JPH04502860A - 植物ゲノムに対するｄｎａの特定部位組込み法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 植物ゲノムに対するＤＮＡの特定部位組込み法（関連分野） 本発明は組換えＤＮＡの分野に関する。特に修正植物、植物ゲノムの特定部位修 正法およびその方法に用いるＤＮＡ構築物に関する。

（関連技術） 近年植物細胞の遺伝子操作および該植物細胞のトランスジェニック植物への再生 に関する技術が開発された。

一方、植物プロトプラストへのＤＮＡの直接的トランスホーメーションを植物細 胞への望ましいＤＮＡの導入に使用し得る。この目的のためいくつかの方法、た とえばＣａ／ＰＥＧ（クレンス（Ｋｒｅｎｓ）等、１９８２：ネグルチウ（Ｎｅ ｇｒｕｔｉｕ）等、１９８７）、エレクトロポレーションおよびマイクロインジ ェクション（クロスウェイ（Ｃｒｏｓｓｗａｙ）等、１９８６）が使用可能であ る。最近開発されたマイクロプロジ豊りタイル法（フレイン（Ｋｌｅｉｎ）等、 １９８７）を用いても“裸の”ＤＮＡでインタクトな植物組織をトランスホーム し得る。一方望ましいＤＮＡをアグロバクテリウムツメファシェンス（Ａｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）およびアグロバクテリウム　リ ゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の天然のＤＮ Ａ）ランスファーシステムを用いて植物細胞に導入し得る（レヴユーについては クレー（に１ｅｅ）等、１９８７を参照せよ）。

植物細胞壁への付着後アグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ　ｔｕ＋ｎｅｆａｃｉｅｎｓ）およびアグロバクテリウム　リゾゲ ネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）はその植物細胞に ＤＮＡ断片を移し得る。この断片、トランスファーＤＮＡ　（Ｔ−ＤＮＡ）はＡ 、ツメファシェンス（ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の場合Ｔｉ−プラスミドおよび Ａ、リゾゲネス（ｒｈ　ｉｚｏｇｅｎｅｓ）の場合はＲｉ−プラスミドと呼ばれ るその細胞中の大きいプラスミド（１９０−２４０ｋｂｐ）のＴ領域と呼ばれて いるものである。このＴ−ＤＮＡは植物細胞の核ゲノムに組み込まれる（トマシ ａ　−（Ｔｏｍａｓｈｏｗ）等、１９８０　、チルトン（ｃｈｉｌｔｏｎ）等、 １９８２）。Ｔ−ＤＮＡに存在する遺伝子はその植物細胞中で発現され、その細 胞に腫瘍細胞の挙動を起こさせる（オームス（Ｏｏｍｓ）等、１９８１　；ウイ ルフイツｙ　（１’ｌｉ１１ｍｉｔｚｅｒ）等、１９８２ａ＋ｂ）。

また腫瘍誘導の原因となる遺伝子に加え、いわゆるオビンの生産を制御する遺伝 子がＴ−ＤＮＡに存在する。オクトビンおよびツバリンなどのオピンはアグロバ クテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）に対するエネルギー、窒素および 、または炭素源として働いている。

これらのオビンの代謝に必要な酵素はＴｉ−（Ｒｉ−）プラスミド上に存在する 遺伝子によってコードされている（たとえばボンホフ（Ｂｏｍｈｏｆｆ）等、１ ９７６；カー（Ｋｅｒｒ）およびロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）　、１９７６　； ホイカース（Ｈｏｏｙｋａａｓ）等、１９７７）。

オピン生産によってＴｉ−およびＲｉ−プラスミドは分類される（たとえばオク トピンまたはツバリンプラスミド）。

Ｔ領域は“ボーダー”とも呼ばれる２５塩基対の不完全なダイレクトリピート２ 個の間にある（ヤダブ（Ｙａｄａｖ）等、１９８２　；ザムブリスキー（Ｚａｍ ｂｒｙｓｋ　ｉ）等、１９８２　；ギエレン（Ｇｉｅｌｅｎ）等、１９８４　； スライトン（Ｓ＋ｉｇｈｔｏ口）等、１９８５）。シス状態でこれらのボーダー が存在することがＴ−ＤＮＡの正しいトランスファーに必要である（ワンプ（Ｗ ａｎｇ）等、１９８４、ペラルタ（Ｐｅｒａｌｔａ）およびリーム（Ｒｅａｍ） 、１９８５）　。十分なＴ−ＤＮＡのトランスファーには正しいボーダーの存在 が必要である（オームス（ｎｏｏｋｓ）等、１９８２　；ショー（Ｓｈａｗ）等 、１９８４ｂ　；ワンプ（Ｗａｎｇ）等、１９８４）　、このテストシステムに よりいくつかの実験で左側のボーダーの欠失が起こり（バッカーレン（Ｂａｋｋ ｅｒｅｎ）等、１９８９）　、他の実験で植物細胞への低効率のＴ−ＤＮＡのト ランスファーが誘導されること（ヒル（Ｈｉｌｌｅ）等、１９８３ａ　；ジョー ズ（Ｊｏｏｓ）等、１９８３）が発見された。右側のボーダーにつづいてＴ−Ｄ ＮＡのトランスファー効率を有意に促進する配列が存在する（ペラルタ（Ｐｅｒ ａｌｔａ）等、１９８６；ヴアン　ハーレン（Ｖａｎ　）Ｉａａｒｅｎ）等、１ ９８６　；ワンプ等、１９８７）　、この“エンハンサ−″要素の作用は、右側 のボーダーに関して位置及び方向において独立している（ヴアン　ハーレン等、 １９８６）。合成したボーダーを用いた実験から左右のボーダー配列は交換可能 で、結果的にその“エンハンサ−”が、どちらのボーダー配列が優勢な右側ボー ダーとなるかを決定していると考えられる（ペラルタ（Ｐｅｒａｌｔａ）等、１ ９８６　；ヴアン　ハーレン（Ｖａｎ　）ｌａａｒｅｎ）等、１９８７）。

Ｔ−ＤＮＡに加えて一方では染色体上に存在し、他方ではＴｉ−プラスミド（Ｖ ｉｒ−領域）に存在する毒性遺伝子がある。

これらの遺伝子はバクテリアの植物細胞への付着やＴ−ＤＮＡの植物細胞へのト ランスファープロセスに関係している（メルチャー（Ｍｅｌｃｈｅｒ）およびホ イカース（Ｈｏｏｙｋａａｓ）、１９８７のレヴユー参照）。

先に述べた全ての遺伝子トランスファーシステムは一般にトランスホームＤＮＡ の組込み部位を予想し得ないという欠点を有している。したがって先に述べた他 の植物トランスホーメーション技術と同様にアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａ ｃｔｅｒ　１ｕｓ）を介して植物細胞に導入されたＤＮＡはゲノム内のランダム な位置に組込まれると考えられる（チー（Ｃｈｙｉ）等、１９８６　；ウオール ロス（Ｗａｌｌｒｏｔｈ）等、１９８６　；スビールマン（Ｓｐｉｅｌｍａｎ） およびシンプソン（Ｓ　ｉａ＋ｐｓｏｎ。

１９８６）。しかし場合によっては、先に組込み部位を決定することが望ましく 、または必要でもある。こうすることによって、導入される遺伝子が望ましい発 現調節が可能となる場所に導入されるように目標を定めたり、また新しく導入し たＤＮＡを利用して特定の植物遺伝子を変異または不活性化することができる。

部位特異的様式で植物ゲノムにＤＮＡ配列を導入するいくつかの方法が報告され ている。これらの方法は全て相同組換えとして知られているメカニズムに基づい ている。

相同組換えはバクテリアやイースト内で極めて効率よく起こる過程である。これ らの生物ではこれを用いて新しく導入したＤＮＡの部位特異的組込みが行なわれ ている（ルブクン（Ｒｎｖｋｕｎ）およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、１９ ８１　；オーウェーバ−（Ｏｒｒ−Ｗｅａｂｅｒ）等、１９８１）。イーストの 場合、ゲノムに導入されるＤＮＡと相同的領域で線状化したＤＮＡ分子は１０〜 １０００倍の高い頻度で組換えを起こすことが分った。最近哺乳類細胞において もゲノムＤＮＡと新しく導入されたＤＮＡとの間で相同組換えが起こることが示 された（スミシーズ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ）等、１９８５；）−マス（Ｔｈｏａ＋ ａｓ）およびカペチ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ）　、１９８７；ソング（Ｓｏｎｇ）等 、１９８７　；ベーカー（Ｂａｋｅｒ）等、１９８８　；カペチ（Ｃａｐｅｃｃ ｈｉ）、１９８９の最近のレヴユー参照）。またこれらのシステムにおいて２つ の欠損変異体のコトランスホーメーシミンをする場合、１つの変異体の相同領域 の線状化によって、平均１０倍以上の組換え頻度が得られることが示された（ク チャーラパチ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）等、１９８４）。

２つの相同的ＤＮＡ分子間の組換えは植物細胞への同時の導入後に行なわれるこ とがワルツ（Ｉｌｉｒｔｚ）等（１９８７）によって報告された。ヨーロッパ特 許出願（ＢＰ−Ａ−０３１７５０９）は相同組換えによる植物ゲノムへのＤＮＡ 配列の組込み法を公開している。この出願によると植物宿主へのＤＮＡ構築物の 導入はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋）　）ランスファー システムのような従来技術によって行ない得る。その実施例では、直接的ＤＮＡ ）ランスホーメーション法（“裸の”　ＤＮＡを用いる）を実際に用いポリエチ レール（ＰＥＧ）処理したタバコのプロトプラストにＤＮＡを導入している。

植物ゲノム内の正確な位置の修正を行ない得ることも報じられている。しかしカ ナマイシン耐性を有する種々の欠損ＡＰＨｎ遺伝子を用いた実験結果は、その遺 伝子の修復が（“インサイチュ−で”）望ましい部位に起っているかどうかに関 して決定的な解答を示さなかった。本発明者等、（パスコウスキー等、１９８８ ）の１人により行なわれた同様の実験に関する最近の報告において、侵入してき た欠損ＡＰＨｎ遺伝子との相同組換えによる欠損ＡＰＨｎ遺伝子の修復がその部 位で起こり得るが、さらにこれを確認する証拠が必要であると考えられている。

さらに植物ゲノムのインサイチュ−モディフィケーションおよび目的変異体の選 択に対する効率的方法が必要である。

（発明の概要） 本発明は植物ゲノムの目的部位に決った変異を組込むのに有用な組換えＴ−ＤＮ Ａ構築物を提供する。さらに本発明は目的とするゲノム部位に決った変異を含む 植物の選択を可能にするＤＮＡ構築物を提供する。これらの構築物はその組込ま れた変異が表現型によって検出することが困難である場合特に有用である。また 本発明はアグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕ ｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはそれに関連する種のＤＮＡ）ランスファーシ ステムを用いて植物細胞にＴ−ＤＮＡ構築物を導入することにより、その植物ゲ ノムの望ましい部位に凍った変異を含むＤＮＡ配列を組込む方法を提供する。ま た上記組換えＴ−ＤＮＡ構築物を含むベクターおよびこのベクターでトランスホ ームしたバクテリアを提供する。本発明の別の実施態様では、上記組換えＤＮＡ 構築物を使用して得られる、ゲノムの目的部位に決った変異を有する、遺伝子的 修正植物が提供される。

（詳細な説明） 驚くべきことに植物細胞に同時に導入された相同的領域を有する２つのＴ−ＤＮ Ａは物理的に相同組換えを行い得ることが分った。さらに受容植物細胞の植物ゲ ノムと相同的領域を有する以後“ターゲツティング構築物″と呼ぶ新しく導入さ れたＴ−ＤＮＡもその相同的領域内でゲノムＤＮＡ配列と組換えを起こし得るこ とが分った。ある場合にはカナマイシン耐性など保存された発現型が変異部位の 修復の結果として示された。すなわちその植物はそのゲノムの望まし部位をｉｎ 　５ｉｔｕで修正されたことになる。また望ましい部位は以後゛ターゲット部位 °　と呼ぶ。

植物ゲノム中の組換え配列は安定で遺伝子的に受け継がれていくと考えられる。

アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）システムで我々が示した組 換え効率（トランスホーマント数での比較）は裸のＤＮＡを用いた直接的ＤＮＡ ）ランスホーメーション法によるワルツ（ｗｉｒｔｚ）等（１９８７）およびパ スコウスキー（Ｐａｓｚ−ｋｏｙｓｋ　ｉ）等（１９８８）の効率に匹敵するも のであった。

植物細胞中での相同組換えのためにアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ−ｂａｃｔｅ ｒｉｕｇ＋）　）ランスファーシステムを用いることは、Ｔ−ＤＮＡの構造的性 質およびトランスファープロセスにおける関連たんばく質の見地から予想外のこ とであった。このこきは以下の知見により説明する。

ａ）アグロバクテリウムトランスファーシステムを用いてトランスホーミングＤ ＮＡ　（Ｔ−ＤＮＡ）がＴ−ＤＮＡボーダーの個所でトランスホーミングプラス ミドから切り出されるが、これは全ての裸のＤＮＡの場合のようにターゲット部 位との相同的領域内で線状化されていない。

ｂ）裸のＤＮＡの場合とは異なり、Ｔ−ＤＮＡ分子はその一本鎖構造と、Ｖｉ　 ｒＥ　（ギエトル（Ｇｉｅｔｌ）等、１９８７　；ダス（口ａｓ）、１９８８　 ；セフ　（Ｓｅｎ）等、１９８９　；シトフスキー（Ｃｉｔｏｖｓｋｉ）等、１ ９８Ｂ、１９１１１９　；クリスチー（Ｃｈｒｉｓｔｉｅ）等、　１９８８）お よびＶｉｒＤ２などの毒性たんばく質との会合のために、相同組換えは起こし得 ないと考えられた。ＶｉｒＤ２はいわゆるＴ−鎮の５′端と共有結合することが 知られている（ヤング（Ｙｏｕｎｇ）およびネスター（Ｎｅｓｔｅｒ）、１９８ ８；ヘレラーｘストレラ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ）等、１９８８　 ；ワード（Ｗａｒｄ）　右よびバーンズ（Ｂａｒｎｅｓ）、１９８８）　。Ｔ− ＤＮＡが一本鎖線状分子として植物細胞にトランスファーするというモデル（ス テイチェル（Ｓｔａｃｈｅ＋）等、１９Ｂ７　；アルブライト（Ａｌｂｒｊｇｈ ｔ）等１９８７）および一本鎮結合たんばく質がゲノムに組込まれる前にそのＤ ＮＡをヌクレアーゼから保護するというモデル（ギエトル（Ｇｉｅｔｌ）等、１ ９８７　；シトフスキー（Ｃｉｔｏｖｓｋｉ）等１９８８．１９８９　；ダス（ Ｄａｓ）等、１９８８　；セン（Ｓｅｎ＞等、１９８９　、クリスチー（Ｃｈｒ ｉｓｔｉｅ）等。

１９８８　；ヤング（Ｙｏｕｎｇ）およびネスター（Ｎｅｓｔｅｒ）、１９８８ ：ヘレラ・エストレラ（）ｌｅｒｒｅｒａ−Ｂｓｔｒｅｌｌａ）等、１９８８　 ；ワード（Ｉｌａｒｄ）およびバーンズ（Ｂａｒｎｅｓ）　、１９８８）が報告 された。

ｃ）Ｔ−ＤＮＡの非常に効率の高いランダム組込みのため非常に高いバックグラ ンドが予想される。このことは適正なｉｎ　５ｉｔｕでの組込み（すなわち相同 組換えによる）を有する植物宿主を見つけ、一方では非トランスホーム宿主や、 そのゲノムにあける全てのＴ−ＤＮＡの望ましくないランダム組込みを有する大 多数の植物宿主を排除する厳しい選択メカニズムを特徴とする特に植物ゲノムに 組込まれる目的とする変異を直ちに観測することが困難である場合（たとえば容 易に観察またはスクリーニングし得ない発現型を有するもの）、このことが問題 となる。事実、多くのインサイチューモディフィケーションは検出が困難である 。

アグロバクテリウムをＤＮＡ）ランスファーシステムとして用いて相同組換えを 行ない得るということが言われてきたが現在までその結果は報告されておらず、 このことは植物ゲノムの部位特異的突然変異誘発に対するアグロバクテリウム（ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）ＤＮＡ）ランスファーシステムの有用性に関す る上記の疑いを支持している。

裸のＤＮＡによるトランスホーメーションよりも植物ゲノムの部位特異的突然変 異誘発を行う上でＤＮＡ）ランスファーシステムとしてアグロバクテリウム（Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる利点にはとりわけ次のようなものがあげら れる。

ｌ）プロトプラストのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）に よるトランスホーメーションは裸のＤＮＡによるトランスホーメーションよりも かなり効率が良い。７２時間アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕ ｍ）と共培養したニコチニア　タバカム（Ｎｉｃｏｔｉｎｉａｔａｂａｃｕｍ） 　ｃｖ、ペチットハバナＳＲＩのプロトプラストから再生したカルスの２０〜５ ０％がトランスホームされていると考えられる（ファンデンエルゼン（Ｖａｎ　 ｄｅｎ　Ｅｌｚｅｎ）等、１９８５ａ　；デビッカ−（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ）等、 １９８５）、Ｔ−ＤＮＡによる組換え頻度が裸のＤＮＡによる組換え頻度よりも 低い場合でさえ、相同組換えによりトランスホームされる細胞の割合はアグロバ クテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）　Ｄ　Ｎ　Ａ−トランスファーシ ステムを用いたトランスホーメーションの効率が高いことからより高くなり得る 。

２）植物体へのプロトプラストの再生も多くの植物種で問題となる。このことは プロトプラストを用いる研究に必要な°裸の”　ＤＮＡの使用を制限する（再生 可能な植物体の１部を使用する粒子衝突性以外。しかしこの方法は多くの問題を 引き起こし、そのため本目的に非常に有用であるとは考えられない）。さらにプ ロトプラストの植物体への再生はカルス相を介して進行する。その相の時、ツマ クローナル変異がよく観察される。ツマクローナル変異には有糸細胞***組織に おける全ての染色体転位が含まれ、キメラ組織が生成する。アグロバクテリウム （Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）を介してトランスホームした植物を得るため にはプロトプラストの再生は必要はない。葉ディスク（ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ ）等、１９８５）、ポテト塊茎ディスク（シェアマン（Ｓｈｅｅｒｍａｎ）およ びビーパン（Ｂｅｖａｎ）　、１９８８　）または***組織などの植物の容易に 再生可能な組織を用いアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）との 共培養後トランスホームした植物を入手し得る。またＡ、リゾゲネス（ｒｈ　ｉ ｚｏｇｅｎｅｓ）を接種したタバコ植物の葉ディスクから若芽がかなりの効率で 再生し得る。現在アグロバクテリウムを用いて容易にトランスホームし得る容易 に再生可能な植物組織が他の多くの植物種から同様に入手し得る。

３）裸のＤＮＡの組込みとは対照的にＴ−ＤＮＡの組込みは精密である。このこ とはＴ−ＤＮＡのコピーがそのまま組込まれ、かつ　スクランプリング°はほと んど起こらないことを意味する（バイン（Ｈａｉｎ）等、１９８５；サー二口フ スキー（Ｃｚｅｒｎｉｌｏｆｓｋｙ）等、１９８６；デロールス（口ｅｒｏｌｅ ｓ）およびガードナー（Ｇａｒｄｎｅｒ）　。

１９８８）、ワルツ（ｌｌｉｒｔｚ）等（１９８７）およびパスコウスキー　（ Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ）等（１９８８）は裸のＤＮＡ）ランスホーメーションを 用いて相同組換えを試験する彼等の実験で植物ゲノムにかなり複雑な組込みパタ ーンを発見した。

４）いくつかの裸ＤＮＡ）ランスホーメーション法はトランスホーメーション効 率をあげるためいわゆるキャリヤーＤＮＡを必要とする。このキャリヤーＤＮＡ は相同組換え事象を妨害する。さらにこのキャリヤーＤＮＡは多少なりとも植物 ゲノムにランダムに組込まれ（ピアボルト（Ｐｅｅｒｂｏｌｔｅ）等、１９８５ ）　、結果的に宿主のゲノムに不都合な変異を起こす。アグロバクテリウム（Ａ ｇｒ。

ｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）システムはキャリヤーＤＮＡを必要としない。

アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）システムに対する注目は 双子葉植物に加えて単子葉植物−球根植物、アスパラガスおよび穀物など−がア グロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いてトランスホームし得 ることが明らかになってから増加した（ホイカース°パン　スログテレン０１ｏ ｏｙｋａａｓ−ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ）等、１９８４；ハーナルスティー ンズ（Ｈｅｒｎａ　ｌ５ｔｅｅｎｓ）等、１９８４；グレーブス（Ｇｒａｖｅｓ ）およびゴールドマン（Ｇｏｌｄｍａｎ）、１９８６．１９８７　；グリムスリ ー（Ｇｒｉｍｓｌｅｙ）等、１９８７）。

一般に２つのＴ−ＤＮＡは植物細胞内で相同組換えを行ない得ることが分ってい る。特にこのことはカナマイシン耐性（Ｋｍ’）を付与するモデル遺伝子、すな わちＮＰＴＩＩ遺伝子で示された。

このＮＰＴＩｒ遺伝子はバクテリアのトランスファーＴｎ５から誘導され（ベッ ク（Ｂｅｃｋ）等、１９８２）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼという 酵素をコードしている。このＮＰＴＩＩ遺伝子を植物遺伝子（またはアグロバク テリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）Ｔ−ＤＮＡ遺伝子）由来の調節シグ ナルの制御下に置くと、植物細胞内に導入後発現し抗生物質カナマイシンに対す る耐性を提供し得る（ビバン（Ｂｅｖａｎ）等、１９８３；ヘレラーエストレラ （）ｌｅｒｒｅｒａ−Ｂｓｔｒｅｌｌａ）等、１９８３）　、植物細胞はカナマ イシン感受性である。したがってこの遺伝子をトランスホームした細胞または組 織スライスの選択マーカーに使用し得る。このＫｍ　’遺伝子は植物細胞、すな わちニコチアナタバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）ｃｖ。

ベチットハバナＳＲＩのプロトプラストにおける相同組換えの検出に用いるモデ ル遺伝子として選んだ。

欠損ＮＰＴＩｒ遺伝子を含むＴ−ＤＮＡのトランスホーメーションではＫｍ　’ プロトプラストは得られなかった。しかしバイナリ−ベクター中容々が異なる欠 損ＮＰＴｎ遺伝子を含む２種のアグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒ ｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株とタバコプロトプラスト を共培養することにより両欠損ＮＰＴ■遺伝子を同時に導入することでＫｔａ　 ’タバコ細胞が出来た。これらの細胞はＫｍ　’カルスに再生され、さらにＫＯ ＋　’植物に再生され得る。ＤＮＡレベルでの解析で両欠損ＮＰＴｎ植物は相同 組換えを介して互いに補い合ったことが確かめられた。またたんばく質レベルで の解析はこの組換え事象がその遺伝子のコード領域内の適正な部位で起っている ことを示した。コントロール実験でこの組換えがアグロバクテリウム内で起って いる可能性は否定された。このことは相同領域を共有する２つのＴ−ＤＮＡ間の 相同組換えが植物細胞で可能であることを初めて示したものである。

別の実験で、ゲノム中に欠損ＮＰＴｎ遺伝子を含むトランスジェニックタバコ植 物を、このアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）ＤＮＡ）ラン スファーシステムを用い植物細胞内に導入された修復構築物でトランスホームし た。またこの修復構築物はその遺伝子内の別の位置に変異を有する欠損ＮＰＴＩ Ｉ遺伝子を含んでいた。

この変異はターゲツティング構築物中の新しく導入されたＮＰＴ■変異体と植物 ゲノム中に存在する変異ＮＰＴｎ遺伝子遺伝相間組換えにより修復し得ることが 示された。正しく組換えが起こると野性型ＮＰＴＩＩ産物と同じ活性のＮＰＴＩ ｒ酵素をコードする修復された遺伝子が生ずる。最も重要なことはＤＮＡレベル での解析が組換えはターゲット部位で起こりインサイチュ−でその遺伝子を修復 したことを明らかにしたこきである。他の実験でターゲッティングは植物ゲノム 中に天然に存在する配列（内在配列）にも可能であることが示された。これらの 実験ではｒｂｃＳ　Ｓ　Ｕマルチ遺伝子群のｌ員である内在遺伝子をターゲット 部位に選び相同組換えによりインサイチュ−で内在配列を変異させる可能性を検 討した。この遺伝子群は光合成に関係する核にコードされているクロロプラスト 局在化たんばく質であるリブロース−１，５−ビホスフェートカルボキシラーゼ ／オキシゲナーゼ（ｒｂｃ　Ｓ）の小さいサブユニットをコードしている。ＳＳ Ｕ遺伝子の発現は光依存性である。それゆえ、４個のエクソンを含むこのｒｂｃ ｓ遺伝子のコード領域およびＮＰＴｆｆ遺伝子のコード領域の間の翻訳的融合が 異なる２つのターゲツティング構築物を作製した（第１０図参照）。ｒｂｃｓの 第２エクソンにおける翻訳的融合体である１つのキメラ遺伝子は、トランスポー トペプチド（ｒｂｃ遺伝子をクロロプラストに向かわせることに関係する）およ び成熟ＳＳＵたんばく質の最初の２３個のアミノ酸をＮ末端でＮＰＴＩＩに融合 したたんばく質をコードしている。トランスポートペプチドおよびえんどう豆の ｒｂｃＳ遺伝子の最初の２３個のアミノ酸とＮＰＴＵとの同様の融合たんばく質 はすでに報告されており、機能を有すると考えられている（シュＬ／イア−（Ｓ ｃｈｒｅｉｅｒ）等、１９８５）。

別の融合たんばく質はトランスポートペプチドおよび成熟ＳＳＵたんば（質の９ ９個のアミノ酸がＮＰＴｎ酵素のＮ末端に融合したたんばく質をコードしている 。トランスホームしたカルスの０．０１％までがＫｍ’であり、はとんどの場合 それは光調節されているようで、それにより５ＳＵ−ＮＰＴｎ融合たんばく質の いくつかはクロロプラストに輸送されていくと考えられている。ササンブロッテ ィングおよびＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクション）法を用いたＤＮＡレ ベルでのゲノム部位の解析は実際にトランスホームしたカルスの一部の光調節カ ナマイシン耐性は１ｎｓｉｔｕでのターゲット部位、すなわち選択したｒｂｃ　 Ｓ部位の修正により生じたこきを明らかにした。

この実験結果は、ターゲット部位が外来または内在のＤＮＡ配列のいずれかであ るという事実とは独立に、Ｔ−ＤＮＡ構築物を用いた相同組換えにより植物ゲノ ム中の目的部位に望ましい変異を導入し得ることを示している。さらに植物宿主 のゲノムの選ばれたターゲット部位に存在する１つの遺伝子の機能的部分と合せ て機能を示すもう１つの遺伝子またはその機能的一部をターゲツティング構築物 とターゲット部位との間の相同組換えを介し、インサイチュ−でその一部分とう まく融合し、２つの機能遺伝子部分の機能的融合を行ない得ることを示している 。その広い可能性の１つとして本発明は原則として植物ゲノムの一部をその位置 を変化させることなく操作し得る方法を提供してεする。上述の実験において、 ホモロジーを共有する遺伝子フラグメイントが互いに補い合い、宿主にカナマイ シン耐性を付与することからこの相同組換えは容易に検出し得る。しかし多くの 場合、相同組換えを介して植物ゲノムに導入したい変異を直接選択することはで きない。

たとえばアミノ酸の交換や遺伝子のコドン使用の変化などの変異は容易に検出で きず、したがってＤＮＡレベルで解析しなければならない。このような解析には ゲノムＤＮＡの制限地図作製、ＰＣＲ分析および、またはＤＮＡ配列分析などが 含まれる。

このような場合、ＤＮＡレベルで望ましい組換え体を全処理細胞からスクリーニ ングするこきはたいへん煩わしく、時間がかかり、かつ経費がかかるので、抗生 物質遺伝子または殺菌剤耐性遺伝子などポジティブ選択マーカーを用いてトラン スホームした宿主を選択することが望ましい。そうすることでゲノム内の不都合 な位置でのランダムな組込みの代りに相同組換えを介してトランスホームされる 確率が高くなる。ランダム組込み頻度は相同組換え頻度に比べはるかに大きいこ とが知られているので、ランダム組込みでトランスホームされた全ての細胞を排 除する強力な選択メカニズムが必要である。したがって、本発明に従がい、この 相同組換えが起こる領域の外でターゲツティング構築物内に存在するネガティブ 選択遺伝子、場合によっては２個のネガティブ選択遺伝子と合わせてポジティブ 選択遺伝子を使用することが望ましい。このようなＴ−ＤＮＡ構築物の一般的構 造は第１３Ａ図に示した。ボックス１および７はＴ−ＤＮＡボーダーを表わし、 ボックス２および６はネガティブ選択マーカーを含む発現カセットであり、ボッ クス３および４はターゲット部位の組換えおよび変異に使用する配列を含み、ま たボックスＥはターゲット部位の外の組換えに関する配列を含んでいる。ネガテ ィブ選択遺伝子はそれらの遺伝子を発現可能な状態でゲノムの中に組込んでいる 細胞に障害（好ましくは致死）を供与するように働く　（たとえばその植物宿主 中適正な発現に必要な調節領域間の構造遺伝子を含む発現カセット内に存在する ような形で）。したがって、ゲノム内にランダムに組込まれた全Ｔ−ＤＮＡを有 する全ての細胞はネガティブ選択遺伝子の存在により障害を受けるか死滅するこ とになる。

ゲノム内に組込まれたポジティブ選択遺伝子を有する細胞だけが生き残ることに なるが、それはネガティブ選択遺伝子が相同領域内の組換えにより排除されるこ とによる。Ｔ−ＤＮＡのスクランプリングは裸ＤＮＡと比べてかなり低い率で起 こることが知られているので、相同的領域内の１つのポジティブ選択遺伝子およ び相同的領域外の１つ、場合によっては２つのネガティブ選択遺伝子の組合せ物 は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋）　Ｄ　Ｎ　Ａ　）ラ ンスファーシステムで使用する場合特に利点が多い。しかし、裸ＤＮＡに対して も十分使用し得るものである。（スクランプリングのない）元の状態の組込み物 の性質はおそら＜Ｔ−ＤＮＡがたんばく質に包まれていることと関係しているの で、このシステムはインビトロでパッケージされたＴ−ＤＮＡと同様、ＤＮＡ結 合たんばく質でパッケージされたＴｉ／Ｒｉベクター以外の他の生物由来の裸Ｄ ＮＡについてもよく適応する。

本発明に従がい、その構築物が最も活性の高い配置で２つのＴ−ＤＮＡボーダー を含むことが非常にのぞましい。しかし、Ｔ−ＤＮＡボーダー１個だけでＤＮＡ ）ランスファーには十分であり、また合成したものでも、もしくは野性型の状態 とは反対の方向で組込まれていても使用し得ることが知られている。宿主中で機 能的であり、かつ発現可能な形で植物宿主内に投与される限りポジティブ選択遺 伝子（ボックス５内に含まれている）の選択は本発明にとってあまり重要ではな い。このポジティブ選択遺伝子は（これらに限定される訳ではないが）ＮＰＴｎ 〜遺伝子（カナマイシン耐性をコードする）、ＨＰＴ−遺伝子（ハイグロマイシ ン耐性）、ＡＬＳ遺伝子（クロルサルフロン耐性）、ＤＨＰＲ−遺伝子（メトス レキセート耐性）を含む群から選択し得る。これらの遺伝子を発現させるために 、カリフラワーモザイクウィルス（［”ａＭＶ）由来の３５３または１９３プロ モーター、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）由来のＴ−Ｄ ＮＡプロモーター、植物プロモーター、またはその宿主内で機能するプロモータ ーなど強力な構成的プロモーターが使用される。一般に、相同組換えに関係しな いと思われるＤＮＡ配列はその植物ゲノム中に存在するＤＮＡ配列とホモロジー を持たないことが望ましい。しかし、これが必要とされる場合、その組換えに関 与する相同領域をできるだけ小さくし目的とする組換えを妨害しないように配慮 する。

ネガティブ選択遺伝子（ボックス２および／またはボックス６）の選択は、その 植物宿主内で機能的であり、かつ発現可能な形で投与される限り、本発明にとっ てあまり重要ではない。たとえばこのネガティブ選択遺伝子はアグロバクテリウ ム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）のＴｉ−プデスミド由来のａｕｘ−２遺伝 子、ＳＶ４０由来のＴＫ〜遺伝子、ストレプトマイセス　グリセオラス（Ｓｔｒ ｏｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）由来のシトクロムｒ４５０、マイズ（ Ｍａ　ｉ　ｚｅ）または７５ビドブシｘ　（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のＡ ｄｈ−遺伝子、または使用される有害物質を無害物質に変換し得る酵素をコード する遺伝子からなる群から選ばれる。

ターゲツティング構築物のバート３および４は本発明に最も重要である。

本発明の最初の好ましい態様において、ターゲット部位の配列の残りの部分は（ すなわち導入される変異の両側）が元の状態を保つように、変異は選択された１ つの部位（以後ターゲット部位と呼ぶ、）に導入される。それゆえ変異の直ぐ隣 りの配列もこの構築物のボックス４に提供されなければならない。したがって変 異は調節領域、シグナル配列、成熟たんばく質の一部（機能ドメインなど）をコ ードする配列など機能遺伝子または遺伝子の機能的部分、またはイントロンの内 および変異と連続するターゲット部位の配列を変えるこ２なくたんばく質を必ず しもコードしていない他の機能的ターゲット部位内に導入される。この状態でボ ックス３およびボックス４はターゲット部位とホモロジーを持つことになり、そ れによりボックス３は相同組換えを促進する役割をもち、以後組換えボックスと して示される。一方ボックス４は変異と変化してはならないターゲット部位配列 を含み、以後相補ボックスとして示される。相補ボックスは組換えボックス内の 相同組換えの後ターゲット部位に組込まれ得るので、後者のボックス内での組換 えの確率が高い。この領域内での相同領域が長ければ長い程組換えの確率も上が ることはよく知られている。それゆえ、相同組換えを促進するためには組換えボ ックスは十分長く、かつ相補ボックスよりも有意に長いことが好ましい。またも しこの構築物の組換えボックスがターゲット部位の上流（５′側）領域を示して いる場合は、相補ボックスは下流（３′側）領域を構成しており、もし組換えボ ックスが３′側なら相補ボックスは５′側を構成していることは理解されよう。

さらに、ボックス３．４、ターゲット部位、およびＥは同じ５′→３′の方向性 を有している。最も重要なことは、ボックス３．４．５およびＥはＴ−ＤＮＡボ ーダーに関し反対向きに挿入することができるけれども、本発明のこの態様にお いてはそれらの順番は変化し得ないことである。同様にネガティブ選択マーカー を含む全フラグメントがＴ−ＤＮＡボーダーに関し逆転していることもありうる 。

この構築物において、相補ボックスは定義により組換えボックスの直ぐ次に存在 する３種の変異を有する。これらの変異には、１から数千塩基対の挿入、ターゲ ット部位の塩基対数は変化しない塩基対の置換、またはターゲット部位の１塩基 対から数千塩基対を減少させる塩基対の欠失またはこれらの組合せが含まれる。

この構築物の組換えボックスは定められたターゲット部位の精確な始めの位置で 開始する必要はない。ターゲット部位の開始点より前でも後でも始まってよい。

しかし、定義によりそれはターゲット部位の変異が始まる点で精確に終っている 。相補ボックスは定義により、変異が挿入または置換である場合はその変異の第 １ヌクレオチドで精確に始まるが、一方定義によりそれはターゲット部位の最後 のヌクレオチドを含むにもかかわらず必ずしもターゲット部位の最後のヌクレオ チドで終る必要はない。変異が塩基対の欠失の場合、相補ボックスはその欠失が 終る点で精確に始まる。もちろん相補ボックスは１つ以上の変異、また１種以上 の変異でさえ持ち得る。この場合もし異なる変異を分けている塩基数が連続する ホモロジー領域と比べて大きい場合、これらの変異は１つ１つ、すなわち別のト ランスホーメーション実験で植物ゲノムに組込まれることが望ましい。

原則として、それ自身が選択可能なまたはスクリーニング可能な領域を提供する 全発現可能遺伝子がターゲット部位に挿入される。この場合発現可能なポジティ ブ選択遺伝子を示すボックス５はこの構築物中には存在しない。結果的にターゲ ット部位の外側のホモロジー領域（ボックスＥ）の必要性は無Ｘなる。

本発明の第２の好ましい態様において、ボックス４はターゲット部位と全く非相 同的な配列を示すことができる。したがってそれは宿主に関して外来の配列、た とえば、同種植物の別品種、異種植物、植物以外の生物由来の配列、合成配列ま たは、遺伝子操作された外来配列を含むがその宿主ゲノムの別の部位由来の、こ の植物宿主に内在する配列も含む。後者の場合、不都合な組換えが起こる機会は ボックス３に比ベボックス４の長さを減らすことで小さくすべきである。上述の 条件では組換え後選択可能またはスクリーニング可能な領域が生じ、別の選択遺 伝子およびボックスＥの必要が無いならボックス５はいらない。

本発明の第３の態様においてはゲノムの部位特異的突然変異誘発は単に機能性ゲ ノム領域の不活性化を目的きしている。これらの機能領域には、（これらに限定 されるわけではないが）遺伝子や遺伝子発現の調節、ＤＮＡ複製に関する領域な どが含まれる。

不活性化は上述のいずれかの構築物を用いたターゲット部位内の欠失、置換（た とえばストップコドンの導入）または挿入（たとえばフレームシフト等を起こす こと）により達成される。このようにターゲット部位の不活性化はターゲット部 位の見かけ上の発現型により直接選択またはスクリーニング可能な場合は、ポジ ティブまたはネガティブ選択遺伝子を提供する必要のないことは明白であろう。

この構築物はボックス１．３．４、および７のみを含み、ボックス４にはターゲ ット部位を不活性化するのに適した変異が含まれる。

°挿入ベクター°として示すいくぶん異なるターゲツティング構築物を第１３Ｂ 図に示す。第１３Ａ図で概説した構築物に加えて、この構築物はターゲラ）Ｎ位 に挿入（ボックス■）を導入するのに使用される。ここでボックス３および４は ターゲット部位と相同的なりＮＡ配列を示しそれらのボックスの塩基配列はター ゲット部位の場合と同じ５′から３′の順序であるが全ボックスの位置はターゲ ット部位の状態と異なっている。第１３Ｂ図に示している構築物の機能性代替物 はボックス３および４が逆向きになったものである。

内在ＤＮＡ配列のターゲツティングがリブロセビスホスフェートカルボキシラー ゼ（ｒｂｃＳ）遺伝子の小さなサブユニットのプロモーターおよびリーダー配列 の一部を組換えボックスに含むターゲット構築物を用いて例示されているが、原 則として、遺伝子の調節要素、遺伝子のコード領域、または遺伝子、遺伝子フラ グメントまたは種々のＤＮＡ配列からなる他の配列のいずれかに属するどの部分 もこのターゲット構築物における組換えボックスに使用し、相同組換えを促進し 得ることは明白である。それとは別にもし、変異を受ける部位に隣接する領域の ＤＮＡ配列が十分分っているなら、第１３Ａ図に示した構築物を用いて、非常に 限定した形であらゆる遺伝子またはあらゆる他のＤＮＡ配列に変異を導入し得る 。

本発明は新しいＤＮＡ配列の使用可能性がまさに時間の問題となっているのでＤ ＮＡ配列が既存の部位に限定されることはない。

本発明はタバコのプロトプラストおよびタバコ植物で例示されているが、アグロ バクテリウム（Ａｇｒｏｔ＋ａｃｔｅｒ　ｉｕｎ＋）　Ｄ　Ｎ　Ａ　）ランスフ ァーシステムでトランスホームし得るかぎり、単子葉でも双子葉でも、また植物 の他の部分や組織、たとえば、塊茎ディスク、葉ディスク、胚、花粉、***組織 などと同様に他種のプロトプラストでもこの方法でトランスホームし得る。本発 明に関して特に興味のもたれる植物にはこれらに限定されるわけではないが、ナ ス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ＞、セリ科（ ｌｌｍｂｅｌ　ｌ１ｆｅｒａｅ）、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、キク 科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、ネギ（Ａ　Ｉ　＋　１ａｃｅａｅ）、ブドウ科（ Ｖｉｔａｃｅａｅ）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇａｃｅａｅ）、アカザ科（ Ｃｈｅｎｏｐｏｄ　１ａｃｅａｅ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）　、ラン科 （Ｏｒｃｈ　１ｄｅａｃｅａｅ）、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）、コーヒー（ Ｃｏｆｆｅａ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）などの植物が含まれる 。

原則としてアグロバクテリウム（Ａｇｒａｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の天然のＤＮＡ トランスファーシステムは本発明を実行するのに使用し得るが野性型Ｔｉ−およ びＲｉ−プラスミドの大きさは組換えＤＮＡ技術を用いてＴ−ＤＮＡを取扱うの を妨げる。それゆえ、植物の遺伝子工学には修正したアグロバクテリウム（Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）ベクターシステムを用いる。遺伝子操作を受けるプ ラスミドはより便利な大きさに短縮される。このいわゆるコインテグレートベク ターを用い、外来ＤＮＡ　（１つのボーダーの次にくるか２つのボーダーの間に ある）を大腸菌内で複製し得る小さなプラスミドを介し、相同組換えによりＴｉ −またはＲｉ−プラスミドに乗せることができる（ヒル（Ｈｉｌｌｅ）等、１９ ８３ｂ；バートン（Ｂａｒｔｏｎ）およびチルトン（Ｃｈｉｌｔｏｎ）、１９８ ３；サンブリスキー（Ｚａｏ＋ｂｒｙｓｋｙ）等、１９８３；デブレア（Ｄｅｂ ｌａｅｒｅ）等、１９８５　；７Ｌ／−り一（Ｆｒａｌｅｙ）等、１９８５）。

Ｔ領域が大腸菌およびＡ、ツメファシェンス（ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の両方 で複製し得るプラスミドであるバイナリ−ベクター上にあり、一方Ｖｉｒ領域が ヘルパーＴｉまたはＲｉ−プラスミド上にあるいわゆるバイナリ−ベクターシス テムが本発明にとって特に好ましい（デフラモンド（Ｄｅ　Ｆｒａｍｏｎｄ）等 、１９８３．ホーケマ（１０６ｋｅ＋ｎａ）等、１９８３；ホーケマ（Ｈｏｅｋ ｅｍａ）等、１９８４ａ）。

ここでのＴ領域はトランスホームする遺伝子をその間でクローン、化し得るボー ダー配列を含んでいるだけである。それによりエン５　ハンサーエレメントが右 側のボーダーの次に存在している。

またＴ−ＤＮＡがアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）の染色 体上に位置するとき、同バクテリア内にトランス状態で毒性遺伝子が存在するな らそれを植物細胞に移し得る（ホーケマ（Ｉｆｏｅｋｅｍａ）等、１９８４ａ） 。

Ｔｉ−またはＲｉ−プラスミドをリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）　（ホイカ ース（Ｈｏｏｙｋａａｓ）　、等１９７７）またはフィロバタテリウム（Ｐｈｙ ｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　（ヴアンビーン（ｖＨＶｅｅｎ）等、１９８８） などアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｎ＋）に関連するバクテ リア内に導入されたとき、これらのプラスミドのＴ−領域は共培養することによ り植物細胞にトランスファーし得ると考えられる。アグロバクテリウム（Ａｇｒ ｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）依存遺伝子ターゲツティングシステムは人間栄養学、 食品加工、動物飼料、非食品工業的用途の分野で興味を持たれている遺伝子およ び環境適用に関する植物遺伝子のインサイチュ−モディフィケーションにとりわ け利用される。

遺伝子のインサイチュ−モディフィケーションは遺伝子機能、遺伝子発現の調節 またはたんばく質機能に影響を与え得る。遺伝子機能への影響にはその発現が望 まれない遺伝子（マルチジーン群の１員または他の配列を含む）の完全な不活性 化のメカニズムが含まれる。このような遺伝子は脂肪酸−１炭水化物−１または 二次代謝などの代謝経路の重要な酵素をコードしているものでもよい。このよう な遺伝子の不活性化はこれらの代謝経路の特異的変化を引き起こす、このような 修正は不健康な（特異的アルカロイドなど）、不都合な代謝物の生成を阻害する には望ましいこともある。果実の成熟、開花、授粉などに関する遺伝子を不活性 化するのに非常に都合がよい。また、食品加工原料、食品成分生産、薬品または 工業的用途に使用する植物における遺伝子も不活性化し得る。

また本発明はそれ自体望ましくないたんばく質あるいはポリペプチドたとえばヒ トや家畜に毒性をもつものなどの生成を阻害するのにたいへん有用である。

（遺伝子発現の調節） 本発明の若干具なる態様においては、目的の遺伝子は全く不活性化しないが、そ の発現の調節を変化させている。これらの修正には、発現の非調節的刺激（過剰 発現）、発現の（部分的）阻害、特定の内部シグナル（ホルモン；代謝物）また は外部シグナル（熱、寒さ、渇き、光強度、日照時間、接触刺激、化学物質、発 熱原）に対する応答などが含まれる。簡略のため、遺伝子発現の調節にはたんば く質の分別（細胞の特定の構成単位または細胞外空間へのたんばく質の輸送）も 含める。特定のＤＮＡ配列が遺伝子の非特異的刺激または阻害に関係し、別の配 列が応答的刺激または遺伝子発現の阻害に関係することが知られている。調節要 素（プロモーター、転写および翻訳のエンハンサ−１光応答要素など）、シグナ ルペプチド、オルガネラのインボートドメイン、トランジットペプチドなどをコ ードする配列など多くのこのような配列が詳細に知られており、近い将来より多 くのものが入手されよう。このような配列の多くはそれ自身の機能性ドメイン（ すなわち他の機能性ドメインと無関係な機能）を構成しており、それがドメイン 間に存在しなかった結合を産む可能性を作り結果的に調節を変化させることにな ることは確かである。しかし、ゲノムの局在化は新しく導入された遺伝子構築物 の調節においても重要な役割を果しており、しばしば遺伝子調節に関わる他の因 子に対し完全に支配的になっている。時々特異的植物宿主内で遺伝子が全く発現 されないことがある。これは植物の遺伝子工学における重要問題の１つである。

本発明はいくぶん予想可能な発現様式を有するゲノム部位に新しく導入した遺伝 子構築物を指向させる可能性を開く上でこの問題を解決する助けとなる。たとえ ば過剰発現を必要とする遺伝子を非常に活性の高いことが分っているゲノム部位 に指向させることができる。これを遂行するために、ｒｂｃＳ遺伝子、クロロフ ィルａ／ｂ結合たんばく質遺伝子などが存在する部位など非常に活性の高い部位 を選ぶことができる。目的とするＤＮＡ配列をプロモーター、エンハンサ−１転 写ターミネータ−など自分自身の調節要素とともに導入してもよいし、ターゲッ ト部位に存在する調節要素に融合してもよい。

また低発現の問題は内在遺伝子の構造を変えたいとき、ゲノムの位置を変えるこ となくたんばく質の、または経過に関するドメインを修正する上で１つの役割を 果す。形式的に言うと、それらの遺伝子を単離し、インビトロで修正した後標準 的トランスホーメーション法を用いて植物ゲノムに再組込みする。それを行うこ とにより修正を受けた遺伝子構築物は植物ゲノム内にランダムに再組込みされ、 しばしばその特異的調節が失なわれる。本発明によって提供される方法を用いれ ばその発現様式を捨てることなく遺伝子をインサイチュ−で修正することができ る。

たとえばコードされるたんばく質のアミノ酸含量はそのたんばく質をコードする 全てまたは一部の塩基配列を置換することによりアミノ酸を挿入、欠失および、 または置換して変化させ得る。

特に興味深い遺伝子はぜイン、ナビン、ファセオリン、貯蔵アルブミンなど種子 貯蔵たんばく質のような豊富なたんばく質をコードする遺伝子であり、それらの 栄養価をリジンやトリプトファンのようなより基本的なアミノ酸を導入すること であげることができる。

さらに、本発明は環境ストレスに関するたんばく質のインサイチュ−モディフィ ケーションに使用するのに非常に利点が多い。

しばしばこれらの遺伝子はそのたんばく質自体を変えることは利点があるがその 遺伝子のゲノム内の位置を変えることにより乱したくない非常に複雑な遺伝子発 現様式を有している。たとえば特定のたんばく質の作用様式、安定性または発熱 原範囲は変化させ得る。一方たんばく質レベルで遺伝子発現が変化するように目 的遺伝子を変異させ得る。このことはたとえばコドン使用様式を変化させること により行なわれる。これらの変異は従来技術を用いて導入し得る。

以下の図は本発明を説明している。

第１図： 植物細胞中で機能する本来のＫｍ　’遺伝子を含むプラスミドｐＳＤＭ４および ｐＳＤＭ７の構築。これらのプラスミドは種々の欠損遺伝子構築の基礎となる（ 第２図、第３図および第５図）。

以下にクローニング操作を示す。１）ｐＭＯＧＥＭ２４由来のＢｇｊ２　ＩＩ／ ＨｉｎｄｎＩフラグメントのｐＵＣ１２（ｘＢａｍＨＩ　Ｘ旧ｎｄＩ［Ｉ）への トランスファー、２）ツバリンシンセターゼ遺伝子の転写ターミネータ−（３’ 　Ｎ０３）のオクトピンシンセターゼ遺伝子の転写ターミネータ−（３’　０Ｃ ３）による置換、３）ＥｃｏＲＩ制限部位におけるＸｈｏＩ制限部位を含む８ｂ ｐ合５ｉＤＮＡフラグメント（リンカ−）の導入、および４）プラスミドπＶｘ 由来のｓｕｐ　Ｆ含有フラグメントのｐＳＤＭ４のＢａＩＩＨＩ部位へのトラン スファー。略号および記号は脚注で説明している。

第２図ニ プラスミドｐＳＤＭ７から開始した欠損Ｋｓ　’遺伝子５′ム１１５′ム■およ び３′ムＩの構築。ｐＳＤＭ７に存在する本来のＫＩＩＩｒは線状に示しである 。欠損遺伝子はその下に下線を引いた。

線はｐＳＤＭ７由来の本来のＫｍ　’遺伝子のＤＮＡ配列がなおその欠損遺伝子 内に存在することを示している。５′ムＩはタレノーポリメラーゼによる平滑化 後ＸｍａＩ［ｒ／Ｂｃｊ！　ＩフラグメントをＥｃｏＲＩ部位を含む１０ｂｐの オリゴヌクレオチド（ＥｃｏＲＩ　−リンカ−）で置換することによって得られ る。タレノーポリメラーゼによる平滑化後ＴｔｈＩ［１，１／　ＢｃＩｌＩフラ グメントをＥｃｏＲＩ−リンカ−（１０塩基）で置換すると５′ム■が生ずる。

３′ム■においてＲｓｒＩＩ部位までのＫｏ＋　’遺伝子の３′側領域を除去し た。変異Ｋ１１ｌ　ｒ遺伝子の末端にｓｕρＦ遺伝子をクローン化した。

略号および記号は脚注で説明する。

第３図： ＸｈｏＩ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントとしての欠損Ｋ１１ｌ　Ｆ遺伝子（第 ２図参照）のバイナリ−ベクターｐＳＤＭ５　（ＸＸｈｏｌＸＨｉｎｄ■）への クローニング。この方法では欠損遺伝子はＴ−ＤＮＡボーダー配列の間のＨｌｌ ｌ　ｒ遺伝子の次に位置する（第４図参照）。

プラスミドｐＳＤＭ５はタレノーポリメラーゼによる平滑化後ｐＭＯＧＥＮ２４ （７）Ｓｐｈｌ　７ラグメントをＸｈｏＩ−＋Ｊ　ンカ−（Ｘｈｏｌ制限部位を 含む１０ｂｐの合成りＮＡフラグメント）で置換することによりｐＭＯＧＥＮ２ ４から誘導した。脚注参照。

第４図： 本来のＫｍ　’遺伝子を含むプラスミドｐｓＤＭ１００のＴ−領域の概観。その 下にｐｓＤＭｌｏｏのＴ−領域のＤＮＡ配列がｐＳＤＭ１０２のＴ−領域および ｐｓＤＭ１０４のＴ−領域にも存在することを黒線で示しである。脚注参照。

第５図ニ プラスミドｐＳＤＭ４から出発するＫｍ　’遺伝子の３′欠失変異体の構築。合 成オクトビン型左ボーダー配列を含む７５ｂｐのＨｉｎｄ　ｍ／　ＢａｍＨＩフ ラグメントをｐＳＤＭ４の本来のＫｍ　’遺伝子の後に導入しｐＳＤＭ８を得た 。この合成左ボーダーを含むフラグメントの配列を第６図に示す。ＥｃｏＲＶ／ 　ＢａｍＨＩフラグメントまたはＥｃｏＲＶ／ＲｓｒＩ［−フラグメントの欠失 を通して各々ｐＳＤＭ８°および３′ムＩｒａが得られる。この方法では本来の 、または欠損Ｋ１１ｌ　Ｆ遺伝子はボーダー配列の間に位置する。ｐＳＤＭ９で はプラスミドｐＲＡＬ３９１２の１１０塩基対ＨｉｎｄＩ［Ｉ／Ｂｇ４ＴＩフラ グメント（ホーケア　（Ｈｏｅｋｅ＋ｎａ）等、１９８５）はｌ（ｍ　ｒ遺伝子 の後に位置する。このフラグメントは野性型オクトピン型ボーダー配列を含んで いる。プラスミドｐＳＤＭ９°および３′ムｎｂは各々Ａｃｃ　Ｉ　／　Ｂｓｔ Ｅ　ＩＩフラグメントまたはＡｃｃｌ／Ｒｓｒ■フラグメントを欠失させること により得られた。プラスミドｐｓＤＭ８°、ｐＳＤＭ９°、３′ムＩＩａおよび ３′ムｎｂのＴ−領域をＥｃｏＲＩ　／　Ｈｉｎｄ　ｍフラグメントとしてバイ ナリ−ベクターｐＬＭ９９７（第７図参照）に移し、ベクターｐ　Ｓ　ＤＭ２０ ０、ｐｓＤＭ２１０、ｐｓＤＭ２０１およびｐｓＤＭ２１１を得た。

第６図： オクトピン型の左Ｔ−ＤＮＡボーダーが存在する合成ＨｉｎｄｎＩ／Ｂａｍｆｌ Ｔフラグメントの配列。種々の制限酵素の認識部位を配列の上下に示した。

第７図ニ プラスミドｐＬＭ９９７の構築。プラスミドｐＬＭ９９７はＴ−ＤＮＡを含むＢ ｇｉｎフラグメントを欠失させ、ついで残存するＢｇｎｎ制限部位にいわゆるポ リクローニング部位（いくつかの制限部位を含む合成りＮＡフラグメント）を導 入することによりｐＭＯＧＥＮ２４から誘導した。プラスミドｐＳＤＭ８”　、 ｐｓＤＭ９”、３’ムＵａおよび３′ムｎｂのＥｃｏＲＩ　／　Ｈｉｎｄ　Ｉ［ Ｉフラグメントを挿入するＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩ［部位を矢印で示した 。

第８図： ササン分析およびポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）による組換えの 検出の説明。コトランスホーメーション実験で得られるＫ１１ｌ　ｒ植物系のゲ ノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ　／Ｂｃｊ！　ＩおよびＨｉｎｄＩ［Ｉで消化した。３ ’　０Ｃ３−プローブおよびＮＰＴＩＩ−プローブを用いたプロッティングおよ びハイブリダイゼーション後検出されるフラグメントを示しである。２．１　ｋ 　ｂフラグメントは修復したＮＰＴＩｒ遺伝子の存在を示している。ＨｉｎｄＩ ［Ｉのみでの消化ではジャンクションフラグメント（すなわち植物ＤＮＡと組込 まれたＴ−ＤＮＡコピーの結合部分を含むフラグメント）を与える。ＨｉｎｄＩ ＩＩフラグメントの数は植物ゲノム中のＴ−ＤＮＡ挿入物の数の指標として使用 される。

プライマー２および３を用いたＰＣＲ分析を２．１ｋｂＥｃｏＲＩ／ＢｃＪＩフ ラグメントが検出されなかった植物について行った。

このプライマーは欠損ＮＰＴＩＩ遺伝子内の欠失される領域にアニールする。修 復ＮＰＴＩＩ遺伝子が存在するときのみ５９３ｂｐのフラグメントが増幅する。

プライマー２および３は５′端から３′端を示す矢印で表わされている。５ＬＢ ＝合成左Ｔ−ＤＮＡボーダー反復物；　Ｂ＝ＢｃｌＩ　；　Ｅ＝ＥｃｏＲＩ　； Ｈ＝Ｈｉｎｄ　ｍ。

第９図：ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を用いたｐｓＤＭｌｏｌ のＴ−ＤＮＡ構築物によるターゲット系列のプロトプラストのアグロバクテリウ ム（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ）依存のトランスホーメーション後の組換え体 の検出。植物系列１０４　（，１，６）のターゲット部位はｐｓＤＭｌｏｏおよ びｐｓＤＭｌｏｌのＴ−ＤＮＡ構築物として示した。ＰＣＲで用いた２０塩基対 長のオリゴヌクレオチド１および２を５′端から３′端方向に示した矢印で表わ した。

第１０図： Ａ、翻訳性５ＳＵ−ＮＰＴｎ融合構築物（例９および１１参照）。

この構築物をＨｉｎｄ［［またはＰｓｔＩ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントとし てｐＩｃ２ＯＲのポリクローニング部位にクローニングし、プラスミドｐＮＴＳ ＳＩ、ｐＮＴｓｓ２、ｐＮＴｓｓ３およびｐＮＴＳＳ４を作成した。ｐＮＴｓｓ ｌはＳＳＵクローン（Ｂｉｎｄ　１１１７ラグメント）の完全な配列を含みかつ 第４エクソンに挿入したｐｓＤＭ５３由来の１６９０　ｂ　ｐＢａｎ＋ＨＩ　Ｎ ＰＴＩＩモジュールを有する融合遺伝子を含んでいる。ＳＳＵ遺伝子（エクソン ）のコード配列は１〜４のボックスで示しである。プロモーター、イントロンお よびターミネータ−などの遺伝子の非コード領域は単一の線で示しである。構築 物、ｐＮＴｓｓ２はｐＮＴｓｓｌに由来し、プロモーターおよびＰｓｔ１部位（ Ｐｌ）までのコード領域の一部を欠いている。プラスミドｐＮＴＳＳ３は第２エ クソンに挿入したＢｇｌ　１１／ＢａｍＨＩ　ＮＰＴＩｒモジュールを有する完 全なＳＳＵクローンを含む。ｐＮＴＳＳ４はｐＮＴｓｓ３のプロモーターを含ま ない融合遺伝子を含んでいる。構築物の下に融合遺伝子の長さを塩基対数で示し た。ｐｌｃプラスミドから５ａＡＩ／ＸｈｏＩフラグメントとして融合構築物を 切り出し、バイナリ−ベクターｐｓＤＭ１４のボーダー間の５ａｉｌｌＸｈｏｌ Ｒ位にクローン化してｐＮＴＳＳｌ　１Ａ／ＢＳｐＮＴｓｓ　１２Ａ／Ｂ、ｐＮ Ｔｓｓ２　ＬＡ／ＢおよびｐＮＴＳＳ２２Ａ／Ｂを作った。Ａ／ＢはｐｓＤＭ１ ４中のこのフラグメントの方向を示している。ここではＢ型の方向のみを示しで ある。ｐｓＤＭ１４の構築を第４１図に示した。

０、Ｄ、　＝オーバードライブ配列。

制限部位：Ｂ１＝ＢａＩＩＩＨＩ、　Ｂ２＝Ｂｇｊｉ！ＩＩ、Ｅ１＝ＥｃｏＲＩ ＳＨ１＝ＨｐａＩ、Ｈ３＝Ｈｉｎｄｎｌ、Ｋ１＝ＫｐｎＩ、Ｐ１＝ＰｓｔＩ、５ １＝ＳａＡ　Ｉ、Ｘ１＝ＸｈｏＩ０ Ｂ、ｐｓＤＭ５３の構築に用いたＥｃｏＲＩ　／　ＸｍａＩ［［フラグメントは ２つの相補的オリゴヌクレオチド（■および■）から戊っている。このフラグメ ントの配列を示し、またその配列の上に制限部位を示した。その配列の下にはそ の翻訳産物のアミノ酸が与えられている。そのアミノ酸の下の数２および３はＮ ＰＴＩＩコード配列の第２および第３コドンに対応している。図の下にＳＳＵお よびＮＰＴＩＩのコード領域間の融合物のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示した。

第１１図： バイナリ−ベクターｐｓＤＭ１４の構築。詳細は例ＩＯ参照。

また脚注参照。

第１２図ニ プラスミドｐＮＴｓｓ５１２は別のＴ−ＤＮＡ構築物を含みタバコ細胞中のＳＳ Ｕ部位を標的とする。このプラスミドの構築は例１２で説明する。ボックス３′ および５′はａｕｘ−２遺伝子の下流および上流の配列を示している。ＳＳＵ遺 伝子の非コード配列は線で示し、コード配列（エクソン）はボックス１〜４で示 した。脚注参照。

制限部位：Ｂ１＝ＢａｍＦＩＩ、Ｂ２＝ＢｇｌＵ、Ｅ　１　＝ＥｃｏＲＬ　Ｈ１ ＝ＨＰａＩ、Ｈ３＝Ｈｉｎｄ　ｍ、Ｋ１＝Ｋｐｎ１．、Ｐ１＝Ｐｓｔｌ、５１＝ ＳａＩＩ、Ｘ１＝ＸｈｏＩ。

第１３図： 遺伝子ターゲツティングに使用し得るＴ−ＤＮＡ構築物のコンセンサス。番号の 付いたボックスの説明は“詳細な説明”の章参照。

以下の例は本発明を説明するものでありその適用範囲を限定するものではない。

例１゜ アグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｉ＋　ｔｕ ａ＋ｅｆａｃｉｅｎｓ）との共培養によるタバコプロトプラストのトランスホー メーション共培養とはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）と 植物プロトプラストを一緒にインキュベートし、プロトプラストからカルスへの 再生に際しＴ−ＤＮＡのトランスファーに関する選択を行う植物細胞トランスホ ーメーション法である（マートン（Ｍａｒｔｏｎ）等、１９７９；フレーリー（ Ｐｒａｌｅｙ）等、１９８４）。

以下に示す実験ではＡ、ツメファシェンス（ｔｕａ＋ｅｆａｃｉｅｎｓ）とのタ バコプロトプラストの共培養に関し以下の方法を使用した。ニコチアナ　タバカ ム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｏ＋）　ｃ　ｖ、ペチットハバナＳＲＩ 植物を５０〜６０ｍ１！のダイチン寒天（０，６％）固形化ＭＳ３０培地（ムラ シゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）および“スコープ”　（ｓｋｏｏｇ）、１９６２； ３０ｇスクロース／１含有）を満たしたマジエンタボックス中で無菌的に生育さ せた。５〜８週毎、この植物の頂点***組織を新鮮な培地に移した。プロトプラ ストは２６℃でに３０．４Ｍスクロース培地（ナギー（Ｎａｇｙ）およびマリガ （Ｍａ　１　ｉｇａ）、１９７６）、１％セルラーゼＲＩＯ１０，１％マセロザ イムＲＩＯおよび０．１％ＭＥＳ中−晩インキユベーションすることにより５〜 ８週無菌的に生育したタバコ植物の葉から調整した。このプロトプラストをに３ スクロース培地で１度洗い、０．４Ｍグルコースを含むに３培地＜ＫｓＧ）でｌ Ｘｌ０’細胞／ｄに希釈した後、９ＣＩｌｌペトリ皿に７ｄづつ分注した。これ らを暗所で一晩インキコベーションしてからバクテリアと共培養した。アグロバ クテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｏ＋）株を２０ｍｇ／ｊ？リファンピ シンおよび５０■／ｌカナマイシンを含むＬＢ培地中２９℃で培養した。後期対 数期の培養物をおよそ１００：１のバクテリア：プロトプラスト比でプロトプラ ストに加えた。共培養３日後、そのプロトプラスト５１Ｒ１を０．１Ｍスクロー スおよび０．２Ｍマニトールを含むＳ■培地（ミューラ−（Ｍｕｌｌｅｒ）等、 １９８３）中０．８％低融点アガロース（シグマ）５献と混合させることにより プロトプラストを着床させた。バクテリアの増殖はセフオタキシムおよびノイン コマイシンを各々最終２００■／ｌおよび１００■／ｉとなるように加えて停止 させた。１０日後、５０ｍｇ／Ｉｌのカナマイシンまたは１０■／ｌハイグロマ イシンを含む１５−のＳ■培地をそのアガロースディスクに加えた。７日後、− １００■／！のカナマイシンおよび２０■／ｌのハイグロマイシンを含む１５ｍ １のＳ■培地を加えた。この時点から毎週、１５ｍｆの古い培地を１５ｍＡの新 しいＳ■培地（１００〜１５０■／１カナマイシン、２０〜３０■／ｌハイグロ マイシン）と置換した。この培地は０．２　Ｍではなく　０．１　Ｍのマニトー ルを用いること以外Ｓ■培地と同じものである。選択することなく液体培地でア ガロースディスクの８分の１をインキュベートすることによりプレート効率を測 定した。Ｋ３およびｓｎ培地中の°ホルモン投入量は、１■／ｆＮＡＡ、０．２ ■／ＩＢＡＰおよび０．１■７１２．４Ｄであった。Ｓ■培地では２．４Ｄは除 いた。セフオタキシムおよびバンコマイシンの最終濃度は各々２００■／１およ び１００■／ｌであった。プロトプラストの着床かり４〜５週間後マイクロカル スを選択または非選択培地から収穫し、３％スクロース、１，０■／１ＮＡＡお よび０．２■／１ＢＡＰを含み、かつ０．６％寒天（ダイチン）で固形化したＭ Ｓ３０培地（ムラシゲ（Ｍａｕｙａｓｈ　ｉｇｅ）およびスコープ（Ｓｋｏｏｇ ）、１９６２）に移した。１．５％スクロース、１．０■／ＩＢＡＰおよび０． １■／ＩＮＡＡを含む固体ＭＳ１５培地中で若枝を誘導させた。固体培地は１０ ０■／１セフオタキシムおよび５０■／ｌバンコマイシンを含んでおり、また選 択用には１００■／１カナマイシンまたは２０■／ｌハイグロマイシンを添加し た。２０■／ｌの７１イグロマイシンまたは１００■／１のカナマイシンを添加 したＭＳ１５培地に若枝の根をつけることでＫｍ　’またはＨＩＴｌｒをテスト した。

例２゜ 欠損ＮＰＴｎ遺伝子の構築 バイナリ−ベクターｐＭＯＧＥＮ２４から出発する種々の欠損ＮＰＴＩＩ遺伝子 を含むベクターの構築（第１図参照）。このプラスミドはベクターｐＲＯＫ１　 ＜ボールカム（Ｂａｕ　Ｉｃｏｍｅ）等、１９８６）に由来し、ツバリンＴｉ− プラスミドｐＴｉＴ３７のボーダーの間に反対向きに植物中で機能するカナマイ シン耐性（Ｋｍ　’　）およびハイグロマイシン耐性（Ｈ！　’　）遺伝子を含 んでいる。ベクターｐＭＯＧＥＭ２４はｐＲＯＫｌ中のＢａｍＨＩ制限部位にＢ ａａ＋ＨＩフラグメントとして大腸菌のハイグロマイシンホスホトランスフェラ ーゼ（Ｈｐｔ）のコード領域をクローニングすることによりｐＲＯＫｌから標準 的組換えＤＮＡ技術を用いて（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、１９８２） 得られる（グリフ（Ｇｒｉｔｚ）等、１９８３）。

結果的に、翻訳開始コドンの前の１９塩基対から翻訳終止コドンの後２０塩基対 までのＨＰＴ遺伝子コード領域を３５３ＣａａＶプロモーターとツバリンシンテ ース遺伝子の転写ターミネータ−の間に入れた。実際の翻訳開始コドン（ＡＴＧ ）の直前に別のＡＴＧコドンが存在する。この最初のコドンは実際のコドンから の翻訳を撹乱するのでこのコドンの配列を標準的ＤＮＡ組換え技術であるオリゴ ヌクレオチド突然変異誘発によりＡＴＡに変換した。

したがってＨＰＴフラグメントの両側のＢａａ＋１１部位はタレノーポリメラー ゼによる平滑化により欠失させた（マニアチス（Ｍａｎｉａ−ｔｉｓ）等、１９ ８２）。

右側ボーダーおよびＫＩｌｒ遺伝子を含むｐＭＯＧＥＮ２４由来のＢｇｊ！ＩＩ ／旧口ｄｌｌＩフラグメントをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｕＩで消化したプラス ミドｐＵｃ１２に移した（メリック（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、１９８３　；第１図参 照）（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、１９８２）、つづいてツバリンシン テース遺伝子の転写ターミネーションシグナルをオクトビンシンテース遺伝子の ターミネーションシグナルと置換した。これでプラスミドｐＳＤＭ２が生成した が、その上には順番に１）ｐＴｉＴ３７の右側ボーダー（ＲＢ）　、２）ＡＴＧ 開始コドンの前の塩基までのツバリンシンテース遺伝子のプロモーター領域（５ ’　ＮＯ３，ビーパン（Ｂｅｖａｎ）等、１９８３）、３）ＡＴＧ開始コドンの 前の５ａｕＩＩ［ａ部位±１０塩基対（ｂｐ）からＴＧＡ終止コドンの後±３７ ０ｂｐの位置に存在するＰｓｔＩ部位までのＴｎ５に由来するＮＰＴｎ遺伝子の コード領域（ベック（Ｂｅｃｋ）等、１９８２）および４）オクトピンシンテー ス遺伝子の転写終止シグナＪＬ／　（３’　ＯＣ３，ギエレン（Ｇｉｅｌｅｎ） 等、１９８４）を含む７００ｂｐ　ＰｖｕＩＩフラグメントが存在する。

ｐＳＤＭ２またはそれから誘導される欠損変異体のＫｍ　’遺伝子をバイナリ− ベクターに再導入することを簡便にするためにＥｃｏＲ１部位にＸｈｏｌ−！Ｊ ンカーを導入した（第１図）。これによりプラスミドｐＳＤＭ４が生成する。同 様に５ｐｈＩフラグメントをＸｈｏｌ−リンカ−で置換することによりバイナリ −ベクターｐＭＯＧＥＮ２４にＸｈｏＩ部位を導入した。５ｐｈＩはｐＭＯＧＥ Ｎ２４を右側ボーダーの直前で、かつＫＩＴＩ「遺伝子のコード領域内で切断す る。このようにしてプラスミドｐＳＤＭ５が生成する（第３図）。

最後にラムダベクターライブラリーによる組換えで植物ゲノム中に組込んだＴ− ＤＮＡ構築物を単離するために（マニアチス（Ｍａｎ　ｉａｔ　ｉｓ）等、１９ ８２）、プラスミドπＶＸ　（シード（Ｓｅｅｄ）、１９８３）由来のＥｃｏＲ Ｉフラグメント上に存在するいわゆるｓｕｐ　Ｆ遺伝子をＫｍ　’遺伝子の次に クローン化した。これもスミシーズ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ）等により使用され、か つ報告された、いわゆるアンバー／サプレッサーシステムを用いて、このｓｕｐ 　Ｆ遺伝子を含むフラグメントが濃縮したラムダファージライブラリーが得られ る。このｓｕｐ　ＦフラグメントのＥｃｏＲＩ制限部位をクレノーポリメラーゼ で平滑化し、このフラグメントを［３ａｍＨＩ−リンカ−にライゲーションして から［ｌａｍＨＩで消化した。このＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＤＭ４のＢａ ｍＨ１部位にライゲーションしてプラスミドｐＳＤＭ７が得られる（第１図）。

欠損にｍ′遺伝子はｐｓＤＭ７から誘導した（第２図参照）。

図から分るように、欠損遺伝子の１つ、すなわち５′ム■構築物の構築を以下に 詳しく述べる。他の欠損Ｋｍ　’遺伝子の構築は第２図で概説する。５′ム■の 構築のためｐＳＤＭ７を制限酵素ＴｔｈＩ［［、１およびＸｍａＩＩＩで切断し 、その末端をタレノーポリメラーゼで平滑化した後、欠失のサイドにＥＣ０ＲＩ −！Ｊンカーを挿入した（１０　ｂ　ｐ）。この修正により、ＮＰＴＩＩ酵素の 活性領域をコードする配列が欠失した（ベック（Ｂｅｃｋ）等、１９８２）。変 異部位の配列はグイデオキシシーケンシング法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等、 １９７７）によって確認した。他の欠損ＫＩＩｌｒ遺伝子と同様に５′ム■を予 めＸｈｏＩｊ５よびＨｉｎｄＩＩ［で切断したベクターｐｓＤＭ５にＸｈｏ　Ｉ 　／　Ｈｉｎｄ　ｍフラグメントとしてクローン化した。

このプラスミドをｐｓＤＭ１０２と呼ぶ（第３図、第４図および第８図参照）。

例３で述べる実験で使用する３′ム変異体を第５図に示す。プラスミドｐＳＤＭ ４に存在する本来のＫ１１ｌ　ｒ遺伝子から出発して２つのタイプの構築物を作 った。１つのタイプはｐＳＤＭＡ上の本来のＫａ＋　’遺伝子の後に合成オクト ビン左側ボーダー配列（第６図）を含む７５　ｂ　ｐ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ／Ｂａ ｍＨＩフラグメントを導入することにより得た。このことによりプラスミドｐ　 Ｓ　Ｄ　Ｍ　８が得られる。ＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩ−またはＥｃｏＲＶ／Ｒｓ ｒｌｌ−７ラグメントの欠失により各々プラスミドｐｓＤＭ８°および３′ムＩ ｌａが得られる。欠損遺伝子（３′ムＩＩａ）はＮＰＴＩＩ遺伝子のコード領域 の一部および転写終止シグナルを欠く。もう１つのタイプの構築物ではプラスミ ドｐＲＡＬ３９１２（ボーダ”　（Ｈｏｅｋｅａ＋ａ）等、１９８５）由来の野 性型オクトビン左側ボーダー配列を含む旧ｎｄＩ１１／Ｂｇｊ２１１フラグメン トをＨｉｎｄｌＩＩおよびＢｇＡ］Ｉで切断したｐｓＤＭＡに移した。このプラ スミドｐＳＤＭ９から、ＮＰＴＩ［遺伝子のコード領域の一部、転写終止シグナ ル（３’　０Ｃ５）およびｐＲＡＬ３９１２由来のＨｉｎｄ　ｍ／　ＢｇＩＩＦ フラグメントの一部を含むＡｃｃｌ／Ｒｓｒｌｌフラグメントを欠失させた。こ れにより３′ムｎｂが生成する。３’　ＯＣ３の後に同じボーダーフラグメント を有する本来のＫｎ＋　’遺伝子はＡｃｃ　Ｉ　／　ＢｓｔＥ　ＩＩフラグメン トを欠失させることにより得られた（ｐＳＤＭ９”）。ＢｓｔＥＩ［の制限部位 は３’　ＯＣ３部分の最後にある転写終止シグナルの後に存在する。左右ボーダ ーの間に本来の、または欠損Ｋｍ　’遺伝子を有する構築物（各々、ｐＳＤＭ８ °、ｐｓＤＭ９°、３′ムＵａおよび３′ムｎｂ）を予めＥＣ０ＲＩおよびＨｉ ｎｄＩＩＩで切断したプラスミドｐＬＭ９９７にＥｃｏＲＩ　／　Ｈｉｎｄ　Ｉ ＩＩフラグメントとして移した（第７図参照）。このことにより各々バイナリ− ベクターｐＳＤＭ２００ＳｐｓＤＭ２１０．９５０Ｍ２０１およびｐＳＤＭ２１ １が生成する。バイナリ−プラスミドはすてにＴ−ＤＮＡを含まないヘルパーＴ ｉ−プラスミドを含むリファンピシン耐性（ｒｉｆ’　）アグロバクテリウム（ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株に三者交配（ジッタ（口１ｔｔａ）等、１９８ ０）により動員された（たとえばホーケマ（ＨｏｅｋｅＩＩＩａ）等、１９８３ ；デブレア（口ｅｂｌａｅｒｅ）等、１９８５）。

結合体を２０■／ｌリフアンピシンおよび５０■／１カナマイシンを含むＬＢ寒 天培地（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、１９８９）で選択した。アグロバ クテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）株はそれらが含むバイナリ−プラ スミドの名前をとって命名した。

例３ ２つの同時に導入したＴ−ＤＮＡ間のタバコプロトプラスト内における相同組換 え 植物細胞内における２つのＴ−ＤＮＡ間の相同組換えの起こる可能性を、２種の アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）株とタバコプロトプラス トを同時に共培養することにより２つのＴ−ＤＮＡでタバコプロトプラストをト ランスホームすることで調べた。

両様は同じ非発がん性ヘルパー株から誘導したが異なるバイナリ−ベクターを含 んでいる。各バイナリ−ベクターのＴ−ＤＮＡは異なる欠損ＮＰＴｎ遺伝子、１ つはその遺伝子のコード領域の５′側部分に欠失を含むもので（ｐｓＤＭｌｏｌ 、第４図および第８図）、もう１つはその遺伝子の３′側部分に欠失を含むもの （ｐＳＤＭ２０１、第５図および第８図）を含んでいる。例２の異なる欠損ＮＰ ＴＩＩ遺伝子の構築についても説明しである。

例で述べた操作に従かいタバコプロトプラストを１）ネガティブコントロールと してＳＤＭ１０２のみを含む１．５Ｘ１０’個のプロトプラスト、２）ネガティ ブコントロールとして３０Ｍ２０１またはＳＤＭ２１１のみを含む１．５Ｘ１０ ’個のプロトプラスト、および３）ＳＤＭ１０２および３０Ｍ２０１の両方また はＳＤＭ１０２およびＳＤＭ２１１の両方を含む１．５Ｘ１０’個のプロトプラ ストと共培養した。

種々の構築物の（コ）トランスホーメーション効率はより小規模の実験で測定し た。ここで５Ｘ１０’個のプロトプラストをＳＤＭ１０２およびＳＤＭ２００の 両方、またはＳＤＭ１０２およびＳＤＭ２１０の両方と共培養した。ＳＤＭ１０ ２株に対するトランスホーメーション効率はプラスミドｐｓＤＭ１０２のＴ−Ｄ ＮＡ上に存在するハイグロマイシン耐性遺伝子を用いて測定した。

ＳＤＭ２００およびＳＤＭ２ＩＱ株を用いて３０Ｍ２０１およびＳＤＭ２１１株 のＴ−ＤＮＡがタバコ細胞にトランスファーする効率を見積った３０Ｍ２００／ ＳＤＭ２１０株のバイナリ−ベクターのＴ−ＤＮＡは３′欠失遺伝子の代りに左 右のＴ−ＤＮＡボーダーの間に本来のＮＰＴＩＴ遺伝子構築物を含むこと以外は ３０Ｍ２０１／ＳＤＭ２１１のものと同じである。プロトプラストのおよそ５〜 ７％がカルスを再生した。生存カルスの±２０％は１０２構築物でトランスホー ムされているが、構築物２００（＝２０１）および構築物２１０（＝２１１）に ついてはそのトランスホーメーション効率は±１５％であった。すでに１つの構 築物（Ｈｅ　’またはＫｎ＋　’　）でトランスホームしたカルスのうち約３０ ％が他の構築物（Ｈａ　’またはＫａ＋　’　）でトランスホームされていると 考えられる。プロトプラストを５′ムー構築物（１，０２）および３′ムー構築 物（２０１または２１１）でコトランスホームする共培養実験における修復率は コトランスホームしたカルスの１〜４％であった。ネガティブコントロールにお いては唯１つのＫＩＩＩｒカルスが得られた。このカルスは修復されたＫｍ　ｒ 遺伝子を含んでおらず、このカルスの子孫はもはやカナマイシン耐性を示さなか った。２０１構築物（合成ＬＢを含む３′ム）と２１１構築物（野性型ＬＢを含 む３′ム）とのトランスホーメーション効率の明確な差は観られなかった。得ら れたＫｍ　’カルスを例１で述べたように植物に再生した。これらの植物の葉の 抽出物中のＮＰＴ■活性が非変性ゲルの正規の位置に検出された（ブラフ）　（ Ｐｌａｔｔ）およびヤング（Ｙａｎｇ）　、１９８７）。またこの植物をＤＮＡ レベルで分析した。このようにしてＫｍ　’の修復が確認された。

理論的にＮＰＴＵ遺伝子はバクテリアのバックグランド中においても相同組換え を介して修復し得る。このことは２つのバクテリア株間のバイナリ−ベクターの トランスファーが起こるときに可能となる。次の例（４）で述べる交配実験でこ の可能性が排除された。

例４ コントロール交配実験 バイナリ−ベクターのトランスファーがアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔ ｅｒ　ｉｕｎ＋）株間で起こるかどうかを試すため、供与様および受容株を２８ ℃で３日間、−緒にインキュベートした。各株１０９個のバクテリアを混合し、 固体ＬＢ培地または植物ホルモン２．４　Ｄ　０．５■／ｌを含む固体ＭＳ３０ 培地にブレーティングしたタバコ懸濁細胞層の上に乗せたニトロセルロースフィ ルターにスポツティングした。さらに三者交配で用いる大腸菌ヘルパー株ＲＫ２ ０１３の存在下で同様の共培養を行った（ジッタ（Ｄｉｔｔａ）等、１９８０） 、供与様ＳＤＭ２０１はｒｉｆ　’であり、か−）ｊ’Ｊｊ−マイシン耐性のバ クテリア遺伝子（Ｋｍ　’　）を有するバイナリ−ベクターｐｓＤＭ２０１を含 んでいる。受容株ＬＢＡ２８５はＬＢＡ２０２株の天然のスペクチノマイシン耐 性（ｓｐｃ　’　）誘導体で、プラスミドは含んでいない。ＬＢＡ２８５は接合 実験においてＴｉ−プラスミドの野生型受容株と同様にふるまう（Ｈｏｏｙｋａ ａｓら、１９８０）。もしバイナリ−ベクターｐｓＤＭ２０１が３０Ｍ２０１か らＬＢＡ２８５にトランスファーするなら、選択プレート上にｓｐｃ’Ｋｍ’の コロニーが検出されるであろう。共培養後バクテリアを２５０■／ｌスペクチノ マイシンおよび５０■／ｌカナマイシンを含むＬＢ培地にブレーティングした。

耐性コロニーは低頻度で出現した（０．８Ｘ１０−”）。これらは全てｒｉｆ　 ’であることから本当のトランスコンジュゲートではない。事実、ＳＤＭ２０１ 株のみのインキュベーション物も同様の効率でｓｐｃ　’　ｒｉｆ　’　Ｋ＋ｏ 　’コロニーを生成した。このことから我々はこれらのコロニーがＳＤＭ２０１ 株の自然発生的ｓｐｃ　’誘導体であると結論した。供与様および受容株を大腸 菌ヘルパー株ＲＫ２０１３とともに共培養したときもバイナリ−ベクターのトラ ンスファ−は起こらなかった（ジッタ（口１ｔｔａ）等、１９８０）。このこと はバイナリ−ベクターの効率的トランスファーに必要な遺伝子は我々のトランス ホーメーション実験に用いた株の中には存在しないが接合体を得るには途中で提 供されなければならないことを示した。大腸菌ＲＫ２０１３株をヘルパーとして 提供したとき植物細胞の存在下（８Ｘ１０−’／受容株）ＭＳ培地上での共培養 後のトランスファー効率は共培養をバクテリアの（ＬＢ）培地（１×１０−３／ 受容株）上で行ったときよりも低い。結果的にＴ−ＤＮＡ間の相同組換え植物細 胞への共導入後に起こると結論し得る。

例５ Ｋａ１′カルス由来の植物のササンプロット分析先に述べられている生育ルーム 内の植物の不完全な葉から植物ＤＮＡを単離しくメトマー（Ｍｅｔｔｌｅｒ）、 １９８７）、ＣｓＣ１勾配で精製した。得られたＤＮＡ懸濁液濃度はＯＤ２．。

で測定した。

約１０μｇのゲノムＤＮＡを制限酵素切断に用いた。０．７％アガロースＴＢＥ ゲルによる分離後（マニアチス（Ｍａｎ　ｉａｔ　ｉｓ）等、１９８９）このＤ ＮＡをキャピラリーブロッティングによりノ＼イボンドＮメンブレン（アマ−ジ ャム、Ｃａｔ、Ｎｎ　ＲＰＮ、３０３Ｎ）に移し、そのメンブレンをハイボンド Ｎプロトコールに従って（予備）ハイブリダイズさせた。最終的洗浄は６５℃、 ０．３　Ｘ　Ｓｓｃ、ｏ、ｉ％ＳＤＳ中で行った。〔α”Ｐ３−ｄＣＴＰで標識 したＤＮＡプローブ（比活性：　０．５〜Ｉ　Ｘ　１０　’ｄｐｍ／　μｇ　Ｄ ＮＡ）をミックスドプライマー法（ベーリンガーマンノ＼イムキット、Ｃａｔ、 Ｎｕ　１．００４４　７６０）を用いて作った。カナマイシン耐性カルスから再 生した植物から単離した染色体ＤＮＡを先に述べた方法に従って分析した。１０ ０個の構築物を含む植物およびトランスホームしていないＮ、タバカム（ｔａｂ ａｃｕｍ）　ｃ　ｖ　、ペチットハバナＳＲＩに由来する各々１０２個の構築物 コピーを含む２種のトランスジェニック植物から単離した染色体ＤＮＡを再構築 に用いた。

ＥｃｏＲＩおよびＢｃｊ！　Ｉによる消化後に期待される内部バンドを第８図に 示した。５′欠失構築物（１０２）は１．６キロ塩基対（ｋｂ）の内部バンドを 与え、一方本来の（正しく修復された）１（ｍ　ｒ遺伝子は２．　ｌ　ｋ　ｂの バンドを与える。ＨｉｎｄＩｎのみによる消化ではいわゆるジャンクションフラ グメントを生成する。

このプローブがＫｍ　ｒ遺伝子の３′部分（たとえば３’　ＯＣ３を含む０．７ ｋｂ　ＰｖｕＩＩフラグメント、ギエレン（Ｇｉｅｌｅｎ）等、１９８３）を含 むとき、３′欠失変異体の組込み物はプロッティングで観察されなかった。この ことは説明を簡略化する。

修復したＮＰＴＩＩ遺伝子に対応する２、　１　ｋ　ｂフラグメントがテストし たほとんどのＫ１１’植物に存在した（第８図）。この２．１ｋｂフラグメント が検出されなかった場合、修復した遺伝子の存在はプライマー２および３を用い たＰＣＲ分析で示し得る（第８図）。

例６ 相同組換えのターゲット部位として欠損ＮＰＴＩＩ遺伝子を含むトランスジェニ ックタバコ植物の構築 無菌的に生育させたタバコ植物の葉ディスク（ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）等、１ ９８５）をバクテリアＳＤＭ１０４株と共培養することによりトランスジェニッ クタバコ植物を得た。共培養後、この葉ディスクをカルス誘導ホルモン（１，０ ■／ＩＮＡＡおよび０．２■／ＡＢＡＰ）および抗生物質セフオタキシム（２０ ０■／１）およびバンコマイシン（１００■／Ｉ２）を含む固体ＭＳ３０−培地 に入れた。１週間後、その葉ディスクを２０■／ｌハイグロマイシンを含むカル ス誘導培地に移した。耐性カルスを切りとり発芽誘導培地（ＭＳ１５．１■＃Ｂ ＡＰ、０．１■／ｆＮＡＡ、１００■／ｌセフオタキシムおよび５０■／ｌバン コマイシン）に移した。若芽を切りとり、それらを２０■／１ハイグロマイシン を含む無ホルモンＭＳ３０培地に植えてＨ＋ｎ’をテストした。上述の方法で得 られたトランスジェニック植物をＤＮＡレベルで分析した（例５参照）。つづい て単純なＴ−ＤＮＡ組込みパターンを示す植物系列を選択した。１０４構築物で トランスホームした植物系列１０４　（，１，６）をターゲツティング実験用の 受容植物として使用した。この系列は植物ゲノム中の同じ位置に逆方向で組込ま れた２つのＴ−ＤＮＡコピーを有すると考えられる（第９図）。

例７ アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）依存ＤＮＡ）ランスファ ーを用いた相同組換えによるトランスジェニックタバコ植物中の欠損ＮＰＴｎ遺 伝子の修復 トランスジェニック植物１０４．１．６のプロトプラストをアグロバクテリウム （Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　Ｓ　ＤＭ　１０１株と共培養した。

この共培養はおよそ２Ｘ１０’個のプロトプラストについて行った。トランスホ ーメーション効率を測定するためにはｌＸｌ０’個のプロトプラストをアグロバ クテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）　Ｓ　ＤＭ１００株と共培養した 。この共培養実験は例１で述べた方法に従って行った。２つの独立する実験で植 物系列１０４のプロトプラストをバイナリ−ベクターｐＳＤＭＩＯＩを有するア グロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ＞と共培養した。このプラス ミドｐＳＤＭ１０１はハイグロマイシン耐性マーカーの隣りに５′欠失をもつＮ ＰＴＩ［遺伝子を含んでいる（第９図）。トランスホーメーション実験で各々２ ８５および２８１個のカナマイシン耐性カルスが生成した。これらのカルスのほ とんどで遺伝子ターゲツティングが起っていなかった。ここで示していない結果 は修復Ｔ−ＤＮＡの場所の５′欠失ＮＰＴｎ遺伝子が内在する植物遺伝子に融合 していることを示唆している。動物細胞を用いた相同組換えに関する最近の報告 では相同組換えの迅速な検出にポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法 を用いている（キム（Ｋｉｍ）およびスミシーズ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ）　、１９ ８８　ニシンマー（Ｚｉｍｍｅｒ）およびグラス（Ｇｒｕｓｓ）、１９８９）。

また我々の実験でも本来のＮＰＴ■遺伝子が相同的組換えで形成されたカナマイ シン耐性カルスのスクリーニングにＰＣＲ法を使用している（第９図）。ターゲ ットＮＰＴＩＩ遺伝子または修復構築物内で欠失した領域にアニールする２つの プライマーを用いたＰＣＲでは本来のＮＰＴＩＩ遺伝子が存在するときのみ増幅 が起こる（９７９ｂｐ長の７ラグメント）。

このようにして全部で２１３個のカルスをスクリーニングした。

３個のカルスがＰＣＲポジティブであることが分り、これらのカルスから植物を 再生して植物系列１．２オよび３を生成させた。

例８ ターゲツティングを検出する分子的分析植物系列の染色体ＤＮＡを例５で説明し たササンプロット法で分析した。ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＢｃＡ　Ｉおよ びＨｉｎｄｌＩ［で切断し、このフラグメントをゲルで分離してからハイボンド −Ｎメンブレンに移した。内部ＮＰＴＩｒプローブを用いて（６１０ｂｐ　Ｘｍ ａＩ［Ｉ／　ＲｓｒＩＩフラグメント、第８図参照）ハイブリダイゼーションを 行った。

植物系列１ではターゲット部位に存在するＮＰＴＩＩ遺伝子の３′変異体コピー の１つが侵入Ｔ−ＤＮＡによる相同組換えにより修復された。野性型ＮＰＴｎ活 性はこの植物系列の葉で検出され（ブラット（Ｐｌａｔｔ）およびヤン（Ｙａｎ ｇ）　、１９８７）　、それにより本来のＮＰＴＩＩ遺伝子の存在が確認された 。

例９ ＳＳＵ融合遺伝子の構築 ＳＳＵＳ用マルチ遺伝子群性メンバーを単離するために、Ｎ。

ツバカム（ｔａｂａｃｕｎ＋）　Ｓ　Ｒ１のサブゲノムライブラリーをラムダフ ァージＰＤＪｎで構築した（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、１９８２）。

Ｎ、ツバカム（ｔａｂａｃｕｍ）　ｃ　ｖ　、ペチットハバナＳＲＩの５ＳＵｃ ＤＮＡクローンに特異的なプローブを用い、３個のイントロンを含む５ＳＵ−遺 伝子を有するクローン（マザー（Ｍａｚｕｒ）等、１９８５）をこのライブラリ ーから単離した。活性遺伝子は２．４ｋｂ塩基対ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント上 に存在する。我々が単離したクローンの制限地図およびＤＮＡ配列は公表されて いるデータと一致していた（マザー（Ｍａｚｕｒ）等、１９８５）、このＨｉｎ ｄｍフラグメントをｐＩＣ１９Ｈにクローン化しプラスミドｐｓＩｃ１を生成し た（マーシコ（Ｍａｒｓｈ）等、１９８４）。この遺伝子を５ＳＵ−ＮＰＴｎキ メラ遺伝子の構築に用いた（第１０図）。これを行うためＮＰＴｎ挿入モジュー ルを以下のように構築した（クローンｐｓＤＭ５３）。

ａ）ツバリンシンテースプロモーターおよびコード配列の最初の領域を含むｐＳ ＤＭ４のＥｃｏＲＩ　／　ＸｍａＩ［［７ラグメント（第１図参照）を唯一のＢ ａｍＨＩおよび唯一のＢｇｊ！ＩＩ制限部位が存在する５１塩基対合成ＥｃｏＲ Ｉ　／　ＸｍａＩＩＩフラグメント（第１０Ｂ図）と置換する、 ｂ）ＮＰＴＩ［−配列から両ＰｓｔＩ制限部位を除去する（ベック（Ｂｅｃｋ） 等、１９８２）、、ｌ−ド領域中のＰｓｔ１部位をＭ１３／オリゴヌクレオチド 突然変異誘発（バイオラド社の突然変異誘発キット）を用いＴｎ５配列中の部位 ｌ７３３のＧをＡに転換することにより除去した（ベック（Ｂｅｃｋ）等、１９ ８２）。

結果的にＮＰＴｎたんばく質のアミノ酸配列に変化はない。別のＰｓｔＩ部位は コード領域の外にあり、ＰｓｔＩによる切断、ｄＣＴＰ存在下でのクレノーポリ メラーゼによる平滑化、ひきつづ＜ＳｍａＩで切断およびライゲーションによる 閉環により除去した。このことにより、３′非コード領域のＴｎ５配列（ベック （Ｂｅｃｋ）等、１９８２）中の２５１９番から２６５６番までのフラグメント を欠失させた。１つの融合遺伝子の構築のため、プロモーターなしのＮＰＴＩｒ の１．７　ｋ　ｂ　ＢａｃＡＨＩフラグメントおよび３’　ＯＣＳターミネータ −をｐｓＩｃｌのｒｂｃＳ−遺伝子のＢａｏ＋８１部位に挿入した。このプラス ミドｐＮＳ１はｒｂｃＳおよびそのｒｂｃｓ遺伝子の第４エクソン中のＮＰＴＩ 間の翻訳的融合物を含んでいる。ｐｓＩＣＩ中の第２エクソンにおける別の５Ｓ Ｕ−ＮＰＴＩＩ融合体を構築するため３ａｍＨＩ部位をタレノーポリメラーゼに よる平滑化で第４エクソンから除去した。これでプラスミドｐＳＩＣ２が生成す る。つづいてｐＳ　ＩＣ２の第２エクソン中にＭ１３／オリゴヌクレオチド突然 変異誘発（バイオラド社の突然変異誘発キット）を用いて新しいＢａ−）ｌＩｆ ｆ位を導入した。このことによりマザー（Ｍａｚｕｒ）等（１９８４）の配列に おける部位１３８３および１３８５で各々ＧからＴおよびＡからＣの変化が起き た。このプラスミドｐＳＩＣ３においてｐＳＤＭ５３由来の１．７　ｋ　ｂＢｇ ｊ２　ＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを新しいＢａｍＨＩ制限部位にクローン化 した。このようにして得たクローンはｒｂｃＳおよびｒｂｃＳ−遺伝子の第２エ クソン中のＮＰＴＩ間の翻訳的融合を含んでいる。

例１０ バイナリ−ベクターｐｓＤＭ１４の構築プラスミドｐｓＤＭ１０　（第７図参照 ）はバイナリ−ベクターｐｓＤＭ１４の構築の基礎となる。合成ボーダーおよび オーバードライブ配列を含むフラグメントを以下の方法によりｐｓＤＭｌｏに移 した。ｐ　Ｔ　ｉ　Ａ　ｃ　ｈ　５のオーバードライブ配列はＢｃｌＩ／５ａｃ ｌフラグメント　（１４０８７−１４７１０、バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）等、１ ９８３）上に存在する。このフラグメントを５ａｃｌおよびＢａｍｆｌ　Ｉで切 断したｐｌｃ２ＯＲにクローン化した。

ｐＩｃ２０Ｒから　°オーバードライブを５ａｃＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントと してｐＵｃ１９　（ＸＳａｃＩＸＥｃｏＲＩ）にクローン化した。生成したプラ スミドを５ａｃｌおよびＫｐｎＩで消化し、右側Ｔ−ＤＮＡボーダーを含む合！ Ｋ　ｐｎ　Ｉ　／　Ｓ　ａｃ　Ｉフラグメントをこれにライゲーションした。こ のプラスミドをＨｉｎｄｍおよびＫｐｎＴで切断することにより左側Ｔ−ＤＮＡ ボーダーを含むＨｉｎｄＩ１１／Ｋｐｎｌフラグメントをクローン化し得た。こ のプラスミドｐＢＩＮＳＢ２からＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントを 切り出した。

このフラグメントの末端をタレノーポリメラーゼで平滑化し、これにＢｇｌＵ− リンカ−をライゲーションした後、ＢｇＡＩＩによる消化につづいてそのフラグ メントをｐｓＤＭｌｏに結合した。このようにしてｐｓＤＭ１４が得られた。

例１１ ｐｓＤＭ１４におけるｒｂｃｓ−ＮＰＴＩＩ融合遺伝子のクローニング ｐＮｓｌｊ；よびｐＮＳ２からの本来の融合遺伝子を含むＨｉｎｄ■フラグメン トおよびプロモーターなしのｒｂｃｓ−ＮＰＴＩＩ融合物を含むＰｓｔ　Ｉ　／ 　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントをｐＩｃ２０Ｒにクローニングしくマーシュ（ Ｍａｒｓｈ）等、１９８４）、各々プラスミドｐＮＴＳＳＩ、２．３および４を 作成した（第１０図参照）。それらの融合遺伝子を３　ａ　１．　Ｉ　／Ｘｈｏ Ｉフラグメントとして予め５ａｊ２１／ＸｈｏＩで切断したバイナリ−ベクター ｐｓＤＭ１４（第１１図）にライゲーションした。

生成したプラスミドｐＮＴＳＳ　１１　（Ａ／Ｂ）　、ｐＮＴｓｓ１２（Ａ／Ｂ ）　、ｐＮＴｓｓ２１　（Ａ／Ｂ）およびｐＮＴｓｓ２２（Ａ／Ｂ）はオクトビ ンＴｉ−プラスミドの合成した左右のボーダーの間にそれぞれ本来の第４エクソ ン融合遺伝子、プロモーターなし第４エクソン融合遺伝子、本来の第２エクソン 融合遺伝子およびプロモーターなし第２エクソン融合遺伝子を含んでいる。

ＡおよびＢはｐｌｃ２ｏＲ中のＸｈｏｌ／　Ｓ　ａ　Ｉ　Ｉ　７ラグメントの方 向を示している。第１０図ではＢの方向のみを示している。このバイナリ−プラ スミドをヘルパーＴｉ−プラスミド上にＶｉｒ−領域を含むアグロバクテリウム （Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）ヘルパー株に入れてＮＴＳＳＩＩ、ＮＴＳＳ １２、ＮＴＳＳ２１およびＮＴＳＳ２２株を作成した。

例１２ ニコチアナツバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）　ｃ　ｖ、ベチッ トハバナＳＲＩのプロトプラストとアグロバクテリウムとの共培養によるｒｂｃ ｓ−遺伝子の１つの部位特異的突然変異誘発別個のトランスホーメーション実験 で１０７個のタバコプロトプラストをアグロバクテリウム＜Ａｇｒｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｎ＋）　Ｎ　Ｔ　Ｓ　Ｓ　１２株およびＮＴＳ　Ｓ　２２株と共培養した 。これらの株各々はバイナリ−ベクター上に存在するＴ−ＤＮＡのボーダー間に プロモーターなし第４エクソンｒｂｃｓ７ＮＰＴＩｒ融合遺伝子＄よびプロモー ターなし第２エクソンｒｂｃＳ−ＮＰＴＩＩ融合遺伝子を含んでいる。

ポジティブコントロールとしてＮ７３３１１株およびＮＴＳ３２１株を１０ｓ個 のタバコプロトプラストと共培養した。使用した共培養法については例１に詳細 に説明しである。プロトプラストの５パーセントがカルスに再生され、ポジティ ブコントロールからこのカルスの１５％がトランスホームされていると考えられ る。

ＮＴＳＳ１２およびＮＴＳＳ２２を用いた共培養実験ではＫｍ　’カルスが得ら れた。ＰＣＲ分析を１０個のカルスの染色体ＤＮＡについて行った（ラスカー（ Ｌａｓｓｎｅｒ）等、１９８９の方法参照）。

あるカルスの場合プロモーターなし融合構築物を有するトランスホームしたＴ− ＤＮＡがターゲット部位で組換えを起こしｒｂｃＳ−プロモーターとＮＰＴｎ遺 伝子の構造部分の間に機能性融合体が生成する。これらのカルスから植物が再生 され、これらの植物から単離したゲノムＤＮＡについてササン分析を行った。こ れらの植物のいくつかではＴ−ＤＮＡのｒｂｃＳ−ＮＰＴＩＩ部分は相同組換え によりターゲット部位に正しい組込まれていることが分った。

例１３ ＳＳＵ部位への遺伝子ターゲツティングを行うための別のＴ−ＤＮＡ構築物 ここではＳＳＵ部位を指向するもう１つのＴ−ＤＮＡ構築物について示している （第１２図）。５ＳＵ−ＮＰＴＩＩ融合構築物とは対照的にこの新しい構築物は ＳＳＵ遺伝子とＮＰＴＩＩ遺伝子のコード領域の間に翻訳的融合物を含んでいな いが、ＳＳＵ遺伝子の第４エクソンに挿入されたツバリンシンテースプロモータ ーの制御下のＮＰＴｎコード領域を有している。ＳＳＵプロモーターの小部分（ ±３６５ｂｐ）を欠失されておりＰＣＲによる組換え体のスクリーニングを可能 にしている。さらにＴ−ＤＮＡａｕｘ−２遺伝子を組換えカルスを濃縮するため ネガティブコントロールとして構築物に導入する。ａｕｘ−２遺伝子産物はα− ナフタレンアセトアミド（ＮＡＭ）をオーキシン（ＮＡＡ）に変換する。高濃度 のく１０〜２０■、＃）ＮＡＭは無オーキシン培地中タバコ細胞の増殖を促進し 得る。しかし、ａｕｘ−２遺伝子を含む細胞は効率的にＮＡＭを高濃度で植物細 胞に毒性を示すより強力なオーキシンＮＡＡに変換する（デビッカ−（口ｅｐｉ ｃｋｅｒ）等、１９８８）、したがって高濃度のＮＡＭを含む無オーキシン培地 を用いることにより、ａｕｘ−２遺伝子を発現しない細胞を選択し得る。

ａｕｘ−２遺伝子を含むｐＴｉＡｃｈ５のＴ−ＤＮＡの２．５ｋｂＨｉｎｄＩ１ １フラグメント（３３９０−５９３３、バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）等、１９８３ ；ギエレ７　（Ｇｉｅｌｅｎ）等、１９８４）をｐＩＣ２０ＲのＨｉｎｄＩ［Ｉ 部位にクローン化した（マージｘ　（Ｍａｒｓｃｈ）等、１９８４）。

ａｕｘ−１遺伝子のプロモーターおよびコード領域の一部を含むａｕｘ−２遺伝 子の上流の配列を欠失させた。このことはＰｓｔｌによる消化（ｐｌＣのポリリ ンカー内）、　゛クレノー′ポリメラーゼのエクソヌクレアーゼ活性を用いた平 滑末端化、ＨｉｎｄＩＩによる消化（５７２１、バーカー（１３ａｒｋｅｒ）等 、１９８３、ギエレン（Ｇｉｅｌｅｎ）等、１９８４）およびプラスミドの再ラ イゲーションによって行なわれた。このようにするとａｕｘ−２遺伝子のプロモ ーター配列が元のままで残る。つづいてａｕｘ−２遺伝子を５ａｌＩ／Ｘｈｏｌ フラグメントとしてｐＮＴｓｓｌｌＢの単一のＳａｉ’　！部位にクローニング した。このプラスミドｐＮＴｓｓ１１２ではａｕｘ−２遺伝子の転写は左側のＴ −ＤＮＡボーダーの方向に行なわれる。

プラスミドｐＮＴｓｓ１をＸｈｏＩで消化し、ついでＢｇｉＩＩにより部分消化 した。Ｓ　Ｓ　Ｕプロモーター領域の５′末端から欠失した３６５ｂｐ以外のほ とんどのＳＳＵ／ＮＰＴＩＩ融合遺伝子を含む３．９　ｋ　ｂ　Ｘｈｏｌ／Ｂｇ ｊｌ！　ＩＩｌフラグメント得られた。このフラグメントをＸｈｏＩおよびＢａ ｍ１−Ｉ　Ｉで切断したｐＵＣ誘導体ｐＩｃ１９Ｈ（７−シユ（Ｍａｒｓｃｈ） 等、１９８４）にクローン化した。ＮＰＴｎコード領域およびＯＣＳターミネー タ−を含むＢａｍＨＩ挿入モジュールを右側Ｔ−ＤＮＡボーダー配列を含まずＮ ＯＳプロモーター領域の後にＮＰＴＩＩコード領域を含むＢｇ　ｌ　ＩＩ　／　 ＢａｍＨＩで置換した。

この新しい挿入モジュールの構築を以下に示す。プラスミドｐＮＴＳＳ５におけ るＮＯＳプロモーターからのＮＰＴＩＩ遺伝子の転写の方向が転写のターミネー タ−きして働き得るＳＳＵ遺伝子の３′末端の方向に行なわれる。このようにし てＯＣＳターミネータ−を省くことができ、挿入モジュールのサイズを小さくす ることができる。ｐＮＴＳＳ５のＳ　ａ、　ｌ　ｌ　／Ｂａｍｆｌｌ　７ラグメ ントを単離し５ａＩＴおよび１３ａｍｆｌ　Ｔで切断したｐＮＴｓｓ　１１２の ベクタ一部分にライゲーションした。このようにして別のターゲツティング構築 物を含むバイナリ−ベクターｐＮＴｓｓ５１２が得られた（第１２図参照）。

新しいＮＰＴｎ挿入モジュールの構築のためＮＯＳプロモーターおよび修復され たＮＰＴＩＩコード領域を含むｐＳＤＭ４のＢｃＡ１／ＳｍａＩフラグメントを ＳｍａｌおよびＢｇｆｆＩＩで切断したｐｌｃ２０Ｈ（マージｘ　（Ｍａｒｓｃ ｈ）等、１９８４）にクローニングした。

このプラスミドからＸｈｏＩ＃よび［ｌａｍＨＩでフラグメントを切り出し、Ｘ ｈｏＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＩｃ１９Ｒ（ツーシュ（Ｍａｒｓｃｈ）等 、１９８４）に再クローニングした。最後に、この新しいＮＰＴｎ挿入モジュー ルをＢｇ　Ｉ　Ｉ　／　ＢａＩＩＩＨｌフラグメントとしてｐＮＴＳＳ５に導入 した。バイナリ−ベクターｐＮＴｓｓ５１２　（第１２図）を三者交配により非 発がん性ヘルパーＴｉ−プラスミド上にＶｉｒ−領域を含むアグロバクテリウム （Ａｇｒｏｂａｃｔ−ｅｒｉｕｍ）株にトランスファーした（例２）。

例１４ プラスミドｐＮＴｓｓ５１２のＴ−ＤＮＡ構築物によるトランスホーメーション タバコプロトプラストをアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｎ ＴＳＳ５１２株と共培養した。再生およびトランスホーメーション効率を測定す るためプロトプラストを例１で述べたようにカナマイシン有無の条件下で再生し た。非トランスホームタバコ細胞をＮＡＭ含有培地で培養しこの培地での再生効 率を測定した。

より大きい実験でプロトプラストをＮＴＳＳ５１２株と共培養し、カナマイシン および１０〜２０■／ｌＮＡＭを含む無オーキシン培地で増殖させた。植物細胞 のゲノム内での非正統的組換によるＴ−ＤＮＡ構築物の組込みでカナマイシン耐 性のａｕｘ−２＋細胞が生ずる。ａｕｘ−２遺伝子はＴ−ＤＮＡの不完全な組込 みまたはメチル化によるこの遺伝子の不活性化により発現されないのでこれらの 細胞のいくつかはＮＡＭ培地で生育し得た。相同組換えによりＮＰＴＩＩ遺伝子 がターゲット部位に正しく挿入されない場合、ａｕｘ−２遺伝子は失なわれる。

この細胞はカナマイシン耐性であり、ａｕｘ−２遺伝子のないことがこれらの細 胞が高濃度のＮＡＭを含む無オーキシン培地で生育するのを可能にした。

より小さいコントロール実験から最初のプロトプラストの５％が生存しくＮＡＡ −およびＮＡＭ−含有培地とも同じく）、再生細胞の１５％がカナマイシン耐性 であった。より大きいターゲツティング実験でＮＡＭ含有培地でのプロトプラス トの再生はａＵＸ−２遺伝子を発現しない細胞を１０〜１００倍に濃縮した。Ｐ ＣＲ技術を用いて望ましい組換えで得られるカルスを同定した。ゲノムＤＮＡを １０個のカルスから抽出しくラスカー（Ｌａｓｓｎｅｒ）等、１９８９）　、Ｐ ＣＲで調べた。反応に用いたプライマーは各々ＮＰＴＩＩ：ｌ−１’領域オヨび Ｔ−ＤＮＡ構築物ｐＮＴＳＳ５１２から欠失したＳＳＵプロモーターの上流領域 にアニールした。もし組換えが侵入Ｔ−ＤＮＡおよびターゲット部位の間で起っ たならＰＣＲは期待されるサイズのフラグメントの増幅を行う。事実、いくつか のカルスでは組換えが検出された。先に述べたようにこれらのカルスから植物を 再生し、これらの植物およびその子孫についてササン分析を行った。いくつかの 植物系列においてＮＰＴｎモジュールがターゲット部位における相同組換えによ り正しく挿入されたことが分った。この遺伝子ターゲツティング効率は１０−４ 〜１０−５の範囲にあると見積られた。

寄託 利用を目的として以下の大腸菌株をオランダ、バーン市の“セントラルブユロー ボアシメルカルチャー”　ＣＢＳに寄託した。

（株　Ｄｈ５ａ：発現型：　Ｆ　−、ｅｎｄ　Ａ　Ｉ　、　ｈｓｄ　Ｒ１７（ｒ −ｋａ＋”ｋ）ｓｕｐ　Ｅ　４４．　ｔｈｉ−１，Ｉａｍｄａ−、ｒｅｃ　Ａ１ ．　ｇｙｒ　Ａ９６．　ｒｅｌ　Ａｌ。

Ａ　（ａｒｇＦ−１ａｃｚｙａ）　ロ１６９．　ｐｈｉ　８０ｄｌａｃｚ　Ａ　 Ａ１５）　。

プラスミド構築物を含む ＤＨ５αに有 用な大腸菌株　寄託口　寄託番号 ｐｓＤＭ１００　１９８９年７月２１日ＣＢＳ　３４８．８９　ｐｓＤＭ４ｓＤ Ｍ１０ ｐｓＤＭ２００／２０１ ＳＤＭ７ ｐｓＤＭｌｏｌ ｐｓＤＭ１０２ ｐｓＤＭ１０４ ｐＳＤＭ９　１９８９年７月２１日ＣＢＳ　３４６．８９　ｐｓＤＭ２１０／２ １１ｐｓＤ１１４　１９８９年７月２１日ＣＢ５３４７．８９　ｐＮＴｓｓ１１ ＰＮＴＳＳ１２ ｐＮＴｓｓ２１ ｐＮＴＳＳ２２ ｐＮＴｓｓ５１２ ｐｓＩｃｌ　１９８９年７月２１日ＣＢ５３４９．８９　ｐＮＴｓｓ１１ｐＮＴ ｓｓ１２ ｐＮＴｓｓ２１ ｐＮＴＳＳ２２ ｐＮＴｓｓ５１２ 全てのバイナリ−植物トランスホーメーションベクターに対する良い受容株であ るアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　Ｌ　Ｂ　Ａ４４０４株 はすでに寄託されており（１９８３年２月２４日）、番号ＣＢ３　１９１．８３ としてオランダ、バーンの“セントラル　ビュローボア　シメルカルチャーズ” 　（ＣＢＳ）から入手できる。

脚注 図で使用されている記号および略号のリスト匡＝＝＝彊　：　２重線ボックスは Ｋｍ　’　によびＨ１遺伝子（ＮＰＴＴＩＩおよびＨＰＴ）のコード領域を示し ている。

非コード領域が一本線ボックスで示しである。

国頭疋（：　ツバリンシンテース遺伝子（５’Ｎ０３）のプロモーター領域およ びツバリンＴｉ−プラスミドの右ホコ］頁］：　転写ターミネータ−を含むオク トピンシンテース遺伝子の３′領域（３’０ＣＳ）。

「薫Ｆ阿■：　ＣａＭＶの３５Ｓ転写物のプロモーター領域。

４ＲＢ　：　右側Ｔ−ＤＮＡボーダーリピート−ｍｕ　：　左側Ｔ−ＤＮＡボー ダーリピートｔ１ｍ’（遺伝子）＝（植物細胞に）ハイグロマイシン耐性（を与 える遺伝子） Ｋｍ’（遺伝子）：（植物に）カナマイシン耐性（を与える遺伝子）。

ＫａｎｌＩ［：　ストレプトコッカス　フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔ。

ｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のバクテリア性カナマイシン耐性遺伝子 。

ＡＩＩＩＰ　ｒ　：　バクテリア性アンピシリン耐性遺伝子。

ＮＰＴＩＩ　：　ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■をコードするＤＮＡ 配列。

ＨＰＴ　：　ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配 列。

参考文献 アルブライト（Ａｌｂｒｉｇｈｔ）、　Ｌ、Ｍ、等Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 　１６９゜１０４６−１０５５．　（１９８７） バーカ−（Ｂａｋｅｒ）、　Ｍ、０９　等Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳ、　８５゜６４３２−６４３６．　（１９８８） バッカＬ／７　（Ｂａｋｋｅｒｅｎ）、　Ｇ、等Ｃｅ１１．５７．　８４７−８ ５７．　（１９８９）バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）、　Ｒ，Ｆ、　Ｐｌａｎｔ　Ｍ ｏ１．Ｂｉｏ＋、、　２．３３５−３５０（１９８３）バートン（Ｂａｒｔｏｎ ）、　Ｋ、Ａ、等Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍａｌｌ、　１０１．５２７−５３ ９゜ボーＪｌ／Ｉンベ（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ）、　Ｄ、Ｃ，等Ｎａｔｕｒｅ、　 ３２１．４４６−４４９゜ベック（Ｂｅｃｋ）、　Ｅ、等Ｇｅｎｅ、　１９．３ ２７−３３６．　（１９８２）とパン（Ｂｅｖａｎ）、　Ｍ、Ｉ！１．等Ｎａｔ ｕｒｅ、　３０４．１８４−１８７．　（１９８３）ビバン（Ｒｅｖａｎ）、　 Ｍ、Ｗ、等Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　ＩＩ　Ｋ２．３６９−３ ８５゜（１９８３ｂ） ボンホ７　（Ｂｏｍｈｏｆｆ）、　Ｇ、等Ｍｏ１．Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　 １４５．１７７−１８１゜ブチャナンーウォラストン（Ｂｕｃｈａｎａｎ−１１ ｏ１１ａｓｔｏｎ）、　１７．等Ｎａｔｕｒｅ、３２８．　１７２−１７３．　 （１９８７）カペチ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ）、　Ｍ、Ｒ，５ｃｉｅｎｃｅ　２４４ ．１２８８−１２９２．　（１９８９）チルシ：ｙ　ン（Ｃｈｉｆｔｉｏｎ）、 　Ｍ、　Ｄ、等　Ｎａｔｕｒｅ、　２９５．４３２−４３４゜クリステ−（Ｃｈ ｒｉｓｔｉｅ）、　Ｐ、Ｊ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１７０゜２６ ５９−２６６７、（１９８ｇ） チャイ（Ｃｈｙｉ）、　Ｙ−Ｓ、等Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、２０４． 　６４−６９゜シトフスキー（Ｃｉｔｏｖｓｋｙ）、　Ｖ、等５ｃｉｅｎｃｅ、 　２４０゜５０１−５０４．　（１９８８） シトフスキー（Ｃｉｔｏｖｓｋｙ）、　Ｖ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　。

」ム　１１９３−１１９７．　（１９８９＞クロスウェイ（Ｃｒｏｓｓｖａｙ） 、　Ａ、等Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　２０２゜１７９−１８５．　 （１９８６） セルニフロフスキー（ＣｚｅｒｎｉＮｏｆｓｋｙ）、　Ａ、Ｐ、等ＤＮＡ、　Ｆ １６　。

４７３−４８２．　（１９８６） ダス（Ｄａｓ）、　Ａ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ。

デＤＬ／ス（Ｄｅｒｏｌｅｓ）、　Ｓ、Ｃ，ｅｎ　ガードナー（Ｇａｒｄｎｅｒ ）、　Ｒ，Ｃ。

Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、、　１１．　３５５−３６４　、　（１９８ ８）デフラモンド（Ｄｅ　Ｆｒａｍｏｎｄ）、　Ａ、Ｊ、等Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ、　１゜２６２−２６９．　（１９８３） デルブレア（口ｅｂｌａｅｒｅ）、　Ｒ，等Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、、　１３Ｈ３゜４７７７−４７８８．　’（１９８５）デピッカー（口ｅｐ ｉｃｋｅｒ）、　Ａ、Ｇ、ヤコブス（Ｊａｃｏｂｓ）、　Ａ、Ｍ、および（ヴア ンモンタギｘ）　Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｑｕ、　Ｍ、Ｃ，、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ 　Ｃｅ１ｌＲｅｐｏｒｔｓ　７．　６３−６６、（１９８８）デピッカ−（Ｄｅ ｐｉｃｋｅｒ）、　Ａ、等Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　２０１゜４７ ７−４８４．　（１９８５） ジッタ（口１ｔｔａ）、　に、、スタンフィールド（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ）、　 Ｓ、。

コービン（Ｃｏｒｂｉｎ）、口、　および　ヘリンスキー（Ｈｅｌｉｎｓｋｉ） 。

Ｄ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　７７、７３ ４７−７３５１．　（１９８０）エルゼン（Ｅｌｚｅｎ）、　Ｐ、Ｊ、Ｍ、ヴア ンデン（ｖａｎ　ｄｅｎ）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ。

Ｂｉａｌ、、　５．　１４９−１５４．　（１９８５ａ）エルゼン（Ｅｌｚｅｎ ）、　Ｐ、Ｊ、Ｍ、ヴアンデン（ｖａｎ　ｄｅｎ）、等Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂ ｉｏｌ、、　５．　１４９−１５４、　（１９８３）エルゼン（ＢＩｚｅｒ＋） 、　Ｐ、Ｊ、Ｍ、ヴアンデン（ｖａｎ　ｄｅｎ）、等Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ、Ｂｉ ｏｌ、、５．　２９９−３０２．　（１９８５）フィブルスキー（Ｐ　ｉｇｕｒ ｓｋ　ｉ）　、口、Ｈ１等Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　７６、　１６４８−１６５２．　（１９７９）フレーリー（Ｆｒａｌ ｅｙ）、　Ｒ，Ｔ、等　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　３゜３７１−３７ ８．　（１９８４） フレーリー（Ｆｒａｌｅｙ）、　Ｒ，Ｔ、等Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　 ３゜６２９−６３５．　（１９８５） ギエトル（Ｇｉｅｔｌ）、　Ｃ，等Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ｌｌ５Ａ、　８４゜９００６−９０１０．　（１９８７） グレーブス（Ｇｒａｖｅｓ）、　Ａ、Ｃ，Ｆ、等Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 　１６９゜１７４５−１７４６．　（１９８７） グレーブス（Ｇｒａｖｅｓ）、　Ａ、Ｃ，Ｐ、等　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ、Ｂｉｏ ｌ、、７゜４３−５０．　（１９８６） グリムスリー（Ｇｒｉｍｓｌｅｙ）、　Ｎ、等　Ｎａｔｕｒｅ、　３２５．　１ ７７−１７９゜グリフ　７　（Ｇｒｉｔｚ）、　Ｌ、等Ｇｅｎｅ、　２５．　１ ７９−１８８．　（１９８３）ハーレン（Ｈａａｒｅｎ）、　Ｍ、Ｊ、Ｊ、ヴア ン（ｖａｎ）　、等　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ。

Ｂｉａｌ、、８．　９５−１０４．　（１９８７）ハーレン（ｌｌａａｒｅｎ） 、　Ｍ、Ｊ、Ｊ、ヴアン（ｖａｎ）、等　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、 、１５．　８９８３−８９９７．　（１９８６）バイン（Ｈａｉｎ）、　Ｒ，等 　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、　１９９　、１０１−１６８゜ハーナルス チーン（Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎ）、　Ｊ、Ｐ、　ＥＭＢＯＪ、　３．３０３９ −３０４１゜かレラーＸＸトレラ（ｔｌｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ）、　 Ｌ、等Ｎａｔｕｒｅ、　３０３゜ハレラーｘストレラ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔ ｒｅｌｌａ）、　Ａ、Ｃ，ＢＭＢＯＪ、　７゜４０５５−４０６２．　（１９８ ｇ） ヒル（Ｈｉｌｌｅ）、　Ｊ、等Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１５４　婁２．　 ６９３−７０１゜ヒル（Ｈｉｌｌｅ）、　Ｊ、等Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ、Ｂｉａｌ 、、　２．１５５−１６３．（１９８３）ホーケア（Ｈｏｅｋｅｍａ）、　Ａ、 等　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、、５゜８５−８９．　（１９８５） ホーケア　（Ｈｏｅｋｅｍａ）、　Ａ、等　Ｎａｔｕｒｅ、３０３．１７９−１ ８０．　（１９ｇ３）ホーケア　（Ｈｏｅｋｅｍａ）、　Ａ、等Ｊ、Ｂａｃｔｅ ｒｉｏ１１．１５８．３８３−３８５゜ボーケ”　（Ｈｏｅｋｅｍａ）、　Ａ１ 等　ＥＭＢＯＪ、　３．２４８５−２４９０．　（１９８４ｂ）ホイカース（） ｌｏｏｙｋａａｓ）、　Ｐ、　Ｊ、　Ｊ、等Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂ、、 　９８゜４７７−４８４．　（１９７７） ホイカースーヴアンスログテレン（Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒ ｅｎ）。

Ｇ、Ｍ、Ｓ、等Ｎａｔｕｒｅ、　３１１．７６３−７６４．　（１９８４）ホイ カース（Ｈｏｏｙｋａａｓ）、　Ｐ、Ｊ、Ｊ、等Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 　１４３゜１２９５−１３０６．　（１９８０） ホーシｘ　（ｔｌｏｒｓｃｈ）、　Ｒ，Ｂ、等　５ｃｉｅｎｃｅ、　２７７、１ ２２９−１２３１゜ジｘ　７７−ソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）、　Ｒ，Ａ、　Ｂ ＭＢ口Ｊ、４．２５−３２゜カー（Ｋｅｒｒ）、　Ａ、等Ｐｈｙｓｉｏ１．Ｐｌ ａｎｔ　Ｐａｔｈｏ＋、、　９゜２０５−２２１．　（１９７６） キムＣＫ１１１１）、　Ｈ，Ｓ、　ｅｎ　スミシーズ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ）、Ｎ ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、８８８７−８９０３．　（１９８ｇ）クリ −（に１ｅｅ）、　Ｈ，等Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ、、　３８ ．４６７−４８６゜フレイン（Ｋｌｅｉｎ）等　Ｎａｔｕｒｅ、３２７．７０− ７３．　（１９８７）クレンメ（Ｋｒｅｎｓ）、　Ｐ、Ａ、等Ｎａｔｕｒｅ、　 ２９６．７２−７４．　（１９８２）カチャーラバチ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔ ｉ）、　Ｒ，Ｓ、等、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８１．　３１５３−３１５’Ａ　（１９８４）ラス カー（Ｌａｓｓｎｅｒ）、　Ｎ、Ｗ、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、７ ゜１１６−１２８．　（１９８９） マニＴチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、　Ｔ、等　Ｍｏｌ、　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ 　Ｉａｂｏｒａｔｏｒｙａ＋ａｎｕａ１．（１９８２） マーシュ（Ｍａｒｓｈ）、　Ｊ、Ｌ、　Ｇｅｎｅ、　３２．４８１−４８５．　 （１９８４）マードア　（Ｍａｒｔｏｎ）、　Ｌ、等　Ｎａｔｕｒｅ、２７７、 １２９−１３１．　（１９７９）マザー（Ｍａｚｕｒ）、　Ｂ、等Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３゜２３７３−２３８６．　（１９８５） メルチャーズ（Ｍｅｌｃｈｅｒｓ）、　Ｌ、Ｓ、等０ｘｆｏｒｄ　５ｕｒｖｅｙ ｓ　ｏｆ　ＰｌａｎｔＭｏｌ、ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、４．　１６７− ２２０　（１９８７）メリック（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、　Ｊ、等　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１０１．２０−７９゜（１９８３＞ メトラー（Ｍｅｔｔｌｅｒ）、　ｒ、Ｊ、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ、　Ｂｉａｌ、 、　５．３４６−３４９゜ミュータ−＜Ｍｕｔｔｅｒ）、　Ｊ、Ｐ、等　Ｐｈｙ ｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ、５７．３７−４１゜ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）、 　Ｔ、等　Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ、１５゜４７３−４９７．　（１９６２ ） ナギー（Ｎａｇｙ）、　Ｊ、Ｉ、等Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏ１．、７８． 　４５３−４５５゜ネグルチウ（Ｎｅｇｒｕｔｉｕ）、　［、等Ｐｌａｎｔ、　 Ｍｏｌ、Ｂｉａｌ、、８゜３６３−３７３．　（１９８７） オームス（ＯｏｒＱｓ）、　Ｇ、等　Ｇｅｎｅ、　１４．３３−５０．　（１９ ８ｉ）オームｘ　（０００１８）、　Ｇ、等　Ｐｌａｓｍｉｄ、７．１５−２９ ．　（１９８２）オー・ウニバー（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ）、　Ｔ、Ｌ、、等Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

５ｃｉ−ＵＳＡ、７８．　６３５４−６３５８．　（１９８１）パスコウスキー （Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ）、　Ｊ、等　Ｐｌａｎｔ、　Ｍａｔ、Ｒｉａｌ、。

ｊｕ旧、　１０−１９．　（１９８７）パスコウスキー（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ）、　Ｊ、ＥＭＢ口Ｊ、　７．４０２１−４０２６゜（１９８ｇ） ビアボルト（Ｐｅｅｒｂｏｌｔｅ）、　Ｒ，等　Ｐｌａｎｔ、　Ｍｏｌ、Ｂｉｏ ｌ、、　５゜２３４−２４６．　（１９８５） ペラルタ（Ｐｅｒａｌｔａ）、Ｅ、Ｇ、　等　ＥＭＢ口Ｊ、、５．　１１３７− １１４２゜ベラルタ（Ｐｅｒａｌｔａ）、　Ｅ、Ｇ、等Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

８２、　５１１２−５１１６．　（１９８５）プラット（Ｐｌａｔｔ、　Ｓ、Ｇ 、等　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｏ＋、、　１６２゜５２９−５３５ ．　（１９８７） サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）、　Ｐ、等Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ。

７４８１２、　５４６３−５４６７、（１９７７）シュレイヤー（Ｓｃｈｒｅｉ ｅｒ）、　Ｐ、Ｈ，等　ＥＭＢ口Ｊ、、４．２５−３２゜シード（Ｓｅｅｄ）、 　Ｂ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　８．２４２７−２４４５．　 （１９８３）セン（Ｓｅｎ）、　Ｐ、等　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　２５ ７３−２５８０．　（１９８９）シａ　−（Ｓｈａｗ）、　Ｃ，Ｈ，等　Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１２゜６０３１−６０４１．　（１９８４ ） シアマン（Ｓｈｅｅｒｒｎａｎ）、　Ｓ、等Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒ ｔｓ、　７．１３−１６゜シリト（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ）、Ｒ，口、　等　Ｂｉｏ ／Ｔｅｃｈｎｏ１ｇＹ、３．　１０９９−１１０２゜スライトン（Ｓｌｉｇｈｔ ｏＩｌｌ）、　Ｊ、Ｌ、等　ＥＭＢＯＪ、、４．　３０６９−３０７７゜スミシ ーズ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ）、　Ｏ，等　Ｎａｔｕｒｅ、　３１７．　２３０−２ ３４゜＜１９８５＞ ソング（Ｓｏｎｇ）、　Ｋ−Ｙ等Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、口 Ｓ八、　８４゜６８２０−６８２４．　（１９８７） スタッチェル（Ｓｔａｃｈｅｌ）、　Ｓ、　Ｅ、等　ＥＭＢＯＪ、　６．　８５ ７−８６３゜ウリアン（Ｌｌｌｉａｎ）、　Ｅ、Ｃ，等Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ １ｌｕｌａｒ　ａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４．　 ９５１−９５４．　（１９８８）ビーン（Ｖｅｅｎ）、　Ｒ，Ｊ、Ｎ、ヴアン（ ｖａｎ）、等Ｔｈｅｓｉｓ　：Ｓｔａｔｅｇｉｅｓ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　 ｉｎ　ｔｈｅｉｒ　１ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｐｌａｎｔｓ　；Ａｎ ａｌｏｇｉｅｓ　ａｎｄ　５ｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ、、　７９−９１．　 （ライデン、オランダ。

ウオールロス（Ｗａａｌｒｏｔｈ）、　Ｍ、等Ｍｏ１．Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、 、　２０２．６−１５゜ソング（Ｈａｎｇ）、　Ｋ、等Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇ ｅｎｅｔ−、２１０，２３６−３４６，（１９８７）ウィルミチ＋−（Ｉｌｉｌ ｌｍｉｔｚｅｒ）、　Ｌ、等　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、　１８６゜１６ −２２．　（１９８２） ライルミチャ−（Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ）、　Ｌ、等　ＥＭＢＯＪ、、１゜１３ ９−１４６．　（１９８２） ウィルツ（Ｗｉｒｔｚ）、　ＩＪ、等ＤＮＡ、　６．　２４５−２５５．（１９ ８７）ヤダ７　（Ｙａｄａｖ）、　Ｎ、Ｓ、等Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ、　７９゜６３２２−６３２６．　（１９８２） ヤング（Ｙｏｕｎｇ）、　Ｃ，Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１７０．３３６ ７−３３７４．　（１９８８＞センブリスキー（Ｚｅａ＋ｂｒｙｓｋｉ）、　Ｐ 、等Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ａｐｐ、　Ｇｅｎｅｔ、　１゜３６１−３７０．　（１９ ８２） センブリスキー（Ｚｅｍｂｒｙｓｋｉ）、　Ｐ、等　ＥＭＢＯＪ、２．　２１４ ３−２１５０゜ジンマー（Ｚｉｍｍｅｒ）、　Ａ、ガス（Ｇｕｓｓ）、　Ｎａｔ ｕｒｅ、　３３８．１５０−１５３゜（１９ｇ９） Ｆｉｇ、　１ Ｆｉｇ、　２ Ｆｉｇ、　３ ＢｓｔＥＩＩ Ｆｉｇ、　７ オーバードライブ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ターゲット部位における相同組換えにより植物宿主のゲノム中にそれ自身の 一部を組込み得る組換えＤＮＡで、以下に示す一般的構造：を有する組換えＤＮ Ａ。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （図中ボックス１および７および連結線はＤＮＡトランスファープロセスにおけ るＴ−ＤＮＡボーダーとして機能し得るＤＮＡ配列を表わす。ボックス１または ７のいずれかが存在しない場合はあるが双方とも存在しないことはない。ボック ス３はターゲット部位の内側のＤＮＡ配列と十分に相同的でありかつ相同組換え を行うのに十分な長さを有しているＤＮＡ配列を表わす。ボックス４はターゲッ ト部位内の配列とは相同的でないＤＮＡ配列を表わし、またボックスを継ぐ線は いくつかの塩基対または塩基対のないことを表わしている。） ２．請求項１記載の組換えＤＮＡで、ボックス１、３および７は請求項１で定義 されたものであり、ボックス４はターゲット部位における対応配列との相同組換 えを起こすのに十分な相同性を有し、それにより１つ以上の変異を含むそれ自身 の一部を組込み得るＤＮＡ配列を含み、およびボックスを継ぐ線はいくつかの塩 基対または塩基対のないことを表わしている組換えＤＮＡ。 ３．請求項１または２記載の組換えＤＮＡで、以下の一般的構造を有する組換え ＤＮＡ。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （図中ボックス１．３および７、および連結する線は前記請求項で定義したもの である。ボックス４はターゲット部位における配列に相同的ではないＤＮＡ配列 を表わす。ボックス５は宿主中で機能的であり、ポジティブ選択遺伝子を含む発 現カセットを表わす。ボックスＥは植物ゲノムにおいてターゲット部位の隣りま たは近傍に存在するＤＮＡ配列に十分相同的であり、かつ相同組換えを起こすの に十分な長さを有するＤＮＡ配列を含んでいる。）４．請求項１または２記載の 組換えＤＮＡで、以下の一般的構造を有する組換えＤＮＡ。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （図中、ボックス１，３および７は請求項１で定義したものである。ボックス２ または６は宿主中で機能的であり、ネガティブ選択遺伝子を含む発現カセットを 表わす。ボックス２または６はいずれかが存在しないことはあるが両方が存在し ないということはない。） ５．請求項４記載の組換えＤＮＡで、以下の一般的構造を有する組換えＤＮＡ。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （図中、ボックス１〜７およびＥ、および連結線は前記請求項で定義されたもの である。ボックスＥは相同組換えを起こすのに十分な相同性および長さを有する ＤＮＡ配列を含む。）６．請求項１または２記載の組換えＤＮＡで、以下の一般 的構造を有する組換えＤＮＡ。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （図中、ボックス１〜７およびＥ、および連結線は前記請求項で定義したもので ある。） ７．請求項４〜６のいずれか１項記載の組換えＤＮＡで、ボックス２およびボッ クス６は望ましくない組換えの後ボックス３および４の発現を阻害するスタッフ ァー配列として働く、ターゲット部位と相同的でないＤＮＡ配列を表わし、ボッ クス２または６のいずれかが存在しないことはあるが両方が存在しないことはな く、かつボックス５は存在しないこともある組換えＤＮＡ。 ８．ターゲット部位における相同組換えにより植物宿主のゲノム内にそれ自身の 一部を組込み得る粗換えＤＮＡで、以下の一般的構造を有する粗換えＤＮＡ。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （図中、ボックス１および７はこのＤＮＡトランスファープロセス中Ｔ−ＤＮＡ ボーダーとして機能し得るＤＮＡ配列を表わす。 ボックス１または７はいずれかが存在しないことはあるが両方が存在しないこと はない。ボックス３および４の両方はターゲット部位における相同組換えを起こ すために十分な相同性および長さを有するＤＮＡ配列を表わす。ボックス内のＤ ＮＡ配列はターゲット部位と同じ５′から３′への配向を有するがボックス自体 の順番はターゲット部位の状態から変化しており、相同組換え後ターゲット部位 にボックスｉの挿入が起こっている。ボックスを継ぐ線はいくつかの塩基対また は塩基対の無いことを表わしている。）９．請求項８記載の組換えＤＮＡで、以 下の一般的構造を有する組換えＤＮＡ。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （図中、ボックス１，３，４，７およびｉ、および連結線は請求項７で定義され たものである。ボックス２または６は宿主中で機能的であり、ネガティブ選択遺 伝子を含む発現カセットを表わしている。ボックス２または６は存在しないこと はあるが両方が存在しないことはない。） １０．請求項４乃至６、または９のいずれか１項記載の組換えＤＮＡで、ネガテ ィブ選択遺伝子がａｕｘ−２遺伝子、チトクロムｐ４５０遺伝子、Ａｄｈ遺伝子 およびＴＫ−遺伝子からなる群から選はれる組換えＤＮＡ。 １１．請求項１乃至１１のいずれか１項記載の組換えＤＮＡで、ポジティブ選択 遺伝子がＮＰＴＩＩ遺伝子、ＨＰＴ遺伝子およびＡＬＳ遺伝子からなる群から選 はれる組換えＤＮＡ。 １２．請求項１乃至１１のいずれか１項記載の構築物を含む、バクテリアのクロ ーニングに適したベクター。 １３．請求項１２記載のベクターで、さらに（イ）宿主中でのベクターの複製を 可能にする複製オリジン、（ロ）トランスホームした宿主の選択を可能にする機 能性マーカー遺伝子、 （ハ）ベクターの操作を容易にするポリリンカー部位、を含むベクター。 １４．請求項１２または１３記載のベクターを含むバクテリア。 １５．請求項１乃至１１のいずれか１項記載のＴ−ＤＮＡ構築物を含む植物トラ ンスホーメーションベクター。 １６．バイナリーベクターである請求項１５記載の植物トランスホーメーション ベクター。 １７．請求項１５または１６記載の植物トランスホーメーションベクターを含む アグロバクテワアまたはこれに関連するバクテリア。 １８．相同組換えによりゲノムの選択されたターゲット部位に所定の変異を含む 植物細胞の調製法で、下記ａ）およびｂ）のステップを含む方法。 ａ）トランスホーメーション条件下植物プロトプラストまたは植物部分を請求項 １乃至１１のいずれか１項記載の構築物を含む植物トランスホーメーションベク ターを含むアグロバクテリアまたはその関連種と共培養する、 ｂ）従来法を用いてＤＮＡレベルでトランスホームした細胞をスクリーニングす ることにより目的の組換えを起こした細胞を同定する。 １９．相同組換えによりゲノムの選択されたターゲット部位に所定の変異を含む 植物細胞の調製法で、下記ａ）およびｃ）のステップを含む方法。 ａ）トランスホーメーション条件下、植物プロトプラストまたは植物部分を請求 項４、５、６または９のいずれか１項記載の構築物を含む植物トランスホーメー ションベクターを含むアグロバクテリアまたはそれの関連種と共培養する、ｂ） 選択条件下ネガティブマーカー遺伝子のいずれも発現しない細胞を選択または濃 縮する、 ｃ）従来法を用い、ＤＮＡレベルでトランスホームした細胞をスクリーニングす ることにより望ましい組換えを起こした細胞を同定する。 ２０．請求項１９記載の方法で、 ａ）前記構築物がポジティブ選択遺伝子を含む請求項３または６記載の構築物で あるステップａ）、 ｂ）選択条件下前記構築物内に存在するネガティブマーカー遺伝子のいずれも発 現せず、かつポジティブ選択遺伝子を発現する細胞を選択または濃縮するステッ プｂ）、以上ａ）およびｂ）のステップを含む方法。 ２１．相同組換えによりゲノムの選択されたターゲット部位に所定の変異を含む 植物細胞の調製法で、下記ａ）およびＣ）のステップを含む方法。 ａ）トランスホーメーション条件下植物プロトプラストまたは植物部分を、適当 な相同組換え後選択またはスクリーニング可能なＤＮＡ配列をボックス３および ボックス４が含む請求項７または８記載の構築物を含む植物トランスホーメーシ ョンベクターを有するアグロバクテリアまたはその関連種と共培養する、ｂ）ボ ックス３および４を発現するが選択条件下ネガティブ選択遺伝子を発現しない細 胞を選択または濃縮する、ｃ）従来法を用い、ＤＮＡレベルでトランスホームし た細胞をスクリーニングすることにより望ましい組換えを起こした細胞を同定す る。 ２２．請求項１８乃至２１記載の方法で、ステップａ）の代りに以下のステップ を含み、その後にステップｂ）を行う方法。 イ）請求項１乃至１１のいずれか１項記載の組換えＤＮＡを含み、バクテリア内 で複製可能なベクターでバクテリアをトランスホームする、 ロ）前記バクテリアを該バクテリアの増殖および前記ベクターの複製が可能な培 地中で培養する、 ハ）前記バクテリア懸濁液から前記ベクターを単離する、ニ）直接的ＤＮＡトラ ンスホーメーション法を用いて植物を前記ベクターまたはそのベクターの一部で トランスホームする。 ２３．バクテリア懸濁液から単離した前記ベクターを結合条件下ＤＮＡ結合たん ぱく質とインキュベートする請求項１９記載の方法。 ２４．請求項１８乃至２３記載の方法を使用して得られる植物細胞。 ２５．請求項２４記載の植物細胞の再生で得られる植物部分。 ２６．本来請求項２４または２５記載の植物細胞または植物部分の再生で得られ る植物、植物部分、植物細胞、種子および有性または無性増殖で得られるそれら の子孫を含む植物。 ２７．前記植物がナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｃ）、マメ科（Ｌｅｇｕｍｒｎｏ ｓａｅ）、セリ科（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ）、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅ ｒａｅ）、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、ネギ（Ａｌｌｉａｃｅａｅ）、ブ ドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇａｃｅａｅ）、ア カザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｃ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）、ラ ン科（Ｏｒｃｈｉｄｅａｃｅａｅ）、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）、コーヒー （Ｃｏｆｆｅａ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）およびイネ科（Ｇｒ ａｍｉｎｃａｒ）からなる群から選はれる請求項２２記載の植物。