JPH0450653A - 癌の検出方法及びキット - Google Patents
癌の検出方法及びキットInfo
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- JPH0450653A JPH0450653A JP15163990A JP15163990A JPH0450653A JP H0450653 A JPH0450653 A JP H0450653A JP 15163990 A JP15163990 A JP 15163990A JP 15163990 A JP15163990 A JP 15163990A JP H0450653 A JPH0450653 A JP H0450653A
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は免疫学的方法を用いた癌の検出方法及び検出用
キットに関する。
キットに関する。
従来、癌の検出方法には種々の方法がとられており、例
えば癌化したと思われる細胞、組織を取出し、これを染
色して検出する方法や、癌細胞が産生ずるいわゆる癌マ
ーカーを免疫学的に検出する方法がある。この癌マーカ
ーには癌胎児性抗原(CEA) 、アルファフェトプロ
ティン(AFP)、癌関連糖鎖抗原・C^19−9など
がある。更に最近、尿中に出現するフィブロネクチン(
以下FNと略称する)の細胞接着ドメインを主体とする
フラグメントが癌マーカーの一つとして用いられること
が見比されている〔カタヤ7 (Katayama)ら
、医学のあゆみ、第150巻、第695〜696頁(1
989)]。
えば癌化したと思われる細胞、組織を取出し、これを染
色して検出する方法や、癌細胞が産生ずるいわゆる癌マ
ーカーを免疫学的に検出する方法がある。この癌マーカ
ーには癌胎児性抗原(CEA) 、アルファフェトプロ
ティン(AFP)、癌関連糖鎖抗原・C^19−9など
がある。更に最近、尿中に出現するフィブロネクチン(
以下FNと略称する)の細胞接着ドメインを主体とする
フラグメントが癌マーカーの一つとして用いられること
が見比されている〔カタヤ7 (Katayama)ら
、医学のあゆみ、第150巻、第695〜696頁(1
989)]。
本発明者らは先に抗体を用いたFNフラグメントの測定
方法を已願した(特開昭63−269057号)。
方法を已願した(特開昭63−269057号)。
一方、高塚らは、天然型FNに対するポリクローナル抗
体を用いたラテックス凝集方法が癌の検出に有用である
ことを見出した〔タカツカ(Takatsuka)ら、
最新医学、第41巻、第2275〜2280頁(198
6) )。
体を用いたラテックス凝集方法が癌の検出に有用である
ことを見出した〔タカツカ(Takatsuka)ら、
最新医学、第41巻、第2275〜2280頁(198
6) )。
しかし、上記FNフラグメント測定方法では酵素免疫測
定方法が用いられており、大量試料が処理される集団検
診にはその簡便性、大量処理能力、コストの点で問題が
あった。更に、ヒト尿中に、疾患により出現するFNフ
ラグメントにも疾患により若干の違いがあり、上記天然
型FNに対するポリクローナル抗体を用いたラテックス
凝集方法で尿中FNフラグメントを測定しても、癌由来
のものか他の良性疾患由来のものか区別がつかず、集団
検診の場においてはスクリーニング後の精密検査の労力
、コストの面で大きな問題があった。
定方法が用いられており、大量試料が処理される集団検
診にはその簡便性、大量処理能力、コストの点で問題が
あった。更に、ヒト尿中に、疾患により出現するFNフ
ラグメントにも疾患により若干の違いがあり、上記天然
型FNに対するポリクローナル抗体を用いたラテックス
凝集方法で尿中FNフラグメントを測定しても、癌由来
のものか他の良性疾患由来のものか区別がつかず、集団
検診の場においてはスクリーニング後の精密検査の労力
、コストの面で大きな問題があった。
本発明の目的は、精度が高く、癌の診断効率が高く、か
つ簡便で大量試料が処理できる安価な癌の検出方法及び
キットを提供することにある。
つ簡便で大量試料が処理できる安価な癌の検出方法及び
キットを提供することにある。
[課題を解決するための手段]
本発明を概説すれば、本発明の第1の発明は癌の検出方
法に関し、ヒト尿試料を、FNの細胞接着ドメインに対
する抗体を感作した担体粒子と混合し、担体粒子の凝集
状態を判定することを特徴とする。また、第2の発明は
癌の検出用キットに関し、FNの細胞接着ドメインに対
する抗体を感作した担体粒子を含有することを特徴とす
る。
法に関し、ヒト尿試料を、FNの細胞接着ドメインに対
する抗体を感作した担体粒子と混合し、担体粒子の凝集
状態を判定することを特徴とする。また、第2の発明は
癌の検出用キットに関し、FNの細胞接着ドメインに対
する抗体を感作した担体粒子を含有することを特徴とす
る。
本発明者らは、上記現状にかんがみて鋭意研究を重ね、
逆受身凝集反応を利用した尿中のFN細胞接着ドメイン
含有フラグメントの検出方法を開発し、この方法が癌の
検出方法及びスクリーニング方法として適当であること
を見出して本発明を完成した。
逆受身凝集反応を利用した尿中のFN細胞接着ドメイン
含有フラグメントの検出方法を開発し、この方法が癌の
検出方法及びスクリーニング方法として適当であること
を見出して本発明を完成した。
本発明で用いられる試料は、ヒト尿から得られるもので
あり、通常は尿そのものを、また場合によっては一定量
のろ紙などの吸収材に染みこませ、ここから抽出する方
法などによって調製し用いることもできる。
あり、通常は尿そのものを、また場合によっては一定量
のろ紙などの吸収材に染みこませ、ここから抽出する方
法などによって調製し用いることもできる。
抗体を作成するための抗原としてのFN細胞接着ドメイ
ンは、天然型FNから酵素処理、化学処理によって、ま
た癌患者の尿から調製することもできるが、遺伝子工学
的に組換え体によって製造することがコスト的にも、ま
た品質の均一性においても適している。本発明のFN細
胞接着ドメインとは、例えば天然型FNをサーモリシン
処理して得られる分子量14万のフラグメントだけでは
なく、細胞接着活性をもつFN分子由来の7ラグメント
であればよく、例えば、特開平1−180900号、同
1206998号、同2−97397号各公報及び特願
昭63−305820号明細書中に記載されている組換
えFN細胞接着フラグメントを免疫原として用いても良
い。
ンは、天然型FNから酵素処理、化学処理によって、ま
た癌患者の尿から調製することもできるが、遺伝子工学
的に組換え体によって製造することがコスト的にも、ま
た品質の均一性においても適している。本発明のFN細
胞接着ドメインとは、例えば天然型FNをサーモリシン
処理して得られる分子量14万のフラグメントだけでは
なく、細胞接着活性をもつFN分子由来の7ラグメント
であればよく、例えば、特開平1−180900号、同
1206998号、同2−97397号各公報及び特願
昭63−305820号明細書中に記載されている組換
えFN細胞接着フラグメントを免疫原として用いても良
い。
抗体は、ウサギ、ヤギ、馬、モルモット、ニワトリなど
の温血動物に体重1 kg当り0.3〜2mg程度の上
記FN細胞接着ドメインを1〜数回背中皮下、フットパ
ッド、大腿筋等にアジュバントと共に注射して当該動物
の体内に形成させる。抗体は十分に精製して用いるのが
良く、この精製方法としてはアフィニティークロマトグ
ラフィーが特に有効である。
の温血動物に体重1 kg当り0.3〜2mg程度の上
記FN細胞接着ドメインを1〜数回背中皮下、フットパ
ッド、大腿筋等にアジュバントと共に注射して当該動物
の体内に形成させる。抗体は十分に精製して用いるのが
良く、この精製方法としてはアフィニティークロマトグ
ラフィーが特に有効である。
一方、この抗体はモノクローナル抗体として、公知の方
法で取得することもできる。その場合には、マウスに前
述のいずれかの抗原をアジュバントと共に数回腹腔等に
注射1.2、膵臓細胞を取出してポリエチレングリコー
ル等を用いてマウスミエローマ細胞ど融合させる。そし
て、融合細胞の中から当該抗体を産生ずるものをクロー
ニングし、増殖させ、マウス腹腔内で培養することによ
りモノクローナル抗体を大量に製造することができる。
法で取得することもできる。その場合には、マウスに前
述のいずれかの抗原をアジュバントと共に数回腹腔等に
注射1.2、膵臓細胞を取出してポリエチレングリコー
ル等を用いてマウスミエローマ細胞ど融合させる。そし
て、融合細胞の中から当該抗体を産生ずるものをクロー
ニングし、増殖させ、マウス腹腔内で培養することによ
りモノクローナル抗体を大量に製造することができる。
担体粒子は間接凝集反応用のものを用いれば良く、例え
ばヒツジ、ニワ) IJ等の動物の赤血球、セラチア菌
などの微生物菌体、ゼラチン粒子、ポリスチレンラテッ
クス、カオリン、炭素束などを使用することができる。
ばヒツジ、ニワ) IJ等の動物の赤血球、セラチア菌
などの微生物菌体、ゼラチン粒子、ポリスチレンラテッ
クス、カオリン、炭素束などを使用することができる。
F’ N細胞接着ドメインに対する抗体を担体に感作す
る方法も一般の抗体を感作する公知の方法によれば良く
、例えば、タンニン酸、グルタルアルデヒド、ビスジア
ゾベンジジン、カルボジイミド類、キノン類、塩化クロ
ム類等のいわゆるカップリング剤を使用する方法、ある
いは物理吸着させる方法などによって行うことができる
。
る方法も一般の抗体を感作する公知の方法によれば良く
、例えば、タンニン酸、グルタルアルデヒド、ビスジア
ゾベンジジン、カルボジイミド類、キノン類、塩化クロ
ム類等のいわゆるカップリング剤を使用する方法、ある
いは物理吸着させる方法などによって行うことができる
。
こうして得られた感作粒子は通常は懸濁液で、又は常法
により凍結乾燥標品とし、必要に応じ、例えば希釈用液
、未感作担体、非特異反応吸収剤、標準液などと組合せ
、癌検出用キットとして用いる。
により凍結乾燥標品とし、必要に応じ、例えば希釈用液
、未感作担体、非特異反応吸収剤、標準液などと組合せ
、癌検出用キットとして用いる。
このようなキットを用いて尿中FN細胞接着ドメイン含
有フラグメントを測定する方法は逆受身反応、ラテック
ス凝集方法に通常用いられる方法によれば良く、例えば
マイクロプレートのウェルに被検試料を入れてその希釈
系列をつくり、各ウェルに前菖己の感作粒子を加えて混
合し、通常1〜2時間静置し、この感作粒子の凝集像を
観察し、判定すれば良い。この方法のほか、例えば被検
試料と感作粒子をスライド板上で混ぜ合せ、1〜2分後
の凝集状態を判定することもできる。
有フラグメントを測定する方法は逆受身反応、ラテック
ス凝集方法に通常用いられる方法によれば良く、例えば
マイクロプレートのウェルに被検試料を入れてその希釈
系列をつくり、各ウェルに前菖己の感作粒子を加えて混
合し、通常1〜2時間静置し、この感作粒子の凝集像を
観察し、判定すれば良い。この方法のほか、例えば被検
試料と感作粒子をスライド板上で混ぜ合せ、1〜2分後
の凝集状態を判定することもできる。
これらの場合、感作粒子が凝集するときを陽性、凝集を
認めないときを陰性とする。また、この凝集状態は光電
管を利用して自動的に判定させることもできる。その場
合においては、感作粒子の凝集速度が、例えば健常人尿
試料での平均凝集速度より大きいときを陽性とすれば良
い。
認めないときを陰性とする。また、この凝集状態は光電
管を利用して自動的に判定させることもできる。その場
合においては、感作粒子の凝集速度が、例えば健常人尿
試料での平均凝集速度より大きいときを陽性とすれば良
い。
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
実施例1
特開平2−97397号公報記載の遺伝子工学的に製造
されたFN細胞接着フラクメント(rFN274 :宝
酒造社製) 0.5 mg/ 1回をウサギに計5回、
常法に基づき注射、免疫し、抗血清を得た。
されたFN細胞接着フラクメント(rFN274 :宝
酒造社製) 0.5 mg/ 1回をウサギに計5回、
常法に基づき注射、免疫し、抗血清を得た。
次に該抗血清をリン酸緩衝生理食塩水で予と平衡化した
プロティンA−セファロース4Bカラム(ファルマシア
社製)に流し、抗体を吸着させた後、吸着成分を溶出さ
せた。次に、このm 分ヲrPN274−セファロース
4Bカラム(宝酒造社製)に流し、次いで吸着成分を溶
出しリン酸緩衝生理食塩水に透析し、感作原の抗体を調
製し、次にこの抗体をラテックス粒子(種水化学社製)
に常法により感作した。
プロティンA−セファロース4Bカラム(ファルマシア
社製)に流し、抗体を吸着させた後、吸着成分を溶出さ
せた。次に、このm 分ヲrPN274−セファロース
4Bカラム(宝酒造社製)に流し、次いで吸着成分を溶
出しリン酸緩衝生理食塩水に透析し、感作原の抗体を調
製し、次にこの抗体をラテックス粒子(種水化学社製)
に常法により感作した。
実施例2
実施例1で調製した感作ラテツクスを用いて尿中FN細
胞接着ドメイン含有フラグメント測定キットを作製した
。
胞接着ドメイン含有フラグメント測定キットを作製した
。
キラ)(7)内容(1回分)を以下に示す:(1)抗体
感作ラテックス 25μβ実施例3 実施例2で調製したキットを用いて健常人又は良性疾患
4者及び癌患者の尿中FN細胞接着ドメイン含有フラグ
メント量を測定した。なお、同一試料について従来方法
である酵素免疫測定方法(特開昭63−269057号
公報記載)によっても測定し、両方法の関係を検討した
。
感作ラテックス 25μβ実施例3 実施例2で調製したキットを用いて健常人又は良性疾患
4者及び癌患者の尿中FN細胞接着ドメイン含有フラグ
メント量を測定した。なお、同一試料について従来方法
である酵素免疫測定方法(特開昭63−269057号
公報記載)によっても測定し、両方法の関係を検討した
。
キットの操作方法は以下のようにして行った。
(1)試料希釈液で試料の2n倍希釈系列を調製し、そ
の10μlをスライド板上のサークル内にとる。
の10μlをスライド板上のサークル内にとる。
(2)抗体感作ラテックス試薬を軽く振り均一にしてか
ら、スライド板のサークル内に25μm滴下する。
ら、スライド板のサークル内に25μm滴下する。
(3) かくはん棒でよくかくはん混合後、振とう装
置にのせ、振とう開始3分後に凝集の有無を判定する。
置にのせ、振とう開始3分後に凝集の有無を判定する。
(4)同時に標準液を用いて同様に操作を行い、試料中
の抗原濃度を決定する。
の抗原濃度を決定する。
その結果、第1図に示すように、本発明による測定方法
は、従来の酵素免疫測定方法と良好な相関性を示し、本
発明の検出方法により癌患者の尿中に高濃度のFN細胞
接着ドメイン含有フラグメントを検出することができた
。第1図は健常人又は良性疾患4者20例、癌患者21
例の尿中細胞接着ドメイン含有フラグメン) ([IF
N)の酵素免疫測定方法による測定値を横軸に、ラテッ
クス凝集方法において、凝集状態が判定される、試料の
最大希釈倍率を縦軸に示し、本発明の検出方法と、従来
の測定方法の相関性を示す図である。
は、従来の酵素免疫測定方法と良好な相関性を示し、本
発明の検出方法により癌患者の尿中に高濃度のFN細胞
接着ドメイン含有フラグメントを検出することができた
。第1図は健常人又は良性疾患4者20例、癌患者21
例の尿中細胞接着ドメイン含有フラグメン) ([IF
N)の酵素免疫測定方法による測定値を横軸に、ラテッ
クス凝集方法において、凝集状態が判定される、試料の
最大希釈倍率を縦軸に示し、本発明の検出方法と、従来
の測定方法の相関性を示す図である。
UFNの1ユニツトは、天然型FNの4pmoleに相
当する凝集活性を示すFN細胞接着ドメイン量を表す単
位である。
当する凝集活性を示すFN細胞接着ドメイン量を表す単
位である。
ラテックス凝集方法において、ラテックス粒子は標準物
質rFN274が0.5ユニット/−以上の場合に凝集
する。したがって、例えば希釈倍率8倍までの各試料希
釈液で凝集がみられ、16倍希釈液で凝集がみられない
場合、試料中には4、0〜B、 0 ニー’−ット/r
nlのrFN2T4に相当するFN細胞接着ドメインを
含有するフラグメントが存在すると検出される。実際に
、第1図中において、ラテックス凝集方法でUFH4,
0〜8.0ユニツト/rnlの値を示す試料は、酵素免
疫測定方法で測定値4.4ユニット/−を示す。また、
他の試料においても、本発明の簡便なラテックス凝集方
法によるUFHの測定値は、従来の高感度な酵素免疫測
定方法による測定値とよく対応している。
質rFN274が0.5ユニット/−以上の場合に凝集
する。したがって、例えば希釈倍率8倍までの各試料希
釈液で凝集がみられ、16倍希釈液で凝集がみられない
場合、試料中には4、0〜B、 0 ニー’−ット/r
nlのrFN2T4に相当するFN細胞接着ドメインを
含有するフラグメントが存在すると検出される。実際に
、第1図中において、ラテックス凝集方法でUFH4,
0〜8.0ユニツト/rnlの値を示す試料は、酵素免
疫測定方法で測定値4.4ユニット/−を示す。また、
他の試料においても、本発明の簡便なラテックス凝集方
法によるUFHの測定値は、従来の高感度な酵素免疫測
定方法による測定値とよく対応している。
本発明の方法及びキットを用いることにより、尿試料中
のFN細胞接着ドメイン含有フラグメントを高感度でか
つ正確に簡便に検出することができる。その結果、短時
間に大量の試料の測定が可能となり、集団検診等におけ
る癌の一次スクリーニングの労力、コストが軽減される
。
のFN細胞接着ドメイン含有フラグメントを高感度でか
つ正確に簡便に検出することができる。その結果、短時
間に大量の試料の測定が可能となり、集団検診等におけ
る癌の一次スクリーニングの労力、コストが軽減される
。
第1図は尿中のFN細胞接着ドメインを含有するフラグ
メントの測定結果を、本発明方法と従来方法と対比して
示すグラフである。
メントの測定結果を、本発明方法と従来方法と対比して
示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、ヒト尿試料を、フィブロネクチンの細胞接着ドメイ
ンに対する抗体を感作した担体粒子と混合し、担体粒子
の凝集状態を判定することを特徴とする癌の検出方法。 2、癌の検出用キットであって、フィブロネクチンの細
胞接着ドメインに対する抗体を感作した担体粒子を含有
することを特徴とする癌の検出用キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15163990A JPH0450653A (ja) | 1990-06-12 | 1990-06-12 | 癌の検出方法及びキット |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15163990A JPH0450653A (ja) | 1990-06-12 | 1990-06-12 | 癌の検出方法及びキット |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0450653A true JPH0450653A (ja) | 1992-02-19 |
Family
ID=15522955
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP15163990A Pending JPH0450653A (ja) | 1990-06-12 | 1990-06-12 | 癌の検出方法及びキット |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0450653A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06309647A (ja) * | 1993-04-28 | 1994-11-04 | Victor Co Of Japan Ltd | 磁気記録媒体及びその製造方法 |
CN103645331A (zh) * | 2013-12-24 | 2014-03-19 | 上海北加生化试剂有限公司 | 一种检测人尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒及其方法 |
CN103675299A (zh) * | 2013-12-24 | 2014-03-26 | 上海北加生化试剂有限公司 | 一种用于检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒及其方法 |
-
1990
- 1990-06-12 JP JP15163990A patent/JPH0450653A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06309647A (ja) * | 1993-04-28 | 1994-11-04 | Victor Co Of Japan Ltd | 磁気記録媒体及びその製造方法 |
CN103645331A (zh) * | 2013-12-24 | 2014-03-19 | 上海北加生化试剂有限公司 | 一种检测人尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒及其方法 |
CN103675299A (zh) * | 2013-12-24 | 2014-03-26 | 上海北加生化试剂有限公司 | 一种用于检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒及其方法 |
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