JPH0453494A - アスコルビン酸―２―リン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はアスコルビン酸−２−リン酸（以下、ＡｓＡ２
Ｐと略記する）の製造方法に関する。

ＡｓＡ２Ｐはアスコルビン酸の安定化誘導体であり、医
薬品、食品、化粧品などの分野で用いられる。

従来の技術 ＡｓＡ２Ｐの製造法としては、アスコルビン酸を化学的
にリン酸化する方法（特公昭４５−３０３２８号公報、
特公昭５２−１８１９１号公報、特公昭４８−１５６０
５号公報）および酵素法による製造法（特開昭６３−２
１４１９０号公報、特開昭６３−２７３４８９号公報、
特開平１−１９９５９０号公報、特開平２−４２９９６
号公報）が知られている。

発明が解決しようとする課題 化学的な合成法では、目的物以外の各種リン酸エステル
の混合物が生成し、複雑な精製工程を必要としたり、収
率が低いなどの問題点がある。また、酵素法でも、酵素
活性が低いため反応時間が長い等の間顧もあり、より効
率のよい製造法の開発が望まれている。

課題を解決するための手段 本発明によればシュードモナス属に属する微生物由来で
、アスコルビン酸とリン酸基供与体とからＡｓＡ２Ｐを
生成する反応を触媒する酵素（以下、アスコルビン酸リ
ン酸化酵素と称す）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断
片を組み込んだ組換え体ＤＮＡを構築し、この組換え体
ＤＮＡを保有させたエシェリシア属に属する微生物を酵
素源として、アスコルビン酸とリン酸基供与体とからＡ
ｓＡ２Ｆを、従来法と比較して、より効率よく製造でき
る。

すなわち本発明は、エシェリシア属に属し、アスコルビ
ン酸リン酸化酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片
を組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する微生物の菌体、
培養液またはそれらの処理物の存在下、水性媒体中でア
スコルビン酸とリン酸基供与体とを反応させて、反応液
から生成したアスコルビン酸−２−リン酸を採取するこ
とを特徴とするアスコルビン酸−２−リン酸の製造法に
関する。

以下に、本発明の詳細な説明する。

アスコルビン酸リン酸化酵素をコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片の供給源としては、該酵素活性を有する微生
物であればいずれでもよいが、なかでもシュードモナス
属に属し、ＡｓＡ２Ｐ生成活性を有する菌株が好適であ
る。具体的には、シュードモナス・アゾトコリガンス（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｚｏｔｏｃｏｌｌｉｇａｎｓ
）＾ＴＣＣ１２４１７があげられる。

シュードモナス属菌種由来のアスコルビン酸リン酸化酵
素をコードする遺伝子のクローニングは、下記のように
して行うことができる。シュードモナス属菌種の染色体
ＤＮＡは、ザ・イーエムビーオー・ジャーナル（Ｔｈｅ
　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ）　４　、１８７５（１９８
５＞記載の方法により調製する。得られた染色体ＤＮＡ
を、適当な制限酵素、例えばＢａｍＨＩ。

ＨｉｎｄＩＩｉなどにより切断し、該制限酵素切断断片
をベクターに組み込むことにより、シュードモナス属菌
種由来のアスコルビン酸リン酸化酵素をコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片を組み込んだ組換え体ＤＮＡを、種
々の組換え体ＤＮＡ混成物とともに得ることができる。

該ＤＮＡ断片と接続するベクターとしては、エシエＩＪ
シア属菌種中で自律複製できるものであれば）Ｔ−ジ・
ベクター、プラスミド・ベクターなどいずれでも使用で
きる。好適にはｐＢＲ３２２〔ジーン（Ｇｅｎｅ）２．
９５　（１９７７）］　、ｐ　ＵＣ１９Ｃジーン（Ｇｅ
ｎｅ）３３．１０３（１９８５）　］などを例示するこ
とができる。

こうして得た種々の組換え体ＤＮＡ混成物を用い、大腸
菌、例えばＭＭ　２９４　（ＡＴＣＣ３３６２５）株を
、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）らの方法〔プロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＬＩ
ＳＡ、、　６９．２１１０（１９７９））により形質転
換する。組換え体ＤＮＡ上には薬剤耐性遺伝子が存在す
るた狛、組換え体ＤＮＡが導入された形質転換株は、薬
剤耐性を示す。得られた薬剤耐性菌株からの、アスコル
ビン酸リン酸化酵素をコードする遺伝子を含む組換え体
ＤＮＡを保有する菌株の選択は、以下のようにして行う
。すなわち、上記で得られた形質転換株をニトロセルロ
ースフィルター上に固定し、アスコルビン酸リン酸化酵
素のアミノ酸配列より予想されるＤＮＡ塩基配列を有す
る合成りＮＡプローブと会合させ、強く会合するものを
選択する〔グルシスティン０ホグネス（Ｇｒｕｎｓｔｅ
ｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ）の方法、プロシーディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、、　７２．３９６１（１９７５）
］　。プローブＤＮＡは、通常のトリエステル法〔ジャ
ーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ　
（Ｊ、八ｍ、［１，ｈｅｍ。

Ｓｏｃ、）　、　９７．７３７２（１９７５）］で合成
される。さらに、強く会合した菌株が保有する組換え体
ＤＮＡについて、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）らの方法
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ（Ｊ
、　Ｍａｔ、Ｂｉｏｌ、）。

９８、５０３　（１９７５）］に従って、該組換え体Ｄ
ＮＡがアスコルビン酸リン酸化酵素をコードする遺伝子
を含む組換え体プラスミドＤＮＡであるかどうかを同定
する。該組換え体ＤＮＡを形質転換株から分離すること
により、シュードモナス属菌種由来のアスコルビン酸リ
ン酸化酵素をコードする遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを
取得することができる。

上記のようにして得られたシュードモナス属菌種由来の
アスコルビン酸リン酸化酵素をコードする遺伝子を含む
組換え体ＤＮＡより、該遺伝子を他菌種の宿主・ベクタ
ー系を用いてサブクローニングすることにより、該遺伝
子を他菌種に導入することも可能である。宿主・ベクタ
ー系としては、従来知られているものはすべて用いるこ
とができるが、たとえば、セラチア属、コリネバクテリ
ウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バ
チルス属などの宿主・ベクター系があげられる。

ＡｓＡ２Ｐ生成活性を高めた菌株として、具体的には、
シュードモナス・アゾトコリガンス＾ＴＣＣ１２４１７
由来のアスコルビン酸リン酸化酵素をコードする遺伝子
を組み込んだ組換え体Ｄ　Ｎ　Ａ　　ｐｓＫ１４を保有
する大腸菌ＭＭ２９４／ｐｓＫ１４があげられる。該菌
株は平成２年６月１５日付で、工業技術院微生物工業技
術研究所（微工研）に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉ　　５Ｋ１４　　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ２９７０）とし
て寄託されている。

上記のようにして得られたＡｓＡ２Ｐ生成活性を高めた
菌株の培養は、通常の細菌の培養方法に従って行う。す
なわち該微生物を、炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸
、ビタミンなどを含有する通常の培地中で、好気的条件
下で温度、ｐＨなどを調節しつつ培養を行えばよい。

培地に用いる炭素源としては、例えばグルコース、フラ
クトース、シュークロース、ａｔ、廃糖蜜、澱粉加水分
解物などの炭水化物、エタノール、グリセリン、ソルビ
トールなどのアルコール類、ピルビン酸、乳酸、酢酸な
どの有機酸、グリシン、アラニン、グルタミン酸、アス
パラギン酸などのアミノ酸など、該微生物が資化可能な
ものであればいずれでも使用できる。これらの使用濃度
は５〜３０％が好ましい。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなど各種無機お
よび有機アンモニウム塩、尿素、ＮＺアミン、肉エキス
、酵母エキス、コーンステイープリカー、カゼイン加水
分解物、フィツシュミールまたはその消化物などの窒素
含有有機物、グリシン、グルタミン酸などの各種アミノ
酸など種々のものが使用できる。その使用濃度は通常０
．１〜１０％である。

無機物としては、リン酸二水素カリウム、リン酸−水素
カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩
化す）　ＩＪウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜
鉛、炭酸カルシウムなどを用いることができる。また必
要に応じて、微生物の生育に必要なアミノ酸、核酸、ビ
タミンなどを培地に添加する。

培養は、振盪培養または通気撹拌培養などの好気的条件
下で行うことが望ましい。培養温度は２０〜４０℃、培
養期間は１０〜４８時間が好適である。培地のｐＨはア
ンモニア、尿素、水酸化ナトリウム溶液などで、中性に
保つことが望ましい。

培＃終了後、培養物よりアスコルビン酸リン酸化酵素を
採取するには一般の酵素採取法、例えば次のようにして
単離することができる。すなわち、菌体を超音波破砕し
て得られた菌体抽出液を、硫安分画、イオン交換、クロ
マトフオーカシング、ゲル濾過などの通常の酵素精製に
用いられる方法を用いて精製し、該酵素を採取する。

アスコルビン酸とリン酸基供与体とからＡｓＡ２Ｐを生
成させる反応は、微生物の培養中に、培地にアスコルビ
ン酸とリン酸基供与体とを存在させる方法（方法１）、
または微生物の培養液、菌体またはそれらの処理物とア
スコルビン酸およびリン酸基供与体を含有する液とを混
合する方法（方法２）により行われる。

反応には必要に応じて界面活性剤、有機溶剤などを存在
させることにより、ＡｓＡ２Ｐの生成効率を向上させる
ことができる。

界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・ステアリル
アミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）
、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドなどのカ
チオン性界面活性剤、ナトリウムオレイルアミド硫酸な
どのアニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビ
タン・モノステアレート（例えばノニオン５Ｔ２２１、
日本油脂社製）などの非イオン性界面活性剤など、アス
コルビン酸とリン酸基供与体とからＡｓＡ２Ｐを生成す
る反応を促進するものであればいずれでも使用でき、こ
れらは通常１〜５０ｍｇ／ｍｌ　、好ましくは１〜２０
ｍｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

有機溶剤としてはトルエン、キシレン、アセトン、脂肪
族アルコール、ベンゼン、酢酸エチルなどを用いること
ができ、０．１〜５０ｍ１／１、好ましくは１〜２０ｍ
１／ｌの１度で用いる。

アスコルビン酸およびリン酸基供与体としては、化学的
な純品でも粗精製物でも良く、またアスコルビン酸また
はリン酸基供与体を含みＡｓＡ２Ｐの生成を妨げないも
のであれば、いかなるものでも使用できる。水性媒体中
、アスコルビン酸は１〜１０００ｍＭ、リン酸基供与体
は１〜１０００ｍＭの濃度範囲で用いる。

リン酸基供与体としては、アデノンン三リン酸＜ＡＴＰ
）、パラニトロフェニルホスフェート、アセチルリン酸
、ピロリン酸、トリポリリン酸、テトラポリリン酸、ポ
リリン酸などが用いられる。

方法２における反応は、温度２０〜７０℃で、ｐＨを３
〜１１に保ち、０．５〜４８時間行う。

培養液の処理物としては、培養液の濃縮物、乾燥物、界
面活性剤および／または有機溶剤添加物などがあげられ
る。また、菌体処理物としては、菌体の乾燥物、界面活
性剤および／または有機溶剤添加物、溶菌酵素処理物、
固定化菌体あるいは菌体からの抽出酵素標品などがあげ
られる。

分離菌体を用いる場合は、湿菌体重量にて１〜４００　
ｍｇ／ｍ＋の範囲が好ましい。

ＡｓＡ２Ｐは、パーティノルｌ０５ＡＸカラム〔ワット
マン（Ｗｈａｔｍａｎ）社製〕を用いる高速液体クロマ
トグラフィーで、２５４ｎｍの吸収を測定することによ
り、合成法により製造された純品を標準品として定量す
ることができる。

培養液および水性媒体反応液からのＡｓＡ２Ｐの採取は
、菌体除去および除蛋白操作後、上清液を中和し、イオ
ン交換樹脂、セファデックスなどを用いるカラムクロマ
トグラフィーや高速液体クロマトグラフィーにより行う
。

本発明の詳細な説明するため、以下に実施例を記載する
。なお、遺伝子工学的実験に用いた試薬およびベクター
は、すべて全酒造社製を、その他の試薬は、牛丼テスク
社製を用いた。

実施例１．アスコルビン酸リン酸化酵素の精製：シュー
ドモナス・アゾトコリガンスＡＴＣＣ１２４１７株をＫ
Ｍ１０２培地（ポリペプトン１０ｇ／Ｌ肉エキス７ｇ／
Ｉ、酵母エキス５　ｇ／Ｉ、　ＮａＣｌ１　３ｇ／Ｉを
含み、ｐＨ７，２に調整した培地）で培養し、得られた
菌体５７０ｇ（湿菌体重量）をマントンガウリンホモゲ
ナイザ−（マントンガウリンＭＦＧ社製）により破砕し
、無細胞抽出液を調製した。抽出液を硫酸プロタミンに
より除核酸後、硫安分画により３０〜５０％硫安画分を
得た。これを２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐｆ１６
．０１１で平衡化したＣＭ−３ｅｐｈａｒｏｓｅカラム
（７，４Ｘ　１９ｃｍ）　（ファルマシア・ファイン・
ケミカル社製）に通塔し、０〜０．２５ＭＮａＣｌの濃
度勾配により溶出し活性画分を集めた。この画分をＹＭ
ＩＯ（アミコン社製）を用いた限外濾過により濃縮して
、２５ｍＭトリエチルアミン・塩酸（ｐＨ１１，０）と
バッファー交換後、同緩衝液で平衡化したＰＢＥ　１１
８カラム（１，４ｘ　５５ｃｍ）　（ファルマシア・フ
ァイン・ケミカル社製）に通塔し、ファルフライトｐｕ
ａ−ｉｏ、　５−塩酸（ｐＨ７，５）により溶出し、活
性画分を集約だ。

得られた両分をＹＭＩＯで濃縮後、２０ｍＭ’Ｊン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化した５ｅｐｈａｄ
ｅｘＧ２５カラム（２，３Ｘ　８０ｃｍ）　（ファルマ
シア・ファイン・ケミカル社製）に通塔し、同緩衝液で
溶出し活性画分を集めることによりアスコルビン酸リン
酸化酵素の精製標品５　ｍ　ｇを取得した。

得られた酵素の性質を以下に示す。

（１）分子量 ５ＤＳ−ＰＡＧＥにより２９０００、ゲル濾過法により
３１５００゜ （２）基質に対するＫｍ値 アスコルビン酸＝１００ｍＭ以上。ＡＴＰ＝４０ｍＭ　
０　ピロリン酸＝１０ｍＭ０ （３）至適ｐＨ ＡＴＰ基質＝５．５付近 ピロリン酸基質＝４．０付近 （４）至適温度 反応の至適温度は、５０℃付近である。

（５）温度安定性 ６０℃、３０分間の処理により活性は３３％程度失活す
る。

（６）阻害 酵素の活性はＣｕ”により阻害を受ける。

実施例２．ＤＮＡの単離： シュードモナス・アゾトコリガンスＡＴＣＣ１２４１７
株を、Ｌ液体培地〔バタトトリブトン（デイフコ社製）
１０ｇ／ｌ、酵母エキス（デイフコ社製）５ｇ／Ｉ、塩
化ナトリウム　５ｇ／ｌを含み、ｐＨを７．２に調整し
た培地〕に接種し、３７℃にて１晩培養シタ。この培養
菌体０．６ｇを０．１　Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウム（ＥＤＴＡ）を含む０．１ＭＮ　ａ　Ｃ］　（
ｐＨ８，５）　　１０　ｍｌに懸濁し、これに１０％ラ
ウリル硫酸ナトリウムを含むＩＭＦリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ９，０）　１１　ｍｌとプロティナーゼＫ　（ｐｒｏ
ｔｅｉｎａｓｅＫ　）　　５　ｍ　ｇとを加え、４２℃
で１時間放置した。この溶液に１　ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ
　Ａを含むＩＱ＋ｔ＋Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０
＞を飽和したフェノール１２ｍ１を加え、充分に撹拌し
た。この溶液を遠心分離し、水層１２ｍ１を分取した。

得られた水層１２ｍ１に２．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液１
．２ｍｌを加え、さらにエタノール３０ｎ＋１を加えた
。析出した染色体ＤＮＡをガラス棒にて巻き取り、乾燥
させた。次いで、これを１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む１０
ｍＭ）リス塩酸緩衝液３＋ｎｌに溶解させ、リボヌクレ
アーゼを５０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で３
０分間放置した。この溶液に等量のクロロホルムを加え
、充分に撹拌後遠心分離した。水層３ｍｌを分取し、そ
れに２．５Ｍ酢酸す）　ＩＪウム溶液０．３ｍｌを加え
、さらにエタノール３０ｍ１を加えた。析出した染色体
ＤＮＡをガラス棒にて巻き取り、乾燥させ、精製染色体
ＤＮＡを得た。次いで、これを１ｍＭＥＤＴＡを含む１
０ｍＭ）リス塩酸緩衝液１ｍ１（ｐＨ８，０）に溶解さ
せた。

実施例３０組換え体ＤＮＡの調製： 上記染色体ＤＮＡ１μｇを含む懸濁液に、Ｂａｍ８１１
０単位を加えて消化反応を行った。別にベクターｐＵｃ
１９　１μｇを含む溶液２０μｍに、ＢａｍＨＩ３単位
を加えて完全消化を行った後、２μｍのＩＭ）ＩＪス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）を加え、アルカリフォスファタ
ーゼ５単位を加え、６５℃で１時間反応を行った。得ら
れた染色体ＤＮＡおよびベクターＤＮＡを、上記と同じ
方法によりフェノール抽出およびエタノール沈＃操作に
より精製した。精製染色体ＤＤＮＡ１００ｎおよび精製
ベクターＤＮＡ２０ｎｇを、Ｔ４リガーゼ緩衝液［６６
ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）、６．６ｍＭ塩化
マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール（Ｄｉｔｈ
ｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）および０．１ｍＭＡＴＰ：］に
懸濁し、Ｔ４リガーゼ１０単位を添加し、１６℃で１６
時間反応させ、両方のＤＮＡを連結させ、組換え体ＤＮ
Ａ混成物を得た。

実施例４．アスコルビン酸リン酸化酵素遺伝子ＤＮＡを
含む組換え体ＤＮＡの選択： 実施例３で得た組換え体プラスミドを用い、大腸菌ＭＭ
２９４株（ＡＴＣ［：３２６２５）をコーエンらの方法
〔ブロン−ディング・オブ・ザ・ナンヨナル・アカデミ
イ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄＳｃｉ、）　ＵＳＡ、、　６９．２１１０（１９７
９）］により形質転換し、アンピシリン１００ｍｇ／ｌ
を含むし寒天培地（Ｌ液体培地に１．５％寒天を含む）
に塗布した。

得られたアンピシリン耐性のコロニー約６０００をニト
ロセルロースフィルター上に固定した。実施例１で得ら
れたアスコルビン酸リン酸化酵素の精製標品を、ヨード
アセトアミドにより還元カルボキシアミドメチル化した
後、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８，０＞中
で、ＴＰＣＫ−）リブシンにより３７℃で２４時間分解
反応を行い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
で分画して得られたアスコルビン酸リン酸化酵素のトリ
プシン分解ペプチドＴＲ１９中のアミノ酸配列に対応す
る合成りＮＡ、すなわち、 ５°　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３ＧＣＡ
ＡＴＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＣＴ Ｇ　　　　　　　　Ｇ　　　　　　　　ＧＴ　　　１７
ｍｅｒＣＣＣ Ｔ　　　　　　　　Ｔ　　　　　　　　Ｔ（３番目の塩
基はＡ、　Ｇ、　Ｃ，Ｔのいずれか９番目の塩基はＡ、
　Ｇ、　Ｃ，Ｔのいずれか１５番目の塩基はＡ、　Ｇ、
　Ｃ，Ｔのいずれか１６番目の塩基はＣまたはＴであり
、 組合せて１２８通りの合成りＮＡの混合物となる。）を
３２Ｐで標識したプローブに４５℃で強く会合した２株
を選んだ〔グルンステイン・ホグネス（Ｇｒｕｎｓｔｅ
ｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ）の方法、プロシーディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ：’　
ス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）
ＵＳＡ、、７２．３９６１（１９７５）］　。得られた
２菌株についてサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）の方法〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　
Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　）、　９８　、５０３　（１９
７５）　）により、上記プローブおよび上記と同様にし
て得られた他のトリプシン分解ペプチドＴＲ９のアミノ
酸配列に対応する合成りＮＡプローブ、すなわち、５′
　　　　　　　　　　　　　　　　３゜ＴＣＡＣＡＡＡ
ＴＡＧＧＡＣＣＡＴＣ ＧＧＧＧ ＣＣ Ｔ （３番目の塩基はＡまたはＧ ６番目の塩基はＡ、　Ｇ、　Ｔのいずれか９番目の塩基
はＡ、　Ｇ、　Ｃ，Ｔのいずれか１２番目の塩基はＡ、
Ｇ、Ｃ，Ｔのいずれか１５番目の塩基はＡまたはＧであ
り、 組合わせて１９２通りの合成りＮＡの混合物となる。） とも会合することを確認した。２株の保持するブラスミ
ドはｐＵｃ１９のＢａｍＨＪ部位に、１２．５ｋｂのシ
ュードモナス・アゾトコリガンス由来の染色体ＤＮＡ断
片が挿入された同一の構造をしており、ｐｓＫｌと命名
した。ｐｓＫｌの制限酵素地図を第１図に示した。

実施例５　遺伝子のサブクローニンク アスコルビン酸リン酸化酵素遺伝子は、ｐＳＫｌの挿入
断片中の５ａｌＩ−Ｘｂａｒ断片上に存在すると推定さ
れた。

上記で得られたプラスミドｐｓＫＩＤＮＡ２μｇを含む
溶液５０μＩに、２０単位のＸｂａ　Ｉおよび６０単位
の５ａｌＩを加え、完全消化した後、構造遺伝子を含む
４ｋｂｒ！ｌｒ片を、アガロースゲル電気泳動法〔マニ
アティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら：モレキュツー・クロ
ーニング、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラト
リ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）　（１９８２）］を用いて単離精製した
。

方、ベクターｐＵｃ１９の１Ｍｇを含む溶液２０μｍに
、１０ｊ１１位のＸｂａ　Ｉおよび３０単位の５ａｌＪ
を加え、完全消化後、フェノール：クロロホルム抽出、
エタノール沈澱を行い、ベクターＤＮＡ断片を得た。精
製したｐｓＫ１由来の４ｋｂＤＮＡ断片１１００ｎおよ
び精製ベクターＤＮＡ５０ｎｇを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
緩衝液中で１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼにより、１６
℃で１６時間結合反応を行った。このようにして得られ
た組換え体ＤＮＡを用い、大腸菌ＭＭ２９４株を形質転
換して、アンピシリン耐性の形質転換株を得た。

これらの形質転換株からプラスミドＤＮＡを分離精製し
、その構造解析を行ったところｐＵｃ１９のｌａｃプロ
モーターの下流にｐｓＫ１由来のアスコルビン酸リン酸
化酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入され
た構造であることを確認し、ｐＳＫ７と命名した。

実施例６　プラスミドｐＳＫ？上のアスコルビン酸リン
酸化酵素をコードする遺伝子の塩基配列の解析： 上記で得られたプラスミドｐＳＫ７に組み込まれた、ア
スコルビン酸リン酸化酵素をコードする遺伝子の塩基配
列を、ジテオキン法〔メツシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　
Ｊ、）、メソッド・イン・エンジモロジ−（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｎ＋ｏ１．）、１０１．２０（１
９８３）］にて決定した。アスコルビン酸リン酸化酵素
の構造遺伝子部分の塩基配列は、以下のとおりであった
。

ＡＴＧＡＴＣＣＧＣＧ　　ＧＴＧＧＣＡＴＣＴＴ　　Ｃ
ＧＣＡＧＣＧＣＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴＣ＾Ｔ（：ＧＣＧ
ＧＴＣ［：ＣＴＣＡＧＧＣＧＡＧＴ　　ＧＡＧＡＧＣＣ
ＧＧＧ　　ＣＧＴＡＣＣＴＣＧＣＣＧＣＧＧＧＣＣ＾八
　ＴＡＴＣＣＣＧＡＣＧ　　ＧＣＡＴＧＧＣＧＡＴ　　
ＣＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧＣＴＣＧＡＣ
ＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧ
ＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧ　ＧＧＣ＾＾ＣＧＣＧＧ＾八ＧＣ
ＴＧＧＡＧＧ　へＣＡＣＣＣＣＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧ八
ＴＣＧＣ口ＡＣＣＧＡ（：Ｇへ　ＡＣＧＴＣＡＣＣＡＡ
　　ＣＧＡＴＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＡＡＣＧ　　Ｃ
ＣＴＧＣＧＣＧＡＴ　　ＧＧＧＧＡＴＧＧＴＧ　　ＣＴ
ＣＧ八ＣＧへＣＡＡＧＡＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＡＣＴＴ
ＧＣＣＣＧＧＣＴＧＣＴＣＧ　ＡＴＣＧＣＧＣＡＧＧＣ
ＡＣＧＧＧＣＣＣＧ　ＧＴＣＧＴ［：ＧＧＣＡ　ＧＧＧ
ＴＧＡＡＧＧ［：　ＴＧＣＣＴＡＣＣＡＡＧＴＧＣＣＧ
ＣＧＴＣＣＣＴＡＴＣＴＧＣＧ　ＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣ
ＣＣＧＡＴＣＴＧＣＧＡＧＧ［：Ｃ＾＾ＧＡＣＣＧＣＡ
ＣＡＴＣＴＣＧＣＣＡＧＣ＾＾ＴＧ　　ＧＣＧＡＣＴ＾
口ＣＣＧＴＣＧＧＧＧＣＡＣＡ口ＣＧＣ（：＾＾ＴＧ　
　ＧＴＴＧＧＣＴＧＧＡ　　ＡＧＣＧＣＡＧＡＴＣ（：
ＴＣＧＣＣＧＡＧＧ　ＴＧＡＴＧＣＣＣＧＡ　ＣＡＡＧ
Ｇ［：ＧＡＣＴ　ＧＣＧＡＴＣＣＴＣＧＣＧｆ：Ｇ［：
ＧＧＣＣＧ　ＴＧ（：［：ＴＡＴＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣ
ＧＧＧ　ＣＧＡＴＴＴＧＣＧＧＧＴＣＧ［：Ａ［：ＡＧ
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ＧＣＣＣＣＴＧＧ実施例７．ＡｓＡ２Ｐの製造： 実施例５で得た組換え体プラスミドｐＳＫ７を用２い、
大腸菌ＭＭ２９４を形質転換した。得られたアンピシリ
ン耐性のコロニーを、１０ｍ１のＬＡｐ培地（Ｌ液体培
地に１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含有する培地〉に
接種し、３０ｔで２４時間培養した。得られた培養液０
．４ｍｌを、４０ｍ１のＬＡｐ培地に接種し、３６℃で
１６時間培養した。得られた培養液を８００Ｏｒｐｍで
１ｏ分間遠心して菌体を得、−２０℃にて凍結保存した
。凍結保存菌体５０ｍｇ／ｍｌ　（湿菌体重量）を含む
、アスコルビン酸０．４Ｍ、ビロリン酸０．２Ｍ、　ナ
イミ−：／５２１５４ｇ／ｌから成る反応液５０ｍ１を
マグネチック・スターラーにて９０　Ｏｒｐｍで撹拌し
つつ、ｐＨヲ４．２に温度を４０℃に保って１時間反応
させた。

その際のＡｓＡ２Ｐの生成量は８．９ｇ／ｌであった。

実施例８．　挿入断片の短縮： ｐＳＫ７は、その挿入断片中の構造遺伝子の上流および
下流に余分な介在配列が存在すると考えられたので、以
下に示すような方法で挿入断片をさらに短縮したプラス
ミドｐＳＫ８を造成した。

ｐＳＫ７ＤＮＡ８μｇを含む溶液１２０μｍに、８０単
位のＸｂａ　Ｉを加え完全消化した後、ＢＡＬ３１緩衝
液［：２０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０）、６００ｍＭ
ＮａＣ１−１２ｍＭ　Ｍｇ［ｌ：１２．１２ｍＭ　［：
ａＣ１＝　］中で、２単位のＢＡＬ３１ヌクレアーゼに
より３０℃にて消化反応を行った。反応開始後、４０分
から６０分の間経時的に反応液を採取し、それぞれフェ
ノール：クロロホルム抽出、エタノール沈澱を行い、１
〜２ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を得た。一方、ベクター
ｐＵｃ１９　１μｇを含む溶液２０μｍに、１０単位の
Ｓｍａ　Ｉを加え消化反応を行った後、２μＩのＩＭＦ
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）を加え、アルカリホスフ
ァターゼ５単位により６５℃で４０分間脱リン酸化反応
を行った。反応終了後、フェノール：クロロホルム抽出
、エタノール沈澱の操作を経てベクターＤＮＡ断片を得
た。

このようにして得られたｐＳＫ７由来のＤＮＡ断片１１
００ｎ　、およびｐＵｃ１９由来のＤＮＡ断片５０ｎｇ
を含む４０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液に、１０単
位のＴ４ＤＮＡＩＪガーセを加え、１６℃で１６時間結
合反応を行った。得られた組換え体ＤＮＡを用いて大腸
菌ＭＭ２９４株を形質転換し、アンピシリン耐性の形質
転換株を選択した。

得られた形質転換株を実施例７と同様に培養した菌体を
用い、ＡｓＡ２Ｐ生成活性を測定し、ＭＭ２９４／ｐＳ
Ｋ７と仕べて高い活性を示す菌株を選択した。その結果
、ＭＭ２９４／ｐＳＫ８株はＭＭ２９４／ｐＳＫ７株の
約１０倍の活性を示した。ｐＳＫ８プラスミドＤＮＡを
分離精製し、その構造解析を行ったところ、ｐＳＫ８の
挿入断片は約１ｋｂに短縮されていた。

施例９．　　プラスミドｐＳＫ１４の造成：ｐＳＫ８の
挿入断片には余分な介在配列はほとんどないと考えられ
るが、さらにｐＵｃ１９のマルチリンカ−サイトを利用
した改変を試み、プラスミドｐｓＫ１４を造成した。

ｐｓＫ８ＤＮＡ１μｇを含む溶液４０μｍ中に１０単位
のＸｂａＩ、１０単位のｓｐｈ　Ｉを加え、完全消化し
た後、アガロースゲル電気泳動により３、７　ｋ　ｂ付
近の断片を単離精製した。得られたＤＮＡを５０μｌの
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液［６７ｍＭ　）リス塩酸
（ｐＨ８，８）、　６．７ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１６．６
ｍＭ（ＮＨ，）２５０．．１０　　ｍＭ　　２−メルカ
プトエタノール、６．７ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．３３ｍ
Ｍ　ｄＣＴＰ、　０．３３ｍＭ　ｄＡＴＰ、　０．３３
ｍＭ　ｄＧＴＰ、　０．３３ｍＭ　ｄＴＴＰ：］中、５
単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化した。

反応液をフェノール、クロロホルム抽出、エタノール沈
澱後、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼ緩衝液４０μｌ中で５単位
のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼにより、１６℃で１６時間結合
反応を行った。

このようにして得られた組換え体ＤＮＡを用い、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換して、アンピシリン耐性の形質
転換株を得た。

これらの形質転換株からプラスミドＤＮＡを分離精製し
、その構造解析を行い、目的の構造であることを確認し
、ｐｓＫ１４と命名した。

実施例１０．アスコルビン酸リン酸化酵素の生産：実施
例９で得た組換え体プラスミドｐｓＫ１４を用い、大腸
菌ＭＭ２９４株を形質転換した。得られたアンピシリン
耐性のコロニーを実施例７と同様に培養し、遠心分離に
より菌体を回収した。

得られた菌体をレム’Ｊ　（Ｌａｅｍｍｌｉ）のサンプ
ルバッファー〔レムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）、　不イチ
−？　−（Ｎａｔｕｒｅ）。

２２７．６８０（１９７０）：］　ｌ：加熱、溶解後、
５ＤＳ−ポＩＪアクリルアミドゲル電気泳動〔レム’Ｊ
　（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法、同上文献〕を行い、ウェ
スタン・プロッティング〔トービン（Ｔｏｉｖｂｉｎ）
ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アヵデ
ミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、）ＬＩＳＡ、、７６、　４３５０（１９７
９）Ｅ後、ワサビペルオキシダーゼで標識した二次抗体
〔ダコー（ＯＡＫＯ）社製〕を用いた酵素抗体染色法〔
円部−史：細胞工学、　　２．１０６１（１９８３）：
］により、分子量約２９０００の部位にポリペプチドバ
ンドを検出した。このバンドはベクターｐＵｃ１９のみ
を保有する大腸菌を用いた場合には存在しなかった。こ
の結果、組換え体プラスミドｐＳＫ１４を保持する大腸
菌はアスコルビン酸リン酸化酵素を大量に生産している
ことが明らかとなった。

ｐｓＫ１４を含む大腸菌Ｍ　Ｍ　２９４株はＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　５ＫＬ４　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−
２９７０）として、微工研に平成２年６月１５日付で寄
託されている。

実施例１１．プラスミド保有株の酵素活性の比較：上記
実施例で得られたアスコルビン酸リン酸化酵素をコード
する遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを保有する菌株を用い
て、各菌株のアスコルビン酸リン酸化酵素の活性を比較
した。

下記第１表に示した各組換え体ＤＮＡ保有株を実施例７
と同様に培養し、得られた菌株を一２０℃にて凍結保存
した。各凍結保存菌体を下記第１表に示した菌体量（湿
菌体重量）を含む、アスコルビン酸０．４Ｍ、ピロリン
酸０．２Ｍ、ナイミーン８２１５　４ｇ／ｌから成る反
応液２ｍｌを、マグネチック・スターシーにて９０　Ｏ
ｒｐｍで攪拌しつつ、ｐｌｌを４．２に、温度を４０℃
に保って１時間反応させた。一方、シュードモナス・ア
ゾトコリガンス＾ＴＣＣ１２４１７株を実施例１と同様
に培養し、得られた菌体を一２０℃にて凍結保存した。

凍結保存菌体５０ｇ／］（湿菌体重量）を用いて、上記
と同様に反応を行った。得られた各反応液中のＡｓＡ２
Ｐ生成量を測定し、シュードモナス・アゾトコリガンス
＾ＴＣ［：　１２４１７株の菌体１ｇあたりのＡｓＡ２
Ｐの生成量を１として、各組換え体ＤＮＡ保有株の菌体
１ｇあたりのＡｓＡ２Ｐの生成量よりアスコルビン酸リ
ン酸化酵素の相対活性を求ｔた。結果を第１表に示す。

第１表 実施例１２．ＡｓＡ２Ｐの生産： 大腸菌５Ｋ１４株を実施例７と同様に培養し、得られた
菌体を一２０℃にて凍結保存した。凍結保存菌体５ｍｇ
／ｍｌ　（湿菌体重量）を含む、アスコルビン酸０．４
Ｍ１ビロリン酸０．２Ｍ、ナイミーンＳ　−２１５４ｇ
／Ｉから成る反応液５０ｍ１をマグネチック・スターシ
ーにて９０　Ｏｒｐｍで撹拌しつつ、ｐＨを４．２に、
温度を４０℃に保って２時間反応させた。その結果、反
応液中にＡｓＡ２Ｐが３４、９　ｇ／ｌ生成蓄積した。

実施例１３゜ 大腸菌５Ｋ１４株を実施例７と同様に培養し、得られた
培養液にアスコルビン酸０．４Ｍ、ビロリン酸０，２Ｍ
、ナイミーンＳ−２１５４ｇ／ｌを添加し、硫酸でｐＨ
を４．２に調整した後、１００　ｒｐｍで撹拌しつつ、
温度を４０℃に保って３０分間反応させた。その結果、
反応液中のΔ５Ａ２Ｐの蓄積量は１７．１　ｇ／］であ
った。

発明の効果 本発明によれば、アスコルビン酸とリン酸基供与体とか
らアスコルビン酸−２−リン酸を従来の方法に比べて効
率よく製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐｓＫ１の制限酵素地図を示す。第
２図、第３図および第４図はそれぞれプラスミドｐＳＫ
７、ｐＳＫ８およびｐｓＫ１４の作製工程を示す。 第 図 第 つ 図

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）エシェリシア属に属し、アスコルビン酸とリン酸
   基供与体とからアスコルビン酸−２−リン酸を生成する
   反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断
   片を組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する微生物の菌体
   、培養液またはそれらの処理物の存在下、水性媒体中で
   アスコルビン酸とリン酸基供与体とを反応させて、反応
   液から生成したアスコルビン酸−２−リン酸を採取する
   ことを特徴とするアルコルビン酸−２−リン酸の製造法
   。
2. （２）該リン酸基供与体がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ
   ）、パラニトロフェニルホスフェート、アセチルリン酸
   、ピロリン酸、トリポリリン酸、テトラポリリン酸また
   はポリリン酸から選ばれる請求項１記載の製造法。
3. （３）該ＤＮＡ断片が、シュードモナス属菌種由来であ
   る請求項１記載の製造法。
4. （４）アスコルビン酸とリン酸基供与体とからアスコル
   ビン酸−２−リン酸を生成する反応を触媒する酵素をコ
   ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を組み込んだ組換え体
   ＤＮＡ。
5. （５）該ＤＮＡ断片がシュードモナス属菌種由来である
   請求項４記載の組換え体ＤＮＡ。
6. （６）エシェリシア属に属し、アスコルビン酸とリン酸
   基供与体とからアスコルビン酸−２−リン酸を生成する
   反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断
   片を組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する微生物。
7. （７）該ＤＮＡ断片が、シュードモナス属菌種由来であ
   る請求項６記載の微生物。
8. （８）エシェリシア属に属し、アスコルビン酸とリン酸
   基供与体とからアスコルビン酸−２−リン酸を生成する
   反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断
   片を組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する微生物を培地
   に培養し、培養物中にアスコルビン酸リン酸化酵素を生
   成蓄積させ、該培養物から該酵素を採取することを特徴
   とするアスコルビン酸リン酸化酵素の製造法。
9. （９）該ＤＮＡ断片が、シュードモナス属菌種由来であ
   る請求項８記載の製造法。
10. （１０）シュードモナス属菌種由来で、下記の塩基配列
    で表わされる、アスコルビン酸とリン酸基供与体とから
    アスコルビン酸−２−リン酸を生成する反応を触媒する
    酵素をコードする遺伝子。 【遺伝子配列があります。】