JPH045208A - 遅効性抗菌剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は、遅効性抗菌剤に係り、特にキチン質（キチン
、キトサン）を微生物培養処理することにより得られる
固形の培養材料からなる抗菌剤、または該固形の培養材
料を更に培養して得られる固形の抗菌剤、或いは前記培
養材料に、水を加えて、固液分離して得られる固形分を
、更に培養して得られる固形の抗菌剤に関するものであ
る。

（背景技術） 近年、キチンやキトサンの如きキチン質を微生物によっ
て分解処理する手法が、種々検討されてきている。これ
は、昆虫類や甲殻類の外殻の処理の一つの手段としては
勿論のこと、そのような微生物処理によって得られる培
養物や培養生成物に有用な薬理活性が存することが認め
られたことによるものである。

かかる状況下、本発明者にあっても、キチンやキトサン
の如きキチン冨をよく分解し、またそれらの分解酵素類
の生産能力の高い微生物を広く自然界から検索している
うち、ｐＨに応して特異な挙動を示す菌株を見い出し、
そしてそのような菌株（微生物）をキチン培地乃至はキ
トサン培地にて培養して得られた培養体が、優れた抗菌
作用を有することを見い出したのである。

（解決課題） ここにおいて、本発明は、かかる知見に基づいて完成さ
れたものであって、その解決課題とするところは、遅効
性の抗菌作用を有し、且つその効果を長期に亘って持続
させ得る薬剤を、微生物の培養体から得ることにある。

（解決手段） そして、本発明は、かかる課題解決のために、コリネバ
クテリウム属のハイ２−Ａ株（微工研菌寄第１０７０２
号）若しくはアクロモバクタ属のハイボー８株（微工研
菌寄第１０７０３号）またはそれら菌株を含む混合微生
物を、キチン培地またはキトサン培地にて培養して得ら
れた固形の培養材料からなる遅効性抗菌剤を、その要旨
とするものである。

また、本発明は、この得られた固形の培養材料に対して
、更に燐源資材及び窒素源資材を配合せしめ、熟成させ
て得られる固形の遅効性抗菌剤をも、その特徴とするも
のである。

さらに、本発明にあっては、前記固形の培養材料に対し
て、水を加えて、固液分離して得られる固形分に、更に
燐源資材、窒素源資材及びキトサンを配合せしめ、熟成
させて得られる固形の遅効性抗菌剤をも、その特徴とす
るものである。

（具体的構成） ところで、かかる本発明に用いられる微生物は、コリネ
バクテリウム属に属する菌株であって、コリネバクテリ
ウム・バイネ−Ａと称されるもの、若しくはアクロモバ
クタ属に属する菌株であって、アクロモバクタ・バイネ
−Ｂと称されるものである。これらの菌株は、滋賀県内
のじゃがいもを原料とする食品（コロッケ）工場の水処
理廃水汚泥から採取され、そのような汚泥にモミ殻を混
ぜて発酵させ、そしてその発酵終了前に更にキトサンを
配合して好気的に発酵培養させたものから単離されたも
のであって、それぞれ、工業技術院微生物工業技術研究
所に、平成元年５月１日に、前者は「微工研菌寄第１０
７０２号（ＰＨＩ？Ｍ　ｐ−１０７０２）　Ｊとして、
また後者は「微工研菌寄第１０７０３号（ＦＥＲＭ　Ｐ
−１０７０３）　　ｌとして受託されており、それぞれ
の菌学的性質は、以下の通りである。

（ｒ）形態学的性質 ａ）バイネ−Ａ株 本菌株は、ダラム陽性の短桿菌（１，５〜２．０　μｍ
Ｘ１．０〜１．５　ｕｍ）である。

ｂ）バイネ−Ｂ株 本菌株は、ダラム陰性の桿菌（１，５〜２．０．ｃｚｍ
ｘＯ１５〜０．７μｍ）で、胞子は形成しない。

（ｎ）各種培地上の性質 ａ）バイネ−へ株 （１）ブイヨン寒天培地 殆ど生育が観られない。

（２）コロイダルキチン寒天培地 コロニーの色は白色で、周辺は少々波打っており、***
はあまりない。３０°Ｃで２日培養後、微かにコロニー
の周辺にクリアーゾーンが見られるが、１０日以上培養
を続けると、コロニーの周りに大きなりリアーゾーンを
形成する。生育速度はパイネＢ株に比べると遅い。

ｂ）バイネ−Ｂ株 （１）ブイヨン寒天培地 コロニーは、半透明で、やや白色を呈し、培地上を無秩
序に広がっていく。３０°Ｃで１日培養後には、生育が
認められる。

（２）コロイダルキチン寒天培地 コロニーは、最初透明で、クリアーゾーンが形成されて
いることで、生育か確認出来る。培養を続けると、どん
どん広かり、菌が良く生育した所は半透明で白色に見え
る。コロニーとクリアーゾーンの面積は路間しであるか
、多少クリアーゾーンの方が大きい。

（ＩＩＩ）生理的性質 ａ）パイネーム株 （１）各温度におけるコロイダルキチン寒天培地（ｐＨ
＝７．０）でのクリアーゾーンの状態（大きさ）は、下
表の通りである。

（２）生育ｐＨ ■Ｌ　Ｂ　（Ｌｕｒｉａ　Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（ｐＨ
７，８゜６．９．　５．９．　５．０．　４．０．　３
．０．　１．９゜１．０） 何れも３週間培養したが、生育は観られなかった。

■キチン培地（ｐ　Ｈ７，９、７，２、６，３、５゜５
．５．２，３．９，２．３，１．３）各培地での０Ｄ６
６゜値（６６０ｎｍの波長で測定された光学密度：生存
菌体の数を表わす）は下表の通りである。

ｐ　Ｈ７，９〜６．３で生育。

−二生育していない。

■　上記■、■で生育が観られなかった培養液（ＬＢ培
地：ｐＨ７，８〜１．０のものキチン培地：ｐＨ５，５
〜１．３のもの）を、ｐＨ７，０のキチン培地に１ｍｆ
ｆ１移し、生育を観た。なお、■のＬＢ培地ｐ　Ｈ７，
８〜１．０の培養液は３週間振盪培養後のものであり、
■のキチン培地ｐ　Ｈ５，５〜１．３の培養液は、同様
に、２週間培養後のものである。

生育結果（ＯＤ６６、値）は下表の通りである。

以上の結果より、本菌株は、中性付近で良く生育し、酸
性条件下では休眠状態にあると考えられる。

地（ｐＨ＝７．０）でのクリアーゾーンの直径（大きさ
）は、下表の通りである。

＊：コロニーがきれいな円形でないため、一方向の直径
しか測定していない。

−二生育していない。

十二シャーレの略−面に広がっている。

（２）生育ＰＨ（３０°Ｃ） ■ＬＢ培地（ｐ　Ｈ７，８、６，９、５，９、５，０。

４．０．３．０．　１．９．　１．０）生育結果（ＯＤ
６６、値）は下表の通りである。ｐ　Ｈ７，８〜５．９
で生育（２４時間後には完全に定常期に達する）。

（３）硝酸塩の還元・・・・・陰性 （４）硫化水素の発生・・・・陰性 （５）　　インドールの生成・・・陰性（６）Ｖ−Ｐテ
スト・・・・・陰性 （７）０〜Ｆテスト・・・・・陰性 （８）　　メチルレットテスト・・陰性（９）　　カタ
ラーゼ・・・・・・陽性（１０）　　オキシダーゼ・・
・・・陰性（Ｉ　＋）　　ウレアーゼ・・・・・・陰性
０２）￥Ｎからの酸とガスの生成試験 酸も、ガスも生成しないニ ゲルコース、サッカロース、ラ ムノース、ソルビトール、キシ ロース、ラクトース、ガラクト ース、マルトース、マンノース。

アラビノース、フラクトース。

マンニトール ０湯　嫌気培養・・・・・・生育しない。

ｂ）バイネ−Ｂ株 （１）各温度におけるコロイダルキチン寒天培■　上記
の図で生育が観られなかった培養液（ｐＨ５，０，４，
０，３，０，１，９，１，０）を、７日後に、ｐ　Ｈ７
，０のＬＢ培地に移す。その結果、元のｐＨが５．０〜
３．０のものは生育した。

これらの結果から、本菌株は、中性付近で良く生育する
が、酸性条件下では休眠状態であると考えられる。

（３）硝酸塩の還元・・・・・陰性 （４）硫化水素の発生・・・・陽性 （５）インドールの生成・・・陰性 （６）Ｖ−Ｐテスト・・・・・陰性 （７）Ｏ−Ｆテスト・・・・・陰性 （８）　　メチルレンドテスト・・陽性〔９）カタラー
ゼ・・・・・・陽性 ｑＯ）オキシダーゼ・・・・・陽性 （１０ウレアーゼ・・・・・・陰性 ０２）　　糖からの酸及びガスの生成試験酸もガスも生
成しないニ ゲルコース、サッカロース　ラ ムノース、ソルヒトール、キシ ロース、ラクトース、ガラクト ース　マルトース　マンノース アラビノース　フラクトース マンニトール ０３）嫌気培養・・・・・・生育する。

（ＩＶ）同定 ａ）バイネ−Ａ株 以上の諸性質から、本菌株は、「微生物の分類と同定（
下）」（長谷用武治編著、学芸出版センター）及び「パ
ーシーズ・マニュアル・オブ・システマチック・バイオ
テクノロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ
　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇＶ
）　Ｊから検索すると、コリネバクテリウム属の１菌株
と考えられるが、既知菌株の何れにも完全に一致しない
ので、コリネバクテリウム・バイオ−Ａ（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｂｉｎｅ−Ａ）　　と命名した。

ｂ）バイネ−Ｂ株 以上の諸性質から、本菌株は、アクロモバクタ属の１菌
株と考えられるが、上記書籍に記載の既知菌株の何れに
も一致しないので、アクロモバクタ・バイオ−Ｂ　（Ａ
ｃｈｒ。

ｍｏｂａｃｔｅｒ　Ｂｉｎｅ−Ｂ）と命名した。

（〜′）微生物の培養 それぞれの菌株の培養には、通常の放線菌の培養方法が
用いられる。培養基の炭素源としては、菌に誘導された
キチン質分解活性を喪失させないためにも、コロイダル
キチンやキトサン等のキチン質を主体とし、これに必要
に応じて公知の適当な炭素源を組み合わせて用いられる
こととなる。また、窒素源としては、アンモニウム塩、
硝酸塩、酵母エキス、ペプトン等が単独でまたは組み合
わせて用いられ、更にＰ源としては燐酸塩等が用いられ
ることとなる。更にその他、必要に応して、無機塩、例
えばアルカリ金属塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸
亜鉛、塩化マンガン等が適宜に添加されることとなる。

なお、培養方法としては、固体培地上での培養も可能で
あるが、一般の酵素生産の方法と同様に、液体培養を採
用することが好ましく、その際には、例えば次の如き組
成の液体培地が用いられる。コロイダルキチン：４ｇ、
Ｋ２ＨＰＯ４：　０．７　ｇ、ＫＨｚＰＯ−：　０．３
　ｇ、ＭｇＳＯ４・５ＨｚＯ：０．５ｇ、ＦｅＳＯ４−
７ＨｚＯ：０．０１ｇ、ＺｎＳＯ４：０．００１ｇ、　
ＭｎＣｆｆ１ｚ　　：　０．００１　ｇ１酵母エキス：
０、２５　ｇ、ペプトン：　０．２５　ｇ、寒天：１５
ｇ、蒸溜水：１０００ｍ１２、ＰＨ７１，０，また、か
かる培養は、バイオ−８株にあっては、好気的条件下及
び嫌気的条件下の何れにおいても行なわれ得るが、バイ
ネ−Ａ株にあっては、好気的条件下で行なわれる振盪培
養法や撹拌と通気による深部培養法などにて実施され、
更にそれらの培養温度は、一般に２０〜４０″Ｃ程度で
ある。

そして、本発明は、上記のコリネバクテリウム・バイネ
−Ａ若しくはアクロモバクタ・バイオ−８を用いて、更
に好適にはそれら菌株を含む混合微生物を用いて、キチ
ンやキトサンの如きキチン質を含む培地、即ちキチン培
地若しくはキトサン培地にて培養するものである。より
具体的には、先ず、それらの微生物を、キチンまたはキ
トサンの如きキチン質に微生物用栄養剤を適当量配合し
てなる混合培地に接種して、好気的条件下にて発酵を行
なう。この好気発酵は、大気中で所要日数放置すること
により実施することが出来るが、また必要に応じて、加
温したり、撹拌或いは強制通気したりする等の公知の好
気発酵操作が採用される。また、キチン質に配合される
栄養剤としては、米糠、糖蜜、油粕等があり、このよう
な栄養剤は、キチン質の１重量部に対して、一般に０．
０５〜２０重量部程度配合される。更に、このキチン質
と栄養剤からなる混合培地には、適当量の水分が加えら
れ、発酵可能な水分量（４０〜６０％）程度に調整され
ることとなる。

次いで、このようにして得られた好気発酵材料（生成物
）には、更にキチン質（キチン乃至はキトサン）、過リ
ン酸石灰、塩化カリ、微生物用栄養剤（米糠や糖蜜等）
が適宜に配合され、熟成か行なわれる。なお、この熟成
のための培地は、般に、上記好気発酵材料の１重量部当
たり、キチン乃至はキトサンを０．１〜１重量部、過リ
ン酸石灰を１５〜２５重量部、塩化カリを８〜１２重量
部、米糠を０．５〜１．５重量部、糖蜜を０．５〜１．
５重量部程度、配合せしめることにより調整され、また
水分率が４０〜６０％程度の湿潤状態において、１０〜
４０日程度、熟成される。更に、この熟成のための培地
内には、必要に応じて、空気が通気せしめられたり、加
温が施される。而して、このように熟成されることによ
り、本発明に係る固形の培養材料、即ち遅効性抗菌剤が
得られるのである。

また、本発明にあっては、上記の如く得られた培養材料
に対して、米糠等の燐源資材、油粕等の窒素源資材を配
合し、それらを均一に混合した後、１５〜３０日程度、
堆積して、空気を供給し、自然に熟成させることにより
、目的とする固形の遅効性抗菌剤を得ることも出来る。

なお、かかる窒素源資材としては、油粕等の有機物か用
いられるが、特に好適には豆科の植物が用いられ、また
その発酵か５０〜７０％済んだものか好ましい。また、
かかる熟成のための栄養剤の配合量としては、固形の培
養材料１００重量部に対して、燐源資材が２〜２０重量
部、窒素源資材が２００〜６００重量部、特に好ましく
は４００重量部程度において、配合されることが望まし
い。

さらに、本発明においては、前記培養材料に対して、所
定量（一般に等量乃至は２倍量程度）の水を加え、かか
る材料中の可溶成分を溶出せしめた後、通常の固液分離
操作を施して、その固相を採取し、そしてこの得られた
固形分に対して、前記と同様な燐源資材及び窒素源資材
を配合し、更にキトサンを均一に混合撹拌せしめて、同
様に熟成を行なうことによっても、本発明に係る固形の
抗菌剤を得ることが出来る。

かかる熟成に際しての栄養剤の配合量は、固液分離して
得られた固形の材料１００重量部に対して、燐源資材は
１〜１０重量部、窒素源資材は１００〜３００重量部、
特に好ましくは２００重量部程度、及びキトサンは１〜
５重量部がそれぞれ好適に採用される。

かくして得られる目的とする固形の抗菌剤中には、上記
の微生物培養によって生成する有効成分の他、微生物そ
のものも存在し、例えばキトサン培地を用いた場合にあ
っては、未分解のキトサンを始め、低分子キトサン、キ
トサナーゼ、オリゴ垢、キトサン分解微生物（ハイ名−
Ａ菌、ハイネＢ菌）等の有効成分が含まれ、以て優れた
抗菌作用が奏され得るのである。また、キチン培地を用
いた場合にあっても、キチンの分解によってキトサンが
生成されるものであるところから、上記と同様な有効成
分を含む培養材料が得られることとなる。

また、この培養材料中に存在する微生物（バイネ−ム菌
、バイネ−Ｂ菌）は、種培養菌として有利に利用するこ
とが出来、例えばこの培養材料の一部を、前述の如く、
キチン質培地に配合して好気発酵を行ない、更に熟成さ
せることによって、目的とする培養材料を得るサイクル
を確立することが出来る。

ところで、かくの如き培養材料が病原微生物の増殖を阻
害する機構については、未だ充分に解明されていないか
、現時点では、そのメカニズムは、次のように考えられ
ている。先ず、培養材料中に存在するキトサン、低分子
キトサン、そのオリコ糖成分は、植物に吸収され、細胞
を刺激、活性化して、ＤＮＡからＲＮＡへの転写を促進
して、キトサン分解酵素（キトサナーゼ）やキチン分解
酵素（キチナーゼ）を誘導生合成する。また、βグルカ
ナーゼ、抗菌性物質：ファイトアレキシンやリグニン形
成に関与するフェニルアンモニアリアーゼの生産を促す
。そして、活性化された細胞は、植物生産（蛋白質、炭
水化物、脂質）を増加させると共に、耐病性を獲得する
。培養材料中に存在し、また植物細胞により誘導生合成
されたキチナーゼ、キトサナーゼは、病原性微生物の細
胞壁のキチン、キトサンを分解して崩壊させ、障害を与
え、そこへ抗菌性物質：ファイトアレキシン等が侵入し
て、病原性微生物の生育を阻害する。

また、キトサンオリゴ塘は、病原性微生物の細胞内に侵
入して、その増殖を抑制する。更に、キトサン分解微生
物（バイネ−Ａ菌、バイネ−Ｂ菌）は植物の根圏に付着
し、接近する病害微生物の細胞壁をキチナーゼ、キトサ
ナーゼで溶解して、植物の根を病原微生物から守る。要
するに、本発明に従う培養材料中に存在する有効成分に
よって、溶菌作用が直接的に或いは間接的に惹起され、
それにより病原菌の生育を阻害して、優れた抗菌作用が
発揮されるようになるのである。

そして、その結果、本発明に従う培養材料からなる薬剤
は、極めて優れた抗菌作用を奏し得るのであり、特にキ
チン質で構成された病原菌に起因する病害の予防及び防
除効果に優れており、例えばモモ　リンゴ、ナシ、ブド
ウ、ビワ等の白モンパ病等に対して、優れた抗菌作用を
示すと共に、かかる抗菌剤は、固形状であるところから
、その効果はゆっくりと現れ、且つ長期において維持さ
れることとなる。

なお、このような本発明に係る固形の抗菌剤を植物に施
用するに際しては、従来の固形状薬剤の施用方法と同様
な手法か採用され、例えば、そのような抗菌剤にて植物
の罹患した色部を直接に被包したり、施用すべき植物が
植え付けられている土壌の該植物の周囲、特に病根の上
に相当する部位に、所定深さの穴を数箇所堀り、その中
に本発明の抗菌剤の所定量を入れて、埋め込んだりする
方法等が、適宜に採用されることとなる。

（実施例） 以下に、本発明の実施例を示し、本発明を更に具体的に
明らかにすることとするが、本発明が、そのような実施
例の記載によって何等の制約をも受けるものでないこと
は、言うまでもないところである。

また、本発明には、以下の実施例の他にも、更には上記
の具体的記述以外にも、本発明の趣旨を逸脱しない限り
において、当業者の知識に基づいて種々なる変更、修正
、改良等を加え得るものであることが、理解されるべき
である。

府１杯料ＬＮ製 先ず、キトサン粉末１　ｋｇと米糠０．２　ｋｇと糖蜜
０、２　ｋｇと油粕０．６　ｋｇからなる混合培地を用
い、これに、コリふバクテリウム・ハイ２−Ａ株及びア
クロモバクタ・ハイネ＝Ｂ殊の種培養菌を含む培養液を
接種し、培地の水分量を約５０％に調整して、大気中で
１０日間放置することにより、好気発酵せしめた。

次いで、この得られた好気発酵材料の１重量部に対して
、過リン酸石灰２０重量部、塩化カリ１０重量部、米糠
１重量部、糖蜜１重量部及びキトサン０．５重量部を配
合して、室温下において、１ケ月間熟成せしめ、固形の
培養材料を得た。

さらに、かくして得られた培養材料に対して、等量の水
を添加して、通常の固液分離操作を施し、その固形分を
採取した。この固形分１００重量部に対して、米糠５重
量部及び油粕２００重量部及びキトサン３重量部を配合
して、均一に混合撹拌した後、３０日間堆積して、空気
を供給し、自然に熟成するようにして、目的とする固形
の熟成物（薬剤）を得た。

ナシの白モンバ　　、： ナシの白モンパ病に対する上記塾成物の効果について調
べるために、先ず、新値後７年を経過し、罹病している
ナシ（品種：幸水）の２０本（そのうち枯死寸前のもの
４本）に対して、それぞれの樹の周囲の土壌、特に病根
の上に相当する部位に、深さ２０〜３０ｃｍの穴を１本
につき６カ所ずつ掘り、各人の中に、上記で得られた薬
剤の０．７ｋｇを入れて、その上を覆土することにより
、施用した。

その結果、全宿木において、徐々に、葉の黄変が解消し
、技の伸張も正常となり、芽の出も正常となる等の効果
が認められ、最終的に、３ケ月後には全宿木が回復した
。また、ナシの糖度も、罹病中には、８度以下であった
ものが、１２度以上に回復して、出荷可能となった。

（発明の効果） 以上の説明から明らかなように、本発明には、コリ茅バ
クテリウム・ハイ２−Ａ株若しくはアクロモバクタ・ハ
イ２−Ｂ株、またはそれら菌株を含む混合微生物を、キ
チン培地やキトサン培地にて培養することにより得られ
た固形の培養材料からなり、またはそれを更に培養せし
めること二二より、或いは前記培養材料に水を加えて、
固液分離して得られる固形分を更に培養せしめることに
より、得られた固形の熟成物からなるものであるところ
から、かかる抗菌剤が、施用されることによって、各種
の病原菌、例えばモモ、ナシ等の白モンパ病等に対して
、優れた遅効性の抗菌作用を示すと共に、そのような作
用を長期に亘って与えるという極めて有利な効果を奏す
るのである。

出願人　　有限会社トダハイオシステム研究所受託番号
変更届 平成２年５月３０日 平成２年　特許−第１０８３６７号 ２、発明の名称 遅効性抗菌剤 ３、手続をした者 事件との関係　　特許出暉人 住　所　滋賀県甲賀郡甲西町若竹町１３−６名　称　　
有限会社　トダハイオンステム研究所通商産業省工業技
術院微生物工業技術研究所６　旧受託番号 微工研菌寄第１０７０２号及び微工研菌寄第１０７０３
号７、新寄託機関の名称

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）コリネバクテリウム属のバイネ−Ａ株（微工研菌
   寄第１０７０２号）若しくはアクロモバクタ属のバイネ
   −Ｂ株（微工研菌寄第１０７０３号）またはそれら菌株
   を含む混合微生物を、キチン培地またはキトサン培地に
   て培養して得られた固形の培養材料からなる遅効性抗菌
   剤。
2. （２）コリネバクテリウム属のバイネ−Ａ株（微工研菌
   寄第１０７０２号）若しくはアクロモバクタ属のバイネ
   −Ｂ株（微工研菌寄第１０７０３号）またはそれら菌株
   を含む混合微生物を、キチン培地またはキトサン培地に
   て培養して得られた固形の培養材料に対して、更に燐源
   資材及び窒素源資材を配合せしめ、熟成させて得られる
   固形の遅効性抗菌剤。
3. （３）コリネバクテリウム属のバイネ−Ａ株（微工研菌
   寄第１０７０２号）若しくはアクロモバクタ属のバイネ
   −Ｂ株（微工研菌寄第１０７０３号）またはそれら菌株
   を含む混合微生物を、キチン培地またはキトサン培地に
   て培養して得られた固形の培養材料に対して、水を加え
   て、固液分離して得られる固形分に、更に燐源資材、窒
   素源資材及びキトサンを配合せしめ、熟成させて得られ
   る固形の遅効性抗菌剤。