FI102217B - Menetelmä Pseudomonas aeruginosa-serotyyppien toteamiseksi näytteestä in vitro monoklonaalisten vasta-aineiden avulla, menetelmässä käytettä viä monoklonaalisia vasta-aineita sekä menetelmässä käyttökelpoinen te stipakkaus - Google Patents

Description

1 102217

Menetelmä Pseudomonas aeruginosa -serotyyppien toteamiseksi näytteestä in vitro monoklonaalisten vasta-aineiden avulla, menetelmässä käytettäviä monoklonaalisia vasta-aineita sekä menetelmässä käyttökelpoinen testipakkaus 5

Jakamalla erotettu hakemuksesta 865 027.

Keksintö koskee immunologista menetelmää, joka on käyttökelpoinen bakteeri-infektioiden diagnostisoinnissa, erityisesti Pseudomonas aeruginosa -serotyyppien diagnos-10 tisoinnissa. Tarkemmin sanottuna keksintö koskee menetelmää Pseudomonas aeruginosa -serotyyppien toteamiseksi näytteestä in vitro, jossa menetelmässä käytetään monoklonaalisia ihmisvasta-aineita tai niiden sitoutuvia fragmentteja, jotka reagoivat spesifisesti vähintään kahden 15 Pseudomonas aeruginosan IATS-serotyypin kanssa, ja muodostunut kompleksi todetaan. Keksintö koskee myös tässä menetelmässä käytettäviä monoklonaalisia ihmisvasta-aineita sekä testipakkausta, jota voidaan käyttää tässä menetelmässä .

20 Gram-negatiivisten bakteerien aiheuttama sairaus ja sen vakavimmat komplikaatiot, esimerkiksi bakteremia ja endotoksemia, aiheuttavat merkittävää sairastumista ja kuolleisuutta ihmispotilaissa. Tämä pätee erityisesti gram-negatiiviseen organismiin, Pseudomonas aeruginosaan, .' 25 joka on enenevässä määrin liittynyt bakteeri-infektioihin, erityisesti sairaalainfektioihin, viimeisten viidenkymmenen vuoden aikana.

Kirjallisuudessa esitetään joukko serotyypin määri-tysohjelmia, joita voitaisiin käyttää anti-Pseudomonasvas-30 ta-aineiden läsnäolon tutkimiseen solusupernatanteista.

: Ohjelmat perustuvat pääasiassa tämän organismin lämpösta- biileihin somaattisiin pääantigeeneihin (katso Zierdt, C.

H. teoksessa Glucose Nonfermenting Gram-Negative Bacteria in Clinical Microbiology, toim. Gilardi, G. L., CRC Press 35 1978, s. 213 - 238). SerotyypitysohjeImien lisääntyminen 2 102217 on tehnyt P. aeruginosan serologisten tutkimusten vertaamisen melko vaikeaksi, ja siten tietyn järjestelmän valinta supernatanttien tutkimista varten näyttää jossain määrin sattumanvaraiselta. Tyypitysjärjestelmien välistä se-5 kavuutta on jokin aika sitten vähentänyt IATS-järjestelmä (the International Antigenic Typing Scheme), jota on ehdottanut the Subcommitee on Pseudominadaceae of the International Commitee on Systematic Bacteriology rungoksi P. aeruginosan tarkempia serologisia tutkimuksia varten. Tämä 10 järjestelmä, joka sisältää 17 erilaista serotyyppiä, jotka merkitään IATS-tyyppi 1, IATS-tyyppi 2 jne., kattaa kaikki aiemmissa järjestelmissä identifioidut lämpöstabiilit somaattiset pääantigeenit. Katso Liu, P. V., Int. J. Syst. Bacteriol. 33 (1983) 256 - 264, joka mainitaan tässä viit-15 teenä.

Kehitettäessä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka reagoivat ristiin P. aeruginosa -kantojen kanssa, on edullista ottaa mukaan myös tyypitysohjelma, joka perustuu P. aeruginosan suojaaviin antigeeneihin. Tällainen ohjelma on 20 suunniteltu pyrittäessä kehittämään rokote kliiniseen käyttöön, ja sitä kuvataan yksityiskohtaisesti julkaisussa Fisher, M. V. et ai., J. Bacteriol. 93 (1969) 835 - 836.

Tämä järjestelmä, jota yleensä kutsutaan Fisher-tyypi-tysjärjestelmäksi, luokittelee pääosan tunnetuista P. 25 aeruginosa -kannoista seitsemään tyyppiin, joista käyte tään merkintöjä Fisher-immunotyyppi 1, Fisher-immunotyyppi 2 jne. IATS- ja Fisher-tyypitysjärjestelmien välistä korrelaatiota on selvitetty kirjallisuudessa (katso Liu, P. V. et ai., supra), ja se esitetään taulukossa I. Kuten 30 taulukosta I käy ilmi, ei ole olemassa vastaavia Fisher- immunotyyppejä tietyille IATS-serotyypeilie, vaikka kukin Fisher-immunotyyppi vastaa tiettyä IATS-serotyyppiä. IATS-ja Fisher-tyypitysjärjestelmien ollessa kyseessä, kummallekin serotyypin määritysjärjestelmälle tärkeiden antigee-35 nideterminanttien uskotaan sijaitsevan P. aeruginosan pin- 3 102217 ta-LPS-molekyyleilla [Liu, P. V. et ai., supra; Hanessien; F et ai., Nature 229 (1979) 209 - 210].

Taulukko I

5 Pseudomonas aeruginosan IATS- ja Fisher-tyypitysohjelmien vartailu ja korrelointi IATS Fisher 1 4 2 3 10 3 4 5 7 6 1 7 15 8 6 • · 9 10 5 11 2 12 20 13 14 15 16 17

Vuonna 1975 Kohler ja Milstein julkaisivat kehityskelpoisen havaintonsa, jonka mukaan tiettyjä hiirisolulin- 25 4 102217 joja voitiin fuusioida hiiren pernasoluihin, jolloin syntyy hybridoomia, joista kukin erittää yhdelle aineelle spesifistä vasta-ainetta, ts. monoklonaalisia vasta-aineita [Kohler, G. ja Milstein, C., Nature 256 (1975) 495 - 5 497]. Tämän tekniikan keksimisen myötä tuli mahdolliseksi tuottaa joissakin tapauksissa suuria määriä täysin spesifisiä hiiren vasta-aineita antigeeneillä oleville yhdelle tai useammalle determinantille.

Käyttämällä hybridoomatekniikkaa Sadoff et ai. ovat 10 raporttinsa mukaan tuottaneet hiiren monoklonaalista IgM-ryhmän vasta-ainetta P. aeruginosan tietyn serotyypin LPS-molekyylien O-ketjudeterminanttia vastaan (Abstracts of the 1982 Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, nro 253). He ilmoittavat lisäksi, että 15 tämä hiiren vasta-aine suojasi hiiret P. aeruginosan, joka oli samaa serotyyppiä kuin se, jota vastaan vasta-aineet suuntautuivat (ts. homologista serotyyppiä), tappavalta hyökkäykseltä. Muutamissa myöhemmissä artikkeleissa on esitetty yksityiskohtaisesti spesifisyydeltään erilaisten 20 hiiren ja ihmisen monoklonaalisten anti-P. aeruginosa -LPS-vasta-aineiden kehittämistä; esimerkiksi Sawada, S. et ai., J. Inf. Dis. 150 (1984) 570 - 576; Sadoff, J. et ai., Antibiot. Chemother. 36 (1985) 134 - 146; Hancock, R. et ai., Infect. Immun. 37 (1982) 166 - 171; Siadak, A. W. 25 ja Lonstrom, M. E. teoksessa Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, toim. Engleman, E. G. et ai., Plenum Publishing Corp. 185, (s. 167 - 185; ja Sawada, S. et ai., J. Inf. Dis. 152 (1985) 965 - 970. Serotyyppispesifisten ihmisen monoklonaalisten anti-P. aeruginosa -LPS-vasta-30 aineiden tuotantoa ja immunoterapeuttista käyttöä kuva-taan avoinna olevissa US-patenttihakemuksissa 734 642 ja 828 005, jotka mainitaan tässä viitteenä.

Vaikka joissakin tilanteissa, kuten silloin kun infektio voidaan jäljittää yhden tietyn serotyypin aiheut-35 tamaksi, voi olla tiettyjä etuja yhdelle P. aeruginosa s 102217 -serotyypille spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden käytöstä, eivät ne olisi edullisia monissa muissa tilanteissa.

Siten on olemassa merkittävä tarve saada aikaan 5 ihmisen monoklonaalisia anti-P. aeruginosa -vasta-aineita, joilla on kyky tunnistaa useita P. aeruginosa -serotyyppe-jä.

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää Pseudomonas aeruginosa -serotyyppien toteamiseksi näytteestä in vitro, 10 jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että näyte saatetaan kosketukseen mahdollisesti leimattujen monoklonaalisten ihmisvasta-aineiden kanssa, jotka reagoivat spesifisesti vähemmän kuin kaikkien mutta vähintään kahden Pseudomonas aeruginosan IATS-serotyypin kanssa, tai niiden 15 sitoutuvien fragmenttien kanssa, ja muodostunut kompleksi todetaan, jolloin monoklonaaliset vasta-aineet ovat valmistettavissa solulinjan ATCC-nro CRL 8941, 9171 tai 9258 avulla.

Keksintö koskee myös monoklonaalisia ihmisvasta-20 aineita sekä testipakkausta käytettäväksi Pseudomonas aeruginosa -serotyyppien toteamiseksi niin kuin patenttivaatimuksissa esitetään.

Tämä keksintö tarjoaa käytettäväksi uusia soluja, jolla on kyky tuottaa ihmisen monoklonaalisia vasta-ainei-25 ta, ja tällaisia vasta-aineita sisältäviä koostumuksia, joilla on kyky selektiivisesti tunnistaa useita, ja joissakin tapauksissa kaikki P. aeruginosa -kannat, jolloin yksittäiset vasta-aineet tyypillisesti tunnistavat P. aeruginosan useita IATS-serotyyppejä ja ei yhtään tai yh-30 den tai useampia Fisher-immunotyyppejä. Kyseessä olevissa • soluissa on identifioitavissa olevia kromosomeja, joissa niiden tai esiastesolun solulinja-DNA on järjestäytynyt koodaamaan vasta-ainetta, jolla on sitoutumiskohta tietyille P. aeruginosa -serotyypeille yhteiselle epitoopil- 6 102217 le. Näitä ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää monin tavoin diagnosointiin.

Tässä keksinnössä käytetyt solut ovat tyypillisesti transformoituja ihmislymfosyyttejä, jotka tuottavat mono-5 klonaalisia ihmisvasta-aineita P. aeruginosan saavutettavissa olevia LPS-molekyylejä vastaan. "Saavutettavissa olevalla" tarkoitetaan sitä, että LPS-molekyylit ovat fysikaalisesti saatavilla käyttöympäristössä suoraan vuorovaikutukseen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa.

10 Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus voidaan toteuttaa tekemällä pysyväksi nukleiinihapposekvenssien, jotka koodaavat P. aeruginosan useiden serotyyppien LPS-molekyyleillä olevalle epitoopille spesifisiä vasta-aineita, ilmentyminen. Monoklonaalisia vasta-aineita tuotetaan 15 tyypillisesti transformoimalla soluohjatusti Epstein-Barr-viruksella (EBV:llä) B-lymfosyyttisolut, joita saadaan ihmisluovuttajista, jotka ovat tai ovat olleet alttiina yhdelle tai useammalle asianmukaiselle P. aeruginosa -se-rotyypille. Siten tuotettuja vasta-aineita erittäviä solu-20 linjoja luonnehditaan jatkuvasti kasvaviksi lymfoblastoi- disoluiksi, joilla on diploidinen karyotyyppi, jotka ovat Epstein-Barr-tuma-antigeenipositiivisia ja jotka erittävät monoklonaalista vasta-ainetta, joka on IgG-, IgM-, IgA-tai IdD-isotyyppiä, mukaan luettuina erilaiset alatyypit, 25 kuten IgGl, IgG2, IgG3 ja IgG4. Itse soluohjattua trans-formointiprosessia kuvataan yksityiskohtaisesti US-patenttijulkaisussa 4 464 465, joka mainitaan tässä viitteenä. Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää kokonaisina tai fragmentteina, kuten Fv-, Fab- ja F (ag') 2-fragmenttei-30 na, tavallisesti kuitenkin kokonaisina.

Vasta-aineina tuottavia solulinjoja voitaisiin vaihtoehtoisesti tuottaa tekemällä solufuusio sopivalla lääkkeellä merkittyjen ihmisen myelooma-, hiiren myeloo-ma-, ihmis-hiiri-heteromyelooma- tai ihmisen lymfoblastoi- 7 102217 disolujen ja ihmisen B-lymfosyyttien kesken, jolloin saadaan ihmishybridisolulinjoja.

Lymfoblastoidi- tai hybridisolulinjoja voidaan kloonata ja tutkia tavanomaisin menetelmin vasta-aineilla, 5 joilla on kyky sitoutua solusupernatanteissa havaittujen erilaisten P. aeruginosa -serotyyppien epitooppeihin. Keksinnön eräänä kohteena ovat ihmisen monoklonaaliset vasta-aineet, jotka pystyvät spesifisesti sitoutumaan lipopoly-sakkaridideterminantteihin, jotka ovat läsnä useissa, mut-10 tei kaikissa P. aeruginosan IATS-serotyypeissä. Determinantit voivat olla läsnä esimerkiksi kahdessa tai kolmessa IATS-serotyypissä, ja ei yhdessäkään yhdessä tai vähintään kahdessa Fisher-immunotyypissä.

Tämän keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-ai-15 neita voidaan käyttää monella tavalla in vitro. Esimerkkeinä mainittakoon, että monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää tyypitykseen, tiettyjen P. aeruginosa -kantojen eristämiseen, heterogeenisessa soluseoksessa olevien P. aeruginosa -solujen selektiiviseen poistamiseen 20 tai vastaaviin tarkoituksiin.

Käytettäessä monoklonaalisia vasta-aineita diagnostisiin tarkoituksiin ne voivat olla joko leimattuja tai leimaamattomia. Diagnostisissa määrityksissä detektoidaan tyypillisesti kompleksi, joka muodostuu monoklonaalisen :* 25 vasta-aineen sitoutuessa P. aeruginosa -organismin LPS:ään. Leimaamattomia vasta-aineita voidaan käyttää agglutinaatiotutkimuksiin. Leimaamattomia vasta-aineita voidaan lisäksi käyttää yhdessä muiden, leimattujen vasta-aineiden (toisten vasta-aineiden) kanssa, jotka reagoivat 30 monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, kuten yhdessä immu-\ noglobuliinille spesifisten vasta-aineiden kanssa. Vaih toehtoisesti monoklonaaliset vasta-aineet voidaan leimata suoraan. Voidaan käyttää monia erilaisia merkkiaineita, kuten radionuklideja, fluoresoivia aineita, entsyymejä, 35 entsyymien substraatteja, entsyymien kofaktoreita, entsyy- 8 102217 mien inhibiittoreita, ligandeja (erityisesti hapteeneja) jne. On käytettävissä monen tyyppisiä immuunimäärityksiä, joista joitakin esimerkkejä kuvataan US-patenttijulkaisuissa 3 817 827, 3 850 752, 3 901 654, 3 935 074, 5 3 984 533, 3 996 345, 4 034 074 ja 4 098 876, jotka kaikki mainitaan tässä viitteinä.

Tämän keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita käytetään yleisesti entsyymi-immuunimäärityksissä, joissa kyseessä olevat vasta-aineet, tai toisesta lajista 10 peräisin olevat toiset vasta-aineet, konjugoidaan entsyymiin. Kun tiettyä serotyyppiä olevaa P. aeruginosaa sisältävä näyte, kuten ihmisveri tai siitä tehty lysaatti, yhdistetään kyseessä oleviin vasta-aineisiin, tapahtuu sitoutuminen vasta-aineiden ja halutun epitoopin sisältävien 15 molekyylien välillä. Tällaiset solut voidaan sitten erottaa sitoutumattomista reagensseista ja lisätä toinen (entsyymillä leimattu) vasta-aine. Sen jälkeen määritetään soluihin spesifisesti sitoutuneen vasta-aine-entsyymikon-jugaatin läsnäolo. Myös muita alan ammattimiesten hyvin 20 tuntemia tavanomaisia menetelmiä voidaan käyttää.

Keksinnön mukaiset testipakkaukset sopivat käytettäviksi yhdessä keksinnön mukaisten vasta-aineiden kanssa P. aeruginosa -infektion tai P. aeruginosa -antigeenin läsnäolon toteamiseksi. Niinpä tämän keksinnön mukainen 25 monoklonaalisia vasta-aineita sisältävä koostumus voidaan toimittaa, tavallisesti kylmäkuivattuna, joko yksinään tai yhdistettynä muihin vasta-aineisiin, jotka ovat spesifisiä muille gram-negatiivisille bakteereille. Pakkauksiin sisältyvät vasta-aineet, jotka voivat olla liitettyinä merk-30 kiaineeseen tai leimaamattomia, sekä puskurit, kuten : Tris-, fosfaatti-, karbonaatti- jne. puskurit, stabiloin tiaineet, biosidit, inertit proteiinit, esimerkiksi naudan seerumialbumiini, tms. Yleensä näitä aineita on läsnä vähemmän kuin noin 5 paino-% aktiivisen vasta-aineen määräs-35 tä, ja yleensä niiden kokonaismäärä on vähintään noin 9 102217 0,001 paino-% vasta-aineena määrästä. Usein on toivottavaa sisällyttää koostumukseen inerttiä jatkeainetta aktiivisten aineosien laimentamiseksi, ja jatkeaineen osuus voi olla noin 1-99 paino-% kokonaiskoostumuksesta. Kun käy-5 tetään toista vasta-ainetta, jolla on kyky sitoutua mono-klonaaliseen vasta-aineeseen, on se yleensä erillisessä astiassa. Toinen vasta-aine on tyypillisesti liitettynä merkkiaineeseen, ja se formuloidaan vastaavalla tavalla kuin edellä kuvatut vasta-aineformulat.

10 Tämän keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-ai neet voidaan kylmäkuivata varastointia varten ja sekoittaa takaisin sopivaan kantajaan ennen käyttöä. Tämä menetelmä on osoittautunut tehokkaaksi tavanomaisten immunoglobulii-nien yhteydessä, ja voidaan käyttää alalla tunnettuja kyl-15 mäkuivaus- ja käyttöliuoksen sekoitusmenetelmiä. Alan ammattimiehet tietävät, että kylmäkuivaus ja sekoitus uudelleen käytt©liuokseksi voivat johtaa vaihtelevan asteiseen vasta-aineen aktiivisuushäviöön (esimerkiksi tavanomaisten immunoglobuliinien yhteydessä IgM-vasta-aineilla on taipu-20 mus kärsiä suuremmista aktiivisuushäviöistä kuin IgG-vas-ta-aineilla) ja että käyttömäärät saatetaan joutua säätämään tämän häviön kompensoivalla tavalla.

Esimerkki I

Esimerkki I valaisee menetelmiä IATS-serotyyppien : 25 2,5 ja 16 ja Fisher-immunotyyppien 3 ja 7 kanssa reagoi vien monoklonaalisten ihmisvasta-aineiden (IgM-isotyyppi) tuottamiseksi.

Ihmisen B-solujen lähteenä toimi ääreisverinäyte, joka oli saatu kystistä fibroosia sairastavalta potilaal-30 ta, jolla tiedettiin olevan krooninen P. aeruginosa -in-fektio. Yksitumaiset solut erotettiin verestä tavanomaisin sentrifugointimenetelmin Ficoll-Paquella [Boyum, A; Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21, Suppl. 97 (1968) 77 - 98] ja pestiin kahdesti kalsiumista/magnesiumista vapaassa fos-35 faattipuskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa (PBS).

10 102217

Yksisoluiset solut puhdistettiin T-soluista käyttämällä muunnettua E-rosettimenettelyä. Lyhyesti kuvattuna solut suspendoitiin ensin pitoisuudeksi 1 x 107 solua/ml PBS:ään, joka sisälsi 20 % naudan sikiöseerumia (FCS), 5 lämpötilassa 4 °C. 1 ml tätä suspensiota laitettiin sitten pyöreäpohjaiseen polystyreeniputkeen, jonka mitat olivat 17 x 100 mm ja johon lisättiin 1 x 109 2-amino-isotiouro-niumbromidilla (EET) käsiteltyä lampaan punasolua, jotka olivat 10-%:isena (tilavuusprosenttia) liuoksena Iscoven 10 muunnetussa Dulbeccon väliaineessa (Iscoven-väliaineessa) [Madsen, M. ja Johnson, H. E., J. Immun. Methods 27 (1979) 61 - 74] . Suspensiota sekoitettiin hyvin varovasti 5-10 min lämpötilassa 4 °C, ja poistettiin E-rosettisolut sitten sentrifugoimalla 8 min Ficoll-Paquella kiihtyvyydellä 15 2 500 x g lämpötilassa 4 °C. E-rosettinegatiiviset yksitu maiset ääreisverisolut (E'PBMC), jotka muodostivat vyöhykkeen rajapinnalle, kerättiin, pestiin kerran Iscoven-väliaineella ja suspendoitiin takaisin samaan väliaineeseen, joka sisälsi 15 tilavuus-% FCS:ää, L-glutamiinia 20 (2 mmol/1), penisilliiniä (100 ky/ml), streptomysiiniä (100 μg/ml), hypoksantiinia (1 x 1C4 mol/1), aminopteriiniä (4 x 10'7 mol/1) ja tymidiiniä (1,6 x 10‘5) mol/1) . Tätä väliainetta kutsutaan tästedes HAT-väliaineeksi.

E'PBMC:n soluohjattu transformointi tehtiin vilje-; 25 lemällä näitä soluja yhdessä transformoivan soluiinjän kanssa. Transformoiva solulinja oli Epstein-Barr-tuma-an-tigeenipositiivinen (EBNA-positiivinen) ihmisen lymfoblas-toidisolulinja, joka oli johdettu GM 1500-lymfoblastoidi-solulinjan etyylimetaanisulfonaatti (EMS) -mutageneesilla ja 30 sitä seuraavalla valikoinnilla 6-tioguaniinin (30 μg/ml) ‘ läsnäollessa, jolloin soluista tuli hypoksantiini-guanii- nifosforibosyylitransferaasin (HGPRT) suhteen vajaukseni -sia ja siten HAT:lie herkkiä. Tämä solulinja on nimetty 1A2-soluiinjaksi ja talletettu the American Type Culture 35 Collectioniin (ATCC) 29. maaliskuuta 1983 ATCC-numeroila u 102217 CRL 8119. Logaritmisen kasvun vaiheessa olevat lA2-solut suspendoitiin HAT-väliaineeseen ja yhdistettiin sitten E"PBMC-soluihin suhteessa 8 1A2-solua / 1 E~PBMC-solu.

Soluseos siirrostettiin kahdeksalle pyöreäpohjaiselle 96-5 syvennyksiselle mikrotiitterimaljalle (Costar 3799) pitoisuudeksi 72 000 solua/syvennys tilavuuden ollessa 200 μΐ/ syvennys ja inkuboitiin lämpötilassa 37 °C kostutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % C02. Viljelmille annettiin lisäravintoa 5. ja 8. päivänä siirrostuksen jälkeen kor-10 vaarnalla puolet supernatantista tuoreella HAT-väliaineel-la. Soluja tarkkailtiin joka toinen päivä käänteismik-roskoopilla merkkien havaitsemiseksi solujen proliferaa-tiosta. 12 päivän kuluttua siirrostuksesta havaittiin, että 100 % syvennyksistä sisälsi lisääntyviä soluja ja 15 että useimmissa syvennyksissä soluja oli riittävän tiheässä, poistamista ja supernatanttien tutkimista anti-P. aeruginosa -vasta-aineen suhteen, varten.

Supernatanteista tutkittiin anti-P. aeruginosa -vasta-aineiden läsnäolo käyttämällä ELISA-menetelmää. 20 Antigeenilevyt olivat tasapohjaisia 96-syvennyksissä mikrot iitterilevyjä (Immulon II, Dynatech), joiden syvennykset sisälsivät erilaisia syvennyksen pohjalle adsorboituja eläviä bakteereja. Bakteerien absorboimiseksi muoviin inkuboitiin 50 μΐ/syvennys poly-L-lysiiniä (PLL) (1 μg/ml 25 PBSrssä, pH 7,2) 30 min huoneen lämpötilassa. Adsorboitu-maton PLL poistettiin sitten, levyt pestiin kerran PBSrllä, lisättiin kuhunkin syvennykseen 50 μΐ pestyä bak-teerisuspensiota (00^=0,2) PBS:ssä, ja inkuboitiin levyjä 1 tunti lämpötilassa 37 °C. Adsorboitumattomat bakteerit 30 poistettiin pesemällä levyt kolmesti Tweeniä sisältävällä fysiologisella suolaliuoksella (0,9 % NaCl, 0,05 tila-vuus-% Tween-20). Tutkimuksessa käytetyt erilaiset antigeenilevyt olivat: (1) P. aeruginosa -Fisher-immunotyyppien 1, 2 ja 4 seos (ATCC-nro 27312, 27313 ja 27315); (2) 35 P. aeruginosa -Fisher-immunotyyppien 3, 5, 6 ja 7 seos 12 102217 (ATCC-nro 27314, 27316, 27317 ja vastaavasti 27318) ; ja (3) mikrotiitterilevy ilman bakteereja.

ELISA aloitettiin suojaamalla ensin levyt suojaus-puskurilla [200 μΐ/syvennys, PBS, pH 7,2, joka sisälsi 5 % 5 (paino/tilavuus) rasvatonta kuivamaitoa, 0,01 ti]avuus-% Antifoam A:ta (Sigma) ja 0,01 % (paino/tilavuus) timero-salia] , käsittelyaika 60 min huoneen lämpötilassa. Suojauksen jälkeen levyt pestiin kolmesti Tweeniä sisältävällä fysiologisella suolaliuoksella. Kaikkiin syvennyksiin 10 laitettiin sitten 50 μΐ PBS:ää, pH 7,2 sisälsi 0,1 % Tween-20:tä ja 0,2 % (paino/tilavuus) naudan seerumialbu-miinia (BSA). Viljelmälevyjen syvennysten supernatantit replikasiirrostettiin vastaaviin antigeenilevyjen syvennyksiin (50 μΐ/syvennys), ja levyjä inkuboitiin 30 min 15 huoneen lämpötilassa. Sitten supernatantit poistettiin, syvennykset pestiin kolmesti Tweeniä sisältävällä fysiologisella suolaliuoksella, ja syvennyksiin lisättiin 50 μΐ asianmukaisella tavalla laimennettua piparjuuriperoksidaa-siin (HRP) liitettyä vuohen anti-ihmis- (IgG + IgN) -vasta-20 ainetta (American Qualex International # A1114 + # A1124). Tässä esimerkissä HRP (vuohen anti-IgG):n ja HRP(vuohen anti-IgM):n lopullinen laimennussuhde oli 1:5 000 ja vastaavasti 1:3 000 PBS:SSä, pH 7,2, joka sisälsi 0,05 % Tween-20:tä ja 0,1 % BSA:ta. Kun oli inkuboitu 30 min huo-25 neen lämpötilassa, ylimääräiset entsyymiin liitetyt vuohen vasta-aineet poistettiin, ja syvennykset pestiin kolmesti Tweeniä sisältävällä fysiologisella suolaliuoksella. Sitten kuhunkin syvennykseen lisättiin 100 μΐ substraattia (0,8 mg/ml o-fenyleenidiamiinidihydrokloridia 100 mM sit-30 raattipuskurissa, pH 0,5 + 0,03 % H202 deionisoidussa ve- 4 ! dessä, sekoitetaan yhtä suuret tilavuudet juuri ennen le vylle siirtämistä). Kun oli inkuboitu pimeässä 30 min, lisättiin kaikkiin syvennyksiin 50 μΐ 3 N H2S04 reaktioiden pysäyttämiseksi. Viljelmäsupernatantit, jotka sisälsivät 35 levyllä olevan antigeenin kanssa reagoivia vasta-aineita, 13 Ί 02217 detektoitiin vastaavissa syvennyksissä tapahtuvan värinke-hityksen avulla, ja reaktion voimakkuus määritettiin kvantitatiivisesti mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 490 nm Bio-Tek EL-310-mikro-ELISA-mittarilla.

5 Viljelmäsupernatanttien analysointi edellä kuvatul la menetelmällä johti kahden syvennyksen (1C1 ja 2H12) identifiointiin, jotka sisälsivät anti-P. aeruginosa -vasta-aineita, jotka reagoivat Fisher-immunotyyppejä 3, 5, 6 ja 7 sisältävän levyn kanssa, mutta eivät Fisher-immuno-10 tyyppejä 1, 2 ja 4 sisältävän eivätkä bakteerittoman levyn kanssa. Jotta saataisiin identifioiduksi tunnistetut yksi tai useampi nimenomainen Fisher-immunotyyppi, valmistettiin kustakin immunotyypistä antigeenilevyt, jotka sisälsivät vain yhtä Fisher-immunotyyppiä olevia PLL-kiinnitet-15 tyjä bakteereja. ELISA-kokeen tekeminen edellä kuvatulla tavalla yksittäisiä immunotyyppejä sisältävillä levyillä syvennyksistä 1C1 ja 2H12 saaduille viljelmäsupernatan-teille osoitti, että nämä kaksi syvennystä sisälsivät vasta-ainetta, joka oli spesifinen sekä Fisher-immunotyypille 20 3 että 7. Samanlainen ELISA, joka tehtiin sarjalla P.

aeruginosa -IATS-tyyppikantoja (saatiin ATCC:sta ja sisälsi nro 33348 - 33364), osoitti, että syvennyksissä 1C1 ja 2H12 ollut vasta-aine reagoi spesifisesti IATS-kantojen 2, 5 ja 16 kanssa.

I! 25 Syvennyksissä 1C1 ja 2H12 olleiden yhden tai useam man reagoivan vasta-aineen isotyyppi määritettiin muuten samanlaisella ELISA-määrityksellä kuin spesifisyystesteis-sä, mutta HRP(vuohen anti-ihmis-IgG) ja HRP(vuohen anti-ihmis-IgM) käytettiin yksittäisinä toisen vaiheen reagens-30 seinä eikä yhdistettyinä. Syvennysten 1C1 ja 2H12 yhden .· tai useamman vasta-aineen positiivinen reaktio Fisher-im- munotyyppien 3 ja 7 kanssa havaittiin vain anti-IgM-rea-gensseilla, mikä osoittaa, että kunkin syvennyksen merkityksellinen yksi tai useampi vasta-aine on IgM-isotyyppiä.

14 102217

Sen määrittämiseksi, aiheuttiko anti-Fisher-immuno-tyyppi 3 ja 7 reaktiomallin yksi vai useampi syvennysten 1C1 ja 2H12 vasta-aine <ts. yksi vasta-aine, joka reagoi sekä Fisher-immunotyypin 3 että 7 kanssa, vai kaksi vasta-5 ainetta, joista toinen reagoi Fisher-immunotyypin 3 ja toinen Fisher-immunotyypin 7 kanssa), viljeltiin kummankin syvennyksen soluja pienenä tiheytenä, ja tutkittiin lisääntyviä soluja sisältävistä syvennyksistä vasta-aineak-tiivisuus erillisillä Fisher-immunotyyppi 3 ja Fisher-im-10 munotyyppi 7 bakteeriantigeenilevyillä. Alaviljely tehtiin 96-syvennyksisillä pyöreäpohjaisilla levyillä tiheytenä 5 solua/syvennys kaikkiaan 100 μΐ-.ssa HAT-väliainetta, josta puuttuu aminopteriinikomponentti (HT-väliaine). Transfor-moimattomia, HAT:lie herkkiä lymfoblastoidisoluja sisälly-15 tettiin kaikkiin syvennyksiin 500 solua/syvennys syöttö-soluiksi. Neljän päivän kuluttua siirrostuksesta kaikkiin syvennyksiin lisättiin 100 μΐ HAT-väliainetta syöttösolujen tappamiseksi selektiivisesti. Syvennyksiin lisättiin 9. päivänä siirrostuksen jälkeen lisäravintoa korvaamalla 20 puolet supernatantista HAT-vällaineella. Sen jälkeen syvennyksiin lisättiin samalla tavalla 4-5 päivän välein HT-väliainetta, kunnes lymfoblastoidisolujen tiheys syvennyksissä oli riittävä supernatantin analysoimiseksi ELISA:11a. Tutkittaessa yksittäistä Fisher-immunotyypin 3 25 ja Fisher-immunotyypin 7 antigeeniä sisältävillä levyillä kaikki supernatantit, jotka reagoivat Fisher-immunotyypin 3 kanssa, reagoivat myös Fisher-immunotyypin 7 kanssa, mikä osoittaa, että yksi vasta-aine aiheutti aktiivisuuden kummankin Fisher-immunotyypin suhteen. Tutkittaessa sattu-30 manvaraisesti valittuja supernatantteja IATS-kantojen 2, 5 ja 16 kanssa niiden havaittiin reagoivan kaikkien kolmen kannan kanssa yksittäisten kantojen sijasta, mikä edelleen tukee sitä päätelmää, että yksi vasta-aine ristireagoi Fisher-immunotyyppi en 3 ja 7 ja IATS-kantojen 2, 5 ja 16 35 kanssa.

1β 102217

Syvennyksien 1C1 ja 2H12 spesifistä vasta-ainetta tuottavien solujen kloonaus toteutettiin tekemällä kunkin syvennyksen soluille useita rajalaimennuskloonauksia, kunnes kaikki edellä mainitulla ELISA-ohjelmalla analysoidut 5 kloonisupernatantit antoivat tulokseksi positiivisten reaktion Fisher-immunotyyppien 3 ja 7 ja IATS-kantojen 2, 5 ja 16 kanssa. Kloonauksessa käytettiin syöttösoluja edellä alaviljelyn yhteydessä kuvatulla tavalla. Tällä tavalla saatiin kaksi kloonattua transformoitua ihmissolu-10 linjaa (1C1 ja 2H12), jotka ovat jatkuvia (kuolemattomia) ja jotka molemmat erittävät Fisher-immunotyyppien 3 ja 7 ja IATS-kantojen 2, 5 ja 16 kanssa reagoivaa monoklonaa-lista ihmisvasta-ainetta. Tässä esimerkissä käytetään so-lulinjasta ja sen tuottamasta vasta-aineesta samaa merkin-15 tää.

Esimerkki II

Esimerkki II valaisee menetelmiä IATS-serotyyppien 2, 5 ja 16 ja Fisher-immunotyyppien 3 ja 7 kanssa reagoivan monoklonaalisen ihmisvasta-aineen (IgG-isotyyppi) 20 tuottamiseksi. Tuotanto-ohjelmat ovat suurin piirtein sa manlaiset kuin esimerkissä I. Lyhyesti ilmaistuna ihmisen B-solujen lähteenä toimi ääreisverinäyte, joka saatiin kystistä fibroosia potevalta potilaalta, jolla oli ollut krooninen P. aeruginosa -infektio. Yksisoluiset solut ero-; 25 tettiin muuten esimerkissä I kuvatulla tavalla, mutta käy tettiin 1,6 ml PBS-suspensiota 1,6 x 109 AET-käsitellyn lampaan punasolun kanssa. Soluohjattu transformointi tehtiin myös samalla tavalla seuraavin poikkeuksin: 1A2- ja E"PBMC-solujen suhde oli 7,5; käytettiin 15 levyä, joissa 30 solutiheys oli 17 000/syvennys; viljelmille annettiin li-. säravintoa 6. ja 10. päivänä siirrostuksen jälkeen; ja 16 päivän kuluttua siirrostuksesta lähes kaikki syvennykset sisälsivät lisääntyviä soluja.

Spesifisten vasta-aineiden tutkiminen viljelmäsu-35 pernatanteista tehtiin kuvatulla tavalla, ja se johti yh- 16 102217 den syvennyksen (9D1) löytämiseen, joka sisälsi vasta-ainetta, joka reagoi Fisher-immunotyyppejä 3, 5, 6 ja 7 sisältävän levyn kanssa, muttei Fisher-immunotyyppejä 1, 2 ja 4 sisältävän eikä bakteerittoman levyn kanssa. Kuvatun 5 ELISA-määrityksen tekeminen yksittäisen immunotyypin tai serotyypin bakteeriantigeeniä sisältävillä levyillä käyttämällä 9Dl-viljelmän supernatanttia osoitti vasta-aineen, joka oli spesifinen kummallekin Fisher-immunotyypille 3 ja 7 samoin kuin IATS-kannoille 2, 5 ja 16. Esimerkin I mu-10 kaisesti tehdyt jatkokokeet osoittivat, että syvennyksessä 9D1 havaittu vasta-ainespesifisyys liittyi yhteen klooniin, joka eritti IgG-isotyypin vasta-ainetta.

Esimerkki III

Esimerkki III osoittaa joidenkin tämän keksinnön 15 mukaisten vasta-aineiden antigeenispesifisyyden.

Sen määrittämiseksi, reagoivatko vasta-aineet 1C1, 2H12 ja 9D1 saman antigeenikohteen kanssa ja ovatko ne siten identtisiä, tehtiin lisäkokeita. Vasta-aineita verrattiin ensin ELISA:ssa käyttämällä sarjaa referenssikan-20 toja ja kliinisesti eristettyjä P. aeruginosa -näytteitä.

ELISA-ohjelma oli edellä kuvatun kaltainen seuraavin muunnoksin: 1) PLL-päällystettyjen levyjen pinnoille adsorboitujen bakteerien sijasta levyn syvennykset sisälsivät erilaisia kokonaisia bakteereja, jotka oli kiinnitetty etanoli 25 lilla syvennyksen pohjaan. Levyt preparoitiin lisäämällä 50 μΐ pestyjen bakteerien suspensiota (00^=0,2) PBS:ssä syvennyksiin, sentrifugoimalla levyjä 20 min kiihtyvyydellä 500 x g, imemällä pois PBS, lisäämällä 75 μΐ etanolia 10 min:n ajaksi, poistamalla etanoli ja ilmakuivaamalla 30 sitten. Antigeenilevyillä olivat IATS-kannat 2, 5, 11 ja .· 16 (ATCC-nro 33349, 33352, 33358 ja vastaavasti 33363) ja 16 kliinisesti eristettyä näytettä, jotka oli ennalta tyypitetty sekä agglutinoimalla Difcon (Detroit, Michigan) Bacto-Pseudomonas aeruginosa-antiseerumin kanssa valmista-35 jän ohjeiden mukaisesti että ELISA:11a (tässä kuvatulla it 102217 tavalla) serotyypeiksi 2, 5, 16 tai näiden serotyyppien yhdistelmäksi; 2) kaniinin tyypitysantiseerumeja käytettiin laimennettuina suhteessa 1:500 PBS:llä lukuun ottamatta anti-IATS 16, joka laimennettiin suhteessa 1:250.

5 Viljelmäsupernatantit, jotka sisälsivät 1C1-, 2H12- ja 9Dl-vasta-aineita, käytettiin sellaisinaan; 3) toisen vaiheen reagensseina käytettiin biotinyloitua proteiini A:ta (B-2001, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) laimennettuna suhteessa 1:500 ja biotinyloitua vuohen anti-10 ihmis-Ig:tä (4703, Tago, Inc., Surlingame, CA) laimennettuna suhteessa 1:500 kaniinin ja vastaavasti ihmisen vasta-aineiden detektointiin. 50 μΐ reagenssia lisättiin asianmukaisiin syvennyksiin, sitoutumaton reagenssi poistettiin, kun oli inkuboitu 30 min huoneen lämpötilassa, ja 15 syvennykset pestiin kolmesti. Sitten kuhunkin syvennykseen lisättiin 50 μΐ ennalta muodostettua avidiinin ja biotiny-loidun piparjuuriperoksidaasin kompleksia (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Kun oli inkuboitu 30 min huoneen lämpötilassa, ylimääräinen 20 Vectastain ABC-reagenssi poistettiin, ja syvennykset pestiin uudelleen kolmesti ennen substraatin lisäämistä.

Kuten taulukossa II esitetään, kokeen tulokset osoittivat, että vaikka vasta-aineet 1C1 ja 9D1 reagoivat jokaisen kliinisesti eristetyn näytteen kanssa, joka oli ; 25 tyypitetty IATS 2-, 5- tai 6-serotyypiksi, ei vasta-aine 2H12 reagoinut kolmen tällaisen näytteen kanssa. Tämä viittaa siihen, että vasta-aine 2H12 tunnisti eri epitoo-pin kuin 1C1 ja 9D1 ja että nämä kaksi epitooppia esiintyvät ilmeisesti rinnakkaisina useimmilla muttei kaikilla 30 kliinisesti eristetyillä näytteillä, jotka vastaavat IATS-, serotyyppejä 2, 5 tai 16.

1β 102217

Taulukko II

Dlfcon bacto-P. aeruginosa -antiseerumien ja xnonoklonaa-listen ihmisvasta-aineiden 2H12, 1C1 ja 9D1 reagointi tyyppikantojen ja kliinisesti eritettyjen P. aeruginosa 5 -näytteiden kanssa

Tyyppikanta tai Kaniini____Ihminen _ kliinisesti eristet- ——.

tv näyte IATS IATS IATS IATS MAb MAb MAb __a2 a5 ai 6 all 2H12 1C1 9D1 10 IATS 2__+__-__-__-__+__+__+_ IATS 5__( + )* +__-__-__+__+__+_ IATS 16__( + )a (a) * +__-__+__+___+_ IATS 11__:__-__-__+__:__- _ A5 23 + + -- + + + 15 B406 + + (+)* - _+_ + + C27__+__+__-__-__+__+__+ D26__+__+__-__-__+__+__+ F155__+__+__+_____+__+__+ F225__+__( + )a +__-__+__+__+_ 20 F250 + + -_ ~_ + + + F253__:__+__:__-__+__+__+_ F255__+__+__:__:__-__+____+_ F256__+__-__:__-__-__+__+_ F396__+__+__+__-__+__+__+ 25 H217__+__+__+__-__+__+__+_ H218__+__+__-__-__+__+ +_ H219__-__+__-__:__+__+ +_ H220 + + - + + + H221 + + ---+ + 30 , a(+) = ELISA-reaktio hyvin heikosti positiivinen.

Tulokset viittasivat lisäksi siihen, että vasta-aineiden 1C1 ja 9D1 tunnistama molekyylikohde oli todennä-35 köisesti läsnä kaikilla kliinisesti eristetyillä P. aeruginosa -näytteillä, jotka voitiin tyypittää kuuluviksi 19 102217 IATS-serotyyppiin 2, 5 tai 16, kun taas vasta-aineen 2H12 tunnistama kohde esiintyi tällaisten eristettyjen näytteiden alaryhmällä.

Sen määrittämiseksi, reagoivatko 1C1-, 2H12- ja 5 9D1-vasta-aineet erilaisten antigeenien vai vaihtoehtoi

sesti saman antigeenin eri epitooppien kanssa, jolloin nämä epitoopit esiintyisivät useimmilla muttei kaikilla IATS

2-, 5- ja 16-serotyypeillä, tehtiin immunotäpläanalyysi.

Koska IATS-kantojen 2, 5 ja 16 yhteinen antigeenisyys on 10 ilmeisesti lämpöstabiilien antigeenien aiheuttama (Liu, P. V. et ai., supra) ja koska lämpöstabiilisuus on aiemmin mainittu lipopolysakkaridimolekyylien luontainen ominaisuus, valittiin IATS-kannoista 2, 5 ja 16 tehdyt LPS-preparaatit analysoitaviksi antigeenipreparaateiksi. 15 Raaka-LPS valmistettiin tyyppikannoista uuttamalla fysio logisella suolaliuoksella lämpötilassa 60 °C [Orskov, F. et ai., Acta. Path. Microbiol. Scand. Section B 79 (1971) 142 - 152] . Kunkin serotyypin LPS:lie (10 //g, määritettynä 2-keto-3-deoksioktonaatti-(KDO)-sisällön perusteella) 20 [Karkhanis, Y. D. et ai., Anal. Biochem. 85 (1978) 595 - 601] tehtiin natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigee-lielektroforeesi (SDS-PAGE) [Hancock, R. E. W. ja Carey, A. M., J. Bacteriol. 149 (1977) 901 - 910] geelillä, jossa vallitsi pitoisuusgradientti 10 -* 20 %. Erottuneet mole-25 kyylispesiekset siirrettiin geeliltä nitroselluloosakal- voon (NCM) kirjallisuudessa kuvatulla tavalla [Towbin, H. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (1979) 4350 - 4354], ja NCM-täplä suojattiin pitämällä 1 tunti Tweeniä sisältävässä PBS.-ssä [Batteiger, B.et ai., J. Immunol. Meth. 55 30 (1982) 297 - 307]. Sitten täpliä inkuboitiin 1 tunti huo neen lämpötilassa 20 ml:ssa käytettyä viljelmäsupernatant-tia, joka saatiin solulinjasta 1C1, 2H12 tai 9D1. Kutakin NCM-täplää huuhdottiin 5 min Tweeniä sisältävällä PBS:llä ja inkuboitiin sitten 1 tunti 25 °C:ssa alkaliseen fosfa-35 taasiin liitetyn vuohen anti-ihmis-(IgG + IgA + IgM) :n 2o 102217 (Zymed) kanssa, joka oli laimennettu suhteessa 1:1 000 tai 1:1 500 PBS-Tween-seoksella. Täpliä pestiin sitten 5 min PBS-Tweenissa, minkä jälkeen antigeeni-vasta-ainevuorovai-kutukset visualisoitiin inkuboimalla täpliä 15 - 20 min 5 lämpötilassa 25 °C 30 ml:ssa nitrosininentetratsolium/5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaatti(NBT-BCIP)substraattia Learyn et ai. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983) 4045 -4049] kuvaamalla tavalla. Värin kehittyminen pysäytettiin huuhtomalla täplä useaan kertaan deionisoidulla vedellä. 10 Näillä kolmella vasta-aineella saadut täpläkuviot olivat selvästi erilaiset. Vasta-aine 2H12 tunnisti pääasiassa lyhyen sarjan säännöllisin välimatkoin esiintyviä (ts. tikapuumainen kuvio) pienimolekyylisiä molekyylejä serotyypeistä 2, 5 ja 16 valmistetuissa antigeenipreparaa-15 teissä. Tämä vasta-aine tunnisti myös heikosti joitakin säännöllisin välimatkoin esiintyviä suurempia molekyylejä. Serotyypistä 11 tehdyllä LPS-preparaatilla ei havaittu reaktiota. Immuunitäpläanalyysin toistaminen käyttämällä LPS-preparaatteja, jotka oli käsitelty ennalta proteinaasi 20 K:11a lämpötilassa 60 °C proteiiniantigeenien tuhoamiseksi, ei muuttanut kuvioita. Pienimolekyyliset vyöhykkeet vastasivat tarkalleen LPS-molekyylien pienempiä muotoja, jotka oli visualisoitu samalla tavalla tehdyllä SDS-PAGE-geelielektroforeesilla, jossa antigeenejä ei siirretty 25 NCM:ään vaan värjättiin spesifisesti LPS:n läsnäolon toteamiseksi [Tsai, C. M. ja Farsch, C. E., Anal. Biochem. 119 (1982) 115 -119)], paitsi että hopealla värjätyn geelin alin vyöhyke (joka vastaa ydinaluetta + LPS:n lipidi A:ta) ei tullut tunnistetuksi. Vasta-aine 1C1 tunnisti sa-30 man sarjan säännöllisin välimatkoin esiintyviä pieniä mo-j lekyylejä serotyypeistä 2, 5 ja 16, mutta ei 11, tehdyistä antigeenipreparaateista, vaikka reaktion intensiteetti ei ollut yhtä suuri kuin 2H12:lla. Tämä vasta-aine tunnisti kuitenkin lisäksi myös voimakkaasti sarjan säännöllisin 35 välimatkoin esiintyviä suurempia molekyylejä serotyypeistä 21 102217 2, 5 ja 16, mikä yhdessä tunnistettujen pienempimolekyy-listen vyöhykkeiden kanssa johti selviin täysin tikapuu-maisiin kuvioihin. Antiseeripreparaattien esikäsittely proteinaasi K:11a ei muuttanut näitä kuvioita. Kuviot vas-5 tasivat tälläkin kertaa tikapuumaisia vyöhykekuvioita, joita havaittiin LPS-spesifisesti värjätyillä geeleillä (ts. ne näyttivät vastaavan toisiaan vyöhyke vyöhykkeeltä) , paitsi että ydintä + lipidi A:ta vastaava vyöhyke ei tullut tunnistetuksi. Vasta-aineella 9D1 oli samanlainen 10 reaktiokuvio kuin vasta-aineella 1C1 IATS-kantojen 2, 5 ja 16, mutta ei 11, suhteen. Tälläkään kertaa eri LPS-prepa-raattien hopeavärjätyn geelin tikapuukuvion alimmainen vyöhyke ei tullut tunnistetuksi, eikä LPS-preparaattien esikäsittely proteinaasi K:11a muuttanut kokonaiskuviota. 15 Nämä havainnot osoittivat yhdessä, että serotyyppien 2, 5 ja 16 LPS oli vasta-aineiden 2H12, 1C1 ja 9D1 tunnistama molekyylikohde.

Esimerkki IV

Esimerkki IV kuvaa menetelmää P. aeruginosan IATS-20 serotyyppien 4 ja 11 ja Fisher-immunotyypin 2 kanssa reagoivan monoklonaalisen ihmisvasta-aineen valmistusta. Toistettiin muuten esimerkeissä I - III kuvattu menettely, mutta oli välttämätöntä tehdä tiettyjä muunnoksia tässä esimerkissä kuvattavan vasta-aineen eristämiseksi, karak-25 terisoimiseksi ja tutkimiseksi. Seuraavassa esitetään tehdyt muutokset menettelyihin ja tässä kuvattavalla monoklo-naalisella vasta-aineella saadut tulokset.

Ihmisen B-solujen lähteenä oli henkilö, joka oli aiemmin immunisoitu suurimolekyylisellä polysakkaridipre-30 paraatilla, joka oli eristetty Fisher-immunotyypistä 3 ; [Pier, g. B., et ai., Infect. Immun. 45 (1984) 309 - 313, joka mainitaan viitteenä].

E~PBMC:n soluohjattu transformointi tehtiin viljelemällä näitä soluja yhdessä transformoivan solulinjan 1A2 35 kanssa. Logaritmisen kasvun vaiheessa olevat lA2-solut 102217 22 suspendoitiin HAT-väliaineeseen ja yhdistettiin sitten E~PBMC-soluihin suhteessa 15 lA2-solua/l E”PBMC-solu. So-luseos siirrostettiin 14 mikrotiitterilevylle pitoisuudeksi 62 000 solua/syvennys tilavuuden ollessa 200 μΐ/syven-5 nys. Viljelmille lisättiin ravintoa päivinä 7 ja 11 siir-rostuksen jälkeen, ja havaittiin, että päivään 15 mennessä kaikki syvennykset sisälsivät lisääntyviä soluja.

Anti-P. aeruginosa -vasta-aineiden läsnäolon tutkimiseksi käytettiin kahta antigeenilevyä, jotka olivat: 10 (1) levy, joka sisälsi P. aeruginosa -Fisher-immunotyyp- pien 1-7 seosta (ATCC-nro 27312, 27313, 27314, 27315, 27317 ja vastaavasti 27318); ja (2) PLL-käsitelty, bakteereja sisältämätön mikrotiitteri-levy.

15 Analysoimalla viljelmäsupernatantit edellä olevien esimerkkien mukaisella menetelmällä identifioitiin noin 100 syvennystä, jotka sisälsivät anti-P. aeruginosa -vasta-aineita, jotka reagoivat Fisher-immunotyyppejä 1-7 sisältävän levyn kanssa muttei PLL-käsitellyn, bakteereja 20 sisältämättömän levyn kanssa. Jotta saataisiin identifioiduksi tunnistetut yksi tai useampi Fisher-immunotyyppi, konstruoitiin edellä kuvatulla tavalla antigeenilevyjä, joissa kukin rivi sisälsi vain yhtä Fisher-immunotyyppiä olevia PLL:llä kiinnitettyjä bakteereja. Tehtiin edellä 25 kuvatulla tavalla ELISA-määritys, jossa kustakin anti-P. aeruginosa -positiivisesta syvennyksestä saatua viljelmä-supernatanttia laitettiin riveittäin uusille antigeenile-vyille, jolloin identifioitiin joukko syvennyksiä, jotka sisälsivät Fisher-immunotyypille 2 spesifistä vasta-ainet-30 ta. Jotta saataisiin tarkemmin analysoiduksi Fisher-immu-notyypin 2 vastaisten vasta-aineiden serologinen spesifisyys, tutkittiin supernatantit samanlaisella ELISA-määri-tyksellä, joka tehtiin antigeenilevyillä, jotka sisälsivät kutakin P. aeruginosan 17 IATS-serotyypistä erillisissä 35 syvennyksissä. Tämän kokeen tulokset osoittivat, että suu- 102217 23 ri enemmistö supernatanteista oli spesifinen IATS-serotyy-pille 11, vaikka yksi supernatantti, syvennyksessä 6D6 oleva, olikin ristireaktiivisesti spesifinen IATS-serotyy-peille 4, 11, 13 ja 14.

5 Jotta saataisiin määritetyksi, aiheutuiko IATS-se- rotyyppien 4, 11, 13 ja 14 vastainen reaktiomalli yhdestä vai useammasta syvennyksessä 6D6 olevasta vasta-aineesta, adsorboitiin lisänäytteitä syvennyksen 6D6 supernatantista erikseen IATS-serotyyppien 4, 7 (negatiivinen vertailunäy-10 te) , 11, 13 ja 14 kanssa, ja testattiin absorboituneet su-pernatantit sitten kutakin viittä IATS-serotyyppiä olevilla PLL-kiinnitetyillä bakteereilla edellä esitetyllä ELI-SA-menetelmällä. Absorboinnit tehtiin suspendoimalla tiivistetty bakteerisolupelletti takaisin yhtä suureen tila-15 vuuteen supernatanttia yhden tunnin ajaksi jäähauteessa, minkä jälkeen supernatantti erotettiin bakteereista sentrifugoimalla. Tämän kokeen tulokset osoittivat, että IATS-serotyypit 4 ja 11 adsorboivat toistensa vastaista vasta-aineaktiivisuutta mutta eivät aktiivisuutta IATS-se-20 rotyyppejä 7, 13 eikä 14 vastaan. Tämä osoitti, että syvennyksessä 6D6 esiintyi ainakin kahta erilaista anti-P. aeruginosa -vasta-ainetta, joista ainakin yksi ristireagoi IATS-serotyyppien 4 ja 11 kanssa.

Asianmukaista vasta-ainetta tuottavien syvennyksen 25 6D6 solujen eristäminen ja kloonaus tehtiin kolmessa vai heessa. Ensimmäisessä vaiheessa alaviljeltiin soluja pienenä tiheytenä (20 solua/syvennys) , ja tehtiin toinen pie-nitiheyksinen alaviljely (5 solua/syvennys) soluille, joita saatiin anti-IATS-serotyypit 4 + 11-positiivisesta sy-30 vennyksestä, joka oli muodostunut ensimmäisessä pieniti-heyksisessä alaviljelyssä (20 solua/syvennys) . Kukin ala-viljely tehtiin 96-syvennyksisillä pyöreäpohjaisilla levyillä mainittuna tiheytenä kaikkiaan 100 μΐ-.ssa HAT-väli-ainetta, josta puuttui aminopteriinikomponentti (HT-väli-35 aine). Kaikkiin syvennyksiin lisättiin transformoimatto- 24 1 0 2 2 1 7 tnia, HAT-herkkiä lymfoblastoidisoluja syöttösoluiksi tiheydeksi 500 solua/syvennys. Neljän vuorokauden kuluttua viimeisestä siirrostuksesta kaikkiin syvennyksiin lisättiin 100 μΐ HAT-väliainetta syöttösolujen tappamiseksi se-5 lektiivisesti. Soluille annettiin lisäravintoa uudelleen 9 vrk:n kuluttua siirrostuksesta korvaamalla puolet superna-tantista HAT-väliaineella. Sen jälkeen soluille lisättiin samalla tavalla ravintoa 4-5 vrk:n välein lisäämällä HAT-väliainetta, kunnes syvennyksissä vallitsi riittävä 10 lymfoblastoidisolutiheys supernatantin analysoimiseksi ELISA:11a edellä kuvatulla tavalla.

Supernatantit, jotka reagoivat IATS-serotyypin 4 kanssa, reagoivat kussakin kokeessa myös IATS-serotyypin 11 ja Fisher-immunotyypin 2 kanssa. Lisäksi IATS-serotyyp-15 pien 13 ja 14 vastainen vasta-aineaktiivisuus oli hävinnyt, mikä vahvistaa aiemmat spesifisyysmääritelmät.

Spesifistä vasta-ainetta tuottavat solut kloonattiin siirrostamalla ensin solut hyvin pieneksi tiheydeksi (laskennan mukaan 1 solu/syvennys) 72-syvennyksisille 20 Terasaki-levyille (Nunc # 1-36538) tilavuuden ollessa 10 μΐ/syvennys. Levyt sijoitettiin inkubaattoriin 3 tunniksi, jotta solut pääsevät asettumaan levyn pohjalle, ja tutkittiin sitten kahden eri henkilön toimesta yhden solun sisältävien syvennysten toteamiseksi. Kukin näistä soluista ’ 25 sijoitettiin sitten yksitellen 96-syvennyksisen pyöreäpoh- jaisen levyn syvennyksiin yhdessä syöttösolujen kanssa, ja tehtiin viljely edellä pienitiheyksisen alaviljelyn yhteydessä kuvatulla tavalla. Kaikkien syntyneiden kloonien supernatantit olivat positiivisia IATS-serotyyppejä 4 ja 30 11 vastaan edellä kuvatulla ELISA-menetelmällä tutkittaes- sa.

Täten saatiin kloonattu transformoitu ihmissolulin-ja, joka kasvaa jatkuvasti (on kuolematon) ja erittää mo-noklonaalista ihmisvasta-ainetta, joka reagoi Fisher-im-35 munotyypin 2 kanssa ja on ristireaktiivinen IATS-serotyyp- 25 102217 pien 4 ja 11 kanssa. Tässä esimerkissä solulinjasta ja sen tuottamasta vasta-aineesta käytetään samaa merkintää (ts. 6D6) .

Syvennyksen 6D6 sisältämän vasta-aineen isotyyppi 5 määritettiin muuten samanlaisella ELISA-menetelmällä kuin edellä kuvattujen spesifisyystestien yhteydessä, mutta toisen vaiheen reagenssina käytettiin HRP-vuohen anti-ih-mis-IgG:tä ja HRP-vuohen anti-ihmis-IgM:ää erikseen eikä yhdistettyinä. Syvennyksen 6D6 vasta-aineen positiivinen 10 reaktio Fisher-immunotyypin 2 ja IATS-serotyyppien 4 ja 11 kanssa havaittiin vain anti-IgM-reagenssilla, mikä osoittaa, että tämä vasta-aine on IgM-isotyyppiä.

6D6-vasta-aineen tunnistaman molekyylispesieksen biokemiallinen karakterisointi tehtiin immuunitäpläanalyy-15 sillä muuten edellä esimerkissä 3 kuvatulla tavalla, mutta analyysissä käytettäviksi antigeenipreparaateiksi valittiin Fisher-immunotyypistä 2 ja IATS-serotyypeistä 4 ja 11 tehdyt LPS-preparaatit. Fisher-immunotyypistä 1 tehty LPS-‘ preparaatti otettiin mukaan negatiiviseksi vertailunäyt- 20 teeksi.

Kukin epäpuhdas LPS-preparaatti laimennettiin ennen analyysiä suhteessa 1:1 hajotuspuskurilla [0,125 mol/1 Trisiä, 4 % (paino/tilavuus) natriumdodekyylisulfaattia (SDS), 20 tilavuus-% glyserolia, 10 tilavuus-% β-merkap-25 toetanolia, 0,4 % (paino/tilavuus) bromifenolisinistä, PH 6,87], ja äänikäsiteltiin haudetta 5 min. Näytteissä olevien proteiinien hajottamiseksi lisättiin kuhunkin näytteeseen proteinaasi K -liuosta (1 mg/ml vedessä) entsyymi-määrän ollessa 40 paino-% LPS:n määrästä, ja inkuboitiin 30 60 °C:ssa 2 tuntia äänikäsitellen haudetta 5 min:n ajan 1 tunnin inkuboinnin jälkeen. Sitten näytteitä pidettiin 5 min 100 °C:n lämpötilassa ja sentrifugoitiin 2 min mikro-sentrifugissa.

Selkeytetyille näytteille, jotka vastasivat 10 mg 35 LPS:ää kustakin bakteerikannasta, tehtiin SDS-polyakryyli- 102217 26 amidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) edellä kuvatulla tavalla. Kun erotettu molekyylispesies oli siirretty NCM:ään, inkuboitiin NMC:iä 2 tuntia huoneen lämpötilassa yhdessä 6D6-solulinjan käytetyn viljelmäsupernatantin 5 kanssa. Menettely oli muuten edellä kuvatun kaltainen.

Positiivisia tuloksia havaittiin vain niillä kaistoilla, jotka sisälsivät Fisher-immunotyypin 2, IATS-sero-tyypin 4 tai IATS-serotyypin 11 LPS:ää. Fisher-immunotyyppiä 2 ja IATS-serotyyppiä 11 vastaavilla kaistoilla vasta-10 aine 6D6 tunnisti lyhyen sarjan säännöllisin välimatkoin (tikapuumaisesti) esiintyviä pieniä molekyylejä, jotka vastaavat täsmälleen LPS-molekyylien pienempiä muotoja, jotka saatiin näkyviin samalla tavalla suoritetussa SDS-PAGE :ssa, jossa antigeenejä ei siirretty NCM:ään, vaan 15 värjättiin spesifisesti LPS:n läsnäolon toteamiseksi; ainoa ero oli se, ettei hopeavärjätyllä geelillä esiintyvää alinta vyöhykettä (joka vastaa ydinaluetta + LPS.-n lipidi A:ta) tunnistettu. IATS-serotyypin 4 LPSrää sisältävällä kaistalla vasta-aine tunnisti sitä vastoin täyden sarjan 20 säännöllisin välimatkoin sijaitsevia vyöhykkeitä, jotka kattoivat lähes koko geelin pituuden; intensiivisimmät reaktiot tapahtuivat suurempia molekyylipainoja vastaavissa vyöhykkeissä. Kuvio vastasi tälläkin kertaa tikapuu-maista vyöhykekuviota, joka havaittiin LPS-spesifisesti 25 värjätyllä geelillä (ts. kuviot vastasivat toisiaan vyöhyke vyöhykkeeltä); ainoa poikkeus oli se, ettei ydintä + lipidi A:ta edustavaa vyöhykettä havaittu. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että LPS:n O-puolen ketju oli mole-kyylikohde, jonka vasta-aine 6D6 tunnisti Fisher-immuno-30 tyypillä 2 ja IATS-serotyypeillä 4 ja 11.

Esimerkki V

Esimerkki V valaisee menetelmää monoklonaalisen ih-misvasta-aineen, joka reagoi P. aeruginosan IATS-serotyyp-pien 6 ja 13 ja Fisher-immunotyypin 1 kanssa, valmistami-35 seksi. Toistettiin muuten esimerkeissä I - IV kuvattu me- 102217 27 nettely, mutta oli välttämätöntä tehdä tiettyjä muutoksia tässä esimerkissä kuvattavan vasta-aineen eristämiseksi, karakterisoimiseksi ja tutkimiseksi. Seuraavassa esitetään menettelyihin tehdyt muutokset ja tässä kuvattavalla mono-5 klonaalisella vasta-aineella saadut tulokset.

Ihmisen B-solujen lähde oli henkilö, joka oli aiemmin immunisoitu suurimolekyylisiä polysakkarideja sisältävällä preparaatilla, joka oli eristetty Fisher-immunotyyy-pistä 2 [Pier et ai., Infect. Immun. 34 (1981) 461]. Kun 10 oli kerätty E'PBMC edellä kuvatulla tavalla, solut jäädytettiin FCSrssa, joka sisälsi 10 tilavuus-% DMSO, neste-typpisäiliössä. Nämä solut sulatettiin myöhemmin nopeasti lämpötilassa 37 °C, pestiin kerran Iscoven-väliaineella ja suspensoitiin HAT-väliaineeseen. Soluohjattu transformoin-15 ti tehtiin suhteessa 15 lAl-solua / 1 E~PBMC-solu. Solu-seos siirrostettiin 20 mikrotiitterilevylle pitoisuudeksi 78 500 solua/syvennys. Viljelmille annettiin lisäravintoa 3-5 vrk:n välein, ja 11 vrk:n kuluttua havaittiin, että kaikki syvennykset sisälsivät lisääntyviä soluja.

20 Anti-P. aeruginosa -vasta-aineiden läsnäolon totea miseksi supernatanteista ELISA-menetelmällä käytettiin an-tigeenilevyä, joka sisälsi P. aeruginosa -Fisher-immu-notyyppien 1-7 seosta (kliinisesti eristetty näyte PSA 1277 (Genetic Systems Corporation Organism Bank, "GSCOB"), 25 ATCC 27313, PSA G98 (GSCOB), ATCC 27315, PSA F 625 (GSCOB), ATCC 27317 ja vastaavasti ATCC 27318) . Kokeessa käytettiin myös PLL-käsiteltyä mikrotiitterilevyä, joka ei sisältänyt bakteereja.

Analysoimalla viljelmäsupernatantit edellä kuvatul-30 la menetelmällä identifioitiin noin 200 syvennystä, jotka sisälsivät anti-P. aeruginosa -vasta-aineita, jotka reagoivat Fisher-immunotyyppejä 1-7 sisältävän levyn kanssa. Jotta saataisiin identifioiduksi syvennykset, jotka sisälsivät kahden tai useamman IATS-serotyypin kanssa rea-35 goivaa vasta-ainetta, muodostettiin edellä kuvatulla ta- 102217 28 valla antigeenilevyt, joissa levyjen rivit sisälsivät vain yhtä IATS-serotyyppiä olevaa PLL-kiinnitettyä bakteeria. Kussakin anti-P. aeruginosa -positiivisessa syvennyksessä olevan lisätyn viljelmän supernatantille tehtiin ELISA-5 määritys edellä kuvatulla tavalla. Supernatantit laitettiin riveittäin uusille antigeenilevyille, jolloin identifioitiin joukko syvennyksiä, jotka sisälsivät useiden IATS-serotyyppien kanssa reagoivaa vasta-ainetta. Yksi syvennys, josta käytetään merkintää 8H7, sisälsi IATS-sero-10 tyypeille 6 ja 13 spesifistä vasta-ainetta. Kun tästä syvennyksestä saatu supernatantti tutkittiin ELISA:11a 7

Fisher-immunotyypin suhteen esimerkissä V kuvatulla tavalla, havaittiin, että syvennyksen 8H7 vasta-aineet olivat spesifisiä Fisher-immunotyypille 1.

15 Jotta saataisiin määritetyksi, aiheutuiko IATS-se- rotyyppien 6 ja 13 vastainen reaktiomalli useista syvennyksessä 8H7 olevista vasta-aineista, adsorboitiin lisä-näytteitä supernatantista erikseen IATS-serotyyppien 6, 13 ja 17 (negatiivinen vertailunäyte) kanssa, ja adsorboitu-20 neet supernatantit tutkittiin sitten kutakin kolmea IATS-serotyyppiä olevilla PLL-kiinnitetyillä bakteereilla edellä kuvatulla ELISA-menetelmällä. Tulokset osoittivat, että IATS-serotyypit 6 ja 13 absorboivat toistensa vastaista vasta-aineaktiivisuutta. IATS-serotyyppi 17 ei absorboinut 25 IATS 6:n eikä IATS 13:n vastaista aktiivisuutta. Nämä tulokset osoittavat, että IATS-serotyyppien 6 ja 13 vastainen reaktiomalli aiheutui yhdestä syvennyksen 8H7 sisältämästä vasta-aineesta.

Syvennyksen 8H7 sisältämien vasta-ainetta tuotta-30 vien solujen eristäminen ja kloonaaminen tehtiin kolmessa vaiheessa suurin piirtein edellä esimerkissä IV kuvatulla tavalla. Täten saatiin aikaan kloonattu transformoitu in-missolulinja, joka kasvaa jatkuvasti (ts. on kuolematon) ja erittää monoklonaalista ihmisvasta-ainetta, joka reagoi 35 Fisher-immunotyypin 1 kanssa ja reagoi ristiin IATS-sero- 29 102217 tyyppien 6 ja 13 kanssa. Tässä esimerkissä käytetään solu-linjasta ja sen tuottamasta vasta-aineesta samaa merkintää 8H7. Esimerkissä IV kuvatulla menettelyllä määritettiin syvennyksen 8H7 vasta-aineen isotyypiksi IgM.

5 Vasta-aineen 8H7 tunnistaman molekyylispesieksen biokemiallinen karakterisointi tehtiin immuunitäplä-analyysillä muuten esimerkeissä III ja IV kuvatulla tavalla, mutta valittiin analyysissä käytettäviksi antigeeniprepa-raateiksi Fisher-immunotyypistä 1 ja IATS-serotyypeistä 6 10 ja 13 tehdyt LPS-preparaatit. IATS-serotyypistä 10 saatua LPS-preparaattia käytettiin negatiivisena vertailunäyttee-nä.

Saatujen immuunitäplien analysointi osoitti positiivisia tuloksia vain niissä NCM-kaistoissa, jotka sisäl-15 sivät Fisher-immunotyypin 1, IATS-serotyypin 6 tai IATS-serotyypin 13 LPS:ää. Fisher-immuniotyyppiä 1 ja IATS-se-rotyyppiä 6 vastaavilla kaistoilla vasta-aine 8H7 tunnisti sarjan säännöllisin välein (ts. tikapuumaisesti) sijaitsevia vyöhykkeitä, jotka kattoivat lähes koko geelin pituu-20 den. Nämä vyöhykkeet vastasivat tarkalleen LPS-molekyylien monia eri molekyylipainomuotoja, jotka näkyivät samalla tavalla tehdyssä SDS-PAGE:ssa, jossa antigeenejä ei siirretty NCMrään vaan värjättiin spesifisesti LPS:n läsnäolon toteamiseksi. IATS-serotyypin 13 LPS:ää sisältävällä kais-25 talla vasta-aine 8H7 tunnisti lyhyemmän sarjan säännöllisin välein esiintyviä vyöhykkeitä, jotka olivat keskinkertaisia - suuria molekyylipa!noja vastaavalla geelialueel-la. Tunnistetut vyöhykkeet vastasivat tälläkin kertaa asemaltaan vyöhykkeitä, joita havaittiin LPS-spesifisesti 30 värjätyllä geelillä; värjätyllä geelillä näkyvät LPS:n pieni- ja suurimolekyylisimmät muodot eivät kuitenkaan tulleet hyvin tunnistetuiksi Western-täpläanalyysissä. Tulokset osoittavat selvästi, että molekyylikohde, jonka vasta-aine 8H7 tunnisti Fisher-immunotyypillä 1 ja IATS-35 serotyypeillä 6 ja 13, oli LPS.

3„ 102217

Edellä esitetyn perusteella todetaan, että valmistetut solulinjat tuottavat monoklonaalisia ihmisvasta-aineita ja niiden fragmentteja, jotka ovat ristireagoivia erilaisia P. aeruginosan IATS-serotyyppejä vastaan. Solu-5 linjat tuottavat vasta-aineita, joille löytyy käyttöä im-muunimäärityksissä ja muissa tunnetuissa menettelyissä.

Vaikka tätä keksintöä on kuvattu jossain määrin yksityiskohtaisesti valaisevalla ja esimerkinomaisella tavalla sen yrmärtämisen helpottamiseksi, on selvää, että 10 siihen voidaan tehdä tiettyjä muutoksia ja muunnoksia liitteenä olevien patenttivaatimusten piiristä poikkeamatta.

Claims (8)

3i '102217

1. Menetelmä Pseudomonas aeruginosa -serotyyppien toteamiseksi näytteestä in vitro, tunnettu siitä, 5 että näyte saatetaan kosketukseen mahdollisesti leimattujen monoklonaalisten ihmisvasta-aineiden kanssa, jotka reagoivat spesifisesti vähemmän kuin kaikkien mutta vähintään kahden Pseudomonas aeruginosan IATS-serotyypin kanssa, tai niiden sitoutuvien fragmenttien kanssa, ja muodos-10 tunut kompleksi todetaan, jolloin monoklonaaliset vasta-aineet ovat valmistettavissa solulinjan ATCC-nro CRL 8941, 9171 tai 9258 avulla.

2. Monoklonaaliset ihmisvasta-aineet tai niiden sitoutuvat fragmentit, tunnetut siitä, että ne 15 kykenevät reagoimaan spesifisesti Pseudomonas aeruginosan IATS-serotyyppien 2 ja 5 ja Fisher-immunotyyppien 3 ja 7 saavutettavissa olevien lipopolysakkaridideterminanttien kanssa ja että niitä tuottaa jatkuvasti viljeltävissä oleva solulinja, joka erittää mainittua monoklonaalista vas-20 ta-ainetta, kuten esimerkiksi solulinja ATCC-nro CRL 8941, jolloin solulinja saadaan transformoimalla ihmisen B-lym-fosyyttejä.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukaiset monoklonaaliset ihmisvasta-aineet tai niiden sitoutuvat fragmentit, ·. 25 tunnetut siitä, että niitä tuottaa solulinja ATCC- nro CRL 8941.

4. Monoklonaaliset ihmisvasta-aineet tai niiden sitoutuvat fragmentit, tunnetut siitä, että ne pystyvät reagoimaan spesifisesti Pseudomonas aeruginosan

30 IATS-serotyyppien 6 ja 13 ja Fisher-immunotyypin 1 saavu- ‘ tettavissa olevien lipopolysakkaridideterminanttien kanssa ja että niitä tuottaa jatkuvasti viljeltävissä oleva solulinja, joka erittää mainittua monoklonaalista vasta-ainetta, kuten esimerkiksi solulinja ATCC-nro CRL 9258, jol-35 loin solulinja saadaan transformoimalla ihmisen B-lym-fosyyttejä. 102217

5. Patenttivaatimuksen 4 mukaiset monoklonaaliset ihmisvasta-aineet tai niiden sitoutuvat fragmentit, tunnetut siitä, että niitä tuottaa solulinja ATCC-nro CRL 9258.

6. Monoklonaaliset ihmisvasta-aineet tai niiden sitoutuvat fragmentit, tunnetu t siitä, että ne pystyvät reagoimaan spesifisesti Pseudomonas aeruginosan IATS-serotyyppien 4 ja 11 ja Fisher-immunotyypin 2 saavutettavissa olevien lipopolysakkaridideterminanttien kanssa 10 ja että niitä tuottaa jatkuvasti viljeltävissä oleva solu-linja, kuten esimerkiksi ATCC-nro CRL 9171, joka erittää mainittua monoklonaalista vasta-ainetta, jolloin solulinja saadaan transformoimalla ihmisen B-lymfosyyttejä.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukaiset monoklonaa- 15 liset ihmisvasta-aineet tai niiden sitoutuvat fragmentit, tunnetut siitä, että niitä tuottaa solulinja ATCC-nro CRL 9171.

8. Testipakkaus käytettäväksi Pseudomonas aeruginosa -serotyyppien toteamiseksi, tunnettu sii- 20 tä, että se sisältää koostumusta, jossa on vähintään yhtä ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta, joka reagoi spesifisesti vähemmän kuin kaikkien mutta vähintään kahden Pseudomonas aeruginosan IATS-serotyypin kanssa, tai sen sitoutuvaa fragmenttia, ja todettavan signaalin antavia 25 merkkiaineita, jotka on sidottu kovalenttisesti mainit tuihin vasta-aineisiin tai toisiin vasta-aineisiin, jotka reagoivat kaikkien mainittujen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, jolloin monoklonaaliset vasta-aineet ovat valmistettavissa solulinjan ATCC-nro CRL 8941, 9171 tai 30 9258 avulla. 33 102217