JPH0466089A - キャンデイダ・ユテイリス由来のａｄｅ１遺伝子を含有するｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はキャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕ
ｔｉｌｉｓ）由来のＡＤＥ　１遺伝子を含有するＤＮＡ
断片である。

（従来技術） ＡＤＥ１遺伝子は、アデニン合成系の酵素であるフォス
フォリポジルアミノイミダゾールサクシノカルボキサミ
ドシンセターゼをコードしている。遺伝子を含有フォス
フォリポジルアミノイミダゾールサクシノカルボキサミ
ドシンセターゼは、次のような酵素反応を触媒する。

ＡＤＥＩ遺伝子は、従来、サツカロマイセス・セレビシ
ェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）由来のものが公知である（Ｇｅｎｅｔｉｋａ、　２
２．５４９−５５６．１９８６）。

ＡＤＥＩ遺伝子を含まない酵母は、アデニン要求性であ
り、ＡＤＥＩ遺伝子を含み、上記酵素を発現する酵母は
アデニン非要求性である。この性質の差異を利用して、
酵母形質転換体の選択が可能となる。すなわちＡＤＥＩ
遺伝子を含むプラスミド・ベクターを作成し、紫外線照
射等の変異処理を行ってＡＤＥＩ遺伝子が非発現性であ
る酵母を作成すれば、該酵母の形質転換実験が可能とな
リ、該酵母の宿主−ベクター系が完成される。このよう
な例としては、サツカロマイセス・セレビシェ由来のＬ
ＥＵ２遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＴＲＰＩ遺伝子などの
利用が挙げられる（蛋白質・核酸・酵素ｕ、　１５２２
−１５３９．１９８３）。

一方、酵母の遺伝子操作系は大腸菌や枯草菌のような細
菌の遺伝子操作系に比べて、真核生物の作る酵素や生理
活性ペプチドの微生物生産に対して有利な点が多い。こ
れは酵母が単細胞でありなから真核生物に属し、遺伝子
の形質発現機構が基本的には他の真核生物のそれと同様
であること、および糖蛋白質の生産における糖鎖の付加
機構が備わっていること等に起因している。

酵母の遺伝子操作系としては、宿主酵母としてサツカロ
マイセス・セレビシェが一般的に使用されているが、他
の酵母を宿主酵母として使用することは未だ研究途上に
ある。

キャンデイダ属酵母は、炭素資化域が広いことなど、サ
ツカロマイセス・セレビシェにない実用面での有利な性
質を有している。とりわけキャンデイダ・ユテイリスは
ウリカーゼなどの臨床検査薬用酵素の生産菌として重要
であり、食料、飼料用酵母として安全性は既に実証済み
であることから、キャンデイダ・ユテイリスの宿主−ベ
クター系の有用性が期待されている。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、キャンデイダ・ユテイリスを宿主酵母と
して、遺伝子操作系として使用するに有用な宿主−ベク
ター系を見出すべく、鋭意検討し、選択マーカーとなる
遺伝子ＤＮＡの取得を行った。

（課題を解決するための手段） 本発明はキャンデイダ・ユテイリス由来のＡＤＥ１遺伝
子を含有するＤＮＡ断片である。

本発明のキャンデイダ・ユテイリス由来のＡＤＥ１遺伝
子は、第２図に示される塩基配列を有している。また、
本発明のキャンデイダ・ユテイリス由来のＡＤＥＩ遺伝
子から演鐸されるアミノ酸配列は第３図に示されている
。

本発明のキャンデイダ・ユテイリス由来のＡＤＥ１遺伝
子は、サツカロマイセス・セレビシェ由来のＡＤＥ１遺
伝子と相補的である。塩基配列における相同性は約６４
．９％である。

本発明のキャンデイダ・ユテイリス由来のＡＤＥ１遺伝
子は、第２図の示される塩基配列の少なくとも１個の塩
基が欠失、置換、挿入、転移もしくは付加されているも
のも包含する。

本発明のキャンデイダ・ユテイリス由来のＡＤＥ１遺伝
子を得る方法は、次の通りである。

本発明では、ＡＤＥＩ遺伝子遺伝子性発現性サツカロマ
イセス・セレビシェ（例えばサツカロマイセス・セレビ
シェＡＴＣＣ４４７６９，ＡＴＣＣ４４７７１ＡＴＣＣ
４６５２５）およびＹＥｐ２．ＹＥｐ１３．ＹＲｐ１７
等のサツカロマイセス・セレビシェにおいて自律的複製
を行うことができるクローニングベクターを必要とする
。本発明ではキャンディダ・・ユテイリスの染色体ＤＮ
Ａを制限酵素の作用により断片化したものを前記クロー
ニングベクターの制限酵素部位に連結させたプラスミド
を得る。このプラスミド混合物で、ＡＤＥＩ遺伝子遺伝
子性発現性サツカロマイセス・セレビシェを形質転換し
、アデニン非要求性株を選択する。これより分離したプ
ラスミドには、キャンデイダ・ユテイリス由来であって
、サツカロマイセス・セレビシェのＡＤＥＩ遺伝子を相
補するＡＤＥＩ遺伝子を有するＤＮＡ断片がクローニン
グされている。

さらに、クローニング断片の制限酵素切断点地図を作成
し、制限酵素を利用してクローニング断片の小型化を行
い、ＡＤＥＩ遺伝子を限定することができる。

また、ＡＤＥ　１遺伝子の塩基配列を決定することによ
り、ＡＤＥＩ遺伝子の発現に関する情報が得られ、ＡＤ
ＥＩ遺伝子にコードされているフォスフォリポジルアミ
ノイミダゾールサクシノカルボキサミドシンセターゼの
アミノ酸配列を知ることができる。

ＡＤＥＩ遺伝子は、アデニン合成系の酵素であるフォス
フォリポジルアミノイミダゾールサクシノカルボキサミ
ドシンセターゼをコードしている遺伝子を含有している
。したがってＡＤＥ１遺伝子遺伝子性発現性酵母は、ア
デニン要求性となり、ＡＤＥ１遺伝子の導入によりアデ
ニン非要求性となることから、形質転換株の選択が可能
となる。

すなわちＡＤＥＩ遺伝子を含むプラスミドベクターを作
成し、紫外線照射等の変異処理によりＡＤＥＩ遺伝子遺
伝子性発現性キャンデイダ・ユテイリスを造成し、種々
の形質転換方法を検討すれば、キャンデイダ・ユテイリ
スの最良の宿主−ベクター系が完成される。

酵母のベクターは通常、大腸菌、酵母いずれでも複製、
選別可能なシャトルベクターとして作成される。ＡＤＥ
Ｉ遺伝子を含むプラスミドベクターとしては、Ｙｌｐ型
ベクターが最も簡便なものである。これはＡＤＥＩ遺伝
子を含有するＤＮＡ断片とｐＢＲ３２２，ｐＵｃ１９等
の大腸菌で複製可能なブスミドベクターを連結すること
により作成される。ＹＩｐ型ベクターは酵母内で自律的
複製に必要な配列を持たないため、ＡＤＥ１遺伝子遺伝
相間配列特異的ＤＮＡの組換えにより、宿主キャンデイ
ダ・ユテイリスの染色体ＤＮＡに組み込まれて初めて複
製される。Ｙｌｐベクターは非常に安定に保持されるの
で、菌株の改良、工業的生産株の作成に有利である。

ＡＤＥＩ遺伝子遺伝子性発現性キャンデイダ・ユテイリ
スの造成には、本発明のＡＤＥＩ遺伝子を有するＤＮＡ
を使用した遺伝子破壊（ｇｅｎｅ　ｄｉｓｒｕｐｔｉｏ
ｎ）法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙａｏｌｏｇｙ
　１０１．２０２−２１１（１９７８）”）が有効な手
段となる。また、紫外線照射による変異処理も良好な手
段のひとつである。アデニン要求性キャンデイダ・ユテ
イリスは、アデニンを含まない最小培地プレートで生育
出来ない株として容易に識別される。

キャンデイダ・ユテイリスの形質転換方法としては、Ｈ
ｉｎｎｅｎらによって開発されたプロトプラスト法（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳ
Ａ、　７５＋　１９２９゜１９７８）木材らによって開
発されたアルカリ金属処理法（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、、　１５３　１６５．１９８３）あるいは主に真核
細胞の形質転換に用いられているエレクトロポレーシ巧
ン法（Ｈａｓｈｉｆｆｉｏｔｏ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＋　」ｈ３３６−３３９、１
９８５）が挙げられる。これらの方法を検討し、最適条
件を設定することにより、キャンデイダ・ユティリスの
宿主−ベクター系が完成され、遺伝子操作に供される。

（実施例） 以下、本発明を実施例を用いてさらに詳しく説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ キャンデイダ・ユテイリスＣＡ（ｕ）−３７の染色体Ｄ
ＮＡをｔｌｅｒｅｆｏｒｄらの方法（Ｃｅｌｌ、　１８
　１２６１−１２７１１９７９）に従って調製し、５０
μｇを制限酵素５ａｕ３ＡＩにより消化した後、０．７
χアガロースゲル電気泳動を行い、５−１０Ｋｂｐの断
片をゲルから切り出して、回収装置であるＤＮＡ−ＣＥ
ＬＬ（第一化学薬品販売）にて回収した。エシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ
３７１１５より抽出したベクター・プラスミドＹＥｐ１
３の制限酵素ＢａｍＨＩ消化物１０μｇとこの断片を混
合後、Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼで４°Ｃ１−夜連結反応を
行った。

この反応液を使用してエシェリヒア・コリＨＢＩＯ１を
コンピテント・セル法にて形質転換し、該形質転換株よ
りプラスミドを抽出した。このプラスミド混合物でＡＤ
ＥＩ遺伝子が非発現性であるす・ンカロマイセス・セレ
ビシェＡＴＣＣ４４７６９をアルカリ金属法にて形質転
換した。すなわち、サツカロマイセス・セレビシェＡＴ
ＣＣ４４７６９を１００１ｄのＴＰＯ培地（２χバクト
ペプトン、２χグルコース、１χ酵母エキス）で５−７
　Ｘ　１０’細胞／Ｗｉまで培養し、集菌、洗浄後１ｍ
ｌのリチウム溶液（０，１Ｍ酢酸リチウム、１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆｉ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，
５）に懸濁した。

３０°Ｃで３０分間振騰後、その１０分の１量に４０９
　ｇのキャリヤーＤＮＡ（５ｍｇ／ｌｌ１１サケ***Ｄ
ＮＡを超音波処理したもの）とプラスミド混合物（１０
μｉ以下にする）を加えて３０°Ｃで３０分間振騰した
。４２°Ｃで５分間熱処理後、滅菌水で２回洗浄し、０
．１　ｊｔｆｉの最小培地（０，６７χｂａｃｔｏ　ｙ
ｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｗｌｏ　ａ＋
ａｉｎｏ　ａｃｉｄ、　２χグルコース、　０．００２
％　Ｌ−トリプトファン、　０．００２χＬ−ヒスチジ
ン塩酸塩、　０．００２χウラシル）に細胞を懸濁し、
２χバクトアガーを含む最小培地プレートに塗布した。

２５°Ｃにて−週間培養後、最小培地プレートで生育し
た（即ち、アデニン非要求性の）形質転換株が得られた
。この形質転換株より抽出したプラスミドは、ＹＥｐ１
３のＢａｍＨＩ部位に約１１ｋｂｐのキャンデイダ・ユ
テイリスのＡＤＥＩ遺伝子を有するＤＮＡ断片が挿入さ
れたものであり、ｐＡＤＥｌｌと命名した。ｐＡＤＥｌ
ｌをサツカロマイセス・セレビシェＡＴＣＣ４４７６９
に移入した株、サツカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ）　５ＨＹ
Ｉ（ｐＡＤＥｌｌ）は、微工研菌寄第１１３５４号とし
て寄託されている。

次にｐＡＤＥｌｌのクローニング断片の制限酵素切断点
地図を作成し、制限酵素を利用してクローニング断片の
小型化を行い、第１図に示す小型化されたＤＮＡ断片を
含むプラスミドｐＡＤＥＢ２．　ｐＡＤＥＥｌ、　ｐＡ
ＤＥｘｌおよびｐＡＤＥＡｌを作成した。アデニン要求
性のサツカロマイセス・セレビシェＡＴＣＣ４４７６９
への形質転換実験により、これらのＤＮＡ断片がＡＤＥ
Ｉ遺伝子を含有するか否かを調べたところ、第１図に示
す結果となり、ＡＤＥＩ遺伝子をＸｈｏｌ−Ａｃｃｌ間
（約１゜３４ｋｂ）に限定することができた。第１図に
おいて、記号は以下の制限酵素を示す。Ａ；Ａｃｃｌ、
　Ｂ；Ｂａｅ＋ＦＩＩ。

Ｅ；ＥｃｏＲＩ、　ＰＨＰｓｔｌ、χ；χｈｏｌさらに
、キャンデイダ・ユテイリスＡＤＥＩ遺伝子の塩基配列
をダイオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　
１０１、２０−７８．１９８３）にて求めたところ、第
２図に示すものであった。また、この塩基配列から推測
される、ＡＤＥＩ遺伝子にコードされたフォスフォリポ
ジルアミノイミダゾールサクシノカルボキサミドシンセ
ターゼを含有するアミノ酸配列は、第３図に示すもので
あった。

（発明の効果） 本発明のＡＤＥＩ遺伝子は、キャンデイダ・ユテイリス
由来のものであり、キャンデイダ属酵母の遺伝子操作系
における選択マーカーとして有用性が大きい。

ゾんＴ−覚り

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＡＤＥｌｌのクローニング断片の制限酵素切
断点地図及びこれをもとに小型化されたＤＮＡ断片とそ
れぞれのＤＮＡ断片を含むプラスミドの名称、およびそ
れぞれのＤＮＡ断片がＡＤＥＩ遺伝子を完全な形で有す
る（＋）が否が（−）かを示している。 第２図はキャンディダ・ユティリスのＡＤＥ１遺伝子の
塩基配列を示している。 第３図はキャンディダ・ユティリスのＡＤＥＩ遺伝子の
塩基配列がら演鐸されるアミノ酸配列を示している。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）キャンデイダ・ユテイリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔ
   ｉｌｉｓ）由来のＡＤＥＩ遺伝子を含有するＤ−ＮＡ断
   片