JPH01160489A - 植物ゲノム内への遺伝子の指示された組込みを可能にする組換えｄｎａ分子 - Google Patents
植物ゲノム内への遺伝子の指示された組込みを可能にする組換えｄｎａ分子Info
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- JPH01160489A JPH01160489A JP63289941A JP28994188A JPH01160489A JP H01160489 A JPH01160489 A JP H01160489A JP 63289941 A JP63289941 A JP 63289941A JP 28994188 A JP28994188 A JP 28994188A JP H01160489 A JPH01160489 A JP H01160489A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、植物ゲノム内に相同ＤＮＡ領域番有する自然
にまたは人為的に改変された遺伝子、遺伝子断片または
その他の有用なＤＮＡ配列の相同組換え（ｈｏｍｏｌｏ
ｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ）に基づいて
、正確に規定された部位で植物のゲノム内に遺伝物質の
指示された組込み（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ−ｔｅｇｒ
ａｔｉｏｎ ）およびこのように植物ゲノム内での遺伝
子の特異的に指示された予測できる改変〔その場での改
変（ｉｎ ５ｉｔｕ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ）
］を可能にする新規な方法に関する。さらに本発明の方
法は、植物の全体のゲノム内の個々の遺伝子の機能の制
御された固定を可能にする。本発明はまた、本方法に従
って得られる遺伝子導入植物体およびそれらの後代並び
にそれらの植物産生物にも関する。
にまたは人為的に改変された遺伝子、遺伝子断片または
その他の有用なＤＮＡ配列の相同組換え（ｈｏｍｏｌｏ
ｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ）に基づいて
、正確に規定された部位で植物のゲノム内に遺伝物質の
指示された組込み（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ−ｔｅｇｒ
ａｔｉｏｎ ）およびこのように植物ゲノム内での遺伝
子の特異的に指示された予測できる改変〔その場での改
変（ｉｎ ５ｉｔｕ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ）
］を可能にする新規な方法に関する。さらに本発明の方
法は、植物の全体のゲノム内の個々の遺伝子の機能の制
御された固定を可能にする。本発明はまた、本方法に従
って得られる遺伝子導入植物体およびそれらの後代並び
にそれらの植物産生物にも関する。
植物の精密な遺伝子操作は、植物細胞のゲノム内への新
しい遺伝子の特異的に指示された取込み（１ｎｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ ）による植物ゲノムの正確で予測でき
る改変を必要とし、この植物細胞は次いで細胞、組織も
しくはカルス培養体または完全な植物体に再生され、こ
のようにして次いで新規な後代を有する新規な植物体を
生ずる。
しい遺伝子の特異的に指示された取込み（１ｎｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ ）による植物ゲノムの正確で予測でき
る改変を必要とし、この植物細胞は次いで細胞、組織も
しくはカルス培養体または完全な植物体に再生され、こ
のようにして次いで新規な後代を有する新規な植物体を
生ずる。
植物の組換えＤＮＡ技術の分野における徹底的な研究は
、近年著しい進歩を遂げた。このことは、一連の遺伝子
導入法が利用可能になり、そして既に多くの研究所にお
いて普通に使用されている遺伝子導入植物体の製造Ｋ特
に当てはまる。
、近年著しい進歩を遂げた。このことは、一連の遺伝子
導入法が利用可能になり、そして既に多くの研究所にお
いて普通に使用されている遺伝子導入植物体の製造Ｋ特
に当てはまる。
最も十分に確立さ五、そして最も頻繁に使用される遺伝
子導入法の一つは、疑いなくアグロバクテリウＡ （Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ） 形質転換系である。
子導入法の一つは、疑いなくアグロバクテリウＡ （Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ） 形質転換系である。
アクロバクテリウム細胞は、それらのＴｉプラスミド上
に大きなＤＮＡ断片、いわゆるＴ−ＤＮＡ領域を有し、
このＴ−ＤＮＡ領域は植物細胞が形質転換される時に植
物ゲノム内に組込まれる。
に大きなＤＮＡ断片、いわゆるＴ−ＤＮＡ領域を有し、
このＴ−ＤＮＡ領域は植物細胞が形質転換される時に植
物ゲノム内に組込まれる。
この天然の遺伝子導入系は、種々の改変を行った後に、
植物の人工的な形質転換のための遺伝子−ベクターとし
て利用され得る。
植物の人工的な形質転換のための遺伝子−ベクターとし
て利用され得る。
さらに、植物体内に遺伝物質を挿入するためのその他の
有効な方法もまた存在し、これらはその大部分がより最
近の発見に基づいている。
有効な方法もまた存在し、これらはその大部分がより最
近の発見に基づいている。
これらは、例えばプロトプラスト内への直接遺伝子導入
、ＤＮＡを含有する膜で包まれた小胞、いわゆるリポソ
ームとプロトプラスト膜との融合、プロトプラストの核
内マイクロインジェクシ冒ンおよび可能性としては花の
***組織内への遺伝物質のマクロインジェクシ冒ンを包
含する。
、ＤＮＡを含有する膜で包まれた小胞、いわゆるリポソ
ームとプロトプラスト膜との融合、プロトプラストの核
内マイクロインジェクシ冒ンおよび可能性としては花の
***組織内への遺伝物質のマクロインジェクシ冒ンを包
含する。
上でよりしりかりと特色づけられた遺伝子導入法は、植
物細胞内に挿入され、そして植物ゲノム内に組込まれた
遺伝物質を実際に生ずるけれども、それらの方法は、植
物の核ゲノム内への挿入された遺伝物質の取込みが制御
されておらず、そして従って偶然に起こるという重大な
欠点を有し、その結果外米ＤＮＡのゲノムの位置を予め
決めることができない〔ボトリクス アイ＋ （Ｐｏ
ｔｒｙｋｕｓ １． ）等、１９８５年：ウォールロス
エム、 （Ｗａｌｌｒｏｔｈ Ｍ、 ）等、１９８６年
；アンプロス ビー、エフ、 （Ａｍｂｒｏｓ Ｐ、
Ｆ、 ）等１９８６年〕。
物細胞内に挿入され、そして植物ゲノム内に組込まれた
遺伝物質を実際に生ずるけれども、それらの方法は、植
物の核ゲノム内への挿入された遺伝物質の取込みが制御
されておらず、そして従って偶然に起こるという重大な
欠点を有し、その結果外米ＤＮＡのゲノムの位置を予め
決めることができない〔ボトリクス アイ＋ （Ｐｏ
ｔｒｙｋｕｓ １． ）等、１９８５年：ウォールロス
エム、 （Ｗａｌｌｒｏｔｈ Ｍ、 ）等、１９８６年
；アンプロス ビー、エフ、 （Ａｍｂｒｏｓ Ｐ、
Ｆ、 ）等１９８６年〕。
植物ゲノム内の組込み部位は、組込まれた外来遺伝子の
発現の効率および強さに関する決定的な影′響を有する
こともまた公知である。例えば、ある組込まれた外来遺
伝子の発現速度は、お互いに独立して製造された２種の
異なる植物体において、そのゲノム内の組込み部位に応
じて相当に異なる。
発現の効率および強さに関する決定的な影′響を有する
こともまた公知である。例えば、ある組込まれた外来遺
伝子の発現速度は、お互いに独立して製造された２種の
異なる植物体において、そのゲノム内の組込み部位に応
じて相当に異なる。
組込み部位に関する同様な依存関係は、遺伝子制御との
関係において、特に誘導および／またはサプレッサーシ
グナルに対する組込まれた外来遺伝子の反応においても
見られた。この場合においても、お互いに独立して製造
された遺伝子導入植物体との間には明らかな相違がある
。
関係において、特に誘導および／またはサプレッサーシ
グナルに対する組込まれた外来遺伝子の反応においても
見られた。この場合においても、お互いに独立して製造
された遺伝子導入植物体との間には明らかな相違がある
。
組込み部位に関するこの依存関係は、例えば植物ゲノム
内での遺伝子のその場での改変を行うことにより克服す
ることができる。そのような特定の標的遺伝子のその場
での改変の構成内で、遺伝子は植物ゲノム内の天然の遺
伝部位にそのまま残り、その結果最適な発現および制御
は当該標的遺伝子に対して確実に行われる。
内での遺伝子のその場での改変を行うことにより克服す
ることができる。そのような特定の標的遺伝子のその場
での改変の構成内で、遺伝子は植物ゲノム内の天然の遺
伝部位にそのまま残り、その結果最適な発現および制御
は当該標的遺伝子に対して確実に行われる。
しかしながら、本発明がなされる時点まで、植物ゲノム
内での遺伝子のその場での改変を可能にするであろう方
法は知られていなかった。
内での遺伝子のその場での改変を可能にするであろう方
法は知られていなかった。
植物細胞内の挿入された外来遺伝子の制御および発現の
効率を高めるために、植物遺伝子工学の分野においてな
されている一般的な努力に関連して、植物ゲノム内の規
定された予め決定できる部位に外米遺伝子の特異的に指
示された組込みを可能にする方法および従って例えば植
物遺伝子のその場での改変の発見は、それ故に緊急の課
題とみなされなければならない。
効率を高めるために、植物遺伝子工学の分野においてな
されている一般的な努力に関連して、植物ゲノム内の規
定された予め決定できる部位に外米遺伝子の特異的に指
示された組込みを可能にする方法および従って例えば植
物遺伝子のその場での改変の発見は、それ故に緊急の課
題とみなされなければならない。
酵母、その他の少数の菌類およびその変形菌ジクチオス
テリ、ラム ジスコイデウム（Ｄｉｃｔｙｏ−８ｔｅｌ
ｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ ）において〔ヒ／ネ
ン エイチー （Ｈｉｎｎｅｎ Ｈ，）等、１９７８年
；ミラービー。エル、（Ｍｉｌｌｅｒ Ｂ−Ｌ−）等、
１９８７年：デロザンネ ニー、およびスビエディッヒ
ニス−ｘ ＋−（Ｄｅ Ｌｏｚａｎｎｅ Ａ−ａｎｄ
５ｐｕｄｉｃｈ ５−Ａ−）。
テリ、ラム ジスコイデウム（Ｄｉｃｔｙｏ−８ｔｅｌ
ｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ ）において〔ヒ／ネ
ン エイチー （Ｈｉｎｎｅｎ Ｈ，）等、１９７８年
；ミラービー。エル、（Ｍｉｌｌｅｒ Ｂ−Ｌ−）等、
１９８７年：デロザンネ ニー、およびスビエディッヒ
ニス−ｘ ＋−（Ｄｅ Ｌｏｚａｎｎｅ Ａ−ａｎｄ
５ｐｕｄｉｃｈ ５−Ａ−）。
１９８７年〕、形質転換ＤＮＡの自然に起こる非常に効
率の良い相同組換えを、形質転換および改変された遺伝
子の天然のゲノムの周囲を研究するために、およびさら
にゲノム内での遺伝子の直接改変のために使用すること
が可能となった。
率の良い相同組換えを、形質転換および改変された遺伝
子の天然のゲノムの周囲を研究するために、およびさら
にゲノム内での遺伝子の直接改変のために使用すること
が可能となった。
しかしながら、関係におけるより高度な複雑さのために
、この方法は、分類学上より上位の群の生物に用いるこ
とはできない。
、この方法は、分類学上より上位の群の生物に用いるこ
とはできない。
哺乳類に、おいて、例えば上記した相同組換えに加えて
、ゲノム内への外来ＤＮＡの非常に効率の良い非相同ま
たは変則組換えもあり、これはゲノム内の特定の望まし
い部位での外来ＤＮＡの制御された取込みを極端に困難
にしている。
、ゲノム内への外来ＤＮＡの非常に効率の良い非相同ま
たは変則組換えもあり、これはゲノム内の特定の望まし
い部位での外来ＤＮＡの制御された取込みを極端に困難
にしている。
また、植物において、植物ゲノムの領域と相同性が無い
ＤＮＡ分子で達成され得る高速度の形質転換が得られる
ので〔シルリット アール。
ＤＮＡ分子で達成され得る高速度の形質転換が得られる
ので〔シルリット アール。
（５ｈｉｌｌｉｔｏ Ｒ，）等、１９８５年：ネグルチ
ウ アイ、 （Ｎｅｇｒｔｉｕ Ｌ ）等、１９８７年
〕、変則非相同組換えの比率も非常に高いことが容易に
推測される。
ウ アイ、 （Ｎｅｇｒｔｉｕ Ｌ ）等、１９８７年
〕、変則非相同組換えの比率も非常に高いことが容易に
推測される。
実際、相同組換えが植物体内に存在するか否か、そして
もし存在するならばこれがどのくらい効果的に作動する
かけ、本発明がなされるまで全（不明だった。
もし存在するならばこれがどのくらい効果的に作動する
かけ、本発明がなされるまで全（不明だった。
結果として、それ故に植物ゲノム内の正確に規定された
部位に制御された方法で遺伝物質を組込むことも、従来
不可能だった。
部位に制御された方法で遺伝物質を組込むことも、従来
不可能だった。
驚くべきことに、この問題点は本発明の範囲内で簡単な
手段により今解決された。
手段により今解決された。
本発明は、相同組換えによって、所望の予め決めること
ができる部位において、制御された方法で植物ゲノム内
に遺伝子、遺伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ配列
を組込むことからなる遺伝子導入植物体の製造方法に関
する。
ができる部位において、制御された方法で植物ゲノム内
に遺伝子、遺伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ配列
を組込むことからなる遺伝子導入植物体の製造方法に関
する。
本発明の範囲内で「植物ゲノム」という語の定義は、核
ゲノムに限定されることなく、ミトコンドリアおよびプ
ラスチド内に存在するゲノムをも包含し、それらはまた
本発明の方法によって制御された改変に適用もできる。
ゲノムに限定されることなく、ミトコンドリアおよびプ
ラスチド内に存在するゲノムをも包含し、それらはまた
本発明の方法によって制御された改変に適用もできる。
従って、本発明の範囲内で、植物ゲノム内の特定の標的
遺伝子を制御されそして効率的な方法によりその場で改
変すること（制御された突然変異誘発）が初めて可能と
なった。
遺伝子を制御されそして効率的な方法によりその場で改
変すること（制御された突然変異誘発）が初めて可能と
なった。
まず最初に所望の遺伝子を分離し、次いで試験管内で改
変し、そして最後にゲノム内に再び組込むという植物固
有の遺伝子を改変する従来性われていた方法に比べ、遺
伝子のその場での改変は、明確な利点を有する。
変し、そして最後にゲノム内に再び組込むという植物固
有の遺伝子を改変する従来性われていた方法に比べ、遺
伝子のその場での改変は、明確な利点を有する。
前もって分離され、そして試験管内で改変された遺伝子
の植物ゲノム内への再組込みは完全にランダムであり、
その結果組込まれた遺伝子の制御および／または発現に
おける困難が組込み部位に応じて生じ得る。本発明の範
囲内で今最初に可能となったその場での改変では、遺伝
子は対照的に植物ゲノム内の天然の遺伝部位に留まり、
従って当該標的遺伝子の最適な制御および発現が可能と
なる。
の植物ゲノム内への再組込みは完全にランダムであり、
その結果組込まれた遺伝子の制御および／または発現に
おける困難が組込み部位に応じて生じ得る。本発明の範
囲内で今最初に可能となったその場での改変では、遺伝
子は対照的に植物ゲノム内の天然の遺伝部位に留まり、
従って当該標的遺伝子の最適な制御および発現が可能と
なる。
植物固有の遺伝子の特異的に指示され、そしてそれ故に
非常に効率的なその場での改変（制御された突然変異誘
発）に加えて、本発明の方法は、とりわけ一連の可能な
用途、例えば発現速度が大きいことが公知である領域に
付加的な遺伝子コピーの取込みおよび望ましくない遺伝
子の脱離およびその除去を開発する。
非常に効率的なその場での改変（制御された突然変異誘
発）に加えて、本発明の方法は、とりわけ一連の可能な
用途、例えば発現速度が大きいことが公知である領域に
付加的な遺伝子コピーの取込みおよび望ましくない遺伝
子の脱離およびその除去を開発する。
特に、本発明によって、例えば育種および／または商品
的な観点から望ましくない特性を植物に与える優性また
は半優性対立遺伝子を、有用で望ましい特性を有する劣
性対立遺伝子に置換することが可能である。
的な観点から望ましくない特性を植物に与える優性また
は半優性対立遺伝子を、有用で望ましい特性を有する劣
性対立遺伝子に置換することが可能である。
本発明の方法のもう一つの明確な可能性のある用途は、
公知方法を用いて植物ゲノム内に人為的に予め組込まれ
た遺伝子もしくは遺伝子断片またはその他の有用なＤＮ
Ａ配列での相同組換えにより、植物ゲノム内への所望の
遺伝子の指示された組込みにおいてである。
公知方法を用いて植物ゲノム内に人為的に予め組込まれ
た遺伝子もしくは遺伝子断片またはその他の有用なＤＮ
Ａ配列での相同組換えにより、植物ゲノム内への所望の
遺伝子の指示された組込みにおいてである。
最初に組込まれた遺伝子もしくは遺伝子断片、または最
初に組込まれたＤＮＡ配列は、それによって有利な特性
、例えば取込まれた遺伝子の良好な発現または制御を示
す植物ゲノム内の領域を捜すことを可能にするプローブ
分子（ｐｒｏｂｅｍｏｌｅｃｕｌｅ ）として使用する
こともできる。
初に組込まれたＤＮＡ配列は、それによって有利な特性
、例えば取込まれた遺伝子の良好な発現または制御を示
す植物ゲノム内の領域を捜すことを可能にするプローブ
分子（ｐｒｏｂｅｍｏｌｅｃｕｌｅ ）として使用する
こともできる。
本発明の方法によって、望ましい遺伝子もしくは遺伝子
断片またはその他の有用なＤＮＡ配列／／ｉ次いで、非
常に簡単に、そして制御された方法で、相同組換えによ
り、遺伝子発現または制御されるべき能力の観点から好
ましい植物ゲノム内のそのような領域内に導かれ得る。
断片またはその他の有用なＤＮＡ配列／／ｉ次いで、非
常に簡単に、そして制御された方法で、相同組換えによ
り、遺伝子発現または制御されるべき能力の観点から好
ましい植物ゲノム内のそのような領域内に導かれ得る。
容易に選択可能な遺伝子もしくは遺伝子断片またはその
他の有用なＤＮＡ配列、例えば形質転換された細胞また
は植物体における選択可能な表現型マーカー、特に抗生
物質またはある種の除草剤に対する耐性を生ずる遺伝子
が、プローブ分子として使用するのに特に好ましい。
他の有用なＤＮＡ配列、例えば形質転換された細胞また
は植物体における選択可能な表現型マーカー、特に抗生
物質またはある種の除草剤に対する耐性を生ずる遺伝子
が、プローブ分子として使用するのに特に好ましい。
遺伝子もしくは遺伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ
配列を、公知の方法を用いて人為的に植物ゲノム内に予
め組込まれた遺伝子または遺伝子断片に結合することは
同様の方法で可能である。
配列を、公知の方法を用いて人為的に植物ゲノム内に予
め組込まれた遺伝子または遺伝子断片に結合することは
同様の方法で可能である。
例えば、昆虫耐性のような望ましい特性をコードする遺
伝子は、標的植物のゲノム内に人為的に予め組込まれた
例えば除草剤耐性をコードする第二の遺伝子に結合され
得る。
伝子は、標的植物のゲノム内に人為的に予め組込まれた
例えば除草剤耐性をコードする第二の遺伝子に結合され
得る。
しかしながら、本発明の方法は、遺伝子もしくはその他
のＤＮＡ配列と植物ゲノム内に予め人為的に組込まれた
遺伝子もしくはＤＮＡ配列との交換もしくは結合に限定
されるものではない。
のＤＮＡ配列と植物ゲノム内に予め人為的に組込まれた
遺伝子もしくはＤＮＡ配列との交換もしくは結合に限定
されるものではない。
明らかに、本発明の方法により、所望の遺伝子または遺
伝子断片およびその他の有用なＤＮＡ配列を、植物ゲノ
ム内に既に自然に存在する遺伝子と交換すること、また
はこれらに結合することは、同様に可能である。
伝子断片およびその他の有用なＤＮＡ配列を、植物ゲノ
ム内に既に自然に存在する遺伝子と交換すること、また
はこれらに結合することは、同様に可能である。
例えば、育種のために有用で望ましい遺伝子は、その特
徴的な表現型マーカーのために後に続く世代において容
易に追跡され得るマーカー遺伝子に結合され得る。
徴的な表現型マーカーのために後に続く世代において容
易に追跡され得るマーカー遺伝子に結合され得る。
このように、表現型マーカー遺伝子により適応させるこ
とにより代々の世代を介して望ましい遺伝子を育糧家が
追跡することは非常に容易である。
とにより代々の世代を介して望ましい遺伝子を育糧家が
追跡することは非常に容易である。
それ故に本発明はまた、それらの特異的な構築のために
、相同組換えによって、新規で望ましい特性をコードし
得る遺伝子またはＤＮＡ配列を、植物ゲノム内の規定さ
れた部位に制御された方法で組込むことができる組換え
ＤＮＡ分子にも関する。
、相同組換えによって、新規で望ましい特性をコードし
得る遺伝子またはＤＮＡ配列を、植物ゲノム内の規定さ
れた部位に制御された方法で組込むことができる組換え
ＤＮＡ分子にも関する。
本発明は前記組換えＤＮＡ分子で形質転換された新規お
よび／または改良特性を有する遺伝子導入植物体も包含
する。
よび／または改良特性を有する遺伝子導入植物体も包含
する。
本発明はさらに、前記組換えＤＮＡ分子を含有する形質
転換された植物細胞から再生される遺伝子導入植物体お
よびその種子、そしてさらには該遺伝子導入植物体の後
代並びにそれらの突然変異体および変種に関する。
転換された植物細胞から再生される遺伝子導入植物体お
よびその種子、そしてさらには該遺伝子導入植物体の後
代並びにそれらの突然変異体および変種に関する。
本発明は同様に、キメラ遺伝子構築物そしてクローニン
グビヒクル（ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｈｉｃｌｅ ）およ
び宿主生物並びに植物に対する所望の特性の制御された
導入方法をも包含する。
グビヒクル（ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｈｉｃｌｅ ）およ
び宿主生物並びに植物に対する所望の特性の制御された
導入方法をも包含する。
以下の記載において、組換えＤＮＡ技術および植物遺伝
学において慣用である多くの表現が用いられている。
学において慣用である多くの表現が用いられている。
発明の詳細な説明および特許請求の範囲、およびこれら
の表現にあてられた範囲の明確な、そして首尾一貫した
理解を確実にするために、以下に定義を与える： 非相同遺伝子またはＤＮＡ ニ一種またはそれ以上の特
定の生成物をコードするか、または生物学的機能を遂行
し、そして該遺伝子が挿入される種以外の種から生じる
ＤＮＡ配列；該ＤＮＡ配列は外来遺伝子または外来ＤＮ
Ａとも記載される。
の表現にあてられた範囲の明確な、そして首尾一貫した
理解を確実にするために、以下に定義を与える： 非相同遺伝子またはＤＮＡ ニ一種またはそれ以上の特
定の生成物をコードするか、または生物学的機能を遂行
し、そして該遺伝子が挿入される種以外の種から生じる
ＤＮＡ配列；該ＤＮＡ配列は外来遺伝子または外来ＤＮ
Ａとも記載される。
相同遺伝子またはＤＮＡ ニ一種またはそれ以上の特定
の生成物をコードするか、または生物学的機能を遂行し
、そして該遺伝子が挿入される種と同一な糧から生じる
ＤＮＡ配列。
の生成物をコードするか、または生物学的機能を遂行し
、そして該遺伝子が挿入される種と同一な糧から生じる
ＤＮＡ配列。
の特定の生成物をコードするか、または生物学的機能を
遂行し、そして合成されたＤＮＡ配列。
遂行し、そして合成されたＤＮＡ配列。
たけ非相同ＤＮＡ遺伝子配列の転写を確実に行わせるＤ
ＮＡ発現の制御配列であるが、前記遺伝子配列はそのよ
うなプロモーターと操作可能に結合されている。
ＮＡ発現の制御配列であるが、前記遺伝子配列はそのよ
うなプロモーターと操作可能に結合されている。
終結配列：転写工程の終了を信号で伝える転写単位の末
端の配列。
端の配列。
で形質転換されなかった宿主細胞において自然に観察さ
れるよりも明らかに高い程度まで（ＲＮＡまたはポリペ
プチドの形成量を測定して）、操作可能に結合された機
能遺伝子配列の遺伝子導入植物細胞内での発現を引き起
こし得る植物プロモーター。
れるよりも明らかに高い程度まで（ＲＮＡまたはポリペ
プチドの形成量を測定して）、操作可能に結合された機
能遺伝子配列の遺伝子導入植物細胞内での発現を引き起
こし得る植物プロモーター。
３′７５′非翻訳領域：ｍＲＮＡに転写されるけれども
ポリ“ペプチドに翻訳されないコード領域の上流または
下流のＤＮＡ領域。これらの領域は、制御配列、例えば
リポソーム結合部位（５つまたはポリアデニル化シグナ
ル（３つを含む。
ポリ“ペプチドに翻訳されないコード領域の上流または
下流のＤＮＡ領域。これらの領域は、制御配列、例えば
リポソーム結合部位（５つまたはポリアデニル化シグナ
ル（３つを含む。
植物材料：そのままでまたは培養液中で生育可能な植物
の部分、例えばプロトプラスト、細胞、カルス、組織、
胚、植物器官、芽、種子、そしてまたとりわけ全体の植
物体。
の部分、例えばプロトプラスト、細胞、カルス、組織、
胚、植物器官、芽、種子、そしてまたとりわけ全体の植
物体。
植物細胞二プロトプラストおよび細胞壁からなる、植物
の構造的および生理学的単位。
の構造的および生理学的単位。
プロトプラスト：植物細胞または組織から分離され、細
胞クローンまたは全体の植物体に再生する能力を有する
細胞壁のない”裸の″植物細胞。
胞クローンまたは全体の植物体に再生する能力を有する
細胞壁のない”裸の″植物細胞。
細胞クローン二連続的な有糸***により細胞□
から形成される遺伝的に同一な細胞の集合体。
植物組Ｗｔ：構造的および機能的単位の形態に組織化さ
れる植物細胞の群。
れる植物細胞の群。
植物器官：種子の組織、例えば根、茎、葉または胚から
構成される構造的および機能的単位。
構成される構造的および機能的単位。
ＤＮＡ発現ベクター二適当な宿主細胞内に挿入されたＤ
ＮＡの発現に必要な全てのシグナル配列を含有するクロ
ー二／グビヒクル、例えばプラスミドまたはバクテリオ
ファージ。
ＮＡの発現に必要な全てのシグナル配列を含有するクロ
ー二／グビヒクル、例えばプラスミドまたはバクテリオ
ファージ。
細胞への挿入を可能にする導入ビヒクル、例えばＴｉプ
ラスミドまたはウィルス。
ラスミドまたはウィルス。
相同組換え：相同な二重鎖ＤＮＡ分子間の断片の相互の
交換。
交換。
遺伝子導入植物体の突然変異体、変種
公知の方法、例えばＵＶ処理、突然変異誘発物質、その
他での処理を用いた自然発生的にまたは人為的に形成さ
れ、そして外来ＤＮＡでの形質転換により得られた遺伝
子導入出発植物体の本発明に必須の特徴および性質を依
然有する遺伝子導入植物体の誘導体。
他での処理を用いた自然発生的にまたは人為的に形成さ
れ、そして外来ＤＮＡでの形質転換により得られた遺伝
子導入出発植物体の本発明に必須の特徴および性質を依
然有する遺伝子導入植物体の誘導体。
植物ゲノム内の規定され予め決められた部位に制御され
た方法で遺伝物質が組込まれ、そして発現されることを
可能にする植物における方法を開発することが、今初め
て本発明の範囲内で可能となった。
た方法で遺伝物質が組込まれ、そして発現されることを
可能にする植物における方法を開発することが、今初め
て本発明の範囲内で可能となった。
本発明の方法は、植物ゲノム内にＤＮＡの相同領域を有
する天然のもしくは人為的に改変されたおよび／または
合成遺伝子もしくは遺伝子断片またはその他、の有用な
ＤＮＡ配列の相同組換えにより植物のゲノム内に遺伝物
質の指示された組込みに基づいており、前記ＤＮＡの相
同領域は、植物ゲノムの天然成分であってもまたは場合
によっては公知の方法を用いて予め植物ゲノム内に人為
的に取込まれたものであって良い。
する天然のもしくは人為的に改変されたおよび／または
合成遺伝子もしくは遺伝子断片またはその他、の有用な
ＤＮＡ配列の相同組換えにより植物のゲノム内に遺伝物
質の指示された組込みに基づいており、前記ＤＮＡの相
同領域は、植物ゲノムの天然成分であってもまたは場合
によっては公知の方法を用いて予め植物ゲノム内に人為
的に取込まれたものであって良い。
それらの特異的な構成のために、相同組換えによる標的
植物体のゲノム内への遺伝子の指示された組込みを可能
にする組換えＤＮＡ分子は、それ故に本発明の本質的な
部分を形成する。
植物体のゲノム内への遺伝子の指示された組込みを可能
にする組換えＤＮＡ分子は、それ故に本発明の本質的な
部分を形成する。
特に本発明は、植物ゲノム内の正確に規定された部位で
の、遺伝子、遺伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ配
列の特異的に指示された組込みを可能にし、そして植物
ゲノム内の相当するＤＮＡ領域に十分な相同性を有する
か、またはその様な十分な相同性を有するＤＮＡ配列が
配置されているＤＮＡを含有し、相同ＤＮＡ領域を含有
する植物細胞の形質転換に際して相同組換えにより植物
ゲノム内の正確に規定された部位に、組込まれるべき前
記ＤＮＡの特異的に指示された組込みを可能にすること
をコードする組換えＤＮＡ分子に関する。
の、遺伝子、遺伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ配
列の特異的に指示された組込みを可能にし、そして植物
ゲノム内の相当するＤＮＡ領域に十分な相同性を有する
か、またはその様な十分な相同性を有するＤＮＡ配列が
配置されているＤＮＡを含有し、相同ＤＮＡ領域を含有
する植物細胞の形質転換に際して相同組換えにより植物
ゲノム内の正確に規定された部位に、組込まれるべき前
記ＤＮＡの特異的に指示された組込みを可能にすること
をコードする組換えＤＮＡ分子に関する。
適当である場合には、植物細胞内で機能し得る発現シグ
ナルおよび植物ゲノム内の特定領域に相同性を有する配
置ＤＮＡ配列（ｆ ｌａｎｋｉｎｇ ＤＮＡ５ｅｑｕｅ
ｎｃｅ ）に操作可能に結合した組込まれるべきＤＮＡ
配列からなる組換えＤＮＡ分子が好ましい。
ナルおよび植物ゲノム内の特定領域に相同性を有する配
置ＤＮＡ配列（ｆ ｌａｎｋｉｎｇ ＤＮＡ５ｅｑｕｅ
ｎｃｅ ）に操作可能に結合した組込まれるべきＤＮＡ
配列からなる組換えＤＮＡ分子が好ましい。
本発明は特に以下のことをコードする組換えＤＮＡ分子
に関する： ａ）該組換えＤＮＡ分子は、有用なそして所望の特性を
コードする構造遺伝子を有し、ｂ）適当である場合には
、植物細胞内で機能し得る発現シグナルに操作可能に結
合しており、Ｃ）相同領域を含む植物細胞の形質転換に
Ｆ鷲して、相同ＤＮＡ配列が配置された遺伝子配列の指
示された組込みが相同組換えにより植物ゲノム内の規定
された部位に起こるような様式で植物ゲノ五内の相当す
るＤＮＡ領域に十分に相同性を有するＤＮＡ配列に構造
遺伝子および所望により発現シグナルからなる上記機能
単位が結合している。
に関する： ａ）該組換えＤＮＡ分子は、有用なそして所望の特性を
コードする構造遺伝子を有し、ｂ）適当である場合には
、植物細胞内で機能し得る発現シグナルに操作可能に結
合しており、Ｃ）相同領域を含む植物細胞の形質転換に
Ｆ鷲して、相同ＤＮＡ配列が配置された遺伝子配列の指
示された組込みが相同組換えにより植物ゲノム内の規定
された部位に起こるような様式で植物ゲノ五内の相当す
るＤＮＡ領域に十分に相同性を有するＤＮＡ配列に構造
遺伝子および所望により発現シグナルからなる上記機能
単位が結合している。
構造遺伝子の他に、あらゆるその他の遺伝子または遺伝
子断片またはＤＮＡ配列もまた使用可能である。
子断片またはＤＮＡ配列もまた使用可能である。
場合によっては植物細胞内で機能し得る発現シグナルの
制御下にあり、そして植物ゲノム内の相当するＤＮＡ領
域に十分な相同性を有し、相同組換えにより遺伝子もし
くは遺伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ配列と上記
相同ゲノムＤＮＡとの直接交換を可能とする遺伝子もし
くは遺伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ配列からな
る遺伝子構築物を４本発明の広い概念社包含する。
制御下にあり、そして植物ゲノム内の相当するＤＮＡ領
域に十分な相同性を有し、相同組換えにより遺伝子もし
くは遺伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ配列と上記
相同ゲノムＤＮＡとの直接交換を可能とする遺伝子もし
くは遺伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ配列からな
る遺伝子構築物を４本発明の広い概念社包含する。
二本鎖ＤＮＡの他に、本発明の方法において、−本鎖Ｄ
ＮＡおよび部分的−本鎖ＤＮＡも用いることができる。
ＮＡおよび部分的−本鎖ＤＮＡも用いることができる。
さらに１組込まれるべき標的ＤＮＡが特定の機能タンパ
ク質と関連するＤＮＡ／タンパク質複合体を用いるとと
吃できる。
ク質と関連するＤＮＡ／タンパク質複合体を用いるとと
吃できる。
この点に関し、数徨のＤＮＡ／タンパク質複合体、例え
ばＤＮＡ／クロマチン結合タンパク質複合体、ＤＮＡ／
植物ウィルつタンパク質複合体または非相同タンパク質
例えば細菌または酵母の組換えタンパク質（例えばＲｅ
ｃ Ａ ｅ Ｂ ＊ Ｃ＃ Ｄ ）を含有するＤＮＡ／
タンパク質複合体を例として記載し得る。
ばＤＮＡ／クロマチン結合タンパク質複合体、ＤＮＡ／
植物ウィルつタンパク質複合体または非相同タンパク質
例えば細菌または酵母の組換えタンパク質（例えばＲｅ
ｃ Ａ ｅ Ｂ ＊ Ｃ＃ Ｄ ）を含有するＤＮＡ／
タンパク質複合体を例として記載し得る。
植物細胞内で発現され、そして植物体に有用なおよび／
または望ましい特性、例えば病原体（例えば植物病原性
昆虫、菌類、バクテリア、ウィルスその他）、除草剤、
殺虫剤もしくはその他の殺生物剤、気候の影響および場
所特性（例えば温かさ、寒さ、風、乾燥、湿気、特別に
極端な土壌条件、浸透圧その他）に対する増加した耐性
または許容性、または葉、種子、塊茎、根、茎その他に
おける保存材料および貯蔵物質形成の増力口を付与する
あらゆる遺伝子が本発明の方法における使用に特に適し
ている。
または望ましい特性、例えば病原体（例えば植物病原性
昆虫、菌類、バクテリア、ウィルスその他）、除草剤、
殺虫剤もしくはその他の殺生物剤、気候の影響および場
所特性（例えば温かさ、寒さ、風、乾燥、湿気、特別に
極端な土壌条件、浸透圧その他）に対する増加した耐性
または許容性、または葉、種子、塊茎、根、茎その他に
おける保存材料および貯蔵物質形成の増力口を付与する
あらゆる遺伝子が本発明の方法における使用に特に適し
ている。
本発明は薬学的に許容性の活性物質、例えばアルカロイ
ド、ステロイド、ホルモン、免疫モジュレータ−および
その他の生理学的に活性な物質をコードする遺伝子も包
含する。
ド、ステロイド、ホルモン、免疫モジュレータ−および
その他の生理学的に活性な物質をコードする遺伝子も包
含する。
有用で望ましい特性をコードする天然に生じている遺伝
子の他に、化学的なまたは遺伝子工学の方法による制御
された改変を予め受けた遺伝子を本発明の範囲内で用い
ることもできる。
子の他に、化学的なまたは遺伝子工学の方法による制御
された改変を予め受けた遺伝子を本発明の範囲内で用い
ることもできる。
本発明の広い概念の中には完全に化学合成により製造さ
れた遺伝子も包含される。
れた遺伝子も包含される。
植物貯蔵タンパク質遺伝子をここで例として記載しても
良い。タンパク質遺伝子に対する可能な改変は、はとん
どの場合栄養価が低いと知られているそれらのアミノ酸
組成に特に関する。
良い。タンパク質遺伝子に対する可能な改変は、はとん
どの場合栄養価が低いと知られているそれらのアミノ酸
組成に特に関する。
従って、例えばトウモロコシのゼイン貯蔵タンパク質は
、そのタンパク質をコードするＤＮＡ配列は公知であり
〔ヴイーナンド ケイ＋ （Ｗｉｅ−ｎａｎｄ Ｋ、
）等、 Ｍｏ１． Ｇｅｎ−Ｇｅｎｅｔ５．１８２：
４４Ｇ−４４４，１９８１年〕、高いプロリン含有を有
するが、一方リジンおよびトリプトファンの比率は非常
に低い。
、そのタンパク質をコードするＤＮＡ配列は公知であり
〔ヴイーナンド ケイ＋ （Ｗｉｅ−ｎａｎｄ Ｋ、
）等、 Ｍｏ１． Ｇｅｎ−Ｇｅｎｅｔ５．１８２：
４４Ｇ−４４４，１９８１年〕、高いプロリン含有を有
するが、一方リジンおよびトリプトファンの比率は非常
に低い。
リジンおよび／またはトリプトファンに富むタンパク質
か、またはあるその他の態様に改良されたゼインタンパ
ク質を新たにコードする予め改変された遺伝子と植物本
来のゼイン遺伝子を置き換える本発明の方法を用いるこ
とにより、ある椎の標的植物の栄養生理学的価値におい
て選択的改良を達成することが今や可能である。
か、またはあるその他の態様に改良されたゼインタンパ
ク質を新たにコードする予め改変された遺伝子と植物本
来のゼイン遺伝子を置き換える本発明の方法を用いるこ
とにより、ある椎の標的植物の栄養生理学的価値におい
て選択的改良を達成することが今や可能である。
さらに加えて、低い栄養生理学的価値を有する植物本来
の貯蔵タンパク質の高いバックグラウンドレベルは、該
植物本来の遺伝子を不活性化する妨害遺伝子の制御され
た組込みによシ減少させ得る。
の貯蔵タンパク質の高いバックグラウンドレベルは、該
植物本来の遺伝子を不活性化する妨害遺伝子の制御され
た組込みによシ減少させ得る。
その様な妨害遺伝子の例は、ゼインタンパク質の発現を
止めるトウモロコシのオバークー２遺仁子である。
止めるトウモロコシのオバークー２遺仁子である。
その他の有用なＤＮＡ配列、特に調節機能を有する非コ
ードＤＮＡ配列も本発明の方法における使用に適してい
る。
ードＤＮＡ配列も本発明の方法における使用に適してい
る。
従って、本発明の範囲内で与えられた定義による相同お
よび非相同遺伝子またはＤＮＡおよび合成遺伝子または
ＤＮＡの両方が本発明の方法における使用に適している
。
よび非相同遺伝子またはＤＮＡおよび合成遺伝子または
ＤＮＡの両方が本発明の方法における使用に適している
。
組込まれるべきＤＮＡ配列は排他的にゲノムＤＮＡから
ｃＤＮＡから、または合成ＤＮＡから構築されることが
できる。ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方および／″
ｌまたけ合成ＤＮＡからなるハイブリッドＤＮＡ配列の
構築がもう１つの可能性である。
ｃＤＮＡから、または合成ＤＮＡから構築されることが
できる。ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方および／″
ｌまたけ合成ＤＮＡからなるハイブリッドＤＮＡ配列の
構築がもう１つの可能性である。
その場合、ｃＤＮＡｔｆゲノムＤＮＡとして同一遺伝子
またはＤＮＡ領域から生じても良く、またはｃ ＤＮＡ
とゲノムＤＮＡの両方が異なる遺伝子またはＤＮＡ領域
から生じても良い。しかしながら、あらゆる場合におい
て、ゲノムＤＮＡおよび／またはＣＤＮＡの両方は同一
または異なる遺伝子またはＤＮＡ領域から個々に各々製
造されても良い。
またはＤＮＡ領域から生じても良く、またはｃ ＤＮＡ
とゲノムＤＮＡの両方が異なる遺伝子またはＤＮＡ領域
から生じても良い。しかしながら、あらゆる場合におい
て、ゲノムＤＮＡおよび／またはＣＤＮＡの両方は同一
または異なる遺伝子またはＤＮＡ領域から個々に各々製
造されても良い。
ＤＮＡ配列が１以上の遺伝子またはＤＮＡ領域の部分を
含む場合には、これらは１ｍそして同一個体から生じて
も、また異なる株に、または同−属の同−程もしくは異
なる稲の変種に属する種々の個体から生じても、また同
一もしくはもう１つの分類学上の単位の１以上の属に属
する個体から生じても良い。
含む場合には、これらは１ｍそして同一個体から生じて
も、また異なる株に、または同−属の同−程もしくは異
なる稲の変種に属する種々の個体から生じても、また同
一もしくはもう１つの分類学上の単位の１以上の属に属
する個体から生じても良い。
種物細胞中の構造遺伝子の発現を確実にするために、コ
ード遺伝子配列は場合によっては全ての始点を植物細胞
内で機能し得る発現配列に操作可能に結合されても良い
。
ード遺伝子配列は場合によっては全ての始点を植物細胞
内で機能し得る発現配列に操作可能に結合されても良い
。
従って本発明のハイブリッド遺伝子構築物は、概して、
構造遺伝子に加えて、プロモーターおよびターミネータ
−配列並びに３′および５′非翻訳領域のその他の調節
配列を包含する発現シグナルを含有する。
構造遺伝子に加えて、プロモーターおよびターミネータ
−配列並びに３′および５′非翻訳領域のその他の調節
配列を包含する発現シグナルを含有する。
コードＤＮＡ配列（構造遺伝子）の発現の誘導を引き起
こし得るあらゆるプロモーターおよびあらゆるターミネ
ータ−をキメラ遺伝子配列の成分として使用し得る。植
物または植物ウィルスの遺伝子から生ずる発現シグナル
は特に適当である。適当なプロモーターおよびターミネ
ータ−の例は、ツバリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）、
オクトピンシンターゼ遺伝子（ＯＣＳ ）およびカリフ
ラワーモザイクウィルス遺伝子（ＣａＭＶ ）のもので
ある。
こし得るあらゆるプロモーターおよびあらゆるターミネ
ータ−をキメラ遺伝子配列の成分として使用し得る。植
物または植物ウィルスの遺伝子から生ずる発現シグナル
は特に適当である。適当なプロモーターおよびターミネ
ータ−の例は、ツバリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）、
オクトピンシンターゼ遺伝子（ＯＣＳ ）およびカリフ
ラワーモザイクウィルス遺伝子（ＣａＭＶ ）のもので
ある。
ＣａＭＶゲノムの３５Ｓおよび１９Ｓ発現シグナルが本
発明の範囲内で好ましく、これらは例えばマニアチス（
Ｍａｎｉａｔｉｓ ）等、１９８２年に記載されるよう
な分子生物学の方法により前記ゲノムから分離され、そ
してコードＤＮＡ配列に結合され得る。
発明の範囲内で好ましく、これらは例えばマニアチス（
Ｍａｎｉａｔｉｓ ）等、１９８２年に記載されるよう
な分子生物学の方法により前記ゲノムから分離され、そ
してコードＤＮＡ配列に結合され得る。
本発明に従って、３５Ｓ転写制御配列に使用される出発
材料は、例えば遺伝子地図〔フランクジー、 （Ｆｒａ
ｎｋ Ｇ−）等、１９８０年〕のヌクレオｆ ）” ６
８０Ｂ−７６５２からなるＣａＭＶ −Ｓ ”株のＳｃ
ａ ｌ断片であって良い。
材料は、例えば遺伝子地図〔フランクジー、 （Ｆｒａ
ｎｋ Ｇ−）等、１９８０年〕のヌクレオｆ ）” ６
８０Ｂ−７６５２からなるＣａＭＶ −Ｓ ”株のＳｃ
ａ ｌ断片であって良い。
１９３プロモーターおよび５′非翻訳領域は、ＣａＭＶ
遺伝子地図〔ホーｙ （Ｈｏｈｎ ）等、１９８２年〕
のＰｓｔ Ｔ部位（５５８６位）とＨｉｎｄ ｍ部位（
５８５０位）との間のゲノム断片上に位置される。相当
するターミネータ−および５′非翻訳佃域は、ＣａＭＶ
ゲノムの７５４２位と７６４３位との間のＥｃｏＲＶ／
ＢｇＬ ＩＩ断片上に位置される。
遺伝子地図〔ホーｙ （Ｈｏｈｎ ）等、１９８２年〕
のＰｓｔ Ｔ部位（５５８６位）とＨｉｎｄ ｍ部位（
５８５０位）との間のゲノム断片上に位置される。相当
するターミネータ−および５′非翻訳佃域は、ＣａＭＶ
ゲノムの７５４２位と７６４３位との間のＥｃｏＲＶ／
ＢｇＬ ＩＩ断片上に位置される。
完全なヌクレオチド配列がガードナー アール、シー、
（Ｇａｒｄｎｅｒ Ｒ，Ｃ，）等、１９８１年に記載
されるＣａＭＶ ＣＭ１８４１株の発現シグナルが本発
明の範囲内で好ましい。
（Ｇａｒｄｎｅｒ Ｒ，Ｃ，）等、１９８１年に記載
されるＣａＭＶ ＣＭ１８４１株の発現シグナルが本発
明の範囲内で好ましい。
使用し得る効果的な植物プロモーターのもう１つの例は
、過産生植物プロモーターである。
、過産生植物プロモーターである。
この徨のプロモーターは所望の遺伝子産物をコードする
遺伝子配列に操作可能に結合されて与えられ、前記遺伝
子配列の発現を媒介することができるものである。
遺伝子配列に操作可能に結合されて与えられ、前記遺伝
子配列の発現を媒介することができるものである。
本発明の範囲内で使用し得る過産生植物プロモーターは
、大豆からのりブロース−１，５−ビスホスフェートカ
ルボキシラーゼの小サブユニットのプロモーターしベリ
ー−ローライ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ ） 、 Ｊ、
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐ−Ｇｅｎ、 、１
：ａａｓ−４９８（１９８２） ）およびクロロフィル
−ａ／ｂ−結合タンパク質のプロモーターを包含する。
、大豆からのりブロース−１，５−ビスホスフェートカ
ルボキシラーゼの小サブユニットのプロモーターしベリ
ー−ローライ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ ） 、 Ｊ、
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐ−Ｇｅｎ、 、１
：ａａｓ−４９８（１９８２） ）およびクロロフィル
−ａ／ｂ−結合タンパク質のプロモーターを包含する。
これら２種のプロモーターは、それらが真核植物細胞中
に元により誘導されるという事実エ −＊−ｗッ’／ｚ
モア（Ａ−Ｃａｓｈｍｏｒｅ ） 、プレナム（Ｐｌｅ
ｎｕｍ ） 、 二ｚ −：ｌ−り １９８３年、第２
９−３８頁；コルマチ ジー、 （Ｃｏｒｕｚｚｉ Ｇ
、 ）等。
に元により誘導されるという事実エ −＊−ｗッ’／ｚ
モア（Ａ−Ｃａｓｈｍｏｒｅ ） 、プレナム（Ｐｌｅ
ｎｕｍ ） 、 二ｚ −：ｌ−り １９８３年、第２
９−３８頁；コルマチ ジー、 （Ｃｏｒｕｚｚｉ Ｇ
、 ）等。
１３９９（１９８３）およびダンスムイル ピー照〕。
場合によっては植物細胞内で活性な発現シグナルの調節
制御下にある遺伝子、ハイブリッド遺伝子構築物または
その他の有用なＤＮＡ配列からなる生成機能単位は次に
、植物ゲノム内の相当するＤＮＡ領域に十分に相同性を
有するＤＮ、Ａ配列により配置され、その結果、該相同
領域を含む植物細胞の形質転換に際し、相同ＤＮＡ配列
により配置された遺伝子配列の指示された組込みは、相
同組換えにより植物ゲノム内の規定された部位に起こる
。
制御下にある遺伝子、ハイブリッド遺伝子構築物または
その他の有用なＤＮＡ配列からなる生成機能単位は次に
、植物ゲノム内の相当するＤＮＡ領域に十分に相同性を
有するＤＮ、Ａ配列により配置され、その結果、該相同
領域を含む植物細胞の形質転換に際し、相同ＤＮＡ配列
により配置された遺伝子配列の指示された組込みは、相
同組換えにより植物ゲノム内の規定された部位に起こる
。
植物ゲノム内の相当する領域に十分な相同性を有し、そ
して従って相同組換えにより遺伝物質の交換を可能にす
る適当な配置ＤＮＡ配列を選択することにより、遺伝子
が植物ゲノムの予め決められた部位に制御された方法で
組込まれ、そして所望する場合には発現されることが初
めて今可能である。
して従って相同組換えにより遺伝物質の交換を可能にす
る適当な配置ＤＮＡ配列を選択することにより、遺伝子
が植物ゲノムの予め決められた部位に制御された方法で
組込まれ、そして所望する場合には発現されることが初
めて今可能である。
配置ＤＮＡと相当するゲノムＤＮＡ領域の間の、相同組
換えによる交換に必要とされる相同性の範囲は、種々の
パラメータ、例えばとりわけ特異的クロマチ／構造に依
存し、そしてそれ故に使用されるＤＮＡ配列に依存して
各々の場合に相当する要求に適応しなければならない。
換えによる交換に必要とされる相同性の範囲は、種々の
パラメータ、例えばとりわけ特異的クロマチ／構造に依
存し、そしてそれ故に使用されるＤＮＡ配列に依存して
各々の場合に相当する要求に適応しなければならない。
本発明の範囲内の配置ＤＮＡとしての使用に適当なＤＮ
Ａ配列は、特に、植物本来の遺伝子および／またはヌク
レオチド配列が完全にまたは部分的に公知であるゲノム
の部分に相同性を有するものであり、そのままで高い発
現効率を既に有する領域に位置される遺伝子またはゲノ
ムの部分が好ましい。
Ａ配列は、特に、植物本来の遺伝子および／またはヌク
レオチド配列が完全にまたは部分的に公知であるゲノム
の部分に相同性を有するものであり、そのままで高い発
現効率を既に有する領域に位置される遺伝子またはゲノ
ムの部分が好ましい。
植物の生長段階に応じた非常に高い発現速度を達成する
ことが公知である植物貯蔵タンパク質遺伝子は、本発明
の対象材料を限定することなしに、ここに可能な例とし
て記載し得る。
ことが公知である植物貯蔵タンパク質遺伝子は、本発明
の対象材料を限定することなしに、ここに可能な例とし
て記載し得る。
その他の遺伝子はそのヌクレオチド配列が少なくとも部
分的に公知であり、そしてそれ故に本発明の方法に使用
し得、例えばニトレートリダクターゼ遺伝子、 ｐｓｂ
Ａ遺伝子〔グレツセルジエイ＋ （Ｇｒｅｓｓｅｌ Ｊ
、 ） 、 ０ｘｆｏｒｄ ５ｕｒｖ−ＰｌａｎｔＭｏ
ｌ、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、、 ２ ： ３２１−５２
８ 、１９８５ ；ズロースキー ジー、（Ｚｕｒａｗ
ｓｋｉ Ｇ、 ）等、 Ｐｒｏｃ。
分的に公知であり、そしてそれ故に本発明の方法に使用
し得、例えばニトレートリダクターゼ遺伝子、 ｐｓｂ
Ａ遺伝子〔グレツセルジエイ＋ （Ｇｒｅｓｓｅｌ Ｊ
、 ） 、 ０ｘｆｏｒｄ ５ｕｒｖ−ＰｌａｎｔＭｏ
ｌ、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、、 ２ ： ３２１−５２
８ 、１９８５ ；ズロースキー ジー、（Ｚｕｒａｗ
ｓｋｉ Ｇ、 ）等、 Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ−ＳＣｉ、 、 ＵＳＡ、 ７９
： ７６９９−７７０３゜１９８２） 、リブロース−
１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユ
ニットの遺伝子並びにアルファアミラーゼおよびシラ糖
シンターゼ遺伝子を包含する。植物特異性遺伝子の他に
、進化の途上でのその非常に顕著な保存傾向のために相
当する植物特異性遺伝子に相同である比較的大きい領域
を有するあらゆる遺伝子を使用することも本発明の範囲
内で可能である。
： ７６９９−７７０３゜１９８２） 、リブロース−
１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユ
ニットの遺伝子並びにアルファアミラーゼおよびシラ糖
シンターゼ遺伝子を包含する。植物特異性遺伝子の他に
、進化の途上でのその非常に顕著な保存傾向のために相
当する植物特異性遺伝子に相同である比較的大きい領域
を有するあらゆる遺伝子を使用することも本発明の範囲
内で可能である。
これらは例えば哺乳類のヒストン遺伝子、アクチン遺伝
子およびグルタチオン−ｓ−ト５７スフエラーセ遺伝子
、およびまた種々の細菌の遺伝子例えばトリ１トフアン
ーおよびグルタミン−シンターゼ遺伝子を包含する。
子およびグルタチオン−ｓ−ト５７スフエラーセ遺伝子
、およびまた種々の細菌の遺伝子例えばトリ１トフアン
ーおよびグルタミン−シンターゼ遺伝子を包含する。
本発明の使用に適した可能な遺伝子の例のこの記載は、
単に本発明のより十分な説明のためのものであって、本
発明の対象材料を限定しようというものでは全熱ない。
単に本発明のより十分な説明のためのものであって、本
発明の対象材料を限定しようというものでは全熱ない。
遺伝子もしくは遺伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ
配列と相同性を有し、そして公知方法により予め標的植
物体のゲノム内に人為的に組込まれ、そしてそのヌクレ
オチド配列が完全にまたは部分的に公知であるＤＮＡ配
列もまた本発明の方法における使用に適している。その
ままで高い発現効率を確保する領域に位置されるＤＮＡ
配列が特に好ましい。
配列と相同性を有し、そして公知方法により予め標的植
物体のゲノム内に人為的に組込まれ、そしてそのヌクレ
オチド配列が完全にまたは部分的に公知であるＤＮＡ配
列もまた本発明の方法における使用に適している。その
ままで高い発現効率を確保する領域に位置されるＤＮＡ
配列が特に好ましい。
本発明の特定の実施態様において、組込まれるべきＤＮ
Ａおよび植物ゲノム内に既に存在する人為的に組込まれ
たＤＮＡは、相同組換えの後に植物ゲノム内に機能的単
位を形成するお互いに相補的なＤＮＡ配列である。
Ａおよび植物ゲノム内に既に存在する人為的に組込まれ
たＤＮＡは、相同組換えの後に植物ゲノム内に機能的単
位を形成するお互いに相補的なＤＮＡ配列である。
前記機能的単位は望ましいそして有用なタンパク質産物
をコードする構造遺伝子でありでも、また植物ゲノム内
の特定の調整機能を遂行する制御配列であっても良い。
をコードする構造遺伝子でありでも、また植物ゲノム内
の特定の調整機能を遂行する制御配列であっても良い。
特定の表現型マーカーまたはいくつかのその他の容易に
検出可能なタンパク質産生物をコードする機能的構造遺
伝子を組換え後に形成するお互いに相補的ｉ ＤＮＡ配
列が本発明の範囲内で特に好ましい。
検出可能なタンパク質産生物をコードする機能的構造遺
伝子を組換え後に形成するお互いに相補的ｉ ＤＮＡ配
列が本発明の範囲内で特に好ましい。
上記の方法で相当するハイブリッド遺伝子構築物を産住
することにより、植物ゲノム内の植物本来の遺伝子の選
択的および予め決定できる改変を行なうことは、本発明
の範囲内で今ギこのように可能である。
することにより、植物ゲノム内の植物本来の遺伝子の選
択的および予め決定できる改変を行なうことは、本発明
の範囲内で今ギこのように可能である。
本発明の本質的々部分はこのように、上記組換えＤＮＡ
分子、相同組換えによシ、所望の予め決定できる部位で
植物ゲノム内に選択的に組込まれている前記組換えＤＮ
Ａ分子内に含まれる遺伝子、ハイブリッド遺伝子構築物
またはその他の有用なＤＮＡ配列のうちの１種で植物材
料を形質転換することからなる遺伝子導入植物体の製造
方法である。
分子、相同組換えによシ、所望の予め決定できる部位で
植物ゲノム内に選択的に組込まれている前記組換えＤＮ
Ａ分子内に含まれる遺伝子、ハイブリッド遺伝子構築物
またはその他の有用なＤＮＡ配列のうちの１種で植物材
料を形質転換することからなる遺伝子導入植物体の製造
方法である。
第１工程において、例えば有用で望ましい遺伝子産物を
コードし、そして植物細胞内で機能し得セしてゲノムの
植物本来の部分に相同性を有する配列領域を配置し得る
発現シグナルに操作可能に結合された１種またはそれ以
上の構造遺伝子からなる上記組換えＤＮＡ分子をまず構
築し、そして相同組換えによって機能的遺伝子を再び形
成し得る適当なりローニングベクター内に挿入される。
コードし、そして植物細胞内で機能し得セしてゲノムの
植物本来の部分に相同性を有する配列領域を配置し得る
発現シグナルに操作可能に結合された１種またはそれ以
上の構造遺伝子からなる上記組換えＤＮＡ分子をまず構
築し、そして相同組換えによって機能的遺伝子を再び形
成し得る適当なりローニングベクター内に挿入される。
構造遺ｄ子の他に、あらゆるその他の所望の遺伝子もし
くは遺伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ配列を用い
ることも可能である。
くは遺伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ配列を用い
ることも可能である。
使用されるクローニングベクターは一般的に、宿主細胞
に適合する種起源の、複製および制御配列を有するプラ
スミドまたはウィルス（バクテリオファージ）ベクター
である。
に適合する種起源の、複製および制御配列を有するプラ
スミドまたはウィルス（バクテリオファージ）ベクター
である。
クローニングベクターは通常複製の一始および形質転換
された宿主細胞中て選択可能な表現型マーカー、特に抗
体またはある種の抗体に対する耐性を結果として生ずる
特定の遺伝子も有する。形質転換されたベクターは宿主
細胞内での形質転換後これらの表現型マーカーにより選
択され得る。
された宿主細胞中て選択可能な表現型マーカー、特に抗
体またはある種の抗体に対する耐性を結果として生ずる
特定の遺伝子も有する。形質転換されたベクターは宿主
細胞内での形質転換後これらの表現型マーカーにより選
択され得る。
本発明の範囲内で使用さ′れ得る選択可能な表現型ヤー
カーは、例えばこれが本発明の対象を限定することなく
アンピシリン、テトラサイクリン、ハイクロマイシン、
０．４１８、カナマイシン、およびネオマイシンに対す
る耐性を包含する。
カーは、例えばこれが本発明の対象を限定することなく
アンピシリン、テトラサイクリン、ハイクロマイシン、
０．４１８、カナマイシン、およびネオマイシンに対す
る耐性を包含する。
本発明の範囲内の適当な宿主細胞は、原核生物であり、
細菌宿主、例えばアグロバクテリウム チュメファシエ
ンス（Ａ、 ｔｊ＋ｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）、およびセ
ルラチア マルセー！センス（８ｅｒｒａｔｉａｍａｒ
ｃｅｓｃｅｎｓ ）およびシアノバクテリアを含む。
細菌宿主、例えばアグロバクテリウム チュメファシエ
ンス（Ａ、 ｔｊ＋ｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）、およびセ
ルラチア マルセー！センス（８ｅｒｒａｔｉａｍａｒ
ｃｅｓｃｅｎｓ ）およびシアノバクテリアを含む。
真核生物宿主、例えば酵母二菌糸体形成菌および植物細
胞も本発明の範囲内で使用できる。
胞も本発明の範囲内で使用できる。
本発明に係るキメラ遺伝子は、例えばマニアチス等、１
９８２年に記載された標準法を用いて適当なりローニン
グベクター内に挿入され机−数的に挿入されるべきベク
ターおよびＤＮＡ配列をまず最初に適当な制限酵素で切
断する。
９８２年に記載された標準法を用いて適当なりローニン
グベクター内に挿入され机−数的に挿入されるべきベク
ターおよびＤＮＡ配列をまず最初に適当な制限酵素で切
断する。
適当な制限酵素は、例えばプラント末端を有する断片を
生じるもの、例えばＳｍａ Ｉ 、Ｈｐａ Ｉ およ
びＥＣ０ＲＶ、または粘着端を形成する酵素、例えばＥ
ｃｏＲＩ、Ｓａｃ Ｉ およびＢａｍＨＩである。
生じるもの、例えばＳｍａ Ｉ 、Ｈｐａ Ｉ およ
びＥＣ０ＲＶ、または粘着端を形成する酵素、例えばＥ
ｃｏＲＩ、Ｓａｃ Ｉ およびＢａｍＨＩである。
お互いに相補的であるプラント末端を有する断片と粘着
端を有する断片の両方を、適当なＤＮＡリガーゼによシ
連結し、連続的で均一なＤＮＡ分子を再び形成すること
ができる。
端を有する断片の両方を、適当なＤＮＡリガーゼによシ
連結し、連続的で均一なＤＮＡ分子を再び形成すること
ができる。
突出する粘着端を有するＤＮＡ断片を大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼのクレノー断片と処理して、相当する相補的ヌ
クレオチドで空隙を充填することによりプラント末端を
製造することもできる。
メラーゼのクレノー断片と処理して、相当する相補的ヌ
クレオチドで空隙を充填することによりプラント末端を
製造することもできる。
他方、例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼを用いて所望のＤＮＡ配列および切断されたベ
クター分子の端部に相補的ホモポリマー尾部を添加する
か、または制限切断部位を有する合成オリゴヌクレオチ
ド配列（リンカ−）を添加し、そして次に適当な酵素で
切断することにより、粘着端を人工的に製造することも
できる。
ェラーゼを用いて所望のＤＮＡ配列および切断されたベ
クター分子の端部に相補的ホモポリマー尾部を添加する
か、または制限切断部位を有する合成オリゴヌクレオチ
ド配列（リンカ−）を添加し、そして次に適当な酵素で
切断することにより、粘着端を人工的に製造することも
できる。
クローニングベクターおよび該ベクターで形質転換され
た宿主細胞は、本発明によシベクターのコピー数を増や
すために使用される。増加したコピー数によって、本発
明のハイブリッド遺伝子構築物を有するベクターを分離
すること、そしてそれを使用すること、例えばキメラ遺
伝子配列を植物細胞内に挿入することが可能となる。
た宿主細胞は、本発明によシベクターのコピー数を増や
すために使用される。増加したコピー数によって、本発
明のハイブリッド遺伝子構築物を有するベクターを分離
すること、そしてそれを使用すること、例えばキメラ遺
伝子配列を植物細胞内に挿入することが可能となる。
それ故に本発明の本質的な部分は、所望により植物細胞
内で機能し、そしてゲノムの植物本来の領域に相同性を
有するＤＮＡ配列を配置し得る発現シグナルに操作可能
に結合されても良い１種もしくはそれ以上の構造遺伝子
またはその他の所望の遺伝子もしくは遺伝子断片または
その他の有用なＤＮＡ配列からなるキメラ遺伝子構築物
を含有するプラスミドの製造に関する。
内で機能し、そしてゲノムの植物本来の領域に相同性を
有するＤＮＡ配列を配置し得る発現シグナルに操作可能
に結合されても良い１種もしくはそれ以上の構造遺伝子
またはその他の所望の遺伝子もしくは遺伝子断片または
その他の有用なＤＮＡ配列からなるキメラ遺伝子構築物
を含有するプラスミドの製造に関する。
その他の製造工程において、所望の遺伝子産生物をコー
ドする構造遺伝子を場合によっては含有しても良い上記
キメラ遺伝子構築物を植物細胞内に挿入し、そしてそれ
を植物ゲノム内に組込むために上記プラスミドを使用す
ることができる。
ドする構造遺伝子を場合によっては含有しても良い上記
キメラ遺伝子構築物を植物細胞内に挿入し、そしてそれ
を植物ゲノム内に組込むために上記プラスミドを使用す
ることができる。
それ故に、本発明は、植物細胞のゲノム内に取込まれ、
上記構造遺伝子またはその他の所望の遺伝子もしくは遺
伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ配列を含有する受
容植物細胞にも関する。
上記構造遺伝子またはその他の所望の遺伝子もしくは遺
伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ配列を含有する受
容植物細胞にも関する。
キメラ遺伝子構築物は好ましくは、公知の遺伝子移入方
法を用いて植物プロトプラスト内に挿入される。
法を用いて植物プロトプラスト内に挿入される。
遺伝子移入ベクターの使用または直接移入方法に基づい
て、植物細胞内にＤＮＡを導入する多くの非常に有効な
方法がその時まで存在するようになった。
て、植物細胞内にＤＮＡを導入する多くの非常に有効な
方法がその時まで存在するようになった。
１つの可能性は、例えば植物細胞をウィルスまたはアグ
ロバクテリウムと接触させることからなる。これは、感
受性植物細胞を感染させるか、または植物細胞から誘導
されるプロトプラストの共培養によシ行われ得る。カリ
フラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）もまた、本発明
に係るキメラ遺伝子構築物を植物体内に挿入するための
ベクターとして本発明の範囲内で使用することができる
しホーン（Ｈｏｈｎ ）等、「植物腫瘍の分子庄物学」
アカデミ−！クプレス（ＡｃａｄｅｍｉＣＰｒｅｓｓ
） 、＝ ｚ−ヨーク、１９８２年、第５４９−５６０
頁； ＊ −ウｘ ｋ （ｌ（ｏｗｅｌｌ ）、米ｉｗ
許笛、４４０７９５６号〕。この場合、ＣａＭＶの全ウ
ィルスＤＮＡゲノムを細菌の親プラスミド内に挿入し、
細菌内で複製され得る組換えＤＮＡ分子を形成する。ク
ローニングの後、ハイブリッド遺伝子構築物を取込むこ
とができるように、組換えプラスミドを制限酵素を用い
て組換えプラスミドのウィルス部分内例えばアフィドに
よるウィルスの転移可能性をコードする遺伝子内で、ラ
ンダムにまたは非常に特異的な非必須部位で切断する。
ロバクテリウムと接触させることからなる。これは、感
受性植物細胞を感染させるか、または植物細胞から誘導
されるプロトプラストの共培養によシ行われ得る。カリ
フラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）もまた、本発明
に係るキメラ遺伝子構築物を植物体内に挿入するための
ベクターとして本発明の範囲内で使用することができる
しホーン（Ｈｏｈｎ ）等、「植物腫瘍の分子庄物学」
アカデミ−！クプレス（ＡｃａｄｅｍｉＣＰｒｅｓｓ
） 、＝ ｚ−ヨーク、１９８２年、第５４９−５６０
頁； ＊ −ウｘ ｋ （ｌ（ｏｗｅｌｌ ）、米ｉｗ
許笛、４４０７９５６号〕。この場合、ＣａＭＶの全ウ
ィルスＤＮＡゲノムを細菌の親プラスミド内に挿入し、
細菌内で複製され得る組換えＤＮＡ分子を形成する。ク
ローニングの後、ハイブリッド遺伝子構築物を取込むこ
とができるように、組換えプラスミドを制限酵素を用い
て組換えプラスミドのウィルス部分内例えばアフィドに
よるウィルスの転移可能性をコードする遺伝子内で、ラ
ンダムにまたは非常に特異的な非必須部位で切断する。
単一の特異的制限認識部位を有する小さいオリゴヌクレ
オチド、いわゆるリンカ−もまた組込まれ得る。そのよ
うに改変された組換えプラスミドを再び一クローン化し
、さらにハイプリーノ遺伝子子構築物を非反復制限部位
内に挿入することによシ改変させる。
オチド、いわゆるリンカ−もまた組込まれ得る。そのよ
うに改変された組換えプラスミドを再び一クローン化し
、さらにハイプリーノ遺伝子子構築物を非反復制限部位
内に挿入することによシ改変させる。
組換えプラスミドの改変ウィルス部分を次に細菌の親プ
ラスミドから切シ取シ、そして植物細胞または全植物体
に接種するために用いる。
ラスミドから切シ取シ、そして植物細胞または全植物体
に接種するために用いる。
キメラ遺伝子構築物を細胞内に導入するもう一つの方法
は、該遺伝子構築物で形質転換さｈたアグロバクテリウ
ム チュメフ了シェンスでの植物細胞の感染を使用する
。苗条（５ｈｏｏｔ ）および根を生長させそして結果
的に全植物体を住じるような当業者には公知の適当な培
養条件で、遺伝子導入植物細胞を次に培養する。
は、該遺伝子構築物で形質転換さｈたアグロバクテリウ
ム チュメフ了シェンスでの植物細胞の感染を使用する
。苗条（５ｈｏｏｔ ）および根を生長させそして結果
的に全植物体を住じるような当業者には公知の適当な培
養条件で、遺伝子導入植物細胞を次に培養する。
キメラ遺伝子構築物を適当な植物ａ胞内に、例えばアグ
ロバクテリウム チュメファシエンスのＴｉプラスミド
によって移すことができる〔デクリーン（Ｄｅｃｌｅｅ
ｎｅ ）等、Ｂｏｔ Ｒｅｖ ４７ ：１４７−１９
４ （１９８１） ： Ｂｏｔ Ｒｅｖ ４２： ５Ｂ
９−４６６（１９７６）〕。アクロバクテリウム チエ
メツ丁シエンスによる感染の間に、Ｔｉプラスミドを植
物体に移し、そして植物ゲノム内に安定に組込む〔ホー
シュ（Ｈｏｒｓｃｈ ）等、−亀←±ル迂−２−２５５
： ４９６−４９８ （１９８４）： ７ラレイ（
Ｆｒａ−１ｅｙ ）等、Ｐｒｏｃ、’Ｎａｔ１．Ａｃａ
ｄ、 ８ｃｉ、ＵＳＡ、 ８０ ：４８０３ （１９８
３） ）。
ロバクテリウム チュメファシエンスのＴｉプラスミド
によって移すことができる〔デクリーン（Ｄｅｃｌｅｅ
ｎｅ ）等、Ｂｏｔ Ｒｅｖ ４７ ：１４７−１９
４ （１９８１） ： Ｂｏｔ Ｒｅｖ ４２： ５Ｂ
９−４６６（１９７６）〕。アクロバクテリウム チエ
メツ丁シエンスによる感染の間に、Ｔｉプラスミドを植
物体に移し、そして植物ゲノム内に安定に組込む〔ホー
シュ（Ｈｏｒｓｃｈ ）等、−亀←±ル迂−２−２５５
： ４９６−４９８ （１９８４）： ７ラレイ（
Ｆｒａ−１ｅｙ ）等、Ｐｒｏｃ、’Ｎａｔ１．Ａｃａ
ｄ、 ８ｃｉ、ＵＳＡ、 ８０ ：４８０３ （１９８
３） ）。
Ｔｉプラスミドは、形質転換された細胞の生成に必須で
ある２つの領域を有する。これらのうちの１つ、トラン
スファーＤＮＡ領域は、植物体に移され、そして＃瘍を
導入する。もう一方、とルレンス関連（ｖｉｒ）領域は
、腫瘍形成のためだけに必須であるが、しかし腫瘍維持
に必須ではない。トランスファーＤＮＡ領域の範囲は、
転移可能性が損われることなく、キメラ遺伝子構築物を
取込むことにより広げられ得る。腫瘍発生遺伝子を除去
することにより、その結果として遺伝子導入植物細胞は
非腫瘍性となり、そして選択可能なマーカーを取込むこ
とにより改変Ｔｉプラスミドを適当な植物細胞内への本
発明の遺伝子構築物の移入用ベクターとして使用するこ
とができる。
ある２つの領域を有する。これらのうちの１つ、トラン
スファーＤＮＡ領域は、植物体に移され、そして＃瘍を
導入する。もう一方、とルレンス関連（ｖｉｒ）領域は
、腫瘍形成のためだけに必須であるが、しかし腫瘍維持
に必須ではない。トランスファーＤＮＡ領域の範囲は、
転移可能性が損われることなく、キメラ遺伝子構築物を
取込むことにより広げられ得る。腫瘍発生遺伝子を除去
することにより、その結果として遺伝子導入植物細胞は
非腫瘍性となり、そして選択可能なマーカーを取込むこ
とにより改変Ｔｉプラスミドを適当な植物細胞内への本
発明の遺伝子構築物の移入用ベクターとして使用するこ
とができる。
Ｔ−ＤＮＡ領域およびｖｉｒ領域が同一アグロバクテリ
ウム細胞内の同一ベクターまたは異なるベクター上にあ
るかどうかに関係なく、ｖｉｒ領域はアグロバクテリウ
ムから植物細胞のゲノムヘＴ −ＤＮＡ領域の移入を起
こす。染色体上のｖｉｒ領域はまたベクターから植物細
胞内へのＴ−ＤＮＡの移入も誘導する。
ウム細胞内の同一ベクターまたは異なるベクター上にあ
るかどうかに関係なく、ｖｉｒ領域はアグロバクテリウ
ムから植物細胞のゲノムヘＴ −ＤＮＡ領域の移入を起
こす。染色体上のｖｉｒ領域はまたベクターから植物細
胞内へのＴ−ＤＮＡの移入も誘導する。
アグロバクテリウムから植物細胞内へＴ−ＤＮＡ領域を
移すための好ましい系は、ｖｉｒ領域とＴ−ＤＮＡ領域
が異なるベクター上に位置していることをコードする。
移すための好ましい系は、ｖｉｒ領域とＴ−ＤＮＡ領域
が異なるベクター上に位置していることをコードする。
その様な系は「二元ベクター系」の名称で知られ、そし
てＴ−ＤＮＡを含むベクターは、「二元ベクター」と表
わされる。
てＴ−ＤＮＡを含むベクターは、「二元ベクター」と表
わされる。
植物細胞内に移され得、そして形質転換された細胞の選
択を可能にするＴ −ＤＮＡを含むあらゆるベクターは
、本発明の範囲内での使用に適している。
択を可能にするＴ −ＤＮＡを含むあらゆるベクターは
、本発明の範囲内での使用に適している。
新規に開発された形質転換技術を用いて、アグロバクテ
リウムの自然の宿主でない植物種をも試験管内で形質転
換することが今や可能である。例えば、単子葉植物、特
に穀物種およびイネ科植物はアグロバクテリウムの自然
の宿主ではない。
リウムの自然の宿主でない植物種をも試験管内で形質転
換することが今や可能である。例えば、単子葉植物、特
に穀物種およびイネ科植物はアグロバクテリウムの自然
の宿主ではない。
この間に、単子葉植物もアグロバクテリウムで形質転換
され得るという証拠が増え、その結果、今や利用できる
ようになっている新しい実験法を用いて、穀物およびイ
ネ科の種もまた形質転換に利用できる〔グリムズレイ
エフ、エイチ、（Ｇｒ該ｓｌｅｙＮ、Ｈｏ） Ｎａｔｕ
ｒｅ、 ３２５ ： １７７−１７９ （１９８７））
。
され得るという証拠が増え、その結果、今や利用できる
ようになっている新しい実験法を用いて、穀物およびイ
ネ科の種もまた形質転換に利用できる〔グリムズレイ
エフ、エイチ、（Ｇｒ該ｓｌｅｙＮ、Ｈｏ） Ｎａｔｕ
ｒｅ、 ３２５ ： １７７−１７９ （１９８７））
。
本発明に係る遺伝子構築物の植物プロトプラスト内への
直接挿入が本発明の範囲内で好ましく、そのための多く
の方法が既に利用できる。
直接挿入が本発明の範囲内で好ましく、そのための多く
の方法が既に利用できる。
例えば、ベクター内に包含される遺伝物質は、′例えば
組換えＤＮＡを機械的に移すためのマイクロビベ７トを
用いて〔ノイハウス（Ｎｅｕｈａｕｓ ）等、１９８７
年〕、植物細胞内に直接マイクロインジェクションする
ことができる。
組換えＤＮＡを機械的に移すためのマイクロビベ７トを
用いて〔ノイハウス（Ｎｅｕｈａｕｓ ）等、１９８７
年〕、植物細胞内に直接マイクロインジェクションする
ことができる。
遺伝物質を植物細胞内に直接移すその他の可能々方法は
、形質膜を変性させる工程段階、例エバポリエチレング
リコール処理〔バスツコウス＊ −（Ｐａｓｚｋｏｗｓ
ｋｉ ）等、ＥＭＢＯＪ、、 ３ ： ２７１７−２．
２ （１９８４））、熱シヨツク処理またはエレクトロ
ポレーション、およびこれら工程段階の組合せ〔シルリ
ット（８ｈｉｌｌｉｔｏ ）等、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈ−を
勇股工し１０９９−１１０３ （１９８５）：フロム（
Ｆｒｏｍｍ ） Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
８ｃｉ、ＵＳＡ 、 ８２ ニー５８２４ （１９８５
）］、によるプロトプラストを処理することにある。
、形質膜を変性させる工程段階、例エバポリエチレング
リコール処理〔バスツコウス＊ −（Ｐａｓｚｋｏｗｓ
ｋｉ ）等、ＥＭＢＯＪ、、 ３ ： ２７１７−２．
２ （１９８４））、熱シヨツク処理またはエレクトロ
ポレーション、およびこれら工程段階の組合せ〔シルリ
ット（８ｈｉｌｌｉｔｏ ）等、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈ−を
勇股工し１０９９−１１０３ （１９８５）：フロム（
Ｆｒｏｍｍ ） Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
８ｃｉ、ＵＳＡ 、 ８２ ニー５８２４ （１９８５
）］、によるプロトプラストを処理することにある。
エレクトロポレーション技術において、ハイブリッド遺
伝子構築物を含むプラスミドと共に植物プロトプラスト
は、高強度の電気パルスに晒される。この結果生体膜の
透過性の可逆的な増加を生じ、そして従ってプラスミド
を挿入することを可能とする。エレクトロボレーシコン
された植物プロトプラストは、それらの細胞壁を再生し
、分化し、そしてカルス組織を形成する。形質転換され
た植物細胞の選択は上記表机型マーカーによって行われ
得る。
伝子構築物を含むプラスミドと共に植物プロトプラスト
は、高強度の電気パルスに晒される。この結果生体膜の
透過性の可逆的な増加を生じ、そして従ってプラスミド
を挿入することを可能とする。エレクトロボレーシコン
された植物プロトプラストは、それらの細胞壁を再生し
、分化し、そしてカルス組織を形成する。形質転換され
た植物細胞の選択は上記表机型マーカーによって行われ
得る。
本発明の範囲内で特に好ましい植物細胞内に遺伝物質を
直接挿入するもう一つの方法は、ネグルチウ アイ、
（Ｎｅｇｒｕｔｉｕ １．）等、１９８７に記載されて
いる。
直接挿入するもう一つの方法は、ネグルチウ アイ、
（Ｎｅｇｒｕｔｉｕ １．）等、１９８７に記載されて
いる。
これは純粋に化学的な工程段階に基づく方法であり、そ
して非常に有効でそして迅速な形質転換を可能にする。
して非常に有効でそして迅速な形質転換を可能にする。
詳１ｉＢには、この方法は以下の段階から成る：・プロ
トプラストをあらゆる植物組織から分離し、そして所望
する場合には植物プロトプラストを培養するのに慣用の
栄養培地の１つの中で培養し： ・実際の形質転換の前に、該プロトプラストを４ないし
１０℃の温度で２０分ないし６時間、アルカリ土類金属
および／またはアルカリ金属カチオン、好ましくはＣａ
ｌ”、Ｋ１および／″！たはＮａ＋、および適当な炭素
源を含有する予備培養培地中で予備培養し； ・このプロトプラストを次に予備培養培地から分離し、
そしてＣａ２＋イオンが存在するか、または存在しない
、必値成分としてα１ないし６０蘭、好ましくは１０な
いし３０ｍＭのＭｇ２”イオンを含有する実際の形質転
換培地中に再懸濁し；−その後すぐに、植物体内で活性
な発現シグナルの制御下Ｉ／ｃある１種またはそれ以上
の遺伝子および支持ＤＮＡ （ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ
ＤＮＡ ） を含有するＤＮＡ試料を形質転換溶液に
添加し；・数秒ないし２０分後、好ましくはα１ないし
１０分後、影質膜を変性させる薬剤を添加し；・上記形
質転換溶液中でプロトプラスト内へのＤＮＡの取込みを
確実に行なう期間、プロトプラストおよびＤＮＡ試料を
培養し：そして・所望する場合には、完全な植物体を形
質転換されたプロトプラストから再生させる。
トプラストをあらゆる植物組織から分離し、そして所望
する場合には植物プロトプラストを培養するのに慣用の
栄養培地の１つの中で培養し： ・実際の形質転換の前に、該プロトプラストを４ないし
１０℃の温度で２０分ないし６時間、アルカリ土類金属
および／またはアルカリ金属カチオン、好ましくはＣａ
ｌ”、Ｋ１および／″！たはＮａ＋、および適当な炭素
源を含有する予備培養培地中で予備培養し； ・このプロトプラストを次に予備培養培地から分離し、
そしてＣａ２＋イオンが存在するか、または存在しない
、必値成分としてα１ないし６０蘭、好ましくは１０な
いし３０ｍＭのＭｇ２”イオンを含有する実際の形質転
換培地中に再懸濁し；−その後すぐに、植物体内で活性
な発現シグナルの制御下Ｉ／ｃある１種またはそれ以上
の遺伝子および支持ＤＮＡ （ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ
ＤＮＡ ） を含有するＤＮＡ試料を形質転換溶液に
添加し；・数秒ないし２０分後、好ましくはα１ないし
１０分後、影質膜を変性させる薬剤を添加し；・上記形
質転換溶液中でプロトプラスト内へのＤＮＡの取込みを
確実に行なう期間、プロトプラストおよびＤＮＡ試料を
培養し：そして・所望する場合には、完全な植物体を形
質転換されたプロトプラストから再生させる。
共形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ）
［シＢ−／チャー アール、ジエイ、 （８ｃｈｏｃ
ｈｅｒ ＲＪ、 ） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、
４ ： １０９３−１０９６．１９８６ ］ を用
いる直箒遺伝子移入は、本発明の範囲内で特に好ましい
。
［シＢ−／チャー アール、ジエイ、 （８ｃｈｏｃ
ｈｅｒ ＲＪ、 ） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、
４ ： １０９３−１０９６．１９８６ ］ を用
いる直箒遺伝子移入は、本発明の範囲内で特に好ましい
。
共形質転換は、植物ゲノム内に異なるＤＮＡ分子（選択
不可能および選択可能な遺伝子）の同時に起こる取込み
および組込みに基づき、そしてそれ故に選択不可能な遺
伝子で形質転換された細胞の配置を可能にする方法であ
る。
不可能および選択可能な遺伝子）の同時に起こる取込み
および組込みに基づき、そしてそれ故に選択不可能な遺
伝子で形質転換された細胞の配置を可能にする方法であ
る。
形質転換の可能な方法の例の上記リストは、完全である
と主張するものでなく、そして本発明の対象を何ら限定
するものではない。
と主張するものでなく、そして本発明の対象を何ら限定
するものではない。
それらのゲノム内に取込まれたバイブＩＪ ＋７ド遺伝
子構築物を含む、細胞クローンは、選択、スクリーニン
グおよび検出の慣用方法を用いて選択さね、そして遺伝
子導入植物体の再生のために使用される。
子構築物を含む、細胞クローンは、選択、スクリーニン
グおよび検出の慣用方法を用いて選択さね、そして遺伝
子導入植物体の再生のために使用される。
培養液に保たれたプロトプラストの完全な植物体ヘノ再
生は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅ１ｌ
Ｃｕ１−ｔｕｒｅ、１ ： １２４−１７６ （Ｍａ
ｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ。
生は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅ１ｌ
Ｃｕ１−ｔｕｒｅ、１ ： １２４−１７６ （Ｍａ
ｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ。
ニューヨーク、１９８３）の中のエバンス（Ｅｖａｎｓ
）等の「プロトプラスト分離および培養」：Ｐｒｏｔｏ
ｐｌａｓｔｓ 、 １９８５− ｖクチャ−プロシーデ
イ＞ゲス（Ｌｅｃｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
） 、第１９−２９頁（パークホイザー、バーゼル、１
９８３）の中の、：Ｚ ム、 ７− ｋ 、ダベイ（Ｍ
、Ｒ８Ｄａｖｅｙ ） （Ｄ ｒ植物プラストの培養お
よび再生における最近の発展」；Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
ｓ 、 １ ｑ ８３− Ｌ／クチャ−プロシーデイン
ゲス、第３１−４１頁（バークホイザー、バーゼル、１
９８３）の中のビー６ジエイ、ゾール（Ｐ。
）等の「プロトプラスト分離および培養」：Ｐｒｏｔｏ
ｐｌａｓｔｓ 、 １９８５− ｖクチャ−プロシーデ
イ＞ゲス（Ｌｅｃｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
） 、第１９−２９頁（パークホイザー、バーゼル、１
９８３）の中の、：Ｚ ム、 ７− ｋ 、ダベイ（Ｍ
、Ｒ８Ｄａｖｅｙ ） （Ｄ ｒ植物プラストの培養お
よび再生における最近の発展」；Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
ｓ 、 １ ｑ ８３− Ｌ／クチャ−プロシーデイン
ゲス、第３１−４１頁（バークホイザー、バーゼル、１
９８３）の中のビー６ジエイ、ゾール（Ｐ。
Ｊ、 Ｄａｌｅ ） の「穀物およびその他の操作困
難な作物のプロトプラスト培養および植物再生」：およ
び上ハ吐力可刺至狂、第２１−３７頁（ＣｆｔＣｐ ｒ
ｅｓｓ 、ポカ レイトン１９８５） の中のエイチ
。
難な作物のプロトプラスト培養および植物再生」：およ
び上ハ吐力可刺至狂、第２１−３７頁（ＣｆｔＣｐ ｒ
ｅｓｓ 、ポカ レイトン１９８５） の中のエイチ
。
パインディング（Ｈ，Ｂｉｎｄｉｎｇ ）の「植物の再
生」並びにボトリクス アイ、およびシルリットアール
、デ４ 、 （Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ、 ａｎｄ ５ｈ
ｉｌｌｉｔｏ Ｒ，Ｄ、）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚ ｍｏｌｏｇｙ、第１１８巻、ｐｌａｎｔＭｏ−１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、 ニー 、およびエイ
チ、バイスバッハ（Ａ、ａｎｄ Ｈ，Ｗｅｉｓｓｂａｃ
ｈ ） 輪、Ａｃａｄｅｍ ｉｃ Ｐｒｅｓｓ 。
生」並びにボトリクス アイ、およびシルリットアール
、デ４ 、 （Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ、 ａｎｄ ５ｈ
ｉｌｌｉｔｏ Ｒ，Ｄ、）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚ ｍｏｌｏｇｙ、第１１８巻、ｐｌａｎｔＭｏ−１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、 ニー 、およびエイ
チ、バイスバッハ（Ａ、ａｎｄ Ｈ，Ｗｅｉｓｓｂａｃ
ｈ ） 輪、Ａｃａｄｅｍ ｉｃ Ｐｒｅｓｓ 。
オルランド−１１９８６に記載されている。
・ 再生方法は植物の種毎に異なる。しかしながら、一
般にプロトプラストが刺激され、分化し、そして公知の
培地の１つ中に細胞壁を形成する。
般にプロトプラストが刺激され、分化し、そして公知の
培地の１つ中に細胞壁を形成する。
結果的にカルス培養体は、ある種の有効物質、例えばオ
ーキシンおよびサイトカイニンとの処理によシ根および
苗条を形成するように銹導され得る。
ーキシンおよびサイトカイニンとの処理によシ根および
苗条を形成するように銹導され得る。
その様に得られた小植物体は土壌に移すことができ、そ
して通常の実住と同様な方法でさらに栽培し得る。
して通常の実住と同様な方法でさらに栽培し得る。
効率の良い再生は、培地、遺伝子型および培養体のこれ
までの履歴に特に依存する。これら３つの変数が適当に
調節されるならば、再生は完全に行われ、そして反復可
能である。
までの履歴に特に依存する。これら３つの変数が適当に
調節されるならば、再生は完全に行われ、そして反復可
能である。
植物ゲノムの組込み成分として植物細胞内で発現可能な
上記ハイプリ＋７ド遺伝子構築物の構造遺伝子を含む再
生された遺伝子導入植物体は、好ましくは無菌苗条培養
体の形態で無性増殖される。
上記ハイプリ＋７ド遺伝子構築物の構造遺伝子を含む再
生された遺伝子導入植物体は、好ましくは無菌苗条培養
体の形態で無性増殖される。
再生された遺伝子導入植物体の植物ゲノム内に機能的な
発現可能遺伝子の安定な取込みは、組込まれた遺伝子の
***安定性および減数***の間のメンデル形質（Ｍｅｎ
ｄｅｌｉａｎ ｔｒａｉｔ ）に基ついて、並びに「サ
ザンプロット」分析〔サザンイー、 ｘ Ａ、（５ｏｕ
ｔｈｅｒｎ Ｅ、Ｍ、 ）、１９７５ ］ を用いて確
認される。
発現可能遺伝子の安定な取込みは、組込まれた遺伝子の
***安定性および減数***の間のメンデル形質（Ｍｅｎ
ｄｅｌｉａｎ ｔｒａｉｔ ）に基ついて、並びに「サ
ザンプロット」分析〔サザンイー、 ｘ Ａ、（５ｏｕ
ｔｈｅｒｎ Ｅ、Ｍ、 ）、１９７５ ］ を用いて確
認される。
従って本発明は、植物ゲノム内の予め決めることができ
る部位、特に、高い発現効率および制御されるべき有利
な能力を確実に得ることができる部位でのＤＮＡの指示
された組込みによる改良されたおよび／または所屋の特
性を有する遺伝子導入植物体の産性にも関する。
る部位、特に、高い発現効率および制御されるべき有利
な能力を確実に得ることができる部位でのＤＮＡの指示
された組込みによる改良されたおよび／または所屋の特
性を有する遺伝子導入植物体の産性にも関する。
本発明の広い概念内には、本発明の上記の方法を用いて
形質転換された遺伝子導入植物体並びに親植物の形質転
換で住する新規で望ましい時機（特性）を依然有するそ
れらの無性および／または有性の後代（ｐｒｏｇｅｎｙ
）も包含される。
形質転換された遺伝子導入植物体並びに親植物の形質転
換で住する新規で望ましい時機（特性）を依然有するそ
れらの無性および／または有性の後代（ｐｒｏｇｅｎｙ
）も包含される。
従って、［遺伝子導入植物体の無性および／または有性
の後代」の本発明の範囲内での定義は、公知の方法例え
ば細胞融合または突然変異選択により得ることができ、
そして形質転換された出発植物体の特徴を依然有するあ
らゆる突然変異体または変種並びに形質転換された植物
材料を含むあらゆるハイブリッド形成および融合産生物
をも包含する。
の後代」の本発明の範囲内での定義は、公知の方法例え
ば細胞融合または突然変異選択により得ることができ、
そして形質転換された出発植物体の特徴を依然有するあ
らゆる突然変異体または変種並びに形質転換された植物
材料を含むあらゆるハイブリッド形成および融合産生物
をも包含する。
本発明は遺伝子導入植物体のムカゴ（ｐｒｏｐａｇｕｌ
ｅ）にも関する。
ｅ）にも関する。
遺伝子導入植物体の「ムカゴ」は本発明の範囲内で有性
まだは無性の手段によシ、生体内または試験管内で増進
され得るあらゆる催物材料を包含すると理解すべきであ
る。プロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、種子
、胚、花粉、胚珠および接合子並びに遺伝子導入植物体
から得ることができるあらゆるその他の増殖材料が本発
明の範囲内で特に好ましい。
まだは無性の手段によシ、生体内または試験管内で増進
され得るあらゆる催物材料を包含すると理解すべきであ
る。プロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、種子
、胚、花粉、胚珠および接合子並びに遺伝子導入植物体
から得ることができるあらゆるその他の増殖材料が本発
明の範囲内で特に好ましい。
本発明はまた植物体の部分、本発明の方法を用いて、前
に形質転換された遺伝子導入植物体またはそれらの後代
から発生し、そしてこの様に少なくとも遺伝子導入細胞
から構築される例えば花、茎、果実、葉、根にも関する
。
に形質転換された遺伝子導入植物体またはそれらの後代
から発生し、そしてこの様に少なくとも遺伝子導入細胞
から構築される例えば花、茎、果実、葉、根にも関する
。
本発明の方法は、全ての植物体、特に彼子植物亜門およ
び裸子植物亜門の体系的な群に属するものの形質転換に
適当である。
び裸子植物亜門の体系的な群に属するものの形質転換に
適当である。
裸子植物亜門の中では球来植物綱の植物が特に興味深い
。
。
被子植物亜門の中では落葉樹および潅木に加えて、ナス
科、ジェウジバナ科、キク科、ユリ科、ブドウ科、アカ
ザ科、マツカゼンウ科、アリアセアエ科、ヒガンバナ科
、アスパラガセアエ科、ラン科、ヤシ科、アナナス科、
アカネ科、ツバキ科、バシ１つ科およびホモノ科、およ
びレグミノプエ目、および特にバビリオナセア工科の植
物が特に興味深い。ナス科、ジョウジバナ科およびホモ
ノ科の代表種が好ましい。
科、ジェウジバナ科、キク科、ユリ科、ブドウ科、アカ
ザ科、マツカゼンウ科、アリアセアエ科、ヒガンバナ科
、アスパラガセアエ科、ラン科、ヤシ科、アナナス科、
アカネ科、ツバキ科、バシ１つ科およびホモノ科、およ
びレグミノプエ目、および特にバビリオナセア工科の植
物が特に興味深い。ナス科、ジョウジバナ科およびホモ
ノ科の代表種が好ましい。
本発明の範囲内の標的作物は、例えばフラガリア（χｐ
ｌ狭ｉａ）、ロータス（−し社叶Ｊ、 メディケープ
（均剣９貌）、オノブリイキス（負帥α２」１）、トリ
ホリウム（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ） 、）リコネラ（Ｔ
ｒｉｇｏｎｅｌｌａ ）、ビグナ（Ｖｉｇｎａ ）、シ
トラス（Ｃｊ ｔｒｕｓ ）、リナム（Ｌｉｎｕｍ）、
ゲラニウム（Ｇｅ−ｒａｎｉｕｍ ）、マニホット（ｈ
ｉａｎｉｈｏｔ ） 、ドーカス（Ｄａｕｃｕｓ ）、
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏ ｓｉｓ ）、ブラ・
ソシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ）、ラフ了ヌス（Ｒ，ａｐ
ｈａｎｕｓ ）。
ｌ狭ｉａ）、ロータス（−し社叶Ｊ、 メディケープ
（均剣９貌）、オノブリイキス（負帥α２」１）、トリ
ホリウム（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ） 、）リコネラ（Ｔ
ｒｉｇｏｎｅｌｌａ ）、ビグナ（Ｖｉｇｎａ ）、シ
トラス（Ｃｊ ｔｒｕｓ ）、リナム（Ｌｉｎｕｍ）、
ゲラニウム（Ｇｅ−ｒａｎｉｕｍ ）、マニホット（ｈ
ｉａｎｉｈｏｔ ） 、ドーカス（Ｄａｕｃｕｓ ）、
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏ ｓｉｓ ）、ブラ・
ソシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ）、ラフ了ヌス（Ｒ，ａｐ
ｈａｎｕｓ ）。
シナビス（５ｉｎａｐｉｓ ）、アトロバ（Ａｔｒｏｐ
ａ ）、カプシカム（９皿世匹）、ダチーラ（Ｄａ想旦
）、ハイオシアムス（ｋ旦庶邦−）、リコベルシコン（
Ｌｙｃｏ ｅｒｓｉｃｏｎ ）、ニコチアナ（Ｎ１ｃｏ
ｔｉａｎａ ）、ノラヌＡ （−８ｏｌａｎｕｍ ）、
ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ジキタ’Ｊス（Ｄｉ且
伏社耶−）、マジョラナ（Ｒａａｊｏｒａｎａ ）、シ
コリウム（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ）、ヘリ アンタ ス
（千Ｊｅｌｉａｎ二丑監）、ラクチーカ（Ｌａｃｔｕ
ｃａ ）、グロムス０江肚ユ竪）１、アスパラガス（戊
□□□囚貫色）、アンチリヌム（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕ
ｍ ）、ヘメロカリス（）Ｉｅｍｅｒｏ−ｃａｌｌｉｓ
）、ネメシア（Ｎｅｍｅｓｉａ ）、ベラルゴニウＡ
（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ）、バニカム（７、ベン−
＝−セｐ ム（、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ）、ラヌンヵ
ルス（Ｒａｎｕｎ−９赳Ｓ）、セネシオ（−違狙虹肋つ
、サルビグローｌシス（Ｓａｌ １ｇ１ｏｓｓｉｓ ）
、ククミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ）、 プロワリア（Ｂｒ
ｏｗａｌ ｊｉａ ）、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｔつ、
ロリウム（−目、ゼア（Ｚｅａ ）、トリチカム（Ｔｒ
ｉｔｉｃｕｍ ）およびンルガＡ （８ｏｒｇｈｕｍ
）からなる群から選択されるものを含み、イボモニア（
Ｉｐｏｍｏｅａ ）、パッジフローラ（、ｐａｓｓｉｆ
Ｊｏｒａ ）、シクラメン（Ｃｙｃｌａｍｅｎ ）、？
ルス（、Ｊ４．ａｊｕｓ ）、フ。
ａ ）、カプシカム（９皿世匹）、ダチーラ（Ｄａ想旦
）、ハイオシアムス（ｋ旦庶邦−）、リコベルシコン（
Ｌｙｃｏ ｅｒｓｉｃｏｎ ）、ニコチアナ（Ｎ１ｃｏ
ｔｉａｎａ ）、ノラヌＡ （−８ｏｌａｎｕｍ ）、
ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ジキタ’Ｊス（Ｄｉ且
伏社耶−）、マジョラナ（Ｒａａｊｏｒａｎａ ）、シ
コリウム（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ）、ヘリ アンタ ス
（千Ｊｅｌｉａｎ二丑監）、ラクチーカ（Ｌａｃｔｕ
ｃａ ）、グロムス０江肚ユ竪）１、アスパラガス（戊
□□□囚貫色）、アンチリヌム（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕ
ｍ ）、ヘメロカリス（）Ｉｅｍｅｒｏ−ｃａｌｌｉｓ
）、ネメシア（Ｎｅｍｅｓｉａ ）、ベラルゴニウＡ
（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ）、バニカム（７、ベン−
＝−セｐ ム（、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ）、ラヌンヵ
ルス（Ｒａｎｕｎ−９赳Ｓ）、セネシオ（−違狙虹肋つ
、サルビグローｌシス（Ｓａｌ １ｇ１ｏｓｓｉｓ ）
、ククミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ）、 プロワリア（Ｂｒ
ｏｗａｌ ｊｉａ ）、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｔつ、
ロリウム（−目、ゼア（Ｚｅａ ）、トリチカム（Ｔｒ
ｉｔｉｃｕｍ ）およびンルガＡ （８ｏｒｇｈｕｍ
）からなる群から選択されるものを含み、イボモニア（
Ｉｐｏｍｏｅａ ）、パッジフローラ（、ｐａｓｓｉｆ
Ｊｏｒａ ）、シクラメン（Ｃｙｃｌａｍｅｎ ）、？
ルス（、Ｊ４．ａｊｕｓ ）、フ。
ルナス（Ｐｒｕｎｕｓ ）、ローザ（Ｒｏｓａ ）、化
ジス０七調す、ボブラス（Ｐｏｐｕｌｕｓ ）、ブンタ
ラム（田虹ｔａｌｕｍ ）、アリウ、４（Ａｌｌｉｕｍ
）、リリクＡ（、Ｌｉ１ｉ−町）、ナＡ／ シーｙ ス
（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ） 、アナナス（Ａｎａ−叩、
アラキス（Ａｒａｃｈｉｓ ）、ファセオルスリを５ｅ
ｏｌｕｓ ）およびビ丈Ａ （Ｐｉｓｕｍ ） から
なる群から選択されるものも含む。
ジス０七調す、ボブラス（Ｐｏｐｕｌｕｓ ）、ブンタ
ラム（田虹ｔａｌｕｍ ）、アリウ、４（Ａｌｌｉｕｍ
）、リリクＡ（、Ｌｉ１ｉ−町）、ナＡ／ シーｙ ス
（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ） 、アナナス（Ａｎａ−叩、
アラキス（Ａｒａｃｈｉｓ ）、ファセオルスリを５ｅ
ｏｌｕｓ ）およびビ丈Ａ （Ｐｉｓｕｍ ） から
なる群から選択されるものも含む。
植物の試験管内での栽培の分野１、特に植物再生の領域
における新しい発展の結果として、植物プロトプラスト
から出発して、ホモノ科の代表種の場合でさえも全体の
植物体を再生することが可能となっている。ホモノ科で
の成功した再生の実験の例は、とりわけアブドウラー
ア−／ｌ／、 （Ａｂｄｕｌｌａｈ、 Ｒ９）等、Ｂｉ
ｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ 、 ４ ：１０８７−１０
９０．．１９Ｂ６．フジムラ ティー。
における新しい発展の結果として、植物プロトプラスト
から出発して、ホモノ科の代表種の場合でさえも全体の
植物体を再生することが可能となっている。ホモノ科で
の成功した再生の実験の例は、とりわけアブドウラー
ア−／ｌ／、 （Ａｂｄｕｌｌａｈ、 Ｒ９）等、Ｂｉ
ｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ 、 ４ ：１０８７−１０
９０．．１９Ｂ６．フジムラ ティー。
（Ｆｕｊ 該ｕｒａ 、Ｔ、 ） 、等、Ｐｌａｎｔ
Ｔｉ５ｓｕｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ」痘ｕ１主： ７４−７
５．．１９８５．）リャマ ケイ。
Ｔｉ５ｓｕｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ」痘ｕ１主： ７４−７
５．．１９８５．）リャマ ケイ。
（Ｔｏｒｉｙａｍａ、に、） 、等、Ｔｈｅｏｒ Ａ
Ｉ Ｇｅｎｅｔ、 ７３ ：１６−１９．１９Ｂ６．
ヤマダ ワイ、 （Ｔａｍａｄａ、 Ｙ、）等、Ｐｌａ
ｎｔ Ｃｅ１ｌ Ｒｅ 、、 ５ ： ８５−８８．１
９８６ （イネ）、そしてトウモロコシプロトプラス
トの例はロープ：Ｌ （Ｐｈｏｄｅｓ 、）等、Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 ６ ：５６−５９．１９８８
に記載されている。
Ｉ Ｇｅｎｅｔ、 ７３ ：１６−１９．１９Ｂ６．
ヤマダ ワイ、 （Ｔａｍａｄａ、 Ｙ、）等、Ｐｌａ
ｎｔ Ｃｅ１ｌ Ｒｅ 、、 ５ ： ８５−８８．１
９８６ （イネ）、そしてトウモロコシプロトプラス
トの例はロープ：Ｌ （Ｐｈｏｄｅｓ 、）等、Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 ６ ：５６−５９．１９８８
に記載されている。
それ故に以下の植物を使用することも本発明の範囲内で
可能である：ロリウム、ゼア、トリチカム、ツルガム、
サツカルム、プロムス、オリザエ、アベナ、ホルデウム
、セカーレおよびセタリア。
可能である：ロリウム、ゼア、トリチカム、ツルガム、
サツカルム、プロムス、オリザエ、アベナ、ホルデウム
、セカーレおよびセタリア。
形質転換された植物細胞から栽培された成熟植物体は種
子製造の目的でそれら自体で交配される。種子のいくつ
かは、うちたてられた遺伝法則に正確に従う比率で有用
で所望の特性をコードする遺伝子を含有する。これらの
種子は遺伝子導入植物体の製造のために使用し得る。
子製造の目的でそれら自体で交配される。種子のいくつ
かは、うちたてられた遺伝法則に正確に従う比率で有用
で所望の特性をコードする遺伝子を含有する。これらの
種子は遺伝子導入植物体の製造のために使用し得る。
同型接合系は、反復自家受精および近文系の製造により
得られうる。これらの近文系は次に今度はハイブリッド
の発注のために用いられ得る。この方法において、外来
遺伝子を含む近文系は、製造の目的でもう一つの近交系
と交配させる。
得られうる。これらの近文系は次に今度はハイブリッド
の発注のために用いられ得る。この方法において、外来
遺伝子を含む近文系は、製造の目的でもう一つの近交系
と交配させる。
本発明の一般的な記載の後により良い理解のために、説
明の目的で特定の実施例を記載するが、これらはそのよ
うに明記しないが本発明の性質を限定するものではない
。
明の目的で特定の実施例を記載するが、これらはそのよ
うに明記しないが本発明の性質を限定するものではない
。
一般的な組換えＤＮＡ法
本発明において用いられる組換えＤＮＡ技術の多くは当
業者にとって決まりきった仕事であるので、これらの普
通に用いられる方法の簡潔な記載は、それらが出てくる
文献の指摘よシもむしろ本明Ｉａ書に含められる。特に
記載した本のを除いて、これらの方法の全てはマニアチ
ス等（１９８２年）による参考文献内に記載されている
。
業者にとって決まりきった仕事であるので、これらの普
通に用いられる方法の簡潔な記載は、それらが出てくる
文献の指摘よシもむしろ本明Ｉａ書に含められる。特に
記載した本のを除いて、これらの方法の全てはマニアチ
ス等（１９８２年）による参考文献内に記載されている
。
反応混合物は典型的には、マサチューセッツ、ビバシー
のニューイングランドバイオラプス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ）社により推奨される緩衝液
巾約５ｏ−ｓｏｏμｙ／ｄのＤＮＡを含不する。
のニューイングランドバイオラプス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ）社により推奨される緩衝液
巾約５ｏ−ｓｏｏμｙ／ｄのＤＮＡを含不する。
制限エンドヌクレアーゼ２−５単位をＤＮＡ １μＩ
につき添加し、そして反応混合物を前記の会社により推
奨される温度で１ないし３時間培養する。６５℃で１０
分間加熱するかまはフェノールでの抽出により反応を終
結させ、エタノールでＤＮＡを沈殿させる。こ、の方法
はマニアチス等の文献の第１０４−１０６頁にも記載さ
れている。
につき添加し、そして反応混合物を前記の会社により推
奨される温度で１ないし３時間培養する。６５℃で１０
分間加熱するかまはフェノールでの抽出により反応を終
結させ、エタノールでＤＮＡを沈殿させる。こ、の方法
はマニアチス等の文献の第１０４−１０６頁にも記載さ
れている。
ＤＮＡ断片を反応混合物に５０−５００μｇ／ｌＬｔで
、ニエーイングランド バイオラプス社により推奨され
る緩衝液中に添加する。反応混合物は全て４種のデオキ
シヌクレオチドトリホスフェートを（１２ｍＭの濃度で
含有する。反応を１５℃で３０分間培養し、そして次に
６５℃に１０分間加熱することによシ終結させる。５′
−粘着端を製造する制限エンドヌクレアーゼ例えばＥｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩでの切断により製造される断片
のためには、ＤＮＡポリメラーゼの大断片またはクレノ
ー断片が使用される。
、ニエーイングランド バイオラプス社により推奨され
る緩衝液中に添加する。反応混合物は全て４種のデオキ
シヌクレオチドトリホスフェートを（１２ｍＭの濃度で
含有する。反応を１５℃で３０分間培養し、そして次に
６５℃に１０分間加熱することによシ終結させる。５′
−粘着端を製造する制限エンドヌクレアーゼ例えばＥｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩでの切断により製造される断片
のためには、ＤＮＡポリメラーゼの大断片またはクレノ
ー断片が使用される。
３′−粘着端を製造するエンドヌクレアーゼ例えばＰｓ
ｔ ＩおよびＳａｃ Ｉによシ製造される断片のために
はＴ４ＤＮＡポリメラーゼが使用される。
ｔ ＩおよびＳａｃ Ｉによシ製造される断片のために
はＴ４ＤＮＡポリメラーゼが使用される。
これらの２つの酵素の使用はマニアチス等の文献の第１
１３−１２１頁に記載されている。
１３−１２１頁に記載されている。
アガロースゲル電気泳動をマニアチス等の第１５０−１
６３頁に記載のように水平型装置で行なう。使用される
緩衝液はその中に記載されているトリス−硼酸塩緩衝液
である。ＤＮＡ断片は、電気泳動の間にゲルまたはタン
ク緩衝液に存在するか、または電気泳動に続いて添加さ
れた０５μｇ／Ｉｌｌ臭化エチジウムで染色される。Ｄ
ＮＡ を長波長の紫外線の照射によシ視覚化する。断片
をゲルから分離しない場合には、低い温度でゲル化する
アガロースが使用され、これはミズーリ セントルイス
のシグマケミカル（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ ）か
ら得られる。 電気泳動後、望ましい断片を削シ取り、
プラスチック管内に入れ、約１５分間６５℃に加熱し、
次いでフェノールで３度抽出し、エタノールで２度沈殿
させる。この方法はマニアチス等の文献の第１７０頁に
記載されたものとはわずかに異っている。
６３頁に記載のように水平型装置で行なう。使用される
緩衝液はその中に記載されているトリス−硼酸塩緩衝液
である。ＤＮＡ断片は、電気泳動の間にゲルまたはタン
ク緩衝液に存在するか、または電気泳動に続いて添加さ
れた０５μｇ／Ｉｌｌ臭化エチジウムで染色される。Ｄ
ＮＡ を長波長の紫外線の照射によシ視覚化する。断片
をゲルから分離しない場合には、低い温度でゲル化する
アガロースが使用され、これはミズーリ セントルイス
のシグマケミカル（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ ）か
ら得られる。 電気泳動後、望ましい断片を削シ取り、
プラスチック管内に入れ、約１５分間６５℃に加熱し、
次いでフェノールで３度抽出し、エタノールで２度沈殿
させる。この方法はマニアチス等の文献の第１７０頁に
記載されたものとはわずかに異っている。
また、ＤＮＡはシーンクリーンキー７ ト（Ｇｅｎｅｃ
ｌｅａｎＫｉｔ）［米国、カリフォルニア ラヨーラの
バイ第１０１社］を用いてアガロースから分離し得る。
ｌｅａｎＫｉｔ）［米国、カリフォルニア ラヨーラの
バイ第１０１社］を用いてアガロースから分離し得る。
Ｄ、ＤＮＡ末端への合成リンカ−断片の付加ＤＮＡ分子
の末端への新規なエンドヌクレアーゼ切断部位を添加す
ることが望ましい場合、上記文献に記載されているよう
にプラント末端を製造するためにまずＤＮＡポリメラー
ゼで処理する。この断沖釣α１−１．０μｇを、ニュー
イングランドバイオラプスから得られるホスホリル化リ
ンカ−ＤＮＡ約１０μｓに、ニューイングランドバイオ
ラプスからのＴ４ＤＮＡリガーゼ ２μｌおよび前記の
会社により推奨される緩衝液中ｔ７） １ ｍＭ ＡＴ
Ｐを含有する２０−３０μ／容量中で添加する。１５℃
で一晩培養後、混合物を６５℃で１０分間加熱すること
により反応を終結させる。反応混合物を次に、合ｇＩＪ
ンカー配列を切断する制限エンドヌクレアーゼに適当な
緩衝液中に約１００μｌに希釈する。そしてこれに、こ
のエンドヌクレアーゼ約５０−２００単位を添加する。
の末端への新規なエンドヌクレアーゼ切断部位を添加す
ることが望ましい場合、上記文献に記載されているよう
にプラント末端を製造するためにまずＤＮＡポリメラー
ゼで処理する。この断沖釣α１−１．０μｇを、ニュー
イングランドバイオラプスから得られるホスホリル化リ
ンカ−ＤＮＡ約１０μｓに、ニューイングランドバイオ
ラプスからのＴ４ＤＮＡリガーゼ ２μｌおよび前記の
会社により推奨される緩衝液中ｔ７） １ ｍＭ ＡＴ
Ｐを含有する２０−３０μ／容量中で添加する。１５℃
で一晩培養後、混合物を６５℃で１０分間加熱すること
により反応を終結させる。反応混合物を次に、合ｇＩＪ
ンカー配列を切断する制限エンドヌクレアーゼに適当な
緩衝液中に約１００μｌに希釈する。そしてこれに、こ
のエンドヌクレアーゼ約５０−２００単位を添加する。
混合物を適温で２−６時間培養し、次に断片をアガロー
スゲル電気泳動に供し、そして上記のように断片を分離
する。生成した断片は今では、制限エンドヌクレアーゼ
での切断により製造された末端を有するであろう。これ
らの末端は通常粘着性であり、その結果、生成した断片
は同じような粘着端を有するその他の断片に容易に連結
され得る。
スゲル電気泳動に供し、そして上記のように断片を分離
する。生成した断片は今では、制限エンドヌクレアーゼ
での切断により製造された末端を有するであろう。これ
らの末端は通常粘着性であり、その結果、生成した断片
は同じような粘着端を有するその他の断片に容易に連結
され得る。
Ｅ、 ＤＮＡ断片からの５′末端のホスフェートの除
去 プラスミドクローニング工程の間に、プラスミドベクタ
ーのホスファターゼでの処理は、ベクターの再循環化を
減少させる（マニアチス等の文献の第１３頁に記載され
ている）。適当な制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを切
断した後、マンハイムのベーリンガーーマンノ１イム（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅ該 ）から得られ
る仔ウシ消化管のアルカリホスフ丁ターゼ１単位を添加
す。
去 プラスミドクローニング工程の間に、プラスミドベクタ
ーのホスファターゼでの処理は、ベクターの再循環化を
減少させる（マニアチス等の文献の第１３頁に記載され
ている）。適当な制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを切
断した後、マンハイムのベーリンガーーマンノ１イム（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅ該 ）から得られ
る仔ウシ消化管のアルカリホスフ丁ターゼ１単位を添加
す。
る。ＤＮＡを５７℃で１時間培養し、そして次いでフェ
ノールで２度抽出し、そしてエタノールで沈殿させる。
ノールで２度抽出し、そしてエタノールで沈殿させる。
Ｆ、 ＤＮＡ断片の連結
相補的な粘着端を有する断片をお互いに結合させる場合
、各々の断片的１１００ｎは、ニー−イングランドバイ
オラプスからのＴａＤＮＡリガーゼ約α２単位をこの会
社により推奨される緩衝液中に含有する２０−４０μｌ
の反応混合物中で培養される。培養は１−２０時間１５
℃で行なう。プラント末端を有するＤＮＡ断片が結合さ
れる場合、それらはＴ４ ＤＮＡ ＩＪガーゼの量を
２−４単位に増加させる以外は上記と同様に培養される
。
、各々の断片的１１００ｎは、ニー−イングランドバイ
オラプスからのＴａＤＮＡリガーゼ約α２単位をこの会
社により推奨される緩衝液中に含有する２０−４０μｌ
の反応混合物中で培養される。培養は１−２０時間１５
℃で行なう。プラント末端を有するＤＮＡ断片が結合さ
れる場合、それらはＴ４ ＤＮＡ ＩＪガーゼの量を
２−４単位に増加させる以外は上記と同様に培養される
。
Ｇ、ＤＮＡの大腸菌内への形質転換
大腸菌Ｈ８１０１株が多くの実験に使用されている。マ
ニアチス等の文献の第２５０−２５１頁に記載されてい
る塩化カルシウム法を用いてＤＮＡを大腸菌内に導入す
る。
ニアチス等の文献の第２５０−２５１頁に記載されてい
る塩化カルシウム法を用いてＤＮＡを大腸菌内に導入す
る。
Ｈ，プラスミドのための大腸菌のスクリニーング
形質転換の後に、大腸菌の生成したコロニーを、ラビッ
トプラスミド（ｒａｐｉｄ ｐｌａｓｍｉｄ ）分離法
により所望のプラスミドの存在を求めて試険する。 ２
￥？！、の慣用の方法はマニアニチス等の文献の第３６
６−３６９頁に記載されている。
トプラスミド（ｒａｐｉｄ ｐｌａｓｍｉｄ ）分離法
により所望のプラスミドの存在を求めて試険する。 ２
￥？！、の慣用の方法はマニアニチス等の文献の第３６
６−３６９頁に記載されている。
■、プラスミドＤＮＡの大規模々分離
大腸菌内からのプラスミドの大規模な分離の方法は、マ
ニアチス等の文献の第８８−９４頁に記載されている。
ニアチス等の文献の第８８−９４頁に記載されている。
Ｊ０Ｍ１３ファージベクター内へのクローニング以下の
記載において、フ丁−ジＭ１３誘導体の二重鎖複製型分
子は決まりきった方法例えば制限エンドヌクレアーゼで
の切断、連結、その他のために用いらする。
記載において、フ丁−ジＭ１３誘導体の二重鎖複製型分
子は決まりきった方法例えば制限エンドヌクレアーゼで
の切断、連結、その他のために用いらする。
記載がなければ、＃索はベーリンガー、バイオラプス（
Ｂ［、）から得ることができる。それらは、それと異な
って特に記載がなければ、製造者の指示に従って使用さ
れる。
Ｂ［、）から得ることができる。それらは、それと異な
って特に記載がなければ、製造者の指示に従って使用さ
れる。
実施例１ニブラスミドｐＡＢＤＩの構築自由に利用可能
なプラスミドｐｋｍ２１およびｐｋｍ２４４〔ベック
イー、 （Ｂｅｃｋ、 Ｅ、）等、Ｇｅｎｅ旦、 ３２
７−３３６ （１９８２）］を制限エンドヌクレアーゼ
ｐｓｔ Ｉで切断する。 組換えに使用されるプラスミ
ド断片を［１８％アガロースゲル内で電気泳動により精
製する。べ−１り等のＧｅｎｅ且、５２７−５５６ （
１９Ｂ２）に記載されるように、その断片を結合して生
ずるプラスミドｐｋｍ２１２４４は、ＮＰＴ−Ｉ遺伝子
の５′−および３′−Ｂａ１３１欠失の組合せを含有す
る。カリフラワーモザイクウィルスのプロモーターシグ
ナルとプラスミドｐｋｍ２１２４４の）ｌｉｎｄ ｌ断
片とを結合するために、カーノブリングプラスミドｐ
Ｊ ＰＡ Ｘを構築する。カップリングプラスミドｐＪ
ＰＡＸはプラスミドｐＵＣ８とｐＵＣ９から得られる〔
メッシング、ジェイ、およびジエイ、ビエイラ（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ、 Ｊ、 ａｎｄ Ｊ、Ｖｉｅｉｒａ ） 、
Ｇｅｎｅ １９ 。
なプラスミドｐｋｍ２１およびｐｋｍ２４４〔ベック
イー、 （Ｂｅｃｋ、 Ｅ、）等、Ｇｅｎｅ旦、 ３２
７−３３６ （１９８２）］を制限エンドヌクレアーゼ
ｐｓｔ Ｉで切断する。 組換えに使用されるプラスミ
ド断片を［１８％アガロースゲル内で電気泳動により精
製する。べ−１り等のＧｅｎｅ且、５２７−５５６ （
１９Ｂ２）に記載されるように、その断片を結合して生
ずるプラスミドｐｋｍ２１２４４は、ＮＰＴ−Ｉ遺伝子
の５′−および３′−Ｂａ１３１欠失の組合せを含有す
る。カリフラワーモザイクウィルスのプロモーターシグ
ナルとプラスミドｐｋｍ２１２４４の）ｌｉｎｄ ｌ断
片とを結合するために、カーノブリングプラスミドｐ
Ｊ ＰＡ Ｘを構築する。カップリングプラスミドｐＪ
ＰＡＸはプラスミドｐＵＣ８とｐＵＣ９から得られる〔
メッシング、ジェイ、およびジエイ、ビエイラ（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ、 Ｊ、 ａｎｄ Ｊ、Ｖｉｅｉｒａ ） 、
Ｇｅｎｅ １９ 。
２６９−２７６ （１９８２））。プラスミドｐＵＣ９
のカップリング配列１０塩基対を、Ｂｉｎｄ Ｉと８ａ
ｌ工部位での切断により分離し、そして引き続きポリメ
ラーゼ−■−クレノー断片〔ジャコブノン、エイチ、
（Ｊａｃｏｂｓｅｎ 、 Ｈ，） 、等、Ｅｕｒ、 Ｊ
。
のカップリング配列１０塩基対を、Ｂｉｎｄ Ｉと８ａ
ｌ工部位での切断により分離し、そして引き続きポリメ
ラーゼ−■−クレノー断片〔ジャコブノン、エイチ、
（Ｊａｃｏｂｓｅｎ 、 Ｈ，） 、等、Ｅｕｒ、 Ｊ
。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、±Ｌ ６２３．（１９７４））を用い
て粘着端を製造し、そしてポリヌクレオチド鎖を結合し
、それによってＨｉｎｄ Ｈ部位を再び製造する。
て粘着端を製造し、そしてポリヌクレオチド鎖を結合し
、それによってＨｉｎｄ Ｈ部位を再び製造する。
８塩基対の合成カップリング要素（Ｘｈｏ Ｉ ）を、
分離したカフブリング配列の３ｍａ １部位に挿入する
。プラスミドｐＵＣ８と改変プラスミド、ＵＣ９の適当
なＸａｒ ｌとＨｉｎｄ Ｉ断片の組換えは、次々と続
く以下の制限部位： ＥｃｏＲｌ 、 Ｓｍａ Ｉ 。
分離したカフブリング配列の３ｍａ １部位に挿入する
。プラスミドｐＵＣ８と改変プラスミド、ＵＣ９の適当
なＸａｒ ｌとＨｉｎｄ Ｉ断片の組換えは、次々と続
く以下の制限部位： ＥｃｏＲｌ 、 Ｓｍａ Ｉ 。
ＢａｍＨＩ 、 Ｓａｌ Ｉ 、 Ｐｓｔ Ｉ 、 Ｈ
ｉｎｄ Ｉ 、 ＢａｍＨＩ 。
ｉｎｄ Ｉ 、 ＢａｍＨＩ 。
Ｘｈｏ ＩおよびＥＣ０ＲＩを有する部分的に非対称の
カップリング配列を有するプラスミドｐＪＰＡＸを製造
する。ＮＰＴ−ＩＩ構造遺云子に結合しているＣ ａＭ
Ｖ遺伝遺伝プロモーター領域は、ＣａＭＶＣＭ４−１８
４株、ＣａＭＶ ＣＭ １８４１株の変種のゲノムに由
来し、その完全なヌクレオチド配列は、ガードナー ７
− ／ｌ／ 、シー、 （Ｇａｒｄｎｅｒ Ｒ，Ｃ，）
等、１９８１に記載されている。ＣａＭＶプロモーター
領域を６ｋｂコスミドＩ）ＨＣ７９、大腸菌プラスミド
ｐＢ）Ｌ ３２２の誘尋体〔ホーン ピー、およびコリ
ンズ ジェイ、（Ｈｏｈｎ Ｂ ａｎｄ Ｃｏｆｆ１ｎ
ｓ Ｊ、）。
カップリング配列を有するプラスミドｐＪＰＡＸを製造
する。ＮＰＴ−ＩＩ構造遺云子に結合しているＣ ａＭ
Ｖ遺伝遺伝プロモーター領域は、ＣａＭＶＣＭ４−１８
４株、ＣａＭＶ ＣＭ １８４１株の変種のゲノムに由
来し、その完全なヌクレオチド配列は、ガードナー ７
− ／ｌ／ 、シー、 （Ｇａｒｄｎｅｒ Ｒ，Ｃ，）
等、１９８１に記載されている。ＣａＭＶプロモーター
領域を６ｋｂコスミドＩ）ＨＣ７９、大腸菌プラスミド
ｐＢ）Ｌ ３２２の誘尋体〔ホーン ピー、およびコリ
ンズ ジェイ、（Ｈｏｈｎ Ｂ ａｎｄ Ｃｏｆｆ１ｎ
ｓ Ｊ、）。
１９８０）内にクローン化し、ＣａＭＶゲノムとコスミ
ドｐＨＣ７９をＢｓｔ ｌで切断し、そして生成する断
片をお互いに連結させる。カリフラワーモザイクウィル
ス遺伝子■およびＮＰＴ−１１遣云子の）ｌｉｎｄｌ断
片の５′発現シグナルをプラスミドｐ Ｊ ＰＡＸ内で
Ｐｓｔ １部位とＨｉｎｄ１部位との間のカリフラワー
モザイクウィルス遺伝子■のプロモーター領域を挿入す
ることにより結合させる。
ドｐＨＣ７９をＢｓｔ ｌで切断し、そして生成する断
片をお互いに連結させる。カリフラワーモザイクウィル
ス遺伝子■およびＮＰＴ−１１遣云子の）ｌｉｎｄｌ断
片の５′発現シグナルをプラスミドｐ Ｊ ＰＡＸ内で
Ｐｓｔ １部位とＨｉｎｄ１部位との間のカリフラワー
モザイクウィルス遺伝子■のプロモーター領域を挿入す
ることにより結合させる。
生成するプラスミドを単一のＨｉｎｄ１部位で切断し、
そしてプラスミドｐｋｍ２１２４４のＨｉｎｄｌ断片を
、この切断部位内に、両方向に取込ませ、プラスミドｐ
Ｊ ＰＡ Ｘ Ｃａｋｍ＋およびｐＪＰＡＸＣａ ｋｍ
−を生成する。ＮＰＴ−１ｔハイブリツド遺伝子の３′
末端の近傍にＥｃｏ ＲＶ配列を製造するために、プラ
スミドｐＪＰＡＸ Ｃａｋｍ” （７） ＢａｍＨＩ断
片をプラスミドｐＢＲ３２７のＢａｍＨＩ 部位内に挿
入する〔ンベロン、エックス（５ｏｌ）ｅｒｏｎ、 Ｘ
）等、Ｇｅｎｅ９．２８７−３０５（１９８０）］。
そしてプラスミドｐｋｍ２１２４４のＨｉｎｄｌ断片を
、この切断部位内に、両方向に取込ませ、プラスミドｐ
Ｊ ＰＡ Ｘ Ｃａｋｍ＋およびｐＪＰＡＸＣａ ｋｍ
−を生成する。ＮＰＴ−１ｔハイブリツド遺伝子の３′
末端の近傍にＥｃｏ ＲＶ配列を製造するために、プラ
スミドｐＪＰＡＸ Ｃａｋｍ” （７） ＢａｍＨＩ断
片をプラスミドｐＢＲ３２７のＢａｍＨＩ 部位内に挿
入する〔ンベロン、エックス（５ｏｌ）ｅｒｏｎ、 Ｘ
）等、Ｇｅｎｅ９．２８７−３０５（１９８０）］。
プラスミドｐＢＲ３２７Ｃａｋｍを得る。新規なＤＮＡ
ｉＪ築物を含むプラスミドｐＢＲ５２７ＣａｋｍのＥｃ
ｏＲＶ断片は、プラスミドｐＵＣＢ内のＳａｌ Ｉ部位
でクローン化されたカリフラワーモザイクウィルス遺伝
子■のＥｃｏＲＶ領域を置換するために使用され、その
結果としてＮＰＴ−Ｉｆ遺伝子のタンパク質コード化Ｄ
ＮＡ配列はカリフラワーモザイクウィルス遺伝子■の５
′−および３′−発現シグナルの制御下にある。そのよ
うにして製造されたプラスミドはＩ）ＡＢＤＩおよびｐ
ＡＢＤ Ｉと記載される（第１図参照）。
ｉＪ築物を含むプラスミドｐＢＲ５２７ＣａｋｍのＥｃ
ｏＲＶ断片は、プラスミドｐＵＣＢ内のＳａｌ Ｉ部位
でクローン化されたカリフラワーモザイクウィルス遺伝
子■のＥｃｏＲＶ領域を置換するために使用され、その
結果としてＮＰＴ−Ｉｆ遺伝子のタンパク質コード化Ｄ
ＮＡ配列はカリフラワーモザイクウィルス遺伝子■の５
′−および３′−発現シグナルの制御下にある。そのよ
うにして製造されたプラスミドはＩ）ＡＢＤＩおよびｐ
ＡＢＤ Ｉと記載される（第１図参照）。
実施例２ニブラスミドｐＨＰ２ ｓ ｉの構築プラスミ
ドｐＨＰ ２３の構築は、ＡＰＨ（３’）ＩＩ構造遺云
子およびＣａＭＶの１ｑ Ｓ Ｒ，ＮＡプロモーター配
列の一部を含むプラスミドｐＡＢＤＩのＥｃｏＲ，Ｖ断
片をプラスミドｐＤＨ５１のＳｍａ Ｉ部位に挿入する
ことにより行われる（第２図参照）。
ドｐＨＰ ２３の構築は、ＡＰＨ（３’）ＩＩ構造遺云
子およびＣａＭＶの１ｑ Ｓ Ｒ，ＮＡプロモーター配
列の一部を含むプラスミドｐＡＢＤＩのＥｃｏＲ，Ｖ断
片をプラスミドｐＤＨ５１のＳｍａ Ｉ部位に挿入する
ことにより行われる（第２図参照）。
プラスミドｐＤＨ５１はビニトルラアク（Ｐｉｅ−ｔｒ
ｚａｋ ）等、１９８６に記載されている。このプラス
ミドは、多くのクローニング部位を含む挿入されたポリ
リンカー領域により分離される、５５Ｂプロモーター領
域およびＣａＭＶのターミネータ−領域を含む。
ｚａｋ ）等、１９８６に記載されている。このプラス
ミドは、多くのクローニング部位を含む挿入されたポリ
リンカー領域により分離される、５５Ｂプロモーター領
域およびＣａＭＶのターミネータ−領域を含む。
３５８プロモーター／ターミネータ−領域に用いられる
出発材料は、ＣａＭＶ”Ｓ”のＳｃａ Ｉ断片テアリ、
これは遺伝子地図のヌクレオチードロ８０８−７６５２
を包含し〔フランク ジー、 （ＦｒａｎｋＧ、）、
Ｃｅ１ｌ、 ２１ ： ２８５−２９４．１９８０ ）
、ソＬテｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位内に挿入されて〔ナ
ランダー ジェイ、 （Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ Ｊ、 ）
等、０ｅｎｅ、２６：。
出発材料は、ＣａＭＶ”Ｓ”のＳｃａ Ｉ断片テアリ、
これは遺伝子地図のヌクレオチードロ８０８−７６５２
を包含し〔フランク ジー、 （ＦｒａｎｋＧ、）、
Ｃｅ１ｌ、 ２１ ： ２８５−２９４．１９８０ ）
、ソＬテｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位内に挿入されて〔ナ
ランダー ジェイ、 （Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ Ｊ、 ）
等、０ｅｎｅ、２６：。
１０１−１０６．１９８５）、プラスミドｐＤＢ ２１
を形成する。これを次に制限酵素Ｈｐｈ Ｉで消化する
。粘着端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼとの処理によシ除去
する。
を形成する。これを次に制限酵素Ｈｐｈ Ｉで消化する
。粘着端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼとの処理によシ除去
する。
３５８プロモーター領域（ｐＵＣｌ ８．２１ （Ｈｐ
ｈＩ）−４１２（Ｓｍａ Ｉ ） ＋ ＣａＭＶ ６８
０８−７４３７（ＨｐｈＩ））を含む断片をＫｐｎＩリ
ンカ−と結合させ、ＮｃｏＩで切断しく ＣａＭＶ６９
０９位）、粘着端をＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片
で付は足し、ＥｃｏＲＩリンカ−と結合させ、そして次
にｌ；ｃｏｆ（、ＩおよびＫｐｎＩで消化する。
ｈＩ）−４１２（Ｓｍａ Ｉ ） ＋ ＣａＭＶ ６８
０８−７４３７（ＨｐｈＩ））を含む断片をＫｐｎＩリ
ンカ−と結合させ、ＮｃｏＩで切断しく ＣａＭＶ６９
０９位）、粘着端をＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片
で付は足し、ＥｃｏＲＩリンカ−と結合させ、そして次
にｌ；ｃｏｆ（、ＩおよびＫｐｎＩで消化する。
Ｃａ Ｍ Ｖプロモーター配列を含む生成するＥｃｏＲ
Ｉ／Ｋｐｎｌ断片を次にプラスミドｐ（Ｊｃ １８内ｔ
７）ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩとの制限切断部位の間に挿入
する。この方法でプラスミドｐＤＧ２を得る。
Ｉ／Ｋｐｎｌ断片を次にプラスミドｐ（Ｊｃ １８内ｔ
７）ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩとの制限切断部位の間に挿入
する。この方法でプラスミドｐＤＧ２を得る。
終結シグナル［ＣａＭＶ７４３９ （Ｈｐ＋ＩＩ ）−
７６３２＋ ｐＵＣｌ８４１３−１５５０（ＨｐｈＩ）
］を有する第二断片をＥｃｏＲＩで切断し、粘着端をク
レノーで付け足し、Ｈｉｎｄｌリンカ−を与え、そして
ＨｉｎｄＩおよび８ｐｈＩで消化する。
７６３２＋ ｐＵＣｌ８４１３−１５５０（ＨｐｈＩ）
］を有する第二断片をＥｃｏＲＩで切断し、粘着端をク
レノーで付け足し、Ｈｉｎｄｌリンカ−を与え、そして
ＨｉｎｄＩおよび８ｐｈＩで消化する。
ＣａＭＶターミネータ−配列を含む生成する５ｐｈＩ
−Ｈｌｎｄ ｌ断片を次にプラスミドｐＤＧ２内の）ｌ
ｉｎｄ Ｉと５ｐｈＩ制限切断部位に挿入する。
−Ｈｌｎｄ ｌ断片を次にプラスミドｐＤＧ２内の）ｌ
ｉｎｄ Ｉと５ｐｈＩ制限切断部位に挿入する。
ｐＨＰ ２３をポリリンカー領域の一部の欠失により改
変させる。ＢａｍＨＩおよび８ｐｈＩでのプラスミドの
切断そしてＢａｍＨＩ −８ｐｈ ｌ断片の欠失後、粘
着端をＴ４ポリメラーゼで除去し、そして断片をお互い
に連結しｐＨＰ２３Δを形成する。
変させる。ＢａｍＨＩおよび８ｐｈＩでのプラスミドの
切断そしてＢａｍＨＩ −８ｐｈ ｌ断片の欠失後、粘
着端をＴ４ポリメラーゼで除去し、そして断片をお互い
に連結しｐＨＰ２３Δを形成する。
ｐＨＰ２３Δの構築は、プラスミドｐＵＣ１９内に、ハ
イブリッド遺伝子〔ロバーツ アールジェイ （ｋＬｏ
ｂｅｒｔｓ Ｒ，Ｊ、） 、 １９８４ ） を有す
るＥｃｏＲＩ断片をクローニングすることにより完了し
、このようにして欠失突然変異体の製造を促進する。
イブリッド遺伝子〔ロバーツ アールジェイ （ｋＬｏ
ｂｅｒｔｓ Ｒ，Ｊ、） 、 １９８４ ） を有す
るＥｃｏＲＩ断片をクローニングすることにより完了し
、このようにして欠失突然変異体の製造を促進する。
実施例３ニブラスミドｐＡＢＤＨの構築ブロックリンガ
−およびダイゲルマン（Ｂｌｏ−ｃｈｌｉｎｇｅｒ ａ
ｎｄ Ｄｉｇｇｅｌｍａｎｎ ） 、 Ｍｏｌ 、 Ｃ
ｅ１ｌ 、 Ｂｉｏｌ 。
−およびダイゲルマン（Ｂｌｏ−ｃｈｌｉｎｇｅｒ ａ
ｎｄ Ｄｉｇｇｅｌｍａｎｎ ） 、 Ｍｏｌ 、 Ｃ
ｅ１ｌ 、 Ｂｉｏｌ 。
ジΩ又月２９２９−２９３１ 、１９８４ Ｋ記載され
、ハイクロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ
）のタンパク質コード化領域を含むプラスミドｐＬＧ
８８ ノＢａｍＨＩ断片を、ｐＤＯＢ ６１２〔バラ
ン イー、（Ｂａ１（１１）ｓ Ｅ、 ）等、Ｑｅｎｅ
４０：’３４５−３４８，１９８５ ］のＢａｍＨ
Ｉ側に挿入し、ｐＡＢＤ）ｌを形成する（第２図参照）
。
、ハイクロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ
）のタンパク質コード化領域を含むプラスミドｐＬＧ
８８ ノＢａｍＨＩ断片を、ｐＤＯＢ ６１２〔バラ
ン イー、（Ｂａ１（１１）ｓ Ｅ、 ）等、Ｑｅｎｅ
４０：’３４５−３４８，１９８５ ］のＢａｍＨ
Ｉ側に挿入し、ｐＡＢＤ）ｌを形成する（第２図参照）
。
実施例４二遺伝子ターゲツテイング（ｇｅｎｅｔａｒｇ
ｅｔｉｎｇ ） ＡＰＲ（３’） Ｉｔハイブリッドマーカー遺伝子の異
なる構築物を有する２つのプラスミドを互いに相補的な
欠失突然変異体の製造のために用いる。
ｅｔｉｎｇ ） ＡＰＲ（３’） Ｉｔハイブリッドマーカー遺伝子の異
なる構築物を有する２つのプラスミドを互いに相補的な
欠失突然変異体の製造のために用いる。
Ｎ１株：
１、 バスソコウスキー ジェイ、 （Ｐａｓｚｋｏｗ
ａｋｉＪ、）等、ＥｍｂｏＪ 、５．２７１７−２７２
２．１９８４ Ｋより記載されたプラスミドｐＡＢＤＩ
（第１ａ図参照）を、制限酵素Ｂａｔ ＩおよびＳｍａ
Ｉで切断する。ｐＡＢＤ ＩからのＢａｌ Ｉ −８ｍ
ａ ｌ断片の欠失により欠失突然変異体Δ−ＢａｌＩを
得る （第１ｂ図参照）。
ａｋｉＪ、）等、ＥｍｂｏＪ 、５．２７１７−２７２
２．１９８４ Ｋより記載されたプラスミドｐＡＢＤＩ
（第１ａ図参照）を、制限酵素Ｂａｔ ＩおよびＳｍａ
Ｉで切断する。ｐＡＢＤ ＩからのＢａｌ Ｉ −８ｍ
ａ ｌ断片の欠失により欠失突然変異体Δ−ＢａｌＩを
得る （第１ｂ図参照）。
λ 該プラスミドのＮｄｅＩ制限切断部位での直線化。
五 ｐＡＢＤＨとの共形質転換によるタバコの核ゲノム
内への直線化プラスミドの組込み。この方法で、標的タ
バコのＮ１株を得る。
内への直線化プラスミドの組込み。この方法で、標的タ
バコのＮ１株を得る。
Ｒ２，Ｒ３株
１、 ｐＡＢＤＩのＮａｒ Ｉでの切断。プラスミド
ｐＡＢＤ ＩからＮａｒＩ断片の欠失ＶＣより欠失突然
変異体ΔＮａｒＩａを得る（第１Ｃ図参照）。
ｐＡＢＤ ＩからＮａｒＩ断片の欠失ＶＣより欠失突然
変異体ΔＮａｒＩａを得る（第１Ｃ図参照）。
２、 該プラスミドのＮｄｅＩ制限切断部位での直線化
。
。
五 タバコゲノム内へのΔＮａｒＩの共形質転換。
標的法Ｒ２およびＲ３を得る。
Ｊ、、Ｊ２株
１、 ｐＡＢＤ ＩのＰｓｔ Ｉでの切断。 プラスミ
ドｐＡＢ１）ＩからＰｓｔ ｌ断片の欠失により欠失突
然変異体ΔＰｓｔ Ｉを得る（第１ｄ図参照）。
ドｐＡＢ１）ＩからＰｓｔ ｌ断片の欠失により欠失突
然変異体ΔＰｓｔ Ｉを得る（第１ｄ図参照）。
２、 該プラスミドのＮｄｅＩ制限切断部位での直線化
。
。
３、 タバコゲノム内へΔＰｓｔ Ｉを導入すると標的
法Ｊ１およびＪ２が得られる。
法Ｊ１およびＪ２が得られる。
欠失突然変異体
５ｐｈＩでのプラスミドｐＨｐ２３Δの切断および５ｐ
ｈＩ断片の欠失により欠失突然変異体Δ８ｐｈＩが得ら
れる（第１ｆ図参照）。
ｈＩ断片の欠失により欠失突然変異体Δ８ｐｈＩが得ら
れる（第１ｆ図参照）。
プラスミド構築に使用される方法は、マニアチス等、１
９８２に記載されている。
９８２に記載されている。
」−級匠上びタバコプ旦ブラストの聚えタバコプロトプ
ラストをタバコの ｒｋ培養液から、慣用の方法（ボト
リ７ス アイ、およびシルＩＪ −ｔ ） ７− Ａ
／、 デ４−、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ−ｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ 、廊１１８巻、Ｐｌａｎｔ Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ。
ラストをタバコの ｒｋ培養液から、慣用の方法（ボト
リ７ス アイ、およびシルＩＪ −ｔ ） ７− Ａ
／、 デ４−、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ−ｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ 、廊１１８巻、Ｐｌａｎｔ Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ。
ニー およびエイチ、バイスバッハＡｃａｄｅｍｉｃｐ
ｒｅｓｓ 、オルランド−１１９８６）によりＮ ｉ’
Ｍする。無菌条件下で、６週令の苗榮９６体の完全に開
いた葉を取り、そして下記組成の酵素水溶液で十分に湿
らす： 酵素水溶成：水 ７０ｍ
ショ糖 １３ｉ９マセ
ロザイムＲ１０１ｇ セルロース ２ｇ”オノズカ”
Ｒ１０ トリセルラーゼ α１３ ｇＭＥＳ
Ｑ、５ ｍｕｐＨ６
，０ 葉を次に１−２ｃｒ！の四角片に切り、そして上記の酵
素水溶液に浮かべる。２６℃の温度で暗室中−晩培養す
る。この混合物を次にゆるやかに攪拌し、そして消化が
完了するまでさらＶＣ３０分培養する。
ｒｅｓｓ 、オルランド−１１９８６）によりＮ ｉ’
Ｍする。無菌条件下で、６週令の苗榮９６体の完全に開
いた葉を取り、そして下記組成の酵素水溶液で十分に湿
らす： 酵素水溶成：水 ７０ｍ
ショ糖 １３ｉ９マセ
ロザイムＲ１０１ｇ セルロース ２ｇ”オノズカ”
Ｒ１０ トリセルラーゼ α１３ ｇＭＥＳ
Ｑ、５ ｍｕｐＨ６
，０ 葉を次に１−２ｃｒ！の四角片に切り、そして上記の酵
素水溶液に浮かべる。２６℃の温度で暗室中−晩培養す
る。この混合物を次にゆるやかに攪拌し、そして消化が
完了するまでさらＶＣ３０分培養する。
この＠濁液を次にノー１フ１幅１００μｍの鋼製のふる
いでこして組織の残渣を分離し、０．６Ｍシ、抛（ＭＥ
Ｓ、ｐＨ５−６）で十分にすすぎ、そして引き続いて１
００ｇで１０分遠心分離する。この処理の結果、プロト
プラストを培地の表面すこ集め％培地をその後例えば殺
菌注入シリンジを用いて、プロトプラストの下から抜き
とる。
いでこして組織の残渣を分離し、０．６Ｍシ、抛（ＭＥ
Ｓ、ｐＨ５−６）で十分にすすぎ、そして引き続いて１
００ｇで１０分遠心分離する。この処理の結果、プロト
プラストを培地の表面すこ集め％培地をその後例えば殺
菌注入シリンジを用いて、プロトプラストの下から抜き
とる。
次いで、ｌ１４Ｍシーｉ＠を含有するに３Ａ培地中にプ
ロトプラストを、再ｉｔｄ 濁し、そして付着している
酵素を除去するために、上記の方法でプロトプラストを
除去させ、そして培地を除去することによシ該プロトプ
ラストを５度洗浄する。洗浄したプロトプラストを最後
に、プロトプラスト密度が１．２−１．６ｘ１０４ｍと
なる様に１４Ｍマンニトールおよび１ｇ／Ａ’ＭＥＳの
溶液に懸濁する。
ロトプラストを、再ｉｔｄ 濁し、そして付着している
酵素を除去するために、上記の方法でプロトプラストを
除去させ、そして培地を除去することによシ該プロトプ
ラストを５度洗浄する。洗浄したプロトプラストを最後
に、プロトプラスト密度が１．２−１．６ｘ１０４ｍと
なる様に１４Ｍマンニトールおよび１ｇ／Ａ’ＭＥＳの
溶液に懸濁する。
欠失プラスミドとｐＡＩ３Ｉ））（ＤＮＡの共形質転換
を１ショツチャ−（５ｃｈｏｃｈｅｒ ）等、１９８６
の指示に従って行う。形質転換実験を実行するために、
プロトプラストをまず最初に洗浄し、計測し、そして次
に分離されたプロトプラストの高い生存率を確実にする
Ｗ５培地［１５４ｍＭＮａＣ１，１２５ｍＭＣａＣ／２
２８２０．５ ｍＭＫｃｌ！、 ５ ｍＭグルコース、
ｐＨ５，６；メンツエル、エル。
を１ショツチャ−（５ｃｈｏｃｈｅｒ ）等、１９８６
の指示に従って行う。形質転換実験を実行するために、
プロトプラストをまず最初に洗浄し、計測し、そして次
に分離されたプロトプラストの高い生存率を確実にする
Ｗ５培地［１５４ｍＭＮａＣ１，１２５ｍＭＣａＣ／２
２８２０．５ ｍＭＫｃｌ！、 ５ ｍＭグルコース、
ｐＨ５，６；メンツエル、エル。
（Ｍｅｎｃｚｅｌ 、 Ｌ、 ）等（１９８１））中１
ｄ当たり１−２．５×１０６細胞の細胞密度に再懸濁す
る。６℃ないし８℃で３０分の培養期間の後、プロトプ
ラストを形質転換実験のために用いる。
ｄ当たり１−２．５×１０６細胞の細胞密度に再懸濁す
る。６℃ないし８℃で３０分の培養期間の後、プロトプ
ラストを形質転換実験のために用いる。
分離されたプロトプラストの実際の形質転換の直前に、
Ｗｓ培地を実際の形質転換培地に置き換える。これは、
１２−１６ｍＭのＭｇ””濃度のマンニトール／マグネ
シウム溶液［ＭａＭｇ溶液：αａ−１１５ｍＭマン＝ト
ー／Ｌ／、（１１％ＭＥＳ （モルホリンエタンスルホ
ン酸）、ｐＨａ６）である。
Ｗｓ培地を実際の形質転換培地に置き換える。これは、
１２−１６ｍＭのＭｇ””濃度のマンニトール／マグネ
シウム溶液［ＭａＭｇ溶液：αａ−１１５ｍＭマン＝ト
ー／Ｌ／、（１１％ＭＥＳ （モルホリンエタンスルホ
ン酸）、ｐＨａ６）である。
これを行うために、まず１００ｇで５分間の遠心分離に
よシプロトプラストをＷ５溶液から除去し、そしてＭａ
Ｍｇ培地（（ｌＬ５ｍ）中に再懸濁する。欠失プラスミ
ドＤＮＡ５−１０μｍ、プラスミドｐＡＢＤＨ２μｇお
よび仔ウシ胸腺キャリアーＤＮＡ ４０ ｔｔＦｌを含
有するＤＮＡ水溶液６５μｌを次にこの懸濁液に添加す
る。キャリアーＤＮＡは形質転換挿入物を含まない中性
キャリアーＤＮＡであり、これは、形質転換されるＤＮ
Ａをヌクレアーゼ消化に対して保護するためにこの混合
物に過剰に添加される。プラスミドおよびキャリマーＤ
ＮＡを、バスツコウスキーおよびノー＃ （Ｐａｓｚｋ
ｏｗｓｋｉ ａｎｄ ８ａｕｌ ）、１９８６に記載さ
れるように、エタノール沈殿により前もって滅菌する。
よシプロトプラストをＷ５溶液から除去し、そしてＭａ
Ｍｇ培地（（ｌＬ５ｍ）中に再懸濁する。欠失プラスミ
ドＤＮＡ５−１０μｍ、プラスミドｐＡＢＤＨ２μｇお
よび仔ウシ胸腺キャリアーＤＮＡ ４０ ｔｔＦｌを含
有するＤＮＡ水溶液６５μｌを次にこの懸濁液に添加す
る。キャリアーＤＮＡは形質転換挿入物を含まない中性
キャリアーＤＮＡであり、これは、形質転換されるＤＮ
Ａをヌクレアーゼ消化に対して保護するためにこの混合
物に過剰に添加される。プラスミドおよびキャリマーＤ
ＮＡを、バスツコウスキーおよびノー＃ （Ｐａｓｚｋ
ｏｗｓｋｉ ａｎｄ ８ａｕｌ ）、１９８６に記載さ
れるように、エタノール沈殿により前もって滅菌する。
、ＤＮＡ添加後約０．１．−１０分後、４０語（Ｗ／Ｖ
） ポリエチレングリコール水溶液を、最終濃度が２
４−２８易（ｗ／ｖ）ＶＣ達するまで添加する。ＣＭＳ
タイプのＰＥＧの使用は特に有利である。これは、分子
量約１０００−約６００００ＰＥＧを４０％（Ｗ／Ｖ）
の最終濃度で含有するＣａ２＋含有（０，ＩＭＣａ（Ｎ
ｏ３）２−４Ｈ２０） ｃＬ４Ｍマン＝トール溶液であ
る。この溶液ＯｐＨ値は７−９である〔ネグルチウ、ア
イ、等（１９８６ａ）ｊ。
） ポリエチレングリコール水溶液を、最終濃度が２
４−２８易（ｗ／ｖ）ＶＣ達するまで添加する。ＣＭＳ
タイプのＰＥＧの使用は特に有利である。これは、分子
量約１０００−約６００００ＰＥＧを４０％（Ｗ／Ｖ）
の最終濃度で含有するＣａ２＋含有（０，ＩＭＣａ（Ｎ
ｏ３）２−４Ｈ２０） ｃＬ４Ｍマン＝トール溶液であ
る。この溶液ＯｐＨ値は７−９である〔ネグルチウ、ア
イ、等（１９８６ａ）ｊ。
ニコチアナ タバカム ベチト ハバンナＳ Ｒ，Ｉ種
の場合には、ＰＥＧ ＣＭ８４０００ が好ましくは使
用される。形質転換培地のｐ）］を次に７に調整する。
の場合には、ＰＥＧ ＣＭ８４０００ が好ましくは使
用される。形質転換培地のｐ）］を次に７に調整する。
この混合物を時々攪拌して２６℃で３０分間培養する。
３ないし５倍容量の［１２Ｍ （？ａＣ／２溶液での段
階における希釈は、２０％より高いＰＥＧ１５度を用い
た場合に有利である。記載された方法で処理されたプロ
トプラストを次に遠心分離しく１００１で５分間）、そ
して新鮮なに３培地中に懸濁する（新鮮なに３培地１０
ａ／中プロトプラストα３ゴ溶液）。さらに培養を、暗
所中２４℃で１０ｃＷＬベトリ皿内で一部の１０ｄ行な
うが、これは個体群密度が１ｄ当た。９４−８Ｘ１０４
プロトプラストに相当する。３日後各皿の培養培地
を新鮮なに３培地ａ５容量部で希釈し、そして２４℃お
よび３０００ルクスの人工光でさらに４日間培養を続け
る。合計で７日後、プロトプラストから生長したクロー
ンを１２η／ｌのハイグロマイシンを含有し、そして１
チアガロースで固化させた栄養培地中に植え、そして［
ビード−タイプ（ｔ）ｅａｄ −ｔｙｐｅ ） Ｊ培養
法〔シルリット、アール。
階における希釈は、２０％より高いＰＥＧ１５度を用い
た場合に有利である。記載された方法で処理されたプロ
トプラストを次に遠心分離しく１００１で５分間）、そ
して新鮮なに３培地中に懸濁する（新鮮なに３培地１０
ａ／中プロトプラストα３ゴ溶液）。さらに培養を、暗
所中２４℃で１０ｃＷＬベトリ皿内で一部の１０ｄ行な
うが、これは個体群密度が１ｄ当た。９４−８Ｘ１０４
プロトプラストに相当する。３日後各皿の培養培地
を新鮮なに３培地ａ５容量部で希釈し、そして２４℃お
よび３０００ルクスの人工光でさらに４日間培養を続け
る。合計で７日後、プロトプラストから生長したクロー
ンを１２η／ｌのハイグロマイシンを含有し、そして１
チアガロースで固化させた栄養培地中に植え、そして［
ビード−タイプ（ｔ）ｅａｄ −ｔｙｐｅ ） Ｊ培養
法〔シルリット、アール。
デ４− 、 （８ｈｉｌｌｉｔｏ 、 Ｒ６Ｄ、 ）等
、Ｐｌａｎｔ Ｃｅ１ｌＲｅｐｏｒｔｓ、 ２．２４４
−２４７ （１９８３） ］ により、暗所中２４℃で
培養する。栄養培地を５日毎に同種の新鮮栄養溶液と交
換する。
、Ｐｌａｎｔ Ｃｅ１ｌＲｅｐｏｒｔｓ、 ２．２４４
−２４７ （１９８３） ］ により、暗所中２４℃で
培養する。栄養培地を５日毎に同種の新鮮栄養溶液と交
換する。
６週めの終りに、直径１−２１−２ｒｒｒ達したノーイ
グロマイシン耐性クローンをアガーで固化されていない
ハイグロフィシンを含有しない抗生物質含有培地に移す
。
グロマイシン耐性クローンをアガーで固化されていない
ハイグロフィシンを含有しない抗生物質含有培地に移す
。
培養条件および再生プロトコルはンール等、１９８７に
記載されている。
記載されている。
植物ゲノム内へのＡＰＨ（５’） ＩＩ欠失突然変異体
の取込みに対して、サザンプロットハイブリッド形成を
用いて７種全てのハイグロマイシン耐性クローンを試験
した。
の取込みに対して、サザンプロットハイブリッド形成を
用いて７種全てのハイグロマイシン耐性クローンを試験
した。
試験されるクローンのうち５種が、予期される遺伝子構
築（３種の異なるＡＰ）ｌ（３’）Ｉ 遺伝子欠失）
を有し、その他の実験のために使用される。
築（３種の異なるＡＰ）ｌ（３’）Ｉ 遺伝子欠失）
を有し、その他の実験のために使用される。
標的欠失のコピー数は２ないし１０の範囲で変化する。
（Ｊ１株−３コピー、１２株−７コピー、Ｎ１株−５コ
ピー、几２株−２コピー、几。
ピー、几２株−２コピー、几。
株−１０コピー）。
ンール等、１９８７Ｖｃ記載された再生プロトコルに従
って、遺伝子導入植物体を次にこれらの細胞系から再生
させ、そしてさらに無菌の苗条培養物の形態で増殖させ
る。
って、遺伝子導入植物体を次にこれらの細胞系から再生
させ、そしてさらに無菌の苗条培養物の形態で増殖させ
る。
数回の継代培養の後、増殖プロトプラストの良好な収率
を与える葉が得られる。
を与える葉が得られる。
核ゲノム内への遺伝子構築物の組込みは、サザンプロッ
トハイプリダイゼーションを用いる単一のメンデル形質
として有糸***安定性および遺伝により確認される。
トハイプリダイゼーションを用いる単一のメンデル形質
として有糸***安定性および遺伝により確認される。
実施例８： 「遺伝子ターゲツティング」実験予め選択
された５種の系からのプロトプラストを「遺伝子ターゲ
ツティング」実験に用いる。
された５種の系からのプロトプラストを「遺伝子ターゲ
ツティング」実験に用いる。
キメラＡＰＨ（３’） Ｉｔ遺云子の相補的部分を含有
するプラスミドＤＮＡを、実施例６に記載の直接遺伝子
転移法を用いて相当する植物株のプロトプラスト内に挿
入して、以下の組合せが選択された： Ｎ１株とｐ１９ＮａｒＩｂ Ｒ２，Ｒ３，Ｊ、および１２株とｐ１９ｓｐｈＩ。
するプラスミドＤＮＡを、実施例６に記載の直接遺伝子
転移法を用いて相当する植物株のプロトプラスト内に挿
入して、以下の組合せが選択された： Ｎ１株とｐ１９ＮａｒＩｂ Ｒ２，Ｒ３，Ｊ、および１２株とｐ１９ｓｐｈＩ。
実施例９：カナマイシン耐性細胞クローンの選択
カナマイシン含有栄養培地中での３ないし４週間の連続
培養後、直径２ないし３ｍの耐性カルスを、α０５ｒＮ
？／／２．４−ジクロロフェノキシ酢酸、２■／／
１−ナフチル酢酸、α１ｍ９／１６−ベンジルアミノプ
リン０．１■／ｌ キネチンおよび７５η／／カナマイ
シンを含有するアガーで固化させたＬＳ培養培地〔リン
スマイブーイー。エム、およびスクラブ エフ、（Ｌｉ
ｎｓｍａｉｅｒＥｏＭ、 ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ Ｆ、
）、ヱ１ｓｊｏｌ Ｐｌａｎｔ、１影１００−１２７
。
培養後、直径２ないし３ｍの耐性カルスを、α０５ｒＮ
？／／２．４−ジクロロフェノキシ酢酸、２■／／
１−ナフチル酢酸、α１ｍ９／１６−ベンジルアミノプ
リン０．１■／ｌ キネチンおよび７５η／／カナマイ
シンを含有するアガーで固化させたＬＳ培養培地〔リン
スマイブーイー。エム、およびスクラブ エフ、（Ｌｉ
ｎｓｍａｉｅｒＥｏＭ、 ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ Ｆ、
）、ヱ１ｓｊｏｌ Ｐｌａｎｔ、１影１００−１２７
。
１９６５ ）上に移植させる。１５０■／ｌ カナマイ
シンおよび０−２ｍｇ／１６−ベンジルアミノプリンを
含有するＬＳ培地上での苗条誘導および引き続くＴ培地
〔ニラチエ、ライ。ビー、およびニラ−ｙ−ｚ 、シー
、 （Ｎｉｔｓｃｈ、Ｙ、Ｐ、 ａｎｄ Ｎ１ｔｓｃｈ
Ｃ，）。
シンおよび０−２ｍｇ／１６−ベンジルアミノプリンを
含有するＬＳ培地上での苗条誘導および引き続くＴ培地
〔ニラチエ、ライ。ビー、およびニラ−ｙ−ｚ 、シー
、 （Ｎｉｔｓｃｈ、Ｙ、Ｐ、 ａｎｄ Ｎ１ｔｓｃｈ
Ｃ，）。
５ｃｉｅｎｃｅ、 １６３ ： ８５−８７１９６９
） 上での板形成により、ベチト ハバンナ８ＲＩ種
のカナマイシン耐性ニコチアナ タバカム植物体が得ら
れる。
） 上での板形成により、ベチト ハバンナ８ＲＩ種
のカナマイシン耐性ニコチアナ タバカム植物体が得ら
れる。
実施例１０：植物遺伝子型内のＮＰＴ−■遺伝子の検出
形質転換された細胞培養物またはそれから再生された植
物体からの葉組織のカルス［１５ｇを、５０ ｍｍｏｌ
／ ｌ ニーｙ−ｖ ンジアミンーＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ
’−四酢酸（ＥＤＴＡ ）、０．２５ｍｏｌ／ｌ塩化ナ
トリウムおよび５０ ｍｍｏ １ ／ ｌα、α、α−
トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミンヒドロクロ
リド（ＴＲＩ ５−ＨＣｌりを含有する１５易シヨ砧溶
液ｐＨａＯ中に０℃でホモジナイズする。１０００１で
５分間ホモジナイズ物を遠心分離し、細胞核をおおまか
に分別する。５０ ｍｍｏｌ ＥＤＴＡ および５０
ｍｍｏｌ ／ｌ ＴＲ・Ｉ Ｓ −ＨＣＩを含有する
１５％シヨ糖溶液ｐ）ｌａｏ中に細胞核を再懸濁し、ド
デシルスルホン酸ナトリウムを最終濃度が（１２％に達
するまで添加し、そして全体を７０℃で１０分間加熱す
る、混合物を２０−２５℃まで冷やした後、酢酸カリウ
ムを濃度が［１５ｍｏｌ／／に達するまで添加する。こ
の混合物を０℃で１時間培養する。生成した沈殿を遠心
分離する（微量遠心分離機内で４℃で１５分）。２〇−
２５℃で２−５倍容ｉ−のエタノールを添加することに
より上清液から、ＤＮＡを沈殿させる。 １０μｙ／ｄ
リボヌクレアーゼＡを含有するＴＲｌ５−ＨＣｅｌ ０
ｍｍｏｌ溶液中に分離したＤＮＡを溶かし、３７℃で
１０分間培養し、プロテナーゼＫを濃度が２５０μ（ｌ
／ｕｒｌに達するまで添加し、そして全体を３７℃でさ
らに１時間培養する。プロテナーゼＫをフェノールおよ
びクロロホルム／インアミルアルコール抽出により除去
する。インプロパツール中の０６Ｍ酢醒す） ＩＪウム
溶１１ｉ０．６容量部を添加することにより水相からＤ
ＮＡを沈殿サセ、そしテ１０ ｍｍｏｌ ／ｌ ＴＲＩ
８− ＨＣ１！ および５ ｍｍｏｌ ／ ｌ ＥＤ
ＴＡを含有する溶液ｐ）１７．５５０μｌ中ＶＣ溶かす
。 この調製Ｖこより、主としてｓ ｏ、 ｏ ｏ ｏ
塩基対以上含むＤＮＡ配列が得られる。
物体からの葉組織のカルス［１５ｇを、５０ ｍｍｏｌ
／ ｌ ニーｙ−ｖ ンジアミンーＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ
’−四酢酸（ＥＤＴＡ ）、０．２５ｍｏｌ／ｌ塩化ナ
トリウムおよび５０ ｍｍｏ １ ／ ｌα、α、α−
トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミンヒドロクロ
リド（ＴＲＩ ５−ＨＣｌりを含有する１５易シヨ砧溶
液ｐＨａＯ中に０℃でホモジナイズする。１０００１で
５分間ホモジナイズ物を遠心分離し、細胞核をおおまか
に分別する。５０ ｍｍｏｌ ＥＤＴＡ および５０
ｍｍｏｌ ／ｌ ＴＲ・Ｉ Ｓ −ＨＣＩを含有する
１５％シヨ糖溶液ｐ）ｌａｏ中に細胞核を再懸濁し、ド
デシルスルホン酸ナトリウムを最終濃度が（１２％に達
するまで添加し、そして全体を７０℃で１０分間加熱す
る、混合物を２０−２５℃まで冷やした後、酢酸カリウ
ムを濃度が［１５ｍｏｌ／／に達するまで添加する。こ
の混合物を０℃で１時間培養する。生成した沈殿を遠心
分離する（微量遠心分離機内で４℃で１５分）。２〇−
２５℃で２−５倍容ｉ−のエタノールを添加することに
より上清液から、ＤＮＡを沈殿させる。 １０μｙ／ｄ
リボヌクレアーゼＡを含有するＴＲｌ５−ＨＣｅｌ ０
ｍｍｏｌ溶液中に分離したＤＮＡを溶かし、３７℃で
１０分間培養し、プロテナーゼＫを濃度が２５０μ（ｌ
／ｕｒｌに達するまで添加し、そして全体を３７℃でさ
らに１時間培養する。プロテナーゼＫをフェノールおよ
びクロロホルム／インアミルアルコール抽出により除去
する。インプロパツール中の０６Ｍ酢醒す） ＩＪウム
溶１１ｉ０．６容量部を添加することにより水相からＤ
ＮＡを沈殿サセ、そしテ１０ ｍｍｏｌ ／ｌ ＴＲＩ
８− ＨＣ１！ および５ ｍｍｏｌ ／ ｌ ＥＤ
ＴＡを含有する溶液ｐ）１７．５５０μｌ中ＶＣ溶かす
。 この調製Ｖこより、主としてｓ ｏ、 ｏ ｏ ｏ
塩基対以上含むＤＮＡ配列が得られる。
このＤＮＡのＥｃｏＲＶエンドヌクレアーゼでの制限、
ＮＰＴ−ＩＩ遺伝子の放射標識Ｂｉｎｄｕ 断片との
前記断片のハイプリ・ｙト”−ｎ’ｚｈ”、 、そし
て「サザンプロ７トＪ分析でのプラスミドｐＡＢＤＩと
の比較は、形質転換されたニコチアナ タバカム細胞の
細胞核ＤＮＡ内にＮＰＴ−ＩＩ遣遺伝の存在を示す。
ＮＰＴ−ＩＩ遺伝子の放射標識Ｂｉｎｄｕ 断片との
前記断片のハイプリ・ｙト”−ｎ’ｚｈ”、 、そし
て「サザンプロ７トＪ分析でのプラスミドｐＡＢＤＩと
の比較は、形質転換されたニコチアナ タバカム細胞の
細胞核ＤＮＡ内にＮＰＴ−ＩＩ遣遺伝の存在を示す。
実施例１１：サザンプロット分析
バラコラスキーおよびソール、１９８３に記載された方
法Ｖこ従って植物ＤＮＡ分析を行う。
法Ｖこ従って植物ＤＮＡ分析を行う。
ゲノムＤＮＡ約５１ｔ（ｌをＥｃｏ ＲＶまたはＨｉｎ
ｄｌのいずれかの制限酵素で切断し、そして生成する断
片を１％標潴アガロースゲル中で電気泳動により分離す
る（マニアチス ティー、等、１９８２ ）。
ｄｌのいずれかの制限酵素で切断し、そして生成する断
片を１％標潴アガロースゲル中で電気泳動により分離す
る（マニアチス ティー、等、１９８２ ）。
ササンプロット分析ヲ、バスッコウスキーおよびソール
、１９８６の記・異に従って行う。
、１９８６の記・異に従って行う。
ニーツクトラフ スｖ −ジョン（ｎ１ｃｋ−ｔｒａｎ
ｓｌａｔｉｏｎ ）をこの場合ファインベルクおよびホ
ーゲルスタイン（Ｉｉ”ｅｉｎｌ）ｅｒｇ ａｎｄ Ｖ
ｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ）、１９８３ に記載の「ラン
ダムプライ？ −（ｒａｎｄｏｍ ｐｒ該ｅｒ ） Ｊ
法に置き換える。
ｓｌａｔｉｏｎ ）をこの場合ファインベルクおよびホ
ーゲルスタイン（Ｉｉ”ｅｉｎｌ）ｅｒｇ ａｎｄ Ｖ
ｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ）、１９８３ に記載の「ラン
ダムプライ？ −（ｒａｎｄｏｍ ｐｒ該ｅｒ ） Ｊ
法に置き換える。
これは、１ｏ ｓ Ｃｐｍ／μｇＤＮＡ以上の再生可能
活性を結果として示す。
活性を結果として示す。
結果
お互いに独立して行われた３種の実験から、合計で１．
４ｘ１０’プロトプラストを含む、カナマイシン耐性の
８種の細胞クローンが得られた。
４ｘ１０’プロトプラストを含む、カナマイシン耐性の
８種の細胞クローンが得られた。
同時に行われた対照試験において、そこでは野生型８Ｒ
１プロトプラストが使用され、そして相補的欠失突然変
異体は提供されず、耐性クローンは観察されなかった。
１プロトプラストが使用され、そして相補的欠失突然変
異体は提供されず、耐性クローンは観察されなかった。
カナマイシン耐性細胞系を特に感受性株Ｊ３およびＪ、
から得ることができる。
から得ることができる。
カナマイシン耐性クローンの形成の頻度は、非中断ハイ
ブリッド遺伝子構築物を用いる平行して行われた実験の
形質転換頻度に匹敵しつる。
ブリッド遺伝子構築物を用いる平行して行われた実験の
形質転換頻度に匹敵しつる。
使用される３′および５’ ＡＰＨ（３’） ＩＩ遺遺
伝欠失物は、それらのプロモーターおよびターミネータ
−領域において異なる２種のハイブリッド遺伝子に由来
する。
伝欠失物は、それらのプロモーターおよびターミネータ
−領域において異なる２種のハイブリッド遺伝子に由来
する。
結果的に、これら欠失突然変異体の相同組換えは、予め
存在する遺伝子構築物と似ているもう１つの種類の制限
断片を生じる新たに結合されだ配置ＤＮＡ配列を有する
マーカー遺伝子を生ずる。
存在する遺伝子構築物と似ているもう１つの種類の制限
断片を生じる新たに結合されだ配置ＤＮＡ配列を有する
マーカー遺伝子を生ずる。
２種のＡＰＨ（３’） Ｉ 欠失突然変異体の中央の相
同領域での相同組換えが起こったことをサザンブローＩ
ト分析は立証し、そして従って族プラスミドの混入によ
る形質転換の可能性を同時に除外する。
同領域での相同組換えが起こったことをサザンブローＩ
ト分析は立証し、そして従って族プラスミドの混入によ
る形質転換の可能性を同時に除外する。
ＤＮＡ分１析
Ｊ２補足された４種のクローンのＤＮＡを調べた。
新規なマーカー遺伝子と関連するＥｃｏＲＶ断片（１２
４７ｂｐ）が、調べられたカナマイシン耐性クローンの
全てに検出された。
４７ｂｐ）が、調べられたカナマイシン耐性クローンの
全てに検出された。
同時に、組込まれたＡＰＨ（３’） Ｉｔ遺遺伝欠失物
の全てが正しいわけではないことがサザンプロット分析
から明らかになった。
の全てが正しいわけではないことがサザンプロット分析
から明らかになった。
再生された完全な遺伝子コピーに関連するＤＮＡ断片の
出現は、欠失した遺伝子コピーの減少と関係がある。こ
のことは、相同組換えの結果として、挿入されたＤＮＡ
による突然変異遺伝子コピーの特異的な訂正が遺伝子内
で起こるという証拠とみなされる。
出現は、欠失した遺伝子コピーの減少と関係がある。こ
のことは、相同組換えの結果として、挿入されたＤＮＡ
による突然変異遺伝子コピーの特異的な訂正が遺伝子内
で起こるという証拠とみなされる。
ＡＰ）ｌ ’（３’） Ｉ遺伝子のタンパク質コード化
領域を有する８０５ｂｐのＨｉｎｄｌ断片が正確に再構
築されることをゲノム遺伝子爪（２）作成は示す。
領域を有する８０５ｂｐのＨｉｎｄｌ断片が正確に再構
築されることをゲノム遺伝子爪（２）作成は示す。
このことは、ハイブリッド遺伝子訂正が正確に進むこと
は非常に可能性のあることであることを意味する。
は非常に可能性のあることであることを意味する。
伝達の検出
遺伝子的に改変された植物体（第１世代および後代）の
広範囲の遺伝子ハイブリッド形成分析および詳細な分子
生物学研究（例えば、植物ゲノムのＤＮＡの“サザンプ
ロット”分析ニアミノグリコシドホスホトランスフェラ
ーゼ、即ちカナマイシン特異性ホスホリル化の酵素の酵
素活性の試験）は以下の結果を住じた：１、ＭＪ菌の遺
伝子は植物ゲノム内に安定に取込まれｂ： Ｚ 一般に、それは改変されずそして一致してハイプリ
ーノド化された後代に移される：五 その遺伝子型は天
然の、単一な、優性植物遺伝子のものに相当する： ４、 ＤＮ、Ａハイブリッド形成“嘗子９および酵素
試験による分子分析は、遺伝子のハイブリッド形成分析
の結果を立証する； ５、 遺伝子的に改変された植物体はそれらの通常の天
然表現型を保持し；従って望ましくない改変が認められ
なかりた。
広範囲の遺伝子ハイブリッド形成分析および詳細な分子
生物学研究（例えば、植物ゲノムのＤＮＡの“サザンプ
ロット”分析ニアミノグリコシドホスホトランスフェラ
ーゼ、即ちカナマイシン特異性ホスホリル化の酵素の酵
素活性の試験）は以下の結果を住じた：１、ＭＪ菌の遺
伝子は植物ゲノム内に安定に取込まれｂ： Ｚ 一般に、それは改変されずそして一致してハイプリ
ーノド化された後代に移される：五 その遺伝子型は天
然の、単一な、優性植物遺伝子のものに相当する： ４、 ＤＮ、Ａハイブリッド形成“嘗子９および酵素
試験による分子分析は、遺伝子のハイブリッド形成分析
の結果を立証する； ５、 遺伝子的に改変された植物体はそれらの通常の天
然表現型を保持し；従って望ましくない改変が認められ
なかりた。
この結果は、他物材料の制御された遺伝子的改変の最良
の方法が本発明によるプロトプラスト内への直接遺伝子
移入の方法と共に見い出されたことを示す。遺伝子的改
変は安定であシ、そして植物の遺伝子型の望ましくない
改変は起こらない。
の方法が本発明によるプロトプラスト内への直接遺伝子
移入の方法と共に見い出されたことを示す。遺伝子的改
変は安定であシ、そして植物の遺伝子型の望ましくない
改変は起こらない。
同型接合型はそれ自体公仰の方法、即ちａ）によシ得ら
れたカナマイシン耐性タバコ他物体からの自家受精およ
び選択により得ることができる。結果的に、ニコチアナ
タバカム植物体は、各々のハブロイドゲノムがネオマ
イシントランスフェラーゼ遺伝子ＮＰＴ−ＩＩの単一コ
ピーのみを含有するものに利用可能である。
れたカナマイシン耐性タバコ他物体からの自家受精およ
び選択により得ることができる。結果的に、ニコチアナ
タバカム植物体は、各々のハブロイドゲノムがネオマ
イシントランスフェラーゼ遺伝子ＮＰＴ−ＩＩの単一コ
ピーのみを含有するものに利用可能である。
寄託：
本発明の範囲内で使用されるプラスミドｐ１９Ｓｐｈｌ
は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブ
タベスト条約の要請に従って、西ドイツ国の国際寄託機
関として認められた「トイチエ ザンムルンク′ フォ
ノ ミクロオＡ／ ｉ ＝ スｙ’ ン［Ｄｅｕｔｓｃ
ｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｎｉｋｒｏ−ｏｒｇ
ａｎｉｓｍｅｎ 、 Ｄ Ｓ Ｍ 〕Ｊに寄託された。
は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブ
タベスト条約の要請に従って、西ドイツ国の国際寄託機
関として認められた「トイチエ ザンムルンク′ フォ
ノ ミクロオＡ／ ｉ ＝ スｙ’ ン［Ｄｅｕｔｓｃ
ｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｎｉｋｒｏ−ｏｒｇ
ａｎｉｓｍｅｎ 、 Ｄ Ｓ Ｍ 〕Ｊに寄託された。
寄託された試料の生存認定は該国際寄託機関により行わ
れた、 °寄託番号は上記国際寄託機関により発行された。
れた、 °寄託番号は上記国際寄託機関により発行された。
第１ａないし１ｈ図は、遺伝子ターゲツティング試験の
工程を示す説明（２）、 第２図は、プラスミドｐＨＰ ２５７およびｐＡＢＤＨ
の製造工程を示す説明口を表わす。 特許出願人 チバーガイギー アクチェンゲ七ルシャ
フト代 理 人 計理士 萼 誕 美 °
ζ・、ξ゛） 、１？：（ （ほか２名）・＋、ｙ％ ：、ノ
工程を示す説明（２）、 第２図は、プラスミドｐＨＰ ２５７およびｐＡＢＤＨ
の製造工程を示す説明口を表わす。 特許出願人 チバーガイギー アクチェンゲ七ルシャ
フト代 理 人 計理士 萼 誕 美 °
ζ・、ξ゛） 、１？：（ （ほか２名）・＋、ｙ％ ：、ノ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）植物ゲノム内の正確に規定された部位での、遺伝
子、遺伝子断片またはその他のＤＮＡ配列の特異的に指
示された組込みを可能にし、そして植物ゲノム内の相当
するＤＮＡ領域に十分な相同性を有するか、またはその
様な十分な相同性を有するＤＮＡ配列が配置されている
組込まれるべきＤＮＡを含有し、相同ＤＮＡ領域を含有
する植物細胞の形質転換に際して相同組換えにより植物
ゲノム内の正確に規定された部位に、組込まれるべき前
記ＤＮＡの特異的に指示された組込みを可能にすること
を特徴とする組換えＤＮＡ分子。 （２）所望により植物細胞内で機能し得る発現シグナル
の制御下にあつても良い組込まれるべきＤＮＡが、植物
ゲノム内の特定領域に相同性を有する配置ＤＮＡ配列に
結合されている請求項１記載の組換えＤＮＡ分子。 （３）所望により植物細胞内で機能し得る発現シグナル
の制御下にあっても良い組込まれるべきＤＮＡが、植物
ゲノム内の相当するＤＮＡ領域に十分な相同性を有し、
相同組換えにより、該相同ゲノムＤＮＡと組込まれるべ
き前記ＤＮＡとの直接置換を可能にする請求項１記載の
組換えＤＮＡ分子。 （４）組込まれるべき前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、ｃ
ＤＮＡまたは合成ＤＮＡからなる請求項１ないし３のい
ずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 （５）組込まれるべき前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡおよ
びｃＤＮＡの両方および／または合成ＤＮＡから構成さ
れる請求項１ないし５のいずれか１項に記載の組換えＤ
ＮＡ分子。 （６）組込まれるべき前記ＤＮＡが、異なる属の種々の
生物からの遺伝子またはその他のＤＮＡ断片から構成さ
れる請求項１ないし３のいずれか１項に記載の組換えＤ
ＮＡ分子。 （７）組込まれるべき前記ＤＮＡが、異なる株、または
１属の１種もしくは異なる種の変種に属する生物からの
遺伝子またはその他のＤＮＡ断片から構成される請求項
１ないし３のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 （８）組込まれるべきＤＮＡが、同一生物の１種以上の
遺伝子の部分から構成される請求項１ないし３のいずれ
か１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 （９）組込まれるべきＤＮＡが、形質転換される植物体
に有用で望ましい特性を付与する構造遺伝子である請求
項１ないし３のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子
。 （１０）前記構造遺伝子が、病原体、除草剤、殺虫剤ま
たはその他の殺生物剤への増加した耐性または許容性を
植物に付与する請求項９記載の組換えＤＮＡ分子。 （１１）前記構造遺伝子が、葉、種子、塊茎、根および
茎における保存材料および貯蔵物質形成および性質を改
良する請求項９記載の組換えＤＮＡ分子。 （１２）前記構造遺伝子が、植物貯蔵タンパク質遺伝子
である請求項１１記載の組換えＤＮＡ分子。 （１３）前記構造遺伝子が、薬学的に許容し得る有効成
分をコードする請求項９記載の組換え ＤＮＡ分子。 （１４）組込まれるべきＤＮＡが、制御機能を有する非
コードＤＮＡ配列である請求項１記載の組換えＤＮＡ分
子。 （１５）前記発現シグナルが、植物または植物ウィルス
の遺伝子に由来する請求項２記載の組換えＤＮＡ分子。 （１６）前記発現シグナルが、リブロース−１，５−ビ
スホスフェートカルボキシラーゼまたはクロロフィルａ
／ｂ−結合タンパク質の小さいサブユニットをコードす
る植物遺伝子に由来する請求項１５記載の組換えＤＮＡ
分子。 （１７）前記発現シグナルが、植物ウィルスの遺伝子に
由来する請求項１５記載の組換えＤＮＡ分子。 （１８）植物ウィルスがカリフラワーモザイクウィルス
である請求項１７記載の組換えＤＮＡ分子。 （１９）カリフラワーモザイクウイルスゲノムの３５Ｓ
発現シグナルが包含される請求項１８記載の組換えＤＮ
Ａ分子。 （２０）カリフラワーモザイクウイルスゲノムの１９Ｓ
発現シグナルが包含される請求項１８記載の組換えＤＮ
Ａ分子。 （２１）前記配置ＤＮＡ配列が、植物本来の遺伝子また
はゲノムの領域に相同性を有するものである請求項１記
載の組換えＤＮＡ分子。 （２２）前記配置ＤＮＡ配列が、標的植物体のゲノム内
に公知方法により人為的に予め組込まれた遺伝子または
遺伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ配列に相同性を
有するものであり、そしてそのヌクレオチド配列が完全
にまたは部分的に公知である請求項１記載の組換えＤＮ
Ａ分子。 （２３）前記配置ＤＮＡおよび植物ゲノム内に人為的に
組込まれたＤＮＡが、相同組換えに際し、植物ゲノム内
で機能単位を形成するお互いに相補的なＤＮＡ配列であ
る請求項２２記載の組換えＤＮＡ分子。 （２４）組換えが起こったとき、お互いに相補的なＤＮ
Ａ配列が、表現型マーカーまたはもう１つの容易に検出
可能なタンパク質産生物をコードする請求項２３記載の
組換えＤＮＡ分子。 （２５）前記遺伝子または遺伝子断片またはその他のＤ
ＮＡ配列が、そのままで高い発現速度を有する植物ゲノ
ム内の領域に位置されている請求項２１ないし２４のい
ずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 （２６）植物貯蔵タンパク質遺伝子が包含される請求項
２１記載の組換えＤＮＡ分子。 （２７）ａ）組換えＤＮＡ分子が、請求項９ないし１４
のいずれか１項に記載の構造遺伝子を含有し、ｂ）所望
により該構造遺伝子が、請求項１５ないし２０のいずれ
か１項に記載の植物細胞内で機能し得る発現シグナルに
操作可能に結合されても良く、 ｃ）構造遺伝子および所望により発現シグナルから上記
機能単位が、相同領域を含む植物細胞の形質転換に際し
て、相同ＤＮＡ配列が配置された遺伝子配列の指示され
た組込みが相同組換えにより植物ゲノム内の規定された
部位に起こるような様式で、植物ゲノム内の相当するＤ
ＮＡ領域に十分に相同性を有するＤＮＡ配列により配置
されている請求項１記載の組換えＤＮＡ分子。 （２８）遺伝子、遺伝子断片またはその他の有用なＤＮ
Ａ配列が請求項１ないし２７のいずれか１項に記載の組
換えＤＮＡを用いて公知の方法によって植物細胞内に形
質転換され、そして植物細胞内で、制御された方法によ
り相同組換えを介して所望の予め決めることができる部
位で植物ゲノム内に組込まれることを特徴とする遺伝子
導入植物体の製造方法。 （２９）相同ＤＮＡ領域を含む植物材料の形質転換が、
アグロバクテリウム形質転換系を用いて行われる請求項
２８記載の方法。 （３０）前記形質転換が、カリフラワーモザイクウィル
ス形質転換系を用いて行われる請求項２８記載の方法。 （３１）前記形質転換が、直接遺伝子移入により行われ
る請求項２８記載の方法。 （３２）前記形質転換が共形質転換である請求項２８記
載の方法。 （３３）天然もしくは改変遺伝子もしくは遺伝子断片ま
たはその他の有用なＤＮＡ配列が、植物ゲノム内の相同
ＤＮＡ領域との組換えにより植物ゲノム内に組込まれる
請求項２８記載の方法。 （３４）高い発現効率および／または組込まれた遺伝子
の有利な制御を確実にする植物ゲノムの領域内に組込み
が行われる請求項２８記載の方法。 （３５）前記相同ゲノムＤＮＡ領域が、植物ゲノムの天
然成分である請求項３５記載の方法。 （３６）前記相同ゲノムＤＮＡ領域が、公知方法により
植物ゲノム内に人為的に予め組込まれている請求項３３
記載の方法。 （３７）前記相同ゲノムＤＮＡ領域が、異種起源のもの
である請求項３６記載の方法。 （３８）前記相同ゲノムＤＮＡ領域が、高い発現効率を
有するゲノムの領域にある請求項３３ないし３７のいず
れか１項に記載の方法。 （３９）前記相同ゲノムＤＮＡ領域が、表現型マーカー
またはもう１つの容易に検出可能なタンパク質産生物を
コードする請求項３６または３７のいずれか１項に記載
の方法。 （４０）請求項１ないし２７のいずれか１項に記載の組
換えＤＮＡ分子を含有するＤＮＡ移入ベクタ（４１）請
求項１ないし２７のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ
分子を含有するＤＮＡ発現ベクタ（４２）請求項４０記
載のＤＮＡ移入ベクターを含有する宿主細胞。 （４３）請求項４１記載のＤＮＡ発現ベクターを含有す
る宿主細胞。 （４４）請求項１ないし２７のいずれか１項に記載の組
換えＤＮＡ分子を含有する請求項４２または４３のいず
れかに記載の宿主細胞。 （４５）微生物である請求項４２または４３のいずれか
に記載の宿主細胞。 （４６）植物細胞である請求項４２または４３のいずれ
かに記載の宿主細胞。 （４７）植物材料が請求項１ないし２７のいずれか１項
に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された遺伝子導入
植物体およびそれらの種子からなる植物材料。 （４８）請求項１ないし２７のいずれか１項に記載の組
換えＤＮＡ分子を含有する植物細胞。 （４９）前記植物材料が請求項４８記載の植物細胞を含
有する遺伝子導入植物体およびそれらの種子からなる植
物材料。 （５０）前記植物材料が請求項４８記載の植物細胞から
再生された遺伝子導入植物体およびそれらの種子からな
る植物材料。 （５１）ナス科、シュウジバナ科、キク科、ユリ科、ブ
ドウ科、アカザ科、マツカゼソウ科、アリアセアエ科、
ヒガンバナ科、アスパラガセアエ科、ラン科、ヤシ科、
アナナス科、アカネ科、ツバキ科、バショウ科、ホモノ
科、およびレグミノサエ目からなる群から選択される請
求項４０、４９または５０のいずれかに記載の植物材料
。 （５２）ナス科、ジュウジバナ科およびホモノ科からな
る群から選択される請求項４７、４９または５０のいず
れかに記載の植物材料。 （５３）フラガリア、ロータス、メティケーゴ、オノブ
リィキス、トリホリウム、トリゴネラ、ビグナ、シトラ
ス、リナム、ゲラニウム、マニホット、ドーカス、アラ
ビドプシス、プラッシカ、ラファヌス、シナピス、アト
ロバ、カプシカム、ダチュラ、ハイオシアムス、リコペ
ルシコン、ニコチアナ、ソラヌム、ペチュニア、ジギタ
リス、マジョラナ、シコリウム、ヘリアンタス、ラクチ
ュカ、プロムス、アスパラガス、アンチリヌム、ヘメロ
カリス、ネメシア、ペラルゴニウム、パニカム、ペンニ
セタム、ラヌンカルス、セネシオ、サルビグロッシス、
ククミス、プロワリア、グリシン、ロリウム、ゼア、ト
リチカム、ソルガム、イボモエア、パッシフローラ、シ
クラメン、マルス、プルナス、ローザ、ルプス、ポプラ
ス、サンタラム、アリウム、リリウム、ナルシサス、ア
ナナス、アラキス、ファセオルスおよびピサムからなる
群から選択される請求項４７、４９または５０のいずれ
かに記載の植物材料。 （５４）ロリウム、ゼア、トリチカム、ソルガム、サッ
カルム、プロムス、オリザエ、アベナ、ホルデウム、セ
カーレおよびセタリアからなる群から選択される請求項
４７、４９または５０のいずれかに記載の植物材料。 （５５）突然変異体および変種を包含する請求項４７お
よび４９ないし５４のいずれか１項に記載の遺伝子導入
植物体の後代。 （５６）遺伝子導入植物体から得ることができるプロト
プラスト、細胞、カルス、組織、器官、種子、花粉、胚
珠、接合子または胚またはその他の増殖材料からなる請
求項４７および４９ないし５５のいずれか１項に記載の
遺伝子導入植物体のムカゴ。 （５７）請求項２８記載の方法により、予め形質転換さ
れた遺伝子導入植物体またはそれらの後代から発生し、
そしてこの様に少なくとも部分的には遺伝子導入細胞か
ら構築される花、茎、果実、葉、根等の植物の部分。
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