ
オトロープ剤の急速な希釈もしくは除去によつて
復元させ、かつ(e)γ−インタフエロンをチオール
樹脂における共有クロマトグラフイーとそれに続
く分子寸法決定クロマトグラフイーとによつて精
製する工程からなることを特徴とする蛋白質の精
製法。
し、(a)γ−インタフエロンをコードするDNA配
列により形質転換された細胞を破壊し、(b)γ−イ
ンタフエロンをケイオトロープ剤によるγ−イン
タフエロンの可溶化によつて抽出し、(c)得られる
可溶化されたγ−インタフエロンを希釈して約１
mg／mlの濃度とし、(d)γ−インタフエロンをケイ
オトロープ剤の急速な希釈もしくは除去によつて
復元させ、かつ(e)γ−インタフエロンをチオール
樹脂における共有クロマトグラフイーとそれに続
く分子寸法決定クロマトグラフイーとによつて精
製する工程からなることを特徴とする蛋白質の精
製法。
発明の技術的分野
本発明は蛋白質の精製法に関するものである。
さらに詳細には本発明は、蛋白質をコードする
DNA配列によつて形質転換された細胞の増殖に
際し高度に不溶性の凝集体を形成し、３個未満の
表面システインアミノ酸残基を特徴とする構造を
形成するようこれら細胞の抽出物から可溶化させ
かつ復元させうる蛋白質の精製法に関するもので
ある。
さらに詳細には本発明は、蛋白質をコードする
DNA配列によつて形質転換された細胞の増殖に
際し高度に不溶性の凝集体を形成し、３個未満の
表面システインアミノ酸残基を特徴とする構造を
形成するようこれら細胞の抽出物から可溶化させ
かつ復元させうる蛋白質の精製法に関するもので
ある。
本発明の方法により精製される好適蛋白質は、
免疫すなわちγインタフエロン（IFN−γ）であ
る。本発明により製造される精製した同質の安定
なγインタフエロンは、ウイルス感染、腫瘍また
は癌の治療処置、並びに免疫変調の用途および方
法に利用することができる。
免疫すなわちγインタフエロン（IFN−γ）であ
る。本発明により製造される精製した同質の安定
なγインタフエロンは、ウイルス感染、腫瘍また
は癌の治療処置、並びに免疫変調の用途および方
法に利用することができる。
発明の背景
たとえば沈澱、モレキユラシーブクロマトグラ
フイー、電気泳動、親和性クロマトグラフイーお
よび共有結合クロマトグラフイーのような精製法
が当業界で周知されており、細胞抽出物から蛋白
質を精製する際に利用されている。しかしなが
ら、蛋白質をコードする組換DNA配列により形
質転換された細胞によつて生産される蛋白質の精
製には独特かつ困難な問題がある。
フイー、電気泳動、親和性クロマトグラフイーお
よび共有結合クロマトグラフイーのような精製法
が当業界で周知されており、細胞抽出物から蛋白
質を精製する際に利用されている。しかしなが
ら、蛋白質をコードする組換DNA配列により形
質転換された細胞によつて生産される蛋白質の精
製には独特かつ困難な問題がある。
好ましくは組換DNA配列の発現レベルは高く、
したがつてこのDNA配列により形質転換された
宿主細胞は細胞内に所望の蛋白質を多量に生産す
る。したがつて、形質転換細胞は多数の外来蛋白
質分子を蓄積する。これらの蛋白質分子は次いで
互いに反応して、通常の細胞には典型的には見ら
れないような高度に不溶性の凝集体を形成する。
次いで宿主細胞はこの異常な外来蛋白質の蓄積に
対し、外来蛋白質凝集体よりなる包蔵体を形成し
て反応する。したがつて、生物学上活性な形態の
これら外来蛋白質の精製には、これら高度に不溶
性の蛋白質凝集体を可溶化してその元来の構造を
保持し或いは回復しうる手段を必要とし、さらに
蛋白質の生物学的活性を維持するように可溶性蛋
白質を精製する手段を必要とする。
したがつてこのDNA配列により形質転換された
宿主細胞は細胞内に所望の蛋白質を多量に生産す
る。したがつて、形質転換細胞は多数の外来蛋白
質分子を蓄積する。これらの蛋白質分子は次いで
互いに反応して、通常の細胞には典型的には見ら
れないような高度に不溶性の凝集体を形成する。
次いで宿主細胞はこの異常な外来蛋白質の蓄積に
対し、外来蛋白質凝集体よりなる包蔵体を形成し
て反応する。したがつて、生物学上活性な形態の
これら外来蛋白質の精製には、これら高度に不溶
性の蛋白質凝集体を可溶化してその元来の構造を
保持し或いは回復しうる手段を必要とし、さらに
蛋白質の生物学的活性を維持するように可溶性蛋
白質を精製する手段を必要とする。
保健分野で価値の大きい遺伝子工学処理された
蛋白質はインタフエロンである。この分野におい
てはネイチヤー、第286巻、第110頁（1980年７月
10日）に報告されインタフエロンの命名が使用さ
れる。「IFN」はインタフエロンを意味し、「IFN
−α」は白血球インタフエロンを意味し、「IFN
−β」は繊維芽インタフエロンを意味し、また
「IFN−γ」はγ−インタフエロンを意味する。
蛋白質はインタフエロンである。この分野におい
てはネイチヤー、第286巻、第110頁（1980年７月
10日）に報告されインタフエロンの命名が使用さ
れる。「IFN」はインタフエロンを意味し、「IFN
−α」は白血球インタフエロンを意味し、「IFN
−β」は繊維芽インタフエロンを意味し、また
「IFN−γ」はγ−インタフエロンを意味する。
IFNは、細胞RNAの誘発およびウイルス複製
に向けられる蛋白質合成を介し広範囲のウイルス
に対して抗ウイルス活性を示す細胞蛋白質であ
る。たとえば、ヒトIFNは次のウイルス活性に対
処するために使用されている：呼吸器感染〔テキ
サス・レポート・オン・バイオロジー・アンド・
メジスン、第35巻、第486−96頁（1977）（以下こ
れをテキサスレポートと呼ぶ）〕；単純疱疹角膜炎
〔テキサスレポート、第497−500頁；R.サンドマ
ツハー、「エキソジニアス・インタフエロン・イ
ン・アイ・デイジーズ」、インターナシヨナル・
バイロロジー、ザー・ハーグ、アブストラク
ト、No.ｗ2/22、第99頁（1978）〕；急性出血合併症
〔テキサスレポート、第501−10頁〕；アデノウイ
ルス結膜炎〔A.ロマノ等、ISMメモＩ−A8131
（1979年10月）〕；帯状疱疹〔テキサスレポート、
第511−15頁〕；チトネガロウイルス感染〔テキサ
スレポート、第523−27頁〕；およびＢ型肝炎〔テ
キサスレポート、第516−22頁〕。さらにW.E.ス
チユワート、ザ・インタフエロン・システム、
第307−21頁、スプリンガー出版（第２版）
（1981）をも参照することができる（以下、これ
をザ・インタフエロンシステムと呼ぶ）。
に向けられる蛋白質合成を介し広範囲のウイルス
に対して抗ウイルス活性を示す細胞蛋白質であ
る。たとえば、ヒトIFNは次のウイルス活性に対
処するために使用されている：呼吸器感染〔テキ
サス・レポート・オン・バイオロジー・アンド・
メジスン、第35巻、第486−96頁（1977）（以下こ
れをテキサスレポートと呼ぶ）〕；単純疱疹角膜炎
〔テキサスレポート、第497−500頁；R.サンドマ
ツハー、「エキソジニアス・インタフエロン・イ
ン・アイ・デイジーズ」、インターナシヨナル・
バイロロジー、ザー・ハーグ、アブストラク
ト、No.ｗ2/22、第99頁（1978）〕；急性出血合併症
〔テキサスレポート、第501−10頁〕；アデノウイ
ルス結膜炎〔A.ロマノ等、ISMメモＩ−A8131
（1979年10月）〕；帯状疱疹〔テキサスレポート、
第511−15頁〕；チトネガロウイルス感染〔テキサ
スレポート、第523−27頁〕；およびＢ型肝炎〔テ
キサスレポート、第516−22頁〕。さらにW.E.ス
チユワート、ザ・インタフエロン・システム、
第307−21頁、スプリンガー出版（第２版）
（1981）をも参照することができる（以下、これ
をザ・インタフエロンシステムと呼ぶ）。
IFNは、その抗ウイルス作用に加えて他の作用
をも示す。たとえば、これはコロニー刺戟因子の
作用に拮抗し、増血コロニー形成細胞の増殖を阻
止し、かつ顆粒球およびマクロフアージ先駆体の
正常な分化を阻害する〔テキサスレポート、第
343−49頁〕。さらに、これはDMSO処理された
フレンド白血病細胞における赤血球分化を阻害す
る〔テキサスレポート、第420−28頁〕。
をも示す。たとえば、これはコロニー刺戟因子の
作用に拮抗し、増血コロニー形成細胞の増殖を阻
止し、かつ顆粒球およびマクロフアージ先駆体の
正常な分化を阻害する〔テキサスレポート、第
343−49頁〕。さらに、これはDMSO処理された
フレンド白血病細胞における赤血球分化を阻害す
る〔テキサスレポート、第420−28頁〕。
さらに、IFNは免疫反応の調節に役割を演ず
る。たとえば、抗原に関する使用量および使用時
間に応じて、IFNは生体内および試験管内におい
て免疫促進性になりうると共に、免疫抑制的にも
なりうる〔テキサスレポート、第357−69頁〕。さ
さらに、IFNはキラーリンパ球の活性および抗体
依存性の細胞媒介細胞毒性を向上させることも知
られている〔R.R.ハーバーマン等、「天然かつ抗
体依存性のヒト細胞媒介細胞毒性のインタフエロ
ンによる開始」、ネイチヤー、第227巻、第221−
23頁（1979）；P.ビバリーおよびD.ナント、「死滅
は自然におこる」、ネイチヤー、第278巻、第119
−20頁（1979）；テキサスレポート、第375−80
頁；J.R.ハドルストーン等、「インタフエロン治
療の後のヒトにおける天然キラー細胞の誘発およ
び動力学」、ネイチヤー、第282巻、第417−19頁
（1979）；S.アインホルン等、「ヒトにおけるイン
タフエロンおよび自然の細胞毒性、第号、外来
白血球インタフエロンを接種した患者の研究」、
アクタ・メジカ・スカンジナビヤ、第204巻、第
478−83頁（1978）〕。
る。たとえば、抗原に関する使用量および使用時
間に応じて、IFNは生体内および試験管内におい
て免疫促進性になりうると共に、免疫抑制的にも
なりうる〔テキサスレポート、第357−69頁〕。さ
さらに、IFNはキラーリンパ球の活性および抗体
依存性の細胞媒介細胞毒性を向上させることも知
られている〔R.R.ハーバーマン等、「天然かつ抗
体依存性のヒト細胞媒介細胞毒性のインタフエロ
ンによる開始」、ネイチヤー、第227巻、第221−
23頁（1979）；P.ビバリーおよびD.ナント、「死滅
は自然におこる」、ネイチヤー、第278巻、第119
−20頁（1979）；テキサスレポート、第375−80
頁；J.R.ハドルストーン等、「インタフエロン治
療の後のヒトにおける天然キラー細胞の誘発およ
び動力学」、ネイチヤー、第282巻、第417−19頁
（1979）；S.アインホルン等、「ヒトにおけるイン
タフエロンおよび自然の細胞毒性、第号、外来
白血球インタフエロンを接種した患者の研究」、
アクタ・メジカ・スカンジナビヤ、第204巻、第
478−83頁（1978）〕。
キラーリンパ球および抗体依存性の細胞媒介細
胞毒性は、腫瘍細胞に対する免疫学的作用に直接
または間接に関与する。したがつて、抗ウイルス
剤としての使用に加え、IFNは抗腫瘍および抗癌
治療並びに免疫変調剤および方法において有力な
用途を有する〔ザ・インタフエロン・システム、
第319−21頁、第250−56頁〕。現在では、IFNは
多くの動物における多種類の腫瘍の増殖に作用す
ることが知られている〔ザ・インタフエロン・シ
ステム、第292−304頁〕。インタフエロンは、他
の抗腫瘍剤と同様に、小さい腫瘍に向けられた場
合、特に有効であると思われる。動物IFNの抗腫
瘍作用は投与量および時間に依存するが、この作
用は毒性レベル以下の濃度で示されている。した
がつて、多くの研究および臨床試験が、ヒトIFN
の抗腫瘍および抗癌特性について行なわれ続けて
いる。これらは、たとえば卵巣癌、急性骨髄白血
病、多発性骨髄腫およびホジキンス病などの幾つ
かの悪性病の治療を含む〔テキサスレポート、第
429−35頁〕。これら臨床試験の結果は有利なもの
であつたが、抗腫瘍、抗癌および免疫変調などの
ヒトIFNの用途は精製IFNの充分な供給ができな
いため著しく阻害されている。
胞毒性は、腫瘍細胞に対する免疫学的作用に直接
または間接に関与する。したがつて、抗ウイルス
剤としての使用に加え、IFNは抗腫瘍および抗癌
治療並びに免疫変調剤および方法において有力な
用途を有する〔ザ・インタフエロン・システム、
第319−21頁、第250−56頁〕。現在では、IFNは
多くの動物における多種類の腫瘍の増殖に作用す
ることが知られている〔ザ・インタフエロン・シ
ステム、第292−304頁〕。インタフエロンは、他
の抗腫瘍剤と同様に、小さい腫瘍に向けられた場
合、特に有効であると思われる。動物IFNの抗腫
瘍作用は投与量および時間に依存するが、この作
用は毒性レベル以下の濃度で示されている。した
がつて、多くの研究および臨床試験が、ヒトIFN
の抗腫瘍および抗癌特性について行なわれ続けて
いる。これらは、たとえば卵巣癌、急性骨髄白血
病、多発性骨髄腫およびホジキンス病などの幾つ
かの悪性病の治療を含む〔テキサスレポート、第
429−35頁〕。これら臨床試験の結果は有利なもの
であつたが、抗腫瘍、抗癌および免疫変調などの
ヒトIFNの用途は精製IFNの充分な供給ができな
いため著しく阻害されている。
インタフエロンは２つの群、すなわち型およ
び型のIFNに分類されている：型のIFNはウ
イルスまたは合成ポリヌクレオチドにより誘発さ
れる「典型的」な酸安定性のIFNであり、一般に
２種類、すなわちIFN−αおよびIFN−βよりな
つている。型のIFNはIFN−γと命名された１
種類のみであり、これは当業界でγインタフエロ
ンとも呼ばれる。
び型のIFNに分類されている：型のIFNはウ
イルスまたは合成ポリヌクレオチドにより誘発さ
れる「典型的」な酸安定性のIFNであり、一般に
２種類、すなわちIFN−αおよびIFN−βよりな
つている。型のIFNはIFN−γと命名された１
種類のみであり、これは当業界でγインタフエロ
ンとも呼ばれる。
IFN−γは特殊抗原または各種のミトゲンによ
りリンパ球において誘発されるグリコ蛋白質であ
り、IFN−αおよびIFN−βとは抗原的に異なつ
ている〔A.ミズラヒ等、「インタフエロンのグリ
コシド化」、ジヤーナル・バイオロジカル・ケミ
ストリー、第253巻、第7612−15頁（1978）；ザ・
インタフエロン・システム、第107−08頁；P.グ
レー等、「イー・コリおよびサル細胞におけるヒ
ト免疫インタフエロンcDNAの発現」、ネイチヤ
ー、第285巻、第503−08頁（1982）；M.P.ラング
フオード等、「ヒト免疫インタフエロンの大規模
生産および物理化学的特性」、インフエクシヨ
ン・アンド・イミユーニテイ、第26巻、第36−41
頁（1979）〕。その蛋白質は40000〜46000ダルトン
の分子量を有すると報告されており、そのグリコ
シル化型は65000〜70000ダルトンの分子量を有す
る可能性がある。酸不安定性（PH２において）で
ある他、IFN−γは56℃にて１時間後に失活され
ると報告されている。これについてはさらに、
M.デレー等、「ミトゲンによりヒト白血球で誘発
されるインタフエロン：生産、部分精製および特
性化」、ヨーロピアン・ジヤーナル・イミユノロ
ジー、第10巻、第877−83頁（1980）；Y.K.イツ
プ等、「ヒトγ（免疫）インタフエロンの部分精製
および特性化」、プロシーデイング・ナシヨナ
ル・アカデミー・サイエンス、USA、第78巻、
第1601−05頁（1981）も参照することができる。
IFN−γはIFN−αもしくはIFN−βとは異なる
細胞受容体を識別すると報告されている〔A.A.
ブランカ等、「型および型のインタフエロン
は異なる受容体を有するという証明」、ネイチヤ
ー、第294巻、第768−70頁（1981）〕。
りリンパ球において誘発されるグリコ蛋白質であ
り、IFN−αおよびIFN−βとは抗原的に異なつ
ている〔A.ミズラヒ等、「インタフエロンのグリ
コシド化」、ジヤーナル・バイオロジカル・ケミ
ストリー、第253巻、第7612−15頁（1978）；ザ・
インタフエロン・システム、第107−08頁；P.グ
レー等、「イー・コリおよびサル細胞におけるヒ
ト免疫インタフエロンcDNAの発現」、ネイチヤ
ー、第285巻、第503−08頁（1982）；M.P.ラング
フオード等、「ヒト免疫インタフエロンの大規模
生産および物理化学的特性」、インフエクシヨ
ン・アンド・イミユーニテイ、第26巻、第36−41
頁（1979）〕。その蛋白質は40000〜46000ダルトン
の分子量を有すると報告されており、そのグリコ
シル化型は65000〜70000ダルトンの分子量を有す
る可能性がある。酸不安定性（PH２において）で
ある他、IFN−γは56℃にて１時間後に失活され
ると報告されている。これについてはさらに、
M.デレー等、「ミトゲンによりヒト白血球で誘発
されるインタフエロン：生産、部分精製および特
性化」、ヨーロピアン・ジヤーナル・イミユノロ
ジー、第10巻、第877−83頁（1980）；Y.K.イツ
プ等、「ヒトγ（免疫）インタフエロンの部分精製
および特性化」、プロシーデイング・ナシヨナ
ル・アカデミー・サイエンス、USA、第78巻、
第1601−05頁（1981）も参照することができる。
IFN−γはIFN−αもしくはIFN−βとは異なる
細胞受容体を識別すると報告されている〔A.A.
ブランカ等、「型および型のインタフエロン
は異なる受容体を有するという証明」、ネイチヤ
ー、第294巻、第768−70頁（1981）〕。
IFN−γは、その抗ウイルス活性に加え、抗腫
瘍活性をも示すと報告されている。さらに、IFN
−αおよびIFN−βと比較して、IFN−γの抗腫
瘍活性は少なくともネズミにおいて腫瘍の退化を
もたらすと思われる。さらに、その天然キラー細
胞の活性化はIFN−αおよびIFN−βにつき観察
されるように頭打ちとならず、かつIFN−γは
IFN−αおよびIFN−βよりもガングリオシドの
循環レベルによる抑制が低いと思われる〔H.ア
ルケル等、「ネズミの繊維芽インタフエロン（
型）および免疫インタフエロン（型）：ガング
リオシドに対する親和性およびネズミの白血病Ｌ
−1210R細胞に対する抗ウイルスおよび抗増殖作
用における顕著な相違」、プロシーデイング・ナ
シヨナル・アカデミー・サイエンス、USA、第
77巻、第2528−32頁（1980）〕。したがつて、IFN
−αもしくはIFN−βに対し貧弱な反応を示す細
胞または腫瘍は、IFN−γによつて効果的に処置
されうると思われる〔たとえばクレイン等、ジヤ
ーナル・ナシヨナル・カンサー・インスチチユー
ト・第61巻、第891頁（1978）；バーン等、アブス
トラクト・ニユーヨーク・アカデミー・サイエン
ス、第11号（1979年10月23−26日）；ブラロツク
等、セルラー・イミユノロジー、第49巻、第390
−94頁（1980）；B.Y.ルビン等、「抗ウイルスお
よび抗増殖剤としてのヒト型および型インタ
フエロンの効果の差」、プロシーデイング・ナシ
ヨナル・アカデミー・サイエンス、USA、第77
巻、第5928−32頁（1980）〕。
瘍活性をも示すと報告されている。さらに、IFN
−αおよびIFN−βと比較して、IFN−γの抗腫
瘍活性は少なくともネズミにおいて腫瘍の退化を
もたらすと思われる。さらに、その天然キラー細
胞の活性化はIFN−αおよびIFN−βにつき観察
されるように頭打ちとならず、かつIFN−γは
IFN−αおよびIFN−βよりもガングリオシドの
循環レベルによる抑制が低いと思われる〔H.ア
ルケル等、「ネズミの繊維芽インタフエロン（
型）および免疫インタフエロン（型）：ガング
リオシドに対する親和性およびネズミの白血病Ｌ
−1210R細胞に対する抗ウイルスおよび抗増殖作
用における顕著な相違」、プロシーデイング・ナ
シヨナル・アカデミー・サイエンス、USA、第
77巻、第2528−32頁（1980）〕。したがつて、IFN
−αもしくはIFN−βに対し貧弱な反応を示す細
胞または腫瘍は、IFN−γによつて効果的に処置
されうると思われる〔たとえばクレイン等、ジヤ
ーナル・ナシヨナル・カンサー・インスチチユー
ト・第61巻、第891頁（1978）；バーン等、アブス
トラクト・ニユーヨーク・アカデミー・サイエン
ス、第11号（1979年10月23−26日）；ブラロツク
等、セルラー・イミユノロジー、第49巻、第390
−94頁（1980）；B.Y.ルビン等、「抗ウイルスお
よび抗増殖剤としてのヒト型および型インタ
フエロンの効果の差」、プロシーデイング・ナシ
ヨナル・アカデミー・サイエンス、USA、第77
巻、第5928−32頁（1980）〕。
さらに、IFN−γの主たる機能は免疫調節剤と
してであることが示唆されている。形質転換細胞
に対するIFN−γの抗増殖作用は、IFN−αまた
はIFN−βの10〜100倍大きいと報告されている
〔P.W.グレー等、上記〕。
してであることが示唆されている。形質転換細胞
に対するIFN−γの抗増殖作用は、IFN−αまた
はIFN−βの10〜100倍大きいと報告されている
〔P.W.グレー等、上記〕。
ヒト細胞からのヒトIFN−γを精製するため、
幾つかの技術が開示されている。この種の１つの
技術は、調節細孔のガラス（CPG）およびコン
カナバリンＡ−セフアローズに対する順次の吸着
に続いてDEAB−セフアセルに対する吸着によ
つてヒト白血病の培養物からのIFN−γを精製す
ることである〔Y.K.イツプ等、「２種類のヒトγ
（免疫）インタフエロンの精製」、プロシーデイン
グ・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス、
USA、第79巻、第1820−24頁（1982）〕。他の技
術は、1983年５月３日付けでI.A.ブローデに対し
発行された米国特許第4382027号公報に記載され
ている。IFN−γはCPGビーズ、コンカナバリ
ンＡ−セフアロース、レンチル・レクチン−セフ
アロースもしくは豆レクチン−アガロースおよび
ヘパリン−セフアロースまたはプロシアン・レツ
ド−アガロースに対する順次の吸着に続くゲル濾
過クロマトグラフイーによつて、ミトゲン誘発ヒ
ト末梢血液白血球からほぼ同質となるまで精製さ
れる。これについては、さらにM.P.ラングフオ
ード、上記；M.ビラスウスカ−スチユワート等、
「ヒトおよびネズミインタフエロン型の産生、
部分精製および特性化」、モレキユラ・イミユノ
ロジー、第12巻、第623−25頁（1980）；M.デレ
ー等、上記；Y.K.イツプ等、「ヒトγ（免疫）イ
ンタフエロンの部分精製および特性化」、プロシ
ーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サイエン
ス、USA、第78巻、第1601−05頁（1981）；J.A.
ジヨージエイド、「ヒトインタフエロンγ
（HuIFN−γ）の産生および精製」、テキサス・
レポート・オン・バイオロジー・アンド・メジス
ン、第41巻、第179−83頁（1981−82）を参照す
ることができる。
幾つかの技術が開示されている。この種の１つの
技術は、調節細孔のガラス（CPG）およびコン
カナバリンＡ−セフアローズに対する順次の吸着
に続いてDEAB−セフアセルに対する吸着によ
つてヒト白血病の培養物からのIFN−γを精製す
ることである〔Y.K.イツプ等、「２種類のヒトγ
（免疫）インタフエロンの精製」、プロシーデイン
グ・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス、
USA、第79巻、第1820−24頁（1982）〕。他の技
術は、1983年５月３日付けでI.A.ブローデに対し
発行された米国特許第4382027号公報に記載され
ている。IFN−γはCPGビーズ、コンカナバリ
ンＡ−セフアロース、レンチル・レクチン−セフ
アロースもしくは豆レクチン−アガロースおよび
ヘパリン−セフアロースまたはプロシアン・レツ
ド−アガロースに対する順次の吸着に続くゲル濾
過クロマトグラフイーによつて、ミトゲン誘発ヒ
ト末梢血液白血球からほぼ同質となるまで精製さ
れる。これについては、さらにM.P.ラングフオ
ード、上記；M.ビラスウスカ−スチユワート等、
「ヒトおよびネズミインタフエロン型の産生、
部分精製および特性化」、モレキユラ・イミユノ
ロジー、第12巻、第623−25頁（1980）；M.デレ
ー等、上記；Y.K.イツプ等、「ヒトγ（免疫）イ
ンタフエロンの部分精製および特性化」、プロシ
ーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サイエン
ス、USA、第78巻、第1601−05頁（1981）；J.A.
ジヨージエイド、「ヒトインタフエロンγ
（HuIFN−γ）の産生および精製」、テキサス・
レポート・オン・バイオロジー・アンド・メジス
ン、第41巻、第179−83頁（1981−82）を参照す
ることができる。
ヒト細胞からのヒトIFN−γを精製する標準法
は、精製用の充分量のIFN−γを生産するため、
抗原もしくはミトゲンによる細胞の誘発または刺
戟を必要とする。たとえば、J.A.ジヨージエイ
ズ、上記を参照することができる。しかしなが
ら、これらの精製法によつてさえ臨床試験或いは
抗ウイルス、抗腫瘍、抗癌もしくは免疫変調法お
よび薬剤において大規模使用するのに充分量の
IFN−γを生産することはできない。
は、精製用の充分量のIFN−γを生産するため、
抗原もしくはミトゲンによる細胞の誘発または刺
戟を必要とする。たとえば、J.A.ジヨージエイ
ズ、上記を参照することができる。しかしなが
ら、これらの精製法によつてさえ臨床試験或いは
抗ウイルス、抗腫瘍、抗癌もしくは免疫変調法お
よび薬剤において大規模使用するのに充分量の
IFN−γを生産することはできない。
ヒトIFN−γをコードするDNA配列をクロー
ン化させかつ宿主細胞で発現させる遺伝子工学の
技術は、多量の蛋白質の生産を可能にする。しか
しながら、多くの遺伝子工学による蛋白質の場合
と同様に、宿主で産生されるヒトIFN−γは高度
に不溶性の蛋白質凝集体の形態である。したがつ
て、産生された各種の宿主の抽出物からIFN−γ
を単離しかつ精製するのは極めて困難であること
が判明した。これらの精製問題は、抗ウイルス、
抗癌および免疫変調法および薬剤に使用するのに
必要な量でIFN−γを入手しうることを妨げてい
る。
ン化させかつ宿主細胞で発現させる遺伝子工学の
技術は、多量の蛋白質の生産を可能にする。しか
しながら、多くの遺伝子工学による蛋白質の場合
と同様に、宿主で産生されるヒトIFN−γは高度
に不溶性の蛋白質凝集体の形態である。したがつ
て、産生された各種の宿主の抽出物からIFN−γ
を単離しかつ精製するのは極めて困難であること
が判明した。これらの精製問題は、抗ウイルス、
抗癌および免疫変調法および薬剤に使用するのに
必要な量でIFN−γを入手しうることを妨げてい
る。
発明の開示
本発明は、遺伝子工学技術により生産された蛋
白質の精製法を提供することにより上記の問題を
解決し、この蛋白質はこれをコードするDNA配
列によつて形質転換された細胞の増殖に際し高度
に不溶性の凝集体を形成すると共に、３個未満の
表面システイン残基を特徴とする構造を形成する
よう可溶化させかつ復元させることができる。
白質の精製法を提供することにより上記の問題を
解決し、この蛋白質はこれをコードするDNA配
列によつて形質転換された細胞の増殖に際し高度
に不溶性の凝集体を形成すると共に、３個未満の
表面システイン残基を特徴とする構造を形成する
よう可溶化させかつ復元させることができる。
特に本発明の目的は、遺伝子工学処理された蛋
白質、すなわち、ヒトIFN−γを安定かつ元来の
構造にて精製する手段を提供することである。
白質、すなわち、ヒトIFN−γを安定かつ元来の
構造にて精製する手段を提供することである。
さらに本発明の目的は、ヒトにおける治療処置
に使用するためのIFN−γを精製された同質かつ
安定な非抗原製剤として提供することである。
に使用するためのIFN−γを精製された同質かつ
安定な非抗原製剤として提供することである。
特定具体例において、本発明は(1)IFN−γをコ
ードするDNA配列で形質転換されかつこれら配
列を細胞内で不溶性の複数凝集体またはこれら凝
集体を含有する包蔵体を形成させるような程度ま
で発現する細胞を破壊し、(2)ケイオトロープ剤で
の可溶化によつてIFN−γ蛋白質を抽出し、(3)ケ
イオトロープ剤の急速希釈または除去によつて可
溶性蛋白質をその元来の構成まで復元させ、かつ
(4)チオール樹脂における共有結合クロマトグラフ
イーに続き寸法決定クロマトグラフイーによつて
蛋白質を精製する工程からなつている。その元構
成で得られる精製されたIFN−γを使用して、治
療的にヒトのウイルス感染、腫瘍または癌に対処
しかつ免疫変調用途に使用することができる。
ードするDNA配列で形質転換されかつこれら配
列を細胞内で不溶性の複数凝集体またはこれら凝
集体を含有する包蔵体を形成させるような程度ま
で発現する細胞を破壊し、(2)ケイオトロープ剤で
の可溶化によつてIFN−γ蛋白質を抽出し、(3)ケ
イオトロープ剤の急速希釈または除去によつて可
溶性蛋白質をその元来の構成まで復元させ、かつ
(4)チオール樹脂における共有結合クロマトグラフ
イーに続き寸法決定クロマトグラフイーによつて
蛋白質を精製する工程からなつている。その元構
成で得られる精製されたIFN−γを使用して、治
療的にヒトのウイルス感染、腫瘍または癌に対処
しかつ免疫変調用途に使用することができる。
３個未満の表面システインを有する他の蛋白質
も、本発明にしたがつて同様に生産しかつ精製す
ることができる。
も、本発明にしたがつて同様に生産しかつ精製す
ることができる。
発明を実施する最良方法
ここに記載した本発明をより良く理解しうるよ
う、以下群細に説明する。
う、以下群細に説明する。
本発明は、IFN−γ並びに蛋白質をコードする
DNA配列により形質転換された細胞で生産され
る３個未満の表面システイン残基を有する他の蛋
白質を精製するための方法を提供する。本発明の
方法は、精製された蛋白質生成物を与えるだけで
なく、ヒトに投与するのに適した安定な天然構造
の蛋白質を与える。
DNA配列により形質転換された細胞で生産され
る３個未満の表面システイン残基を有する他の蛋
白質を精製するための方法を提供する。本発明の
方法は、精製された蛋白質生成物を与えるだけで
なく、ヒトに投与するのに適した安定な天然構造
の蛋白質を与える。
IFN−γを産生しかつ精製する本発明の好適実
施例においては、IFN−γのための遺伝子を有し
かつIFN−γ蛋白質の形態で遺伝子を発現するプ
ラスミドにて形質転換されたイー・コリ細胞を培
着増殖させる。この種の細胞は一般に、全細胞蛋
白質含有量に対し10〜40％の範囲のIFN−γの発
現程度を示す。この高度の発現は、細胞内に疏水
性反応により互いに結合された多数のIFN−γの
モノマーよりなる不溶性の複数凝集体を形成す
る。細菌細胞は典型的には細胞の細胞質内の包蔵
体にこれら凝集体を封入する。
施例においては、IFN−γのための遺伝子を有し
かつIFN−γ蛋白質の形態で遺伝子を発現するプ
ラスミドにて形質転換されたイー・コリ細胞を培
着増殖させる。この種の細胞は一般に、全細胞蛋
白質含有量に対し10〜40％の範囲のIFN−γの発
現程度を示す。この高度の発現は、細胞内に疏水
性反応により互いに結合された多数のIFN−γの
モノマーよりなる不溶性の複数凝集体を形成す
る。細菌細胞は典型的には細胞の細胞質内の包蔵
体にこれら凝集体を封入する。
本発明による方法の最初の工程は、これら形質
転換細胞を破壊してIFN−γ含有の包蔵体を遊離
させることを必要とする。細胞懸濁物を先ずリゾ
チームで処理し、この酵素は細菌細胞壁のペプチ
ドグリカン外層を消化して、細胞を浸透圧もしく
は機械的破壊をより受け易くする。完全な細胞破
壊は、たとえばフランスプレスまたはマントン−
ガウリンを用いて機械的破壊により達成される。
得られた細胞物質の遠心分離により、細胞中に存
在する全IFN−γの99％を含有する膜ペレツトを
生成させ、これはまだ複数の凝集体または包蔵体
の形態である。さらに、このペレツトは脂質とリ
ポ多糖類と微量の核酸とを含有する。殆んどのイ
ー・コリ蛋白質は可溶性であるため、ペレツト蛋
白質の約70％がIFN−γである。
転換細胞を破壊してIFN−γ含有の包蔵体を遊離
させることを必要とする。細胞懸濁物を先ずリゾ
チームで処理し、この酵素は細菌細胞壁のペプチ
ドグリカン外層を消化して、細胞を浸透圧もしく
は機械的破壊をより受け易くする。完全な細胞破
壊は、たとえばフランスプレスまたはマントン−
ガウリンを用いて機械的破壊により達成される。
得られた細胞物質の遠心分離により、細胞中に存
在する全IFN−γの99％を含有する膜ペレツトを
生成させ、これはまだ複数の凝集体または包蔵体
の形態である。さらに、このペレツトは脂質とリ
ポ多糖類と微量の核酸とを含有する。殆んどのイ
ー・コリ蛋白質は可溶性であるため、ペレツト蛋
白質の約70％がIFN−γである。
本発明の次の工程は、たとえばグアニジン塩酸
塩または尿素のようなケイオトロープ剤での処理
によるIFN−γの可溶化である。これらの薬剤
は、不溶性蛋白質凝集体を可溶化させる能力が知
られている。膜ペレツトをケイオトロープ剤と共
にホモゲナイズして、IFN−γの複数凝集体を可
溶性の個々の分解した蛋白質モノマーへ変換させ
る。可溶化しない物質を遠心分離により除去す
る。さらに、ケイオトロープ剤での処理は、燐脂
質とリポ多糖類と核酸とを同様にペレツト内で可
溶させることも了解すべきである。
塩または尿素のようなケイオトロープ剤での処理
によるIFN−γの可溶化である。これらの薬剤
は、不溶性蛋白質凝集体を可溶化させる能力が知
られている。膜ペレツトをケイオトロープ剤と共
にホモゲナイズして、IFN−γの複数凝集体を可
溶性の個々の分解した蛋白質モノマーへ変換させ
る。可溶化しない物質を遠心分離により除去す
る。さらに、ケイオトロープ剤での処理は、燐脂
質とリポ多糖類と核酸とを同様にペレツト内で可
溶させることも了解すべきである。
IFN−γ蛋白質の復元は、水性生理緩衝液での
ケイオトロープ抽出物の急速希釈によりケイオト
ロープ剤の濃度を低下させることによつて達成さ
れる。個々のIFN−γモノマーは安定な天然構造
に戻り、かつ溶液中に溶解した状態を保つ。しか
しながら、IFN−γの場合、可溶化したIFN溶液
の蛋白質濃度は最初に約１mg／mlに調節して希釈
または除去に際し可溶性の天然蛋白質を充分回収
しうるようにせねばならないことが判明した。よ
り高い蛋白質濃度はケイオトロープ剤の希釈また
は除去に際しモノマー間での静電相互反応を促進
して、蛋白質の分解および可溶化を阻害する。し
たがつて、ケイオトロープ含有の可溶化したIFN
溶液は、最初にケイオトロープ剤含有緩衝液によ
り約１mg／１mlの蛋白質濃度まで希釈される。
ケイオトロープ抽出物の急速希釈によりケイオト
ロープ剤の濃度を低下させることによつて達成さ
れる。個々のIFN−γモノマーは安定な天然構造
に戻り、かつ溶液中に溶解した状態を保つ。しか
しながら、IFN−γの場合、可溶化したIFN溶液
の蛋白質濃度は最初に約１mg／mlに調節して希釈
または除去に際し可溶性の天然蛋白質を充分回収
しうるようにせねばならないことが判明した。よ
り高い蛋白質濃度はケイオトロープ剤の希釈また
は除去に際しモノマー間での静電相互反応を促進
して、蛋白質の分解および可溶化を阻害する。し
たがつて、ケイオトロープ含有の可溶化したIFN
溶液は、最初にケイオトロープ剤含有緩衝液によ
り約１mg／１mlの蛋白質濃度まで希釈される。
次いで、ケイオトロープ抽出物をPBS（燐酸塩
緩衝塩水）およびたとえば蔗糖のような炭水化物
を含有する水性生理緩衝液で希釈して復元を行な
う。この希釈工程は次の２つの機能を示す：(1)こ
の希釈はケイオトロープ剤濃度を減少させて蛋白
質を分解し、かつ(2)希釈緩衝液における炭水化物
の存在は蛋白質から天然構造への復元に際し、
IFN−γの疏水性領域を安定化させる。
緩衝塩水）およびたとえば蔗糖のような炭水化物
を含有する水性生理緩衝液で希釈して復元を行な
う。この希釈工程は次の２つの機能を示す：(1)こ
の希釈はケイオトロープ剤濃度を減少させて蛋白
質を分解し、かつ(2)希釈緩衝液における炭水化物
の存在は蛋白質から天然構造への復元に際し、
IFN−γの疏水性領域を安定化させる。
希釈工程に続いて、可溶性の元蛋白質の60％が
回収される。IFN−γの40％は沈澱物として損失
され、これは濾過により除去される。この沈澱物
は、復元の弱かつたIFN−γ分子と燐脂質および
核酸汚染物との相互作用によつて生ずる。かくし
て、この復元工程は、IFN−γを可溶性の原型で
与えるだけでなく、元蛋白質分子を燐脂質、核酸
および蛋白質凝集体の汚染物から分離する選択機
構でもある。
回収される。IFN−γの40％は沈澱物として損失
され、これは濾過により除去される。この沈澱物
は、復元の弱かつたIFN−γ分子と燐脂質および
核酸汚染物との相互作用によつて生ずる。かくし
て、この復元工程は、IFN−γを可溶性の原型で
与えるだけでなく、元蛋白質分子を燐脂質、核酸
および蛋白質凝集体の汚染物から分離する選択機
構でもある。
この復元工程の第２の具体例は、抽出物中の可
溶化脂質に対し高度の親和性を有する洗剤の添加
を必要とする。抽出物における燐脂質は洗剤で被
覆されてミセルを形成し、かくして上記のような
可溶性IFN−γの沈澱形成および損失をもたらす
ような静電相互作用を防止する。次いで、ケイオ
トロープ剤を透析または透析濾過により溶液から
除去することができ、かつ洗剤とミセルとを親和
性クロマトグラフイーにより除去することができ
る。
溶化脂質に対し高度の親和性を有する洗剤の添加
を必要とする。抽出物における燐脂質は洗剤で被
覆されてミセルを形成し、かくして上記のような
可溶性IFN−γの沈澱形成および損失をもたらす
ような静電相互作用を防止する。次いで、ケイオ
トロープ剤を透析または透析濾過により溶液から
除去することができ、かつ洗剤とミセルとを親和
性クロマトグラフイーにより除去することができ
る。
復元工程の後に得られた濾液は、約85％純度の
IFN−γである。しかしながら、可溶性のイー・
コリ蛋白質がまだ溶液を汚染している。IFN−γ
を精製しかつ濃縮するには、濾液をたとえば活性
化チオール−セフアロースのようなチオール樹脂
を用いて共有結合クロマトグラフイーにかける。
バツチ式吸着を行ない、この場合スルフヒドリル
側鎖を有する樹脂、すなわちセフアロースビーズ
を濾液に加える。この溶液を撹拌しかつカラムに
ポンプ輸送して、回収樹脂の充填カラムを形成す
る。
IFN−γである。しかしながら、可溶性のイー・
コリ蛋白質がまだ溶液を汚染している。IFN−γ
を精製しかつ濃縮するには、濾液をたとえば活性
化チオール−セフアロースのようなチオール樹脂
を用いて共有結合クロマトグラフイーにかける。
バツチ式吸着を行ない、この場合スルフヒドリル
側鎖を有する樹脂、すなわちセフアロースビーズ
を濾液に加える。この溶液を撹拌しかつカラムに
ポンプ輸送して、回収樹脂の充填カラムを形成す
る。
天然構造におけるIFN−γはそのアミノ末端に
２個の表面システインを含有するので、濾液に対
するスルフヒドリル含有樹脂の添加は樹脂上のス
ルフヒドリル基およびIFN−γの酸化をもたらし
て、両者間にジスルフイド結合を形成する。かく
して、溶液中のIFN−γはジスルフイド結合を介
して樹脂に共有結合され、かつ溶液中の残存蛋白
質は樹脂カラムを通過し、その流過容量を捨て
る。
２個の表面システインを含有するので、濾液に対
するスルフヒドリル含有樹脂の添加は樹脂上のス
ルフヒドリル基およびIFN−γの酸化をもたらし
て、両者間にジスルフイド結合を形成する。かく
して、溶液中のIFN−γはジスルフイド結合を介
して樹脂に共有結合され、かつ溶液中の残存蛋白
質は樹脂カラムを通過し、その流過容量を捨て
る。
この技術は、イー・コリ細胞から抽出された
IFN−γの精製に特に適していることに注目され
る。何故なら、イー・コリ蛋白質は一般に表面シ
ステイン残基を欠如し、したがつて濾液中の可溶
性イー・コリ蛋白質汚染物は樹脂カラムに結合し
ないからである。さらに、この工程は、表面シス
テインを有する天然構造にてIFN−γを選択す
る。システインが露出されない復元蛋白質は樹脂
に結合せず、流過容量にてカラムを通過する。さ
らに、樹脂に対するIFN−γ蛋白質の共有結合
は、IFN−γの安定性をその天然構造への復元を
促進することにより付加する。早期の復元工程
は、安定な天然構造にてIFN−γ集団を与える
が、この段階における蛋白質は充分には復元され
なかつた。この段階にて樹脂カラムに蛋白質をそ
のアミノ末端で結合させれば、蛋白質が固定化さ
れてその元構造までより充分に復元されうる。最
後に、この工程並びにその前段の復元工程は、３
個未満のシステイン残基を有する蛋白質を必要と
することに注目すべきである。それより多数のシ
ステイン残基の分子間および分子内のジスルフイ
ド結合の形成を促進し、したがつて適切な復元お
よび樹脂に対する蛋白質の結合を阻害する。
IFN−γの精製に特に適していることに注目され
る。何故なら、イー・コリ蛋白質は一般に表面シ
ステイン残基を欠如し、したがつて濾液中の可溶
性イー・コリ蛋白質汚染物は樹脂カラムに結合し
ないからである。さらに、この工程は、表面シス
テインを有する天然構造にてIFN−γを選択す
る。システインが露出されない復元蛋白質は樹脂
に結合せず、流過容量にてカラムを通過する。さ
らに、樹脂に対するIFN−γ蛋白質の共有結合
は、IFN−γの安定性をその天然構造への復元を
促進することにより付加する。早期の復元工程
は、安定な天然構造にてIFN−γ集団を与える
が、この段階における蛋白質は充分には復元され
なかつた。この段階にて樹脂カラムに蛋白質をそ
のアミノ末端で結合させれば、蛋白質が固定化さ
れてその元構造までより充分に復元されうる。最
後に、この工程並びにその前段の復元工程は、３
個未満のシステイン残基を有する蛋白質を必要と
することに注目すべきである。それより多数のシ
ステイン残基の分子間および分子内のジスルフイ
ド結合の形成を促進し、したがつて適切な復元お
よび樹脂に対する蛋白質の結合を阻害する。
結合したIFN−γをたとえばDTT（ジチオスレ
イトール）またはシステインのような還元剤によ
つてカラムから溶出させる。システインは、無毒
性であり、かつ蛋白質上にスルフヒドリル基を還
元状態で維持するので好適であり、かくして経時
的な蛋白質の凝集を防止する。この共有結合クロ
マトグラフイーの工程は、希釈工程に際し10〜20
倍まで濃縮された安定な精製IFN−γ集団をもた
らす。
イトール）またはシステインのような還元剤によ
つてカラムから溶出させる。システインは、無毒
性であり、かつ蛋白質上にスルフヒドリル基を還
元状態で維持するので好適であり、かくして経時
的な蛋白質の凝集を防止する。この共有結合クロ
マトグラフイーの工程は、希釈工程に際し10〜20
倍まで濃縮された安定な精製IFN−γ集団をもた
らす。
本発明の最終工程は、寸法決定、すなわちモレ
キユラシーブクロマトグラフイーによる第２精製
である。しかしながら、このクロマトグラフイー
工程は、寸法決定用カラムに対し精製蛋白質を少
容量で充填することを必要とする。したがつて、
チオール樹脂カラムから溶出された蛋白質を硫酸
アンモニウムで沈澱させ、少量の配合緩衝液に再
溶解させて、これを寸法決定用カラムに充填す
る。
キユラシーブクロマトグラフイーによる第２精製
である。しかしながら、このクロマトグラフイー
工程は、寸法決定用カラムに対し精製蛋白質を少
容量で充填することを必要とする。したがつて、
チオール樹脂カラムから溶出された蛋白質を硫酸
アンモニウムで沈澱させ、少量の配合緩衝液に再
溶解させて、これを寸法決定用カラムに充填す
る。
溶液中に残存する大きいIFN−γ凝集体が最初
に溶出される。次いで、精製されたIFN−γが溶
出し、後の使用のために回収される。イー・コリ
蛋白質汚染物および化学試薬が最後に溶出する。
かくして、このクロマトグラフイー工程はさら
に、たとえばイー・コリ蛋白質、蛋白質凝集体ま
たはたとえばグアニジン塩酸塩、プロテアーゼ阻
止剤または還元剤のような望ましくない化学試薬
を全て除去することによりIFN−γ製剤を生成す
る。さらに、この工程は、ヒトにおける最終的治
療用途に適した充分な配合緩衝液中へ純粋なIFN
−γを交換することを可能にする。最後に、この
精製は全てのパイロゲン燐脂質を除去し、この燐
脂質はIFN−γと共に精製されて、１ナノグラム
以上の濃度でヒトに投与すると毒性作用をもたら
す。
に溶出される。次いで、精製されたIFN−γが溶
出し、後の使用のために回収される。イー・コリ
蛋白質汚染物および化学試薬が最後に溶出する。
かくして、このクロマトグラフイー工程はさら
に、たとえばイー・コリ蛋白質、蛋白質凝集体ま
たはたとえばグアニジン塩酸塩、プロテアーゼ阻
止剤または還元剤のような望ましくない化学試薬
を全て除去することによりIFN−γ製剤を生成す
る。さらに、この工程は、ヒトにおける最終的治
療用途に適した充分な配合緩衝液中へ純粋なIFN
−γを交換することを可能にする。最後に、この
精製は全てのパイロゲン燐脂質を除去し、この燐
脂質はIFN−γと共に精製されて、１ナノグラム
以上の濃度でヒトに投与すると毒性作用をもたら
す。
安定な純IFN−γ製剤を、ヒトにおけるウイル
ス感染および腫瘍もしくは癌の治療に使用するの
に適した投与濃度まで希釈することができる。
ス感染および腫瘍もしくは癌の治療に使用するの
に適した投与濃度まで希釈することができる。
本発明の方法は、遺伝子工学の技術により生産
された全ての蛋白質を精製するのに使用すること
ができ、この蛋白質は３個未満の表面システイン
アミノ酸残基を有すると共に形質転換宿主内で不
溶性の凝集体を形成することが了解されよう。
された全ての蛋白質を精製するのに使用すること
ができ、この蛋白質は３個未満の表面システイン
アミノ酸残基を有すると共に形質転換宿主内で不
溶性の凝集体を形成することが了解されよう。
本発明を容易に理解しうるよう、IFN−γの精
製例を下記に示す。
製例を下記に示す。
実施例
細胞破壊
プラスミドptrp−IFN−γ（すなわちtrpに由来
する発現制御配列に作用結合したIFN−γをコー
ドするDNA配列を含んだプラスミド）によつて
形質転換されたイー・コリK12細胞を培着増殖さ
せた。１Kgのこれら細胞を、ポリトロンTP45/80
により３の緩衝液No.１（５％の蔗糖と0.1Mのト
リス（PH7.5）と5mMのEDTAとよりなる）中で
ホモゲナイズした。0.4ｇのリゾチーム「粉末」
を加え、そして混合物を再びホモゲナイズし、か
つ室温で30分間静置した。蔗糖とトリスとを含有
する緩衝液は細胞の浸透圧溶菌を防止すると共
に、リゾチームでの処理は細菌細胞壁のペプチド
グリカン外層の細胞を除去した。この「軟化した
細胞」をベツクマンJ6B型にて5000rpmで60分間
遠心分離し、ポリトロンPT45/80（設定５）にて
11の緩衝液No.２（0.1Mのトリス（PH7.5）およ
び5mMのEDTAよりなる）に再懸濁させた。緩
衝液No.２（すなわち蔗糖を欠如した低張性の「破
壊緩衝液」）における細胞の懸濁はこれら細胞を
膨潤させて、破壊に対するその感受性を増大し
た。
する発現制御配列に作用結合したIFN−γをコー
ドするDNA配列を含んだプラスミド）によつて
形質転換されたイー・コリK12細胞を培着増殖さ
せた。１Kgのこれら細胞を、ポリトロンTP45/80
により３の緩衝液No.１（５％の蔗糖と0.1Mのト
リス（PH7.5）と5mMのEDTAとよりなる）中で
ホモゲナイズした。0.4ｇのリゾチーム「粉末」
を加え、そして混合物を再びホモゲナイズし、か
つ室温で30分間静置した。蔗糖とトリスとを含有
する緩衝液は細胞の浸透圧溶菌を防止すると共
に、リゾチームでの処理は細菌細胞壁のペプチド
グリカン外層の細胞を除去した。この「軟化した
細胞」をベツクマンJ6B型にて5000rpmで60分間
遠心分離し、ポリトロンPT45/80（設定５）にて
11の緩衝液No.２（0.1Mのトリス（PH7.5）およ
び5mMのEDTAよりなる）に再懸濁させた。緩
衝液No.２（すなわち蔗糖を欠如した低張性の「破
壊緩衝液」）における細胞の懸濁はこれら細胞を
膨潤させて、破壊に対するその感受性を増大し
た。
ホモゲナイズ物をマントン−ガウリンに
8000psiで３回通過させることにより、細胞の完
全機械破壊を行なつた。破壊された細胞の残骸を
冷却された15容器（約８℃にて氷上に保つ）に
集め、かつベツクマンJ6B型にて4000rpmで60分
間遠心分離した。かくして膜ペレツトを得、これ
をポリトロンPT45/80（設定５）により２の緩
衝液No.３（0.5Mの尿素、0.2mMのDTT、10mM
のベンズアミジンおよび１×PBS（PH7.5））に再
懸濁させて洗浄し、次いでベツクマンT6B型に
て4000rpmで60分間遠心分離した。この洗浄によ
りバツクグランドとしてのイー．コリ蛋白質が除
去された。洗浄した膜ペレツトの平均重量は、細
胞１Kg当り約50ｇであつた。IFN−γはペレツト
中に不溶性の複数凝集体として存在した。
8000psiで３回通過させることにより、細胞の完
全機械破壊を行なつた。破壊された細胞の残骸を
冷却された15容器（約８℃にて氷上に保つ）に
集め、かつベツクマンJ6B型にて4000rpmで60分
間遠心分離した。かくして膜ペレツトを得、これ
をポリトロンPT45/80（設定５）により２の緩
衝液No.３（0.5Mの尿素、0.2mMのDTT、10mM
のベンズアミジンおよび１×PBS（PH7.5））に再
懸濁させて洗浄し、次いでベツクマンT6B型に
て4000rpmで60分間遠心分離した。この洗浄によ
りバツクグランドとしてのイー．コリ蛋白質が除
去された。洗浄した膜ペレツトの平均重量は、細
胞１Kg当り約50ｇであつた。IFN−γはペレツト
中に不溶性の複数凝集体として存在した。
ＩＦＮ−γの抽出および復元
膜ペレツトからの安定なIFN−γ蛋白質モノマ
ー抽出は、ケイオトロープ剤によるペレツトの可
溶化を必要とする。次いで、抽出した可溶性蛋白
質を、水性生理緩衝液での可溶化溶液の急速希釈
によつて復元させた。
ー抽出は、ケイオトロープ剤によるペレツトの可
溶化を必要とする。次いで、抽出した可溶性蛋白
質を、水性生理緩衝液での可溶化溶液の急速希釈
によつて復元させた。
50ｇの洗浄した膜ペレツトを4.5の4N
GuHCl（グアニジン塩酸塩）抽出緩衝液（0.2mM
のDTT、10mMのベンズアミジンおよびPBS（PH
7.2））に再懸濁させ、かつ約８℃にて30分間静置
した。可溶化してない物質をペレツト化させかつ
ベツクマンT6B型にて5000rpmで60分間遠心分離
して捨てた。得られた透明な上澄は、可溶化され
たIFN−γとペレツト中に含まれる脂質および核
酸とを含有した。
GuHCl（グアニジン塩酸塩）抽出緩衝液（0.2mM
のDTT、10mMのベンズアミジンおよびPBS（PH
7.2））に再懸濁させ、かつ約８℃にて30分間静置
した。可溶化してない物質をペレツト化させかつ
ベツクマンT6B型にて5000rpmで60分間遠心分離
して捨てた。得られた透明な上澄は、可溶化され
たIFN−γとペレツト中に含まれる脂質および核
酸とを含有した。
抽出物の蛋白質濃度を１mg／ml、すなわち復元
のための最適濃度まで低下させるため、4Mの
GuHCl抽出物を先ず10％の蔗糖と1mMのEDTA
と0.2mM DTTと10mMのベンズアミンとを含有
する4.5のPBS緩衝液（PH7.2）を添加して2N
GuHClまで希釈した。抽出物の試料を採取して、
ビオラド染色試薬法により蛋白質濃度を測定し
た。この時点における蛋白質濃度は、典型的には
1.5〜2.5mg／mlの範囲である。さらに、蛋白質濃
度を、10％の蔗糖と1mMのEDTAと0.2mMの
DTTと10mMのベンズアミジンとPBS（PH7.2）
とを含有する適当量の2N GuHCl溶液を添加し
て１mg／mlまで低下させた。典型的には、これら
希釈物の最終容積は10〜20の範囲である。これ
らの希釈は約８℃にて行なつた。
のための最適濃度まで低下させるため、4Mの
GuHCl抽出物を先ず10％の蔗糖と1mMのEDTA
と0.2mM DTTと10mMのベンズアミンとを含有
する4.5のPBS緩衝液（PH7.2）を添加して2N
GuHClまで希釈した。抽出物の試料を採取して、
ビオラド染色試薬法により蛋白質濃度を測定し
た。この時点における蛋白質濃度は、典型的には
1.5〜2.5mg／mlの範囲である。さらに、蛋白質濃
度を、10％の蔗糖と1mMのEDTAと0.2mMの
DTTと10mMのベンズアミジンとPBS（PH7.2）
とを含有する適当量の2N GuHCl溶液を添加し
て１mg／mlまで低下させた。典型的には、これら
希釈物の最終容積は10〜20の範囲である。これ
らの希釈は約８℃にて行なつた。
安定な可溶性のIFN−γの復元は、５％の蔗糖
と10mMのベンズアミジンと1mMのEDTAとを
含有するPBS希釈緩衝液（PH7.2）の９倍容量で
０〜４℃にて2mM GuHCl抽出物を希釈して行
なつた。希釈緩衝液を、エチレングリコール冷却
ジヤケツトを装着した容器中で０−４℃に維持し
た。溶液の通気は、収率を著しく低下させるので
注意深く回避する。この1/10希釈は、復元した可
溶性IFN−γの約60％回収をもたらした。IFN−
γの約40％が、リポ多糖類および核酸汚染物と共
に溶液から沈澱した。この微細な沈澱を、ミリポ
アCV6LO1TP1型の10インチの0.22mm親水性TC
ジユロポアフイルタに通して所定容量（100〜200
）濾過することにより除去した。ここで試料を
採取して、ビオラド法により蛋白質濃度を測定し
た。この段階における蛋白質濃度は典型的には
0.055mg／mlである。
と10mMのベンズアミジンと1mMのEDTAとを
含有するPBS希釈緩衝液（PH7.2）の９倍容量で
０〜４℃にて2mM GuHCl抽出物を希釈して行
なつた。希釈緩衝液を、エチレングリコール冷却
ジヤケツトを装着した容器中で０−４℃に維持し
た。溶液の通気は、収率を著しく低下させるので
注意深く回避する。この1/10希釈は、復元した可
溶性IFN−γの約60％回収をもたらした。IFN−
γの約40％が、リポ多糖類および核酸汚染物と共
に溶液から沈澱した。この微細な沈澱を、ミリポ
アCV6LO1TP1型の10インチの0.22mm親水性TC
ジユロポアフイルタに通して所定容量（100〜200
）濾過することにより除去した。ここで試料を
採取して、ビオラド法により蛋白質濃度を測定し
た。この段階における蛋白質濃度は典型的には
0.055mg／mlである。
共有結合クロマトグラフイーによるＩＦＮ−γ
精製 復元したIFN−γを含有する希釈混合物を、次
いでチオール樹脂を用いる共有結合クロマトグラ
フイーにかけた。IFN−γ蛋白質を樹脂に結合さ
せるジスルフイド結合の形成を促進するため、
「希釈」混合物を先ず1N NaOHによりPH８に調
節した。活性化されたチオールセフアロース4B
（フアルマシア・フアイン・ケミカルス社）をバ
ツチ式（２容量％）で加え、そして４℃にて少な
くとも２〜３時間または１晩撹拌した。チオール
樹脂は、製造業者により推奨された通りに作成
し、すなわち10倍容量の蒸留水で洗浄し、次いで
0.2MのGuHClと５％の蔗糖と10mMのベンズア
ミジンと5mMのEDTAとを含有する５倍容量の
PBS緩衝液（PH8.0）で平衡化させた。IFN−γ
は、その表面システイン残基を介し樹脂上のスル
フヒドリル側鎖に共有結合する。
精製 復元したIFN−γを含有する希釈混合物を、次
いでチオール樹脂を用いる共有結合クロマトグラ
フイーにかけた。IFN−γ蛋白質を樹脂に結合さ
せるジスルフイド結合の形成を促進するため、
「希釈」混合物を先ず1N NaOHによりPH８に調
節した。活性化されたチオールセフアロース4B
（フアルマシア・フアイン・ケミカルス社）をバ
ツチ式（２容量％）で加え、そして４℃にて少な
くとも２〜３時間または１晩撹拌した。チオール
樹脂は、製造業者により推奨された通りに作成
し、すなわち10倍容量の蒸留水で洗浄し、次いで
0.2MのGuHClと５％の蔗糖と10mMのベンズア
ミジンと5mMのEDTAとを含有する５倍容量の
PBS緩衝液（PH8.0）で平衡化させた。IFN−γ
は、その表面システイン残基を介し樹脂上のスル
フヒドリル側鎖に共有結合する。
バツチ式吸着の後、活性化したチオールセフア
ロース4Bを200／ｈの流速にてフアルマシアカ
ラム（KS370／15）にポンプ輸送した。溶出液の
流過容積を蛋白質濃度につき測定し、これからカ
ラム樹脂に結合した蛋白質の量を決定することが
できる。充填樹脂をカラムを、0.2NのGuHClと
10mMのベンズアミジンと5mMのEDTAと５％
の蔗糖とを含有する５倍容量のPBS緩衝液（PH
8.0）にて40／ｈの流速で洗浄した。結合した
IFN−γの溶出は、洗浄したビーズをPBS（PH
8.0）と40mMの還元剤DTTもしくはシステイン
と５％のの蔗糖と5mMのEDTAと10mMのベン
ズアミジンとを含有する２倍容量の溶出緩衝液に
４℃で４時間または１晩静置して行なつた。溶出
液中に遊離したIFN−γを30／ｈの流速で回収
した。ビーズをさらに１容量の溶出緩衝液中に４
℃で30分間静置することにより継続し、そして蛋
白質濃度が0.1mg／ml以下になるまでフラクシヨ
ンを集めた。
ロース4Bを200／ｈの流速にてフアルマシアカ
ラム（KS370／15）にポンプ輸送した。溶出液の
流過容積を蛋白質濃度につき測定し、これからカ
ラム樹脂に結合した蛋白質の量を決定することが
できる。充填樹脂をカラムを、0.2NのGuHClと
10mMのベンズアミジンと5mMのEDTAと５％
の蔗糖とを含有する５倍容量のPBS緩衝液（PH
8.0）にて40／ｈの流速で洗浄した。結合した
IFN−γの溶出は、洗浄したビーズをPBS（PH
8.0）と40mMの還元剤DTTもしくはシステイン
と５％のの蔗糖と5mMのEDTAと10mMのベン
ズアミジンとを含有する２倍容量の溶出緩衝液に
４℃で４時間または１晩静置して行なつた。溶出
液中に遊離したIFN−γを30／ｈの流速で回収
した。ビーズをさらに１容量の溶出緩衝液中に４
℃で30分間静置することにより継続し、そして蛋
白質濃度が0.1mg／ml以下になるまでフラクシヨ
ンを集めた。
寸法決定クロマトグラフイーによるＩＦＮ−γ
の最終的精製 チオール樹脂カラムから溶出したIFN−γは、
分子寸法決定カラムに充填するため少容量まで濃
縮せねばならない。すなわち、400ｇの固体硫酸
アンモニウムを１のIFN−γ溶液に溶解させ、
そして４℃にて１晩静置した。生じた蛋白質沈澱
物をベツクマンJ6B型により5000rpmにて４℃で
60分間遠心分離することによりペレツト化させ、
次いでPBS（PH7.2）と５％の蔗糖とを含有する配
合緩衝液250mlに溶解させた。未溶解の物質を、
250mlのバケツトを装着したソルバールGSA型ロ
ータにおいて12000rpmで30分間遠心分離して除
去した。
の最終的精製 チオール樹脂カラムから溶出したIFN−γは、
分子寸法決定カラムに充填するため少容量まで濃
縮せねばならない。すなわち、400ｇの固体硫酸
アンモニウムを１のIFN−γ溶液に溶解させ、
そして４℃にて１晩静置した。生じた蛋白質沈澱
物をベツクマンJ6B型により5000rpmにて４℃で
60分間遠心分離することによりペレツト化させ、
次いでPBS（PH7.2）と５％の蔗糖とを含有する配
合緩衝液250mlに溶解させた。未溶解の物質を、
250mlのバケツトを装着したソルバールGSA型ロ
ータにおいて12000rpmで30分間遠心分離して除
去した。
透明なIFN−γ溶液（約15mg／mlの濃度で250
ml）を、10のＳ−200セフアデツクス寸法決定
カラム（Ｋ100/100）に４℃で約500ml／ｈの流速
にて加えた。カラムからの物質の溶出は、SDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により監視する
ことができ、純IFN−γを含有するフラクシヨン
をその後の使用のために集めた。IFN−γをカラ
ム容積の約50％で溶出させ、100mlのフラクシヨ
ンを集めた。
ml）を、10のＳ−200セフアデツクス寸法決定
カラム（Ｋ100/100）に４℃で約500ml／ｈの流速
にて加えた。カラムからの物質の溶出は、SDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により監視する
ことができ、純IFN−γを含有するフラクシヨン
をその後の使用のために集めた。IFN−γをカラ
ム容積の約50％で溶出させ、100mlのフラクシヨ
ンを集めた。
この手順により配合緩衝液にまだ存在する安定
な純粋IFN−γ調製物が得られ、これを追加配合
緩衝液により適当な投与濃度まで希釈することが
できる。
な純粋IFN−γ調製物が得られ、これを追加配合
緩衝液により適当な投与濃度まで希釈することが
できる。
本発明の多くの実施例につき上記したが、基本
構成を改変して本発明の方法を行なう他の実施例
を与えることが了解されよう。したがつて、本発
明の範囲は、例として上記した特定実施例のみに
限定されないことが了解されよう。
構成を改変して本発明の方法を行なう他の実施例
を与えることが了解されよう。したがつて、本発
明の範囲は、例として上記した特定実施例のみに
限定されないことが了解されよう。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB848414354A GB8414354D0 (en) | 1984-06-05 | 1984-06-05 | Purifying protein |
| GB8414354 | 1984-06-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62500072A JPS62500072A (ja) | 1987-01-16 |
| JPH0550273B2 true JPH0550273B2 (ja) | 1993-07-28 |
Family
ID=10561969
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60502445A Granted JPS62500072A (ja) | 1984-06-05 | 1985-06-04 | 蛋白質の精製法 |
Country Status (7)
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