JPH04502701A - 検出可能な表現型のファージ形質導入による細菌の検出 - Google Patents
検出可能な表現型のファージ形質導入による細菌の検出Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ロ な のフ −ジ/ による の
二1Fと1量
1、1浬Fと11
本発明は、一般的には生物試料における細菌の検出と同定に関する。更に詳細に
は、本発明は、目的とする細胞に特異的に感染し且つ検出可能な表現型に感染細
胞を形質導入することができるバクテリオファージによる生物試料のスクリーニ
ングに関する。
細菌の種および株の検出および同定は、様々な場合に興味がある。例えば、食料
、水および他の食品を病原菌による汚染について迅速にスクリーニングすること
ができることが必要とされている。患者の検体での細菌の検出も、多くの感染性
の病気の治療に必要である。後者の場合には、細菌を具体的に分類することがで
きることが望ましい場合がしばしばあり、各種の殺菌剤に対する感受性について
細菌をスクリーニングすることが更に望ましいことがある。
これまで、細菌の同定には、血清分類、栄養学的スクリーニングおよびファージ
分類のような各種の手法が用いられてきている。血清分類では、標的細菌上で異
なる細胞表面抗原に結合することができる抗体のパネルを用いる。栄養学的スク
リーニングは、様々な種類の細菌の代謝の要件の変動によるものである。良好に
定義された培地上で細菌を生育させる(または生育させる試みを行う)ことによ
って、生育に必要な物質および生育を阻害する物質に基づいて細菌を分類するこ
とができる。
本発明にとって特に興味深いのは、バクテリオファージが別種のファージの宿主
範囲が限定されることに基づいて細菌培養物を分類するのに用いられてきたこと
である。未知細菌の純粋培養物の一部を別種のファージのパネルで感染させるこ
とを試みることによって、細菌細胞の種類を決定することができる。
このようなファージ分類法は細菌の種類を同定する上で極めて精確であり且つ確
定的な方法であるが、この方法は時間が掛かり、手間も掛かる。試料中の細菌を
、先ず純粋な培養物を単離することができるように生育させねばならない。次に
、純粋培養物の個々のコロニーを生育させた後、数個に分割してパネル中の種々
のファージに暴露させねばならない。
暴露の後に、通常のプラーク分析を行って、各種のファージの感染性を決定する
。全体の処置には24〜48時間またはそれ以上掛かり、それを行うには極めて
熟練した者が必要とされる。処置が長たらしく且つ細菌コロニー中のプラークを
同定する必要があるため、この手続きは自動化がし難い。更に、時間を必要とす
るため、この手続きは治療に先立つ患者の感染の性質を決定するのには理想的で
はない。
加熱処理または部分加熱滅菌により弱体化された細菌のような無力化した細菌は
、多くの食品加工の局面において主要な検出の問題である。このような無力化し
た細菌は生育能力を有して(おり、したがって潜在的に病原性を有して)いるこ
とがあり、しかも十分に弱体化しているので、通常の分析法による検出には非選
択的回収段階(予備濃縮)と次に選択的濃縮段階で標的とする細菌を生育させ、
競合する生物の生育を抑制することができるようにすることが必要な場合がある
。このような追加段階は、分析を行うのに要する時間を著しく増加することがあ
る。
空気、水および土壌のような開放的環境での特定の細菌の検出も問題があること
がある。存在し得る細菌の種類が多種多様であるため、関心のある特定の種類を
識別することが困難であることが多い。
上記の問題点に鑑み、生物学的試料において細菌細胞を検出し、同定するための
改良されたファージスクリーニング分析法を提供することが望ましい。特に、こ
れらの分析を比較的短時間に行うことができ且つこの分析法が極めて単純で半熟
縁者でも行うことができることが望ましい。これらの分析を混合培養物について
最少限の段階数で行い、且つ容易に観察され、自動読取りを行いやすい検出可能
な結果を生じるのが好ましい。この分析を用いなければ検出には予備濃縮段階お
よび選択的濃縮段階を必要とするような無力化した細菌をこの分析で検出するこ
とができるのが更に望ましい。また、空気、水および土壌のような開放的環境中
で特定の細菌細胞を迅速且つ好都合に検出することができることが望ましい。
2、實景孜専鬼脱所
細菌細胞の表面を特性決定するのにバクテリオファージを使用することは、Ma
kela著、Enterobacterial Surface−Antige
ns:Methods for Mo1ecular Characteriz
ation+Korhonenら監修、Elsevier 5cience P
ublishing 、ツムステルダム155〜1フ8頁(1985年)に述べ
られており、従来のプラーク分析法を用いて特定のファージの感染性を決定して
いる。バクテリオファージP22の分子遺伝学は、5usskind &Bot
stein著(1978年) Microbiol、Rev、、42.385−
413に述べられている。P22が形質導入ベクターとして働く能力は、渡辺ら
(1972年) Virol、、50,874−882および叶bach A
Jackson著(1982年) J、Bacteriol、、149,985
−994に記載されている。
pac配列を組み込んだ組換プラスミドを選択的に形質導入するのにP22を使
用することは、Schmidt & Schmieger著(1984年) M
o1.Gen、Genet、、196.123−128およびVogel &S
chmieger著(1986年) Mo1.Gen、Genet、、205,
563−567に記載されティる。外来遺伝子を、5panova & Kar
lovsky著(1986年) Folia Microbiol、、31,3
53−363に記載されているように、トランスポゾン突然変異誘発によりバク
テリオファージしくP22に関連)に挿入する。クローニングベクターとしてス
ファージを用いることは、Young K Davis著(1983年) Pr
oc。
Natl、Acad、Sci、USA、 80.1194−1198に記載され
ており、未知の遺伝子生成物を抗体プローブによって検出することができること
が記載されている。クローニングベクターとしてM13ファージを用いることは
、Vieira & Messing著(1987年) Meths。
Enz、、153.3−11に記載されている。
細菌は、選択的培地、免疫同定法および核酸プローブのような多くの手法によっ
て生物学的試料中で検出することができる。サルモネラを検出するための特定の
方法は、米国特許第4.689.295号公報に記載されている。食品中でサル
モネラを検出するファージに基づいた試験は、ASM Needs (1987
年)53.542に記載されている。この試験では、ファージを用いて標的のサ
ルモネラの表面への吸着を媒介する。
氷形成を成核する能力は、数種類の水成核陽性(Ina” )細菌中の単一の遺
伝子によってコードされることが報告されており、この能力は水成核遺伝子を有
するプラスミドでの形質転換によりE、コリに形質転換することができる。米国
特許第4,464.473号明細書H0rserら著、Mo1ecular G
eneticsof the Bacterial−Plant Intera
ction (A、Puhler監修)Elsevier/North Ho1
land Biochea+1cal+353−361頁(1983年);Gr
een ら著(1985年) 、Nature、317.645−648 ;お
よびCoro t t。
ら著(1986年) EMBOJ、、5,231−236を参照されたい。P、
シリンガニ(P、syringae)中の水成核遺伝子(遺伝子1naZ)の配
列情報は報告されている(Greenら著(1985年)同上)。対応するタン
白質は、分子量が約1.2X10Sのものである。このタン白質の同定および精
製に関する情報は、Wolberら著(1986年) Proc、Natl、A
cad、Sci、USA、83.7256−7260に報告されている。P、フ
ルオレスセンス(P、 f l uorescens)の水成核遺伝子(遺伝子
1naW)についての配列情報も報告されている。
Warrenら著(1986年) Nuc、Ac1ds Res、、14.80
47−8060を参照在についての既知の試験法である。無核表面上で容積■(
通常は0.01d)のN個の液滴を配列させ、温度T(0’C未満)に冷却し、
凍結した液滴の数Ntを数えることから成っている。次に、IId当たりの核の
数を下記の弐:核#!=(1/VHog−(N/ (N Nt ) )によって
算出する。G、Vali著(1971年) J、Atoms、Sci、、28,
402−409゜発皿曵互!
本発明によれば、生物学的試料中の生育可能な細菌を検出して同定するための方
法および組成物が提供される。これらの目的のため、生育可能な細菌という用語
は遺伝子を(一時的にまたはその他の方法で)発現させることができる総ての細
菌を包含する。組成物とは、既知の宿主範囲の細菌に惑染し、これらの細菌に形
質導入して容易に検出し得る表現型、好ましくは水成核表現型とすることができ
るバクテリオファージ粒子である。本発明の方法はほとんどの種類の細菌を検出
するのに好適であるが、標的細菌はバクテリオファージの感染を受け易いもので
なければならず且つ野生型細菌はそれ自体検出可能な表現型を産生ずることがで
きないという制限を有する。目的の生物学的試料は、生育可能な条件において細
菌を支持し且つ保存することができる実質的に任意の源から得ることができ、患
者標本、水、酪農製品、食肉製品等がある。かかる試料は、混合したまたは不純
な個体群の細菌を含むことがあり、目的の標的細菌を含むことがあるが必ずしも
含むとは限らない。本発明の好ましい方法は、特に食品中のサルモネラの検出で
ある。
本発明の方法は、細菌の存在について試料をスクリーニングしまたは未知の株ま
たは種の細菌を分類するのに用いることができる。スクリーニングには、比較的
広い宿主範囲を有する単一バクテリオファージのみが必要となる。生物学的試料
を細菌の生育を促進するのに好適な条件モにてインキュベーションするのであり
、純粋培養物を提供する必要はない。
このようなスクリーニング手続きは極めて速やか且つ簡単であり、食品または水
試料のような汚染された試料を同定するのに特に有用である。細菌分類法は、対
照的に、独特なまたは重複した宿主範囲を有するバクテリオファージのパネルを
用いる。バクテリオファージのそれぞれを、典型的にはファージパネルの各種の
部分を試験を行う細菌の(純粋または他の)培養物の部分に加えることによって
、培養物に対して試験する。次に、細菌の種類を、個々のバクテリオファージの
反応性のパターンに基づいて決定する。分類には細菌の純粋培養物を用いること
があるが、本発明の方法はファージの感染性の検出が極めて速やかであり、分析
に要する全時間を著しく短縮するという利点を有する。更に、水成核のような検
出可能な表現型は自動化した装置で容易に検出することができるので、分析に要
する労力が軽減される。
本発明の方法は、特定の細菌に対するバクテリオファージの特異性を利用するも
のである。この特異性は、バクテリオファージを改質してマーカー遺伝子を含ま
せるときに保持される(実施例5参照)。その結果、本発明の分析法による検出
は、他の(標的でない細菌の)存在とは無関係に特異的に行うことができる。勿
論、本発明の改質したバクテリオファージは、これが由来する野生型ファージに
比較するとその宿主範囲特異性が幾分変化することがあることも(好ましくはな
いが)可能である。かかる変動は、バクテリオファージが目的の細菌に対する特
異性を保持し且つ特定の試料に存在する可能性がある他の細菌に対する特異性を
持たない限り問題とはならない。
本発明の方法の重要な利点は、生育可能であるが、例えば、熱、低温または脱水
のような有害なまたは弱体化させる処理に暴露することによる何らかの方式で無
力化(生理学的に妥協)する細菌細胞を含む分析法に用いることができることで
ある。かかる無力化は、通常は工業的処理、例えば食品に由来する細菌性汚染物
の処理中に生じる。本発明の分析法は、健康な細胞および無力化した細胞の混合
物中の無力化した細胞のような無力化した細胞を検出することができる(実施例
4、熱により無力化したサルモネラ細胞を含む)。この方法では著しく時間を節
約することになり、この方法は予備濃縮段階および選択的濃縮段階の必要性が最
少限度になりまたはなくなる。これらの段階は、通常は他の生物の個体数を抑制
しながら標的細胞を検出可能な水準にまで増殖させる手段として他の細菌分析法
に用いられる。Andrews著、InjuredIndex and Pat
hogenic Bacteria、Boca Raton、フロリダ、56−
113頁(1989年)を参照されたい。弱体化した細胞は選択的濃縮の苛酷さ
に耐えることができないので、先行する非選択的な「予備濃縮」段階を用いて弱
体化した細胞を安定化させることが多い。食品医薬品局のSa1monella
単離プロトコールでは、この2つの段階(予備濃縮および選択的濃縮)のそれぞ
れについて最低22時間としている。Andrehs ら著、Bacteri−
ologfcal Analytical Manual、第5版、食品医薬品
局、コロンビア特別区、第■章、1−29 (1979年)。したがって、本発
明の方法は、無力化した細胞を有する系に通用するときにはかなりの時間の節約
になる。
好ましい態様では、形質導入するファージは氷成核遺伝子を有する。試料を、先
ずファージの細胞への付着を促進する条件下で、典型的には約35°C〜40°
Cの範囲の温度で、撹拌せずに、約15〜120分の範囲の時間、ファージと共
にインキュベーションするのである。その後、試料を、水成核部現型の展開を促
進する条件下にて、典型的には約20°C〜25°Cの範囲の温度で約30分〜
2時間の範囲の時間懸濁液中でインキュベーションする。水成核部現型に形質転
換した細菌は、通常のクリオアッセイによって、典型的には試験を行う懸濁液を
容積が約10m未満の液滴に分割し、この液滴を約−3°C〜−12゛Cの範囲
、更に一般的には約−8”C〜−】0°C範囲の温度に暴露することによって検
出される。このような温度範囲で氷核が形成されることは、細菌の細胞表面に氷
の成核部位が存在することを示している。
、W体煎嶌」1111哩
本発明は、改質したバクテリオファージ、以後形質導入粒子と表わす、を用いて
、生物学的試料中の細菌細胞を検出しまたは同定する。本明細書に用いられる形
質導入粒子という用語は、改質したバクテリオファージの成分部分であってこれ
らの成分部分を適当な条件下で互いに混合すると結合して改質したバクテリオフ
ァージを形成するものをも包含するものとする。生物学的試料は、細菌の生育を
支持し或いは生育可能な状態で細菌細胞を懸濁することができる実質的に任意の
物質または媒体であることができる。本発明にとって特に興味深い生物学的試料
には、水、土壌、食品試料、例えば食肉製品および酪農製品であって細菌による
汚染を特に受けやすいもの、患者の試料、例えば血液、血漿、血清、痰、***、
唾液、洗浄液、糞便、細胞培養物等がある。
検出される細菌の細胞の範囲は、利用可能なバクテリオファージの宿主範囲によ
ってのみ制限される。特に興味あるのは、食品および水供給物を汚染することが
でき且つ動物およびヒトに病気を引き起こす原因となる病原性細菌である。これ
らの病原性細菌は通常はグラム陰性であるが、ダラム陽性菌の検出および同定も
本発明の一部である。特に興味深い細菌宿主、これらの宿主によって引き起こさ
れる病気およびこれらの宿主に感染することができるバクテリオファージの代表
的リストを、第1表に示す。
】−」−一部
ブーム (Uリー五久だbじ]:ヅ
Bordetel la 陰性 百日咳 N、八、 PEREVER5EVら、
pertussis Zh、Mikrobiol、、5.54−57参照
Brucel Ia 陰性 プルセラ病 TB;212;371abortus
Mycobacterium −一 結核 LG、DSGAtuberculo
sis
Sa Imone l Ia 陰性 腸チフス 163;175;ViI ;V
iVI ;8;t)’phi 23;25;46;175Sa1monel I
a 陰性 胃腸炎 1.;P22;102typ102typhi 敗血症
5alsonella 陰性 胃腸炎 31;102sch102schott
+ 敗血症
Sa1monel la 陰性 胃腸炎 102cholerae 5uis
敗血症
5erratia 陰性 傷の感染症 S24VAShigella 陰性 細
菌性の下痢 φ80;P2;2;37dysenteriae
Staphylococcus 陽性 中毒シEIツタ、 K;Pi;Pl、4
;1lc18;15;17;29;42D;
47;52;53;79;80;
81;83A;92
Streptococcus 陽性 連鎖球菌感染症 φX240;IA;IB
;12/12;pyrogenes 113 ; 120 ; 124Vibr
io 陰性 コレラ 138;1145; 149;163cholerae
Yersinia 陰性 ペスト R;Y;PIestis
Listeria 陽性 髄膜炎、abcess 243monocytoge
nes
aeroginosa 感染症
Escherichia 陰性0 ***症 Pi;/;T4olt
Klebsiella 陰性 呼吸器系、尿路 60;92感染症
本発明の形質導入粒子は、天然に存在するバクテリオファージを改質して、標的
細菌を容易に識別し得る表現型に形質転換することができる遺伝子、以後−次マ
ーカー遺伝子と表わす、を有するようにすることによって得られる。形質導入粒
子は、細菌宿主が検出可能な方法で遺伝子の機能を発現することができるように
一部マーカー遺伝子を標的細菌宿主に特異的に導入することができるものでなけ
ればならない。多くのバクテリオファージが存在し、所望な宿主範囲とバクテリ
オファージが目的とする遺伝子を有し且つ形質導入する能力によって改質される
ように選択することができる。特に、バクテリオファージは、−次マーカー遺伝
子、関連したブロモーター領域および包含される任意の他のDNA領域を収容し
得るほどに十分大きなものでなければならない。本発明の改質バクテリオファー
ジは、一般的には未改質バクテリオファージの正常な宿主範囲特異性を保持する
が、選択される標的細菌を同定する能力に悪影響を及ぼさない限り特異性が変化
してもよい。
改質されるバクテリオファージは溶菌性または毒性を有するものであってもよく
、好ましくは溶菌性であって標的細菌において一部マーカー遺伝子を長時間に亙
って発現するものである。或いは、バクテリオファージの改質によって、標的細
菌宿主中にマーカー遺伝を導入することができるが細胞溶解性または溶層性感染
を行うことができない欠陥のある形質導入粒子を生じることがある。後者の場合
には、−次マーカー遺伝子は、感染した宿主中に支持され且つ発現されるプラス
ミドまたは他の自己複製エピソーム単位の一部であってもよい。ファージから誘
導された正常な宿主範囲外の標的細胞に感染するときにも、同様な結果(感染な
しのマーカー遺伝子の導入)が起こることがある。
マーカー表現型の形質導入は、マーカー遺伝子の一次的発現(すなわち、細胞に
よって安定に受け継がれていない遺伝子からの発現)によって起こることがある
。このような場合には、バクテリオファージによって形質導入されたDNAは、
全試験期間中そのままの形でいることは出来ない。しかしながら、ファージによ
って形質導入されたマーカー遺伝子の転写は、DNAが分解して試験期間の終わ
りまでに機能マーカーを集めてしまう前に十分効率的である。したがって、細菌
がファージDNAを分解するとしても、細菌を本発明の分析法によって検出する
ことができる。
本発明に有用なバクテリオファージは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション、12301バークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド20
852のような微生物貯蔵機関から得ることができる。毒性バクテリオファージ
は無細胞溶解物として利用可能であるが、溶加性バクテリオファージは一般的に
は感染した宿主細胞として利用可能である。
任意の源から得た野生型バクテリオファージを従来の組換DNA技法によって改
質して、目的とする検出可能な表現型を産生ずることができる所望な一部マーカ
ー遺伝子を導入することができる。導入の前に、目的とするマーカー遺伝子を、
適当な遺伝子カセット上のプロモーター領域と結合する。遺伝子カセットは、E
、coliのような適当な宿主中で通常の組換DNA技法によって構築すること
ができる。マーカー遺伝子とプロモーター領域は両方とも標的宿主中で機能する
ように選択すべきであり、カセットは所望ならば抗生物質耐性、重金属耐性等の
二次マーカー遺伝子を包含して、試験管内操作を容易にすることができる。
一部マーカー遺伝子(または、単独遺伝子系でない場合には、複数の遺伝子)は
、標的細菌宿主中で容易に検出可能な表現型を発現することができるものとする
。好適な表現型には、生物発光、酵素によって触媒されるカラーの産生(例えば
、酵素β−グルクロニダーゼCGUS)を用いる)、水成核活性などが挙げられ
る。通常の水成核分析法を用いて容易で且つ速やかに検出されることが本明細書
で示されている水成核活性を用いることが好ましい。本開示の残りの部分は主と
して氷成核活性および標的細菌細胞の導入および検出に向けられるが、開示され
た原理は他の検出可能な表現型にも広く適用することができる。
好適な水成核遺伝子を、水成核部現型を自然に表わす微生物から単離することが
できる。水成核遺伝子の例とこの遺伝子が単離される細菌には、プスードモナス
シリンガエ5203(Pseudomonas syringae 5203)
から単離される1naZ、ブスードモナスシリンガエPS31から単離される1
naY、 P、フルオレセンスMS1650(P、fluorescens M
S1650)から単離される1na14、およびエルウィニアヘルビコラ(Er
winia herbicola)から単離される1ceEが挙げられる。1n
aZの配列はGreen & 14arren(1985年) Nature、
317,645−648に記載されており、1na−の配列は何arrenら(
1986年) Nucl、Ac1d、Res、、14.8047−8060に記
載されているが、これらの文献の開示内容は参考として本明細書に包含される。
米国特許第4,464.473号公報も参照されたい。また、この公報の記載内
容は参考として本明細書に包含される。これらの文献教示内容は、当業者が野生
型から水成植生物を単離し、それから通常のクローニングおよびスクリーニング
手法によってina遺伝子を得るのに十分である。
本発明の形質導入粒子は多数の従来の遺伝学的操作法、例えばマーカー遺伝子カ
セットのバクテリオファージゲノム中への部位を指定した挿入、マーカー遺伝子
またはその一部を有するプラスミドのバクテリオファージコート中へのパンケー
ジング、トランスポゾン突然変異誘発および同種組換によって作成することがで
きる。これらの変法の選択は、細菌宿主の性状、バクテリオファージの性状およ
びバクテリオファージが特性決定される程度によって変わる。
十分に特性決定されたバクテリオファージ、特に遺伝学的に遺伝子の位置決定が
されたものについては、プロモーター領域のような一部マーカー遺伝子カセット
および所望ならば二次マーカーを標準的組換DNA手法によってバクテリオファ
ージゲノムに配置するのが望ましいことがある。上記のような好適な宿主中でプ
ラスミドを作成した後、マーカー遺伝子カセットを摘出して、所望なバクテリオ
ファージ中に挿入する。他のバクテリオファージにも一般化することができるλ
フアージ中への挿入法は、Young & Davis(1983年) Pro
c。
Natl、Acad、Sci、USA、 80.1194−1198に3己載さ
れており、この文献の記載内容は参考として本明細書に包含される。
溶解性または溶層性感染が可能な形質導入粒子は、バクテリオファージゲノムの
本質的でない領域を欠失して遺伝子カセットを置換することによって製造される
。望ましくは、欠失し、挿入される領域はほぼ同じ大きさであり、パッケージン
グが破壊を最少限に止どめて行うことができるようにする。
しかしながら、場合によっては、特に比較的大きなマーカー遺伝子カセットを挿
入することが所望な時には、バクテリオファージゲノムのある種の本質的領域を
欠失する必要があることもある。このような場合には、形質導入粒子はDNAを
所望な細菌宿主に送入する能力を保持するが、宿主内部で再生を行うことができ
なくなる。しかしながら、野生型バクテリオファージであって、本質的なパフケ
ージング機能を提供することができるもののようなヘルパーバクテリオファージ
を提供することによって再生を行うことができる。
また、良好に特性決定されたバクテリオファージに就いては、DNA構成体中の
バクテリオファージpac部位にプラスミドまたはカセットを付着させることに
よってプラスミドまたはマーカー遺伝子カセットをパッケージすることが可能で
ある。pac部位はバクテリオファージゲノムから得て、−次マーカー遺伝子、
プロモーター領域および所望ならば二次マーカーを有するプラスミド中にクロー
ニングすることができる。次に、プラスミドを高貴な細菌宿主に形質転換し、こ
れに次に欠損pac部位を有するバクテリオファージを感染させる。細菌宿主は
、次いでプラスミドおよび/またはプラスミドDNAをその宿主範囲の細菌中に
挿入することができるバクテリオファージコート内部でパッケージされたマーカ
ー遺伝子カセットを有する形質導入粒子を産生ずる。p、aC部位をクローニン
グし、パッケージング欠損バクテリオファージを産生ずる一般的方法は、Vog
el & Schmieger(1986年)Mo1.Gen、Genet、
、 205.563−567に記載されており、その開示内容は参考として本明
細書に包含される。
余り特性決定されていないバクテリオファージについては、トランスポゾン突然
変異誘発を用いて本発明の形質導入粒子を作成することができる。ファージL
(Salmonella typhimu−rius+)の突然変異誘発につい
ての5panova & Karlovsky(1986年) Folia M
icrobiol、、31,353−363の方法(この開示内容は参考として
本明細書に包含される)を−膜化して他のトランスポゾン、バクテリオファージ
および細菌宿主に適用することができる。前記のプラスミドからのマーカー遺伝
子カセットを、先ず通常の手法によって所望なトランスポゾンに挿入する。次い
で、改質したトランスポゾンを、好適な宿主に改質トランスポゾンとバクテリオ
ファージの両者を同時感染させることによって所望なバクテリオファージ中に転
位させる。
宿主細胞を次に溶菌が起きるまでインキュベーションし、放出されたファージを
集める。放出されたファージの一部はトランスポゾンインサートを有している。
次に、バクテリオファージのない宿主細胞に前記の方法で得られたファージ混合
物を感染させて、トランスホモン上に存在する検出可能なマーカーを有する細胞
を選択する。次に、改質トランスポゾンを有するバクテリオファージが溶層性に
なった溶菌されていない選択された細胞を選択媒質にのせて、所望なフェノタイ
プについてスクリーニングする。こうして選択された細胞は、適当なプロモータ
ーのコントロール下で所望な一部マーカー遺伝子を有するプロファージを含む。
次に、形質導入粒子が、プロファージを誘発して溶菌状態にすることによって得
られ、これによって細胞溶解を生じ、多量の好適な形質導入粒子を放出させるこ
とができる。
トランスポゾン突然変異誘発による形質導入粒子の作成における二次選択マーカ
ーの使用は有効であるが、必要とされるものではない。突然変異誘発によって一
部選択マーカー、例えば水成核遺伝子を有するようになったファージは、例えば
水成核遺伝子の場合の氷核に対するレプリカ・ブレーティング・アッセイのよう
な適当な分析法を行うことによって野生型ファージのバックグラウンドに対して
同定することができる。かかるスクリーニング法はLindowら(1,978
年) App。
Environ、Microbiol、 、 36.831−838に教示され
ており、この教示内容は参考として本明細書に包含される。
前記の手法に加えて、形質導入粒子は、低頻度形質導入粒子または高頻度形質導
入粒子を同種組換によって作成することもできる。低頻度形質導入粒子は、最初
に目的とするバクテリオファージゲノムの制限ライブラリーを作成することによ
ってマーカー遺伝子カセットを有するプラスミドから構成することができる。こ
のライブラリーからの制限フラグメントを、次に好適な宿主中のプラスミドにク
ローニングして、野生型バクテリオファージと同種の比較的大きな領域を有する
プラスミドを生じさせる。この領域は、当該技術分野で十分に記載されている方
法で同種組換法におけるクロスオーバ一点として働(。次に、この組換プラスミ
ドを適当な細菌宿主に導入して、−次または二次マーカー遺伝子を発現するコロ
ニーを選択して、野生型バクテリオファージを感染させる。
このバクテリオファージの感染によって産生される形質導入粒子は比較的低い割
合が挿入体としてマーカー遺伝子カセットを有する全プラスミドを有する。次に
、新鮮な細菌培養物に混合形質導入粒子を感染させ、形質転換コロニーをプラス
ミドによって担持される一部マーカ一または二次マーカーの発現によって選択す
る。
S、チビムリウム(S、 typhimurium)を特異的に感染させること
ができる低頻度形質導入粒子の作成の具体例を、下記の実験の部に実施例2とし
て示す。
通常は約5%を上回る比較的高い形質導入頻度を有する低頻度形質導入粒子を用
いて、本発明の分析法を行うことができる。低率の形質導入を存する形質導入粒
子については、通常は細菌宿主を更に改質して、高頻度形質導入粒子を産生させ
るのが望ましい。
高頻度形質導入粒子は、同種組換の標的として細菌ゲノム中のプロファージを用
いること以外は前記の方法によって作成される。このために、溶加性株(プロフ
ァージとしてゲノム中に野生型バクテリオファージDNAを有する株)を用い、
宿主中で複製することができない遺伝子マーカーカセットを有するプラスミドで
形質転換する。このようにして、選択的マーカーをプロファージに組み込んだ宿
主のみが、適当な選択的条件下で生育可能となる。或いは、プラスミドを変えて
、プロファージでの組換が容易に検出されるようにすることもできる。所望な細
菌宿主中で複製することができないプラスミドを、数種類の手法で作成すること
ができる。例えば、前記の方法で作成した低頻度形質導入ファージを複製を妨害
するプロファージによって発現される免疫機能として用いることができる。第二
に、好適なりローニング宿主において複製可能であるが目的の標的宿主では複製
が不可能なプラスミドを用いることができる。最後に、このプラスミドを改質し
て、−次マーカー遺伝子をプロファージに挿入し、二次マーカーをプロファージ
に組み込まれている領域外にお(ようにすることができる0次に、−次選択表現
型を発現するが二次選択表現型を喪失した細胞に就いてのスクリーニングによっ
て組換を検出することができる。所望なマーカー遺伝子のプロファージへの組み
込みは、5outhern (1975) J、Mo1ec、Biol、、98
+503−517に記載されているサザン・プロット法のような標準的手法によ
って確認することができる。
S、チビムリウムに特異的に感染することができる高頻度形質導入粒子の具体例
を、下記の実験の部の実施例3に示す。
同種組換による高頻度形ts人粉粒子好ましい作成法には、挿入可能な要素がト
ランスポゾンの本質的な末端配列に連結した目的とする検出可能な表現型に対す
る遺伝子を含んで成るトランスポゾン・タッキングのしようが挙げられる。この
ような挿入可能な要素は、バクテリオファージゲノム中の位置を同定することが
可能になり、このゲノム中で氷成核または他のリポータ−遺伝子を本質的なバク
テリオファージの機能を妨害することなく挿入することができる。一般的に、任
意の細菌性トランスポゾンを用いて、挿入可能な要素を作成することができる。
生成する挿入可能な要素の大きさは出初るだけ小さくして成熟ウィルス粒子中に
生成するファージゲノム全体をパッケージ出初るようにするのが望ましい。
トランスポゾン・タッキングにおける好適な部位の発生の頻度は低いと考えられ
るので、用いられる細菌性トランスポゾンは、転位結果を選択することができる
機能をコードするのが好ましい。このため、天然に存在するトランスポゾンを改
質して、小型の選択可能なトランスポゾンを提供することができる。トランスポ
ザーゼ機能を転位可能な要素の末端から分離することができる任意のトランスポ
ゾンが好適である。
これには、Is(挿入配列)要素、例えばl550、および転位可能な医薬品耐
性要素、例えばTn3 、Tn5およびTn7が挙げられるがこれらに限定され
ないことは、当該技術分野で知られている通りである。当該技術分野において極
めて詳細に特性決定されているように改質するには、細菌性トランスポゾンTn
5が最も好都合である。Krebs & Reznikoff(1986年)J
、Mo1.Biol、、192.721−791HDodson & Berg
(1989年) Gene、76.207−213゜
一つの方法として、トランスポゾンの本質的な末端DNA配列を、当該技術分野
に知られている方法によって化学的に合成することができる。これらのDNA配
列を合成する場合に、多数の制限エンドヌクレアーゼに対する制限部位を含むフ
ランク配列(ポリリンカー)を含むことが有利である。これによりトランスポゾ
ン要素の両端の間への選択可能なマーカーの挿入が容易になり、こうして作成さ
れる要素をベクタープラスミド中へ容易にクローニングすることができ、ベクタ
ープラスミドの選択は特定のバクテリオファージに対する細菌性宿主の性質によ
って変わる。当該技術分野で周知のように、Co1E1 、 P15Aまたはp
MB9レプリコン(例えば、pAT273、pAcYc184、pBR322ま
たはpUc19)に由来する狭宿主領域プラスミドがエンテロバクテリアエ(E
nterbactriaceae)科からの細菌に用いるのに好適であるが、通
常は不和合性群IncP、 IncWまたはIncQ (例えば、pRK2、p
S−aまたはpRsFloloに由来するもの)に由来する任意の広宿主領域プ
ラスミドが他のグラム陰性菌に用いるのに好適である。ダラム陽性菌に対しては
、当該技術分野に知られている他の好適なプラスミドベクターを用いることがで
きる。
選択されたトランスポゾンに対するトランスポザーゼはトランスポゾンの両端の
間に配置されないのが好ましい。この方法では、転位可能な要素が一旦バクテリ
オファージゲノムに挿入されてしまえば第二の転位操作を行うことが不可能にな
る。一般的には、この配置が輸送される要素と同じDNA分子上に(すなわち、
シスに)なることが望ましいが、トランスポゾンとトランスポザーゼはある種の
系では、別個のプラスミドレプリコン上に(すなわち、トランスに)配置するこ
とができる。
トランスボザーゼタン白質に対するコード配列を高発現性細菌プロモーターの加
硫に挿入することによって、転位可能な要素のトランスポザーゼ遺伝子の発現を
改質することも望ましいことがある。かかるプロモーターは当業者に知られてお
り、E、 col iのtac 、 trcおよびlacプロモーターが挙げら
れる。細菌性トランスボザーゼの過剰発現は宿主細胞にとって有害であることが
知られているので、選択されるプロモーターからの転写を調製することができる
ようにすることも望ましい。tac 、 trcおよびlacプロモーターのよ
うなプロモーターは、1acI遺伝子の生成物であるlacリプレッサーによっ
て抑制される。トランスポザーゼと同じ分子上にかかる遺伝子を包含することに
より、抑制が少ない条件(すなわち、誘起条件)下でのみトランスボザーゼタン
白質が確実に発現するようになる。1acl遺伝子に対しては、化学的イソプロ
ピルプロとルチオガラクトシド(IPTG)は、lacリプレッサーを制限しや
すい。
一般的には、高発現性でありながら抑制可能なプロモーターとその関連リプレッ
サー遺伝子との結合は、同じ結果を与える働きをする。選択可能なマーカーを転
位可能な要素の両端の間にインサートとして用いるときには、マーカーはできる
だけ小さくすべきである。転位可能な要素の大きさはlkb未満とするのが好ま
しい。通常は、抗生物質耐性遺伝子は所望なものよりも大きいが転位されるDN
Aの絶対的大きさは個々のバクテリオファージのパッケージ限度によって決定さ
れる。
選択の好ましい手段は、H,coliに記載されているようなラクトース利用に
対するα−相補性の現象を用いる。ここで、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の小さ
なフラグメント(長さが約500bpである1acZαフラグメント)は、アミ
ノ酸が欠失した(M15欠失)他の突然変異体ポリペプチドに対する機能を回復
するポリペプチドをコードする。トランスポゾンの両端の間に1acZαフラグ
メントが包含されることにより、プラスミド上にまたは染色体中にlacZM1
5欠失を有する宿主細菌に対するラクトース利用を回復する能力によって、挿入
されたDNAを有するバクテリオファージを選択することができる。
これらの2種類の活性をコードするDNAフラグメントは詳細に特性決定されて
おり、当業者が容易に操作することができる。1.Zabtn ら、The 0
peron (J、H,Millerら監修) 、ColdSpringer
Harbor Laboratory (−ニー ・ヨーク)、104−107
(1978年)を参照されたい。
前記のように、トランスボザーゼ、末端片DNA、マーカーDNAおよびリプレ
ッサーを含むプラスミドが、細菌性ゲノム内部にプロファージDNA (例えば
、P22)を含む細菌細胞(例えば、サルモネラ)中に導入される。トランスボ
ザーゼは適当な化学的誘導物質(例えば、IPTG)によって誘導され、細菌細
胞を多数の世代に亙って生育させる9次に、プロファージを適当な化学的誘導物
質(例えば、マイトマイシンC)によって誘導され、バクテリオファージを産生
ずる。
トランスポゾン挿入を有するバタテリオファ・−ジは、適当な細菌宿主(例えば
、M15欠失を有するもの)に誘導されたファージ溶菌生成物を感染させること
によって選択される。感染細胞は、マーカーに対して選択的な媒質上で培養され
、プロファージゲノムであってこれも末端片とマーカーを含むトランスポゾンフ
ラグメントを含むものを含む細胞が選択される。次いで、選択された細胞を誘導
してファージ溶菌を行い、純粋なファージ調製物を得る。トランスポゾン挿入を
有するバクテリオファージのDNAフラグメントは、イン・ビトロ法を用いて単
離される。このフラグメントを適当なプラスミドベクター上でクローニングする
。次に氷遺伝子を、イン・ビトロ法を用いる選択可能なマーカー(例えば、1a
cZα)の代わりに用いる。次いで同種組換を、このようにして作成した氷遺伝
子を含むプラスミドを用いて行うのであり、同種組換には細菌性ゲノムのプロフ
ァージDNAとプラスミド上の氷遺伝子をフランクするプロファージDNAとの
間の組換がある。ファージ誘導によって生成する株は、プロファージDNA内部
の部位において氷遺伝子DNAを含む形質導入粒子を生成するが、この部位に氷
遺伝子が存在することは本質的なファージの機能を破壊しない。
前記のようにして作成される形質導入粒子を用いて、下記の方法により生物学的
試料中の標的細菌を検出する。幾つかの場合には、生物学的試料を感染させて、
そして表現型を直接観察することが可能になるが、他の場合には試料中に存在す
る細菌の集積培養物を最初に作成するのが好ましい。試料を得て(必要であれば
)集積培養物を作成する方法は生物学的試料の性状によって変わり、各種の試料
の型を作成するのに好適な手法は、標準的微生物および細菌学の教本、Berg
ey’ sManual of Determinative Bacteri
ology (8版) 、Buchar、+n& Gibbons(監修) 、
Williams & Wilkens Co、、バルチモア(i974年);
Manual of Methods for General Bacter
iology+Gerhard tら(監修) 、Ao+、Soc、Micro
biology 、ワシントン(1981年);およびManual of C
11nical Microbiology(2版)、Lennetteら(監
修) 、Am、Soc、Microbiology 、ワシントン(1974年
)に詳細に記載されている。
生物学的試料が(集積培養物の増殖を伴って又は伴わないで)作成されてしまっ
たならば、これを典型的には形質導入粒子の細菌への結合と遺伝子材料の注入を
促進する条件下で、典型的には細菌を迅速に増殖させる温度(例えば、35°C
〜40℃)で撹拌せずに十分に感染を行うことができる時間(例えば、15分〜
120分間)の条件下で形質導入粒子に暴露させる。
ina遺伝子を存する形質導入粒子については、試料を次に低温(例えば、20
゛C〜25°C)でインキュベーションして水酸液部位を形成させる。短時間の
後、典型的には30分から2時間後に、試料を下記に更に詳細に記載されている
方法で氷核について分析することができる。
水酸液遺伝子を有する形質導入粒子については、Vali(1,971年)上記
、に記載した通常の液滴凍結分析法が水成核部現型への形質転換を検出するのに
有用である。また、水成核部現型を検出するための特異的傾向凍結分析法は米国
特許第4,784,943号公報に教示されており、この開示内容は参考として
本明細書に包含される。簡単にいえば、水酸液を検出する分析法は、水性状態に
おいては水性媒質の凍結または融解を行うときに螢光または可視特性に変化を表
わす螢光化合物を用いることから成る。好適な螢光化合物は、フルオレセイン族
、例えばカルセイン、カルボキシフルオレセインおよび関連化合物から選択する
ことができる。
前記のように、本発明の分析法は生物学的試料をスクリーニングして、形質導入
粒子の宿主領域にある細菌が存在するかどうかを決定するのに有用である。本発
明は、ファージの感染を決定するためのプラーク分析法による通常のファージ分
類と同様な方法で細菌の種および株を分類するのにも有用である。
本発明による分類には、異なる、通常は重複している宿主領域を有する形質導入
粒子のパネルが用いられる。次に、標的細菌の種および株を、各種の形質導入粒
子との反応性のパターンによって決定することができる。このような試験は、単
一キャリヤー上で行い、キャリヤー表面上の固定形状またはマトリックスに異な
る形質導入粒子をスポットすることができる9次いで、反応性のパターンを迅速
に観察することができる。
本発明は、栄養スクリーニングと組み合わせて、検討を行う細菌を更に特性決定
することができる。集積培養またはコロニー形成培養中に選択的媒質を供給する
ことによって、増殖し続けることができる細菌の領域を制限することができる。
本発明の表現型分析法は増殖可能な細胞を検出することができるだけであるので
、検出可能な表現型がなければ存在し得る細菌の種類が制限される。形質導入粒
子の宿主領域と選択的媒質の増殖可能領域とを適当に組み合わせることによって
、本発明の方法を決定を行う細菌の種類に対して極めて特異的にすることができ
る。
細菌宿主を特異的に同定する本発明の能力を増加させる第二の方法は、免疫吸着
の使用である。抗血清またはモノクローン性抗体のような固定化抗体を用いて、
細胞表面のエピトープの同一性により細菌細胞を特異的に補足する。次に、この
細菌を、前記のような本発明の形質導入粒子を用いて更に検出することができる
。固相表面の特定の細菌の種および株の免疫吸着に好適な材料および方法は、E
nterobacterialsurface antigens:Metho
ds for molecular characterfzation。
Korhonenら(監修)Elsevier 5cience Publis
hers、Am5terdara(1985年)に記載されている。
本発明は、抗生物質および他の殺菌剤に対する細菌の感受性を決定することがで
きるので、本発明は患者の診断薬に於いて特に有用である。細菌のスクリーニン
グを行う抗生物質または殺菌剤と共に短時間インキュベーションを行った後、本
発明の形質導入粒子に暴露することによって、細胞の代謝活性が停止し、表現型
の変化が防止される。このような試験は、前記のような形質導入粒子を用いて細
菌の存在を最初に確認した後に用いられる。次に、細菌の感染にとって致命的で
あることを決定する抗生物質および殺菌剤を用いて、患者を治療することができ
る。このような迅速且つ容易な抗生物質および殺菌剤の検出は、重度の細菌感染
症の治療に極めて重要である。
具体的な態様では、ファージ特異性により本発明のバクテリオファージに予め感
受性を付与しておいた細菌を分析する手段が提供される。すなわち、第一段階で
は、標的細菌を例えば形質転換によって改質してこれらの細菌がこのバクテリオ
ファージに対する細胞特異性受容体を含むまたは発現するようにする。第二段階
では、改質した(または標識した)細菌を置くことになる試料環境に、これらの
細菌を導入しまたは混合する。この試料環境は、屋外(例えば、土壌、空気また
は水)、生活宿主(例えば、植物、動物または昆虫)、装置(例えば、製造、加
工またはパッケージング装置)および臨床試料のような細菌が存在する任意の設
定とすることができる。次に、(前記のような)本発明のバクテリオファージ分
析法を、導入される受容体に特異的なバクテリオファージを用いて行い、標識し
た細菌の存在を監視しまたは定量することができる。
この態様の利点は、これが放出される細菌と同じ種類の細菌(または極似した細
菌)を含むまたは同じ種類の細菌(または極似した細菌)を別個の源から導入す
ることができる試料環境に放出される細菌を追跡しまたは探知する手段を提供す
ることである。追跡される細菌は、この追跡される細菌中に導入された細胞特異
的受容体の存在によって他の細菌(すなわち、本質的に同じである細菌)と識別
することができる。
このようにして、交差反応性(バックグラウンド)なしで(受容体成分以外は)
同様な細菌の存在において、放出された細菌の存在について分析する機会が提供
される。
プスードモナスを監視する典型的な方法では、コーリーファージλの受容体であ
ることが知られているE、coliのlamB遺伝子が用いられる。G、Vri
es o(1984年) Proc、Natl、Acad、Sci。
tlsA、81.6080−6084 ;およびR,Ludwig (1987
年)同上、84.3334−3338を参照されたい。また、これらの文献の開
示内容はいずれも参考として本明細書に包含される。I amBの発現によって
、Pseudomonas種はλファージが付着し且つファージDNAを注入し
易くなる。受容体遺伝子、例えば水成核遺伝子を有する組換λファージは、通常
は強プロモーターの制御下にて、法官主領域プラスミド中に構築される。I a
mB遺伝子を(例えば同種組換によってう分析される細菌の染色体中に挿入され
る。次いで、本明細書の教示にしたがって分析を行う。
この方法の一つの具体的使用はブスードモナス土壌細菌およびプスードモナス着
生細菌のようなプスードモナス細菌であって、特定の環境または設定、例えば土
壌、温室または畑の設定中に放出されるものを監視することである。放出される
細菌の少なくとも幾つかの種類は、最初に形質転換されてバクテリオファージ特
異性受容体を発現する。次いで、後になって環境から細菌を集めることによって
、環境中の細菌の存在を決定することができる。この方法は、細菌の存在、移動
および生存能力を追跡する手段を提供する。
下記の実施例は冷時のために提供するものであり、制限のためのものではない。
INA形質導入粒子を、下記のようにして作成した。水成核遺伝子1naY (
プスードモナスシリンガエ株PS31から単離されたもの、この株はDeini
nger ら(1988) J、Bacteriol、、170+669−67
5に記載されている)をプラスミドpLVC76に挿入することによって、pυ
C118プラスミド−M13バクテリオファージ系(Vieira & Mes
sing(1987) Meths、εnz、 、 153.3−11)を改質
した。また、このプスラミドもM13バクテリオファージpac部位を有する。
次に、形質導入粒子を、パッケージング−欠損M13へルバーファージを用いて
産生させた。1naY遺伝子はIacプロモーターの制御の下で元のρ1Ic1
18プラスミドから誘導され、生成する形質導入粒子はE、コリのメール(Fo
)株に対するM13ファージの特異性を保持した。
この形質導入粒子を0.2 tnanミツイルター過させて(調製物に残ってい
る任意のINA”細胞を除去し’j 、−12’Cまでは水成核活性がないこと
を見出した。E、コリMV1193 (Fo)の形質転換の効率を、pLVC7
6によって担持されたアンピシリン耐性遺伝子の活性に基づいて水成核活性とは
無関係に測定した。INA形質導入粒子(10m)に暴露した細胞(1004;
OD、。。−0,001)のコロニー成形分析は、37°Cで30分間インキュ
ベーションし、1蔵に希釈し、50it!の分量を培養することによって行った
。結果を第2表に示す。
形質導入粒子は2つの効果を生じた。第一に、それらは細胞生存能力を低下させ
た。このような生存能力の低下は、ヘルパーファージ、すなわち粒子を構成する
のに用いられ且つ形質導入粒子を汚染するパッケージング欠損ファージによって
引起されるものと考えられる。第二に、それらは幾つかの細胞を形質転換してア
ンピシリン耐性にした。アンピシリン耐性コロニーの5個を氷核について調べた
ところ、試験した低ファージ濃度で回収されたコロニーの数を用いて最初に存在
した細菌の数を算出すると、高ファージ濃度での形質転換効率は約5%であった
。
E、コリMV1193の試料を、次のようにして試験した。細胞(100バ、0
0.。。−0,01)をINA形質導入粒子の懸濁液(10゜希釈) 10J1
1と共に37°Cで2時間インキュベーションした後、室温で1時間インキュベ
ーションした。次に、試料を40X101I!に滴/希釈液であって、希釈は最
初の試料濃度の10−1から10−5まで10倍ずつにしたものから成る標準液
滴凍結分析法で水成核活性について試験した。凍結分析法の結果を、第3表に示
す。
算−」し−表
T(’C)d当りの核 d当りの核 d当りの核 最初の細胞当(TP’sなし
)1 (細胞なし)(細胞+TP’ s) りの核の%2−3.7 0.0 0
.0 3.0X10’ 0.002%−4,10,00,06,9X10” 0
.099%−4,60,00,01,6X1030.23%−5,20,00,
0B、2X1031.2%−6,20,00,01,6xlO’ 2.3%−7
,30,00,02,4xlO’ 3.5%−8,20,00,02,5xlO
’ 3.6%−9,30,00,01,4xiO’ 19.8%−11,10,
00,03,0xlO542,8%I TP’sは形質導入粒子である。
2 細胞の最初の濃度は、1.00(7)00.0゜が7.0X10”細胞/d
であるという近似関係を用いて算出した。検出限界は5核/dであった。
3時間後に、試験では、希釈懸濁液中の細胞の数を測定したところ、感度(約4
0%)はコロニー形成分析法の感度(約90%)にほぼ等しかった。コロニー形
成分析では、E、コリに対して約15時間を要した。バックグラウンドは、検出
限界を下回った。それ故、信号:ノイズ比は少なくとも105であった。データ
ーは、水成核分析に典型的な温度依存性感度を示し、−11°Cでのデータ一点
は、細胞の全数がINA+フェノタイプに形質転換されたことを示していた。
INA形質導入ファージの生物学的特異性について試験するため、E、コリのF
−株(JE5505、K12誘導体)をE、コリ門ν1193について前記した
のと同じ方法を用いて試験した。
E、コリの形質導入を試みたところ、検出可能な核は生じなかった。抗生物質感
受性または耐性は、下記のようにして試験した。実験は、細菌を最初にテトラサ
イタリン(10I1g/m1)クロラムフェニコール(50■/戚)または抗生
物質なしく対照)と共に37゛Cで30分間インキュベーションしたこと以外は
、第3表に関連して記載したのと本質的に同してあった。この実験の結果を、第
4表に示す。
−3,61,lX10’ 0.0 0.0−4.0 2.9X10” 0.0
1.lX10”−4,74,3X1.O” 0.0 4.3X10”−5,49
,2xlO’ 0.0 1.1.xlO’−6,31,8X10’ 0゜0 2
.OXl、O’−7,23,2xlO’ 0.0 3.0xlO’−8,24,
3xlO’ 0.0 3.2xlO’−10,23,0X10’ 0.0 3.
0X10’l 試験条件は、細胞を表に示した抗生物質と共に37°Cで30分
間予備インキュベーションした後、INA形質導入粒子を添加したことを除いて
、第3表のものと同じであった。
この分析では、試料中のテトラサイクリン耐性菌の数を正確に測定し、これらの
細菌の総てがクロラムフェニコール惑受性であることを正確に決定した。したが
って、本発明の分析法は、抗生物質耐性および感受性についてのスクリーニング
に好適である。
2、 サルモネーチビムリウムの\
水成核活性を付与することができる低頻度形質導入粒子をプラスミドpRLG6
1のバクテリオファージP22による同種組換によって得た。プラスミドpR1
,G61は、tacプロモーター(Bagdasarianら(1983年)
Gene、26,273−282)の転写制御下で水成核遺伝子1naW(Co
rottoら(1986年’) EMBOJt、5,231−236に記載の方
法でブスードモナスフルオレセンスMS1650から単離)を含む。複製の源と
アンピシリン耐性遺伝子はρBR322(Bolivarら (1977年)
Gene、2.95−113)から誘導され、pRLG61はP22染色体のH
indnI消化物からクローニングされたP22 DNAの4.3kb挿入体を
含む。pRLG61は試験管内で構築され、E。
コリ中でクローニングされた。プラスミド起動系を用いて、これを次にサルモネ
ラチピムリウムLT2株に抱合させる二とによって形質転換した。pRLG61
(LT2)株(RGSIと命名)に対する水成核分析では、高水準の水成核活
性が示された。
INA形質導入粒子は、RGSIの液体培養物を細胞当り5プラ一ク形成単位(
PFU)の感染の多重度(m、o、i、)で野生型P22ファージで感染させる
ことによって作成した。感染培養物を数時間インキュベーションし、粗製のファ
ージ含有溶菌物を培養物をクロロホルムで処理しく細菌細胞を溶解させ)た後、
遠心分離を行って(細胞破片をペレット化)することによって作成した。ファー
ジは、未だ活性を有する氷核のような各種の細胞物質と共に上澄液画分に残った
。次いで、塩化セシウムブロックグラディエントによる遠心分離によって、氷核
および売のタン白質生細胞混入物からファージ粒子を分離しくこれを3M15M
界面から集め)た(Davisら(1980年)Advanced Bacte
rial Genetics、Co1d Sprnger Harbor La
bora−tory、コールドスプリングハーバ−、ニュー・ヨーク、80〜8
2頁)、最後に、ファージ含有画分を透析して、塩化セシウムを除去した後、0
.45J!raフイルターを通して濾過して調製物を滅菌した。
それらの形成の性質のため、この調製物中の形質導入粒子と野生型ファージの比
率は小さかった。水成核活性の検出とトランスフェクションされた培養物からの
薬物耐性形質導入体の回収は両方とも、約1000回の正常な溶菌性感染に対し
て唯1回の形質導入を生じることができたことを示唆していた。
(前記のようにRGSIをP22で感染させることによって誘導した)低頻度形
質導入粒子の調製物を用いて、1naW遺伝子をS、チビムリウムLT2の培養
物中に形質導入した。比較的効能度の培養物を用いて、形質導入粒子調製物中の
主要な種である野生型ファージによる致死超感染から形質導入細胞を保護するよ
うにした。また、ファージを宿主細胞に吸着させた後アンピシリン(Ap)を培
養液に加えて、野生型P22による溶菌性感染の割合を更に低下させた(宿主細
胞も野生型ファージもApに対する耐性を持たなかった)。形質導入ファージの
種特異性を、形質導入粒子調製物を用いてE、 col 1A81157株の平
行トランスフェクションによって試験した。
S、チビムリウムLT2とE、coli AB1157の末期対数相培養物(0
0600= 0.5〜1.0 )に、約0.1PFU/細胞のm、o、i、で形
質導入粒子調製物を感染させた。培養物を37゛Cで撹拌せずにインキュベーシ
ョンし、粒子を20分間宿主細胞に吸着させた。対照試料を平行して実験し、こ
れは形質導入ファージに「感染した」滅菌ブイヨンと未感染細菌培養物とから成
っていたeApを感染培養物に加え、インキュベーションを37°Cで撹拌しな
がら更に40分間継続した。次いで、培養物を24℃で1時間インキュベーショ
ンして、水成核活性を発現させた。
次に、第3表に関連してE、コリについて前記した方法で水成核分析を行った。
LT2とAB1157培養物のODh’oo測定したところ、それぞれ1.0お
よび0.67であった。結果を、下記の第5表に示す。
裏−」L−表
−5,70008,7X10’ 1.2X10−’−6.0 0 0 0 2.
9X10” 4.lX1O−5−7,00001,8X10” 2.6X10−
’−8,00008,7X10’ 1.2X10−’−9,00003,9X1
0’ 5.6X10−3−10.0 0 0 0 2.lX1053.0X10
−”−11,00002,7X105 3.9X10−2この表は、温度の関数
としての実験試料の水成核活性を表わしている。最初の培養物1戒当りの氷核の
累積頻度は特定の温度について与えられている。右端の欄の(%INA” LT
2)は、細胞数の画分パーセントとして表わしたld当りの氷核の数を表わし、
ODa。。〜1.0に対しては7X106細胞数/ mlと計算された。
前記の結果は水成核活性の発現が、感染されやすい宿主株(LT2)の形質導入
ファージ調製物による感染の結果としてのみ起こることを示している。宿主細胞
もファージ自体も、検出可能な水成核活性は発現しない。更に、E、coli
AB1157では水成核活性の検出可能な形質導入が観察されなかったので、こ
の実験は1na−遺伝子の形質導入の後にも粒子の宿主株特異性が保持されてい
ることを示している。形質導入頻度が示しているように、前記の実験において観
察された氷核の最大頻度、2.7 XIO’ /dは形質導入ファージ調製物の
PFLI当りIXl、0−3の氷核に対応した。
プラスミドpRLG61の形質導入も、アンピシリン耐性コロニーをトランスフ
ェクションした培養物から回収することによって検出された。前記のような感染
および初期インキュベーションの後に、細胞をアンピシリンを含む寒天培地に塗
布した。寒天表面には、熱で殺菌したLT2の層を予め被覆してあり、受容細胞
を吸着させて、調製物中の致死野生型ファージから保護した。アンピシリン耐性
の形質導入コロニーは、−晩インキユベーションした後に生じた。この結果は、
形質lファージ調製物のPFU当り6X10−’のAprコロニーのpRLG6
1に対する形質導入頻度を示していた。したがって、2つの別個の実験により、
この系の形質導入の頻度は、形質導入粒子調製物のPFυ当り10−3〜10−
2回の範囲の形質導入であると決定された。
要約すれば、低頻度形質導入粒子は、水成核遺伝子をファージP22中に形質導
入することによって調製された。次に、こうして産生じた粒子をサルモネラチビ
ムリウムLT2株に形質導入したところ、容易に検出可能な水成核活性を付与す
ることを見出した。実験の対照試料におけるバックグラウンド水成核活性は存在
しないことが見出され、P22に対して非許容性である細菌のE、coliのト
ランスフェクションの試みからは水成核活性は生じなかった。
3、 ファージP22t P′多 二
下記に、ファージP22を用いて展開した高頻度形質導入(HFT)系を説明す
る。この系は、サルモネラの感染をうけやすい株に1na−遺伝子の高頻度形質
導入を行うことができた。このHFT系は、形質導入したリポータ−遺伝子(ブ
ルートモナスフルオレセンスからの1na−水成核遺伝子)が高頻度形質導入粒
子/ファージ(HFTPs)を産生させるのに用いられるサルモネラの溶加性株
に含まれるR22プロフアージとの永久共組込み体として存在するように構成さ
れた。HFTP産生株を増殖することによって、あらゆる細胞がTPsの(組換
プロファージの溶菌性サイクルを誘導した場合の)潜在的産生体であり、非形質
導入野生型の復帰ファージに対して高率のTPsを生じる培養物を生じた。
2種類の基本的成分を用いて、HFT系を構成した。i)S、チビムリウムのp
olA突然変異株(DNAポリメラーゼ■を欠く)、およびii ) Co1E
l型の複製源を有するプラスミドpRLG68、水成核活性およびアンピシリン
(Ap)耐性をコードする起動性プラスミド。
AA3007とよばれる(Whitfjeld & Levin (1973年
)J。
Bacteriol、、116.54−58) polA株はCo1E1によっ
て誘導されたプラスミドの自律複製を支持することはできないので、この株を特
異的に用いた。引き続く操作においてその使用を促進するため、最初にAA30
07のスペクチノマイシン耐性(Sc’)誘導体を次のようにして選択した。A
A3007の培養物を5dのL−ブイヨン(LB)中で一晩(ON)37°Cで
生育させ、次に、ON培養物2戚を用いて、Scを100硝/−の濃度で含む2
00dの■、ブイヨン培養物に対する接種物として用いた。
24時間生育させた後、LB+S c (S c、50g/d)プレート上で、
プレート当り24時間液体培養物50illを用いて培養物の複製培養物を作成
した。Sc′コロニーは、37°Cでプレートを24時間生育させた後、同定し
単離した。一つのこのようなSc’コロニーは^A3007Scゝ株の源であり
、これ以後RGSIOと命名した。RGSIO上のR22の生育を確認し、R2
2に対して溶層性となった、RGSIIと呼ばれるR22に対して溶層性となっ
た誘導体を、RGSIOの芝生上に形成されたR22プラークの曇り中心から細
胞をストリークすることによって単離した。
HFT系の他のキー要素はプラスミドpRLG68であり、これは高発現1na
W (水成核)遺伝子の(同種組換による)組込みが促進されるように設計され
た。pRLG68を2段階で構成される。最初に、4゜6kbのBamHI /
Hind m制限酵素フラグメントで得られるjnaWのクローンを発現ベク
タープラスミドpKK223−3にクローニングした(Brosius & H
o1ly (1984年)Proc、Natl。
Acad、Sci 、USA、 81.6929−6983)。pKK223−
3はアンピシリン耐性(Ap’ )遺伝子、複製源およよびpBR322のrb
om」部位(であっである種の細胞抱合系によって起動されるもの)を含み(B
olivarら(1977年) Gene、2.95−113)、更にこれはプ
ラスミドのポリリンカー(マルチクローニング部位)領域に接近して挿入された
外来遺伝子に増進するように配置された強力なtacプロモーター(de Bo
erら(1983年) Proc、Natl。
Acad、5ci−USA、80.2l−25)を含む。中間の1naW/ p
KK223−3構築物はpRLG66と呼ばれた。pRLG68の構築の第二お
よび最終段階は、R22染色体性DNAのフラグメントのpRLG66中の部位
への挿入を含んだ。P22物理地図中でBamHIフラグメント「B」としてし
られる2、5kbのR22フラグメント(Rutila & Jackson(
1981) Virology、113,769−775)をR22染色体のB
ancHI消化物から精製し、pRLG66の(tacプロモーター領域の直ぐ
蒸留の)特異BamH1部位に挿入して、本質的なプラスミドの機能を妨害した
り1na−の発現を干渉したりしないようにした。
R22フラグメントは究極的には)IFTP産生株の構築中にR22プロフアー
ジ中の外来DNAの挿入の点となるので、このフラグメントはR22の基本的ラ
イフサイクルに本質的な遺伝子を欠いているものを選択した。生成するR22/
pRLG68構築物はpRLG68と呼ばれた。
(pBR322前駆体から究極的に誘導される)pRLG68のbom碩域は、
細菌の接合中に起動して移動させ、接合および起動の機能は接合ドナー株によっ
てトランスに提供されるようにした。したがって、pRLG68をE、coli
GJ23株中に形質転換し、この株中でpRLG68がR64drdll /
pGJ28系(Van Hauteら(1983)EMBOJ、、2,411
−417)によって起動可能にし、且つそこから中間種接合を介してRGSII
に移動した。pRLG68は、 (polA突然変異により)受容体RGSII
株中で自律的に複製することができなかったので、交配からの任意のAp’ S
c’生成物はR22DNAのプラスミド領域とプロファージ中の同種領域との間
の同種組換から生じるR22プロフアージ中のpRLG66挿入体を含むものと
仮定した。若干数の代表的クローンの(そのAA3007およびRGSl、l前
駆体株と一緒の)サザンブロント法による分析では、pRI、G68/P22共
組込み体の形成と一敗する結果が得られた。生成する株はRGSl2と呼ばれ、
HFTPsを産生ずる株であった。
HFTPsは、R22および他の関連ファージの溶原に溶菌サイクルを誘導する
ことが知られている薬物であるマイトマイシン−CT:RGSl2の培養物を処
理することによって、この株から産生じた(Arberら(1983年) La
mbdaII、Co1d Spring HarborLaboratory、
コールドスプリングハーバ−、ニュー・ヨーク、443−445頁)。このよう
なl?G512の誘導によって子孫ファージ流の複製とパッケージングが起こり
、これらの粒子の多くは組換HFTPsであった。RGSl2の培養物をLブイ
ヨン中で37°Cで中間−指数相(A6゜。=0.40)まで生育させ、この時
点でマイトマイシン−〇を5mMの最終濃度になるまで加えた。
培養フラスコを箔で覆い、細菌の光活性DNA修復機構を促進する光を遮断しく
これによって誘導の効率をできるだけ低くシ)、インキュベーションを数時間再
開して、細菌細胞を完全に溶解した。細菌破片を2,000Xgで20分間遠心
分離することによって溶菌培養物から除き、上澄液を0.45μフイルターを通
して除菌した。更に、l?G512上澄液を55℃で15分間加熱したところ、
(材料の標準的液滴凍結分析によって分析した)残留している水成核活性を破壊
し、HFTP自体には悪影響を及ぼさないことが判った。実験上の対照として、
PGSII(非組換で溶層性のRGSl2の祖先株)から同様な方法でファージ
を産生した。
幾つかの実験では、RGSl2 HFTPを特性決定した。第一に、マイトマイ
シン−Cによって誘導されたRGSIIおよびRGS12培養物からのファージ
調製物の力価を、同様に処理した非突然変異体LT2 (P22) ”の溶原性
株(LT2はRGSIIおよびRGS12の激しい非突然変異性原種体である)
から産生じたファージの試料と比較した。力価は、LT2(P22)” 、RG
SIIおよびRGS12調製物に対してそれぞれ109.10!lおよび10’
PFtl/dであった。ファーシカ価は細菌叢に形成されたプラークを計数する
ことによって測定されるので、溶菌性感染を行うことができるファージのみが分
析可能である。RGS12調製物の力価から比較的低いことは、TPの比率が著
しいことを示唆しており、はとんどのTPは溶菌性の生育が不完全であり(それ
らが含む異種DNAは本質的なりNAを締め出すことになる)からである。これ
は、生成したR3GIIおよびRGS12ファージDNAの制限消化物の電気泳
動分析によって確認され、これはRGS12ファージDNAに余分な制限フラグ
メントの存在を示した。余分なフラグメントの大きさはpRLG68/ P22
プロファージ共組込み体で予言したものと一致した。更に、それらの相対的強度
から、ファージ粒子のほとんどが余分のDNAを含むことが判った。
下記の実験では、前記と同様にして作成したのと同じRGS12HFTPの調製
物を用いた。RGS128FTPを用いる水成核活性(INA)の形質導入によ
る細菌細胞の検出を、以後「形質導入分析」と呼ぶことにする。形質導入分析法
は、細菌を含む試料のHFTPによる感染と、試料中で発現した水成核活性(I
NA)の最終的定量から成っている。初期の実験は、HFTP系を用いて細菌を
特性決定し且つ検出を最適にするために行った。最終的に、実験は、下記の実施
例のような実際の食品試料中の細菌の分析を模倣するために行った。
下記の実験は、全卵混合物中に存在するサルモネラの検出を説明するために行っ
た。S、チビムリウムLT2株の培養物を、Lブイヨン中で37°Cで光学濃度
(A&。。)が0.35になるまで生育させた。次に、この培養物を10倍ずつ
希釈して生の混合した卵(すなわち、卵黄と卯白を一緒に混合したもの)に加え
、卵中の希釈列は、最初の(Ab。。−0,35)培養物に対して10−5にま
で及んだ。細菌はRGS12 HFTPを用いて下記のようにして形質導入によ
って分析した。10−2〜10− ’細菌希釈液/卵のそれぞれの40mの試料
を滅菌したしブイヨン360 !J1に加え、最初の試料の10倍希釈液を構成
した。更に、細菌を接種していない混合物の対照試料を同様にして作成した(L
Bで1:10に希釈)。細菌を接種していない混合物の対照を除いたそれぞれの
試料にRGS12 HFTP調製物100I!1を加え(全体で2 X106P
Ftlを含んだ)、対照は代わりに滅菌したしブイヨンを等量刑えた。次に、試
料を37°Cで1時間および23”c テi 時間インキュベーションして、形
質導入したINAを発現させた。次に、形質導入した試料のTNAを、下記のよ
うにして液滴凍結分析法によって測定した。それぞれの形質導入した試料に、螢
光染料混合物(100mMカルボキシ−フルオレセイン、100mM トリス−
H(、epH7,0) 1 /100容積を加えて、分析の際に凍結物の検出を
容易にした(試料の色は凍結により螢光性の黄色から鈍い赤色に変化する)。次
に、それぞれ試料の希釈液を、(総ての希釈液中1mM強度での)同じカルボキ
シフルオレセイン緩衝液で10−1から10−5までの10倍ずつで作成した。
(最初の細菌培養物の形質導入希釈液である)最初の分析試料のそれぞれ希釈
液の20X10Jllの液滴を、次に温度調節した冷却槽の表面に浮かせたパラ
フィンで被覆した箔上に載せた。次に、槽の温度を−2,0°Cから−12,0
°Cまで80分間を要して下げたときの液滴の凍結を監視した。次に、未処理の
凍結液滴データーを用いて、最初の試料中における氷核の頻度を算出した(Va
li(1971年) J、Atmos、Sci、+28+402−409)。そ
の最終的形態では、データーは累積INA温度スペクトル、すなわち、ある温度
範囲における1−当りの氷核の数として表わされている。上記の実験の結果を第
5表に2、 未接種卵十〇FTP O00
1上記データーは形質導入試料で行ったINA分析の結果を示している。細菌/
Idは1.形質導入の試料を作成するために細菌/卵混合物のLB中での1=l
O希釈液を考慮して、最初の培養物のA6゜。から算出した( A b o。=
0、7 = 5 Xl0B細胞数/d)。
第5表に示されるように、HFT系を用いるINAの形質導入では、LT2細胞
が存在する総ての試料中で、(LBで希釈してHFTPを添加した後)この細胞
を250細胞数/dの濃度程度まで検出することができた。また、未接種卯試籾
から明らかなように、細菌が存在しないときには、バックグラウンド活性は存在
しなかった。これらの実験で観測されたINAは、ここのINA”細胞が検出さ
れたという点において強力な結果計数性を有していた。これを簡単にいえば、試
料中の細胞の大多数はINA”表現型に形質導入されているので、試料のINA
の頻度で細菌の細胞濃度を計算することができたのである。したがって、−12
°C(この温度ではINAの検出が最も感受性が高い)でのINAの測定は、試
料中のLT2細胞の個体数と強力に相関していた。
要約すれば、高頻度形質導入系はファージP22で展開され、tacによって促
進される1naW遺伝子の形質導入はP22プロファージ中に水成核遺伝子を含
むサルモネラ株からの形質導入粒子を製造することによって最大になった。DN
A分析技術によってその構造を立証した後、HFT系を形質導入分析法に用いて
、接種を行った生卵の試料中に存在するLT2細胞を検出した。形質導入分析法
は、疎らな数の細菌を検出するのに極めて高い感度を示し、バックグラウンド信
号がなく、且つこの分析法は存在する細菌細胞の数を計算するのに用いることが
できることを示した。
4、鼾ヱ男】進上−丸綴股員圭で」L
この実施例では、無力化した細菌のファージ形質導入に対する応答を試験し且つ
これらの細菌がこの方法によって検出し得るようになるまで要する回収時間を決
定するように設計された一組の実験を説明する。
細胞の損傷は、サルモネラチピムリウムの培養液を有害なほどの高温に暴露する
ことによって行い、その時間中、試料の一部を経時的に採取して、L寒天(豊富
な非選択的培地)およびSS寒天(ザルモネラおよびシゲラの単離に用いられる
極めて選択的な培地)で培養した。−晩のインキュベージタンの後、それぞれの
熱処理した試料のLおよびSS寒天上で生育したコロニーの相対数を用いて、熱
処理によって生じた損傷の程度を測定した。下記の実験では、前記の実施例(実
施例3)に記載の高頻度形質導入(HFT)系を用いる熱によって損傷を生じた
細胞の形質導入の結果を説明する。
下記の実験において、LT2の希釈培養物を水槽中に浸漬することによって55
°Cに暴露した。試料の一部を、時間O(すなわち、水槽に浸漬する直前)、お
よび浸漬の後60 、90゜120および150秒の時間に培養物から採取した
。この試料を希釈したものをLおよびSS寒天上で直ちに培養して、細菌に対し
てなされた初期の損傷を評価した。次に、それぞれの試料を分割して、2組の同
じ熱処理した試料を作成した。一方の組は、RGS12形質導入ファージを用い
て、(実施例3に記載したのと同じ)方法であってインキュベーションが全部で
2時間、すなわち37°Cで1時間、次いで23℃で1時間である方法を用いて
形質導入した。試料の他の組は形質導入を行わず、形質導入を行ったものと平行
してインキュベーションして、形質導入手続き中の熱によって無力化した細胞の
回収について対照とした(この観察は、ファージに感染した試料では不明瞭であ
った)。次に、形質導入されない対照試料の希釈物を、形質導入インキュベーシ
ョンが終了した時点でLおよびSS寒天上で培養し、分析を行って、形質導入し
た試料によって発現されたINAを測定した。実験の結果を第655°Cでの秒
数
1 培養数と熱無力化実験から採取した試料のINAの比較。
個々のプレート上のコロニー数を希釈しない培養物についての−当りのコロニー
形成単位(cfu)に翻訳してrNAデーターと直接比較することができるよう
にした。r<DLJとは、コロニー数が検出限界を下回る(すなわち、コロニー
は希釈した培養液では検出されない)場合を示し、この実験の培養のDLはI
X10”cfu/−であった。「無力化%J値は、100−%(SS上のcfu
/L上のcfu)で表わし、培養に就いての検出限界を下回る最高値は計算で置
換した。
熱処理の一つの明らかな効果は、細胞を完全に殺すことでありこれにより増殖可
能な細胞数は経過時間の終わりまでに95%まで減少した。後で採取した生存細
胞から無力化した細胞の数が増加することも明らかであり、すなわちLBで培養
可能な細胞の極僅かだけがSS寒天で増殖することができた。
第6表で明らかなよ・うに、90秒後に採取した試料はほとんどまたは完全に無
力化した細胞を含んでいた。特にこれらの後者の試料では、熱処理の効果は形質
導入処理の終了まで持続し、培養物は分割することが出来ず、120秒および1
50秒の試料では更に2時間の内に更に死亡するものがあった。しかしながら、
酷く損傷を受けた試料では増殖は見られないが、形質導入分析を行うのに要した
時間のうちに、無力化した状態から幾分か回復した。回復の程度は一層重度に損
傷を受けた試料では少なく、最初に無力化した細胞の大半は処理の終了までその
状態のままであった。
第6表に示した結果は、形質導入試料中に発現した氷核の頻度は生育可能な細菌
(すなわち、無力化されたまたは無力化されていない状態で熱処理を生き延びた
細胞)のそれぞれの個体数に緊密に対応し、これは、初期の個体数が無力化した
細胞だけから成るときにも真実であった。これに対する重要な推論は、熱処理に
よって殺された細胞は分析には現れないということである。要約すれば、熱で無
力化した細菌の形質導入による検出に対する応答は、実質的に健康な細胞の応答
と同じであった。これらの結果は、ファージ形質導入分析を、無力化細胞を確実
に検出するための回復期間を必要とせずに行うことができることを示している。
要約すれば、細胞損傷はS、チビムリウムL72株の培養物において55°Cに
様々な長さの時間暴露することによって誘導された。熱で損傷した試料またはL
B寒天およびSS寒天の培養を次に行った。2種類の培地で増殖した細菌コロニ
ーの数の差を用いて、細菌培養物に対する損傷の尺度とした。
次に、形質導入分析を、RGS12 HFTP系を用いて、これらの熱で無力化
した細菌について行った。分析の結果は、無力化した細菌が健康な細菌と同じ高
率で検出され、処理によって殺された細菌は分析による検出では見られなかった
ことを示し下記の実験では、各種の血清群からの多数の異なるサルモネラ血清型
の分析におけるP22由来の形質導入系の応答を試験した。実施例3に記載した
「高頻度形質導入J (HFT)系を、下記の実験で用いた。高頻度形質導入粒
子/ファージ(HFTP)は、水成核活性(ISA)をコードする高発現性遺伝
子(tac促進1naW)を有し、実施例3ではS、チビムリウムLT2株細胞
を敏感に検出することができることが示された。下記の組の実験では、P22由
来のTPは(形質導入粒子分析の生物学的特異性はそのキーとなる特徴の一つで
あるので)P22の既知の宿主領域に従い、様々な感受性を有する細菌株が同等
な高率で形質導入/検出され、且つ分析試料中の非P22感受性細菌の存在は感
受性細菌の検出を妨げないことを示していた。2つの実験からの結果を下記に示
す。一つは細菌の純粋培養物における形質導入を検討したものであり、他方は混
合培養物における形質導入を検討したものである。
A、笠暮隻畏1
サルモネラ層のKauffmann−White分類図(Kauffmann
(1978年) Das FundamnL、Munksgaard 、コペン
ハーゲン)の血清群B、D、C,,C2およびG2に属する9種類の異なる血清
型を含む数種類のサルモネラ株が、B、5tocker博士によって提供された
。各種の株の外膜におけるP22受容体分子の既知の存在または不在によって、
P22惑受性(P22s)またはP22耐性(P22’)として分類することが
でき、血清群BおよびDに属する株はP22’であり、血清群C+、Czおよび
G2に属する株はP 22’となった。それぞれの細菌の純粋培養物について形
質導入分析を行って、形質導入が既知のP22”でしか起きないことを確認した
。S、チビムリウムLT2株(P22”)のHFT系による形質導入における挙
動は予め決定されていたので(実施例3を参照)、この株を対照とじてパネルに
包含させた。
それぞれの株の純粋培養物を、37°Cで中間−指数相(Ab。。
は0628から0.67の範囲であった)までLブイヨンで増殖させ、次に、そ
れぞれの培養物の連続希釈物を(希釈剤として滅菌したLBを用いて)最初の培
養物に対して10−7まで10倍ずつで作成した。次に、(実施例3と同じ方法
で作成した) PGS128FTPを用いて、実施例3に記載した方法にしたが
って形質導入を行った。それぞれの培養希釈物の少量(0,1m)であって、そ
れぞれが全部で3 X106pfuを含むHFTP調製物25JLlを有するも
のを作成した。これらの試料を37°Cで1時間、続いて23“Cで1時間イン
キュベーションした。インキュベーションの後、濃縮螢光染料(次のINA分析
の際に、凍結結果の検出を容易にするために用いた)の少t(liLl)を、実
施例3に記載した通りにそれぞれの形質導入培養希釈物に加えた。
次いで、それぞれの形質導入希釈物の3つの10ul液滴を、96ウ工ルマイク
ロタイター皿の別々のウェルに入れた。次いで、このマイクロタイター皿を、−
io、ooCで平衡にした形状のぴったり合った冷却ブロックに入れた。10〜
15分後に、凍結液滴の数を数えた。結果を第7表に示す。
】−ニし一部
試料/希釈
用いる形質導入によってINAにつし)て分析した。INAは−10,0°Cの
定温で測定した。示したデータ一番よ、試料希釈物当り全部で3つの液滴から凍
結するそれぞれの試料希釈物の液滴の数である。それぞれの血清群を、株名の隣
の括弧内に示す、星印はP22’である株を表わし、残りはP221である。
第7表に示した結果は、P22’株の中でのみINAの形質導入が起こり、更に
感受性を有する細菌はいずれの場合にも等しく高感度で検出されることを示して
いる。P22′株では、INAのバックグラウンドは検出されなかった。最初の
(希釈していない)対数相の培養物のA部。。の測定によれば、対応する10−
7希釈物(したがって、この実験における最低検出限界)の細胞数は100細胞
数/成より少なかった。この水準の感度は、株LT2のみで以前に観察した水準
と一致した(実施例3を参照)。したがって、この実験は、P22によって媒介
される形質導入はファージの既知の宿主領域に従い、各種のP22”株が同じ高
効率で形質導入されたことを示している。
B、徂1」11勧
形質導入分析の特異性のもう一つの様相は、「非標的」細菌(すなわち、形質導
入分析による検出が期待されない関連細菌)がファージ形質導入によるP22’
細菌の検出が期待されることである。下記の実験では、このような設定での形質
導入を検討した。
この実験では、RGS12 HFTPを下記に記載したことを除いて本実施例の
A部の方法と同様に用いた。ただ1種類のP22’株、S、clublinを用
いて試料を作成して、P 22’″細菌の存在においてS、ダブリン(S、du
blin)を分析した。P 22’細菌は、E、コリJC102’l1株(Wi
llisら、(1981年) Mo1.Gen、Genet、+183、479
−504)、B、サブチリス(B、5ubtillis)BR151株(ATC
CNi133677) 、およびS、ハバナ(す/L/−F−ネラの天然のP2
2’株)であった(本実施例のA部を参照)。それぞれの株を37°C″?:L
ブイヨン中で中間−指数相まで生育させ、その時点でのA、。。を測定した。次
いで、培養物を(新たなしブイヨン中で希釈することによって)同じ濃度(A
b。。−0,36)に調整した。
それぞれの株の制御形質導入を行って、(在るとすれば)P22′細菌における
バックグラウンドをチェックし、S、ダブリンの純粋培養物と共に分析の応答を
測定した。S、ダブリン試料は、最初の(Ab。。=0.36)培養物を10倍
ずつ10−9まで希釈することによって作成し、10−2から10−9までの希
釈物のみを分析に使用した。4系列のこのような希釈液を作成し、一つの系列で
は、希釈剤として滅菌LBを用い、他の3系列ではP22′細菌の未希釈(A部
。。=0.36)培養物のそれぞれのものを希釈剤として用いた。換言すれば、
それぞれの試料系列は、(最初の培養物に対して)S、ダブリンの濃度が1O−
2からlo−9までの8種類の希釈物からなっていた。他の未希釈培養物の一つ
は、S、ダブリン希釈系列に対する希釈剤として用いたので、他の細菌はS、d
ublin希釈負圧のそれぞれにおける未希釈強度で存在した。したがって、そ
れぞれのP221細菌は、(10−”のS、ダブリン希釈物中での)102倍か
ら(10−9のS、ダブリン希釈物中での)109倍までの過剰量の範囲に存在
した。
それぞれの試料/希釈物は全量が0.1 dであり、それぞれを個別に(全体で
3 ×10’pfuを含む) RGS12 TPを25m添加することによって
形質導入した。多数の個体試料を収容するため、蓋のついた滅菌96ウ工ルマイ
クロタイター皿中で処理を行った。インキュベーションは、37°Cで1時間の
後、23°Cで1時間行った。インキュベーションの後、少量(1ttりの螢光
染料濃縮物をそれぞれの試料に加えて、実施例3に記載したのと同じ次のINA
分析の際に凍結物の検出を容易にした。
それぞれの試料の4つの104の量を、柔軟なプラスチック製の96ウ工ルマイ
クロタイター皿の別個のウェルに入れ、この皿を−10,0’cで平衡にした形
状がぴったり合った冷却ブロックに入れた。10〜15分後に凍結した液滴を計
数した。結果を第8表に示す。
第−産一部
S、dubljn希釈率
S、ダブリン(単独) 4444410S、ダブリン+E、コリ 444431
0S、ダブリン十B、サブチリス 44441221 それぞれの試料のそれぞ
れの希釈物を、HPTPを用いて形質導入によりINAについて分析した。IN
Aは−10,0°Cの定温で測定した。表中の数字は、(試料希釈液当り全部で
4つの液滴からの)試料系列のそれぞれの希釈物に対する凍結した液滴の数であ
る。最上欄の数字は、(S、ダブリンのみで分析した場合を除き)S、ダブリン
培養物の他の細菌の未希釈培養物での希釈率を表わす。
第8表に示した結果は、分析試料中の他のP22’細菌が存在しても標的株の検
出には明確な影響を及ぼさないことを示している。分析では、未形質導入細菌に
おいてもまたは「形質導入」 (すなわちTPに暴露した) P22’細菌でも
、バックグラウンド活性は検出されなかった。言い換えれば、P22″′細菌が
存在する場合には、これらの細菌はこの細菌の検出に有意な効果を及ぼさなかっ
た。本実施例のA部に記載した結果では、分析法の最少検出限界(すなわち、凍
結したものの最大希釈)には到達できなかったので、希釈系列をこの実験では1
0−9まで延長して、検出限界を下回るようにした。最初の培養物は、(A b
。。に基づいた細菌数の計算によれば)108〜10”程度の細胞を含むので、
任意の細胞が10−9の希釈において期待されることは稀である。したがって、
これらの結果は、多数の非標的細菌の存在においても、この分析法の検出限界は
任意の細菌の分析の理論的限界付近、すなわち、細胞が存在しない点まで延長さ
れたことを示している。
前記の結果を要約すると、P22/1na−形質導入系の応答を、P22感受性
およびP22耐性株の両方を表わす数種類の細菌に対して試験した。この分析の
応答は、(個々の株におけるP22受容体の既知の存在/不在にしたがって)そ
の予測される特異性、感受性株の検出における感度および非感受性細菌の多数の
存在による干渉に対するその耐性によって評価した。
この分析法は、厳密に特異的であり、既知のP221株では活性は生じなかった
。更に、この分析法の感度は、分析を行った総てのP22′−株において等しく
高く、いずれの場合にも、LT2株のみを用いる前の実験において決定された通
りの最適水準で行われた。最後に、この分析法の感度は、多数のP 22’細菌
の存在によって影響されず、分析は最適水準で行この実施例では、酵素マーカー
遺伝子の形質導入に基づく細菌の分析法を説明する。この系では、β−グルクロ
ニダーゼまたはrgusJ活性をコードする遺伝子のP22によって媒介される
形質導入を用い、次に1.形質導入されたGUS”細菌を螢光分析法によって検
出した。
GUS活性は、E、コリに12から最初に単離されたuidA遺伝子によってコ
ードされる(Jeffersonら(1986年) Proc、Natl。
Acad、Sci、USA、 83.8447−8451)。これは、良好に特
性決定された酵素マーカー系であって、細菌から高等植物までの生物の領域で機
能することが示されている(Jeffersonら(1987年)EMBOJ、
、6.3901−3907)。GUS活性の螢光分析の試薬は、市販されている
。
GUS形質導入系は、実施例3に記載の1naW高頻度形質導入系を構築するの
に用いたのと同様な方法で、ファージP22を用いて設計された。本実施例では
、uidA遺伝子を溶加性宿主細菌の染色体に配置するP22プロファージに、
ファージの溶菌サイクルの誘導によりファージ自身のDNAと共にuidA配列
の複製およびパッケージングを生じるような方法で組込んだ。
uidAクローンは、プラスミドpJJ3431であって、遺伝子が若干改質さ
れており開始コドンにNcoI部位を提供するものから得た。改質では、遺伝子
生成物のアミノ末端に5つのエキストラアミノ酸を導入したが、GUS活性は保
持された。
uidA遺伝はpJJ3431の2.9kbのNcoI/PstI制限酵素フラ
グメント上で単離され、発現ベクターpKX233−2の対応する部位にクロー
ニングされた(Brosiusら (1985年) J、Biol、Chem、
、266゜3539−3541 )。pKK233−2は、rtrCJと呼ばれ
る強力なハイブリッドプロモーターとリポソーム結合部位と開始コドンとを有す
るuidA遺伝子を提供し、更にこれはアンピシリン耐性(Ap’)をコードし
て、ある種の細菌性の抱合系によって起動されるようにした領域(r′olom
J)を含んだ。生成する構成をpRLG73と命名した。
次に、pRLG73にR22DNAの領域を供給し、同種組換の標的を提供して
、構築の次の段階でプラスミドをR22プロフアージに組込むようにした。2.
5kbのR22BamHIフラグメント’ B J (Rutica & Ja
cksonのP22物理地図において命名されている;実施例3を参照されたい
)を、trcプロモーター領域の直ぐ上流のpRLG73の特異なりamHI部
位にクローニングした。R22フラグメントは最終的にはプラスミドをファー、
ジゲノムに挿入する点であるので、これは任意の本質的なR22遺伝子を妨害し
ないように選択された。生成するR22/p R1,G 73プラスミドをpR
LG80と呼んだ。
下記の構築段階は、実施例3に記載された1naW形質導入系について更に詳細
に記載されたのと同じ段階を、pRLG68の代わりにpRLG80を用いて、
精確に行った。pRLG80を、E、コリ供与体株からR22に対して溶加性で
あるS、チビムリウム受容体中に、細菌抱合によって移された。更に、RGSI
Iと呼ばれるS、チビムリウム受容体は、そのDNAポリメラーゼ遺伝子の一つ
に突然変異体を含み(突然変異体の対立遺伝子は「po1/1」と命名されてい
る)、これによってpRLG80プラスミドの自律複製を禁止した。したがって
、RGSII中のpRLG80についての製造の唯一の手段は、プラスミドに担
持された同種の領域に存在するR22染色体中への組込みによるものであった。
このような子孫細胞は選択された後、pRLG80によって担持されたA pr
ママ−−によって接合され、pRLG80担持子孫も発現したGUS活性によっ
て同定された((:、USの比色分析用の基質が媒溶液中に含まれるときには可
視)。
新規なP22/pRLG80溶原性株はRGS34と呼ばれ、uidA形質導入
ファージ(TP)を産生ずるのに用いられる株であった。
TPの産生はRGS34の液体培養物を実施例3に記載されたように薬物マイト
マイシン−Cで処理することによって達成された。マイトマイシン−Cによる処
理で、培地に放出された後宿主細胞の溶菌を伴う子孫ファージ粒子の複製および
パフケージングを生じる。RGS34の場合には、このような誘導比よってTP
および(複製サイクルの際にプラスミドDNAの摘出によって生じる)正常なフ
ァージを産生じた。しがしながら、RGS34はプラーク法によって測定したと
き、予想外に少ない数の正常ファージを産生ずることが判った。T Pは、非フ
ァージDNAの存在によりファージDNAの完全ゲノムを有することが妨害され
るので(ファージはそれらが有することができるDNAの量で限定される)、プ
ラーク形成を欠くと予想される。したがって、プラーク形成法は存在するTPの
数の直接的な尺度ではなく、TP調製物を特徴決定するための参考数を提供する
働きをするだけである。)lGs34 TP調製物は、IIIdl当り7X10
’のプラーク形成単位(p f u)を含んでいた。対照的に、RGSII溶原
性株溶原ける正常なR22溶原の誘導では、約I X10’pfu/meを産生
じた。
R5G34由来のファージのDNAを下記のようにして作成して分析した。RG
S34マイトマイシン−C誘導TPO30dを72、000 gで3時間遠心分
離してプラークをペレット化した。
ファージベレットをTE緩衝液(10nM )リス−HC1,,1mMNaJD
TA 、 pHB、 O) 0.5 rtdlに再懸濁した後、N a 2 E
D T A % ドデシル硫酸ナトリウム、およびプロテアーゼーKをそれぞ
れ20mM、0.5%および50n/mlの最終濃度になるように添加してプロ
テアーゼで処理した後、37°Cで1時間インキュベーションした。プロテアー
ゼ処理の後フェノール抽出を3回、およびエーテル抽出を3回行い、次にエタノ
ールを66%になるように添加してファージDNAを沈澱させた。精製したファ
ージDNAをTE緩衝液100Iに溶解した。RGS34 TP DNA17)
制限消化物をゲル電気泳動によって分析したところ、電気泳動は(正常なR22
DNAに対して)エキストラバンドの存在を示し、これはpRLG80のファー
ジゲノムへの組み入れから予測されるものに対応した。このDNA分析では、T
Pが実際にRGS34株によって産生されることが確認された。
RGS34マイトマイシン−〇によって誘導されるTP調製物は最初は細菌細胞
破片を含んでおり、これを4.OOOXgで10分間遠心分離することによって
ペレット化した(が、残りのTPは懸濁したままであった)。しかしながら、T
P懸濁液に残っていたTP産生宿主細胞の溶菌の際に、多(のGUS活性が放出
された。TP懸濁液中に含まれる任意のGUS活性のために、uidA遺伝子の
形質導入から生じる活性を不明瞭になり易く、最初にTP調製物を精製した後に
使用する必要があった。これは、48.000 gで遠心分離を2回連続して行
ってTPをペレット化した後、TPを新鮮なしブイヨンに再懸濁することによっ
て行った。これによってTPtl製物のGUS活性を効果的に稀釈して、下記の
螢光GUS分析のバックグラウンド近くの水準にした。
形質導入分析はRGS34 TPを細菌の指数相培養物に加え、数時間インキュ
ベーションし、次いで形質導入細胞の抽出物を作成し、これを螢光基質法を用い
てGUS活性を測定した。
S、チビムリウムL72株(P22惑受性株)およびS、ハバナ(サルモネラの
P22耐性株)を37°Cで指数相まで生育させ、次いで(新鮮なしブイヨン中
で稀釈することによって)実験の開始時にA6゜。=0.21に調整した。滅菌
しブイヨンの試料を含めて、場合によりTP調製物を添加した汚染したGUS活
性を測定した。それぞれの0.2rd試料に、全部で7X10’pfuを含むT
Pli製物0.1 rdを加え、−組の対照試料を、同様にして、TPの代わり
に滅菌LBの等量を加えて調整した。
次に、試料を37°Cで3.5時間インキュベーションし、その後細菌を遠心分
離によってペレット化し、GUS抽出緩衝液(50111M Na−PO4、p
H7,0,1mM NazEDTA、 0.1%トライトンX−100、IOR
IMβ−メルカプトエタ/ −ル) 0.25dニ再懸濁した。次いで、それぞ
れの細胞懸濁液にトルエン5J11を加えて(細胞を透水性にして、GUS酵素
を抽出緩衝液に放出させ)、40秒間振盪した後、室温で10分間放置した。次
に、試料を遠心分離して、細胞破片をベレット化して、相分離を行い、それぞれ
の抽出液0.19a1を新しい試験管に採取した。
GUS分析は、それぞれの0.19N!1の細胞抽出物に4−メチルウンベリフ
ェリルグルクロニド(rMUGJGUSの螢光基質)の20mM溶液10t11
を加えることによって開始した。MUG自身は螢光性ではないが、GUSと反応
することによって、螢光性になる4−メチルウンベリフェロン基を放出する。分
析物を37°Cで30分間インキュベーションした後、それぞれの分析試料の5
0111を採取して0.2 M NazCOs 0.95dに加えた(NazC
Osは反応を停止して、反応生成物の螢光を増進する)。
試料の螢光を、螢光分光光度計で365nmで試料を励起して測定し、螢光の発
光は455nmで測定した。結果を第9表に示す。
第一ユー表
試 籾 螢光単位
1)LT2対照 45
2) LT2+TP 1183
3)S9ハバナ対照 98
4)S、ハバナ+TP 46
5)Lブイヨン対照 38
6)Lブイヨン+TP 82
1 数字は365nmで励起し、455nmで発光させて測定した試料の螢光を
示す。生の螢光単位を4−メチルウンベリフェロン(MUGとGUSとの反応に
よって放出される螢光化合物)の対応する濃度に変換することができるGUS活
性の相対的測定として供する。
第9表は、GUS活性の強い正の値のみが形質導入LT2試料(試料2)に生じ
たことを示している。TP調製物における残留GUS活性(試料5および6の差
によって測定される)は無視し得るものであるので試料2に示された活性は形質
導入によるものであった。対照的に、S、ハバナ株では、TPに暴露することに
よってGUS活性は増加しなかった。
したがって、GUS形質導入系は、2221株(LT2)では機能するが、P2
2’株(SJavana)では機能しないことを示していた。これらの試料で測
定したバックグラウンド螢光はこれらの株(或いは滅菌しブロス中)での固有の
GUS活性の結果ではなく、MUG調製物における有利の4−メチルウンベリフ
ェロンの少量の存在によるものと考えられた。
上記発明を明快に理解するために、例示と実施例とによ、って幾分詳細に記載し
たが、請求の範囲内である程度の変化および改質を行うことができることは明ら
かであろう。
手続補正書(方式)
%式%
1、事件の表示
PCT/US89104’388
平成1年特許願第511237号
2、 発明の名称
検出可能な表現型のファージ形質導入による細菌の検出
3、補正をする者
事件との関係 特許出願人
名称 ディーエヌエー プラント テクノロジーコーポレイション
4、代理人
住所 〒105東京都港区虎ノ門−丁目8番lO号6、補正の対象
(1)特許法第184条の5第1項の規定による書面の「特許出願人の代表者」
の欄
(2)明細書及び請求の範囲の翻訳文
(3)委任状
7、補正の内容
(IX3)別紙の通り
(2)明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書(内容に変更なし)
8、添付書類の目録
(1)訂正した特許法第184条の5第1項の規定による書面 1 通
(2)明細書及び請求の範囲の翻訳文 各 1 通(3)委任状及びその翻訳文
各 1 通国際調査報告
Claims (45)
- 1.試料中の標的細菌を特異的に検出する方法であって、試料を標的細菌に特異 的な形質導入粒子に暴露し、該粒子は細菌に検出可能な表現型を付与することが でき、試料中に、検出可能な表現型を有する細菌の存在を検出することを含んで 成る方法。
- 2.検出可能な表現型が氷成核活性である、請求の範囲第1項に記載の方法。
- 3.形質導入粒子がプロテアーゼ領域の下流に氷成核遺伝子を有する、請求の範 囲第2項に記載の方法。
- 4.氷成核遺伝子がinaW,inaY,inaZおよびiceEから成る群か ら選択される、請求の範囲第3項に記載の方法。
- 5.検出可能な表現型が酵素によって触媒される色の産生である、請求の範囲第 1項に記載の方法。
- 6.色の産生がβ−グルクロニダーゼによって触媒される、請求の範囲第5項に 記載の方法。
- 7.試料を、異なる宿主領域特異性を有する複数の形質導入粒子に暴露すること によって、細菌の型を前記複数の粒子によって付与される検出可能な表現型のパ ターンに基づいて決定することができる、請求の範囲第1項に記載の方法。
- 8.試料を標的細菌に特異的な固定化抗体に暴露した後形質導入粒子に暴露する 、請求の範囲第1項に記載の方法。
- 9.試料を患者標本、水、酪農製品および食肉製品から成る群から選択する、請 求の範囲第1項に記載の方法。
- 10.試料が標的細菌と非標的細菌を含み、前記バクテリオファージが標的細菌 に対して特異的であるが非標的細菌には特異的でない、請求の範囲第1項に記載 の方法。
- 11.形質導入粒子に暴露する前に、試料を標的細菌を弱体化することができる 条件に暴露した、請求の範囲第1項に記載の方法。
- 12.暴露条件に加熱を含む、請求の範囲第10項に記載の方法。
- 13.標的細菌がサルモネラ属のものである、請求の範囲第1項に記載の方法。
- 14.形質導入粒子がP22,L,ViI,8,23,25,31,46,10 2,163および175から成る群から選択されるバクテリオファージから誘導 される、請求の範囲第1項に記載の方法。
- 15.試料中の標的細菌を特異的に検出する方法であって、前記試料を、標的細 菌に対して特異的な形質導入粒子の存在下にて、前記粒子の前記細菌への付着を 促進する条件下にてインキュベrションし、前記形質導入粒子は細菌に氷成核表 現型を付与することができるものであり、次いで、前記試料を氷成核表現型の展 開を促進する条件下でインキュベーションし、 試料中における氷成核表現型を有する細菌の存在を検出することから成る方法。
- 16.試料を最初に約35℃から40℃の範囲の温度で撹拌せずに約15から1 20分間インキュベーションする、請求の範囲第15項に記載の方法。
- 17.試料を、次に20℃から25℃の範囲の温度で約30分間から2時間イン キュベーションする、請求の範囲第16項に記載の方法。
- 18.試料を、異なる宿主領域特異性を有する複数の形質導入粒子の存在下でイ ンキュベーションし、更に形質導入粒子が細菌を氷成核表現型へ形質転換するこ とによって、細菌の種類を決定することをも含んで成る、請求の範囲第15項に 記載の方法。
- 19.試料を、標的細菌に特異的な固定化抗体に暴露し、該固定化抗体に結合し た標的細菌を分離した後、前記試料をインキュベーションすることを含んで成る 、請求の範囲第15項に記載の方法。
- 20.増殖培地が標的細菌の増殖のために選択的である、請求の範囲第13項に 記載の方法。
- 21.試料を患者標本、水、酪農製品および食肉製品から成る群から選択する、 請求の範囲第13項に記載の方法。
- 22.形質導入粒子がプロテアーゼ領域の下流に氷成核遺伝子を有する、請求の 範囲第13項に記載の方法。
- 23.形質導入粒子を標的細菌のゲノム内部のプロファージとして組み入れる、 請求の範囲第13項に記載の方法。
- 24.氷成核表現型を有する細菌の存在を、氷成核分析法によって検出する、請 求の範囲第13項に記載の方法。
- 25.氷成核分析法が螢光凍結分析法である、請求の範囲第24項に記載の方法 。
- 26.標的細菌を特異的に検出する方法であって、標的細菌を形質転換して、予 め選択した細胞表面受容体を発現させ、 形質転換した標的細菌をある環境に導入して、この環境から細菌を集め、 集めた細菌を表面受容体に対して特異的な形質導入粒子に暴露し、 前記粒子が 細菌に検出可能な表現型を付与することができ、 集めた細菌中での検出可能な表現型を有する細菌の存在を検出することから成る 方法。
- 27.形質転換した細菌が導入される環境が、細胞表面受容体を欠くことを除い て標的細菌と実質的に同じである他の細菌を含む、請求の範囲第26項に記載の 方法。
- 28.標的細菌がブスードモナス種であり細胞表面受容体がlamB遺伝子によ ってコードされる、請求の範囲第26項に記載の方法。
- 29.環境が土壌、空気および水から選択される、請求の範囲第26項に記載の 方法。
- 30.感染された細菌細胞に氷成核表現型を付与することができる形質導入粒子 。
- 31.グラム陰性菌に特異的に感染することができる請求の範囲第30項に記載 の形質導入粒子。
- 32.グラム陰性菌がE.コリ、ビブリオコレラおよびサルモネラから成る群か ら選択される、請求の範囲第31項に記載の形質導入粒子。
- 33.グラム陽性菌に特異的に感染することができる、請求の範囲第30項に記 載の形質導入粒子。
- 34.グラム陽性菌がスタフィロコーカスアウレウス(Staphylococ cus aureus)およびストレプトコーカスビロゲネス(Strepto coccus pyrogenes)から成る群から選択される、請求の範囲第 33項に記載の形質導入粒子。
- 35.プロテアーゼから下流に氷成核遺伝子を有する請求の範囲第30項に記載 の形質導入粒子。
- 36.氷成核遺伝子の外に選択的に含んで成る、請求の範囲第35項に記載の形 質導入粒子。
- 37.追加の選択的マーカーが抗生物質耐性である請求の範囲第36項に記載の 形質導入粒子。
- 38.プロテアーゼの転写制御下で氷成核遺伝子を含むプロファージを有する細 菌細胞。
- 39.氷成核遺伝子がinaW,inaY,inaZおよびiceEから成る群 から選択される、請求の範囲第38項に記載の細菌細胞。
- 40.E.コリまたはS.チピムリウムの株である、請求の範囲第38項に記載 の細菌細胞。
- 41.感染した細菌細胞に氷成核表現型を付与することができる形質導入粒子を 産生する方法であって、プロモーターの転写制御下で氷成核遺伝子を含むプロフ ァージを有する細菌細胞を誘導し、 前記の細菌細胞が溶菌したとき放出される形質導入粒子を集めることから成る方 法。
- 42.氷成核遺伝子がinaW,inaY,inaZおよびiceEから成る群 から選択される、請求の範囲第41項に記載の方法。
- 43.感染した細菌細胞に検出可能な表現型を付与することができる形質導入粒 子を産生する方法であって、検出可能な表現型をコードする遺伝子をトランスポ ゾンの本質的な末端DNA配列と結合して挿入可能な要素を産生させ、 挿入可能な要素で組換可能なゲノムを有するバクテリオファージに挿入可能な要 素を導入することから成る方法。
- 44.遺伝子が氷成核遺伝子および色の産生酵素遺伝子から成る群から選択され る、請求の範囲第43項に記載の方法。
- 45.挿入可能な要素が細菌プラスミド中に存在し、細菌細胞中での組換によっ てバクテリオファージに導入される、請求の範囲第43項に記載の方法。
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