JPH04502920A - インスリン依存性糖尿病の診断と治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インスＩン　の鉢　と°１ 主班夏分立 本発明はインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の存在、ＩＤＤＭになり易い性向 、又はＩＤＤＭになる過程の開始を検出する方法に関し、さらに詳しくは本発明 は６５キロダルトンの熱シラツク蛋白（ｈｓｐ６５）　（又はこ、れと免疫学的 に交差反応をする分子）、又はこのような蛋白に反応性の抗体やＴ細胞に関する 。

さらに本発明は、ｈｓｐ６５又はその免疫学的に関連する蛋白又は断片を投与す るか、又はこのような蛋白又は断片に活性化されたＴ細胞（このようなＴ細胞は 処理してその免疫原性を減弱化されている）又はこのようなＴ細胞や処理された Ｔ細胞の断片を、その免疫学的寛容を引き起こすように投与することによる、Ｉ 　ＤＤＭを防止したり発生中のＩＤＤＭを治療する方法に関する。

坐貝立宣景 インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の発生率は、多くの国でこの数十年間に数 倍増加し、現在生きているヒトの１％は７０才になるまでにＩＤＤＭになるだろ うと予想されている。ＩＤＤＭはインスリン産生ベータ細胞を破壊する自己免疫 学的反応により引き起こされる。糖尿病の臨床症状はベータ細胞の大部分（おそ らく９０％）が再生できないほど破壊された後に初めて現れ、患者の生存はイン スリンの外的供給に依存することになる。即ち臨床診断ができる時期にはこの自 己免疫反応は不可逆的な損傷を与えており、しかもその多くは顕著な症状を示さ ない。

糖尿病に関与する自己免疫反応の治療を成功させるためには、患者の症状が明ら かになる前に治療を開始することと、インスリンを産生ずる能力をなくした患者 へのインスリン補充が必要である。自己免疫反応を停止させることにより糖尿病 が直り外因性インスリンが不要になるのは、患者がまだ充分量の内因性インスリ ンを与えることができる充分な数のベータ細胞を有しているうちに、病気の進行 をとめることができた場合のみである。従ってＩＤＤＭの症状が明らかになる前 にそして外因性インスリンが必要になる前に危険のある患者が同定できたら、い かなる療法ももっと有効となるであろう、ＩＤＤＭの新しい患者の約９０％は、 患者層のある家族以外から発生している。従って疾患を止めることが不可能な段 階になる前に疾患を検出するために、マススクリーニングに適した測定法が緊急 に必要とされている。

幸いなことにＩＤＤＭにはＢＢクラットＮＯＤマウスのように多くの動物モデル がある（例えばロッシーニ（Ｒｏｓｓｉｎｉ）ら、アニュアル・レビュー・イム ノロジー（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、ｌａ＋＋＋＋ｕｎｏ１．）第３巻、２８９−３２ ０頁（１９８５年）を参照）。この動物の多くは自然にＩＤＤＭを発症し、ヒト のＩＤＤＭの多（の特徴を示す。

熱シヨツク蛋白（ｈｓｐ’ｓ）は、高温条件又は他のストレスをかけた時に細胞 から産生される蛋白群のｌ員である。熱シジック蛋白には種々の分子量のものが ある（例えば２０キロダルトン、６５−６８キロダルトン、７０キロダルトン、 ９０キロダルトン、１１０キロダルトンなど）、熱シヨツク蛋白は自然界に普遍 的に存在しており、細菌、酵母、植物、昆虫、及びヒトを含む高等動物により産 生される。この蒼白は高度に保存されており、これらの多様な生物のすべてで著 しい相同性を示している。長い進化の時間にわたって極端に保存されているため 、熱シヨツク蒼白は重要な機能を果たすと考えられる。細胞をストレス（例えば 熱、ある種の金属、薬剤、又はアミノ酸類似体）で刺激すると、普通これらの蛋 白の合成が増加する。しかしこれらの蛋白の特殊な機能は今のところ不明である 。

例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者は９０キロダルトンの熱ショ ンク蛋白に対する抗体を有することが観察されている（ミッタ（Ｍｉｎｏｔａ） ら、ジャーナル・オン・クリニカルインベスティゲーション（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、 　Ｉｎｖｅｓｔ、）第８１巻、１０６−１０９頁（１９８８年））。ｈｓｐ９０ に対する抗体の機能は不明である。

ＨＳＰ６５はラットのアジュバント関節炎に関与していることが知られている（ バンエデン（ｖａｎ　Ｅｄｅｎ）　ら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第３３１巻 、１７１−１７３頁（１９８８年）参照）。

アジュバント関節炎はある株のラットをマイコバクテリウムチューバーキュロー シス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ　ｔｕｂｅｃｕｌｏｓｉｓ、　ＭＴ）に対し て免疫することにより発症する自己免疫関節炎である。

この疾患はＭＴのｈｓｐ６５の９個のアミノ酸ペプチド配列（１８０−１８８） に対して反応性のＴリンパ球のクローンにより、放射線照射を受けた免疫学的に 無防備の（ｎａｉｖｅ）ラットに移すことができることが見いだされた。従って アジュバント関節炎は抗ｈｓｐ６５Ｔリンパ球により引き起こされる自己免疫疾 患のようである。関節に対するこの自己免疫攻撃は、１８０−１８５　ｈｓｐ６ ５ペプチドと軟骨プロテオグリカンの結合蛋白の一部との部分配列の相同性に起 因していた（コーエン（Ｃｏｈｅｎ）、サイエンティフィックアメリカン（Ｓｃ ｉｎｅｔｉｆｉｃ　Ａａ＋ｅｒｉｃａｎ）第２５６巻、５２−６０頁（１９８８ 年）を参照）、またリウマチ関節炎の患者の滑液のＴリンパ球はＭＴのｈｓｐ６ ５に対して応答した（レス（Ｒｅｓ）ら、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）第■巻、 ４７８−４８０頁（１９８８年）参照）。

アジュバント関節炎の誘導の前にラットにｈｓｐ６５を投与すると、後に関節炎 が発症するのを防ぐことができることがわかった。従ってｈｓｐ６５に対する免 疫応答の存在はラット及びヒトの両方の関節炎に関連しており、ｈｓｐ６５の投 与により関節炎に対する耐性が与えられた。

ヨーロッパ特許出願筒２６２，７１０号は、自己免疫関節炎やＷ（ｌの自己免疫 疾患の緩和、治療、そして診断に有用なポリペプチドを開示している。

ヒトのＰ１蛋白の完全な一次構造（ヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を含む ）が、最近ニス・ジンダイ（Ｊｉｎｄａｉ、　Ｓ、）ら、「バクテリアや植物シ ャベロニン及び６５キロダルトンのマイコバクテリア抗原に類似のヒトミトコン ドリア蛋白の一次構造」（＠Ｐｒ１ｓ＋ａｒｙ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ａ 　Ｈｕｍａｎ　ＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＰｒｏｔｅｉｎ　Ｈｏｍｏｌｏｇｏ ｕｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｈａｐｅｒ ｏ−ｎｉｎｓ　ａｎｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　６５４ｉ１ｏｄａｌｔｏｎ　Ｍｙｃｏｂ ａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｎｔｉｇｅｎ’）、モレキュラーアンドセリュラーバイオ ロジ−（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）第９ 巻、５．２２７９−２２８３頁（１９８９年）に最近発表された０分子量が約６ ３キロダルトンであると開示されているこの蛋白は、本明細書でｂＨ５Ｐ６５蛋 白として記載されているヒト熱シヨツク蛋白である。前記文献の内容のすべては 参考のため本明細書に引用されている０図３に復元されているこの蛋白の構造は 、ジンダイが開示しているものと同じである。

ヨーロッパ特許出願筒２６１．６４８号は、自己免疫疾患の治療に自己免疫疾患 に特異的な活性化Ｔ細胞の使用を開示している。このＴ細胞は好ましくはまず圧 力で処理し、次に化学的架橋剤及び／又は細胞骨格（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ）破壊剤で処理して免疫原性を改良する。完全に処理した細胞又はその両分は、 Ｔ細胞が特異的な自己免疫疾患に対するワクチンとして使用することができる。

自己免疫性Ｔａ１ｌ胞を阻止するための公知の方法では、特定の自己免疫特異性 を有する減弱化した又は無毒性のＴ細胞の試料、又はその断片又は両分で対象を 免疫する。対象は少なくとも２つのタイプの制御Ｔ細胞を活性化して応答する（ Ｔ細胞活性化マーカーを認識する抗エルゴタイプ（ａｎｔｉ−ｅｒｇｏ−ｔｙｐ ｉｃ）　Ｔ細胞と、病原性内因性自己免疫Ｔ細胞上に存在する自己抗原リセプタ ーを認識するらしい抗イディオタイプＴｉｔ胞）、実験動物でのＴ細胞ワクチン 接種は、疾患の予防とともに、確立した疾患の永久的緩解を誘導するのに有効で ある。

ハウウェル（Ｈｏｍｅｌｌ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２４６巻、６ ６８−６７０頁（１９８９年）、及びバンデンバーク（Ｖａｎｄｅｎ−ｂａｒｋ ）　ら、ネーチャー　（Ｎａ　ｔｕｒｅ）第３４１巻、５４１−５４４頁（１９ ８９年）は、実験的自己免疫性脳を髄炎に対するラットのワクチン接種にＴａ１ ｌ胞リセブターのβ頷のペプチド配列の使用を開示しており、従って自己免疫Ｔ 細胞リセプター自身が制御Ｔ細胞の標的エピトープを供衿することができるとい う結論を支持している。

自己免疫疾患一般に関してＴ細胞又は断片をこのように使用することは公知であ るが、ＩＤＤＭに特異的な特定の抗原はこれまで知られていなかった。即ちＩＤ ＤＭに対するワクチン接種のための活性化Ｔ細胞は、本発明以前には得られてい なかった。

主里皇！ｈ 本発明の目的は、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の早期診断の方法を与え ることである。

本発明の別の目的はＩＤＤＭの早期診断に使用されるキットを与えることである 。

本発明のさらに別の目的は、ＩＤＤＭを予防する方法を与えることである。

本発明のさらに別の目的は、発生段階でＩＤＤＭを治療する方法を与えることで ある。

本発明のさらに別の目的は、ＩＤＤＭの予防又は治療のための免疫学的寛容誘導 性組成物を与えることである。

本発明のさらに別の目的はＩＤＤＭの予防又は治療のための新規ポリペプチドを 与えることである。

本発明のさらに別の目的は、ＩＤＤＭの予防又は発生段階でのＩＤＤＭの治療に 有効なＴ細胞又は断片を与えることである。

本発明のさらに別の目的は、本発明のＩＤＤＭ特異抗原を使用してこれに特異的 なＴ細胞を単離した後、このようなＴ細胞のりセブター領域のペプチド配列を性 状解析し、ＩＤＤＭの予防又は治療にこのようなりセプターペプチドを使用する ことである。

本発明においてＩＤＤＭの研究の過程で、動物はｈｓｐ６５分子又はこれと交差 反応する分子を発現し、これが動物の血液や尿中に出現することが発見された。

またこれらの動物はこのような分子に特異的な抗体やＴ細胞を発現する。即ちｈ ｓｐ６５（又はこれと交差反応する分子）、又はこれらに特異的な抗体又はＴ細 胞の血液又は尿中での存在は、β細胞が完全に破壊され患者が一生涯糖尿病が続 くようになる前にＩＤＤＭを検出するための測定法に役立つ。

ある患者におけるＩＤＤＭの存在又はその発生段階は、ｈｓｐ６５（又はこれと 交差反応する分子）、又はこれらに特異的な抗体又はＴｒｉｌｌ胞の存在を試験 することにより診断することができる。

本発明はまたこのような測定を実施する方法、及びこのような測定を実施するた めのキットを与える。発生段階の糖尿病を検出することにより、自己免疫反応を 終結させるための方法を開始することができる０例えばＩＤＤＭに関与する自己 免疫反応に対する耐性を誘導するのに、ｈｓｐ６５、又はその活性なエピトープ 又はこれと交差反応をする別の分子（抗原）の投与が効果的である。このような 抗原（減弱化されているか無毒性の型、又は処理して抗原性を改良した後のもの ）、又はその断片又は活性画分に特異的なＴ細胞の投与は、ＩＤＤＭに関与する 自己免疫反応に対する耐性を誘導するのに有効であろう。

本発明はさらにＩＤＤＭの予防又は治療法に関する。適当なアジュバント中でｈ ｓｐ６５、又はその活性エピトープ又はこれと免疫学的に交差反応する別の分子 （抗原）に対して免疫することによりＩＤＤＭが誘導されることが発見された。

しかし有効なアジュバントは用いないで、好ましくは寛容誘導性担体とともに、 このような抗原をワクチン接種すると、該抗原に対する特異的寛容を作り出すこ とができる。これによりＩＤＤＭに対する自己免疫反応に対する耐性を作り出す ことができる。このような抗原（減弱化されているか無毒性の型、又は処理して 抗原性を改良した後のもの）、又はその断片又は活性画分に特異的なＴ細胞によ るワクチン接種の場合も同じことが言える。もし患者がｉＤＤＭの前８床的な発 生段階にあれば、このような抗原又はＴ細胞（又は両分）を注射することにより 、この抗原に対する寛容を作り出すことができ、重症の永久的な障害が与えられ る前に自己免疫過程を阻止することができる。

辺　（７）　ｑ”肌 本発明は以下の図面の簡単な説明と好適な態様の詳細な記載からより良く理解で きるであろう。

図１は、ＩＤＤＭを発症しなかったＮＯＤマウスの血清中（７）ｈｓｐ６５、抗 ｈｓｐ６５、抗インスリン抗体、そして抗イデイオタイプ抗体の量を示す。

図２は、ＩＤＤＭを発症したＮＯＤマウスでは疾患の進行が明瞭になる前にｈｓ ｐ６５と抗ｈｓｐ６５が顕著に増加していることを示すグラフである。ＩＤＤＭ に先行する抗インスリン抗体とイディオタイプ（ＤＭ）抗体の増加は軽微であっ た。

図３は、ヒトＰＩ蛋白〔これはｈＨ５Ｐ６５である）のヌクレオチドと、推定さ れるアミノ酸配列を示す。左側の数字は、推定される開始コドンの最初の座標１ に対するヌクレオチド配列を示す。アミノ酸配列は同じ点の１から始まって番号 をつけである。このリーディングフレームの５”延長部分は１文字コードで示し である。λ２２ａ配列の開始を示す内部ＥｃｏＲＩ部位（ｎｔ７１２）の位置も 示しである。３゛末端のＡテイル（Ａ　ｔａｉｌ）からのポリアデニル化シグナ ル１５ｎｔには下線が引いである。Ｎ末端の推定のミトコンドリア標的配列（ｔ ａｒｇｅｔｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）　と、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔのリピー ト配列を含むＣ末端のケラチン様アミノ酸配列は、四角で囲っである。

リーダー配列中の陽性に荷電したアミノ酸は（＋）と記載しである。

図４は、年齢の関数としてのヒトｈｓｐ６５、ＭＴ−ｈｓｐ６５及びＭＴ−ｈｓ ｐ　７０に対するＮＯＤ／ＬｔＴ細胞の自然の反応性の程度を示すグラフである 。

図５は、ペプチドの濃度の関数としての、ｐ２７７とｐ２７８に対するＴ細胞の 増殖応答を示すグラフである。

図６は、Ｐ２７７、ＭＴ　ｈｓｐ６５そしてプラスミツドコントロールに応答し ての、若い前糖尿病性ＮＯＤ／Ｌｔマウスに急性糖尿病を移すことができるＣ７ とＣ９Ｔ細胞の増殖を示す棒グラフである。

図７は、休止している誘導された糖尿病における、ペプチドｐ２７７とｐ２７８ に対する免疫の結果を示す、ドツトは試験群の各マウスの免疫３週間後のグルコ ース濃度を示す。

′ｆ量量ゝ 以下の実施例により、本発明の具体的な態様と本発明に関連する実験を示す。こ れらは例示のために示すのみであり、非限定的に記載されている。

実施例１：ＭＴｈｓ　の マイコバクテリウムチューバーキュローシス（Ｍｙｃｏｂａｃ　ｔｅ−ｒｉｕｍ 　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のｈｓｐ分子を標準的方法で大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ ｉ）にトランスフェクションし、パン・エデン（νａｎ　Ｅｄｅｎ）　ら、ネー チ−１，−（Ｎａｔｕｒｅ）第３３１巻、１７１−１７３頁（１９８８年）に記 載の方法により精製した。このように遺伝子操作した大腸菌細胞は大量のＭＴ　 ｈｓｐ６５分子を産生ずるであろう。

種々の供給源からのｈｓｐは密接な相同性があるため、遺伝子工学又は細胞から の単離により産生される場合、哺乳類又はヒト由来のｈｓｐ６５でも有効である 。

実施例２：ＭＴｈｓ　に・　の 標準的な実験車種のウサギにュージーランドホワイト）の背中に、０．５−の無 機油中に乳化させた０、　５　ｍの生理食塩水（不完全アジュバント）中の、実 施例１に従い産生させたＭＴ　ｈｓｐ６５の１００μｇを皮下注射した。１刃稜 １．０　ｉｄ生理食塩水中の１００μｇのＭＴ　ｈｓｐ６５分子でウサギを追加 免疫し、２週間後にウサギから血液をとり血清を採取した。２刃稜同様にしてウ サギに追加免疫をして、もう一度血液を取った。この血清抗体を使用して、試験 動物及びヒトの血液及び尿中のｈｓｐ６５を検出した。

実施例３：　」鉦旦ｉ■皿定 標準的固相ラジオイムノアッセイを用いてｈｓｐ６５分子の存在を検出した。や わらかいＰＶＣマイクロタイタープレートを１００μＥの試験血清又は尿で４℃ で１８時間被覆し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した０次に対照ウ サギ血清又は抗ｈｓｐ６５血清（実施例２に従い産生じた）を、ＰＢＳ十０．１ ％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１　：　１００希釈し、各ウェルに５０μ！ 添加し、３７°Ｃで２−３時間インキュベートした６次にウェルをＰＢＳで３回 洗浄した。

＋！Ｊ−ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンを１００．　ＯＯＯＣＰＭ／ウェルで添加 し、ウェルを３７°Ｃで２時間維持した０次にプレートをＰＢＳで４回洗浄し、 乾燥させ、ウェルをガンマカウンター中で計測した。抗ｈｓｐ６５血清で得られ た値で、標準ウサギ血清で得られた平均値ＣＰＭ＋２Ｓ、Ｄ、を越えるものを、 ｈｓｐ６５の存在について陽性とした。

実施例４：　ｈＳ　の ｈｓｐ６５の抗体を同様にして検出した。ただしプレートに結合した抗原は血清 又は尿ではなく、実施例１に従い産生じた精製ＭＴ　ｈｓｐ６５の５μｌｌｌ／ ウエルである。抗ｈｓｐ６５抗体について試験すべき血清は１：５０に希釈され る。尿は希釈しない。ｈｓｐ６５を含むウェルに血清又は尿を添加し、マウスの 試料については放射標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンを使用し、ヒトの試料につ いてはヤギ抗ヒト免疫グロブリンを使用して、ｈｓｐ６５に結合している抗体の 存在を検出した。

残りの測定は実施例３に記載したように実施する。健康なマウス、ラット又はヒ トの対照血清で得られた平均ＣＰＭ＋２３、Ｄ、より大きいＣＰＭを陽性と定義 した。

実施例５：　ｈＳ６　と　ｈｓ　はＩＤＤＭの准′−全１前及捜土工玉 ＮをＤマウス １４匹の雌のＮＯＤマウスから、生後２１日目から一定の間隔で約２００日間採 血し、ＩＤＤＭの進行について点数をつけた。ｈｓｐ６５、抗ｈｓｐ６５、抗イ ンスリン抗体、そしてＤＭイディオタイプに対す抗イデイオタイプ抗体について 、血清を試験した。

実施例３の測定法を使用してｈｓｐ６５を試験した。抗ｈｓｐ６５の存在は実施 例４に記載の方法に従い測定した。抗インスリン抗体は、インスリンのりセプタ ー結合部位を認識するイディオタイプ抗体であり、時にＤＭ−イディオタイプ抗 体と称する０本明細書の譲受人の所有する米国特許出願第０７／２９５．４０１ 号では、患者の血清又は尿中にＤＭ−イディオタイプ抗体又は抗ＤＭ−イディオ タイプ抗体が存在することは発生段階ＩＤＤＭ又は活性なＩＤＤＭが陽性である 兆候であることが開示されている。このような抗体は、健常愚者の血清又は尿中 には存在しない。抗インスリン抗体及び抗イデイオタイプ抗体の測定に使用した 方法は、上記出願第０７／２９５．４０１号に記載されているものであり、その 内容は参考のため本明細書に引用されている。

ＮＯＤマウスのうち１０匹はＩＤＤＭを発症し、４匹はＩＤＤＭにならなかった 。図１は、ＩＤＤＭを発症しなかった１匹のマウスの血清を試験した結果であり 、図２は、ＩＤＤＭを発症したマウスの１匹の血清を試験した結果を示す。ここ からＩＤＤＭのないマウスに比較して、ＩＤＤＭを発症したマウスは８５日目か ら始まって生後１８５８５日目しく高濃度のｈｓｐ６５を示していることがわか る。実際にＩＤＤＭが発症してからはｈｓｐ６５濃度は減少した。抗ｈｓｐ６５ 抗体はｈｓｐ６５出現の数週間後に現れた。抗インスリン及び抗イデイオタイプ （Ｄ　Ｍ）抗体はそれよりさらに後に現れた。従ってｈｓｐ６５と抗ｈｓｐ６５ は臨床的ＩＤＤＭより先行しており、発症前の疾患の進行の早期指標として有用 であった。

表１は、１４匹の各マウスのデータを累積したものである。

１−−Ｌ ＮＯＤマウスにおける迫っているＩ　ＤＤＭの血清測定’　＜ＩＤＤ　に′−。

発症したマウスにおいて発症の平均年齢は１５０．５日であった。ｈｓｐ５５血 清試験の平均はＩＤＤＭの７２．５日前に陽性であり、抗ｈｓｐ６５試験の平均 はＩＤＤＭの４４日前に陽性であった。抗インスリンと抗イデイオタイプ抗体は 、平均してＩＤＤＭのわずか２９日と１９日前に陽性であった。従って、ｈｓｐ ６５と抗ｈｓｐ６５は最終的にＩＤＤＭになるか否かの比較的早期の指標である 。

約１００日例のＮＯＤマウスのｈｓｐ６５の存在について尿を試験した。表２は ＩＤＤＭを発症したマウスでは、試験したマウスの尿は陽性であったことを示し ている。

Ｊ− マ　−　・　白　）　Ｍの　の゛ 表３は、ＩＤＤＭを発症しなかったＢＢラットは血清又は尿にｈｓｐ６５又は抗 ｈｓｐ６５が出現しなかったことを示す。

ＩＤＤＭが発症（９０−１００日目）したラットは、ＩＤＤＭの発症の１０から ２０日前に試験したとき、陽性であった。

測定は実施例３と４に開示された方法で実施した。

ｌ−主 ＢＢ−・　に番るＩＤＤＭの　に　゛　たｈｓ　ｈｓ　の゛ 一堅上ユユＵυＬ４宣 ＩＤＤＭを発症する前の種々の時期に５人の患者から血清を入手した。これらの ヒトは既知のＩＤＤＭ！Ａ者の第１親等の親類であり、ＩＤＤＭを発症する危険 があると考えられたので、ＩＤＤＭの発症の１／２から２年前に血清を採取した 。

これらの人以外に新たにＩＤＤＭと診断された４人の患者の血清又は尿について ｈｓｐ６５を調べた。対照血清及び尿は、１０人の活動性多発性硬化症患者と、 ＩＤＤＭに関係のない種々の病気で一般病院にいる３５人の小児から得た。その 結果を表４に示す、測定は実施例３と４に記載の方法に従い実施した。

ｌ−土 ＩＤＤＭ準　におしるｈＨ５Ｐ６５と　ｈＨ５Ｐ６５前ＩＤＤＭ患者の５人のう ち４人とＩＤＤＭ患者のうち４人のうち２人は、ｈＨＳＰ６５と抗ｈＨＳＰ６５ 測定で陽性であることが上の表かられかる。対照で陽性のものはいない、従って ＭＴのｈｓｐ６５に対するウサギの抗ｈｓｐ６５は、ＩＤＤＭの発症に関連する ヒトの血清又は尿中のｈＨ５Ｐ６５を検出することができる。さらにＭＴのｈｓ ｐ６５はヒト抗体を検出できる。

前述したように、ヒト又は他の供給源から得られたｈｓｐ６５と同様に、ヒト又 は他の供給源のｈｓｐ６５に対して作成された抗体もまた、これらの測定に使用 できる。生物の進化の過程でｈｓｐ６５は高い保存性を有しているため、これが 可能なのである。

前Ｉ　ＤＤＭ患者と新ＩＤＤＭ患者のすべてが陽性ではなかったことは、図２に 記載したようにＩＤＤＭの実際の発症時又はその近辺の時期には、ｈＨＳＰ６５ と抗ｈＨＳＰ６５の濃度は減少しがちであるという事実から説明できる。従って これらの陰性の患者は、Ｉ　ＤＤＭの発症の時期に近い時に試験されたために、 陽性が消失しているのかも知れない。

上記より、ヒト患者ではＩＤＤＭの発症の少し前にｈＨＳＰ　６５（又はこれと 交差反応する分子）又は抗ｈＨ５Ｐ６５は陽性になることが明らかである。従っ てｈｌ（ＳＰ６５又は抗ｈＨ５Ｐ６５の測定は、ＩＤＤＭが進行しているかも知 れない人たちをスクリーニングするのに有効である。

ＩＤＤＭが進行しているヒトの血清又は尿に現れるｈＨＳＰ　６５はいくつかの 起源に由来するであろう。その起源は、健常なベータ細胞に普通に発現され、こ のベータ細胞がウィルス感染や毒性の攻撃を受けた時免疫学的また破壊の前兆と して放出されるｈＨＳＰ６５かも知れないし、又は免疫学的破壊のストレスによ りベータ細胞から放出されるのかも知れない。

ｈＨｓＰ６５はまたベータ細胞に対する長期の活性のある時期に、免疫系の細胞 により発現されるかも知れない。この系におけるｈＨＳＰ６５の起源は現在明ら かではないが、いったんｈＨＳＰ　６５が放出されると、その人は刺激されてｈ ＨＳＰ６５分子に対する抗体を作り出す。

分子量６４．０００の規定されていない分子に対する抗体は、バエケスコツ（Ｂ ａｅｋｅｓｋｏｖ）ら、ネーチ＋　−（Ｎａ　ｔｕｒｅ）第２９８巻、１６７− １６８頁（１９８２年）により、数人の新たに診断されたＩＤＤＭ患者に記載さ れている。しかしこの６４キロダルトンの抗原がｈｓｐであるか否かは不明であ る。さらに３４キロダルトン抗原は、ＩＤＤＭの発症の前に血液又は尿に現れる ことは知られていない、この規定されていない６４キロダルトンベータ細胞抗原 に対して、ｈｓｐ６５はアミノ酸配列が公知の規定された蛋白である（トーμ（ Ｔｈｏｌｅ）ら、インフェクシッン・アンド・イミユニティ−（Ｉｎｆｅｃｔｉ ｏｎ　ａｎｄ　Ｉｓｍｕｎｉｔｙ）第５５巻、１４６６−１４７５頁（１９８７ 年））、同様に、ｈＨｓＰ６５のアミノ酸配列は、図３に示されている。

実施例６：　ＣＢＬＫｓ’　７　スの　７４０■／ｋｇ１日の投与量のベータ細 胞毒ストレプトシトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）を５日間連続で接種 すると、Ｃ５７ＢＬ／ｋｓｊマウスは約２週間後にＩＤＤＭを発症する。

この実験では、１０匹の雄のＣ５７ＢＬ／ｋｓｊマウス（３月齢）の群に、ＩＤ ＤＭを誘発する（約１４日日）ために低投与量のストレプトシトシン注射（４０ ■／ｋｇ１日×５）をしたか又はしなかった。そしてＩＤＤＭの発症（２５０■ ％より高い血中グルコース）と血中のｈｓｐ６５と抗ｈｓｐ６５の出現について 調べた０表５に示すように、１０日日目ＩＤＤＭの臨床症状の現れる前）までに ｈｓｐ６５が出現し、次に抗ｈｓｐ　６５が出現した。

表−」− °　７　９　番　ＤＭ　ス　し　゛ シンモール：　ｈｓ　ｈｓ　の の　の マイコバクテリウムのｈｓｐ６５に認識される哺乳類の分子を同定するために、 上記のウサギの抗ｈｓｐ６５抗血清と、Ｔ８７８と命名されたモノクローナル抗 体を使用した。この抗体は、エム・アール・シー結核ユニット（ＭＲＣＴｕｂｅ ｒｃｕｌｏｓｉｓＵｎｉｔ）　、ハマースミス病院（Ｈａａｎｅｒｓｍｉｔｈ　 ｌ１ｏｓｐｉｔａｌ）　、ロンドン、のジェイ・イバニイ（Ｊ、　Ｉｖａｎｙｉ ）博士に開発され、供給されたものである。この抗体はマイコバクテリウムチュ ーバーキュローシス（Ｍ、　ｔｕｂｅｃｕｌｏｓｉｓ）のｈｓｐ６５分子に対し て特異的である。これらの抗体の結合に対して３種類の調製物を測定した：　ク ローン化したマイコバクテリウムチューバーキュローシス（Ｍ、　ｔｕｂｅｃｕ ｌｏｓｉｓ）のｈｓｐ６５　；　Ｉ　ＤＤＭを発症しているＮＯＤマウスと健常 な対照の血清；そして熱ショックで処理したラットの繊維芽細胞溶解物と対照の 繊維芽細胞溶解物。

ｈＨ５Ｐ６５は実施例１に記載の方法で調製した。ラットの胎児繊維芽細胞を標 準的方法を使用して培養した。熱シヨツク蛋白を誘導するために、繊維芽細胞の 培養物を４２．５°Ｃで２時間インキュベートし、次に３７°Ｃで１／２時間イ ンキュベートした。熱シヨツク繊維芽細胞と対照繊維芽細胞を３７℃で培養し、 プロテアーゼインヒビターとともに０．１％ＳＤＳと１％トリトンよりなる溶解 緩衝液を用いて、約５Ｘ１０’個の細胞を溶解した。ブランドフォード（Ｂｒａ ｄ　ｆｏｒｄ）定量法により蛋白濃度を２　ｔｕｇ　／　ｄに調製した。この物 質を標準的電気泳動法で還元条件（２％の２−メルカプトエタノール）下でル− ンにつき１００μｇで１０％ポリアクリルアミドゲルに流した。健常な対照マウ スとＩＤＤＭを発症しているＮＯＤマウスからの血清を２■／ｄに希釈した。こ れらの血清の調製物を上記したようにポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し た。次に標準的方法により、分離した蛋白をニトロセルロースペーパー上に移し た。次にペーパーを１％ヘモグロビン（ブロッキング用）とともに室温で１時間 インキュベートした後、１　：　１００希釈の正常ウサギ血清又は抗ｈｓｐ　６ ５で、又は１：１００希釈のＴＢ７８又は対照モノクローナル抗体で室温で２時 間インキュベートした。ＩｔＳＩ放射標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン又はヤギ 抗マウス免疫グロブリンでインキュベートして洗浄し、オートラジオグラフィー で現像して、分離したバンドへの抗体の結合を検出した０分子量標準物質も含め た。

抗ｈｓｐ６５によりいくつかのバンドが検出されることが見いだされた。マイコ バクテリウムｈｓｐ６５はウサギ抗血清とモノクローナル抗体ＴＢ６Ｂの両方に より検出された。これらの抗体はまた、熱シヨツク後に発現が増強された薔歯類 の繊維芽細胞中の６５キロダルトンのバンドを認識した。加熱した繊維芽細胞溶 解物では、３０キロダルトンと４７キロダルトンに陽性のバンドがあった。ＩＤ ＤＭを発症して０るＮＯＤマウスの血清中に約２５キロダルトンに追加のノくン ドカ（検出された。従って哺乳類の６５キロダ、ルトン、４７キロダルトン、３ ０キロダルトン、２５キロダルトンの分子はマイコバクテリウムのｈｓｐ６５と 交差反応性がある。

実施例８：ｈＨ５Ｐ５は　の−ン゛ルノ１ンス　れ王 ＩＤＤＭの進行には血液や尿中のｈｓｐ６５の発現の上昇が伴うため、ランゲル ハンス島のベータ細胞がｈｓｐ６５の供給源かも知れないと考えられた。この理 論を試験するために、抗ｈｓｐ６５がランゲルハンス島細胞に結合するか否かを 調べるために試験した。

標準的方法を使用してラットの膵臓の凍結切片（厚さ６−８μ）を作成した。切 片に１：５０希釈した正常ウサギ血清又は抗ｈｓｐ６５抗血清（非特異的抗体を 除去するために肝臓粉末で吸収されている）を重層し、室温で３０分間インキュ ベートし、ＰＢＳで完全に洗浄し、次に５％正常ヤギ血清で５分間インキュベー トした後、フルオレセイン標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンで室温で３０分間イ ンキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、螢光顕微鏡で調べた。ランゲルハンス島は抗 ｈｓｐ６５抗血清で明るく染色されていたが、対照ウサギ血清は染色されなかっ た。従ってランゲルハンス島はｈｓｐ６５を発現する。

実施例９：ｈｓに・　る　はＩＤＤＭ　悸　るランゲルハンス島はｈｓｐ６５を 発現することがわかったため、抗ｈｓｐ免疫応答はベータ細胞に障害を与え従っ てＩＤＤＭを誘発するかも知れないと仮定された。ＩｌｌのＣ５７ＢＬ／ｋｓ　 ｊ　マウス（８週齢）又は雌のＮＯＤマウス（４，５週齢）の腹腔内に、５０μ ｇのｈｓｐ６５を注射し、ＩＤＤＭを発症するか否かを試験した（２５０■％よ り多い血中グルコースで証明さなくとも３カ月早かった。　Ｃ５７ＢＬ／ｋｓｊ マウスは自然発生ＩＤＤＭはなかった。ｈｓｐ６５を油又はＰＢＳで乳化して投 与した。油に乳化したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を対照として使用した。そ の結果を表６に示す。油中のｈｓｐ６５はＩＤＤＭを誘発するがＰＢＳ中のｈｓ ｐ６５はＩＤＤＭを誘発しないことがわかった。従っておそらくベータ細胞はｈ ｓｐ６５と交差反応する抗原を発現するため、ｈｓｐ６５に対する免疫応答はＩ Ｄ０Ｍ発症の引金となる。

２表−」− パ°　パン　ｈｓ　４ＩＤＤＭ＝　る 追加の実験で正常な株のマウス（これはＮＯＤマウスのようにＩＤＤＭを自然発 症せず、Ｃ５７ＢＬ／ｋｓｊのように低投与量ストレプトシトシン投与後でもＩ 　ＤＤＭを発症しない）に、５０μｇの抗原、不完全フロインドアジュバント（ 油）で乳化したｈｓｐ６５又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を腹腔内投与した 。１９日後の朝にマウスから採血し、血中グルコースを測定した。２００ｍｇ％ を越えるグルコース濃度によりＩＤＤＭを診断した。その結果を表７に示す。ｈ ｓｐ６５による免疫は、特に適当な投与量で投与した場合、−見正常な系統のマ ウスでもｌ　ＤＤＭを誘発することができる。これは、ｈｓｐ５５又はｈｓｐ６ ５と免疫学的に交差反応する分子はＩＤＤＭの標的抗原であるという結論を支持 している。

表−ｊ− “・　の　のマ　ス・Ｉ　ＤＤＭ ＩＨ主１五 盪工ｌ五 有効なアジュバントなしで、又は免疫学的寛容誘導性担体を用いて抗原を投与す ると、免疫学的非応答性（即ち抗原に対する特異的寛容）を誘導することができ ることは充分確立されている。従ってＰＢＳ中のｈｓｐ６５を注射したマウスが 、油中のｈｓｐ６５により誘導されたＩＤＤＭに対する耐性を獲得したか否かを 調べるため試験した。ＰＢＳ中のｈｓｐ６５を受けた後１月後に、Ｃ５７ＢＬ／ ｋｓｊマウスに油中ｈｓｐ６５を投与したが、どのマウスも３週間後にＩＤＤＭ は発症しなかった（血中グルコース濃度が２５０■％を越えることにより判定し た）、これに対してＰＢＳ中のｈｓｐ６５を受けた１０匹の対照マウスのうち８ 匹が、油中ｈｓｐ６５を受けた後にＩＤＤＭを発症した。

別の実験で３００週齢雌のＮＯＤマウスにＰＢＳ中のｈｓｐ６５を腹腔内投与し た後、ＩＤＤＭを誘発するために１５日後に５０μｇの油中ｈｓｐ６５を投与し た。ＩＤＤＭの存在は投与後３５日目の血中グルコースが２００■％を越えるこ とにより測定した。マウスが５月齢になったときもう一度ＩＤＤＭの存在を測定 した。この年齢ではすべての未処理の雌のＮＯＤマウスのうち５０％でＩＤＤＭ が検出されることがわかっている。結果を表８に示す。

ＪＬ ＩＤＤＭに・　ン　−　のｈｓ　の −Ｌユニｍ星 即ちｈｓｐ６５は糖尿病性免疫反応に対する寛容を誘導するために使用できるこ とがわかる。この寛容はｈｓｐ６５の免疫学的な攻撃に対して有効なだけでなく 、ＮＯＤマウスでの自然発生ＩＤＤＭの自然の進行に対する治療法としても有効 である。

実施例１１：　ｈＨ３Ｐ６５　いる　のＩＤＤＭの′ム図１０に示すようにｈｓ ｐ６５はＩＤＤＭの自己免疫反応に対する耐性を誘導するのに使用される。これ は、外因性ｈｓｐ６５に対する接触を通してベータ細胞のｈＨＳＰ６５に対する 免疫学的寛容の機構により引き起こされるようである。即ちｈｓｐ６５はＩＤＤ Ｍが臨床的に明らかになる前に治療に使用することかでき、重症の永久的障害が 与えられる前に自己免疫反応を阻止することができる。この実験の結果は表８に まとめられており、ＮＯＤマウスにおける自然発生ＩＤＤＭの自然の進行は有意 に阻止することができ、ｈｓｐ６５（侍にｈＨ５Ｐ６５）は治療的に使用するこ とができる。ＮＯＤマウスでは自己免疫反応は非常に早く始まる。１月齢ですで にインスリン炎が検出される。この系統の雌のマウスでは５０％は５月目にＩＤ ＤＭが臨床的に明瞭になる。３０日齢のマウスにｈｓｐ６５を投与すると、この 自然の進行を阻止する。これはランゲルハンス島に対する自己免疫が始まった後 でも治療が有効であることを示している。

実施例１２：ｈＨＳＰ　に・　Ｔ　の・　番　の１行ぶ　’　％ｚｉ 図３に示されているヒトｈｓｐ６５は通常の方法で発現のためにクローン化し、 そこから実質的に純粋な組換えヒトｈＳｐ６５が得られた。

本実験は、自然発生的にベータ細胞を破壊しているマウスはヒ）ｈｓｐ６５に対 して反応性のＴ細胞を明示していることを確証している。種々の年齢の雌のＮＯ Ｄ／Ｌ　ｔマウスの５から７匹の群から得られた肺臓細胞懸濁液について、基本 的にサイクグロブリンに対するＴ細胞応答について記載された方法（アール・マ ロン（Ｍａｒｏｎ、　Ｒ）　ら、ジャーナルオブイミュノロジ−（Ｊ、　Ｉｍｍ ｕｎｏｌｏｇｙ）　第１３１巻、２３１６−２３２２頁１９８３年））に従い、 Ｔ細胞の増殖について測定した。簡単に説明すると、ｌＸｌ０’細胞／−の細胞 を、５μｇ／ｄの以下の抗原の存在下又は欠如下で、マイクロタイターウェル中 の０．２　ｉｄの培養液の中で３重測定で７２時間インキュベートシた：　ヒト ｈｓｐ５５、ＭＴｈｓｐ６５、又はＭＴｈｓｐ　７０　。

最後の１２時間のインキュベートの間のＤＮＡへの［３Ｈ］チミジンの取り込み により増殖を測定した。結果はΔＣＰＭとして示す：　試験抗原を含むウェルの 平均ＣＰＭ−抗原を加えないで培養した対照ウェルの平均ＣＰＭ士標準標準誤差 Ｅ）、対照ＣＰＭは９．０００から１０．５００まで変化した。マウスの約５０ ％でＩＤＤＭの発症は４から５月齢の間であり、図４でｒＩＤＤＭ」として示し である。

ＮＯＤ／ＬｔＴ細胞の自発的反応性（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｒｅａｃｔｉｖ ｉｔｙ）の程度を種々の抗原に対して年齢の関数として示しているこの実験の結 果は、図４でグラフで示しである。　ＮＯＤ／ＬＬマウスがインスリン炎をほと んど示さないか又は全く示さない１月齢の時期は、どの抗原に対してもＴ細胞の 反応性は検出されなかった。しかし２から３月齢の時期はインスリン炎の上昇と ともに、ヒトｈｓｐ６５に対しては強く上昇傾向の反応性が認められたが、ＭＴ ｈｓｐ６５に対する反応性は比較的小さくＭＴｈｓｐ７０に対する反応性は全（ なかった、ヒ）ｈｓｐ６５と？１Ｔｈｓｐ６５に対する反応性は４．５月にＩＤ ＤＭの発症とともに低下し、ＩＤＤＭの臨床症状の出現した後の６月目でもさら に低下した。従ってヒ）ｈｓｐ６５に対するＴ細胞の応答は、明瞭なＩＤＤＭに 先行するベータ細胞の障害の増加に関連しているようであった。ＩＤＤＭの発症 に伴うＴ細胞の反応性の低下は、ベータ細胞とそれらの抗原が失われることによ る免疫刺激の低下により説明することができる。

ＮｏＤ、／ｌ、ｔＳＣ５７ＢＬ／６　、又はＣ５７ＢＬ／ＫＳ株の３．５月齢の 雌の５匹のマウス群から、膵臓細胞の懸濁液を得た。１群のＮＯＤ／ＬＬマウス （第２群）はあらかじめ油中の５０μｇ／ｄの門Ｔｈ５ｐ６５の腹腔内投与によ りプライム（ｐｒｉｍｅ）　しておいた。いくつかの肺臓細胞（第４．６．８群 ）は、１．２５９ｇ／ｒｄのＣｏｎ　Ａで４８時間インキュベートして活性化し た。Ｃｏｎ　Ａ後の細胞をＣｏｎＡを含まない増殖培地に移し、さらに５日間培 養した。

実施例１２に記載したように、組換えヒトｈｓｐ６５、組換えＭＴｈｓｐ６５又 は対照大腸菌抗原に対する、活性化−週間後の肺臓細胞の増殖性応答について試 験した。対照大腸菌は、ｈｓｐ６５遺伝子を含まないρＥＸ２プラスミツドでト ランスフェクションした。抗原は５μｇの濃度で使用した。増殖性応答は３重測 定で行い、刺激指数（Ｓｌ）として示しである：　試験抗原でインキュベートし た肺臓細胞に取り込まれた３）（−チミジンの、抗原無添加の対照培養物に取り 込まれた３）１−チミジンに対する比率。対照培養物の平均ＣＰＭは５，０００ −７．０００であり、平均ＣＰＭからの標準偏差はいつも平均の１０％より小さ かった。細胞のいくつかをＣｏｎ　Ａで４８時間培養して活性化することにより 、糖尿病を引き起こす細胞の能力について試験した。前糖尿病性（ｐｒｅｄｉａ ｂｅｔｉｃ）の、１月齢の雌のマウスの群の腹腔内に、２５Ｘ１０’個の何も添 加していない肺臓細胞、又はＭＴｈｓｐ６５で刺激しておいた、又は刺激してい ないマウスのＣｏｎ　Ａで活性化した膵臓細胞を投与した。２１日後に高血糖症 （血中グルコース〉２００■／ａ）と組織学的インスリン炎として現れた急性糖 尿病の出現について、マウスに点数をつけた。大体午前９時頃に各マウスの尾静 脈から血液を取り、ジスカングルコースメーター（Ｄｉｓｃａｎ　Ｇｌｕｃｏｓ ｅ　Ｍｅｔｅｒ）と試験紙（ベーリンガーベルヶ（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ） 、西ドイツ）を使用して血中グルコース濃度を測定した。インスリン炎は組織的 証拠により判定した（ワイズマンインスティテユート（Ｗｅｉｚｏ＋ａｎｎ　Ｉ ｎ５ｔｉｔｕｔｅ）の組織学実験室でヘマトキシリン染色とライトグリーン染色 を行った）、試験スライドがどのマウスに由来するかは明らかにしていない人間 によりインスリン炎のグレード分類を行った。

その結果を表９に示す、ヒトｈｓｐ６５に対するＮＯＤ／Ｌｔマウス牌臓細胞の 心臓細胞ＭＴｈｓｐ６５に対するＮＯＤ／Ｌｔマウス牌臓細胞の心臓細胞の差（ １−４群）は、対照大腸菌抗原に対するＮＯＤ／Ｌｔ牌臓細胞の心臓細胞はｈｓ ｐ６５に対する他の株の応答（５−７群）よりも有意に大きかった（Ｐ＜０．０ １）　（スチュデントのＴ検定を使用：　ＮＤ、測定されなかった）。

ｗＩ＝　−−４市　Ｊ　ｔ　品 表９に示された結果は、ヒトｈｓｐ６５に対する３、５月齢のＮＯＤ／Ｌｔマウ スのＴ細胞応答は、マウスをＮＴｈ５ｐ６５に対して免疫することにより（２群 ）、又はＴ細胞マイトジェンであるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ　；　４群）で Ｔ細胞集団を活性化することにより増強させることができることを示している。

ＣｏｎＡは、ｉｎ　ｖｉｖｏで動物内に存在する活性化された自己免疫性Ｔ細胞 を優先的に刺激することが証明されている。従ってｉｎ　ｖｉｖｏでＭＴｈｓｐ ６５に対する免疫をしたか、又はｉｎ　ｖｉｔｒ。

でＣｏｎＡで活性化したＮＯＤ／ＬｔＴ細胞は、−ヒトｈｓｐ６５に対する本質 的な応答を示す。

ヒトｈＨＳＰ６５はそれ自身マイトジェンではない、ＩＤＤＭを自然発症しない 株（Ｃ５７ＢＬ／６　（５群と６群）又はＣ５７ＢＬ／ＫＳ（７群と８群））の 成体マウスはＣｏｎＡ刺激によるＴ細胞反応性を示さない。

最後に表９は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＣｏｎ　Ａによる抗ヒトｈｓｐ６５Ｔ細胞 集団の活性化は、１月齢の前糖尿病性のＮＯＤ／Ｌｔマウス（２群と４群）に急 性糖尿病を移すことができることを示している。

ヒ）ｈｓｐ６５と糖尿病に対するＴ細胞応答性の関連性は表１０に示されている ０表１０のデータを出した実験では、マロン（Ｍａｒｏｎ）の記載する方法（前 述）に従い、ＭＴｈｓｐ　６５　（５μｇ／−）で膵臓細胞を繰り返し刺激する ことにより、Ｔ細胞株が得られた。クローンは株細胞の限界希釈法により単離し た。基本的に表９に関して説明した方法に従い、Ｔ細胞クローンの、急性糖尿病 を移すことができる能力について試験した。ただし５Ｘ１０”個のＣｏｎ　Ａ活 性化細胞を腹腔内に移した０表９について説明したよう、抗原に対するクローン の増殖性応答はＳＩとして測定した。対照培養物のＣＰＭは４゜５００−６，５ ００　ＣＰＭであり、平均ＣＰＭからの標準偏差はいつも１０％未満であった。

表−±１ −　Ｔ　ローンはヒ　ｈｓｔ これらのクローンはＭＴｈｓｐ６５又は大腸菌対照に対するよりもヒトｈｓｐ６ ５に対してより激しく応答することがわかった。さらに、クローン２７、Ｃ７、 そしてＣ９はヒトｈｓｐ　６５に対して強く応答し糖尿病誘発性であったが、ヒ ）ｈｓｐ６５に対して比較的弱く応答したクローン２１は糖尿病を移ｊことがで きなかった。クローン化Ｔ細胞はただ１つの特異ｒを有する抗原リセブターを発 現するため、ヒ）ｈｓｐ６５上Ｑエピトープ（ＭＴｈｓｐ６５上のエピトープに ある程度交差反応ｒのエピトープ）を認識するＴ細胞により、急性糖尿病は前Ｖ 尿病性ＮＯＤ／Ｌ　ｔマウスに移されると結論される。

実施例１４　：　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　Ｔ　は　炊　ＩＤＤＭに・　ン ５−７匹の２月齢の雌のＮＯＤ／Ｌｔマウスの群を、５０μｇの油中抗原の腹腔 内投与によりプライムしたが、あるいはしなかった、マウスの肺臓細胞を、実施 例１３０表９に関して説明したように抗原（５μｇ／ｍ）又はＣｏｎＡ　（１， ２５μｇ／ｌ１１）でインキュベートしたか、あるいはしなかった。次に１月齢 の前糖尿病性マウスの群の腹腔内に細胞を移した（２５×１０６個）、実施例１ ３に記載した方法で３週間後に２、性糖尿病（高血糖症；血中グルコース〉２０ ０■／ｄ１）についてマウスを調べた。８月齢に高血糖症とインスリン炎により 自然発生ＩＤＤＭについて検査した。この実験の結果を表１１に示す。対照（１ 群）との差は有意であった。（＊Ｐ＜０゜０１）。数字は２−３回の実験の累積 の結果である。

麦−土工 ｈｓ６ＴＬ　−’　悸　し　・　の　炊ＩＤＤＭに・　ン Ｔ　の１ 予想されたように未処理の対照マウス（１群）は７週齢で高血糖症ではなく、８ 月齢では８１％について自然発生ＩＤＤＭが見られた。これに対して、肺臓細胞 をｉｎ　ｖｉｔｒｏでＭＴｈｓ６５（２具）又はＣｏｎＡ（３群）で活性化して あった場合は前糖尿病性マウスの肺臓細胞を用いて急性糖尿病（血中グルコース が２００■／ａを越える）を移すことができた。

ｉｎ　ｖｉｖｏでＭＴｈｓｐ６５、Ｂ　ＳＡ、ＭＴｈｓｐ７０でプライムしてあ ったマウスから得られた肺臓細胞を、ｉｎ　ｖｆｔｒｏで各抗原で活性化の後投 与した。抗ＭＴＭｐ６５細胞（６群）により急性糖尿病は誘発されたが、抗ＢＳ Ａ又は抗ＭＴｈｓｐ７０細胞では活性化されなかった（４群と５群）、ヒトｈｓ ｐ６５に対して強く応答したＣｏｎ　Ａ及びＭＴｈｓｐ６５活性化細胞に対して （表８と表９Ｌ　ＢＳＡ又は？１Ｔｈｓｐ７０反応性細胞の増殖定量では、ＭＴ ｈｓｐ６５又はヒトｈｓｐ６５に対する反応性は検出されなかった（図には示し ていない）。従って急性糖尿病の転移は、ヒトｈｓｐ６５に応答するＴ細胞を含 有する細胞集団に特異的であった。

表１１は、急性糖尿病に引き続いて、８月目に発生する自然発生ＩＤＤＭの発生 率は有意に低下することを示している。

マウスを抗ＢＳＡ又は抗ＭＴｈｓｐ６５牌臓細胞でインキュベートしても、急性 糖尿病も自然発生ＩＤＤＭも誘導されなかった（４群と５群）。

急性の採用的に転移された（ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ） 　糖尿病が自然発生ＩＤＤＭを防ぐ能力も、上記（表９）の抗ｈｓｐ６５Ｔ細胞 で行った実験で見られた。３１匹のマウスに毒性のクローン２７、Ｃ７、Ｃ９を 注射すると、すべてが１．２週間で急性糖尿病になった。２週間以内にこれらは すべて高血糖症から自然に回復し、自然発生ＩＤＤＭを発症した３１匹のうち２ 匹のみが８月齢で自然発生ＩＤＤＭを発症した。

これに対して、無毒性クローン２１を注射された１３匹のマウスは急性糖尿病を 発症セす、これらのマウスのうち６匹は６月目までに自然発生糖尿病になった（ Ｐ＜０．０１）。

従って抗ヒトｈｓｐ６５Ｔ細胞の採用的転移（ａｄｏｐｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｆ ｅｒ）による糖尿病は一過性である。しかしこれらのマウスは急性糖尿病から回 復しただけでなく、後の自然発生ＩＤＤＭの進行に対して耐性を獲得した。従っ て前糖尿病性マウスを無毒性Ｔ細胞に接触させるとＩＤＤＭの発症を加速したり 、症状を悪化させたりすることはなく、むしろ糖尿病反応に対して耐性を獲得さ せることになる。

実施例１５：　゛　Ｔ　番ｈＨＳＰ　のン　ＩＤＤＭ 実施例１３の表８に関して記載した方法により、Ｔ細胞をＣｏｎＡ又はＭＴｈｓ ｐ６５でインキュベートした後、ライダー（Ｌｅｔｄｅｒ）ら、プロシーディン グズオブナショナルアカデミーオブサイエンシーズオブユーエスエ−（Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、＾、）第８４巻、４５７７頁（１９８７年）に記載の方法に従い、活性 化細胞をγ線照射（１５００Ｒ）又はグルタルアルデヒド（０，３％、１５分） で減弱化することにより、３月齢の前糖尿病性ＮＯＤ／Ｌｔマウスの肺臓細胞か らＴ細胞ワクチンを作成した。５週齢の雌の前糖尿病性ＮＯＤ／Ｌｔマウスの１ ５又は２５匹の群の腹腔内に１０’個の処理した肺臓細胞をワクチン接種したか 、又はしなかった、６月齢の時、各群の５匹のマウスについて、ヒ）ｈｓｐ６５ に対する肺臓のＴ細胞の増殖応答を試験した（刺激指数（Ｓｒ）で表示しである ）。抗原を添加しない場合の対照ＣＰＭはワクチン接種をしなかったものは２． ４６５±２３５であり、ワクチン接種したものは２．２４６±１８５であった。

残りのマウスから採血し、標準的固相ラジオイムノアッセイ（シヱクタ−（Ｓｃ ｈｅｃ　ｔｅｒ）　ら、ジャーナルオプバイオロジカルケミストリー（Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）第２５９巻、６４１１−６４１９頁（１９８４年））に より、ヒトｈｓｐ６５に対する抗体を測定した。血清抗体を検出するためにマイ クロタイタープレートを、ｈｓｐ６５（抗ｈｓｐ６５用）、インスリン（抗イン スリン用）又はＤＭイディオタイプ陽陽性モルモットゼインスリンイディオタイ プ抗体用）でインキュベート（５０μｇ／ｄ）することにより被覆した。被覆ウ ェルを試験マウス血清（１：５０希釈）でインキュベートし、１２５■標識ヤギ 抗マウス免疫グロブリン（アマージャム社（Ａｍｅｒｓｈａｔａ）　、英国ｉ　 １０’ＣＰＭ／ウェル）を反応させて、これらの抗原に対する抗体の存在を検出 した。ｈｓｐ６５抗原（又はこれと交差反応する抗原）を検出するためにウェル を１：５希釈した試験血清１．５μｌでインキュベートし、ウサギ抗ｈｓｐ６５ 免疫グロブリン（１：１００希釈）で重層した。

１１Ｉ標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（アマージャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ） を使用して結合を測定した。相対的抗体価は、１　：　１００希釈血清のヒトｈ ｓｐ６５に対する結合のＣＰＭを意味する。Ｗ尿病ではない１月齢のＮＯＤ／Ｌ ｔマウスから得られた血清抗ヒトｈｓｐ６５の平均ＣＰＭはｉ、　４５０±１９ ４であった。前記の固相ラジオイムノアッセイによりｈｓｐ６５又は交差反応性 抗原の存在についてマウスの血清を試験した。その結果を表１２に示す、ワクチ ン接種したマウスはワクチン接種しなかったマウスとは有意に差があった。　（ ＊　ｐ　＜　０．０１）。

表１２の結果は、本来は毒性のＣｏｎ　Ａ又はＭＴｈｓｐ６５活性Ｔ細胞は、Ｔ 線照射（１，５０ＯＲ）又はグルタルアルデヒド（０゜３％）処理で減弱化する ことができ、自然発生ＩＤＤＭに対してワクチン予防することができることを証 明している。他の実験的疾患で証明されたように、照射処理又はグルタルアルデ ヒド処理自己免疫Ｔ細胞は毒性がなく、急性糖尿病を引き起こさ荘かった（デー タは示していない）、ＩＤＤＭの予防は、ヒトｈｓｐ６５にに対するワクチン接 種マウスの自然発生性のＴ細胞と後退の反応性の著しい低下に関連していた。

前の例で説明したように、ＮＯＤ／Ｌｔマウスのランゲルハンス島に対する障害 は、血清中に抗ｂｓｐ６５抗体に認識される蛋白が出現することで示される。こ の血清抗体はおそらく障害されたベータ細胞に由来するため、その量に対するＴ 細胞ワクチン接種の影響をみるのは興味深いことである。Ｔ細胞ワクチンの投与 は、６月齢で血清中に現れるｈｓｐ６５又は交差反応性抗原の量を著しく低下さ せることがわかる（表１２）。

この低下は組織学的観察でインスリン炎が検出されないことと関連していた（デ ータは示されていない）。

従ってＭＴｈｓｐ６５又はＣｏｎＡで活性化された抗ヒトｈｓｐ６５Ｔ細胞は、 減弱化され自然発生ＩＤＤＭの進行に対してＮＯＤ／Ｌｔマウスをワクチン予防 するのに使用できる。ワクチン化状態はＩＤ０Ｍ過程の免疫学的兆候が減少した ことで特徴づけられた：　抗ヒ）ｈｓｐ６５Ｔ細胞と抗体。同時にｈｓｐ６５又 はｈｌ（ＳＰ６５に交差反応性の血清抗原が減少していた（インスリン炎の停止 により説明できる）。

実施例１６：　Ｔ　クチン　番　の沃　に実施例９において、インスリン炎と高 血糖症にＳ徴づけられる急性糖尿病は、油中ＭＴｈｓｐ６５で前糖尿病性ＮＯＤ ／Ｌｔマウスを免疫することにより誘発することができることが証明された。ま たこの型の糖尿病は一過性であり、実際には後の自然発生ＩＤＤＭにつながるこ とも示された０本実験は急性誘発性糖尿病に対する、ヒ）ｈｓｐ６５に対する免 疫の効果とＴ細胞ワクチン接種の影響を試験する。

実施例１５の表１２に関して記載したように１０７個のＣｏｎＡ活性化、グルタ ルアルデヒド処理した肺臓細胞で、４週齢の雌のＮＯＤ／Ｌｔマウスの群をワク チン接種したか、又はしなかった、２週間後に急性糖尿病を誘発するために、マ ウスにＭＴｈｓｐ６５又はヒトｈｓｐ６５（油中５０μｇ）で刺激（ｃｈａｌ　 ｌｅｎｇｅ）した。次に８月齢で自然発生ＩＤＤＭの進行を見るために、実施例 １３に記載したように高血糖症とインスリン炎を測定して１．マウスを調べた。

その結果を表１３に示す。有意差は＊Ｐ＜０．０１であった。

表　１３ 、　ｈｓ　”　Ｍ　ＩＤＤＭに・　る Ｔ〕ン ０Ｍ ワクチン接種しなかったマウスはヒトｈｓｐ６５又はＭＴｈｓｐ６５に対して応 答し、急性、一過性糖尿病を発症したことがわかる。この後に自然発生ＩＤＤＭ に対する耐性が起きた。

これに対してＴ細胞処理マウスは、抗原誘発ゑ、性糖尿病に対して耐性であった 。これらも自然発生ＩＤＤＭに対しては防御性であった。即ち］゛細胞ワクチン 接種は、人工免疫により誘発された急性糖尿病と後の自然発生ＩＤＤＭに対して 、有効に耐性を作り出している。

実施例１７：　二二土上金底 ヒトｈｓｐ６５分子上の最も重要なエピトープは、ＭＴｈｓｐ６５配列と完全で はないが部分的相同性を有するアミノ酸配列であると推定された。完全な相同性 を有するものはそれほど作用が強くないため、対応するエピトープはおそらく少 し異なるのであろう。

ヒトｈｓｐ６５配列のカルボキシル基末端で始まる一連のペプチドを合成し、マ イコバクテリウムとヒトの配列でわずかに違いがある配列を選んだ。このような ペプチドのひとつは、図３に示すヒ）ｈｓｐ６５分子のアミノ酸配列４３７＝４ ６０を有している、即ちＨ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ −Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ−Ｃｙｓ　−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ａ　１　ａ −Ｌｅｕ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−＾１ａ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ −＾５ｐ−ＯＨ，このペプチドはｐ２７７と命名した。

対照ペプチドＰ２７８は、３個のアミノ酸分だけｐ２７７と重複し、次の配列を 有する：　）Ｉ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｇｌｙ− １１ｅ−Ｇ１ｕ４１ｅ−１１ｅ−Ｌｙｓ−＾ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−１ ｉｅ−ＯＨ、これは図３のアミノ酸配列４５８−４７４に相当する。

実施例１８：　ＩＡＵ−のＩＤＤＭのい　に・番　“月Ｊ二Ｅ免ｍ 実施例１２に記載した方法に従いｐ２７７に対する増殖性応答について、前糖尿 病性の３月齢の雌のＮＯＤ／ＬｔマウスからのｐＩＮ細胞の懸濁液を試験し、そ の結果を表５に示した。これらのマウスはさらに１−３月の間明瞭なＩＤＤＭを 発現しないが、それらのＷｌｌＩｉＴ細胞はＰ２７７に対して強い応答を示すが 、２２７８に対しては応答しない０本実験及び他の１ｎｖｉｔｒｏ実験で、ペプ チドの最適濃度は５．μｇ／ｄである。

実施例１９：　Ｔ　ローンレ　７ｈｓ ・に・　” 急性糖尿病を若い前糖尿病性ＮＯＤ／Ｌｔマウスに移すことができるＣ７とＣ９ Ｔ細胞クローン（前記の表１０参照）は、ｐ２７７に対して応答する。このクロ ーンはｐ２７７と全マイコバクテリウムｈｓｐ６５に対して応答するが、ｈｓｐ ６５遺伝子を含まないプラスミツドの対照調製物には応答しないことがわかる。

従って病原性Ｔ細胞が２２７７を認識するため、ｐ２７７ベブチドは病原性エピ トープを有すると結論することができる。

Ｃ７と０９もマイコバクテリウムｈｓｐ６５分子に対して応答するため、ｐ２７ ７エビトープはマイコバクテリウムｈｓｐ６５分子上にも存在するようである。

従って２２７７配列に相同性のマイコバクテリウムｈｓｐ６５配列は免疫学的に 機能性である。マイコバクテリウムの配列は以下のようであり、Ｐ２７７のヒト の配列から下線の部分が置換を受けている：ｔｌ−Ｖａ　ｌ　−Ａｌｔ−Ｇ　ｌ ｙ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｇ　Ｉｙ−１ａｌ−１−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ−」１−ＪＬＬｔ− Ａｈｔ−Ｐｒ。

４、ｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−７−−−−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−剪１ ４ｓｐ−ＯＲ、２４個のアミノ酸のうち１３個が置換されていることがわかる。

従って２２７７の免疫学的な性質は、その配列の約６０％の変化を許容できると 結論することができる。最小エピトープは２４個でなく１０個のアミノ酸であっ たとしても、マイコバクテリウムの配列から少なくとも４から６個のアミノ酸だ け異ならないＰ２７７の１０個のアミノ酸の配列はない。

実施例２０：　ベプチ′　７７は　に・　る几　とし工使且工ｌ工 非免疫原性型の全ｈｓｐ６５分子は、アジュバント中の免疫原性ｈｓｐ６５に対 する免疫により誘発されたＮＯＤ／Ｌｔマウスの急性糖尿病に対して、耐性を誘 発することができることが実施例１０で証明された。図７は、ペプチドｐ２７７ は誘発糖尿病に対する耐性を得るのに使用することができる（しかし２２７８は 異なる）ことを示している。７匹の５週齢の雌の前糖尿病性ＮＯＤ／Ｌｔマウス の群を、不完全フロインドアジュバント中の５ａｌｇのｐ２７７又はＰ２７８で 処理した。２週間後、急性糖尿病を誘発するためにマウスを不完全フロインドア ジュバント中の５ａｌｇの免疫原性ｈｓｐ６５で免疫した。

３週間後、血中グルコースを測定した。Ｐ２７７で処理したマウスはいずれも高 血糖症（血中グルコースが２００ＩＩＩｇ／ｄ１以上）にはならなかったことが わかる、これに対してペプチドｐ２７８で処理した７匹のマウスのうち５匹は糖 尿病になった。

Ｐ２７７による処理はまた、これらの７匹のマウスのすべてで自然発生糖尿病の 発症を防止したが、種々の抗原（例えばウシ血清アルブミン又はｈｓｐ７０）で 処理された対照マウスの８０％は７月齢までに糖尿病を発症した。即ち、ｐ２７ ７による処理は、誘発性糖尿病及び自然発生糖尿病の両方に対して耐性を与えた 。従って特異抗原は、非免疫原性型で投与された全ｈｓｐ６５分子で見られる治 療効果を生み出すことができる。

ｐ２７７の上記のデータはＮＯＤマウスの糖尿病に関するものであるが、全ｈｓ ｐ６５分子又はこれと免疫学的に交差反応性の他の分子と同様にこのペプチドは 、ヒトにおける診断と治療に使用できることは明白である。これはＮＯＤマウス の糖尿病はヒトＩＤＤＭの忠実なモデルとして認識されているからである。さら にＮＯＤマウスは、ヒトＩＤＤＭに関連したＤＱＪの主要組織適合性抗原複合体 （ＭＭＣ）のクラス■分子に類憤の分子（ＩＡ）を有することが、トッド（Ｔｏ ｄｄ）ら、ネーチ＋　（Ｎａｔｕｒｅ）第３２９巻、５９９頁（１９８７年）に より発表されている。従ってヒトとＮＯＤ糖尿病誘発性Ｔ細胞は両方とも、Ｄ　 Ｑ　ａ鎖の５７位のアスパラギン酸の欠如したＭＨＣクラス■分子により提示さ れる同じペプチド配列を認識するはずである。もし糖尿病を発症しているヒトと ＮＯＤマウスが同じ抗原（例えばｐ２７７）を見ているなら、このようなペプチ ドはヒト及びＮＯＤマウスのＩＤＤＭの診断と治療に使用することができる。

本発明による発生段階のＩＤＤＭの診断マーカーとして役立つＩＤＤＭの進行中 にヒトの体で産生される特定の蛋白は、約６５キロダルトンのヒト熱シヨツク蛋 白（又はこれと交差反応性の抗原）である、６５キロダルトンのヒト熱シヨツク 蛋白のヌクレオチドと推定されるアミノ酸配列を図３に示す。

以下この蛋白をｈＨ５Ｐ６５と呼ぶ、６５キロダルトン蛋白に結合する同じ抗体 と交差反応する他の蛋白もｉｎ　ｖｉｖｏで産生される０例えばマイコバクテリ ウムチューバーキュローシス（Ｍ。

ｔｕｂｅｃｕｌｏｓｉｓ）のｈｓｐ６５分子に対して特異的なモノクローナル抗 体と交差反応する４７キロダルトン、３０キロダルトンそして２５キロダルトン 分子が、マウスとラット中に見いだされた。このような抗体と交差反応する４７ キロダルトン分子もラット繊維芽細胞中に見いだされている０種間の熱シヨツク 蛋白の保存性を考慮すると、これらはヒトにも存在するであろうことは充分予想 される。さらにＩ　ＤＤＭの進行中に血液又は尿中に放出される蛋白は、ｈＨ５ Ｐ６５ではなく　ｈＨ５Ｐ　６５と交差反応性の分子であるかも知れない、それ はベータ細胞上の表面蛋白、又はｈＨ５Ｐ６５上に存在するエピトープを保持し ている蛋白の断片かも知れない。

従って本発明に従ってその血液又は尿中の存在を測定される、ＩＤＤＭの存在又 はその発生段階の診断マーカーとして役立つ分子は、ｈＨＳＰ６５に対するポリ クローナル抗体、そして好ましくはｈＨＳＰ６５のＰ２７７配列に対するモノク ローナル抗体又はポリクローナル抗体と免疫学的に反応するものでなく、任意の 種の６５キロダルトンの熱シヨツク蛋白に対するヒト血清中に見いだされる他の 関連分子も含むものと意図される。この定義は具体的には、すでに見いだされ本 明細書中で議論されている６５キロダルトン、２５キロダルトン及び４７キロダ ルトン蛋白を含むが、これらに限定されるものではない。

自然界の熱シヨツク蛋白の構造の類似性のため、本明細書に開示した診断マーカ ーの存在は、具体的に任意の生物の熱シヨツク蛋白に対するポリクローナル抗体 又はモノクローナル抗体によって検出することができる０例えばマイコバクテリ ウムチューバーキュローシス（Ｍ、　ｔｕｂｅｃｕｌｏｓｉｓ、ＭＴ）の熱シヨ ツク蛋白は、遺伝子工学的方法により容易に大量に産生ずることができる。この 蛋白はウサギやマウスにおいて抗体の産生に使用することができる。本発明に従 ってウサギ抗ＭＴｈｓｐ６５ポリクローナル抗体は、ｈＨＳＰ６５の存在を測定 するために使用することができる。同様にＭＴｈｓｐ６５に対して免疫したマウ スの肺臓から得られたＭＴｈｓｐ６５と反応するモノクローナル抗体が選択され る。このような抗体はまたｈＨ５Ｐ　６５と交差反応するであろう、ｐ２７７は 病原的に活性のエピトープを含むことが証明されているため、好適なモノクロー ナル抗体はＰ２７７蛋白に対して作成されたものである。

本明細書の実施例で使用される特定のモノクローナル抗体は例示のためのみであ る。ある抗原と特異的に反応する性質に関して特異的に産生されたこのような任 意のモノクローナル抗体が、本発明の目的のために他のどれよりも優れていると 考えられる理由はない。

前記したように、ｈＨ５Ｐ６５蛋白（又はこれと交差反応性の分子）は診断マー カーとして使用できるのみでなく、ｈＨ５Ｐ６５に対する抗体も使用することが できる。ヒトの患者においてｈＨ５Ｐ６５又は関連蛋白が放出されたとき自然発 生的に形成される抗体が測定される。　ｈＨ５Ｐ６５又は関連蛋白の測定がこの 目的に役立つのと同程度に、このような抗体の陽性の結果は、ＩＤＤＭが迫って いることの指標として有用である。任意のｈｓｐ６５蛋白との反応性を捜して２ ．抗ｈｓｐ６５抗体は測定される。即ちＭＴｈｓｐ６５蛋白は抗ｈＨＳＰ６５抗 体と交差反応する。もちろん抗ｈ）ｌｓＰ６５抗体の存在の測定のための使用に 好適な蛋白はｈＨ５Ｐ６５蛋白であり、さらに好ましくはそのＰ２７７配列であ る。しかし通常の技術を有する当業者は過度に実験をしなくても、ある蛋白又は 蛋白断片が抗ｈｌ（ＳＰ６５抗体と交差反応するかどうかを、経験的に決めるこ とができる。このような蛋白又は他の分子が抗ｈＨｓＰ６５抗体と免疫反応する か否かをめるために、簡単なｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験が使用される。もし交差反応 する場合は、本発明の方法において使用され、それも本発明に包含されると考え られる。

ｐ２７７配列は、上記した実験において記載したＮＯＤ／Ｌｔマウス、ヒトｈＨ ５Ｐ６５に誘発されそのＴ細胞はヒトｈｓｐ６５に対して応答する他の株のマウ ス、Ｃ５７ＢＬ／６　、上の病原性エピトープに対応することが証明されている が、そのＴ細胞はＰ２７７に対して応答しない。従ってこれはｈＨ３Ｐ６５上の 唯一の病原性エピトープでないことは明らかである。実際に前糖尿病性ヒト愚者 の血液又は尿中に見いだされる診断マーカーは、約６２キロダルトンの分子量を 有すると性状解析されている。従って主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）で提示さ れる特定のエピトープ（ヒト白血球抗原、ＨＬＡ）は個人毎に異なるであろうと 予想される。従って現在ｐ２７７配列が好適であると提示されているが、通常の 技術を有する当業者は、ｈＨ５Ｐ６５蛋白中の抗原性配列はｐ２７７と同じ又は 関連した配列を有するものが見つかるであろうことを理解できるであろう。本発 明はすべてこのような配列を包含すると意図される。

前記の例はｈｓｐ６５又は交差反応性抗原そしてそれに特異的な抗体が、発生段 階の糖尿病の診断マーカーとして使用できるのみでなく、このような蛋白に特異 的なＴ細胞も使用できることを示している。実際にこのような特異的なＴ細胞は 抗体の出現に先行するようである。実際にベータ細胞を攻撃するのは抗体ではな くＴ細胞である。通常の技術を有する当業者は、特定の抗原に対する’ｌ胞活性 の多くの測定法があることを理解できるであろう。例えば試験対象者からリンパ 球を得て、ｈＨ５Ｐ６５又は交差反応性抗原に接触させ、活性化に対して起きる 種々の効果（例えば増殖、サイトカイン産生又はリンホカイン産生、酵素産生、 カルシウムフランシスなど）を測定する。このような測定法は当該分野の技術の 範囲内にある。

上記したようにｈｓｐ６５はラットのアジュバント関節炎やヒトのリウマチ関節 炎に関連していることが知られている。

１００Ｍ過程と異なり関節炎の過程はその顕著な症候や症状により明白に表現さ れているため、ＩＤＤＭを発症している人と関節炎の人との鑑別において、ｈｓ ｐ６５又は抗ｈｓｐ６５の測定に関する不確定性はないであろう。従って関節炎 の症候や症状がないのにｈｓｐ６５又は抗ｈｓｐ６５が検出される場合は、全臨 床的ベータ細胞の破壊と発生段階のＩＤＤＭの可能性に注意を向けさせるのに役 立つであろう。ベータ細胞に対する自己免疫の診断を確定するのに、追加の検査 （例えばベータ細胞に対する抗体）が利用されるであろう。

１００Ｍ過程が臨床的には無症状であるのに対し、全身性エリテマトーデス（Ｓ ＬＥ）は明白な症候と症状で特徴づけられるため、全身性エリテマトーデスとｈ ｓｐ９０との関連は、１００Ｍ過程と混乱されることはないであろう。

ｈＨｓＰ６５又は関連蛋白に対する抗体は、ＩＤＤＭの診断に使用され、ここで ｈｓｐ６５又は他の免疫学的に交差反応性分子は患者に皮下注射され、皮膚反応 の有無が観察される。またはｈＨＳＰ６５又は関連分子を患者の血液又は血液成 分と接触させ、患者の血液中に任意の公知の免疫学的方法により検出される抗ｈ Ｈ５Ｐ６５との免疫学的反応の有無（即ちｈｓｐ６５と交差反応する抗体）につ いて観察される。このような公知の免疫学的方法にはラジオイムノアッセイ、蛍 光免疫定量法、ＥＬＩＳＡ　（酵素免疫測定法）、ケミルミネセンス測定法など がある。

ｉｎ　ｖｉｖｏの皮膚試験では、充分な時間の後（例えば投与後２４から７２時 間後）に注射部位での皮膚反応が測定される。

膨大化及び／又は発赤は遅延化過敏症に起因する。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏの血清学的検査では、患者の血清をｈＨｓＰ６５又は関連蛋白 と接触させる。血清がｈｓｐ６５の抗原決定基に対する抗体を含有する場合は、 免疫反応が起こり、これを標準的方法（例えばＥＬｒｓＡ、　ｍ集など）により 検出し定量する。

ｈＨｓＰ５５、抗ｈＨ５Ｐ６５又はｂＨｓＰ６５特異的Ｔ細胞の存在を検出する のに公知の免疫測定技術が使用される。例えばｈｓｐ６５を使用する測定法によ り、ある人の血清中の抗ｈ）ＩＳＰ６５抗体の存在が陽性であると測定された場 合はＩＤＤＭが発生段階であるか又は存在することを意味するという事実を通常 の技術を有する当業者が知れば、このような当業者は使用できる免疫測定技術の タイプは充分認識しているであろう、ラジオイふノアッセイ（固相又は液相）以 外に、任意の従来の免疫測定法（例えば酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ） 、酵素やラジオアイソトープ以外の標識物を用いる不均一免疫測定法（競合法及 び非競合法）、蛍光消光法及び酵素チャネリング法に基づく均一免疫測定法、免 疫沈障法（放射免疫拡散法を含む）、そして肉眼の半定量的検出法と定量的濁度 的検出法に基づく凝集測定法など）が使用できる。

測定には任意の通常の固相法又はサンドインチ測定技術を使用することができる 。

同様に本発明を達成するための種々の測定を実施するために、キットを調製して もよい。このようなキットは単一の測定又は決まった数の測定を実施するのに必 要なすべての材料を含むであろう。例えば抗ｈＨＳＰ６５抗体の存在を測定する ためのキットは、固相に固定されたｈｓｐ６５と、検出すべき抗ｈｌｌｓＰ６５ 抗体の非可変領域を認識することができる標識した抗体（例えば標識抗ヒ）　Ｆ ａｂ）を含む、　ｈＨｓＰ６５の存在を測定するためのキットは、固相に固定さ れた抗体（これはｈＨｓＰ　６５と反応するか又は交差反応する）、そして固定 抗体が認識するエピトープとは異なるｈｌ（ＳＰ６５のエピトープと反応するこ とができる標識抗体を含む、キットはまた、ｈｓｐ６５と抗ｈ）ＩＳＰ６５抗体 の免疫複合体を沈降させることができる試薬と、キットの使用法を記載する説明 書とキットの材料を入れるための容器を含む、任意の従来の標識物（例えばラジ オアイソトープ、酵素、発色団、又は発蛍光団）を使用することができる。典型 的なラジオアイソトープはヨード−１２５又はイオウ−３５である０本目的のた めの典型的な酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ 　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）　、ｃｘ　−ガラクトシダーゼ及びアルカリ性ボスフ ァターゼがある。

本発明の診断用組成物は、ｈｓｐ６５に適当なアジュバントや付属成分を組合せ ることにより調製される。

上記の実験で証明されたように、ランゲルハンス島細胞と熱シヨツク繊維芽細胞 はマイコバクテリウムｈｓｐ６５と交差反応する分子を放出する。マイコバクテ リウムｈｓｐ６５の免疫はＩＤＤＭを引き起こすという事実は、マイコバクテリ ウムｈｓｐ６５と交差反応する抗原に対する免疫攻撃はベータ細胞に障害を与え ることを示している。このような免疫応答は、交差反応性ｈｓｐ６５又は侵入す る微生物により偶然免疫された後に起きる最初の出来事である。ｈＨｓＰ６５又 は関連蛋白の放出も、ウィルス又は毒素（ｔｏｘｉｎ）によるベータ細胞の障害 の後に起きるであろう、即ち血液又は尿中のｈｓｐ５５陽性分子の出現がなぜＩ ＤＤＭの進行の初期の兆候であるかというと、それはこれらの分子はベータ細胞 の障害の進行に伴って放出されるからである。同様にｈＨｓＰ６５に対する免疫 応答それ自身がＩＤＤＭを引き起こすため、抗ｈＨＳＰ６５抗体はＩＤＤＭが迫 っていることの信鱈できる兆候である。

ｈＨｓＰ６５の抗体が本来偶然の免疫の結果であっても、又はウィルスや毒素に よるベータ細胞の障害の後のｈＨｓＰ６５の放出によるものであっても、ベータ 細胞中に含まれるｈＨｓＰ６５が攻撃されるため、抗ｈＨｓＰ６５抗体又は抗ｈ ＨｓＰ６５　Ｔ細胞の産生は、ベータ細胞破壊の過程を増強し永続させる。

毒性抗ｈｓｐ６５Ｔ細胞により移されたか又はｈｓｐ６５に対する能動的免疫に より誘発された急性糖尿病から回復した後は、自然発生ＩＤＤＭを防ぐことがで きるとうい事実は重要である。これは自己免疫応答の動力学と規模がそれ自身の 調節につながるということを示唆している。潜行性で慢性の過程は自己免疫疾患 に対する自然の防御に対し「こそこそ逃げてしまうｊようであるが、明かな自己 免疫刺激は制御を増強するようである。疾患のゑ、性発症による自己免疫疾患に 対する耐性の獲得は、実験的自己免疫脳を髄炎（ＥＡＥ）のラットモデルで普通 に見られる。ミニリン塩基性蛋白（ｍｙｅｌｉｎｂａｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ） に対する能動的免疫又は活性Ｔ細胞の受動的転移により誘発された急性ＥＡＥか らの自然回復の後は、ラットはＥＡＥをさらに誘発させようとする試みに対して 耐性を示す、ＥＡＥの発現は、ミニリン塩基性蛋白に応答する毒性Ｔ細胞を調節 することができる機構（おそらく抗イデイオタイプ抑制）を活性化することが見 いだされた。

減弱化した自己免疫Ｔ細胞を使用してＴ細胞ワクチン接種をすることが、急性疾 患を引き起こさずに制御機構を活性化させる１つの方法のようである。ＥＡＥに 対するワクチン接種で示された種類の抗イデイオタイプ及び抗エルゴタイプ（ａ ｎｔｉ−ｅｒｇｏｔｙｐｉｃ）　Ｔ細胞は、自己免疫性抗ｈｓｐ６５Ｔ細胞を鎮 め、ＩＤＤＭの臨床症状の発現を防止する。

この理論は、ｈＦＩｓＰ６５に対する免疫応答の寛容又は抑制の誘導は、どのよ うにして糖尿病過程が開始した後でもこれを防止し治療することができるかを説 明するのに役立つ。即ちｈｓｐ６５、ｈｓｐ６５と交差反応する低分子量分子（ ２５，３０又は４７キロダルトン）、又は断片、修飾されたペプチド配列、合成 ペプチド、又は融合蛋白の計画に基づく又はｈｓｐ　６５の物理化学的要求を満 足するように計画された有機分子でさえも、ｈＨｓＰ６５に対するポリクローナ ル抗体と交差反応するか又はｈＨｓＰ６５と交差反応する抗体の産生を引き起こ すことができる限りは、ＩＤＤＭ過程を防止又は治療するのに使用することがで きる。この目的のためにはｈｓｐ６５のｐ２７７配列が好適な物質である。さら にｈＨｓＰ６５又は関連抗原に対して特異的な減弱化Ｔ細胞は、４その断片又は 活性部分とともに、このような免疫の誘発又はこのような免疫応答の抑制に使用 することができる。

ｈｓｐ６５分子はｈｌｌｓＰ６５に対する寛容を作りだしてベータ細胞の自己破 壊を停止させることにより、ＩＤＤＭの進行の持続に対して効果的な治療用組成 物として有用であることが証明されている０発生段階のＩ　ＤＤＭのこのような 治療に使用される活性成分は、ｈＨＳＰ６５と免疫学的に交差反応する任意の物 質である（即ちそれはｈｆｌｓＰ６５に対するポリクローナル抗体と交差反応す るか、又はｈＨＳＰ６５と交差反応する抗体を誘導する）、このような物質はペ プチドであろうと蛋白、炭水化物又は他の物質であろうと、寛容を誘導する方法 で投与された場合は、この交差反応性によりｈＨｓＰ６５に対する寛容を誘導す るのに役立つ、この物質がｈｓｐ６５蛋白の場合は、任意の種のものが使用でき る。　ｈＨＳＰ６５と免疫学的に交差反応するために、この物質は完全な蛋白で ある必要はなく、蛋白自身の抗原活性を保持する蛋白の断片（例えばｐ２７７） でもよい。ある物質がｈＨＳＰ６５と交差反応するか否かはルーチンの実験によ り測定することができる。その物質がｈＨＳＰ　６５に対するポリクローナル抗 体と交差反応するか、又はｈＨＳＰ６５と交差反応する抗体の産性を誘導する場 合、それは発生段階のＩＤＤＭの治療法に関する限り、本発明の範囲に含まれる と考えられる。このような物質がヒトの治療に使用できるという追加の証明は、 実施例１０に記載したようにマウスの試験で寛容の誘導を試験することである。

このような実験はルーチン的であり、過度な実験は必要ない。

ヒトＩＤＤＭの治療に好適な化合物はｈＨＳＰ６５である。ヒト熱シヨツク蛋白 のアミノ酸配列は図３に記載されている。

この目的のためにこの蛋白を使用することができる。そのｐ２７７配列はこの目 的のためのもう一つの好適な分子である。

ここに記載したｈｓｐ６５蛋白以外に、ｈｓｐ６５と交差反応する能力を有する その塩、官能性誘導体、前駆体及び活性画分も使用することができる０図３の配 列又はバンエデン（ｖａｎＥｄｅｎ　）ら（前述）の記載する配列（１つ又はそ れ以上のアミノ酸が欠失しているか付加されている、又は他のアミノ酸で置換さ れている）も、それらがｈＨ５ＰＢ５と免疫学的に交差反応する能力を有してい る限り、本発明に包含される。

本明細書において「塩」という用語は、蛋白分子のカルボキシル基の塩とアミノ 基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は当業者に公知の方法で作 成され、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、第 二鉄塩、又は亜鉛塩などの無機塩、そして例えばアミン（例えばトリエタノール アミン、アルギニン又はリジン、ピペリジン、プロカインなど）との有機塩基の 塩を含む、酸付加塩としては、例えば無機酸（例えば塩酸又は硫酸）との塩、そ して有機Ｍ（例えば酢酸又はシュウ酸）との塩を含む。

本明細書で使用される「官能性誘導体」という用語は、残基又はＮ−又はＣ−末 端基上の側鎖として存在する官能基から当業者に公知の方法で調製される誘導体 を意味しており、薬剤として許容される限り（ＦＳち蛋白の活性を破壊せず、そ れを含む組成物に有害な性質を与えず、その抗原性に悪影響を与えない限り）本 発明に包含される。

これらの誘導体としては、例えばカルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニウ ム又は−級又は二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分 （例えばアルカノイル、カルボサイクリックアロイル基）と作成されるアミノ酸 残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、又はアシル部分と作成される遊離ヒド ロキシ基（例えばセリン残基又はスレオニン残基のヒドロキシ基）の０−アシル 誘導体がある。

「前駆体」とは、動物又はヒトの体内でｈｓｐ６５の前に形成されｈｓｐ６５に 変換される化合物である。

本発明において実質的に精製された「活性画分」としては、ｈ）ＩＳＰ６５と交 差反応する能力を有する限り、ｈｓｐ５５蛋白分子単独又は関連する分子と一緒 であるか又はそこに結合している残基（１又はリン酸残基）と−緒であるｈｓｐ ６５蛋白のポリペプチド鎖の断片又は前駆体、又は蛋白分子又は糖残基自身の凝 集体を含む。このような活性画分の例としては、ｈＨＳＰ６５のＰ２７７配列が ある。

前記の活性成分は、免疫原性応答を誘導するより寛容を誘導するような方法で投 与することが、非常に重要である。即ちそれは油又は他の免疫原性アジュバント 中で投与されるべきである。活性成分が寛容を誘導するのに好適な投与方法は、 抗原−担体複合体が投与された時抗原に対する寛容の誘導を促進する担体ととも に投与することである。このような担体は寛容誘導性担体（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎ ｉｃ）として知られている。公知の寛容誘導性担体としては、Ｄ−アミノ酸の重 合体、ポリエチレングリコール、垢分子の重合体、自己２ｇ０分子、自己肺臓細 胞、及び脂肪酸分子がある。寛容を誘導するために、抗原はモノマーとして非常 に可溶性の形で投与される。抗原に対する寛容を誘導する他の公知の方法は、寛 容誘導性特徴により具体的に選択された担体さえなしで経口的に投与する方法で ある。寛容を誘導するための具体的な投与方法は、通常の知識を有する当業者に 公知であり、このような方法は本発明において使用される。このような方法自体 は本発明には含まれない。

ＩＤＤＭの予防又は治療に使用されるＴ細胞調製物は、前記の１００Ｍ特異的抗 原に対する特異性を獲得したＴ細胞（即ちｈＨｓＰ６５、又はこれと交差反応性 の抗原、例えばｐ２７７に特異的）から得られる。これらの特異的細胞は、この ような抗原の存在下でインキュベートするか、又はＴ細胞による免疫応答を誘導 することができるマイトジェン（例えばコンカナバリンＡ）でインキュベートし て活性化されていることが必要である。このような活性化ＩＤＤＭ特異的Ｔ細胞 は、好ましくは例えば放射線照射により減弱化される。好適な減弱化の方法（こ れはＴ細胞の免疫原性を増加させる好ましい効果もある）は、充分な圧力と時間 の水圧で処理して、膜蛋白の実質的な損失を伴うことなくＴ細胞の免疫原性を増 強させることによる、圧力処理である。又はその圧力は、細胞から細胞表面蛋白 が剥がれるような強さと時間であってもよい。低速遠心分離により細胞を除去し た後、高速遠心分離をしてその断片を、上澄液中に残存している可溶性蛋白のよ うに、ワクチンとして使用する。これらの方法のすべては本特許の譲受人のヨー ロッパ特許第２６１，６４８号に記載されており、その内容は参考のため本明細 書中に引用されている。

ＩＤＤＭ特異的、活性化Ｔ細胞はまた、化学的架橋剤（例えばホルムアルデヒド 、グルタルアルデヒド、又は８−メトキシソラレンのような光活性化ソラレン架 橋剤（本特許の譲受人のヨーロッパ特許３３３．６０６号に記載されており、そ の内容は参考のため本明細書中に引用されている））で処理してもよい、このよ うなＴ細胞はまた細胞骨格破壊剤（例えばサイトカルジン（ｃｙｔｏｃｈａｌｓ ｉｎ）又はコルヒチン（ｃｏｃｈｉｃｉｎｅ）　）で処理してもよい、圧力処理 、化学的架橋剤処理及び細胞骨格破壊側処理のどれを組合せてもよい、さらにこ の欅に処理した細胞は、溶解し、固定された細胞膜のみ回収し、使用することが できる。これらの方法のすべては、ヨーロッパ特許第２６１．６４８号に詳細に 記載されている。

ＩＤ０Ｍ抗原（即ちｈＨＳＰ６５蛋白、又はこれと交差反応性の抗原）に特異的 なＴｌｉ［［Ｉ胞すセブターの可変領域、及び好ましくはそのＶＤＪ領域を単離 し、自己免疫脳を髄炎Ｔ細胞すセプターに対する、ハウウェル（Ｈｏ＋＊ｅＪｌ ）　（前述）とバンデンバーク（Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ）　（前述）の記載した 方法で、本発明のＴ細胞ワクチン調製物として使用することができる。

本明細書に記載したようにＩＤ０Ｍ抗原がいったん明らかになれば、ＩＤＤＭに 関してこれらすべての公知の方法を使用することができる。いったん抗原が公知 になれば、通常の技術を有する当業者は、過度の実験をすることなくこれらのす べての技術を実施することができる。従って本発明はこのような方法のすべてを 含むものと意図される。これらのすべては、本発明の抗原を使用する追加の方法 である。

このような寛容誘導性組成物は、例えばＩ　ＤＤＭの進行に関して遺伝的な危険 性のあるＩＤＤＭ患者の家族で、ＩＤＤＭの進行を防止するためのワクチンとし て投与される。しかし好ましくは、血液又は尿中にｈＨｓＰ６５が検出される人 で、好ましくはｈＨ５Ｐ６５に対する免疫応答が発現する前に、ＩＤＤＭの持続 的進行を防止するために使用される。寛容誘導性は免疫応答を防止し、従って調 節不可能な抗ｈＨ５Ｐ６５応答により引き起こされる障害（ＩＤＤＭ）を防止す る。しかし抗ｈＨ５Ｐ６５抗体が出現した後に本発明の組成物を治療に使用して も遅すぎることはない０表８と表１３に示した実験の結果は、本発明はランゲル ハンス島に対する自己免疫が始まった後でも免疫応答を停止するのに役立つこと を示している。ヒトの自己免疫過程の進行は何年もかかるため、応答のダウン調 節（ｄｏｗｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）でさえ有効であろう。

ｈＨ５Ｐ６５又は関連蛋白（前述）は、ＩＤＤＭの診断のための診断組成物にお ける抗原とともに、特にＩＤＤＭの緩解と治療のためのワクチンとして、薬剤組 成物における免疫原として使用することができる。当業者に公知の方法で調製さ れる、これらの薬剤組成物及び診断用組成物は、また本発明の一部を構成する。

ｈｓｐ６５のワクチンとしての又は治療薬としての効果を改良するための別の方 法は、公知の遺伝子工学的方法でｈｓｐ６５をそのまま又は融合蛋白の一部とし て又はその多分子体（ｍｕｌｔｉａ＋ｅｒ）として発現する微生物を作成するこ とである。これらの微生物自身は、その微生物に対する抗体の産生を刺激するの みでなく、ＩＤＤＭの緩解と治療に有用な生きたワクチンの調製に使用すること ができる。これらの遺伝子工学的に作成された微生物、及びそれらを含む薬剤組 成物もまた、本発明の一部を構成する。適切な遺伝子工学的に作成された微生物 の例としては、バクシニア（Ｖａｃｃｉｎｉａ）やサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅ ｌｌａ）の株がある。

本発明の組成物は、経口的に又は非経口的（例えば皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔 内、肛門内）に投与される。寛容誘導性薬剤組成物は当業者に公知の方法で調製 される。

前記の具体的なｓｐＡは、現在の知識を応用することにより本発明の概念から逸 脱することなく、本発明の具体的な態様を他人が容易に修飾又は適用することが できるように、充分記載されており、従ってその様な改良や応用は開示された態 様内に包含されるものと考えられる。本明細書で使用された用語は説明のための みであり、限定するものではない。

図面の簡単な説明 図１は、ＩＤＤＭを発症しなかったＮＯＤマウスの血清中のｈｓｐ６５、抗ｈｓ ｐ６５、抗インスリン抗体、そして抗イデイオタイプ抗体の量を示す。

図２は、ＩＤＤＭを発症したＮＯＤマウスでは疾患の進行が明瞭になる前にｈｓ ｐ６５と抗ｈｓｐ６５が顕著に増加していることを示すグラフである。

図３は、ヒトＰＬ蛋白（これはｈ）ｌｓＰ６５である）のヌクレオチドと、推定 されるアミノ酸配列を示す。

ＵｊＪ４は、年齢の関数としてのヒトｈｓｐ６５、ＭＴ−ｈｓｐ　６５及びＭＴ −ｈｓｐ　７０に対するＮＯＤ／ＬｔＴ細胞の自然の反応性の程度を示すグラフ である。

図５は、ペプチドの濃度の関数としてのＰ２７７とｐ２７８に対するＴ細胞の増 殖応答を示すグラフである。

図６は、Ｐ２７７、ＭＴ　ｈｓｐ６５そしてプラスミツドコントロールに応答し ての、若い前糖尿病性ＮＯＤ／Ｌｔマウスに急性糖尿病を移すことができるＣ７ とＣ９Ｔ細胞の増殖を示す棒グラフである。

図７は、休止している誘導された糖尿病における、ペプチドｐ２７７とｐ２７８ に対する免疫の結果を示す。

俤歎（ｆ３徹） Ｉ／１　稍　Ｉ／Ｉ　い　膿　硝　膿　いＩ／Ｉ　膿　めＯＰＩψＧ〜−ロー ＋−１ｆ　ｒ−Ｆ４　Ｐ４　Ｐ４−Ｎ　Ｎ　Ｎ　＋＋１１＋ＩＭｗ＋ｔｗｗ１６ １１’ｌｉｌｌＴ　ｈＦｉ’ｆｔ漫Ｘ　（Ａ　ＣＰＭ　Ｘ　１ａ３＊　５Ｅ）公 ７悟ド（ｕｇ／ｍ１） ＦＩＧ、５ ４　Ｉｔ　（ｈ７５’　ｃｐｍ　Ｘ　１ｏ　＞目口閣 鉢中り″ルクース　（ｍｇ／ｄｌ） 手続補正書（自発） 平成２年１２月１７日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　患者の血液又は尿を検査して、ｈＨＳＰ６５に対する抗体と免疫学的に反応 性のある蛋白の有無、又はｈＨＳＰ６５と免疫学的に反応性のある抗体又はＴ細 胞の有無を調べることよりなる、患者のインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の 存在又はその発生段階（ｉｎｃｉｐｉｅｎｃｅ）を診断する方法。 ２　蛋白、抗体又はＴ細胞の有無について血液を検査することよりなる、請求の 範囲第１項に記載の方法。 ３　蛋白又は抗体の有無について尿を検査することよりなる、請求の範囲第１項 に記載の方法。 ４　検査の段階は、患者の血清又は尿を検査してｈＨＳＰ６５に対する抗体と免 疫学的に反応性のある蛋白の有無を調べることよりなる、請求の範囲第１項に記 載の方法。 ５　検査の段階は、患者の血清又は尿を検査してｈＨＳＰ６５と免疫学的に反応 性のある抗体の有無を調べることよりなる、請求の範囲第１項に記載の方法。 ６　検査の段階は、患者の血液又は尿を検査してｈＨＳＰ６５と免疫学的に反応 性のあるＴ細胞の有無を調べることよりなる、請求の範囲第１項に記載の方法。 ７　蛋白はｈＨＳＰ６５のｐ２７７配列に対する抗体と免疫学的に反応性のある ものである、請求の範囲第４項に記載の方法。 ８　抗体はｈＨＳＰ６５のｐ２７７配列と免疫学的に反応性のあるものである、 請求の範囲第５項に記載の方法。 ９　検査段階はラジオイムノアッセイよりなる、請求の範囲第４項に記載の方法 。 １０　検査段階はＥＬＩＳＡ法よりなる、請求の範囲第４項に記載の方法。 １１　検査段階は、ｈＨＳＰ６５を患者の皮下に注射して、検出可能な皮膚反応 の発生を観察することよりなる、請求の範囲第５項に記載の方法。 １２　ＩＤＤＭの有無を診断するためのキットにおいて、ｈＨＳＰ６５イディオ タイプ抗体と、検出すべきｈＨＳＰ６５抗体の非可変領域又は抗ｈＨＳＰ６５イ ディオタイプ抗体を認識できる標識をつけた抗体、及びｈＨＳＰ６５又はその抗 体の有無に関して検出可能なシグナルを与えることができる試薬よりなる、上記 キット。 １３　ｈＨＳＰ６５イディオタイプ抗体は固相に固定されており、標識をつけた 抗体はＦａｂである、請求の範囲第１２項に記載のキット。 １４　標識はラジオアイソトープ、酵素、発色団、そして発蛍光団よりなる群か ら選択される、請求の範囲第１２項に記載のキット。 １５　インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の予防又は治療法において、ＩＤＤ Ｍの臨床症状が現れる前に、ｈＨＳＰ６５に対するポリクローナル抗体と免疫学 的に反応するか、又はｈＨＳＰ６５と免疫学的に反応する抗体の産生を引き起こ す物質を、ｈＨＳＰ６５に対する免疫学的寛容を誘導するような方法で投与する ことよりなる、上記方法。 １６　ＩＤＤＭの治療において、治療されるべき患者は、発生中のＩＤＤＭの測 定結果は陽性であったが臨床症状がまだ現れていない患者である、請求の範囲第 １５項に記載の方法。 １７　ＩＤＤＭの治療において、患者はその血液又は尿中に、ｈＨＳＰ６５に対 する抗体と免疫学的に反応性のある蛋白、又はｈＨＳＰ６５と免疫学的に反応性 のある抗体が検出されるが、まだＩＤＤＭの臨床症状が現れていない、請求の範 囲第１５項に記載の方法。 １８　投与される物質は、薬剤として許容される免疫学的寛容誘導性（ｔｏｌｅ ｒｏｇｅｎｉｃ）の担体中の薬剤組成物の形である、請求の範囲第１５項に記載 の方法。 １９　物質はｈｓｐ６５又はその塩、官能性誘導体、前駆体又は活性画分よりな る、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２０　物質はｈＨＳＰ６５又はその塩、官能性誘導体、前駆体又は活性画分より なる、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２１　物質はｈｓｐ６５よりなる、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２２　ｈｓｐ６５はｈＨＳＰ６５である、請求の範囲第２１項に記載の方法。 ２３　物質はｐ２７７又はその塩、官能性誘導体、前駆体又は活性画分よりなる 、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２４　インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の予防又は治療のための製剤におい て、（ａ）ｈＨＳＰ６５に対する抗体に対し免疫学的に反応性のある蛋白に対し て特異性を獲得したＴ細胞であって、該Ｔ細胞は該蛋白の存在下でインキュベー トするか、又はＴ細胞による免疫応答を誘導することができるマイトジェン（分 裂促進剤）とともにインキュベートすることにより活性化されており；（ｂ）該 Ｔ細胞は減弱化されており；（ｃ）該Ｔ細胞は水圧による圧力処理、化学的架橋 剤による処理、及び／又は細胞骨格（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ）架橋剤による 処理を受けており；（ｄ）（ａ），（ｂ）又は（ｃ）の断片、又は（ａ）、（ｂ ）又は（ｃ）から脱離した表面蛋白；又は（ｅ）該蛋白に特異的な（ａ）のりセ プターの可変領域、その塩、官能性誘導体、前駆体又は活性画分より基本的に構 成されるペプチドよりなる、上記製剤。 ２５　インスリン依存性糖尿病の予防又は治療のための薬剤組成物において、薬 剤として許容される免疫学的寛容誘導性（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ）の担体と、 活性成分としてｈＨＳＰ６５に対するポリクローナル抗体と免疫学的に反応する 物質、又はｈＨＳＰ６５と免疫学的に反応する抗体を産生を引き起こす物質の有 効量よりなる、上記薬剤組成物。 ２６　活性成分はｈｓｐ６５である、請求の範囲第２５項に記載の薬剤組成物。 ２７　活性成分はｈｓｐ６５又はその塩、官能性誘導体、前駆体又は活性画分で ある、請求の範囲第２５項に記載の薬剤組成物。 ２８　活性成分はｈＨＳＰ６５又はその塩、官能性誘導体、前駆体又は活性画分 である、請求の範囲第２５項に記載の薬剤組成物。 ２９　活性成分はｈＨＳＰ６５である、請求の範囲第２８項に記載の薬剤組成物 。 ３０　活性成分はｐ２７７又はその塩、官能性誘導体、前駆体又は活性画分であ る、請求の範囲第２５項に記載の薬剤組成物。 ３１　インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の予防法又は治療法において、ＩＤ ＤＭの臨床症状が現れる前に、請求の範囲第２４項に記載の製剤を、ｈＨＳＰ６ ５に対する免疫学的寛容を誘導するような方法で投与することよりなる、上記方 法。 ３２　配列【配列があります】 、又は この配列と免疫学的に交差反応性を示すが完全な熱ショック蛋白ではないその任 意の修飾物よりなる、実質的に純粋なポリペプチド。 ３３　ポリペプチドは配列【配列があります】、又は少なくとも４０％の配列相 同性を有するその修飾物である、請求の範囲第３２項に記載のポリペプチド。 ３４　約２４個のアミノ酸を有する請求の範囲第３２項に記載のポリペプチド。