BE1005485A5 - Agent viral. - Google Patents

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Abstract

L'invention a trait au polypeptide viral de l'hépatite non-A non-B post-transfusionnelle, aux séquences d'ADN encodant ce polypeptide viral, aux vecteurs d'expression contenant ces séquences d'ADN et aux hôtes transformés par ces vecteurs d'expression. L'invention a également trait à l'utilisation de tels peptides dans les essais de diagnostic et les formulations de vaccin.

Description


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  AGENT VIRAL. 
 EMI1.1 
 



  1. 1 t- : La présente invention a trait. à là séparation : et à la pplr < -a à la carac. térisation de l'agent viral responsable de l'hépatite non-A non-B post-transfusionnelle   (PT-NANBH)   et. en particulier aux polypeptides viraux   : PT-NANBH, au   séquences d'ADN encodant ces polypeptides viraux, aux vecteurs d'expression contenant ces séquences d'ADN, et aux   - cellules hôtes transformées   par ces vecteurs   d'expression.   



   Elle se rapporte également à l'utilisation d'une séquence   d'ADN   dans un essai d'hybridation d'acide nucléique pour le 
 EMI1.2 
 diagnostic de la PT-NANBH Elle a traita en otreà diac ait- ! l'utilisation de polypeptides viraux   PT-NANBH   ou   anticorps   polyclonaux ou monoclonaux contre ces polypeptides dans une immunoanalyse pour le diagnostic de   PT-N & NBH ou dans   un vaccin pour sa prévention. 



   L'hépatite non-A, non-B (NANBH) est par définition un diagnostic d'exclusion et a généralement été utilisée pour décrire des cas d'infection hépatique virale chez l'être humain qui ne sont pas dus à des virus d'hépatite A ou B. Dans la majorité de ces cas, la cause de l'infection n'a pas été identifiée bien que pour des raisons. cliniques et épidémiologiques, on ait pensé à un certain nombre d'agents qui pourraient être responsables, cfr Shih 
 EMI1.3 
 et al (Prog. Liver Dis. et al (prog. Liver Dis., 1986, 8, 433-452). Rien qu'sax Etats-Unis d'Amérique, jusqu'à 10% des transfusions sanguines peuvent avoir une NANBH comme conséquence, ce qui en fait un problème d'importance.

   Même pour la PT-NAHBH, il peut y avoir au moins plusieurs agents viraux responsables de l'infection et au fil des années, les revendications quant à l'identification de l'agent n'ont-pas manqué, maisaucune n'a été établie. 



   La demande de brevet européen 88310922. 5 tend à décrire la séparation et la caractérisation de l'agent 

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 éthiologique responsable de la PT-NANBH que l'on appelle également virus de l'hépatite C (HCV). Une bibliothèque d'ADNc a été préparée à partir d'acide nucléique viral obtenu d'un chimpanzé atteint de PT-NANBH et a été sélectionnée au moyen d'antisérums humains. Une série de clones ont été isolés et mis en séquence. Les données de séquence d'acide nucléique et d'acide aminé en résultant et qui sont décrites dans la demande, représentent approximativement 70% du génome viral   10kb   et sont entièrement dérivées de son extrémité 3'correspondant à la région de programmation non structurée. 



   Les inventeurs ont à présent isolés et caractérisés les polypeptides viraux de la PT-NANBH par le clonage et l'expression de séquences d'ADN encodant ces polypeptides viraux.   D'une manière-surprenante-,   les données de séquence d'acide nucléique et d'acide aminé présentent des différences considérables avec les données correspondantes rapportées dans la demande de brevet européen 88310922.5. Dans l'ensemble, ces différences sont d'environ 20% au niveau de l'acide nucléique et de 15% au niveau de l'acide aminé, mais certaines régions des séquences présentent même des différences plus importantes. 



  Le niveau global de différence est plus important que ce que l'on attendrait pour deux isolats du même virus, même en tenant compte de facteurs géographiques, et peut s'expliquer par l'une des deux raisons suivantes. 



   Tout d'abord, les inventeurs de la présente invention et ceux de la demande de brevet européen susmentionnée ont utilisé des sources différentes pour l'acide nucléique utilisé dans le clonage du cADN. En particulier la demande de brevet européen décrit l'utilisation de plasma de chimpanzé comme source du matériel de départ de l'acide nucléique viral, le virus ayant été transmis à un chimpanzé à deux occasions. La PT-NANBH est, bien sûr, une maladie humaine et le passage 

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 du virus dans un hôte étranger, même s'il est proche parent de l'homme, se traduira vraisemblablement par une mutation intensive de l'acide nucléique viral.

   De ce fait les données de séquence que contient la demande de brevet européen 8831022.5 peuvent ne pas être exactement représentatives de l'agent viral réel responsable de la PT-NANBH chez l'homme. 



  Par contraste, les inventeurs de la présente invention ont utilisé l'acide nucléique viral d'une source de plasma humain comme matériel de départ pour le clonage du cADN. Les données de séquence ainsi obtenues sont plus susceptibles de correspondre aux séquences natives d'acide nucléique et d'acide aminé de la PT-NANBH. 



   Deuxièmement, il peut se faire que l'agent viral existe sous la forme de plus d'un sous-type et que les données de séquence décrites dans la demande de brevet européen et celles élucidées par les inventeurs de la présente correspondent à des sous-types séparés et distincts du même agent viral. Alternativement il peut se faire que le niveau de différence entre les deux groupes de données de séquences soit dû à une combinaison de ces deux facteurs. 



   La présente invention donne un polypeptide viral PT-NANBH comprenant un antigène ayant une séquence d'acide aminé qui est pour au moins 90% homologue à la séquence d'acide aminé indiquée dans les SEQ   IDN  :   3,4, 5,18, 19,20, 21 ou 22, ou en est un fragment antigénique. 



   Les SEQ ID   NO 3,   4,5, 18,19, 20,21 ou 22 indiquent la séquence d'acide aminé telle qu'on la déduit de la séquence d'acide nucléique. La séquence d'acide aminé sera de préférence homologue à au moins 95% ou même 98% avec la séquence d'acide aminé indiquée en SEQ ID NO 3,4, 5,18, 19,20, 21 ou 22. Facultativement l'antigène peut être fondu avec un polypeptide hétérologue. 



   Deux antigènes ou plus peuvent facultativement 

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 être utilisés soit en combinaison soit fondus en un seul polypeptide. L'utilisation de deux antigènes ou plus de cette manière dans un essai de diagnostic donne des résultats plus fiables que l'utilisation de l'essai de criblage du sang pour le virus PT-NANBH. On obtiendra de préférence un antigène dans la région de programmation structurée (l'extrémité 5') et un autre dans la région de programmation non structurée (l'extrémité 3'). La préférence est donnée en particulier à la fusion des antigènes entre eux pour donner un polypeptide résultant de la recombinaison.

   Cette dernière approche présente une série d'avantages en ce sens que les antigènes individuels peuvent être combinés dans un rapport fixe déterminé à l'avance (habituellement équimolaire) et qu'il ne faut produire, purifier et caractériser qu'un seul polypeptide. 



   Un fragment antigénique d'un antigène ayant une séquence d'acide aminé homologue à au moins 90% avec ce qui est indiqué dans les SEQ ID no 3, 4, 5,18, 19,20, 21 ou 22 contiendra de préférence un minimum de cinq, six, sept, huit, neuf ou dix, quinze, vingt, trente, quarante ou cinquante acides aminés. Les emplacements antigéniques de ces antigènes peuvent être identifiés au moyen de procédures type. Celles-ci peuvent impliquer la fragmentation du polypeptide lui-même au moyen d'enzymes protéolyptiques ou d'agents chimiques et la détermination subséquente de l'aptitude de chaque fragment à se lier aux anticorps ou à provoquer une réponse immune en cas d'inoculation à un animal ou dans un système de modèle in vitro approprié 
 EMI4.1 
 (Stroh-maier et al, Gen. Virol., 1982, 59, 205-306). i9, 20e-306). 



  Alternativement   l'ADN   encodant le polypeptide peut être fragmenté par digesticn par des enzymes réducteurs ou d'autres techniques réputées et ensuite introduit dans un système d'expression pour produire des fragments (facultativement fondus en un polypeptide généralement d'origine bactérienne). Les fragments qui en résultent sont évalués comme décrit précédemment (Spence   e-c   al, J. Gen. 

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 Virol., 1989, 70, 2843-51 ; Smith et al, Gene, 1984, 29, 263-9). Une autre approche consiste à synthétiser chimiquement de courts fragments de peptides (longueur de 3-20 acides aminés ; conventionnellement longueur de 6 acides aminés) qui couvrent la totalité de la séquence du polypeptide long avec chaque peptide chevauchant le peptide adjacent.

   (ce chevauchement peut être à partir de 1-10 acides aminés, mais l'idéal est n-1 acides aminés, où n est la longueur du peptide ; Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sc., 1984,81, 3998-4002). Chaque peptide est alors évalué comme décrit précédemment, si ce n'est qu'il est généralement d'abord couplé à une molécule porteuse pour faciliter l'induction d'une réponse immune. Enfin il y a des méthodes de prédiction qui comportent l'analyse de la séquence du point de vue de caractéristiques particulières, par   ex.,   l'hydrophilicité, dont on pense qu'elles ont un rapport avec des emplacements importants immunologiquement parlant (Hopp et Woods, Proc. Natl. Acad. Sc., 1981, 78, 3824-8 ; Berzofsky, Science, 1985,229, 932-40).

   Ces prédictions peuvent alors être testées par les approches du polypeptide ou du peptide résultant de la recombinaison décrites précédemment. 



   Le polypeptide viral sera, de préférence, fourni sous une forme pure, c. à. d. avec une pureté supérieure à 90%, voire 95%. 



   Le polypeptide viral PT-NANBH de la présente invention peut être obtenu au moyen d'un synthétiseur d'acide aminé, s'il s'agit d'un antigène n'ayant pas plus d'environ trente résidus ou par la technologie de   l'ADN   résultant de la recombinaison. 



   La présente invention fournit également une séquence d'ADN encodant un polypeptide viral PT-NANBH tel que défini ici. 

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   La séquence d'ADN de la présente invention peut être synthétique ou clonée. La séquence d'ADN sera, de préférence, telle qu'indiquée dans la SEQ ID ne 3,4, 5,18, 19,20, 21 ou 22. 



   Pour obtenir un polypeptide viral PT-NANBH comprenant de multiples antigènes, il est préférable de fondre les séquences de programmation individuelles en un seul cadre de lecture ouvert. La fusion devra, bien sûr, se faire de manière à ce que l'activité antigénique de chaque antigène ne soit pas compromise de manière importante par sa position par rapport à un autre antigène. On accordera, bien entendu, une attention particulière à la nature des séquences à l'endroit de la jonction entre les antigènes. 



  Les méthodes d'obtention de tels polypeptides simples sont bien connues dans ce domaine. 



   La présente invention fournit également un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN telle que définie ici, et capable, en présence d'un hôte approprié, d'exprimer la séquence d'ADN pour produire un polypeptide viral PT-NANBH. 



   Le vecteur d'expression contient normalement des éléments de contrôle de l'ADN qui réalisent l'expression de la séquence d'ADN dans un hôte approprié. Ces éléments peuvent varier en fonction de l'hôte, mais comprennent généralement un activateur, un site de liaison aux ribosomes, des sites de démarrage et d'arrêt translationnels, et un site d'arrêt de la transcription. Des exemples de tels vecteurs sont les plasmides et les virus. 



  Les vecteurs d'expression de la présente invention comprennent à la fois des vecteurs extrachromosomiques et des vecteurs qui sont intégrés dans le chromosome de la cellule hôte. Pour utilisation dans des E. coli, le vecteur d'expression peut contenir la séquence d'ADN de la présente invention facultativement sous forme de fusion liée soit à 

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 l'extrémité   5'ou 3'de   la séquence d'ADN encodant, par exemple, la   ss-galactosidase   ou à l'extrémité   3'de   la séquence d'ADN encodant, par exemple, le gène trp E. Pour utilisation dans le système de bacillovirus de l'insecte (AcNPV), la séquence d'ADN est facultativement fondue avec la séquence de programmation de la polyhédrine. 



   La présente invention fournit également une cellule hôte transformée avec un vecteur d'expression tel que défini ici. 



   Des exemples de cellules hôte utilisées avec la présente invention comprennent les cellules procaryotiques et eucaryotiques, telles que cellules bactériennes, de levure, de mammifères et d'insectes. Des exemples particuliers de telles cellules sont les E. coli, les s. cerevisiae, les P. pastors, des cellules d'ovaire de hamster chinois et de souris, et la Spodoptera   fruqiperda   et la Tricoplusia ni. Le choix de la cellule hôte peut dépendre d'une série de facteurs, mais si la modification post-translationnelle du polypeptide viral PT-NANBH est importante, on choisira de préférence un hôte eucaryotique. 



   La présente invention fournit également un procédé pour préparer le polypeptide viral PT-NANBH qui comprend le clonage ou la synthétisation d'une séquence d'ADN encodant le polypeptide viral PT-NANBH, tel que défini ici, insérant la séquence   d'ADN   dans un vecteur d'expression capable, dans un hôte approprié, de s'exprimer, de transformer une cellule hôte avec le vecteur d'expression, de faire une culture de la cellule hôte transformée et d'isoler le polypeptide viral. 



   Le clonage de la séquence d'ADN peut être effectué au moyen de procédures type bien connues dans ce domaine. Par ailleurs, il est particulièrement avantageux dans ces procédures d'utiliser les données de séquence 

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 révélées ici de manière à faciliter l'identification et la séparation des séquences d'ADN clonées souhaitées. L'ARN sera isolé, de préférence, en pastillant le virus à partir du plasma d'humains contaminés identifiés par implication dans la transmission de PT-NANBH. 



  L'ARN isolé fait l'objet d'une transcriptase inverse dans l'ADNc par amorçage sélectif ou par oligo-dT. 



  Facultativement l'ARN peut être soumis à une étape de pré-traitement pour en retirer toute structure secondaire qui pourrait interférer avec la synthèse ADNc, par exemple, par chauffage ou par réaction avec de l'hydroxyde mercurique de méthyle. L'ADNc est habituellement modifié par addition de linkers suivie d'une digestion avec un enzyme réducteur. 



  Il est alors inséré dans un vecteur de clonage, tel que le pBR322 ou un dérivé de celui-ci ou les-vecteurs lambda gtlo et gtll (Huynh   et al, DNA Cloninq,   1985, Vol. 1 : A Practical Approach, Oxford, IRC Press), conditionné en virions le cas échéant, et les molécules d'ADN résultant de la recombinaison utilisées pour transformer les E. coli et donc générer la bibliothèque souhaitée. 



   La bibliothèque peut être examinée de manière sélective en utilisant une stratégie de sélection type. S'il s'agit d'une bibliothèque d'expression, elle peut être examinée sélectivement au moyen d'une méthode immunologique avec des antisérums obtenus à partir de la même source de plasma que le matériel de départ de l'ARN et également avec des antisérums provenant de sources humaines supplémentaires supposées positives pour des anticorps contre la PT-NANBH. Etant donné que les antisérums humains contiennent généralement des anticorps contre les E. coli qui peuvent donner lieu à un important mouvement propre pendant la sélection, il est préférable de les traiter d'abord avec un lysat   d'E. coli   non   transformé   de manière à retirer ces anticorps.

   Il est avantageux d'avoir recours à un contrôle négatif au moyen d'antisérums provenant de donneurs humains 

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 accrédités, c. à. d. des donneurs humains ayant été soumis à des tests répétés et ne présentant pas d'anticorps contre l'hépatite virale. Une stratégie de sélection alternative serait d'utiliser un ou plusieurs oligonucléotides marqué (s) comme sondes d'hybridation. L'utilisation d'oligonucléotides dans l'examen sélectif d'une bibliothèque cADN est généralement plus simple et plus fiable que la sélection avec des antisérums. Les oligonucléotides seront synthétisés de préférence en utilisant les informations de la séquence d'ADN contenues ici. Un ou plusieurs tours de criblage supplémentaires d'une sorte ou de l'autre peuvent être effectués pour caractériser et identifier les clones positifs. 



   Après avoir identifié un premier clone positif, la bibliothèque peut être réexaminée sélectivement pour détecter des clones positifs supplémentaires en utilisant le premier clone comme sonde d'hybridation. Alternativement ou en sus, d'autres bibliothèques peuvent être préparées et celles-ci peuvent être sélectionnées au moyen   d'immuno-sélecteurs   ou de sondes d'hybridation. De cette manière, on peut obtenir d'autres séquences d'ADN. 



   Alternativement, la séquence d'ADN encodant le polypeptide viral PT-NANBH peut être synthétisée au moyen de procédures type et cette solution peut être préférée au clonage de   l'ADN   dans certaines circonstances (Gait. 



  Oligonucleotid Svnthesis : A Practical Approach, 1984, Oxford, IRL Press). Donc clonée ou synthétisée, la séquence d'ADN souhaitée peut être insérée dans un vecteur d'expression utilisant des techniques type connues. Le vecteur d'expression est normalement coupé au moyen d'enzymes réducteurs et la séquence d'ADN insérée au moyen d'une ligature à extrémité émoussée ou en zigzag. La coupure est généralement réalisée en un site de restriction dans une position adéquate dans le vecteur d'expression de manière 

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 à ce qu'une fois insérée, la séquence d'ADN soit sous le contrôle des éléments fonctionnels de l'ADN qui réalisent son expression. 



   La transformation d'une cellule hôte peut être effectuée par des techniques type. Un marqueur phénotypique est habituellement utilisé pour faire la distinction entre les transformants qui ont repris avec succès le vecteur d'expression et les autres. La mise en culture de la cellule hôte transformée et la séparation du polypeptide viral PT-NANBH peut également se faire par des techniques type. 



   L'anticorps spécifique d'un polypeptide viral PT-NANBH de la présente invention peut être obtenu au moyen du polypeptide. Il peut être polyclonal ou monoclonal. L'anticorps peut être utilisé pour les essais de contrôle de qualité de lots de polypeptides viraux PT-NANBH ; la purification d'un polypeptide viral PT-NANBH ou du lysat viral ; la topographie des épitopes ; lorsqu'il est marqué, comme élément conjugué dans un essai type compétitif, pour la détection des anticorps ; et dans les essais de détection des antigènes. 



   L'anticorps polyclonal contre un polypeptide viral PT-NANBH de la présente invention peut être obtenu en injectant un polypeptide viral PT-NANBH, facultativement couplé à un support pour promouvoir une réponse immune, dans une cellule de mammifère : souris, rat, mouton ou lapin, et en récupérant l'anticorps ainsi produit. Le polypeptide viral   PT-NANBH   est généralement administré sous forme d'une formulation injectable dans laquelle le polypeptide est mélangé à un diluant physiologiquement acceptable. Des adjuvants tels que l'adjuvant complet de Freund (FCA) ou l'adjuvant incomplet de Freund (FIA) peuvent être inclus dans la formulation.

   La formulation est normalement injectée dans   l'hôte   sur une période de temps appropriée, des échantillons de plasma étant prélevés à intervalles 

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 réguliers pour essai relatif aux anticorps viraux   anti-PT-NANBH.   Lorsqu'un niveau d'activité approprié est obtenu, l'hôte fuit. L'anticorps est alors extrait du plasma sanguin et purifié par des procédures type, par exemple, par protéine A ou par chromatographie en résine échangeuse des ions. 



   L'anticorps monoclonal contre un polypeptide viral PT-NANBH de la présente invention peut être obtenu en fondant des cellules d'une lignée cellulaire immortalisante avec des cellules produisant des anticorps contre le polypeptide viral et en faisant une culture de la lignée cellulaire fondue rendue immortelle. De manière typique, on inocule à un hôte mammifère non humain, tel que souris ou rat, le polypeptide viral. Après un temps suffisant pour que l'hôte ait pu élaborer une réponse anticorps, des cellules produisant des anticorps, telles que les splénocytes, sont retirées.

   Les cellules d'une lignée cellulaire immortalisante, telle qu'une lignée cellulaire de myélome de souris ou de rat, sont fondues avec les cellules produisant des anticorps et les fusions en résultant examinées de manière sélective pour identifier une lignée cellulaire, telle qu'un hydridome, sécrétant l'anticorps monoclonal souhaité. La lignée cellulaire fondue peut être mise en culture et l'anticorps monoclonal purifié du milieu de culture de manière similaire à la purification de l'anticorps polyclonal. 



   Les essais de diagnostic basés sur la présente invention peuvent être utilisés pour déterminer la présence ou l'absence d'infection PT-NANBH. ils peuvent également être utilisés pour contrôler le traitement de cette infection, par exemple dans une thérapie d'interféron. 



   Dans un essai pour le diagnostic d'une infection virale, il y a fondamentalement trois approches distinctes qui peuvent être adoptées impliquant la détection de l'acide nucléique viral, l'antigène viral ou l'anticorps viral. 

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  L'acide nucléique viral est généralement considéré comme le meilleur indicateur de la présence du virus lui-même et identifierait des substances susceptibles d'être infectieuses. Par ailleurs, la détection de l'acide nucléique n'est généralement pas aussi directe que la détection d'antigènes ou d'anticorps puisque le niveau cible peut être très bas. L'antigène viral est utilisé comme marqueur pour la présence du virus et comme indicateur de   l'infectivité.   En fonction du virus, la   quantité d'antigènes   présente dans un échantillon peut être très faible et difficile à détecter. La détection d'anticorps est relativement directe car, en effet, le système immune de l'hôte amplifie la réponse à une infection en produisant d'importantes quantités d'anticorps qui circulent.

   La nature de la réponse des anticorps peut souvent être cliniquement utile, par exemble des anticorps de catégorie IgM plutôt qu'IgG indiquent une infection récente, ou la réponse à un antigène viral particulier associé à la clearance du virus. 



  Donc l'approche exacte adoptée pour le diagnostic d'une infection virale dépend des circonstances particulières et de l'information recherchée. Dans le cas du PT-NANBH, une analyse de diagnostic peut incorporer n'importe laquelle de ces trois approches. 



   Dans un essai pour le diagnostic de PT-NANBH impliquant la détection d'acide nucléique viral, la méthode peut comprendre l'hybridation de l'ARN viral présent dans un échantillon ou de l'ADNc synthétisé à partir de cet ARN viral, avec une séquence d'ADN correspondant à la séquence de nucléotide de la SEQ ID   n    3,4, 5,18, 19,20, 21 ou 22 et la sélection des hybrides d'acide nucléique en résultant pour identifier tout acide nucléique viral PT-NAN3H. L'application de cette méthode est habituellement limitée à un échantillon d'un tissu approprié, tel que biopsie du foie, où   l'ARN   viral est susceptible d'être   présent dans   de fortes proportions.

   La séquence   d'ADN   correspondant   à la   séquence de nucléotide de la SEQ ID n* 3, 4, 5, 18, 19, 20,21 

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 ou 22 peut prendre la forme d'un oligonucléotide ou d'une séquence ADNc contenant facultativement un plasmide. La sélection des hybrides d'acide nucléique sera, de préférence, effectuée au moyen d'une séquence d'ADN marquée. Un ou plusieurs tours de sélection supplémentaires d'un type ou de l'autre peuvent être effectués pour mieux caractériser l'hybride et donc identifier tout acide nucléique viral PT-NANBH. Les étapes de l'hybridation et de la sélection sont effectuées suivant des procédures connues. 



   Par suite de l'application limitée de cette méthode dans l'essai de l'acide nucléique viral, une méthode privilégiée et plus pratique implique la synthèse d'ADNc à partir de l'ARN viral présent dans un échantillon, l'amplification d'une séquence d'ADN présélectionnée correspondant à une sous-séquence de la séquence de nucléotide de la SEQ ID nO 3, 4, 5, 18,19, 20,21 ou 22, et l'identification de la séquence d'ADN présélectionnée. 



  L'échantillon pour essai peut être prélevé dans tout tissu approprié ou fluide physiologique et sera de préférence concentré pour tout   l'ARN   viral présent. Un exemple de tissu approprié est une biopsie du foie. Des exemples de fluide physiologique approprié sont : l'urine, le plasma, le sang, le sérum, le sperme, les larmes, la salive ou le fluide cérébrospinal. Les exemples de premier choix sont le sérum et le plasma. 



   La synthèse de l'ADNc s'effectue normalement par transcription inverse amorcée au moyen d'amorces sélectives, définies ou oligo-dT. L'amorce la plus avantageuse est un oligonucléotide correspondant à la séquence nucléotide de SEQ ID   n    3,4, 5,18, 19,20, 21 ou 22 et conçu pour enrichir en ADNc contenant la séquence présélectionnée. 



   L'amplification de la séquence d'ADN présélectionnée est de préférence effectuée au moyen d'une technique de réaction en chaîne de polymérase (PCR) (Saiki 

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 et al, Science, 1985,230, 1350-4). Dans cette technique, on utilise une paire d'amorces oligonucléotides dont l'une correspond à une portion de la séquence de nucléotide de SEQ ID   n    3,4, 5,18, 19,20, 21 ou 22 et dont l'autre se trouve du côté   3'de   la première et correspond à une portion de la séquence complémentaire, la paire définissant entre elles la séquence d'ADN présélectionnée.

   Les oligonucléotides ont généralement une longueur d'au moins 15, de manière optimale de 20 à 26 bases et bien que quelques erreurs puissent être tolérées en variant les conditions de la réaction, l'extrémité   3'des   oligonucléotides devrait être parfaitement complémentaire pour pouvoir amorcer de manière efficace. La distance entre les extrémités   3'des   oligonucléotides peut être d'environ 100 à environ 2000 bases. Pratiquement l'un des oligonucléotides de la paire utilisée dans cette technique sert également pour amorcer la synthèse d'ADNc.

   La technique PCR elle-même est effectuée sur l'ADNc sous forme d'une seule chaîne utilisant un enzyme tel que la polymérase Taq, et un surplus d'amorceurs oligonucléotides de plus de 20-40 cycles conformément aux protocoles publiés   (Saiki et   al, Science, 1988,239, 487-491). 



   Pour raffiner la technique, il peut y avoir plusieurs tours d'amplification, chaque tour étant amorcé par une autre paire d'oligonucléotides. Donc, après le premier tour d'amplification, une paire interne d'cligonucléotides définissant une séquence d'ADN plus courte (disons, de 50 à 500 bases) peut être utilisée pour un deuxième tour d'amplification. Dans ce raffinement quelque peu plus fiable, auquel on se réfère sous le nom de "Nested   PCR",   c'est bien entendu, la séquence d'ADN amplifiée finale qui constitue la séquence présélectionnée. 



  (Kemp et al, Proc. Natl. Acad. Sc., 1989,   86 (7),   2423-7 et Mullis et al, Methcds in   Enzynclocy,   1987, 155, 335-350). 



   L'identification de la séquence d'ADN 

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 présélectionnée peut se faire par analysa des produits PCR sur un gel agarose. La présence d'une bande au poids moléculaire calculé pour la séquence présélectionnée est une indication positive de la présence d'acide nucléique viral dans l'échantillon. Des méthodes alternatives d'identification comprennent celles basées sur le transfert Southern, le transfert de points, la restriction oligcmère et mise en séquence de l'ADN. 



   La présente invention fournit également un kit d'essai pour la détection de l'acide nucléique viral PT-NANBH, qui comprend : i) une paire d'amorces oligonucléotides dont l'une correspond à une portion de la séquence de nuclé- otides de SEQ ID nO 3,4, 5, 18, 19,20, 21 ou 22 et dont l'autre se trouve du côté   3'de   la première et correspond à une portion de la séquence com- plémentaire, la paire définissant entre elles une séquence d'ADN présélectionnée ; ii) un enzyme de transcriptase inverse pour la syn- thèse de l'ADNc à partir de l'ARN de l'échantil- lon en amont de l'amorce correspondant à la sé- quence de nucléotides complémentaire de SEQ ID
N'3, 4,5, 18,19, 20,21 ou 22 ;

     iii) un enzyme   capable d'amplifier la séquence d'ADN présélectionnée   ;   et facultativement iv) des solutions de lavage et tampons de réaction. 



   Avantageusement le kit d'essai contient également un échantillon de contrôle positif pour faciliter l'identification de l'acide nucléique viral. Les caractéristiques des amorces et des enzymes seront de préférence celles indiquées ci-dessus en rapport avec la technique PCR. 



  Dans un   essai peur le diagnostic de   la PT-NANBH impliquant la détection d'antigènes viraux ou d'anticorps viraux, la méthode peut comprendre la mise en contact d'un échantillon 

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 avec un polypeptide viral PT-NANBH de la présente invention ou un anticorps polyclonal ou monoclonal contre ce polypeptide, et la détermination de l'existence ou non d'une liaison antigènes anticorps contenue dans l'échantillon. 



  L'échantillon   peut être prélevé   dans tout tissu ou fluide physiologique approprié mentionné ci-dessus pour la détection de l'acide nucléique viral. Si on obtient un fluide physiologique, il pourra être concentré de manière optimale pour détecter tout antigène ou anticorps viral présent. 



   Une série de formats d'analyse peuvent être utilisés. Le polypeptide viral PT-NANBH peut être utilisé pour capturer les anticorps de manière sélective par rapport à la   PT-NANBH   dans la solution, pour marquer de manière sélective les anticorps déjà capturés ou à la fois pour capturer et pour marquer les anticorps. De plus, le polypeptide viral peut être utilisé dans une variété de formats d'analyse homogènes dans lesquels l'anticorps réagissant avec l'antigène est détecté dans la solution sans séparation de phases. 



   Les types d'essai dans lesquels on utilise le polypeptide viral   PT-NANBH   pour capturer les anticorps dans la solution impliquent l'immobilisation du polypeptide sur une surface solide. Cette surface devrait pouvoir être lavée d'une manière ou d'une autre. Des exemples de surfaces adéquates sont des polymères de différents types (moulées dans des cupules de microtitrage ; des perles ; des tige-ctes de différents types ; des électrodes ; et des appareils optiques), des particules (par ex., latex ; érythrocytes stabilisés ; cellules bactériennes ou fongiques ; spores ; sels contenant contenant de   l'or   ou d'autres métaux ; et   gels proéinacés), la dimensicn   habituelle de la particule étant de 0,02 à 5 microns, des membranes (par ex., de nitrocellulose ; papier ;   acétccallulose ;

   et   des membranes haute   porosité/haute   

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 surface d'un matériau organique ou inorganique). La fixation du polypeptide viral PT-NANBH à la surface peut se faire par adsorption passive d'une solution de composition optimale contenant des tensioactifs, des solvants, des sels et/ou des chaotropes ; ou par liaison chimique active. La liaison active peut être effectuée au moyen d'une variété de groupes fonctionnels réactif ou activables qui peuvent être exposés à la surface (par exemple agents de condensation ; esters acides actifs, halogénures et anhydrides ; groupes aminés, oxhydrile ou carboxyle ; groupes sulfydryle ; groupes carbonyle ; groupes diazo ; ou groupes insaturés).

   Facultativement la liaison active peut se faire via une protéine (elle-même attachée à la surface passivement ou par liaison active), telle l'albumine ou la caséine, à laquelle le polypeptide viral peut être lié chimiquement par toute une série de méthodes. L'utilisation d'une protéine de cette manière peut conférer des avantages par suite d'un point isolélectrique, d'une charge, de l'hydrophilicité ou de toute autre propriété physico-chimique. Le polypeptide viral peut également être attaché à la surface (généralement, mais pas nécessairement, une membrane) suite à la séparation électrophorétique d'un mélange réactionnel, tel que la précipitation immune.

   Après avoir mis en contact (avoir fait réagir) la surface supportant le polypeptide viral PT-NANBH avec un échantillon, en laissant le temps nécessaire pour qu'il y ait réaction, et le cas échéant, en retirant le surplus d'échantillon par l'un des nombreux moyens disponibles (lavage, centrifugation, filtration, magnétisme ou action capillaire), l'anticorps capturé est détecté par n'importe quel moyen qui donnera un signal détectable.

   On peut, par exemple, y arriver en utilisant une molécule ou une particule marquée comme indiqué ci-dessus qui réagira avec l'anticorps capturé (par exemple, protéine A, protéine   G,   etc. ; anti-espèce ou sous-type   d'anti-immoglobuline   ; facteur rhumatoïde ; ou anticorps de l'antigène utilisé de manière compétitive ou bloquante), ou toute molécule contenant un épitope contenu dans le polypeptide.

   Le signal 

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 détectable peut être optique, radioactif ou physico-chimique et peut être fourni directement en marquant la molécule ou la particule avec, par exemple, un colorant, un marqueur radioactif, une espèce électroactive, une espèce magnétiquement résonante ou fluorogène, ou indirectement en marquant la molécule ou la particule au moyen d'un enzyme capable lui-même de donner lieu à un changement mesurable de n'importe quel type. Alternativement le signal détectable peut être obtenu, par exemple, par agglutination ou par un effet de diffraction ou de biréfringence si la surface est sous forme de particules. Des essais dans lesquels un polypeptide viral PT-NANBH est utilisé lui-même pour marquer un anticorps déjà capturé demandent une certaine forme de marquage de l'antigène qui permettra sa détection.

   Le marquage peut être direct en attachant chimiquement ou passivement, par exemple, un marqueur radioactif, une espèce magnétiquement résonante, un marqueur sous forme de particule ou d'enzyme au polypeptide ; ou indirect en attachant toute forme de marque à une molécule qui réagira elle-même avec le polypeptide. La chimie de liaison d'une marque au polypeptide viral PT-NANBH peut se faire directement via une moitié déjà présente dans le polypeptide, telle qu'un groupe aminé, ou par le biais d'une moitié intermédiaire, telle qu'un grou-pe de maléimides. 



  La capture de l'anticorps peut se faire sur n'importe laquelle des surfaces déjà mentionnées par n'importe quel réactif y compris l'adsorption passive ou activée qui se traduira par la liaison de complexes spécifiques d'anticorps ou immunes. En particulier, la capture de l'anticorps pourrait se faire par une anti-espèce ou un sous-type d'anti-immoglobuline, par facteur rhumatoïde, protéines A, G, etc. ou par toute molécule contenant un épitope contenu dans le polypeptide. Le polypeptide PT-NANBH marqué peut être utilisé dans une liaison compétitive où la liaison à toute molécule spécifique sur n'importe laquelle des surfaces données comme exemple ci-dessus est bloquée par l'antigène dans l'échantillon.

   Alternativement, il peut être 

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 utilisé d'une manière non-compétitive dans laquelle l'antigène dans l'échantillon est lié spécifiquement ou non spécifiquement à l'une des surfaces ci-dessus et est également lié à une molécule spécifique bi-ou polyvalente (par   ex.,   un anticorps), ses autres valences étant utilisées pour capturer le polypeptide marqué.

   Souvent, dans des analyses homogènes, le polypeptide viral PT-NANBH et un anticorps sont marqués séparément de manière à ce que lorsque l'anticorps réagit avec le polypeptide viral en solution libre, les deux marques interagissent pour permettre, par exemple, le transfert non rayonnant d'énergie capturée par une marque vers l'autre marque avec détection appropriée de la deuxième marque excitée ou de la première marque éteinte (par ex., par fluorimétrie, résonance magnétique ou mesure des enzymes). L'addition de polypeptide viral ou d'anticorps dans un échantillon se traduit par une restriction de l'interaction de la paire marquée et donc par un niveau différent du signal dans le détecteur. Un format d'essai convenant pour la détection de l'anticorps PT-NANBH est le format de l'immuno-dosage avec enzyme en sandwich (EIA).

   Un polypeptide viral PT-NANBH est appliqué sur des cupules de microtitrage. Un échantillon et un polypeptide viral PT-NANBH auxquels sont couplés un enzyme, sont ajoutés simultanément. Tout anticorps PT-NANBH présent dans l'échantillon se lie à la fois avec le polypeptide viral recouvrant la cupule et avec le polypeptide viral couplé à l'enzyme. De manière typique le même polypeptide viral est utilisé des deux côtés du sandwich. Après lavage, l'enzyme lié est détecté au moyen d'un substrat spécifique impliquant un changement de couleur.

   Un kit d'essai pour utilisation dans un tel EIA comprend : (1) un polypeptide viral PT-NANBH marqué d'un enzyme ; (2) un substrat pour l'enzyme ; (3) un moyen procurant une surface sur laquelle un polypeptide PT-NANBH est immobilisé ; et (4) facultativement, des solutions de lavage et/ou tampons. 

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   Les polypeptides viraux de la présente invention peuvent être incorporés dans une formulation de vaccin pour induire l'immunité contre le PT-NANBH chez l'homme. A cette fin, le polypeptide viral peut être présenté en association avec un support acceptable du point de vue pharmaceutique. Pour son utilisation dans une formulation de vaccin, le polypeptide viral peut facultativement être présenté comme un élément d'une particule née de la fusion du noyau de l'hépatite B, telle que décrite dans Clarke et al (Nature, 1987, 330,381-384), ou un polymère à base de polylysin, tel que décrit dans Tam (PNAS, 1988, 85, 5409-5413). Alternativement, le polypeptide viral peut facultativement être attaché à une structure particulaire telle que liposomes ou ISCOMS.

   Les supports acceptables du point de vue pharmaceutique sont, entre autres, des milieux liquides pouvant être utilisés pour véhiculer le polypeptide viral dans l'organisme d'un patient. Un exemple de tels milieux liquides est la solution saline. Le polypeptide viral lui-même peut être dissous ou mis en suspension sous forme de solide dans le support. La formulation de vaccin peut également contenir un adjuvant pour stimuler la réponse immune et ainsi, accentuer l'effet du vaccin. Des exemples d'adjuvants sont, entre autres : l'hydroxyde d'aluminium et le phosphate d'aluminium. La formulation de vaccin peut contenir une concentration finale du polypeptide viral allant de 0,01 à 5 mg/ml, de préférence de 0,03 à 2 mg/ml.

   La formulation de vaccin peut être incorporée dans un conteneur stérile qui est alors scellé et stocké à basse température, par exemple, à   4 C,   ou peut être lyophilisée. 



  Pour introduire l'immunité contre le PT-NANBH chez l'homme, on peut administrer une ou plusieurs doses de la formulation du vaccin. Chaque dose peut être de 0, 1 à 2 ml, de préférence de 0,2 à 1 ml. Une méthode pour induire l'immunité contre le   PT-NANBH   chez l'homme consiste à administrer une quantité efficace de formulation du vaccin comme il a été dit précédemment. La présente invention fournit également l'utilisation d'un polypeptide viral 

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 PT-NANBH dans la préparation d'un vaccin pour utilisation dans l'induction de l'immunité contre le PT-NANBH chez l'homme. Les vaccins de la présente invention peuvent être administrés par toute méthode appropriée pour l'administration de vaccins, y compris l'injection orale et parentérale (ex., intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire).

   Le traitement peut consister en une seule dose de vaccin ou en plusieurs doses réparties dans le temps. Les souches de E. coli transformées suivantes ont été déposées auprès de la National Collection of Type Cultures (NCTC), Central Public Health Laboratory, 61, Colindale Avenue, Londres, NW9 5HT aux dates indiquées :   i) E.   coli TG1 transformés par pDX113 (WD001) ; Dépôt   n    NCTC 12369 ; 7 décembre 1989.   ii) E.   coli TG1 transformés par pDX128 (WD002) ; Dépôt   no NCTC   12382 ; 23 février 1990. iii) E. coli TG1 transformés par   pl36/155   (WD003) ;
Dépôt   n    NCTC 12428 ; 28 novembre 1990. 



    (iv)   E. coli TG1 transformés par   pl56/92   (WD004) : Dépôt   n    NCTC 12429 ; 28 novembre 1990. 



  (v) E. coli TG1 transformés par   pl29/164   (WD005) ;
Dépôt   n    NCTC 12430 ; 28 novembre 1990. 



  (vi) E. coli TG1 transformés par pDX136 (WD006) ; Dépôt   n    NCTC 12431 ; 28 novembre 1990. 



   Dans les figures, la figure 1 représente la production de pDX122 décrite à l'Exemple 7, la figure 2 représen-te deux séquences fondues alternatives décrites à l'Exemple 17, et la figure 3 représente des cartes de 
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 restriction, de SEQ ID ne 21 et 22. Dans la liste de séquences, il y a des listes SEQ ID n  1 à 25 auxquelles référence est faite dans la description et dans les revendications. Les exemples suivants servent à illustrer l'invention. 



  EXEMPLE 1. Synthèse de   l'ADNc   

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Le plasma regroupé (160 mls) de deux personnes (appelées A et L) connues pour avoir transmis la NANBH via des transfusions a été dilué (1 : 2,5) avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ensuite centrifugé à 190. 000g (par ex., 30.000 t/min dans un rotor MSE 8x50) pendant 5 heures à   4OC.   Ce qui surnageait a été retenu comme source des anticorps spécifiques pour la sélection ultérieure des bibliothèques d'ADNc.

   La pastille a été remise en suspension dans 2 mls de 20mM tris-chlorhydrate,   2mM   EDTA 3% SDS, 0,2M NaCl (2xPK) extrait 3 fois avec un volume égal de phénol, 3 fois avec du chloroforme, une fois avec de l'éther, et ensuite précipité avec 2,5 volumes d'éthanol   à-20 C.   Le précipité a été remis en suspension dans 10 l de   10mM   tris-chlorhydrate, lmM EDTA à pH 8. 0 (TE). 



  L'acide nucléique a été   utilisé   comme modèle dans un kit de synthèse d'ADNc (Amersham International pic, Amersham, Royaume-Uni) avec amorçage   oligo-dT   et hexanucléotide sélectif. Les conditions de la réaction étaient telles que recommandées par le fournisseur du kit. Spécifiquement 1 l d'acide nucléique a été utilisé pour une première réaction de synthèse de brin qui a été marquée (-32P) dCTP (Amersham ; activité   spé-cifique 3000Ci/mmol)   dans un volume final de 20 cl et incubé à   42. C   pendant 1 heure.

   La totalité de première réaction de brin a ensuite été utilisée pour la deuxième réaction de synthèse du brin, contenant E. coli   RNaseH   (0,8 U) et de la polymérase ADN 1 (23 U) dans un volume final de   lOOjnl, incubé   à   120C   pendant 60 minutes, 
 EMI22.1 
 ensuite à 22. C pendant 60 minutes. L'ensemble de la réaction a ensuite été incubé à 70 C pendant 10 minutes, placé sur glace, 1 U de polymérase d'ADN T4 y a été ajoutée et ensuite il a été incubé à   370C   pendant 10 minutes. La réaction a été arrêtée en ajoutant   51   de 0,2M EDTA pH8. Les nucléotides non incorporés ont été enlevés en passant la réaction dans une colonne NICK (Pharmacia Ltd, Milton Keynes, Royaume-Uni).

   L'ADNc a ensuite été ex-trait deux fois avec du phénol, trois fois avec du chloroforme, une fois avec de l'éther et ensuite 20 g de dextran ont été ajoutés avant 

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 précipitation avec 2, 5 volumes d'éthanol 100%. 



  EXEMPLE 2. Production de bibliothèque d'expression 
La pastille d'ADNc séchée a été remise en suspension dans   51   de TE stérile et ensuite incubée avec 500ng de linkers EcoRI (Pharmacia, GGATTCC phosphorylé) et 0, 5 U de ligase   d'ADN   T4 (New England BioLabs, Beverley, MA, USA) dans un volume final de 10   gl   contenant 20mM de tris-HCl pH7, 5,   10mM   MgC12, 10mM DTT,   1mM   ATP pendant 3 heures à   15 C.   La ligase a été neutralisée en chauffant à   65 C   pendant 10 minutes et l'ADNc a été digéré avec 180U   d'EcoRI (BCL, Lewes, U. K. ) dans un volume final de 1001 à     37. C   pendant 1 heure.

   De l'EDTA a été ajouté à une concentration finale de   10mM   et l'ensemble de la réaction chargé sur une colonne AcA34 (LKB). Des fractions   (501)   ont été collectées et comptées. Le pic d'ADNc dans le volume exclu (980 cpm) a été regroupé, extrait deux fois avec du phénol, trois fois avec du chloroforme, une fois avec de l'éther et ensuite précipité à l'éthanol. L'ADNc ds a été remis en suspension dans   51   de TE et ligaturé sur des bras lambda gtll EcoRI (Gibco, Paisley, Ecosse) dans une réaction de 10 l contenant 0,5U de ligase d'ADN T4,66 mM de tris-hydrochlorate, 10mM de MgC12, 15mM de DTT pH 7,6 à 15 C pendant la nuit.

   Après neutralisation de la ligase par chauffage à 65 C pendant 10 minutes,   51   de la réaction ont été ajoutés à une réaction de repliage d'Amersham et incubés à-22 C pendant 2 heures. Le matériel replié a été titré sur le brin Y1090 E. coli (Huynh etal 1985) et contenait un total de 2, 6x104 résultant de la recombinaison. 



  Des cellules pour monocouches   (Y0190)   ont été préparées en inoculant 10 mls de bouillon-L avec une seule colonie d'une plaque d'agar et en agitant pendant la nuit à 37 C. Le jour suivant, 0,5mls de la culture de la nuit ont été dilués avec   10mls   de bouillon-L frais et   0,   lml 1M MgS04 et   0,   1ml 20% (p/v) de maltose ont été ajoutés. La culture a été agitée pendant 2 heures à 37 C, les bactéries récoltées par 

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 centrifugation à 5.000g pendant 10 minutes et remises en suspension dans 5 mls de   10mM   MgS04 pour produire le stock de cellules pour monocouches.

   Une portion   (dgl)   du matériel replié a été mélangée avec 0,2ml de cellules pour monocouches, incubée à   370C   pendant 20 minutes avant d'ajouter 3 mls de gélose de couverture et l'ensemble du mélange versé sur une plaque L-agar de 90 mm. Après incubation pendant la nuit à   47 C,   les plaques ont été comptées et le nombre total de phages résultant de la recombinaison a été déterminé. Le matériel replié restant (500   pl)   a été stocké à   4 C.   Des bibliothèques supplémentaires ont été préparées de manière substantiellement similaire. 



  EXEMPLE 3. Sélection des bibliothèque d'expression 
La bibliothèque initiale décrite à l'Exemple 2 a été plaquée sur le brin Y1090 E. coli à une densité d'environ 5x103 pfu par plaque de   140mm   et incubée à   37 C   pendant 2 heures jusqu'à ce que les plaques soient visibles. Des filtres de nitrocellulose stériles ayant été imprégnés d'IPTG (isopropyl-thiogalactoside) ont été laissés en contact avec la plaque pendant 3 heures et ensuite retirés.

   Les filtres ont d'abord été blo-qués par incubation avec une solution de blocage (3% (p/v) BSA/TBS-Twee (lOmM Tris-HCl pH8, 150mM NaCl, 0, 05% (v/v) Tween 20) contenant 0,05% bronidox) (20mls/filtre) et ensuite transférés vers la solution tampon de liaison   (1%   (p/v)   BSA/TBS/Tween   contenant 0,05% bronidox) contenant des anticorps purifiés (par chromatographie en résine échangeuse des ions) provenant du plasma regroupé de A & L   (20J.'gjml).   Après incubation à température ambiante pendant 2 heures, les filtres ont été lavés trois fois avec   TBS-Tween   et ensuite incubés dans la sclution tampon de liaison contenant un sérum anti-humain de mouton biotinylé (1 : 250).

   Après 1 heure à température ambiante, les filtres ont été lavés 3 fois avec TBS/Tween et ensuite incubés dans la solution tampon de liaison 

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 contenant un complexe de streptavidine/peroxydase (1 : 100). 



  Le signal s'est développé avec DAB. Les signaux positifs sont apparus sous forme de plaques (colorées). 



   Sur un total de 2,6 x 104 plaques sélectionnées, 8 signaux positifs ont été obtenus lors du premier tour de sélection. En utilisant les filtres comme calibre, les régions des plaques originales correspondant à ces signaux positifs ont été cueillies au moyen d'une pipette de Pasteur stérile. Les bouchons agar ont été mis en suspension dans 0,1 ml de tampon SM et les phages ont pu se diffuser. Le titre de phages de chaque bouchon a été déterminé sur le brin Y1090 E. coli. Le stock de phages de chaque bouchon a ensuite été réexaminé de manière sélective comme auparavant sur des plaques séparées de 90 mm à une densité d'environ 1 x 103 pfu par plaque. Sur les 8 signaux positifs du premier tour, un était clairement positif au second tour, c. à. d. > 1% de plaques positives, il a été appelé JG2.

   Cela correspond à un taux positif de 40/106 dans la bibliothèque. 



   Ceci et d'autres phages positifs identifiés de façon similaire dans d'autres bibliothèques d'ADNc décrites à l'Exemple 2 ont ensuite été purifiés par des tours répétés d'examen sélectif de plaques à faible densité (1-200 pfu/plaque de 90 mm) jusqu'à ce que 100% des plaques soient positives avec la sélection d'anticorps A & L. Trois phages résultant de cette recombinaison sont JG1, JG2 et JG3. 



  EXEMPLE 3. Sélection secondaire de   JG1,   JG2 et JG3 avec un échantillonnage de sérum 
Chacun des phages résultant de la recombinaison, JG1, JG2 et JG3, ont été purifiés sur plaque et stockés sous forme de stocks titrés dans un tampon SM à   4*C.   Ces phages ont été mélangés (1 : 1) avec un stock de phages identifiés comme étant négatifs dans l'Exemple 3 et le mélange utilisé pour contaminer le brin Y1090 E. coli à 1000 pfu par plaque. 

 <Desc/Clms Page number 26> 

 



  Des décollements de plaque ont été effectués et traités comme décrit à l'Exemple 3, si ce n'est que les filtres ont été divisés en quadrants et que chaque quadrant a été incubé avec un anticorps différent ; il s'agissait des anticorps A & L   (20g/ml)   ; du plasma de A (1 : 500) ; du plasma de L (1 : 500) et d'IgG de H   (20mg/ml).   H est un patient probablement positif pour les anticorps PT-NANBH car il s'agissait d'un hémophile qui avait reçu un Facteur VIII n'ayant pas subi de traitement thermique. A la fin de la réaction, chaque filtre a été jugé à l'insu comme étant positif (lorsqu'il y avait manifestement deux types de signal) ou négatif (lorsque toutes les plaques donnaient le même signal).

   Ce pouvait être un jugement subjectif et les résultats ont donc été comparés et seuls les filtres pour lesquels un acord était atteint à la majorité ont été considérés comme positifs. Les résultats sont présentés au tableau 1. 



   TABLEAU 1 
 EMI26.1 
 
<tb> 
<tb> A & L <SEP> A <SEP> L <SEP> H
<tb> HJG1 <SEP> + <SEP> +
<tb> JG2 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> JG3 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 
 
JG1 est apparu comme réagissant uniquement avec des anticorps du patient A et non de L ou H ; ce n'est pas ce qu'on attendrait   d'un véritable   polypeptide résultant de la recombinaison lié à PT-NANBH et donc JG1 a été écarté de l'analyse. Par ailleurs, JG2 et JG3 ont montré des réactions positives nettes avec les trois sérums PT-NANBH A, L et H ; on a poursuivi leur analyse. Le type d'analyse décrit ci-dessus a été répété pour JG2 et JG3, si ce n'est que les filtres ont été divisés en portions plus petites et que celles-ci ont été incubées avec des panneaux de sérums positifs et négatifs.

   L'échantillonnage de sérums positifs comprenait les sérums de 10 hémophiles et de 9 drogués utilisant la voie intraveineuse (IVDA). Ceux-ci 

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 représentaient la meilleure source de sérums positifs même si le taux positif réel était inconnu. L'échantillonnage de sérums négatifs a été obtenu de donneurs accrédités étroitement contrôlés pendant de nombreuses années par le North London Blood Transfusion Centre, Deansbrook Road, Edgware, Middlesex, U. K. et n'ont jamais présenté aucun signe d'infection pour toute une série d'agents y compris PT-NANBH. Les résultats sont présentés aux tableaux 2 et 3. 



   TABLEAU 2 
 EMI27.1 
 
<tb> 
<tb> I. <SEP> D. <SEP> JG2 <SEP> JG3
<tb> IVDAs <SEP> V19146 <SEP> 4/4 <SEP> 0/5
<tb> V27083 <SEP> 2/4 <SEP> 0/5
<tb> V29779 <SEP> 0/4 <SEP> 0/5
<tb> V12561 <SEP> 0/5 <SEP> 4/5
<tb> V15444 <SEP> 3/4 <SEP> 5/5
<tb> V18342 <SEP> 4/4 <SEP> 0/5
<tb> V8403 <SEP> 3/4 <SEP> 0/5
<tb> V20001 <SEP> 4/4 <SEP> 0/5
<tb> V21213 <SEP> 3/4 <SEP> 0/5
<tb> Hémophiles <SEP> M1582 <SEP> 4/4 <SEP> 4/5
<tb> M1581 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> M1575 <SEP> 3/5 <SEP> 0/5
<tb> M1579 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> M1585 <SEP> 3/5 <SEP> 0/5
<tb> M1576 <SEP> 1/5 <SEP> 1/5
<tb> M1580 <SEP> 1/5 <SEP> 0/5
<tb> M1578 <SEP> 1/5 <SEP> 0/5
<tb> M1587 <SEP> 1/5 <SEP> 3/5
<tb> M1577 <SEP> 2/5 <SEP> 1/5
<tb> 
 Les positifs sont soulignés. 

 <Desc/Clms Page number 28> 

 



  TABLEAU 3 
 EMI28.1 
 
<tb> 
<tb> IVDA <SEP> Hémophile <SEP> Donneur <SEP> acrédité
<tb> JG2 <SEP> 6/9 <SEP> (66%) <SEP> 5/10 <SEP> (50%) <SEP> 0/10 <SEP> (0%)
<tb> JG3 <SEP> 2/9 <SEP> (22%) <SEP> 4/10 <SEP> (40%) <SEP> 0/10 <SEP> (0%)
<tb> JG2+JG3 <SEP> 1/9 <SEP> (11%) <SEP> 3/10 <SEP> (30%) <SEP> 0/10 <SEP> (0%)
<tb> JG2 <SEP> ou <SEP> JG3 <SEP> 7/9 <SEP> (77%) <SEP> 6/10 <SEP> (60%) <SEP> 0/10 <SEP> (0%)
<tb> 
 
Ces données sont compatibles avec l'hypothèse selon laquelle les deux résultats de la recombinaison expriment des polypeptides associés avec un agent responsable du PT-NANBH et que ces polypeptides ne sont pas identiques mais peuvent-partager certains sites antigéniques. 



  EXEMPLE 5. Cartographie de la restriction et mise en séquence de l'ADN de JG2 et JG3 
Une portion   (10gel)   des stocks de phages de JG2 et JG3 a été bouillie pour dénaturer les phages et exposer l'ADN. Cet ADN a alors été utilisé comme modèle dans une amplification PCR en utilisant la polymérase Taq ; chaque réaction contenait ce qui suit dans un volume final de   sol :     10mM     Tris-HCl,   50mM KCl, 1, 5mM MgC12, 0, 01% de gélatine, pH 8,3   à 25oC   plus des amorces oligonucléotides dl9   et D20   (SEQ   IDn"1   et 2 respectivement ; 200ng chacun) ; ces amorces sont situées dans les séquences lambda flanquant le site de 
 EMI28.2 
 clonage EcoRI et amorcent donc l'amplification de tout ce qui est cloné dans cette région.

   Une portion de la réaction a été analysée sur un gel agarose à 1% et comparée aux marqueurs. L'amplification de JG2 a produit un fragment d'environ   2Kb   ; JG3 un d'environ   1Kb.   Le reste du mélange de la réaction a été extrait avec du phénol/chloroforme en 

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 présence de   10mM   EDTA et de SDS à 1% et   l'ADN   récupéré par précipitation par l'éthanol. Le matériel amplifié a alors été digéré avec 20U d'EcoRI pendant 60 minutes à   370C   et séparé sur un gel agarose 1% LGT dans TAE. Les fragments ont diminué de taille comme prévu et ont été élués et purifiés au moyen d'Elutips (S & S). Les inserts JG2 et JG3 ont été ligaturés avec pUC13 digéré par EcoRI et transformés en brin TG1 E. coli.

   Les éléments résultant de la recombinaison ont été identifiés comme colonies blanches sur des plaques X-gal/L-Amp (plaques L-agar complétées par   100JLg/ml   d'ampicilline, 0,5 mg/ml X-gal) et ont été vérifiés par des préparations de plasmide à petite échelle et digestion d'enzymes réducteurs EcoRI pour déterminer la taille de l'insert ADN. Le plasmide résultant de la recombinaison contenant l'insert JG2 a été appelé DM415 et celui contenant   JG3,   DM416. La séquence de l'insert JG2 a été déterminée par mise en séquence bicaténaire de l'ADN plasmide et par sousclonage en vecteurs de mise en séquence M13 tels que mpl8 et mpl9 suivi d'une mise en séquence monobrin. La séquence de l'insert JG3 a été déterminée de la même manière.

   L'ADN en résultant et les séquences d'acides aminés qui en résultent sont indiqués dans SEQ ID   no 3   et 4. 



  EXEMPLE 6. Expression du polypeptide PT-NANB dans les E. coli 
 EMI29.1 
 Le plasmide pDM416 (5gag) a été digéré avec EcoRI (20U) dans un volume final de 20ill et l'insert 1Kb récupéré par élution dans un gel agarose   1%   LGT. Ce matériel a alors   été"poli"en   utilisant un fragment de Klenow et un mélange dNTP pour remplir les extrémités en surplomb de l'EcoRI. 



  L'ADN a été récupéré par précipitation à l'éthanol après extraction avec du phénol/chloroforme. Le fragment à bord émoussé a été ligaturé en pDEV107 clivé/phosphatasé SmaI (un vecteur qui permet le clonage à l'extrémité   3'de   lac Z) et ensuite transformé en cellules TG1 E. coli. Il y a eu une augmentation de l'ordre de 30 fois des colonies pendant un contrôle vecteur seul. Les transformants contenant le 

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 plasmide requis résultant de la recombinaison ont été identiés par hybridation au moyen d'une sonde radioactive produite par amplification PCR du produit de recombinaison JG3. Douze colonies ont été analysées par digestion avec des enzymes réducteurs   (Sali)   des mini-préparations de plasmide pour déterminer l'orientation de l'insert.

   Un quart de ces produits de recombinaison étaient correctement orientés pour exprimer la séquence PT-NANBH sous forme d'une fusion avec   ss-galactosidase.   L'un de ceux-ci (pDX113) a été pris pour continuer l'analyse. Une colonie de pDX113 a été utilisée pour inoculer 50 mls de bouillon de L, incubé à   370C   et agité jusqu'à la   phase "mid-log" et poussée   à s'exprimer par addition de   20mM IPTG.   Après 3 heures, les cellules ont été récoltées par centrifugation à 5.000g pendant 20 minutes, remises en suspension dans 50 mls PBS et repastillées.

   Les cellules pastillées ont été remises en suspension dans 5 mis de solution tampon (25mM   Tris-HCl, lmM   EDTA,   1mgjml   lysozyme, 0,2% (v/v) Nonidet-P40, pH8, 0) par gramme de pastille et incubées à   0 C   pendant 2 heures. L'ADN bactérien émis a été digéré par addition de DNase I et de MgS04 pour atteindre des concentrations finales de   40, u. g/ml   et 2mM respectivement pour réduire la viscosité. Ce lysat brut a été analysé par PAGE et le modèle des protéines coloré au bleu Coomassie. Une protéine d'environ 150kD a été induite dans pDX113 contenant des bactéries et on a estimé que cette protéine représentait 10-15% de la protéine totale.

   Des gels similaires ont été transférés à la membrane PVDF (GRI, Dunmow, Essex, Royaume-Uni) et les membranes incubées avec des sérums PT-NANBH positifs et négatifs ; la protéine 150kD a réagi avec les sérums A et L mais pas avec le sérum humain normal. Des traces de contrôle contenant du lysat des E. coli exprimant la   ss-galactosidase   n'ont pas réagi avec les sérums A, L ou avec le sérum humain normal. On a ajouté de l'urée au lysat brut pour avoir une concentration finale de 6M et le matériel insoluble a été récupéré par centrifugation. 



  L'extrait d'urée 6M a été utilisé pcur recouvrir directement les cupules de microtitrage pendant 1 heures à   37OC.   Les 

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 cupules ont été lavées trois fois avec de l'eau distillée double et ensuite bloquées par addition de 0, 25ml de BSA à   0/2%   par cupule contenant 0, 02% NaN3 pendant 20 minutes à   37OC.   La plaque a alors été aspirée. Des plaques de contrôle recouvertes d'un lysat brut d'un brin E. coli produisant de la B-galactosidase (pXY461) ont été produites de la même façon. Ces plaques ont été utilisées dans des analyses ELISA comme décrit à l'exemple 10. 



  EXEMPLE 7. Expression du polypeptide PT-NANBH dans des cellules d'insectes 
L'insert PT-NANBH de JG3, isolé comme décrit à l'Exemple 5, a été   cloné   en châssis avec les 34 premiers 
 EMI31.1 
 nucléotides de polyhédrine dans le vecteur pAc360 (Luckow et Summers, Biotechnology, 1988, 6, 47-55), en utilisant notre connaissance du cadre de lecture du gène lac Z dans le vecteur gtll. Des oligonucléotides ont été synthétisés qui ont été en mesure de s'hybrider en séquences gtll flanquant le site de clonage EcoRI et qui permettraient l'amplification de l'insert par PCR. Ces oligonucléotides comprenaient des sites de restriction BamHI convenablement placés pour permettre le clonage direct dans le site BamHI de pAc360, en plaçant le gène inséré en châssis avec les séquences terminales aminées de la polyhédrine.

   Une petite quantité de produit de recombinaison gtll JG3 a été bouillie pour exposer   l'ADN   et ensuite utilisée dans une amplification PCR contenant les amorces oligonucléotides   d75   et d76 (SEQ ID   nO 6   ry 7 ; 200 mg) et 0,5 U de polymérase Taq. Après amplification, la réaction a été extraite avec un volume égal de   phénol/chloroforme, précipitée   avec de l'éthanol et digérée avec 10 U de BamHI dans un volume final de   30gel.   Le fragment amplifié a été résolu dans un gel agarose à 1%, élué et ligaturé dans le pAc360 digéré avec le BamHI pour produire le construct de transfert pDX119.

   Le plasmide résultant de la recombinaison   (2g)   et   l'ADN   de type sauvage AcNPV   (lug)   ont été co-transfectés dans des 

 <Desc/Clms Page number 32> 

 cellules d'insectes par précipitation du phosphate de calcium. La virus négatif d'inclusion résultant de la recombinaison a été choisi par sélection visuelle. Après trois tours de purification de plaque, le virus résultant de la recombinaison (BHC-5) a foisonné et l'expression de la protéine résultant de la recombinaison dans les cellules d'insectes a été évaluée par SDS-PAGE, transfert Western et ELISA. Une protéine abondamment exprimée d'environ 70kD est produite dans les cellules contaminées. Cette protéine réagit avec les sérums PT-NANBH suivant transfert Western et ELISA.

   Un autre produit de recombinaison du bacillovirus (BHC-7) a été construit pour inclure des séquences JG2 en sus des séquences JG3 présentes en   BEC-5,   comme décrit à la figure 1. Les séquences   PT-NANBH   présentes dans JG2 ont été amplifiées et clonées dans le vecteur pAc360 comme dit ci-dessus pour produire pDX118 et les fragments appropriés de BamHI/Sal I de pDX119 et pDX118 ont été liés ensemble dans cet ordre dans pAc360 pour produire le construct de transfert   pDX122.   Les plasmides résultant de la recombinaison ont été identifés par hybridation et l'orientation de   l'ADN   inséré déterminée par analyse des enzymes réducteurs.

   Le virus résultant de la recombinaison a été produit comme décrit ci-dessus et la protéine exprimée analy-sée par   SDS-PAGE,   transfert Western et ELISA. Un polypeptide très abondant (40% du total de la protéine de la cellule) 95kDa réagissant avec les sérums   PT-NANBH   a été trouvé dans les cellules infectées. 



  EXEMPLE 8. Purification du   polype ? tide DXE113   
Le brin TGA E. coli contenant le plasmide pDX113 (appelé brin WDL001) a été incubé et induit dans un fermenteur de 1,5 litres (modèle   SET002,     SGI   Newhaven, East Sussex, Royaume-Uni) à   37. C pendant   5 heures. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 5.000g pendant 20 minutes et traitées comme suit. 

 <Desc/Clms Page number 33> 

 a) Extraction. 



  Les cellules humides sont remises en suspension (1 : 20,   p/v)   dans la solution tampon A (50mM Tris-HCl, 50mM NaCl, AmM EDTA, 5mM DTT, 10% (v/v) glycérol,   pH8,   0). Un lysozyme est ajouté à 5mg solide par ml de suspension et le mélange est laissé à   4 C.   Après 15 minutes, le mélange était soniqué cm amplitude crête à crête) sur de la glace pendant 3 minutes au total (poussées de 6 x 30 sec). De la DNase I a été ajoutée à raison de 4   jug   par ml de suspension et le mélange abandonné pendant 30 minutes. La suspension a été centrifugée pendant 20 minutes à 18.000g (max) et le surnageant écarté.

   La pastille a été remise en suspension dans la solution tampon B (25mM Hepes, 4mM urée, 5mM DTT, ph8, 0) dans un rapport de   1 : 6 (pjv)   pour obtenir une suspension fine. Celle-ci a été centrifugée à 18.000g (max) pendant 20 minutes et le surnageant écarté. 



   La pastille a été remise en suspension dans la solution tampon C (25mM Hepes, 8M urée, 2mM DTT, pH 8,0) dans un rapport de 1   : 6 (p/v) ;   avant la mise en suspension, on a ajouté : de la leupeptine   (1gjmil),   de la pepstatine   (lg/ml)   et E64   (lg/ml).   La suspension a été centrifugée à 18.000g (max) pendant 30 minutes et le surnageant décanté et conservé. La pastille a été remise en suspension dans 25 mM Hepes, SDS à 1% pH 8,0. b) Chromatographie. Le surganeant de la fraction de 8M d'urée a été dilué 1 : 5 (v/v) dans 25mM Hepes, SM urée, 2mM DTT, pH 8, 0 et fractionnée sur une colonne de 7 ml Q-Sépharose. Les protéines ont été éluées via un gradient de sel de 0-1M NaCl. La chromatographie et la manipulation des données ont été contrôlées par un FPLC (Pharmacia).

   Le DX113 élue à environ 500 mM NaCl et est virtuellement homogène suivant analyse SDS Page et transfert Western. 



  EXEMPLE 9. Purification du polypeptide BHC-5 
Des cellules Sf9 (2xlO9) ont été contaminées par 

 <Desc/Clms Page number 34> 

 un stock de virus BHC-5 résultant de la recombinaison (moi 5). Après incubation à   28*C   pendant 2 jours, les cellules ont été récoltées par centrifugation et ensuite traitées comme suit : a) Extraction. 



  La masse de cellules humides (1,2g) a été remise en 
 EMI34.1 
 suspension dans 6msl de solution tampon A (25mM Hepes, 5mM DTT, 1J-Lg/ml de leupeptine, 1J-Lg/ml de pepstatine, 1J-Lg/mo d'E64 pH 8, 0). Les cellules remises en suspension ont été placées sur de la glace et soniquées par 3 secousses de 15 secondes (amplitude crête à crête 6   jum)   séparées par des périodes de repos de 30 secondes. La suspension soniquée a été centrifugée à 18.000g (max) pendant 20 minutes et le surnageant écarté. La pastille a été remise en suspension dans la solution tampon A plus 4M d'urée (6mls) et centrifugée à 18.000g (max) pendant 20 minutes. Le surnageant a été écarté et la pastille ré-extraite avec la solution tampon A plus   8M   d'urée (6ml).

   Après centrifugation à 18. 000g (max) pendant 30 minutes, le surnageant a été retenu et dilué 1 : 6 dans la solution tampon plus 8M urée. Cet extrait a été chromatographié sur une colon-ne mono-Q équilibrée dans la même solution tampon. La colonne a été éluée au moyen d'un gradient de sel   (0-1M   NaCl) sur 12 volumes de colonne. Le   BHC-5   a élué à environ 0,45-0,   55M   NaCl et avait une pureté supérieure à 90% suivant l'estimation de SDS-PAGE. Le rendement était d'environ 70%. 



  EXEMPLE 10. Performance de DX113 et des polypeptides BHC-5 et-7 dans une ELISA 
Les plaques Microelisa (96 well, Nunc) ont été directement recouvertes de 50mm de solution tampon de bicarbonate   (50mM   bicarbonate de sodium et 50mM carbonate de sodium, titrés à un pH de 9,5) avec soit un lysat brut de BHC-5 de   6M   urée ou avec du pDX113 purifié. Les plaques ont été bloquées avec BSA à 0, 2% et ensuite incubées pendant 

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 30 minutes à   370C   avec des sérums dilués dans un rapport de 1 : 20 (bacille) ou 1 : 100 (E. coli).

   Après lavage dans une solution saline Tween (0,85% saline, 0, 05% Tween 20,0, 01% Bronidox), les plaques ont été incubées avec de   l'immuno-globuline   anti-humaine de chèvre en conjonction avec la péroxydase (1 : 2000) pendant 30 minutes à 37 C. Les plaques ont alors été lavées dans une solution saline Tween et colorées en ajoutant le substrat chromogénique TMB   (tétraméthyl-benzidine-HCl)     (100I/cupule)   et en incubant pendant 20 minutes à température ambiante. La réaction a été arrêtée avec 50   gl   d'acide sulphurique 2M et l'OD450 déterminée (Tableau 4). 

 <Desc/Clms Page number 36> 

 



   TABLEAU 4 Format ELISA IG anti-humainindirect pourla détection des anticorps NANB 
 EMI36.1 
 
<tb> 
<tb> Bacille. <SEP> coli
<tb> BHC-5 <SEP> (phase <SEP> DX113 <SEP> (phase
<tb> solide) <SEP> solide)
<tb> > 2 <SEP> 1,670
<tb> 1,855 <SEP> 1,531
<tb> 1,081 <SEP> 1,015
<tb> Sérums <SEP> de <SEP> patients <SEP> 1,842 <SEP> 1,558
<tb> à <SEP> haut <SEP> risque <SEP> posi-0, <SEP> 526 <SEP> 0,638
<tb> tifs <SEP> dans <SEP> l'essai <SEP> > 2 <SEP> 1,516
<tb> 1,823 <SEP> 1,602
<tb> 1,779 <SEP> 1,318
<tb> 1,122 <SEP> 0,616
<tb> 1,686 <SEP> 1,441
<tb> 0,259 <SEP> 0,205
<tb> 0, <SEP> 158 <SEP> 0,120
<tb> 0,298 <SEP> 0,209
<tb> Sérums <SEP> de <SEP> patients <SEP> 0, <SEP> 194 <SEP> 0,111
<tb> à <SEP> haut <SEP> risque <SEP> néga-0, <SEP> 282 <SEP> 0,181
<tb> tifs <SEP> dans <SEP> l'essai <SEP> 0,263 <SEP> 0,165
<tb> 0,184 <SEP> 0, <SEP> 163
<tb> 0,121 <SEP> 0, <SEP> 099
<tb> 0,

  243 <SEP> 0,104
<tb> Donneur <SEP> accrédité <SEP> 0,224 <SEP> 0,119
<tb> 
 
Les sérums de patients à haut risque d'infection PT-NANBH (IVDA's, hémophiles) ont été essayés comme décrit ; toutes les données sont exprimées sous forme de lectures OD450. Le donneur accrédité sert de contrôle négatif. Dans 

 <Desc/Clms Page number 37> 

 ce groupe particulier de sérums, 10/19 sont positifs dans les deux phases solides. En outre, le DX113 a été conjugé à une phosphatase alcaline au moyen d'une réduction   SATA/maléimide   et une analyse immunométrique a été réalisée. 



  Les sérums NANB positifs et négatifs connus ont été dilués comme indiqué dans le sérum du donneur accrédité et ajoutés à une phase solide recouverte de BHC-7. Soit simultanément ou après incubation (30 minutes à   37 C),   on a ajouté le conjugué DX113   (50gel, 1 :   2000). Après incubation à   37 C   pendant 30 minutes, les plaques ont été lavées avec une solution tampon de 50mM de bicarbonate et colorées au moyen d'un système d'amplification IQ Bio et l'OD 492 déterminé (Tableau 5). 



   TABLEAU 5 
ELISA immunométrique (polypeptide marqué) pour la détection d'anticorps NANB 
 EMI37.1 
 
<tb> 
<tb> Positifs <SEP> Négatifs <SEP> Donneur
<tb> dans <SEP> l'essai <SEP> dans <SEP> l'essai <SEP> acrédité
<tb> > 2 <SEP> 0,217 <SEP> 0,234
<tb> 0,821 <SEP> 0,252
<tb> > 2 <SEP> 0,214
<tb> 0,542 <SEP> 0,257
<tb> 0,876 <SEP> 0,308
<tb> 1,583 <SEP> 0,278
<tb> > 2 <SEP> 0,296
<tb> > 2 <SEP> 0, <SEP> 273
<tb> 1,830 <SEP> 0,262
<tb> > 2 <SEP> 0,251
<tb> 
 EXEMPLE 11. Formulation de vaccin
Une formulation de vaccin peut être préparée par 

 <Desc/Clms Page number 38> 

 des techniques conventionnelles au moyen des constituants suivants dans les quantités indiquées : Polypeptide viral PT-NANBH > 0, 36 mg Thiomersal 0,04-0, 2 mg Chlorure de sodium < 8,5 mg Eau 1 ml EXEMPLE 12.

   Production d'anticorps monoclonaux contre les   polvoeotides   PT-NANBH 
L'insert ADN du DM415 a été sous-clone dans le vecteur p36C de transfert du bacillovirus et le virus résultant de la recombinaison produit par une méthode essentiellement similaire à celle décrite à l'Exemple 7. Le virus résultant de la recombinaison a été appelé BHC-1 et présentait de très faibles niveaux de protéine spécifique à PT-NANBH. Des cellules Sf-9   (5x107   cellules/ml) contaminées avec BHC-1 ont été lysées dans du PBS contenant 1% (v/v) NP40 et centrifugées à 13000g pendant 2 minutes. 



  Le surnageant a été passé sur Extractigel-D (Pierce Chemicals) pour retirer le détergent et ensuite mélangé sous forme d'émulsion 1 : 1 avec un adjuvant complet de Freund. On a effectué une injection sous-cutanée de 0,   1ml   d'émulsion (équivalent à 5x106 cellules) à des souris. 14 et 28 jours suivant l'injection, on a fait aux souris une injection intrapéritonéale de 0, 1ml (équivalant à 5x106 cellules) d'un extrait exempt de détergent de cellules Sf-9 contaminées par BHC-7 ; le BHC-7 contient un insert ADN produit en ligaturant ensemble les régions de chevauchement de DM415 et DM416 (Exemple 7). Elles ont subi une ablation de la rate trois jours plus tard. Les cellules de rate ont été fondues avec des cellules de myélome NSo en présence de PEG1500 en utilisant des techniques type.

   Les cellules d'hybridome en résultant ont été choisies par croissance dans un milieu HAT (hypoxanthine, aminoptérine, thymidine). 10-14 jours après la fusion, le surnageant a été examiné de manière sélective 

 <Desc/Clms Page number 39> 

 par ELISA pour constater l'activité   anti-PT-NANBH.   Les cupules qui montraient une réactivité à la fois aux antigènes DX113 et BHC-7 (Exemple 10) ont été identifiées et les colonies individuelles ont été transférées dans d'autres cupules, incubées et re-testées. Les cupules présentant une réactivité spécifique à ce stade ont été re-clonés à une dilution limitée pour assurer la monoclonalité. 



  EXEMPLE 13. Détection de l'acidenucléique viral PT-NANBH chez des patients 
Sérums ; Les échantillons de 1400 donneurs enrôlés dans une étude prospective sur l'hépatite post-transfusionnelle ont été congelés   à -20OC.   Des échantillons avant transfusion et après transfusion sériels des 260 récipients ont été stockés de la même manière. Les échantillons d'après la transfusion ont été prélevés tous les quinze jours pendant 3 mois, une fois par mois pendant 6 mois et 6 mois plus tard, jusqu'à 18 mois. Les sérums gelés du donneur et du récipient relatifs à trois incidents de   PT-NANBH   survenus en 1981 étaient également disponibles pour étude.

   Le diagnostic de la PT-NANBH était basé sur une augmentation de la transférase de l'acide aminé alanine du sérum (ALT), dépassant 2,5 fois la limite supérieure à la normale dans au moins deux échantillons séparés après transfusion. D'autres virus hépatotropes ont été exclus par des essais sérologiques et les causes non virales de lésion hépatocellulaire ont été exclues par des études conventionnelles cliniques et en laboratoire. 



   Immuno-dosage : Des échantillons de sérum ont été testés rétrospectivement afin de détecter la présence d'anticorps contre l'HCV (antigène C100) au moyen du kit Ortho Diagnostics ELISA utilisé d'après les instructions du fabricant. Des sérums réactifs à plusieurs reprises ont été titrés jusqu'au point final dans un sérum humain négatif 

 <Desc/Clms Page number 40> 

 pour   l'anti-C100.   



   Détection des séquences virales PT-NANBH : L'ARN du sérum ou du plasma a été extrait, soumis à transcriptase inverse et amplifié comme dit ci-dessous. Les amorces oligonucléotides de la transcriptase inverse/PCR ont été dérivées de la séquence de nucléotide du clone JG2 isolé dans l'EXEMPLE 3, et synthétisées sur un synthétiseur Applied Biosystems 381A. Les séquences des quatre amorces oligonucléotides ont été les suivantes : 
 EMI40.1 
 
<tb> 
<tb> Désignation <SEP> SEO <SEP> ID <SEP> No <SEP> Dimension <SEP> du
<tb> produit
<tb> d94 <SEP> sens <SEP> 8
<tb> 829bp
<tb> d95 <SEP> anti-sens <SEP> 9
<tb> Nlsens <SEP> 10
<tb> 402bp
<tb> N2 <SEP> anti-sens <SEP> 11
<tb> 
 (i) Extraction ARN   5-50gel   de sérum (ou de plasma) ont été portés à 200 l en ajoutant de l'eau distillée stérile.

   L'échantillon de 200 l a été ajouté à un volume égal de solution tampon 2 x PK (2 x PK = 0. 2M   TrisCl,   pH 7,5, 25mM EDTA, 0,3M NaCl, 2% w/v SDS, protéinase K   200g/ml),   mélangé et incubé à   37 C   pendant 40 minutes. Les protéines ont été enlevées en extrayant deux fois avec du phénol/chloroforme et une fois avec du chloroforme seulement. On a ajouté 20 g de glycogène à la phase aqueuse et   l'ARN   a alors   été précipité   en ajoutant 3 volumes d'éthanol absolu glacé. Après stockage   à-70 C   pendant 1 heure,   l'ARN   a   é-cé   pastillé dans une centrifugeuse Eppendorf (15 minutes, 14000 t/min, 4 C).

   La pastille a été lavée une fois dans de l'éthanol à 95%, séchée sous vide et dissoute dans   lOjLtl   d'eau distillée stérile. Les solutions d'ARN ont été stockées à-70 C. 

 <Desc/Clms Page number 41> 

 



  (ii) Synthèse ADNcUn mélange de   10gel     contenant 2pu   de solution   d'ARN,   50ng   d'oligonucléotide synthétique   d95, 10mM   Hepes-HCl   pH 6,9 et 0, 2mM EDTA pH8, 0 a été préparé. Ce mélange de 10 l a été recouvert de 2 gouttes d'huile minérale, chauffé pendant 2 minutes dans un bain d'eau à   900C   et rapidement refroidi sur de la glace. La synthèse de l'ADNc s'est effectuée après ajustement de la réaction de manière à ce qu'elle contienne 50mM Tris-HCl pH7,5, 75mM 
 EMI41.1 
 KCl, 3mM MgC12, 10mM DTT, 0, 5mM de dATP, dCTP, dGTP et dTTP, 20 unités d'inhibiteur RNase (Pharmacia) et 15 unités de transcriptase inverse MLV   cloné   (Phar-macia) dans un volume final de 20 l.

   Le mélange de 20 l a été incubé à   37 C   pendant 90 minutes. Après synthèse, l'ADNc a été stocké à   - 20OC.   



  (iii)"Nested"PCRTout au long de cette étude, des résultats de PCR positifs erronés ont été évités en appliquant strictement les mesures de prévention de la contamination de Kwok et Higuchi (Nature, 1989, 339, 237-238). a) Tour I La réaction en chaîne de polymérase s'est effectuée dans un mélange de 50 l   contenant lOmM Tris-HCl   pH8,3, 50mM KC1, 1, 5mM   MgC12,   de la gélative à 0, 1% p/v, 1 unité de polymérase ADN Taq résultant de la recombinaison (Perkin Elmer Cetus),   200uM de dNTP, 30ng   de chaque amorce"externe" (d94 et d95 ; SEQ ID   n    8 et 9 respectivement) et   zu   de solution d'ADNc.

   Après une première dénaturation de 5 
 EMI41.2 
 minutes à 94 C, 35 cycles de 950C pendant 1, 2 minutes, 56 C pendant 1 minute, 72 C pendant 1 minute ont été effectués, suivis d'une extension finale de 7 minutes à 72 C (Techne   PHC-1   Automated Thermal   Cycler).   b) Tour 2 Le mélange réactionnel était comme décrit ci-dessus pour le Tour I, mais 125ng de chaque amorce"interne", Nl et N2 (SEQ ID   n    10 et 11 respectivement) ont été utilisés au lieu des 

 <Desc/Clms Page number 42> 

   amorces"externes"d94   et d95.

   Un petit échantillon   d'las   des produits PCR du Tour 1 a été transféré dans le mélange réactionnel de   50/1   du Tour 2.25 cycles de 95*C pendant 1, 2 minutes,   46'C   pendant 1 minute,   72"C   pendant 1 minute, ont été effectués, suivis d'une extension à   72 C   pendant 7 minutes. c) Analyse 20   1   des produits PCR du Tour 1 et du Tour 2 ont été analysés par électrophorèse sur un gel agarose à 2%. Des bandes ont été visualisées par coloration au bromure d'éthidium et photographiées à 302 nm. 



   Valeur de prédiction de la sérologie anti-C100 et PCR dans l'étude prospective : Six des 1400 donneurs (0, 43%) enrôlés dans l'étude prospective ont présenté des anticorps contre le C100 dans leur sérum. Parmi ces six donneurs aux anticorps positifs, un seulement (le donneur   D6)   s'est avéré être contaminé comme on a pu l'apprécier par le développement de la séroconversion PT-NANBH et HCV dans un récipient (récipient R6) cfr tableau 6 ci-dessous. 



   Les séquences virales ont été détectées par PCR dans le sérum du donneur D6 mais pas dans les sérums des cinq autres donneurs séropositifs. Le récipient R6 où s'est développé la pT-NANBH avait également reçu du sang de sept autres donneurs (D7 à D13). Les sérums de ces donneurs ont été testés et se sont avérés négatifs à la fois pour les anticorps et pour le PCR. 

 <Desc/Clms Page number 43> 

 



   TABLEAU 6 RESUME DES DONNEES DONNEUR/RECIPIENT :
ETUDE PROSPECTIVE 
 EMI43.1 
 
<tb> 
<tb> DONNEURS <SEP> RECIPIENTS
<tb> Donneur <SEP> anti-HCV <SEP> PCR <SEP> Récipient <SEP> PT-NANBH <SEP> Séroconversion
<tb> antiHCV
<tb> D1 <SEP> +-RI <SEP> Non <SEP> Non
<tb> D2 <SEP> +-R2 <SEP> Non <SEP> Non
<tb> D3 <SEP> +-R3 <SEP> Non <SEP> Non
<tb> D4 <SEP> +-R4 <SEP> Non <SEP> Non
<tb> D5 <SEP> +-R5 <SEP> Non <SEP> Non
<tb> D6 <SEP> + <SEP> +
<tb> D7
<tb> D8
<tb> D9--R6 <SEP> Oui* <SEP> Oui*
<tb> D10
<tb> D11 <SEP> - <SEP> D12
<tb> D13
<tb> 
 
 EMI43.2 
 * Période d'incubation 1 mois+ Séroconversion 5 mois après la transfusion EXEMPLE 14. Isolation et expression de séquences d'ADN PTNANBH supplémentaires. 



   Les bibliothèques lambda gtll préparées à l'Exemple 2 ont également été sélectionnées avec les sérums de patients à haut risque pour le PT-NANBH mais qui n'ont pas réagi aux antigènes viraux, DX113, BHC-5 et BHC-7, le raisonnement étant qu'ils pourraient bien contenir des anticorps qui reconnaissent différents antigènes. Les sérums PJ-5 (The Newcastle Royal Infirmary, New-castle), Birm-64 

 <Desc/Clms Page number 44> 

 (Queen Elizabeth Medical Centre, Birmingham), PG et Le (University College and Middlesex School of Medicine, Londres) satisfaisaient à ce critère et ont été utilisés pour sélectionner les bibliothèques suivant une procédure identique à celle décrite dans les Exemples 3 et 4. Une série d'éléments résultant de la recombinaison ont donc été identifiés, dont aucun ne s'est croisé avec des sondes de JG2 et JG3.

   L'un des produits de recombinaison, BR11, identifié par réaction avec PJ-5, a été choisi pour poursuivre l'analyse. 



   Le clone, BR11, contenait un insert d'environ 900bp qui a été amplifié par PCR au moyen des amorces d75 et d76 (SEQ ID   n    6 et 7) comme décrit à l'Exemple 7. La séquence amplifiée a été directement clonée dans le vecteur bacillovirus pAc360 pour former du   pDX128   contenant un cadre de lecture ouvert en phase avec les 11 premiers acides aminés de la polyhédrine. Les stocks de bacillovirus résultant de la recombinaison (appelés BHC-9) ont été produits suivant la procédure décrite à l'Exemple 7. Des cellules d'insectes ont été contaminées avec un virus résultant de la recombinaison purifié et un polypeptide d'environ 22kD a été obtenu dans des extraits de cellule marqués radioactivement.

   L'insert amplifié de   BR11   a également été clone dans le vecteur phage pUC13 et M13 pour mise en séquence ;   l'ADN   et les données de séquence des acides aminés sont présentés en SEQ ID no 5. L'insert contient 834 bp plus les linkers EcoRI ajoutés pendant le clonage. 



  EXEMPLE 15. Performance du polypeptide BHC-9 dans une ELISA 
Une ELISA a été établie au moyen de cupules de microtitrage revêtues d'un extrait de cellule infectée BHC9 et d'un système de détection de conjugué Ig anti-humain suivant la procédure décrite à l'Exemple 10. 



  Une panoplie de sérums à haut risque a été testée en 

 <Desc/Clms Page number 45> 

 parallèle avec BHC-7 et BHC-9 et a également été examinée par PCR au moyen de la méthode décrite à l'Exemple 13. Les résultats sont indiqués au Tableau 7 dans lequel les échantillons positifs sont soulignés. 



   TABLEAU 7 
 EMI45.1 
 
<tb> 
<tb> Numéro <SEP> PCR <SEP> BHC-7 <SEP> BHC-9
<tb> 1 <SEP> + <SEP> 2, <SEP> 09 <SEP> 2,0
<tb> 2 <SEP> + <SEP> 2,09 <SEP> 2,0
<tb> 3 <SEP> + <SEP> 1, <SEP> 89 <SEP> 1,37
<tb> 4 <SEP> + <SEP> 1,57 <SEP> 0,27
<tb> 5 <SEP> + <SEP> 1,26 <SEP> 2,00
<tb> 6 <SEP> + <SEP> 0,91 <SEP> 2, <SEP> 0
<tb> 7-0, <SEP> 90 <SEP> 0,51
<tb> 8 <SEP> + <SEP> 0,84 <SEP> 1,19
<tb> 9-0, <SEP> 53 <SEP> 0,43
<tb> 10-0, <SEP> 45 <SEP> 2,0
<tb> 11 <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP> 1, <SEP> 07
<tb> 12-0, <SEP> 32 <SEP> 2,00
<tb> 13-0, <SEP> 23 <SEP> 0,30
<tb> 14-0, <SEP> 15 <SEP> 0,43
<tb> 15 <SEP> + <SEP> 0,16 <SEP> 0,76
<tb> 16-0, <SEP> 09 <SEP> 1,74
<tb> 17-0, <SEP> 27 <SEP> 2,00
<tb> 18-0, <SEP> 15 <SEP> 2, <SEP> 00
<tb> 19-0, <SEP> 12 <SEP> 2,00
<tb> 20-0, <SEP> 08 <SEP> 0,05
<tb> coupure <SEP> 0,27 <SEP> 0,29
<tb> 
 
De ces 20 échantillons,

   50% sont manifestement positifs avec le BHC-7 alors que 85% sont positifs avec le BHC-9. Deux échantillons (11 & 12) qui sont à la limite du positif avec le BHC-7 sont clairement positifs avec le BHC-9 et certains échantillons qui sont au niveau de la coupure ou en-dessous avec le BHC-7 sont positifs avec le BHC-9. De 

 <Desc/Clms Page number 46> 

 plus, deux échantillons   (11   & 15) qui étaient à la limite ou négatifs avec le BHC-7 mais positifs avec le BHC-9 sont PCR positifs. Dans l'ensemble il n'y a que deux échantillons (13 & 20) qui sont négatifs avec les deux polypeptides et le PCR. 



  EXEMPLE 16. Isolation des séquence d'ADN   Put-NANBH   chevauchement des clones existants 
La sélection immunologique des bibliothèques d'expression ADNc décrites aux Exemples 3,4 et 14 ne peut identifier que les clones qui contiennent une région immuno-réactive du virus. Une autre approche de la production de clones spécifiques à la PT-NANBH est d'utiliser le PCR pour amplifier les molécules d'ADNc qui chevauchent les clones existants. Des jeux d'amorces peuvent être préparés lorsqu'un membre de la paire se trouve dans des séquences clonées existantes et l'autre en-dehors ; cette approche peut être étendue aux paires   d'amorces "nichées"   également. 



   L'ADNc préparé comme à l'Exemple   la été   amplifié par PCR, avec des paires d'amorces simples   ou "nichées",   au moyen des conditions de réaction décrites à l'Exemple 13. 



  L'approche est illustrée par l'utilisation des paires d'amorces suivantes : dl64 (SEA ID   n    : 12) et dl37 (SEQ ID n  16) ; dl36 (SEQ ID   n    : 14) et dl55 (SEQ ID nO : 15) ; dl56 (SEQ ID ne 16) et d92 (SEQ ne 17). Un membre de chaque paire est conçu pour amorcer dans les séquences clonées existantes (dl37 et dl36 amorcent respectivement dans les extrémités   5'e   3) de BR11, d92 amorce l'extrémité   5'de   JG3). Les autres amorces sont basées sur des séquences disponibles pour d'au-tres agents PT-NANBH. L'amorce dl64 correspond aux bases 10 à 31 de la figure 2 dans Okamoto et al, Japan, J. EXD. Med., 1990,   6^H¯0^H¯,   167-177).

   Les amorces   dol55   et dl56 correspondent aux positions 462 à 489 et 3315 à 3337 respectivement de la figure 47 de la de-mande de brevet 

 <Desc/Clms Page number 47> 

 européen 88310922.5. Une ou plusieurs substitutions de nucléotides peuvent se faire pour introduire un site de reconnaissance EcoRI près de l'extrémité   5'des   amorces, sauf pour dl64 où un site de reconnaissance Bgl2 a été introduit ; ces changements facilitent le clonage ultérieur du produit amplifié. Les produits PCR ont été digérés par l'enzyme/les enzymes réducteur (s) approprié (s), décomposés par électrophorèse sur gel agarose et des bandes de la dimension attendue ont été excisées et clonées en vecteurs plasmides et bactériophages tels que décrits à l'Exemple 5. 



  Les séquences des ADN amplifiés 164/137 (SEQ ID n"18), 136/155 (SEQ ID   nO 19)   et 156/92 (SEQ ID n  20) sont présentées dans la liste des séquences. Ces nouvelles séquences étendent la couverture du génome PT-NANBH au-delà de celle obtenue par immunosélection (SEQ ID n* 3,4 & 5). Ces séquences, ainsi que d'autres qui se trouvent dans les. régions déjà décrites, peuvent être combinées en une séquence continue à l'extrémité 5' (SEQ ID   n    21) et à l'extrémité 3' (SEQ ID   n    22) du génome PT-NANBH. 



  EXEMPLE 17. Fusion de différents antigènes PT-NANBH en un seul polypeptide résultant de la récombination 
Les données présentés au Tableau 7 indiquent qu'alors qu'on détecte plus d'échantillons de sérum anticorps positifs en utilisant BHC-9 comme antigène cible (17/20) plutôt que BHC-7 (10/20), il y a certains échantillons (par ex., &num;4) qui ne sont positifs qu'avec BHC-7. Cette image est confirmée par la poursuite des essais. De même, un construct de fusion a été induit au moyen de la séquence à partir de BHC-7 et   BHC-9.   



   Les séquences de BHC-7 et BHC-9 peuvent être combinées de toute une série de manières : chaque séquence peut être positionnée au terminal de l'acide aminé de la fusion résultante et la nature de la séquence de liaison peut également varier. La figure 2 illustre deux manières 

 <Desc/Clms Page number 48> 

 possibles de combiner ces séquences. 



   Les fragments de restriction appropriés portant des sites d'enzymes réducteurs appropriés et des séquences de linker ont été générés soit par PCR au moyen d'amorces spécifiques   cu   par digestion des plasmides existants par les enzymes de digestion. Le vecteur de transfert DW143 consiste en un fragment BamHl/Pstl de DX122 (figure 1 ; le site Pst est à la position 1504 JG2, SEQ ID nO 3) lié à l'extrémité   5'de l'ensemble   de la région de programmation de BR11 (SEQ ID   n    7) qui a été amplifiée en tant que fragment de Pstl/BamHl utilisant des amorces d24 (SEQ ID   n    23) et dl26 (SEQ ID   n    24) ; la région de liaison consiste en six acides aminés dérivés de l'amorce dl26 et en séquences lambda bactériophages résiduelles.

   Le vecteur de transfert DX136 
 EMI48.1 
 diffère de DX143 en ce que le fragment BR11 a été généré au moyen de d24 (SEQ ID n  23) et dl32 (SEQ ID nO 25) et ainsi la région de liaison contient cinq lysines. Ces vecteurs de transfert ont été utilisés pour co-transfecter des cellules Sf-9 d'insectes en culture avec l'ADN AcNPV et des stocks purifiés de plaques de bacillovirus résultant de la recombinaison ont été produits comme décrit à l'Exemple 7. 



  BHC-10 a été produit comme résultat de la transfection avec DX143 ;   BHC-11   comme résultat de la transfection avec DX136. 



  Les polypeptides résultant de la recombinaison exprimés par ces deux virus ont été analysés par SDS-PAGE et transfert Western. Le   BHC-10   a produit un polypeptide avec un poids moléculaire apparent de 118kDa. Le BHC-11 a produit un polypeptide avec un poids moléculaire apparent de 96kDa. Les deux polypeptides ont réagi avec des sérums connus pour réagir dans ELISA uniquement avec BHC-7 (par ex., sérum A) ou uniquement avec BHC-9 (sérum B64, exemple 14). Les deux polypeptides ne diffèrent que dans la séquence de liaison et ceci peut affecter soit leur mobilité sur SDS-PAGE ou la manière dont ils sont traités dans les cellules infectées. 

 <Desc/Clms Page number 49> 

 



  EXEMPLE 18. Performance des antigènes de fusion PT-NANBH dans une ELISA 
Une ELISA a été établie au moyen de cupules de microtitrage recouvertes d'extraits de cellule infectées au BHC-9 et d'un conjugué Ig anti-humain suivant la procédure décrite à l'Exemple 10. Le tableau 8 présente les données à partir d'une comparaison des deux fusions avec les autres antigènes PT-NANBH résultant de la recombinaison BHC-7 et BHC-9 ainsi que la protéine résultant de la recombinaison HCV, C-100-3 (Ortho Dia-gnostic Systems, Raritan, New Jersey). Les sérums sont groupés par modèle de réaction avec BHC-7, BHC-9 et C-100-3.

   Les sérums du Groupe I réagissent violemment avec les trois antigènes ; le Groupe II réagit violem-ment avec BHC-7 uniquement ; le Groupe III réagit violemment avec BHC-9 uniquement-et le Groupe IV réagit violemment avec seulement deux des trois antigènes. 

 <Desc/Clms Page number 50> 

 
 EMI50.1 
 TABLEAU 8 
 EMI50.2 
 
<tb> 
<tb> SERUM <SEP> BHC-7 <SEP> BHC-9 <SEP> C-100-3 <SEP> BHC-10 <SEP> BHC-11
<tb> Groupe <SEP> 1
<tb> AH <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0
<tb> AC <SEP> > 2, <SEP> 0 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0
<tb> 57 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0
<tb> 77 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0
<tb> 84 <SEP> 1,4 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2, <SEP> 0 <SEP> > 2,0
<tb> Groupe <SEP> II
<tb> 805-6 <SEP> > 2,0 <SEP> 0,261 <SEP> 0,1 <SEP> 1,78 <SEP> +*
<tb> 805-17 <SEP> > 2,

  0 <SEP> 0,181 <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> 1, <SEP> 37 <SEP> +*
<tb> 805-149 <SEP> > 2,0 <SEP> 0,651 <SEP> 0,084 <SEP> 1,57 <SEP> ++*
<tb> Groupe <SEP> III
<tb> JS <SEP> 0,32 <SEP> > 2,0 <SEP> 0,17 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2, <SEP> 0
<tb> 805-57 <SEP> 0,069 <SEP> 1,403 <SEP> 0,25 <SEP> 1,9 <SEP> +*
<tb> 805-82 <SEP> 0,116 <SEP> 1,272 <SEP> 0,4 <SEP> 1,85 <SEP> ++*
<tb> 805-94 <SEP> 0,353 <SEP> 1,675 <SEP> 0,2 <SEP> > 2,0 <SEP> +*
<tb> PJ1 <SEP> 0,27 <SEP> > 2,0 <SEP> 0,2 <SEP> > 2,0 <SEP> 1,85
<tb> GroupeIV
<tb> A <SEP> > 2,0 <SEP> 0,14 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0
<tb> KT <SEP> 1,57 <SEP> 0,27 <SEP> > 2,0 <SEP> > , <SEP> 20 <SEP> > 2,0
<tb> Le <SEP> 0,152 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0 <SEP> > , <SEP> 20 <SEP> > 2,0
<tb> PJ5 <SEP> 0,123 <SEP> > 2,0 <SEP> > 2,0 <SEP> > , <SEP> 20 <SEP> > 2,0
<tb> 303-923 <SEP> > 2,0 <SEP> 0,9 <SEP> 0,37 <SEP> 1,9 <SEP> +*
<tb> 303-939 <SEP> > 2,0 <SEP> 1,

  55 <SEP> 0,268 <SEP> 2,0 <SEP> +*
<tb> 
 * Ces échantillons n'ont été testés que par transfert Western sur   BHC-11.   



   Ces données montrent qu'à la fois BHC-1C et BHC-11 ont une réactivité similaire avec ces sérums et, ce qui est plus important, que les deux activités antigéniques semblent avoir été retenues par les fusions. Tous les sérums 

 <Desc/Clms Page number 51> 

 des Groupes II & III qui ne réagissent respectivement qu'avec BHC-7 ou BHC-9, donnent une réaction claire avec les fusions. En outre il semblerait qu'avoir les deux antigènes ensemble donne un essai plus sensible. Par exemple, l'échantillon KT donne des OD de 1,57 et 0,27 avec BHC-7 et BHC-9 respectivement, alors qu'avec les fusions, l'OD est > 2,0. 

 <Desc/Clms Page number 52> 

 



  SEQ   ID N' :   1 TYPE SEQUENCE : Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE : 21 BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : bactériophage lambda gtll SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide ; oligo dl9 CARACTERISTIQUES : de 1 à 21 bases homologues à la partie amont du gène   lacZ   flanquant le site   EcoRl   dans le bactériophage lambda gtll PROPRIETES : amorce la synthèse de   l'ADN   à partir du vecteur phage dans l'ADNc inséré au site   d'EcoRl.   



  GGTGGCGACG ACTCCTGGAG C 21 SEQ ID N' : 2 TYPE SEQUENCE : Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE : 21 BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLCGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN   synthetique   ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : bactériophage lambda gtll SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide ; oligo d20 CARACTERISTIQUES : 

 <Desc/Clms Page number 53> 

 de 1 à 21 bases homologues à la partie amont du gène lacZ flanquant le site   EcoRl   dans le bactériophage lambda gtll PROPRIETES   :   amorce la synthèse de l'ADN à partir du vecteur phage dans l'ADNc inséré au site   d'EcoRI.   



  TTGACACCAG ACCAACTGGT A 21 SEQ ID   N' :   3 TYPE SEQUENCE : Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR SEQUENCE : 1770 PAIRES DE BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE   :   linéaire TYPE MOLECULE : ADNc à ARN génomique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain ; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : clone JG2 de bibliothèque ADNc dans lambda gtll CARACTERISTIQUES : de 1 à 1770 bp portion de la polyprotéine PT-NANBH PROPRIETES :

   encode probablement protéines virales non structurelles CAA AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC AAC CTC CTG TGG 48 Gln Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp
5 10 15 CGG CAT GAG ATG GGC GGG GAC ATT ACC CGC GTG GAG TCA GAG AAC AAG 96 Arg His Glu Met Gly Gly Asp Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys
20 25 30 

 <Desc/Clms Page number 54> 

 GTA GTA ATC CTG GAC TCT TTC GAC CCG CTC CGA GCG GAG GAG GAT GAG 144 Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala Glu Glu Asp Glu
35 40 45 CGG GAA GTG TCC GTC CCG GCG GAG ATC CTG CGG AAA TCC AAG AAA TTC 192 Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe   50   55 60 CCA CCA GCG ATG CCC GCA TGG GCA CGC CCG GAT TAC AAC CCT CCG CTG 240 Pro Pro Ala Met Pro Ala Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu
65 70 75 80 CTG GAG TCC TGG AAG GCC CCG GAC TAC GTC CCT CCA GTG GTA CAT GGG 288 Leu Glu 

  Ser Trp Lys Ala Pro Asp Tyr Val Pro Pro Val Val His Gly
85 90 95 TGC CCA CTG CCA CCT ACT AAG ACC CCT CCT ATA CCA CCT CCA CGG AGA 336 Cys Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg
100 105 110 AAG AGG ACA GTT GTT CTG ACA GAA TCC ACC GTG TCT TCT GCC CTG GCG 384 Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Val Ser Ser Ala Leu Ala
115 120 125 GAG CTT GCC ACA AAG GCT TTT GGT AGC TCC GGA CCG TCG GCC GTC GAC 432 Glu Leu Ala Thr Lys Ala Phe Gly Ser Ser Gly Pro Ser Ala Val Asp
130 135 140 AGC GGC ACG GCA ACC GCC CCT CCT GAC CAA TCC TCC GAC GAC GGC GGA 480 Ser Gly Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp Gln Ser Ser Asp Asp Gly Gly 145 150 155 160 GCA GGA TCT GAC GTT GAG TCG TAT TCC TCC ATG CCC CCC CTT GAG GGG 528 Ala Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly
165 170 175 GAG CCG GGG GAC CCC GAT CTC AGC GAC GGG TCT TGG TCT ACC GTG AGT 576 

 <Desc/Clms Page number 55> 

 Glu 

  Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser
180 185 190 GAG GAG GCC GGT GAG GAC GTC GTC TGC TGC TCG ATG TCC TAC ACA TGG 624 Glu Glu Ala Gly Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp
195 200 205 ACA GGC GCT CTG ATC ACG CCA TGC GCT GCG GAG GAA AGC AAG CTG CCC 672 Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu Ser Lys Leu Pro
210 215 220 ATC AAC GCG TTG AGC AAC TCT TTG CTG CGT CAC CAC AAC ATG GTC TAC 720 Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His Asn Met Val Tyr 225 230 235 240 
 EMI55.1 
 GCT ACC ACA TCC CGC AGC GCA AGC CAG CGG CAG AAG AAG GTC ACC TTT 768 Ala Thr Thr   Sar   Arg Ser Ala Ser GIn Arg Gln Lys Lys Val Thr Phe
245 250 255 GAC AGA CTG CAA ATC CTG GAC GAT CAC TAC CAG GAC GTG CTC AAG GAG 816 
 EMI55.2 
 Asp Arg Leu Gln Ile Leu Asp Asp His Tyr Gln Asp Val Leu Lys Glu 
260 265 270 ATG AAG GCG AAG GCG TCC ACA GTT AAG GCT AAG CTT CTA 

  TCA GTA GAG 864 Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala Lys Leu Leu Ser Val Glu
275 280 285 GAA GCC TGC AAG CTG ACG CCC CCA CAT TCG GCC AAA TCT AAA TTT GGC 912 Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly
290 295 300 
 EMI55.3 
 TAT GGG GCA AAG GAC GTC CGG AAC CTA TCC AGC AAG GCC ATT AAC CAC 960 Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser Ser Lys Ala Ile Asn His 305 310 315 320 ATC CGC TCC GTG TGG GAG GAC TTG TTG GAA GAC ACT GAA ACA CCA ATT 1008 Ile Arg Ser Val Trp Glu Asp Leu Leu Glu Asp Thr Glu Thr Pro Ile 

 <Desc/Clms Page number 56> 

 
325 330 335 GAC ACC ACC ATC ATG GCA AAA AAT GAG GTT TTC TGC GTC CAA CCA GAG 1056 Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys Val   Gln   Pro Glu
340 345 350 AGA GGA GGC CGC AAG CCA GCT CGC CTT ATC GTG TTC CCA GAC TTG GGG 1104 Arg Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe Pro Asp Leu Gly
355 360 365 GTC CGT 

  GTG TGC GAG AAA ATG GCC CTC TAT GAC GTG GTC TCC ACC CTC 1152 Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Val Val Ser Thr Leu
370 375 380 CCT CAG GCT GTG ATG GGC TCC TCG TAC GGA TTC CAG TAT TCT CCT GGA 1200 Pro   Gln   Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Gln Tyr Ser Pro Gly 385 390 395 400 CAG CGG GTC GAG TTC CTG GTG AAC GCC TGG AAA TCA AAG AAG ACC CCT 1248   Gln   Arg Val Glu Phe Leu Val Asn Ala Trp Lys Ser Lys Lys Thr Pro
405 410 415 ATG GGC TTT GCA TAT GAC ACC CGC TGT TTT GAC TCA ACA GTC ACT GAG 1296 Met Gly Phe Ala Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu
420 425 430 AAT GAC ATC CGT GTA GAG GAG TCA ATT TAT CAA TGT TGT GAC TTG GCC 1344 Asn Asp Ile Arg Val Glu Glu Ser Ile Tyr Gln Cys Cys Asp Leu Ala
435 440 445 CCC GAA GCC AGA CAG GCC ATA AGG TCG CTC ACA GAG CGG CTT TAT ATC 1392 Pro Glu Ala Arg Gln Ala Ile Arg Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr 

  Ile 
 EMI56.1 
 450 455 460 GGG GGT CCC CTG ACT AAT TCA AAA GGG CAG AAC TGC GGC TAT CGC CGG 1440 Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gln Asn Cys Gly Tyr Arg Arg 465 470 475 480 

 <Desc/Clms Page number 57> 

 TGC CGC GCG AGC GGC GTG CTG ACG ACT AGC TGC GGT AAT ACC CTC ACA 1488 Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr
485 490 495 TGT TAC TTG AAG GCC TCT GCA GCC TGT CGA GCT GCA AAG CTC CAG GAC 1536 Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg Ala Ala Lys Leu   Gln   Asp
500 505 510 TGC ACG ATG CTC GTG TGC GGA GAC GGC CTT GTC GTT ATC TGT GAG AGC 1584 Cys Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val Ile Cys Glu Ser
515 520 525 GCG GGA ACC CAG GAG GAC GCG GCG AGC CTA CGA GTC TTC ACG GAG GCT 1632 Ala Gly Thr Gin Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Val Phe Thr Glu Ala
530 535 540 ATG ACT AGG TAC TCT GCC CCC CCC GGG GAC CCG CCC CAA CCA GAA TAC 1680 Met Thr Arg 

  Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro   Gln   Pro Glu Tyr 545 550 555 560 GAC CTG GAG TTG ATA ACA TCA TGC TCC TCC AAT GTG TCG GTC GCG CAC 1728 Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val Ala His
565 570 575 GAT GCA TCT GGC AAA AGG GTA TAC TAC CTC ACC CGT GAC CCG 1770 Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro
580 585 590 SEQ ID   N';   4 TYPE SEQUENCE : Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR SEQUENCE : 1035 PAIRES DE BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE ;

   ADNc à ARN génomique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain ; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle 

 <Desc/Clms Page number 58> 

 SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : clone JG3 de bibliothèque ADNc dans lambda gtll CARACTERISTIQUES : de 1 à 1035 bp portion de la polyprotéine PT-NANBH PROPRIETES :

   encode probablement   proteines   virales non structurelles ACA GAA GTG GAT GGG GTG CGG CTG CAC AGG TAC GCT CCG GCG TGC AAA 48 Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr Ala Pro Ala Cys Lys
5 10 15 CCT CTC CTA CGG GAG GAG GTC ACA TTC CAG GTC GGG CTC AAC CAA TAC 96 Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr Phe   Gln   Val Gly Leu Asn Gln Tyr
20 25 30 CTG GTT GGG TCG CAG CTC CCA TGC GAG CCC GAA CCG GAT GTA GCA GTG 144 Leu Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro Asp Val Ala Val
35 40 45 CTC ACT TCC ATG CTC ACC GAC CCC TCC CAC ATC ACA GCA GAG ACG GCT 192 Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Thr Ala
50 55 60 AAG CG-C AGG CTG GCC AGG GGG TCT CCC CCC TCC TTG GCC AGC TCT TCA 240 Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser Ser
65 70 75 80 GCT AGC CAG TTG TCT GGC CCT TCC TCG AAG GCG ACA TAC ATT ACC CAA 288 Ala Ser 

    Gln   Leu Ser Gly Pro Ser Ser Lys Ala Thr Tyr Ile Thr   Gln  
85 90 95 AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC AAC CTC CTG TGG CGG 336 Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg
100 105 110 

 <Desc/Clms Page number 59> 

 CAT GAG ATG GGC GGG GAC ATT ACC CGC GTG GAG TCA GAG AAC AAG GTA 384 His Glu Met Gly Gly Asp Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val
115 120 125 GTA ATC CTG GAC TCT TTC GAC CCG CTC CGA GCG GAG GAG GAT GAG CGG 432 Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala Glu Glu Asp Glu Arg
130 135 140 GAA GTG TCC GTC CCG GCG GAG ATC CTG CGG AAA TCC AAG AAA TTC CCA 480 Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe Pro 145 150 155 160 CCA GCG ATG CCC GCA TGG GCA CGC CCG GAT TAC AAC CCT CCG CTG CTG 528 Pro Ala Met Pro Ala Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Leu
165 170 175 GAG TCC TGG AAG GCC CCG GAC 

  TAC GTC CCT CCA GTG GTA CAT GGG TGC 576 Glu Ser Trp Lys Ala Pro Asp Tyr Val Pro Pro Val Val His Gly Cys
180 185 190 CCA CTG CCA CCT ACT AAG ACC CCT CCT ATA CCA CCT CCA CGG AGA AAG 624 Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg Lys
195 200 205 AGG ACA GTT GTT CTG ACA GAA TCC ACC GTG TCT TCT GCC CTG GCG GAG 672 Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Val Ser Ser Ala Leu Ala Glu
210 215 220 CTT GCC ACA AAG GCT TTT GGT AGC TCC GGA CCG TCG GCC GTC GAC AGC 720 Leu Ala Thr Lys Ala Phe Gly Ser Ser Gly Pro Ser Ala Val Asp Ser 225 230 235 240 GGC ACG GCA ACC GCC CCT CCT GAC CAA TCC TCC GAC GAC GGC GGA GCA 768 Gly Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp Gln Ser Ser Asp Asp Gly Gly Ala   245 250   255 GGA TCT GAC GTT GAG TCG TAT TCC TCC ATG CCC CCC CTT GAG GGG GAG 816 

 <Desc/Clms Page number 60> 

 Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu
260 265 270 

  CCG GGG GAC CCC GAT CTC AGC GAC GGG TCT TGG TCT ACC GTG AGT GAG 864 Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser Glu
275 280 285 GAG GCC GGT GAG GAC GTC GTC TGC TGC TCG ATG TCC TAC ACA TGG ACA 912 Glu Ala Gly Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr
290 295 300 GGC GCT CTG ATC ACG CCA TGC GCT GCG GAG GAA AGC AAG CTG CCC ATC 960 Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu Ser Lys Leu Pro Ile 305 310 315 320 AAC GCG TTG AGC AAC TCT TTG CTG CGT CAC CAC AAC ATG GTC TAC GCT 1008 Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His Asn Met Val Tyr Ala
325 330 335 ACC ACA TCC CGC AGC GCA AGC CAG CGG 1035 Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Gln Arg
340 345 SEQ ID N' : 5 TYPE SEQUENCE : Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR SEQUENCE : 834 PAIRES DE BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE :

   ADNc à ARN génomique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain ; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : clone BRU de bibliothèque ADNc dans lambda gtll CARACTERISTIQUES : 

 <Desc/Clms Page number 61> 

 de 1 à 834 bp portion de la polyprotéine PT-NANBH PROPRIETES :

   encode probablement protéines virales structurelles AGA AAA ACC AAA CGT AAC ACC AAC CTC CGC CCA CAG GAC GTC AGG TTC 48 Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Leu Arg Pro Gln Asp Val Arg Phe
5 10 15 CCG GGC GGT GGT CAG ATC GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG 96 Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg
20 25 30 GGC CCC AGG TTG GGT GTG CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG 144 Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser
35 40 45 CAA CCT CGT GGA AGG CGA CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CAG CCC GAG 192 Gln Pro Arg Gly Arg Arg   Gln   Pro Ile Pro Lys Ala Arg   Gln   Pro Glu
50 55 60 GGC AGG GCC TGG GCT CAG CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAC 240 Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn
65 70 75 80 GAG GGC ATG GGG TGG GCA GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGT GGC TCC CGG 288 Glu Gly Met Gly Trp Ala 

  Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg
85 90 95 CCT AGT TGG GGC CCC ACT GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT 336 Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly
100 105 110 AAA GTC ATC GAT ACC CTC ACA TGC GGC TTC GCC GAC TCT CAT GGG GTA 384 Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Ser His Gly Val
115 120 125 

 <Desc/Clms Page number 62> 

 CAT TCC GCT CGT CGG CGC TCC CTT AGG GGC GCT GCC AGG GCC CTG GCG   432   His Ser Ala Arg Arg Arg Ser Leu Arg Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala
130 135 140 CAT GGC GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT 480 His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn 145 150 155 160 TTA CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTG CTG TCC TGT 528 Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys
165 170 175 TTG ACC ATT CCA GCT TCC GCT TAT GAA GTG CGC AAC GTG TCC GGG ATC 

  576 Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile
180 185 190 TAC CAT GTC ACG AAC GAT TGC TCC AAC TCA AGC ATC GTG TAC GAG ACA 624 Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Thr
195 200 205 GCG GAC ATG ATC ATG CAC ACC CCC GGG TGT GTG CCC TGT GTC CGG GAG 672 Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu
210 215 220 GGT AAT TCC TCC CGC TGC TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC 720 Gly Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala 225 230 235 240 AAG GAC GCC AGC ATC CCC ACT GCG ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG 768 Lys Asp Ala Ser Ile Pro Thr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu
245 250 255 CTC GTT GGG GCG GCT GCC TTC TCG TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC 816 Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Ser Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu
260 265 270 TGC GGA TCT GTT TTC CCG   8 :

   4   

 <Desc/Clms Page number 63> 

 Cys Gly Ser Val Phe Pro
275   SEQIDN'   : 6 TYPE SEQUENCE : Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE : 31 BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : bactériophage lambda gtll SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide ; oligo d75 CARACTERISTIQUES : de 4 à 9 bases site BamHl de 10 à 31 bases homologues à la portion amont du gène   lacZ   flanquant le site EcoRl dans le bactériophage lambda gtll de 26 à 31 bases site   EcoRl   PROPRIETES : amorce la synthèse à partir du vecteur phage dans l'ADNc inséré au site   d'EcoRl   et introduit un site BamHl approprié pour le clonage ultérieur en vecteurs d'expression. 



    TAAGGATCCC   CCGTCAGTAT CGGCGGAATT C 31 SEQ ID   N'   : 7 TYPE SEQUENCE : Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE : 30 BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique 

 <Desc/Clms Page number 64> 

 ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : bactériophage lambda gtll SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide ; oligo d76 CARACTERISTIQUES : de 4 à 9 bases site BamHl de 10 à 30 bases homologues à la portion aval du gène   lacz   flanquant le site EcoRi dans le bactériophage lambda gtll PROPRIETES : amorce la synthèse de 1'ADN à partir du vecteur phage dans   l'ADNc   inséré au site d'EcoRI et introduit un site BamHl approprié pour le clonage ultérieur en vecteurs d'expression. 



  TATGGATCCG TAGCGACCGG CGCTCAGCTG 30 SEQ ID   N* : 8   TYPE SEQUENCE : Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE : 19 BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain ; sérum infecté par hépatite non-A,   non-B   post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide ; oligo d94 CARACTERISTIQUES : de 1 à 19 bases homologues aux bases 914 à 932 du brin de sens de JG2 (SEQ ID   n'3)   PROPRIETES : amorce la synthèse de   l'ADN   sur le brin négatif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH. 

 <Desc/Clms Page number 65> 

 
 EMI65.1 
 



  ATGGGGCAAA GGACGTCCG 19 SEQ IDN' : 9 TYPE SEQUENCE : Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE : 24 BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE ; linéaire TYPE MOLECULE ; ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain ; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide ; oligo d95 CARACTERISTIQUES : de 1 à 24 bases homologues aux bases 1620 à 1643 du brin anti-sens de JG2 (SEQ ID n'3) PROPRIETES : amorce la synthèse de l'ADN sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH. 



  TACCTAGTCA TAGCCTCCGT GAAG 24 SEQ ID N* : 10 TYPE SEQUENCE : Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE : 17 BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain ; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle 

 <Desc/Clms Page number 66> 

 SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide ; oligo N1 CARACTERISTIQUES : de 1 à 17 bases homologues aux bases 1033 à 1049 du brin du sens de JG2 (SEQ ID n'3) PROPRIETES : amorce la synthèse de   l'ADN   sur le brin négatif de   l'ARN/ADN   génomique de la PT-NANBH. 



  GAGGTTTTCT GCGTCCA 17 SEQ ID N' : 11 TYPE SEQUENCE : Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE : 17 BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain ; sérum infecté par hépatite   non-A,   non-B post-transfusionelle   SCURCE   EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide ; oligo N2 CARACTERISTIQUES : de 1 à 17 bases homologues aux bases 1421 à 1437 du brin anti-sens de JG2 (SEQ ID n'3) PROPRIETES : amorce la synthèse de   l'ADN   sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH. 



  GCGATAGCCG CAGTTCT 17 

 <Desc/Clms Page number 67> 

 SEQ ID   N' :   12 TYPE SEQUENCE : Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE   :   22 BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain ; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide ; oligo dl64 CARACTERISTIQUES : de 1 à 22 bases homologues aux bases 10 à 31 de la séquence à la fig. 2 d'Okamoto et al, Japan, J. Exp. 



  Med., 1990,60, 166-167, base 22 changée de A en T pour introduire un site de reconnaissance du Bg 12 de 8 à 13 bases du site de reconnaissance Bgl2 PROPRIETES : amorce la synthèse de   l'ADN   sur le brin négatif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et introduit un site Bgl2. 



  CCACCATAGA TCTCTCCCCT GT 22 SEQ ID N* : 13 TYPE SEQUENCE : Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE   :   30 BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain ; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle 

 <Desc/Clms Page number 68> 

 SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide ; oligo dl37 CARACTERISTIQUES : de 1 à 30 bases homologues aux bases 154 à 183 du brin négatif de BRU (SEQ ID   n'5)   ; bases 174, 177 et 178 modifiées pour introduire un site de reconnaissance   d'EcoRI.   de 5 à 10 bases de site de reconnaissance   d'EcoR1.   



  PROPRIETES : amorce la synthèse de   l'ADN   sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et introduit un site EcoR1 pour clonage. 



  GCGAGAATTC GGGATAGGTT GTCGCCTTCC 30 SEQ ID   N'   : 14 TYPE SEQUENCE : Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE : 27 BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain ; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide ; oligo dl36 CARACTERISTIQUES : de 1 à 27 bases homologues aux bases 672 à 698 du brin positif de BRU (SEQ ID   nO 5) ;   base 675 changée en G pour introduire un site de reconnaissance d'EcoR1. de 5 à 10 bases de site de reconnaissance d'EcoRl. 

 <Desc/Clms Page number 69> 

 



  PROPRIETES : amorce la synthèse de   l'ADN   sur le brin négatif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et introduit un site   EcoRl   pour clonage. 



    GGGGAATTCC   TCCCGCTGCT   GGGTAGC   27 SEQ ID   N' :   15 TYPE SEQUENCE : Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE : 28 BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : chimpanzé ; sérum infecté par hépatite   non-A,   non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide   ;   oligo dl55 CARACTERISTIQUES : de 1 à 28 bases homologues aux bases 462 à 489 du brin négatif de la figure 47, demande de brevet européen 88310922.5   ;   bases 483 et 485 modifiées pour introduire un site de reconnaissance EcoRl de 5 à 10 bases site de reconnaissance   d'EcoRl.   



  PROPRIETES : amorce la synthèse de   l'ADN   sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et introduit un site   EcoRl   pour clonage. 



    ACGGGAATTC     GACCAGGCAC     CTGGGTGT   28 SEQ ID N' : 16 

 <Desc/Clms Page number 70> 

 TYPE SEQUENCE : Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE : 23 BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : chimpanzé ; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide ; oligo dl56 CARACTERISTIQUES : de 1 à 23 bases homologues aux bases 3315 à 3337 du brin positif de la figure 47, demande de brevet européen 88310922. 5 ; base 323 changée en C pour introduire un site de reconnaissance EcoRI de 4 à 9 bases site de reconnaissance d'EcoRI. 



  PROPRIETES : amorce la synthèse de   l'ADN   sur le brin négatif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et introduit un site EcoRI pour clonage. 



  CTTGAATTCT   GGGAGGGCGT   CTT 23 SEQ ID   N' :   17 TYPE SEQUENCE : Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE : 29 BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain ; sérum infecté par 

 <Desc/Clms Page number 71> 

 hépatite non-A,   non-B   post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide ; oligo d92 CARACTERISTIQUES : de 1 à 29 bases homologues aux bases 36 à 64 du brin négatif de JG2 (SEQ ID N'3) ; bases 57,58 et 60 changées pour introduire un site de reconnaissance   EcoRl   de 5 à 10 bases site de reconnaissance   d'EcoRI.   



  PROPRIETES : amorce la synthèse de   l'ADN   sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et introduit un site EcoRl pour clonage. 



  CGCCGAATTC ATGCCGCCAC AGGAGGTTG 29 SEQ ID N' : 18 TYPE SEQUENCE : Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR SEQUENCE : 504 PAIRES DE BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain ; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : clone 164/137 CARACTERISTIQUES : à partir de 308 à 504 bp, début de la poloyprotéine PT-NANBH. 



  PROPRIETES : encode probablement des protéines virales structurelles. 

 <Desc/Clms Page number 72> 

 GATCACTCCC CTGTGAGGAA CTACTGTCTT CACGCAGAAA   GCGTCTAGCC     ATGGCGTTAG   60 TATGAGTGTC GTGCAGCCTC CAGGACCCCC   CCTCCCGGGA   GAGCCATAGT GGTCTGCGGA 120 ACCGGTGAGT   ACACC GAAT TGCCAGGACG ACCGGGTCCT TTCTTGGATT AACCCGCTCA   180   ATGCCTGGAG   ATTTGGGCGT GCCCCCGCAA GACTGCTAGC CGAGTAGTGT TGGGTCGCGA 240 AAGGCCTTGT   GGTACTGCCT   GATAGGGTGC TTGCGAGTGC   CCCGGGAGGT   CTCGTAGACC 300 
 EMI72.1 
 GTGCACC ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC 349 
Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro   Gln   Arg Lys Thr Lys Arg Asn
5 10 ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC 397 Thr Asn Pro Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly 

  Gln Ile
15 20 25 30 
 EMI72.2 
 GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG 445 Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val
35 40 45 CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAA CCT CGT GGA AGG CGA 493 Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser   Gln   Pro Arg Gly Arg Arg
50 55 60 CAA CCT ATC CC 504 Gln Pro Ile Pro
65 SEQ ID   N' :   19 TYPE SEQUENCE : Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR SEQUENCE : 1107 PAIRES DE BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain ; sérum infecté par hépatite non-A,   non-B   post-transfusionelle 

 <Desc/Clms Page number 73> 

 SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : clone 136/155 CARACTERISTIQUES : de 1 à 1107 bp portion de la poloyprotéine PT-NANBH. 



  PROPRIETES : encode probablement des protéines virales structurelles. 



  TCC TCC CGC TGC TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC AAG GAC 48 Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Lys Asp
5 10 15 GCC AGC ATC CCC ACT GCG ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG CTC GTT 96 Ala Ser Ile Pro Thr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val
20 25 30 GGG GCG GCT GCC TTC TGC TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC TGC GGA 144 Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly
35 40 45 TCT GTT TTC CTC GTC TCT CAG CTG TTC ACC TTC TCG CCT CGC CGA CAT 192 Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His
50 55 60 CAG ACG GTA CAG GAC TGC AAT TGT TCA ATC TAT CCC GGC CAC GTA TCA 240   Gln   Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser
65 70 75 80 GGT CAC CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA CCT ACA GCA 288 Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala
85 90 95 GCC CTA GTG GTA TCG CAG 

  CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCT GTC GTG GAC   336   Ala Leu Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Val Asp
100 105 110 

 <Desc/Clms Page number 74> 

 ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC CTG GCG GGC CTT GCC TAC TAT 384 Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr
115 120 125 TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTC TTG GTT GTG ATG CTA CTC TTT 432 Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe
130 135 140 GCC GGC GTT GAC GGG GAA CCT TAC ACG ACA GGG GGG ACA CAC GGC CGC 480 Ala Gly Val Asp Gly Glu Pro Tyr Thr Thr Gly Gly Thr His Gly Arg 145 150 155 160 GCC GCC CAC GGG CTT ACA TCC CTC TTC ACA CCT GGG CCG GCT CAG AAA 528 Ala Ala His Gly Leu Thr Ser Leu Phe Thr Pro Gly Pro Ala   Gln   Lys
165 170 175 ATC CAG CTT GTA AAC ACC AAC GGC AGC TGG CAC ATC AAC AGA ACT GCC 576 Ile   Gln   Leu Val Asn Thr Asn 

  Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala
180 185 190 TTG AAC TGC AAT GAC TCC CTC CAA ACT GGG TTC CTT GCC GCG CTG TTC 624 Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe
195 200 205 TAC ACG CAC AGG TTC AAT GCG TCC GGA TGC TCA GAG CGC ATG GCC AGC 672 Tyr Thr His Arg Phe Asn Ala Ser Gly Cys Ser Glu Arg Met Ala Ser
210 215 220 TGC CGC CCC ATT GAC CAG TTC GAT CAG GGG TGG GGT CGC ATC ACT TAT 720 Cys Arg Pro Ile Asp   Gln   Phe Asp   Gln   Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr 225 230 235 240 AAT GAG TCC CAC GGC TTG GAC CAG AGG CCC TAT TGC TGG CAC TAC GCA 768 Asn Glu Ser His Gly Leu Asp   Gln   Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala
245 250 255 
 EMI74.1 
 CCT CAA CCG TGT GGT ATC GTG CCC GCG TTG CAG GTG TGT GGC CCA GTG 816 

 <Desc/Clms Page number 75> 

 Pro Gln Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Leu   Gln   Val Cys Gly Pro 

  Val
260 265 270 TAC TGT TTC ACT CCA AGC CCT GTT GTG GTG GGG ACG ACC GAT CGT TTC 864 Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe
275 280 285 GGC GCC CCT ACG TAC AGA TGG GGT GAG AAT GAG ACG GAC GTG CTG CTT 912 Gly Ala Pro Thr Tyr Arg Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu
290 295 300 CTC AAC AAC ACG CGG CCG CCA CGG GGC AAC TGG TTC GGC TGT ACA TGG 960 Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp 305 310 315 320 
 EMI75.1 
 ATG AAT AGC ACC GGG TTC ACC AAG ACG TGT GGG GGC CCC CCG TGC AAC 1008 Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn 325 330 335 ATC GGG GGG GTC GGC AAC AAC ACT TTG ATC TGC CCC ACG GAC TGC TTC 1056 Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu Ile Cys Pro Thr Asp Cys Phe
340 345 350 CGG AAG CAT CCC GAG GCC ACT TAC ACC AAA TGC GGT TCG GGG CCT TGG 1104 Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp
355 360 

  365 TTG 1107 Leu SEQ ID   N' :   20 TYPE SEQUENCE : Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR SEQUENCE : 2043 PAIRES DE BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique 

 <Desc/Clms Page number 76> 

 ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain ; sérum infecté par hépatite non-A, non-B pcst-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : clone 156/192 CARACTERISTIQUES : de 1 à 2043 bp portion de la poloyprotéine PT-NANBH. 



  PROPRIETES : encode probablement des protéines virales non structurelles. 



  TGG GAG GGC GTC TTC ACA GGC CTC ACC CAC GTG GAT GCC CAC TTC CTG 48 Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Val Asp Ala His Phe Leu
5 10 15 TCC CAA ACA AAG CAG GCA GGA GAC AAC TTC CCC TAC CTG GTG GCG TAC 96 Ser Gln Thr Lys Gln Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr
20 25 30 CAG GCT ACT GTG TGC GCT AGG GCC CAG GCC CCA CCT CCA TCA TGG GAT 144   Gln   Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp
35 40 45 CAA ATG TGG AAG TGT CTC ATA CGG CTA AAG CCT ACT CTG CGC GGG CCA 192 Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu Arg Gly Pro
50 55 60 ACA CCC TTG CTG TAT AGG CTG GGA GCC GTC CAA AAC GAG GTC ACC CTC 240 Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu Val Thr Leu
65 70 75 80 ACA CAC CCC ATA ACC AAA TTC ATC ATG GCA TGC ATG TCA GCC GAC CTG 288 Thr His Pro Ile Thr Lys Phe Ile Met Ala Cys Met Ser Ala Asp Leu
85 90 95 GAG GTC GTC ACG AGC ACC 

  TGG GTG CTG GTG GGC GGG GTC CTT GCA GCT 336 

 <Desc/Clms Page number 77> 

 Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala
100 105 110 CTG GCT GCG TAT TGC TTG ACA ACA GGC AGC GTG GTC ATT GTG GGT AGG 384 Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr Thr Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg 
115 120 125 ATC ATC TTG TCC GGG CGG CCG GCT ATT GTT CCC GAC AGG GAA GTC CTC 432 Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Ile Val Pro Asp Arg Glu Val Leu
130 135 140 TAC CAG GAG TTC GAT GAG ATG GAA GAG TGC GCG TCG CAC CTC CCT TAC 480   Il.............................................................   



  Tyr   Gln   Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr 145 150 155 160 ATC GAG CAG GGA ATG CAG CTC GCC GAG CAG TTC AAG CAA AAA GCG CTC 528 Ile Glu   Gln   Gly Met Gln Leu Ala Glu   Gln   Phe Lys Gln Lys Ala Leu
165 170 175 GGG TTG CTG CAG ACA GCC ACC AAG CAA GCG GAG GCC GCT GCT CCC GTG 576 Gly Leu Leu Gln Thr Ala Thr Lys Gln Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val 
180 185 190 GTG GAG TCC AAG TGG CGA GCC CTT GAG ACC TTC TGG GCG AAA CAC ATG 624 Val Glu Ser Lys Trp Arg Ala Leu Glu Thr Phe Trp Ala Lys His Met
195 200 205 TGG AAC TTC ATC AGC GGG ATA CAG TAC TTA GCA GGC TTG TCC ACT CTG 672 Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile   Gln   Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu
210 215 220 CCT GGG AAT CCC GCG ATT GCA TCA CTG ATG GCG TTC ACA GCC TCT GTC 720 Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met Ala Phe Thr Ala Ser Val 225 230 235 240 

  

 <Desc/Clms Page number 78> 

 ACT AGC CCG CTC ACC ACC CAA TCT ACC CTC CTG CTT AAC ATC CTG GGG 768 Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gln Ser Thr Leu Leu Leu Asn Ile Leu Gly 
245 250 255 
 EMI78.1 
 GGA TGG GTA GCC GCC CAA CTC GCT CCC CCC AGT GCT GCT TCA GCT TTC 816 Gly Trp Val Ala Ala Gln Leu Ala Pro Pro Ser Ala Ala Ser Ala Phe
260 265 270 GTA GGC GCC GGC ATT GCT GGT GCG GCT GTT GGC AGC ATA GGC CTT GGG 864 Val Gly Ala Gly Ile Ala Gly Ala Ala Val Gly Ser Ile Gly Leu Gly
275 280 285 AAG GTG CTT GTG GAC ATC TTG GCG GGC TAT GGA GCA GGA GTG GCA GGC 912 Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Val Ala Gly
290 295 300 GCG CTC GTG GCC TTT AAG GTC ATG AGC GGC GAA ATG CCC TCC ACC GAG 960 Ala Leu Val Ala Phe Lys Val Met Ser Gly Glu Met Pro Ser Thr Glu 305 310 315 320 GAC CTG GTT AAC TTA CTC CCT GCC ATC CTC TCT CCT GGT GCC CTG GTC 1008 Asp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro Gly Ala 

  Leu Val 
325 330 335 GTC GGG GTC GTG TGC GCA GCG ATA CTG CGT CGG CAC GTG GGT CCA GGG 1056 Val Gly Val Val Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His Val Gly Pro Gly
340 345 350 GAG GGG GCT GTG CAG TGG ATG AAC CGG CTG ATA GCG TTC GCC TCG CGG 1104 
 EMI78.2 
 Glu Gly Ala Val Gln Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala Ser Arg 355 360 365 GGT AAC CAT GTT TCC CCC ACG CAC TAT GTG CCA GAG AGC GAC GCC GCA 1152 Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Ser Asp Ala Ala
370 375 380 

 <Desc/Clms Page number 79> 

 GCA CGT GTC ACT CAG ATC CTC TCC GAC CTT ACT ATC ACC CAA CTG TTG 1200 Ala Arg Val Thr   Gln   Ile Leu Ser Asp Leu Thr Ile Thr   Gln   Leu Leu 385 390 395 400 AAG AGG CTC CAC CAG TGG ATT AAC GAG GAC TGC TCC ACG CCC TGC TCC 1248 Lys Arg Leu His Gln Trp Ile Asn Glu Asp Cys Ser Thr Pro Cys Ser
405 410 415 GGC TCG TGG CTA AGG GAT GTT TGG GAC TGG ATA TGC ACA GTT 

  TTG GCT 1296 Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Asp Trp Ile Cys Thr Val Leu Ala
420 425 430 GAC TTC AAG ACC TGG CTC CAG TCC AAG CTC CTG CCG CGA TTA CCG GGA 1344 Asp Phe Lys Thr Trp Leu   Gln   Ser Lys Leu Leu Pro Arg Leu Pro Gly
435 440 445 GTC CCC TTT TTC TCA TGC CAA CGT GGG TAC AAG GGG GTC TGG CGG GGA 1392 Val Pro Phe Phe Ser Cys Gin Arg Gly Tyr Lys Gly Val Trp Arg Gly 
450 455 460 GAC GGC ATC ATG CAG ACC ACC TGC TCA TGT GGA GCA CAG ATC ACC GGA 1440 Asp Gly Ile Met   Gln   Thr Thr Cys Ser Cys Gly Ala   Gln   Ile Thr Gly 465 470 475 480 CAT GTC AAA AAC GGT TCC ATG AGG ATC GTT GGG CCT AAG ACC TGT AGT 1488 His Val Lys Asn Gly Ser Met Arg Ile Val Gly Pro Lys Thr Cys Ser
485 490 495 AAC ATG TGG CAT GGA ACA TTC CCC ATC AAC GCA TAC ACC ACG GGC CCC 1536 Asn Met Trp His Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro
500 505 510 TGC ACG 

  CCC TCC CCA GCG CCA AAC TAT TCC AGG GCG CTG TGG CGG GTG 1584 Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser Arg Ala Leu Trp Arg Val 

 <Desc/Clms Page number 80> 

 
515 520 525 GCT GCT GAG GAG TAC GTG GAG GTT ACG CGG GTG GGG GAT TTC CAC TAC 1632 Ala Ala Glu Glu Tyr Val Glu Val Thr Arg Val Gly Asp Phe His Tyr
530 535 540 GTG ACG AGC ATG ACC ACT GAC AAC GTA AAA TGC CCG TGC CAG   GTT CCA 1630   Val Thr Ser Met Thr Thr Asp Asn Val Lys Cys Pro Cys   Gln   Val Pro 545 550 555 560 GCC CCC GAA TTC TTC ACA GAA GTG GAT GGG GTG CGG CTG CAC AGG TAC 1728 Ala Pro Glu Phe Phe Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr
565 570 575 GCT CCG GCG TGC AAA CCT CTC CTA CGG GAG GAG GTC ACA TTC CAG GTC 1776 Ala Pro Ala Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr Phe   Gln   Val
580 585 590 GGG CTC AAC CAA TAC CTG GTT GGG TCG CAG CTC CCA TGC GAG CCC GAA 1824 Gly 

  Leu Asn Gln Tyr Leu Val Gly Ser   Gln   Leu Pro Cys Glu Pro Glu
595 600 605 CCG GAT GTA GCA GTG CTC ACT TCC ATG CTC ACC GAC CCC TCC CAC ATC 1872 Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile
610 615 620 ACA GCA GAG ACG GCT AAG CG-C AGG CTG GCC AGG GGG TCT CCC CCC TCC 1920 Thr Ala Glu Thr Ala Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro 625 630 635 640 TTG GCC AGC TCT TCA GCT AGC CAG TTG TCT GCG CCT TCC TCG AAG GCG 1968 Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Ser Lys Ala
645 650 655 ACA TAC ATT ACC CAA AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC 2016 

 <Desc/Clms Page number 81> 

 Thr Tyr Ile Thr Gln Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala
660 665 670 AAC CTC CTG TGG CGG CAT GAG ATG GGC 2043 Asn Leu Leu Trp Arg His Glu Met Gly
675 680 SEQ ID N' : 21 TYPE SEQUENCE :

   Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR SEQUENCE : 2116 PAIRES DE BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain ; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : contig formé par des clones d'ADNc à partir de l'extrémité 5'du génome CARACTERISTIQUES : de 308 à 2116 bp début de la poloyprotéine PT-NANBH. 



  PROPRIETES : protéines virales structurelles et non structurelles. 



  GATCACTCCC CTGTGAGGAA CTACTGTCTT CACGCAGAAA GCGTCTAGCC ATGGCGTTAG 60 TATGAGTGTC GTGCAGCCTC CAGGACCCCC   CCTCCCGGGA   GAGCCATAGT GGTCTGCGGA 120 ACCGGTGAGT ACACCGGAAT TGCCAGGACG ACCGGGTCCT TTCTTGGATT AACCCGCTCA 180 ATGCCTGGAG   ATTTGGGCGT   GCCCCCGCAA GACTGCTAGC CGAGTAGTGT TGGGTCGCGA 240   AAGGCCTTGT   GGTACTGCCT GATAGGGTGC TTGCGAGTGC   CCCGGGAGGT     CTCGTAGACC   300 GTGCACC ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC 349
Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn
5 10 

 <Desc/Clms Page number 82> 

 
 EMI82.1 
 ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC 397 Thr Asn Pro Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile 15 20 25 30 GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG 445 Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro 

  Arg Leu Gly Val 35 40 45 CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAA CCT CGT GGA AGG CGA 493 Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg
50 55 60 CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CAG CCC GAG GGC AGG GCC TGG GCT CAG 541   Gln   Pro Ile Pro Lys Ala Arg   Gln   Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln
65 70 75 CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAC GAG GGC ATG GGG TGG GCA 589 Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala
80 85 90 GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGT GGC TCC CGG CCT AGT TGG GGC CCC ACT 637   Il.............................................................   



  Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr 100 105 110   115   GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT AAA GTC ATC GAT ACC CTC 685 Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu
120 125 130 ACA TGC GGC TTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCT 733 Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala
135 140 145 CCC TTA GGG GGC GCT GCC AGG GCC CTG GCG CAT GGC GTC CGG GTT CTG 781 Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu
150 155 160 

 <Desc/Clms Page number 83> 

 
 EMI83.1 
 GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT TTA CCC GGT TGC TCT TTC 829 Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe
165 170 175 TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTG CTG TCC TGT TTG ACC ATT CCA GCT TCC 877 Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser 180 185 190 195 
 EMI83.2 
 GCT TAT GAA 

  GTG CGC AAC GTG TCC GGG ATC TAC CAT GTC ACG AAC GAT 925 Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp
200 205 210 TGC TCC AAC TCA AGC ATC GTG TAC GAG ACA GCG GAC ATG ATC ATG CAC 973 Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Thr Ala Asp Met Ile Met His
215 220 225 
 EMI83.3 
 ACC CCC GGG TGT GTG CCC TGT GTC CGG GAG GGT AAT TCC TCC CGC TGC 1021 Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ser Ser Arg Cys 230 235 240 TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC AAG GAC GCC AGC ATC CCC 1069 Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Lys Asp Ala Ser Ile Pro
245 250 255 ACT GCG ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG CTC GTT GGG GCG GCT GCC 1117 Thr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala 260 265 270 275 TTC TGC TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC TGC GGA TCT GTT TTC CTC 1165 Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu
280 285 290 GTC TCT CAG CTG TTC 

  ACC TTC TCG CCT CGC CGA CAT CAG ACG GTA CAG 1213 Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Gln Thr Val Gln
295 300 305 

 <Desc/Clms Page number 84> 

 
 EMI84.1 
 GAC TGC AAT TGT TCA ATC TAT CCC GGC CAC GTA TCA GGT CAC CGC ATG 1261 Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pn Gly His Val Ser Gly His Arg Met 310 315 320 GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA CCT ACA GCA GCC CTA GTG GTA 1309 Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val
325 330 335 TCG CAG CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCT GTC GTG GAC ATG GTG GCG GGG 1357 Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly 340
345 350 355 GCC CAC TGG GGA GTC CTG GCG GGC CTT GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG 1405 Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly
360 365 370 AAC TGG GCT AAG GTC TTG GTT GTG ATG CTA CTC TTT GCC GGC GTT GAC 1453 Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp
375 380 

  385 GGG GAA CCT TAC ACG ACA GGG GGG ACA CAC GGC CGC GCC GCC CAC GGG   1501   Gly Glu Pro Tyr Thr Thr Gly Gly Thr His Gly Arg Ala Ala His Gly
390 395 400 CTT ACA TCC CTC TTC ACA CCT GGG CCG GCT CAG AAA ATC CAG CTT GTA 1549 Leu Thr Ser Leu Phe Thr Pro Gly Pro Ala Gln Lys Ile Gln Leu Val
405 410 415 
 EMI84.2 
 AAC ACC AAC GGC AGC TGG CAC ATC AAC AGA ACT GCC TTG AAC TGC AAT 1597 Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn 420 425 430 435 GAC TCC CTC CAA ACT GGG TTC CTT GCC GCG CTG TTC TAC ACG CAC AGG 1645 Asp Ser Leu Gin Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr His Arg
440 445 450 

 <Desc/Clms Page number 85> 

 TTC AAT GCG TCC GGA TGC TCA GAG CGC ATG GCC AGC TGC CGC CCC ATT 1693 Phe Asn Ala Ser Gly Cys Ser Glu Arg Met Ala Ser Cys Arg Pro Ile
455 460   465   GAC CAG TTC GAT CAG GGG TGG GGT CCC ATC ACT TAT AAT GAG TCC CAC 1741 Asp 

  GIn Phe Asp GIn Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Asn Glu Ser His
470 475 480 GGC TTG GAC CAG AGG CCC TAT TGC TGG CAC TAC GCA CCT CAA CCG TGT 1789 Gly Leu Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Gln Pro Cys
485 490 495 GGT ATC GTG CCC GCG TTG CAG GTG TGT GGC CCA GTG TAC TGT TTC ACT 1837 Gly Ile Val Pro Ala Leu   Gln   Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr 500 505 510 515 CCA AGC CCT GTT GTG GTG GGG ACG ACC GAT CGT TTC GGC GCC CCT ACG 1885 Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Ala Pro Thr
520 525 530 
 EMI85.1 
 TAC AGA TGG GGT GAG AAT GAG ACG GAC GTG CTG CTT CTC AAC AAC ACG 1933 Tyr Arg Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr
535 540 545 CGG CCG CCA CGG GGC AAC TGG TTC GGC TGT ACA TGG ATG AAT AGC ACC 1981 Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr
550 555 560 GGG TTC ACC AAG ACG TGT GGG GGC CCC CCG TGC AAC ATC GGG GGG 

  GTC 2029 Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Val
565 570 575 GGC AAC AAC ACT TTG ATC TGC CCC ACG GAC TGC TTC CGG AAG CAT CCC 2077   Il.............................................................   



  *Gly Asn Asn Thr Leu Ile Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro 

 <Desc/Clms Page number 86> 

 
 EMI86.1 
 580 585 590 595 GAG GCC ACT TAC ACC AAA TGC GGT TCG GGG CCT TGG TTG 2116 Glu Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu
600 605 SEQ ID N' : 22 TYPE SEQUENCE   :   Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR SEQUENCE : 3750 PAIRES DE BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire TYPE MOLECULE : ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain ; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : contig formé par des clones d'ADNc à partir de l'extrémité 3'du génome CARACTERISTIQUES : de   l   à   3750   bp portion de la poloyprotéine PT-NANBH. 



  PROPRIETES : protéines virales non structurelles. 



  TGG GAG GGC GTC TTC ACA GGC CTC ACC CAC GTG GAT GCC CAC TTC CTG 48 Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Val Asp Ala His Phe Leu
5 10 15 TCC CAA ACA AAG CAG GCA GGA GAC AAC TTC CCC TAC CTG GTG GCG TAC 96   Ser Gln   Thr Lys Gln Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr
20 25 30 CAG GCT ACT GTG TGC GCT AGG GCC CAG GCC CCA CCT CCA TCA TGG GAT 144 
 EMI86.2 
 Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp 35 40 45 

 <Desc/Clms Page number 87> 

 CAA ATC TGG AAG TGT CTC ATA CGG CTA AAG CCT ACT CTG CGC GGG CCA 192   Gln   Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu Arg Gly Pro
50 55 60 ACA CCC TTG CTG TAT AGG CTG GGA GCC GTC CAA AAC GAG GTC ACC CTC 240 Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val   Gln   Asn Glu Val Thr Leu
65 70 75 80 ACA CAC CCC ATA ACC AAA TTC ATC ATG GCA TGC ATG TCA GCC GAC CTG 288 Thr His 

  Pro Ile Thr Lys Phe Ile Met Ala Cys Met Ser Ala Asp Leu   85   90 95 GAG GTC GTC ACG AGC ACC TGG GTG CTG GTG GGC GGG GTC CTT GCA GCT 336 Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala
100 105 110 CTG GCT GCG TAT TGC TTG ACA ACA GGC AGC GTG GTC ATT GTG GGT AGG 384 Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr Thr Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg
115 120 125 ATC ATC TTG TCC GGG CGG CCG GCT ATT GTT CCC GAC AGG GAA GTC CTC 432 Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Ile Val Pro Asp Arg Glu Val Leu
130 135 140 TAC CAG GAG TTC GAT GAG ATG GAA GAG TGC GCG TCG CAC CTC CCT TAC   480   Tyr Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr
145 150 155 160 ATC GAG CAG GGA ATG CAG CTC GCC GAG CAG TTC AAG CAA AAA GCG CTC 528 Ile Glu   Gln   Gly Met   Gln   Leu Ala Glu   Gln   Phe Lys 

    Gln   Lys Ala Leu
165 170 175 GGG TTG CTG CAG ACA GCC ACC AAG CAA GCG GAG GCC GCT GCT CCC GTG 576 Gly Leu Leu   Gln   Thr Ala Thr Lys   Gln   Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val 

 <Desc/Clms Page number 88> 

 
180 185 190 GTG GAG TCC AAG TGG CGA GCC CTT GAG ACC TTC TGG GCG AAA CAC ATG 624 Val Glu Ser Lys Trp Arg Ala Leu Glu Thr Phe Trp Ala Lys His Met   195   200 205 TGG AAC TTC ATC AGC GGG ATA CAG TAC TTA GCA GGC TTG TCC ACT CTG 672 Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gln Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu
210 215 220 CCT GGG AAT CCC GCG ATT GCA TCA CTG ATG GCG TTC ACA GCC TCT GTC 720   Il.............................................................   



  Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met Ala Phe Thr Ala Ser Val 225 230 235 240 ACT AGC CCG CTC ACC ACC CAA TCT ACC CTC CTG CTT AAC ATC CTG GGG 768 Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gln Ser Thr Leu Leu Leu Asn Ile Leu Gly 
245 250 255 GGA TGG GTA GCC GCC CAA CTC GCT CCC CCC AGT GCT GCT TCA GCT TTC 816 Gly Trp Val Ala Ala   Gln   Leu Ala Pro Pro Ser Ala Ala Ser Ala Phe
260 265 270 GTA GGC GCC GGC ATT GCT GGT GCG GCT GTT GGC AGC ATA GGC CTT GGG 864 Val Gly Ala Gly Ile Ala Gly Ala Ala Val Gly Ser Ile Gly Leu Gly
275 280 285 AAG GTG CTT GTG GAC ATC TTC GCG GGC TAT GGA GCA GGA GTG GCA GGC 912 Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Val Ala Gly
290 295 300 GCG CTC GTG GCC TTT AAG GTC ATG AGC GGC GAA ATG CCC TCC ACC GAG 960 Ala Leu Val Ala Phe Lys Val Met Ser Gly Glu Met Pro Ser Thr Glu 305 310 315 320 

 <Desc/Clms Page number 89> 

 
 EMI89.1 
 GAC CTG GTT AAC TTA 

  CTC CCT GCC ATC CTC TCT CCT GGT GCC CTG GTC 1008 Asp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro Gly Ala Leu Val 
325 330 335 GTC GGG GTC GTG TGC GCA GCG ATA CTG CGT CGG CAC GTG GGT CCA GGG 1056 Val Gly Val Val Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His Val Gly Pro Gly
340 345 350 GAG GGG GCT GTG CAG TGG ATG AAC CGG CTG ATA GCG TTC GCC TCG CGG 1104 Glu Gly Ala Val   Gln   Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala Ser Arg
355 360 365 GGT AAC CAT GTT TCC CCC ACG CAC TAT GTG CCA GAG AGC GAC GCC GCA 1152 Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Ser Asp Ala Ala
370 375 380 GCA CGT GTC ACT CAG ATC CTC TCC GAC CTT ACT ATC ACC CAA CTG TTG 1200 Ala Arg Val Thr Gln Ile Leu Ser Asp Leu Thr Ile Thr Gln Leu Leu 385 390 395 400 AAG AGG CTC CAC CAG TGG ATT AAC GAG GAC TGC TCC ACG CCC TGC TCC 1248 Lys Arg Leu His Gln Trp Ile Asn Glu Asp Cys Ser Thr Pro Cys Ser
405 410 415 GGC TCG TGG CTA 

  AGG GAT GTT TGG GAC TGG ATA TGC ACA GTT TTG GCT 1296 Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Asp Trp Ile Cys Thr Val Leu Ala
420 425 430 GAC TTC AAG ACC TGG CTC CAG TCC AAG CTC CTG CCG CCA TTA CCG GGA 1344 Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gln Ser Lys Leu Leu Pro Arg Leu Pro Gly
435 440 445 GTC CCC TTT TTC TCA TGC CAA CGT GGG TAC AAG GGG GTC TGG CGG GGA 1392 Val Pro Phe Phe Ser Cys Gln Arg Gly Tyr Lys Gly Val Trp Arg Gly 

 <Desc/Clms Page number 90> 

 
 EMI90.1 
 450 455 460 GAC GGC ATC ATG CAG ACC ACC TGC TCA TGT GGA GCA CAG ATC ACC GGA 1440 Asp Gly Ile Met Gln Thr Thr cys Ser Cys Gly Ala Gln Ile Thr Gly 465 470 475 480 CAT GTC AAA AAC GGT TCC ATG AGG ATC GTT GGG CCT AAG ACC TGT AGT 1488 His Val Lys Asn Gly Ser Met Arg Ile Val Gly Pro Lys Thr cys Ser   435   490 495 AAC ATG TGG CAT GGA ACA TTC CCC ATC AAC GCA TAC ACC ACG GGC CCC 1536 Asn Met Trp His Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala 

  Tyr Thr Thr Gly Pro
500 505 510 TGC ACG CCC TCC CCA GCG CCA AAC TAT TCC AGG GCG CTG TGG CGG GTG 1584 Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser Arg Ala Leu Trp Arg Val
515 520 525 GCT GCT GAG GAG TAC GTG GAG GTT ACG CGG GTG GGG GAT TTC CAC TAC 1632 Ala Ala Glu Glu Tyr Val Glu Val Thr Arg Val Gly Asp Phe His Tyr
530 535 540 GTG ACG AGC ATG ACC ACT GAC AAC GTA AAA TGC CCG TGC CAG GTT CCA 1680   Il.............................................................   



  Val Thr Ser Met Thr Thr Asp Asn Val Lys Cys Pro Cys   Gln   Val Pro 545 550 555 560 GCC CCC GAA TTC TTC ACA GAA GTG GAT GGG GTG CGG CTG CAC AGG TAC 1723 Ala Pro Glu Phe Phe Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr
565 570 575 GCT CCG GCG TGC AAA CCT CTC CTA CGG GAG GAG GTC ACA TTC CAG GTC 1776 Ala Pro Ala Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr Phe   Gln   Val
580 585 590 GGG CTC AAC CAA TAC CTG GTT GGG TCG CAG CTC CCA TGC GAG CCC GAA 1824 

 <Desc/Clms Page number 91> 

 Gly Leu Asn Gln Tyr Leu Val Gly Ser GIn Leu Pro Cys Glu Pro Glu
595 600 605 CCG GAT GTA GCA GTG CTC ACT TCC ATG CTC ACC GAC CCC TCC CAC ATC 1872 Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile
610 615 620 ACA GCA GAG ACG GCT AAG CG-C AGG CTG GCC AGG GGG TCT CCC CCC TCC 1920   fi.............................................................   

  



  Thr Ala Glu Thr Ala Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser 625 630 635 640 TTG GCC AGC TCT TCA GCT AGC CAG TTG TCT GCG CCT TCC TCG AAG GCG 1968 Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Ser Lys Ala
645 650 655 ACA TAC ATT ACC CAA AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC 2016 Thr Tyr Ile Thr Gln Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala
660 665 670 AAC CTC CTG TGG CGG CAT GAG ATG GGC GGG GAC ATT ACC CGC GTG GAG 2064 Asn Leu Leu Trp Arg His Glu Met Gly Gly Asp Ile Thr Arg Val Glu
675 680 685 TCA GAG AAC AAG GTA GTA ATC CTG GAC TCT TTC GAC CCG CTC CGA GCG 2112 Ser Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala
690 695 700 GAG GAG GAT GAG CGG GAA GTG TCC GTC CCG GCG GAG ATC CTG CGG AAA 2160   Il.............................................................   



  Glu Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys 705 710 715 720 TCC AAG AAA TTC CCA CCA GCG ATG CCC GCA TGG GCA CGC CCG GAT TAC 2208 Ser Lys Lys Phe Pro Pro Ala Met Pro Ala Trp Ala Arg Pro Asp Tyr
725 730 735 

 <Desc/Clms Page number 92> 

 AAC CCT CCG CTG CTG GAG TCC TGG AAG GCC CCG GAC TAC GTC CCT CCA 2256 Asn Pro Pro Leu Leu Glu Ser Trp Lys Ala Pro As ? Tyr Val Pro Pro
740 745 750 GTG GTA CAT GGG TGC CCA CTG CCA CCT ACT AAG ACC CCT CCT ATA CCA 2304 Val Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr Pro Pro Ile Pro
755 760 765 
 EMI92.1 
 CCT CCA CGG AGG AAG AGG ACA GTT GTT CTG ACA GAA TCC ACC GTG TCT 2352 Pro Pro Arg Arg Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Val Ser
770 775 780 TCT GCC CTG GCG GAG CTT GCC ACA AAG GCT TTC GGT AGC TCC GAA CCG 2400   il.............................................................   



  Ser Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ala Phe Gly Ser Ser Glu Pro 785 790 795 800 TCG GCC GTC GAC AGC GGC ACG GCA ACC GCC CCT CCT GAC CAA CCC TCC 2448 Ser Ala Val Asp Ser Gly Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp   Gln   Pro Ser
805 810 815 GAC GAC GGC GGA GCA GGA TCT GAC GTT GAG TCG TAT TCC TCC ATG CCC 2496 Asp Asp Gly Gly Ala Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro
820 825 830 CCC CTT GAG GGG GAG CCG GGG GAC CCC GAT CTC AGC GAC GGG TCT TGG 2544 Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp
835 840 845 TCT ACC GTG AGT GAG GAG GCC GGT GAG GAC GTC GTC TGC TGC TCG ATG 2592 Ser Thr Val Ser Glu Glu Ala Gly Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met
850 855 860 TCC TAC ACA TGG ACA GGC GCT CTG ATC ACG CCA TGC GCT GCG GAG GAA 2640   fi.............................................................   



  Ser Tyr Thr Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu 865 870 875 880 

 <Desc/Clms Page number 93> 

 AGC AAG CTG CCC ATC AAC GCG TTG AGC AAC TCT TTG CTG CGT CAC CAC 2688 Ser Lys Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His
885 890 895 AAC ATG GTC TAC GCT ACC ACA TCC CGC AGC GCA AGC CAG CGG CAG AAG 2736 Asn Met Val Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Gln Arg   Gln   Lys
900 905 910 AAG GTC ACC TTT GAC AGA CTG CAA ATC CTG GAC GAT CAC TAC CAG GAC 2784 Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu   Gln   Ile Leu Asp Asp His Tyr   Gln   Asp
915 920 925 GTG CTC AAG GAG ATG AAG GCG AAG GCG TCC ACA GTT AAG GCT AAG CTT 2832 Val Leu Lys Glu Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala Lys Leu
930 935 940 CTA TCA GTA GAG GAA GCC TGC AAG CTG ACG CCC CCA CAT TCG GCC AAA 2880 Leu Ser Val Glu Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys 

  945 950 955 960 TCT AAA TTT GGC TAT GGG GCA AAG GAC GTC CGG AAC CTA TCC AGC AAG 2928 Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser Ser Lys
965 970 975 GCC ATT AAC CAC ATC CGC TCC GTG TGG GAG GAC TTG TTG GAA GAC ACT 2976 Ala Ile Asn His Ile Arg Ser Val Trp Glu Asp Leu Leu Glu Asp Thr
980 985 990 GAA ACA CCA ATT GAC ACC ACC ATC ATG GCA AAA AAT GAG GTT TTC TGC 3024 Glu Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys
995 1000 1005 GTC CAA CCA GAG AGA GGA GGC CGC AAG CCA GCT CGC CTT ATC GTG TTC 3072 Val   Gln   Pro Glu Arg Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe
1010 1015 1020 

 <Desc/Clms Page number 94> 

 
 EMI94.1 
 CCA GAC TTG GGG GTC CGT GTG TGC GAG AAA ATG GCC CTC TAT GAC GTG 3120 Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Val 1025 1030 1035 1040 GTC TCC ACC CTC CCT CAG GCT GTG ATG GGC TCC TCG TAC GGA TTC CAG 3168 Val 

  Ser Thr Leu Pro Gln Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Gln 1045 1050 1055 TAT TCT CCT GGA CAG CGG GTC GAG TTC CTG GTG AAC GCC TGG AAA TCA 3216 Tyr Ser Pro Gly Gln Arg Val Glu Phe Leu Val Asn Ala Trp Lys Ser
1060 1065 1070 AAG AAG ACC CCT ATG GGC TTT GCA TAT GAC ACC CGC TGT TTT GAC TCA 3264 Lys Lys Thr Pro Met Gly Phe Ala Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser
1075 1080 1085 ACA GTC ACT GAG AAT GAC ATC CGT GTA GAG GAG TCA ATT TAT CAA TGT   3312   Thr Val Thr Glu Asn Asp Ile Arg Val Glu Glu Ser Ile Tyr Gln Cys
1090 1095 1100 TGT GAC TTG GCC CCC GAA GCC AGA CAG GCC ATA AGG TCG CTC ACA GAG 3360   il.............................................................   



  Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg   Gln   Ala Ile Arg Ser Leu Thr Glu 1105 1110 1115 1120 CGG CTT TAT ATC GGG GGT CCC CTG ACT AAT TCA AAA GGG CAG AAC TGC 3408 Arg Leu Tyr Ile Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly   Gln   Asn Cys
1125 1130 1135 GGC TAT CGC CGG TGC CGC GCG AGC GGC GTG CTG ACG ACT AGC TGC GGT 3456 Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly
1140 1145 1150 AAT ACC CTC ACA TGT TAC TTG AAG GCC TCT GCA GCC TGT CGA GCT GCA 3504 Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg Ala Ala
1155 1160   1165   

 <Desc/Clms Page number 95> 

 AAG CTC CAG GAC TGC ACG ATG CTC GTG TGC GGA GAC GGC CTT GTC GTT 3552 Lys Leu   Gln   Asp Cys Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val
1170 1175 1180 ATC TGT GAG AGC GCG GGA ACC CAG GAG GAC GCG GCG AGC CTA CGA GTC 3600 

    Il.............................................................   



  Ile Cys Glu Ser Ala Gly Thr Gln Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Val 1185 1190 1195 1200 TTC ACG GAG GCT ATG ACT AGG TAC TCT GCC CCC CCC GGG GAC CCG CCC 3648 Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro
1205 1210 1215 
 EMI95.1 
 CAA CCA GAA TAC GAC CTG GAG TTG ATA ACA TCA TGC TCC TCC AAT GTG 3696 Gln Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val
1220 1225 1230 TCG GTC GCG CAC GAT GCA TCT GGC AAA AGG GTA TAC TAC CTC ACC CGT 3744 Ser Val Ala His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg
1235 1240 1245 GAC CCG 3750 Asp Pro
1250 SEQ ID   N' :   23 TYPE SEQUENCE : Nucl otide LONGUEUR SEQUENCE : 23 BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : lin aire TYPE MOLECULE :

   ADN synth tique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : baculovirus Autographa californica Nuclear Polydedrosis virus (AcNPV) SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synth tiseur oligo- 

 <Desc/Clms Page number 96> 

 nucl otide ; oligo d24 CARACTERISTIQUES : de 1   23 basas homologues   la portion de g ne polyh drine AcNPV en aval du site de clonage BamHl dans les vecteurs pAc360 et similaires. 



  PROPRIETES : amorce la synth se de   l'ADN     partir des s quences du vecteur de transfert du baculovirus qui flanquent   l'ADN   ins r  au niveau du site BamHl. 



  CGGGTTTAAC   ATTACGGATT   TCC 23 SEQ ID N* : 24 TYPE SEQUENCE : Nucl otide LONGUEUR SEQUENCE : 31 BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : lin aire TYPE MOLECULE : ADN synth tique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : baculovirus Autographa californica Nuclear Polydedrosis virus (AcNPV) SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synth tiseur oligonucl otide ; oligo dl26 CARACTERISTIQUES : de 1   31 bases homologues aux s quences de jonction en amont produite lorsque l'ADNc amplifi  par d75 (SEQ ID n'5) est   clon    dans le site de clonage BamHl dans des vecteurs pAc360 et similaires ; des d s quilibres au niveau des bases 13 et 14 introduisent un site Pstl de 1   10 bases homologues   la r gion du site BamHl dans des vecteurs pAc360 et similaires de 4   9 bases site BamHl 

 <Desc/Clms Page number 97> 

 de 12   17 bases site Pstl. 



  PROPRIETES : amorce la synth se de   l'ADN     la jonction des s quences du vecteur de transfert du baculovirus et des s quences amplifi es pr c demment par l'oligo d75 ; introduit un site de reconnaissance Pstl pour le travail de clonage ult rieur. 



  TAAGGATCCC CCT GCA GTA TCG GCG GAA TTC
Ser Ala Val Ser Ala Glu Phe
5 SEQ ID   N'   : 25 TYPE SEQUENCE : Nucl otide LONGUEUR SEQUENCE : 45 BASES ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : lin aire TYPE MOLECULE : ADN synth tique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : N/A SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synth tiseur oligonucl otide ; oligo dl32 CARACTERISTIQUES : de 5   10 bases site de reconnaissance Pstl de 13   27 bases codage de liaison pour cinq r sidus Lys de 28   45 bases homologues aux bases 4   21 de BR11 (SEQ ID 7). 



  PROPRIETES : amorce la synth se de   l'ADN     l'extr mit    5'de   BRU et introduit une s quence synth tique qui code 5 lysines ainsi qu'un site de reconnaissance Pstl pour le travail de clonage ult rieur. 

 <Desc/Clms Page number 98> 

 
 EMI98.1 
 CTGCCTGCA GTA AAG AAG AAG AAG AAG AAA ACC AAA CGT AAC ACC A 45 Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Lys Arg Asn Leu 5 10

Claims (19)

  1. EMI99.1
    R E V E N D I C A T I O N S REVENDICATIONS 1.-Polypeptide viral PT-NANBH comprenant un antigène ayant une séquence d'acide aminé qui est au moins homologue à 90% avec la séquence d'acide aminé dont question à la SEQ ID no3, 4,19, 20,21 ou 22, ou en est un fragment antigénique.
  2. 2.-Polypeptide viral PT-NANBH suivant la revendication 1, dans lequel la séquence d'acide aminé est au moins homologue à 90% avec la séquence d'acide aminé dont question à la SEQ ID nO 3 ou 4 en est un fragment antigénique.
  3. 3.-Polypeptide viral PT-NANBH suivant l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la séquence d'acide aminé est au moins homologue à 95% avec la séquence d'acide aminé SEQ ID en question, ou en est un fragment antigénique.
  4. 4.-Polypeptide viral PT-NANBH suivant la revendication 3, dans laquelle la séquence d'acide aminé est au moins homologue à 98% avec la séquence d'acide aminé SEQ ID en question, ou en est un fragment antigénique.
  5. 5.-Polypeptide viral PT-NANBH comprenant un antigène provenant de la région de programmation structurée du génome viral et un antigène provenant de la zone de programmation non structurée du génome viral.
  6. 6.-Polypeptide viral PT-NANBH suivant la revendication 5, dans lequel l'antigène de la région de programmation structurée a une séquence d'acide aminé qui est au moins homologue à 90% avec la séquence d'acide aminé dont question à la SEQ ID nO 5, ou en est un fragment antigénique, et l'antigène de la région de programmation non structurée a une séquence d'acide aminé qui est au moins homologue à 90% avec la séquence d'acide aminé dont question à la SEQ ID nO 3 ou 4, ou en est un fragment antigénique. <Desc/Clms Page number 100>
  7. 7. - Séquence d'ADN encodant un polypeptide viral PT-NANBH suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6.
  8. 8. - Séquence d'ADN conformément à la revendication 7 telle qu'indiquée à la SEQ ID no3, 4,19, 20,21 ou 22.
  9. 9. - Vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN suivant l'une quelconque des revendications 7 et 8, et capable en présence d'un hôte approprié d'exprimer la séquence d'ADN pour produire un polypeptide viral PT-NANBH.
  10. 10.-Cellule hôte transformée avec un vecteur d'expression conformément à la revendication 9.
  11. 11.-Procédé pour la préparation d'un polypeptide viral PT-NANBH, comprenant le clonage ou la synthétisation d'une séquence d'ADN encodant un polypeptide viral PT-NANBH conformément à l'une quelconque des revendications 1 à 6, l'insertion de la séquence d'ADN dans un vecteur d'expression telle qu'elle puisse, en présence d'un hôte approprié, s'exprimer et transformer une cellule hôte au moyen du vecteur d'expression, de mettre en culture la cellule hôte transformée et d'isoler le polypeptide viral.
  12. 12.-Anticorps polyclonal ou monoclonal contre un polypeptide viral PT-NANBH, conformément à l'une quelconque des revendications 1 à 6.
  13. 13.-Une méthode pour la détection d'acide nucléique viral PT-NANBH comprenant : i) l'hybridation de l'ARN viral présent dans un échantillon, ou l'ADNc synthétisé à partir de cet ARN, avec une séquence d'ADN correspondant à la SEQ ID no3, 4,19, 20,21 ou 22, et la sélection des hybrides d'acide nucléique en résultant pour identifier tout acide nucléique viral PT-NANBH ; ii) la synthétisation d'ADNc à partir de l'ARN viral présent dans un échantillon, l'amplification d'une séquence d'ADN présélectionnée correspondant à une sous-séquence de la SEQ ID N03, 4,19, 20,21 ou 22 et l'identification <Desc/Clms Page number 101> de la séquence d'ADN présélectionnée.
  14. 14 - - Un kit d'essai pour la détection d'acide nucléique viral PT-NANBH comprenant : i) une paire d'amorces oligonucléotides dont l'une correspond à une portion de la séquence de nucléotide de SEQ ID n 3, 4,19, 20, 21 ou 22 et dont l'autre se trouve du côté 3'de la première et correspond à une portion de la séquence complémentaire, la paire définissant entre elles une séquence d'ADN présélectionnée ; ii) un enzyme de transcriptase inverse pour la synthèse de l'ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon en amont de l'amorce correspondant à la séquence nucléotide complémentaire de la SEQ ID n 3, 4,19, 20,21 ou 22 ; iii) un enzyme capable d'amplifier la séquence d'ADN présélectionnée ;
    et en option iv) des solutions de lavage et tampons de réaction.
  15. 15.-Une méthode pour la détection de l'antigène viral PT-NANBH ou de l'anticorps viral, comprenant la mise en contact d'un échantillon avec un polypeptide viral PT-NANBH conformément à l'une des revendications 1 à 6, ou un anticorps polyclonal ou monoclonal conformément à la revendication 12, et la détermination de la présence ou non d'une liaison antigène-anticorps au sein de l'échantillon.
  16. 16.-Un kit d'essai pour la détection d'antigène viral PT-NANBH ou d'anticorps viral comprenant un polypeptide viral PT-NANBH conformément à l'une des revendications 1 à 6, ou un anticorps polyclonal ou monoclonal suivant la revendication 12, et des moyens pour déterminer l'existence ou non d'une liaison EMI101.1 antigène-anticorps au sein de l'échantillon.
  17. 17.-Une formulation de vaccin comprenant un polypeptide viral PT-NANBH conformément à l'une des revendications 1 à 6, en association avec un support acceptable du point de vue pharmaceutique. <Desc/Clms Page number 102>
  18. 18.-Une méthode pour la détection d'un anticorps viral comprenant : la mise en contact d'un échantillon avec un ou plusieurs polypeptide (s) PT-NANBH, le (s) dit (s) polypeptide (s) viral (viraux) comprenant au moins deux antigènes viraux, PT-NANBH utilisés en combinaison ou fondus en un seul polypeptide, au moins un desdits antigènes dérivant de la région de programmation structurée du virus et au moins un autre desdits antigènes dérivant de la région de programmation non structurée du virus, et la détermination de l'existence au non d'une liaison antigène-anticorps. au sein de l'échantillon.
  19. 19.-Un kit d'essai pour la détection d'un anticorps viral PT-NANBH qui comprend : au moins un polypeptide (s) viral (viraux) PT-NANBH, le (s) dit (s) polypeptide (s) viral (viraux) comprenant au moins deux antigènes viraux utilisés en combinaison ou fondus en un seul polypeptide, au moins un desdits antigènes dérivant de la région de programmation structurée du virus et au moins un autre desdits antigènes dérivant de la région de programmation non structurée du virus, et des moyens de détermination de l'existence ou non d'une liaison antigène-anticorps au sein de l'échantillon.
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