DE68927803T2

DE68927803T2 - Bakterieller nachweis durch phagentransduktion von nachweisbaren phenotypen

Info

Publication number: DE68927803T2
Application number: DE68927803T
Authority: DE
Inventors: Robert Green; Paul Wolber
Original assignee: DNA Plant Technology Corp
Current assignee: DNA Plant Technology Corp
Priority date: 1988-10-04
Filing date: 1989-10-03
Publication date: 1997-07-10
Anticipated expiration: 2009-10-04
Also published as: JP2944694B2; CA2000159A1; DE68927803D1; EP0437537A4; EP0437537A1; WO1990004041A1; US5447836A; AU4486889A; AU634500B2; JPH04502701A; EP0437537B1; CA2000159C; ATE149208T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Detektion und Identifizierung von Bakterien in biologischen Proben. Im spezielleren betrifif die vorliegende Erfindung das Screenen biologischer Proben mit Bakteriophagen, die fähig sind, Zellen von Interesse spezifisch zu infizieren und die infizierten Zellen zu einem Phenotyp mit Eiskeimbildung zu transformieren.
Die Detektion und Identifizierung bakterieller Spezies und Stämme ist unter Vielzahl von Umständen von Interesse. Beispielsweise ist es notwendig, Nahrungsmittel, Wasser und andere Eßwaren rasch auf Verunreinigung mit pathogenen Bakterien screenen zu können. Auf ähnliche Weise ist die Detektion von Bakterien in Proben von Patienten bei der Behandlung zahlreicher infektiöser Erkrankungen notwendig. In letzterem Fall ist es häufig wünschenswert, die Bakterien spezifisch typisieren zu können, und es wäre weiters wünschenswert, die Bakterien auf die Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Bakterioziden zu screenen.
Bisher sind zur bakteriellen Identifizierung verschiedene Techniken eingesetzt worden, einschließlich Serotypisierung, Nährstoffscreening und Phagentypisierung. Zur Serotypisierung wird ein Bereich von Antikörpern eingesetzt, die fähig sind, sich an bestimmte Zelloberflächenantigene auf Zielbakterien zu binden. Basierend auf dem beobachteten Bindungsmuster können die Spezies und der Stamm der Bakterien ermittelt werden. Nährstoffscreening basiert auf Variationen bei den Stoffwechselanforderungen verschiedener Bakterientypen. Durch Züchten der Bakterien auf genau definierten Medien (oder durch den Versuch, zu züchten) können die Bakterien basierend auf jenen Substanzen, die zum Wachstum notwendig sind, und jenen Substanzen, die Wachstum hemmen, klassifiziert werden.
Wie für die vorliegende Erfindung von besonderem Interesse ist, sind Bakteriophagen verwendet worden, um bakterielle Kulturen auf Basis des begrenzten Wirtsbereichs verschiedener Phagen zu typisieren. Indem versucht wird, Aliquote einer Reinkultur unbekannter Bakterien mit einer Gruppe verschiedener Phagen zu infizieren, kann der bakterielle Zelltyp ermittelt werden.
Eine derartige Phagentypisierung ist zwar ein hochpräzises und determinatives Verfahren zum Identifizieren des bakteriellen Typs, es hat jedoch den Nachteil, sowohl zeit- als auch arbeitsaufwendig zu sein. Bakterien in einer Probe müssen zuerst gezüchtet werden, sodaß Reinkulturen isoliert werden können. Einzelne Kolonien der Reinkulturen müssen dann gezüchtet und daraufhin in Aliquote unterteilt werden, die den verschiedenen Phagen in der Gruppe ausgesetzt werden. Nach dem Aussetzen werden herkömmliche Plaqueassays durchgeführt, um die Infektiosität der verschiedenen Phagen zu ermitteln. Das gesamte Verfahren dauert 24 bis 48 h oder länger und erfordert zur Durchführung hervorragend geschultes Personal. Wegen des langwierigen Verfahrens und der Notwendigkeit, Plaques in den bakteriellen Kolonien zu identifizieren, kann das Verfahren nicht automatisiert werden. Darüberhinaus ist das Verfahren wegen der erforderlichen Zeit weniger ideal, um die Art der Infektion eines Patienten vor der Therapie zu ermitteln.
Inaktivierte Bakterien, wie jene, die durch Kochen oder teilweise Wärmestenisation geschwächt sind, stellen bei vielen Nahrungsmittelverarbeitungssituationen ein Hauptproblem für die Detektion dar. Solche inaktivierte Bakterien bleiben häufig lebensfähig (und daher potentiell pathogen), sind aber ausreichend geschwächt, sodaß für die Detektion nach herkömmlichen Assayvorschriften ein nicht-selektiver Gewinnungsschritt (Voranreichung) erforderlich ist, gefolgt von einem selektiven Anreicherungsschritt, um das Wachstum der Ziel-Bakterien zu ermöglichen, während das Wachstum konkurrierender Organismen gehemmt wird. Solche zusätzlichen Schritte können die zur Durchführung des Assays erforderliche Zeit beträchtlich verlängern.
Die Detektion spezieller Bakterien in offenen Umgebungen, wie Luft, Wasser und Boden, kann ebenfalls problematisch sein. Wegen der großen Vielzahl von Spezies, die vorhanden sein können, ist es oft schwierig, eine spezielle Spezies von Interesse zu unterscheiden.
In Anbetracht obiger Ausführungen wäre es wünschenswert, verbesserte Phagen- Screeningassays zum Detektieren und Identifizieren bakterieller Zellen in biologischen Proben bereitzustellen. Insbesondere wäre es wünschenswert, wenn solche Assays in einem relativ kurzen Zeitraum durchgeführt werden könnten und die Assayprotokolle ausreichend einfach sind, um von angelerntem Personal durchgeführt zu werden. Vorzugsweise werden die Assays an Mischkulturen mit einer minimalen Anzahl an Schritten durchgeführt und führen zu einem nachweisbaren Ereignis, das leicht zu beobachten und automatisch ablesbar ist. Es wäre weiters wünschenswert, mit den Assays inaktivierte Bakterien nachweisen zu können, die andernfalls einen Voranreicherungsschritt und einen selektiven Anreicherungsschritt zur Detektion erfordern. Außerdem wäre es winschenswert, spezielle bakterielle Zellen in offenen Umgebungen, wie Luft, Wasser und Boden, rasch und zweckmäßig detektieren zu können.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Die Verwendung von Bakteriophagen bei der Charakterisierung der Oberfläche bakterieller Zellen wird in Makela, "Enterobacterial Surface Antigens: Methods for Molecular Characterization", Hrsg. Korhonen et al., Elsevier Science Publishing, Amsterdam, S.155-178 (1985) erörtert, worin herkömmliche Plaqueassays eingesetzt werden, um die Infektiosität spezieller Phagen zu ermitteln. Die Molekulargenetik des Bakteriophagen P22 wird in Susskind und Botstein (1978), "Microbiol.Rev." 42:385- 413, erörtert. Die Fähigkeit von P22, als Transduktionsvektor zu agieren, wird in Watanabe et al. (1972) "Virol." 50:874-882 und Orbach und Jackson (1982) "J.Bacteriol." 149:985-994 beschrieben. Die Verwendung von P22 zur selektiven Transduktion rekombinanter Plasmide mit integrierten pac-Sequenzen wird in Schmidt und Schmieger (1984) "Mol.Gen.Genet." 196:123-128 und Vogel und Schmieger (1986) "Mol.Gen.Genet." 205:563-567 beschrieben. Fremde Gene werden durch Transposon- Mutagenese, in den Bakteriophagen L (mit P22 verwandt) insertiert, wie in Spanova und Karlovsky (1986) "Folia Microbiol." 31:353-363 beschrieben. Die Verwendung des λ- Phagen als Kloniervektor wird in Young und Davis (1983) "Proc.Natl.Acad.Sci. USA" 80:1194-1198 beschrieben, wo unbekannte Genprodukte durch Antikörpersonden detektiert werden können. Die Verwendung des M13-Phagen als Kloniervektor wird in Vieira und Messing (1987) "Meths.Enz." 153:3-11, beschrieben.
Bakterien können in biologischen Proben durch eine Anzahl von Techniken, einschließlich selektiver Medien, Immunassays und Nukleinsäuresonden, detektiert werden. Spezielle Verfahren zum Detektieren von Salmonella werden in der US-PS- 4.689.295 beschrieben. Ein Test auf Phagenbasis zur Dektion von Salmonella in Nahrungsmitteln wird in ASM News (1987) 53:542 beschrieben. Bei diesem Test werden Phagen verwendet, um die Adsorption der Ziel-Salmonella an einer Oberfläche zu vermitteln.
Es ist berichtet worden, daß die Fähigkeit zur Eiskeimbildung in mehreren eiskeimbildungspositiven (Ina+) Bakterien durch ein einziges Gen kodiert ist, und diese Fähigkeit kann durch Transformation mit einem das Eiskeimbildungsgen tragenden Plasmid auf E.coli übertragen werden. Siehe US-PS-4.464.473; Orser et al., "Molecular Genetics of The Bacterial-Plant Interaction" (Hrsg. A.Puhler), Elsevier/North Holland Biomedical, S.353-361(1983); Green et al. (1985) Nature" 317:645-648; und Corotto et al. (1986) EMBO J. 5:231-236. Über die Sequenzinformation für ein Eiskeimbildungsgen in P.syringae (Gen inaZ) ist berichtet worden; Green et al. (1985) ibid. Das entsprechende Protein hat ein Molekulargewicht von etwa 1,2 x 10&sup5;. Die die Identifizierung und Reinigung dieses Proteins betreffende Information wird in Wolber et al. (1986) "Proc.Natl.Acad.Sci." USA 83:7256-7260 geoffenbart. Über die Sequenzinformation für ein Eiskeimbildungsgen in P.fluorescens (Gen inaW) ist ebenfalls berichtet worden. Siehe Warren et al. (1986) "Nuc.Acids.Res." 14:8047-8060.
Der Tröpfchengefrierassay ist ein bekanntes Verfahren zum Testen des Vorhandenseins ganzzelliger Bakterien mit Eiskeimbidung und zellfreier Keime. Das Verfahren besteht darin, eine Anordnung von N Tröpfchen mit dem Volumen V (üblicherweise 0,01 ml) auf einer keimfreien Oberfläche auszulegen, auf die Temperatur T (weniger als 0ºC) abzukühlen und Nf, die Anzahl gefrorener Tröpfchen, zu zählen. Die Anzahl an Kernen/ml wird dann durch die folgende Formel berechnet: Kerne/ml=(1/V) loge [N/(N- Nf)].G. Val (1971) "J.Atmos.Sci." 28:402-409.
Die EP-A-0.168.933 offenbart ein Verfahren zur Detektion lebender Bakterien in Testproben unter Verwendung von Transduktionsteilchen, um ein Lumineszenzgen in die Bakterien einzubringen. Die Beschreibung schlägt vor, daß einer Antibiotikabehandlung unterzogene Bakterien auf diese Weise gescreent werden können, daß aber nur nicht von der Behandlung beeinflußte Bakterien detektiert werden.
Die US-A-4.464.473 offenbart das Einbringen eines Eiskeimbildungsgens in anfällige bzw. dafür empfängliche Bakterien, die dann bei Verfahren verwendet werden können, bei denen Eiskeimbildung erwünscht ist, beispielsweise Schneeerzeugung. Es gibt keinen Hinweis auf die Verwendung des Verfahrens zur Unterscheidung lebensfähiger und nichtlebensfähiger Bakterien.
Herrmann et al. beschreiben in "Molecular and General Genetics" 159(2) 171-178 (1978) die Herstellung eines Transduktionsteilchens (d.h. eines Bakteriophagen) durch das Insertieren eines Transposons, das ein nachweisbares Gen trägt, in sein Genom.
Die EP-A-231608 offenbart ein Verfahren zum Markieren ("Tagging") eines Bakteriums mit einer stillen DNA-Sequenz, die dann verwendet wird, um die Spur des Mikroorganismus in der Umgebung zu verfolgen.
Gemäß vorliegender Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um spezifisch Zielbakterien in einer Probe zu detektieren, wobei das Verfahren umfaßt:
das Aussetzen der Probe einem für die Zielbakterien spezifischen Transduktionsteilchen, worin die Probe zuvor Bedingungen ausgesetzt worden ist, durch die die Bakterien abgetötet oder geschwächt werden sollen, wobei das Teilchen den Bakterien den detektierbaren Phenotyp der Eiskeimbidung verleihen kann; und
das Detektieren des Vorhandenseins inaktivierter und nicht-inaktivierter Bakterien in der Probe, die die Bedingungen überleben, denen sie ausgesetzt worden sind, und die Eiskeimbildungsaktivität aufweisen.
Wünschenswerterweise trägt das Transduktionsteilchen ein Eiskeimbildungsgen stromab von einem Promotorbereich. Das so getragene Eiskeimbildungsgen ist vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus inaW, inaY, inaZ und iceE besteht.
Vorzugsweise wird die Probe bei Verfahren gemäß dem ersten Aspekt einer Vielzahl von Transduktionsteilchen mit unterschiedlichen Wirtsbereichspezifitäten ausgesetzt, wodurch der Bakterientyp auf Basis des Musters der Phenotypen mit Eiskeimbildung ermittelt werden kann, das von der Vielzahl an Teilchen verursacht wird.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung gemäß dem ersten Aspekt wird die Probe vor dem Einwirken des Transduktionsteilchens immobilisierten Antikörpern ausgesetzt, die für die Zielbakterien spezifisch sind.
Bevorzugte Proben zur Anwendung des Verfahren gemäß dem ersten Aspekt sind Proben von Patienten, Wasser, Milchprodukten und Fleischerzeugnissen. Das Verfahren gemäß dem ersten Aspekt kann eingesetzt werden, wenn die Probe Zielbakterien und Nichtzielbakterien enthält, wobei der Bakteriophage für die Zielbakterien, nicht aber für die Nichtzielbakterien spezifisch ist. Das Verfahren ist auch anwendbar, wenn die Probe vor dem Einwirken des Transduktionsteilchens Bedingungen ausgesetzt worden ist, die die Zielbakterien schwächen können, beispielsweise wenn die Probe Erhitzen ausgesetzt worden ist.
Ein Beispiel für Zielbakterien zur Detektion nach dem Verfahren gemäß dem ersten Aspekt sind jene vom Genus Salmonella. Beispiele für geeignete Transduktionsteilchen zur Verwendung beim Verfahren nach dem ersten Aspekt sind jene, die von einem Bakteriophagen abgeleitet sind, der aus P22, L, Vil, 8, 23, 25, 31, 46, 102, 163 und 175 ausgewählt ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum spezifischen Detektieren von Ziel bakterien in einer Probe bereitgestellt, wobei das Verfahren umfaßt:
das Inkubieren der Probe in einem Wachstumsmedium in Gegenwart eines Transduktionsteilchens, das für die Zielbakterien spezifisch ist, unter Bedingungen, die das Anheften der Teilchen an die Bakterien fördern, wobei das Transduktionsteilchen den Bakterien einen Phenotyp der Eiskeimbildung verleihen kann;
daraufhin das Inkubieren der Probe unter Bedingungen, die die Entwicklung des Phenotyps mit Eiskeimbildung fördern; und
das Detektieren des Vorhandenseins von Bakterien, die den Phenotyp mit Eiskeimbildung aufweisen, in der Probe. Vorzugsweise ist das Wachstumsmedium für das Wachstum der Ziel bakterien selektiv.
Vorzugsweise wird die Probe gemäß dieser Ausführungsform zunächst bei einer Temperatur im Bereich von etwa 35ºC bis 40ºC ohne Rühren für einen Zeitraum von etwa 15 bis 120 min inkubiert, und wünschenswert wird die Probe daraufhin bei einer Temperatur im Bereich von 20ºC bis 25ºC für einen Zeitraum von etwa 30 min bis 2 h inkubiert. Geeigneterweise wird die Probe in Gegenwart einer Vielzahl von Transduktionsteilchen mit unterschiedlichen Wirtsbereichspezifitäten inkubiert, und es wird ermittelt, welche Transduktionsteilchen zur Transformation der Bakterien zum Phenotyp mit Eiskeimbildung führen, wodurch der Bakterientyp ermittelt werden kann. Gemäß dieser Ausführungsform wird vorgezogen, daß das Verfahren weiters das Einwirken von immobilisiertem Antikörper, der für die Zielbakterien spezifisch ist, auf die Probe; und das Abtrennen von an den immobilisierten Antikörper gebundenen Zielbakterien vor dem Inkubieren der Probe umfaßt; wünschenswert wird das Transduktionsteilchen als Prophage innerhalb des Genoms der Zielbakterien aufgenommen; und geeigneterweise wird das Vorhandensein von Bakterien, die den Phenotyp mit Eiskeimbildung aufweisen, mit einem Eiskeimbildungsassay detektiert, das beispielsweise ein Fluoreszenzgefrierassay umfaßt.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum spezifischen Detektieren von Ziel bakterien bereitgestellt, wobei das Verfahren umfaßt:
das Transformieren der Zielbakterien, um einen vorgewählten Zelloberflächenrezeptor zu exprimieren;
das Einbringen der transformierten Zielbakterien in eine Umgebung;
das Entnehmen von Bakterien aus der Umgebung;
das Aussetzen der entnommenen Bakterien einem Transduktionsteilchen, das für den Oberflächenrezeptor spezifisch ist, wobei das Teilchen den Bakterien den Phenotyp der Eiskeimbildung verleihen kann; und
das Detektieren des Vorhandenseins von Bakterien, die diesen Phenotyp aufweisen, in den entnommenen Bakterien.
Vorzugsweise enthält die Umgebung, in die die transformierten Bakterien eingebracht werden, andere Bakterien, die geeigneterweise die gleichen wie die Zielbakterien sind, mit der Ausnahme, daß ihnen der Zelberflächenrezeptor fehlt. Geeigneterweise sind die Zielbakterien eine Pseudomonas-Spezies und kodiert ein lamB-Gen für den Zelloberflächenrezeptor. Die Umgebung ist beispielsweise Boden, Luft oder Wasser.
Das Transduktionsteilchen, das den infizierten bakteriellen Zellen den Phenotyp der Eiskeimbildung verleihen kann, kann beispielsweise eines sein, das fähig ist, gramnegative Bakterien, wie z.B. Escherichia coli, Vibrio cholerae oder Salmonellae, spezifisch zu infizieren. Das Transduktionsteilchen kann alternativ dazu fähig sein, gram-positive Bakterien, wie Staphylococcus aureus oder Streptococcus pyogenes, spezifisch zu infizieren.
Das Transduktionsteilchen weist geeigneterweise ein Eiskeimbildungsgen stromab von einem Promotor auf und kann zusätzlich zum Eiskeimbildungsgen einen selektiven Marker, wie z.B. Antibiotikaresistenz, umfassen.
Das Aussetzen einer bakteriellen Zelle einem Transduktionsteilchen nach dem Verfahren gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt kann eine Bakterienzelle, z.B. E.coli oder S.typhimurium, die einen Prophagen mit einem Eiskeimbildungsgen unter der Transkriptionskontrolle eines Promotors aufweist, ergeben. Geeigneterweise ist das Eiskeimbildungsgen aus inaW, inaY, inaZ und iceE ausgewählt.
Transduktionsteilchen, die fähig sind, infizierten Bakterienzellen den Phenotyp der Eiskeimbildung zu verleihen, werden geeigneterweise nach einem Verfahren hergestellt, das umfaßt:
das Induzieren bakterieller Zellen, die einen Prophagen aufweisen, der ein Eiskeimbildungsgen unter der Transkriptionskontrolle eines Promotors umfaßt; und
das Entnehmen von Transduktionsteilchen, die freigesetzt werden, wenn die Bakterienzellen lysiert werden. Wieder ist das Eiskeimbildungsgen geeigneterweise aus inaW, inaY, inaZ und iceE ausgewählt.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Transduktionsteilchen, die fähig sind, infizierten Bakterienzellen den Phenotyp der Eiskeimbildung zu verleihen, umfaßt:
das Kombinieren eines Gens, das für den Phenotyp mit Eiskeimbildung kodiert, mit den essentiellen terminalen DNA-Sequenzen eines Transposons, um ein insertierbares Element herzustellen; und
das Einbringen des insertierbaren Elements in einen Bakteriophagen mit einem Genom, das zur Rekombination mit dem insertierbaren Element fähig ist. Das Gen wird aus Eiskeimbildungsgenen ausgewählt; das insertierbare Element kann in einem bakteriellen Plasmid vorhanden sein und durch Rekombination in einer bakteriellen Zelle in den Bakteriophagen eingebracht werden.
Gemäß vorliegender Erfindung werden Verfahren und Zusammensetzungen bereitgestellt, um lebensfähige Bakterien in biologischen Proben zu detektieren und zu identifizieren. Für diese Zwecke umfaßt der Begriff lebensfähige Bakterien alle Bakterien, die dazu fähig sind, Gene (vorübergehend oder anders) zu exprimieren. Die Zusammensetzungen umfassen Bakteriophagenteilchen, die einen bekannten Wirtbereich von Bakterien infizieren und solche Bakterien zu einem Phenotyp mit Eiskeimbildung transformieren können. Das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung eignet sich zum Detektieren der meisten Bakterientypen, mit der Einschränkung, daß die Zielbakterien gegenüber der Bakteriophageninfektion empfänglich sein müssen und daß die Bakterien des Wildtyps selbst nicht den nachweisbaren Phenotyp erzeugen können. Biologische Proben von Interesse können eigentlich aus jeder Quelle erhalten werden, die fähig ist, Bakterien in einem lebensfähigen Zustand zu halten oder aufzubewahren, einschließlich Proben von Patienten, Wasser, Milchprodukten, Fleischerzeugnissen und dergleichen.
Solche Proben enthalten oft gemischte oder unreine Bakterienpopulationen, die möglicherweise, aber nicht notwendigerweise ein Zielbakterium von Interesse enthalten. Ein bevorzugtes Verfahren gemäß vorliegender Erfindung ist die Detektion von Salmonella, insbesondere in Nahrungsmitteln.
Das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung kann entweder zum Screenen von Proben auf das Vorhandensein von Bakterien oder zum Typisieren von Bakterien eines unbekannten Stammes oder einer unbekannten Spezies verwendet werden. Zum Screenen ist nur ein einzelner Bakteriophage mit einem relativ breiten Wirtsbereich notwendig. Die biologische Probe wird unter Bedingungen inkubiert, die geeignet sind, das Wachstum von Bakterien zu fördern, und es ist nicht notwendig, eine Reinkultur bereitzustellen. Solche Screeningverfahren sind sehr schnell und einfach und sind besonders nützlich, um verunreinigte Proben, wie Nahrungs- oder Wasserproben, zu identifizieren. Bei bakterieller Typisierung wird im Gegensatz dazu eine Bakteriophagengruppe mit unterschiedlichen oder einander überlappenden Wirtsbereichen eingesetzt. Jeder der Bakteriophagen wird gegen eine (Rein- oder andere) Kultur der Bakterien getestet, indem typischerweise verschiedene Elemente der Phagengruppe zu Aliquoten der zu testenden Kultur zugegeben werden. Der Bakterientyp wird dann auf Basis des Reaktivitätsmusters der einzelnen Bakteriophagen ermittelt. Obwohl die Typisierung die Verwendung einer Reinkultur der Bakterien umfassen kann, hat das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung den Vorteil, daß die Detektion der Phageninfektiosität sehr rasch erfolgt, wodurch die für den Assay erforderliche Gesamtzeit stark verringert wird. Darüberhinaus kann der Phenotyp mit Eiskeimbildung leicht durch automatisierte Systeme detektiert werden, wodurch der für den Assay erforderliche Arbeitsaufwand verringert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt die Spezifität von Bakteriophagen für bestimmte Bakterien. Diese Spezifität wird beibehalten, wenn die Bakteriophagen modifiziert werden, sodaß sie ein Markergen enthalten (siehe Beispiel 5). Als Folge kann die Detektion über das erfindungsgemäße Assay unabhängig vom Vorhandensein anderer (Nichtziel bakterien) auf spezifischer Basis erreicht werden. Es ist selbstverständlich möglich (wenn auch unwahrscheinlich), daß die modifizierten Bakteriophagen gemäß vorliegender Erfindung im Vergleich zum Wildtypphagen, von dem sie abstammen, eine gewisse Änderung in ihrer Wirtsbereichspezifität aufweisen. Eine solche Variation ist kein Problem, solange der Bakteriophage die Spezifität für die Bakterien von Interesse beibehält und frei von Spezifität für andere Bakterien ist, die in einer bestimmten Probe vorhanden sein könnten.
Ein wichtiger Vorteil des Verfahren gemäß vorliegender Erfindung besteht darin, daß es bei Assays verwendet werden kann, die Bakterienzellen umfassen, die lebensfähig, aber auf irgendeine Weise inaktiviert (physiologisch beeinträchtigt) sind, z.B. durch Einwirkung schädigender oder schwächender Behandlungen, wie z.B. Hitze, Kälte oder Trocknung. Eine solche Inaktivierung entsteht üblicherweise während der industriellen Verabeitung, z.B. der Behandlung bakterieller Verunreinigungen in Nahrungsmitteln. Der erfindungsgemäße Assay kann inaktivierte Zellen detektieren (Beispiel 4, das durch Hitze inaktivierte Salmonella-Zeilen betrifft), einschließlich inaktivierter Zellen in einem Gemisch aus gesunden und inaktivierten Zellen. Das sorgt insofern für eine beträchtliche Zeitersparnis, als es die Notwendigkeit eines Voranreicherungsschrittes und eines selektiven Anreicherungsschrittes minimiert oder ausschaltet. Solche Schritte werden in anderen bakteriellen Assays üblicherweise verwendet, um zu ermöglichen, daß sich die Zielzelen auf eine detektierbare Menge vervielfältigen, während die Populationen anderer Organismen eingeschränkt bleiben. Siehe Andrews, "Injured Index and Pathogenic Bacteria", Boca Raton, Florida, S.56-113 (1989). Weil geschwächte Zellen möglicherweise nicht in der Lage sind, die strengen Bedingungen selektiver Anreicherung zu überleben, wird oft ein vorhergehender nichtselektiver "Voranreichungs"-Schritt eingesetzt, um das Stabilisieren der geschwächten Zellen zuzulassen. Die Salmonella-Isolierungsvorschrift der US-Lebensmittelbehörde empfiehlt ein Minimum von 22 h für jeden der beiden Schritte (Voranreicherung und selektive Anreicherung); Andrews et al; "Bacteriological Analytical Manual", 5. Auflage, Lebensund Arzneimittelbehörde, District of Columbia, Kapitel VI, 1-29 (1978). Das erfindungsgemäße Verfahren bietet somit beträchtliche Vorteile bezüglich Zeitersparnis, wenn es auf Systeme mit inaktivierten Zellen angewandt wird.
Der Transduktionsphage trägt ein Eiskeimbildungsgen. Die Probe wird zunächst unter Bedingungen mit dem Phagen inkubiert, die die Befestigung des Phagen an der Zelle fördern, typischerweise bei einer Temperatur im Bereich von etwa 35ºC bis 40ºC ohne Rühren für einen Zeitraum im Bereich von etwa 15 bis 120 min. Daraufhin wird die Probe in einer Suspension unter Bedingungen inkubiert, die die Entwicklung des Phenotyp mit Eiskeimbildung fördern, typischerweise bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20ºC bis 25ºC für einen Zeitraum im Bereich von etwa 30 min bis 2 h. Zum Phenotyp mit Eiskeimbildung transformierte Bakterien werden nach einem herkömmlichen Kryoassay detektiert, typischerweise, indem die zu testende Suspension in Tropfen mit Volumina unter etwa 10 µl unterteilt und die Tröpfchen einer Temperatur im Bereich von etwa -3ºC bis -12ºC, häufiger im Bereich von etwa -8ºC bis -10ºC, ausgesetzt werden. Die Bildung von Eiskeimen in einem solchen Temperaturbereich weist auf das Vorhandensein von Eiskeimbildungsstellen an den Zelloberflächen der Bakterien hin.

Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung setzt modifizierte Bakteriophagen, die nachstehend als Transduktionsteilchen bezeichnet werden, ein, um Bakterienzellen in biologischen Proben zu detektieren oder zu identifizieren. Wie hierin verwendet, umfaßt der Begriff Transduktionsteilchen auch Komponenten eines modifizierten Bakteriophagen, die, wenn sie unter entsprechenden Bedingungen miteinander vermischt werden, sich vereinen, um den modifizierten Bakteriophagen zu bilden. Bei den biologischen Proben kann es sich eigentlich um jede Substanz oder jedes Medium handeln, das/die fähig ist, bakterielles Wachstum zu unterstützen oder bakterielle Zellen auf andere Weise in einem lebensfähigen Zustand zu halten. Zu biologischen Proben, die für die vorliegende Erfindung von besonderem Interesse sind, gehören Wasser, Erde, Nahrungsmittelproben, wie z.B. Fleischerzeugnisse und Milchprodukte, die für bakterielle Verunreinigung besonders anfällig sind, Proben von Patienten, wie Blut, Plasma, Serum, Sputum, Samen, Speichel, durch Spülen von Organen erhaltene Flüssigkeiten, Fäzes, Zellkultur und dergleichen.
Der Bereich zu detektierender bakterieller Zellen ist nur durch die Wirtsbereiche verfügbarer Bakteriophagen beschränkt. Von besonderem Interesse sind pathogene Bakterien, die zur Verunreinigung von Nahrung und Wasserversorgungen fähig und dafür verantwortlich sind, Erkrankungen bei Tieren und Menschen hervorzurufen. Solche pathogenen Bakterien sind üblicherweise gram-negativ, obwohl auch die Detektion und Identifizierung gram-positiver Bakterien Teil der vorliegenden Erfindung ist. Eine repräsentative Liste bakterieller Wirte von besonderem Interesse gemeinsam mit den durch solche Wirte verursachten Erkrankungen und den zur Infizierung solcher Wirte fähigen Bakteriophagen ist in Tabelle 1 angeführt.
Die Transduktionsteilchen gemäß vorliegender Erfindung werden erhalten, indem ein natürlich auftretender Bakteriophage so modifiziert wird, daß er ein Gen trägt, das fähig ist, die Zielbakterien in einen Phenotyp mit Eiskeimbildung zu transformieren, das in der Folge als primäres Markergen bezeichnet wird. Das Transduktionsteilchen muß fähig sein, das primäre Markergen auf solche Weise spezifisch in den bakteriellen Zielwirt einzubringen, daß der bakterielle Wirt die Genfunktion auf nachweisbare Art exprimieren kann. Es gibt eine große Anzahl von Bakteriophagen, und sie können zur Modifizierung auf Basis des gewünschten Wirtsbereichs und der Fähigkeit des Bakteriophagen, das Gen von Interesse zu tragen und zu transduzieren, ausgewählt werden. Insbesondere muß der Bakteriophage groß genug sein, um das primäre Markergen, den zugeordneten Promotorbereich und jegliche anderen DNA-Bereiche, die enthalten sein können, unterzubringen. Der modifizierte Bakteriophage gemäß vorliegender Erfindung behält üblicherweise die normale Wirtsbereichspezifität des unmodifizierten Bakteriophagen bei, obwohl eine gewisse Änderung der Spezifität akzeptabel wäre, solange sie die Fähigkeit zum Identifizieren der gewählten Zielbakterien nicht beeinträchtigt.
Der zu modifizierende Bakteriophage kann temperent oder virulent sein und ist vorzugsweise temperent, sodaß eine verlängerte Expression des primären Markergens in den Zielbakterien bereitgestellt wird. Alternativ dazu kann die Modifikation des Bakteriophagen zu einem fehlerhaften Transduktionsteilchen führen, das fähig ist, das Markergen in einen bakteriellen Zielwirt einzubringen, aber unfähig ist, lytische oder lysogene Infektion zu erzielen. Im letzteren Fall kann das primäre Markergen Teil eines Plasmids oder einer anderen selbstreplizierenden episomalen Einheit sein, das/die im infizierten Wirt beibehalten und exprimiert wird. Ein ähnliches Ergebnis (Einbringen des Markergens ohne Infektion) kann auftreten, wenn ein Transduktionsteilchen eine Zielzelle außerhalb des normalen Wirtsbereichs des Phagen, von dem es abstammt, infiziert.
Die Transduktion des Markersphenotyps kann durch vorübergehende Expression (d.h. Expression aus einem Gen, das von der Zelle nicht stabil behalten wird) des Markergens stattfinden. In einem solchen Fall wird die vom Bakteriophagen transduzierte DNA möglicherweise nicht den gesamten Testzeitraum intakt überleben. jedoch ist die Transkription des vom Phagen transduzierten Markergens ausreichend effizient, bevor die DNA abgebaut wird, um zu gewährleisten, daß das Bakterium bis zum Ende des Testzeitraums eine funktionelle Markierung aufgebaut hat. Das Bakterium kann daher auch dann nach dem erfindungsgemäßen Assay detektiert werden, wenn das Bakterium die Phagen-DNA abbaut.
Gemäß vorliegender Erfindung nützliche Bakteriophagen könen von mikrobiologischen Depots, wie der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, erhalten werden. Virulente Bakteriophagen sind als bakterienfreie Lysate erhältlich, während lysogene Bakteriophagen im allgemeinen als infizierte Wirtszellen erhältlich sind.
Aus einer beliebigen Quelle erhaltene Bakteriophagen des Wildtyps können nach herkömmlichen rekombinanten DNA-Techniken modifiziert werden, um ein gewünschtes primäres Markergen einzubringen, das fähig ist, den detektierbaren Phenotyp von Intersse herzustellen. Vor dem Einbringen wird das Markergen von Interesse mit einem Promotorbereich auf einer geeigneten Genkassette kombiniert. Die Genkassette kann nach herkömmlichen rekombinanten DNA-Techniken in einem geeigneten Wirt wie z.B. E.coli konstruiert werden. Sowohl das Markergen als auch der Promotorbereich sollten so gewählt sein, daß sie im Zielwirt funktionieren, und die Kassette kann gegebenenfalls ein zweites Markergen, wie z.B. eine Antibiotikaresistenz, Schwermetallresistenz oder dergleichen, enthalten, um die Manipulation in vitro zu erleichtern.
Das primäre Markergen (oder die Gene, wenn nicht ein einzelnes Gensystem) sollte fähig sein, einen Phenotyp mit Eiskeimbildung im bakteriellen Zielwirt zu exprimieren.
Geeignete Eiskeimbildungsgene können aus Mikroorganismen isoliert werden, die in natürlichem Zustand einen Phenotyp mit Eiskeimbildung aufweisen. Zu den exemplarischen Eiskeimbildungsgenen und Bakterien, aus denen sie isoliert werden können, gehören aus Pseudomonas syringae S203 isoliertes inaZ, aus Pseudomonas syringae PS31 isoliertes inaY, aus P.fluorescenc MS1650 isoliertes inaW und aus Erwinia herbicola isoliertes iceE. Die Sequenz von inaZ ist in Greeen und Warren (1985) Nature 31 7:645-648 angeführt, während die Sequenz von inaW in Warren et al. (1986) "Nucl.Acid.Res." 14:8047-8060 angeführt ist. Siehe auch US-PS-4.464.473. Die Lehren dieser Dokumente reichen aus, um einen Fachmann in die Lage zu versetzen, einen Eiskeimbildungsorganismus aus der Umgebung zu isolieren und durch herkömmliche Klonierungs- und Screeningtechniken ein ina-Gen davon zu erhalten.
Die Transduktionsteilchen gemäß vorliegender Erfindung können mit einer Anzahl herkömmlicher Genmanipulationstechniken hergestellt werden, einschließlich stellengerichteter Insertion der Markergenkassette in das Bakteriophagengenom, Packen des Plasmids, das das Markergen oder einen Abschnitt davon trägt, in die Bakteriophagenhülle, Transposonmutagenese und homologe Rekombination. Die Wahl unter diesen Alternativen hängt von der Art des bakteriellen Wirts, der Art des Bakteriophagen und dem Ausmaß ab, in dem der Bakteriophage charakterisiert worden ist.
Bei gut charakterisierten Bakteriophagen, insbesondere jenen, bei denen eine Genkartierung ("mapping") vorgenommen wurde, ist es häufig wünschenswert, die primäre Markergenkassette, einschließlich des Promotorbereichs und gegebenenfalls der zweiten Markierung, durch rekombinante Standard-DNA-Techniken im Bakteriophagengenom anzuordnen. Nach der Herstellung des Plasmids in einem geeigneten Wirt, wie oben beschrieben, wird die Markergenkassette herausgeschnitten und in den gewünschten Bakteriophagen eingefügt. Strategien zur Insertion in den λ-Phagen, die auf andere Bakteriophagen übertragen werden können, sind in Young und Davis (1983) "Proc.Natl.Acad.Sci." USA 80:1194-1198, beschrieben.
Transduktionsteilchen, die zur lytischen oder lysogenen Infektion fähig sind, werden durch Deletion nichtessentieller Bereiche des Bakteriophagengenoms und Substitution der Genkassette hergestellt. Wünschenswerterweise haben die deletierten und insertierten Bereiche in etwa die gleiche Größe, sodaß das Packen mit minimaler Störung erfolgen kann. In manchen Fällen jedoch kann es notwendig sein, bestimmte essentielle Bereiche des Bakteriophagengenoms zu löschen, insbesondere, wenn es wünschenswert ist, relativ große Markergenkassetten insertieren. In diesem Fall behalten die Transduktionsteilchen die Fähigkeit bei, die DNA in den gewünschten bakteriellen Wirt einzufügen, sind aber nicht fähig, sich innerhalb des Wirts zu vermehren. Reproduktion kann jedoch erzielt werden, indem ein Helfer-Bakteriophage bereitgestellt wird, wie z.B. Bakteriophagen des Wildtyps, die in der Lage sind, essentielle Packungsfunktionen bereitzustellen.
Alternativ dazu ist es bei gut charakterisierten Bakteriophagen möglich, das Plasmid oder die Markergenkassette durch Befestigung der Bakteriophagen-pac-Stelle in einem DNA-Konstrukt mit dem Plasmid oder der Kassette zu packen. Die pac-Stelie kann aus dem Bakteriophagengenom erhalten und in das Plasmid kloniert werden, das das primäre Markergen, den Promotorbereich und gegebenenfalls den zweiten Marker enthält. Das Plasmid kann dann auf einen geeigneten bakteriellen Wirt übertragen werden, der dann mit einem Bakteriophagen mit einer fehlerhaften pac-Stelie infiziert wird. Der bakterielle Wirt erzeugt dann Transduktionsteilchen, bei denen das Plasmid und/oder die Markergenkassette in eine Bakteriophagenhülle gepackt ist, der fähig ist, die Plasmid-DNA in Bakterien seines Wirtsbereichs zu insertieren. Allgemeine Verfahren zur Klonierung von pac-Stellen und Herstellung von Bakteriophagen mit Packungsfehlern werden von Vogel und Schmieger (1986) "Mol.Gen.Genet." 205:563- 567 beschrieben.
Bei weniger charakterisierten Bakteriophagen kann Transposon mutagenese eingesetzt werden, um die Transduktionsteilchen gemäß vorliegender Erfindung herzustellen. Das Verfahren von Spanova und Karlovsky (1986) "Folia Microbiol." 31:353-363 für die Mutagenese von Phage L (Salmonella typhimunum) kann verallgemeinert werden, um es auf andere Transposone, Bakteriophagen und bakterielle Wirte anzuwenden. Eine Markergenkassette wird vom Plasmid, wie oben beschrieben, zunächst nach herkömmlichen Techniken in ein gewünschtes Transposon insertiert. Das modifizierte Transposon wird dann durch gleichzeitige Infektion eines geeigneten Wirts sowohl mit dem modifizierten Transposon als auch dem Bakteriophagen in den gewünschten Bakteriophagen transponiert. Die Wirtszellen werden dann inkubiert, bis Lyse auftritt, und die freigesetzten Phagen werden gesammelt. Eine Fraktion des freigesetzten Phagen trägt das Transposoninsert. Von Bakteriophagen freie Wirtszellen werden dann mit dem wie oben beschrieben erhaltenen Phagengemisch infiziert, und Zellen ausgewählt, die die auf dem Transposon vorhanden nachweisbare Markierung tragen. Unlysierte ausgewählte Zellen, in denen der das modifizierte Transposon tragende Bakteriophage lysogen geworden ist, werden dann auf selektive Medien ausplattiert und auf den gewünschten Phenotyp gescreent. Solche ausgewählte Zeilen enthalten somit Prophagen mit dem gewünschten primären Markergen unter der Steuerung eines geeigneten Promotors. Transduktionsteilchen können dann erhalten werden, indem der Prophage in einen lytischen Zustand übergeführt wird, was zu Zell-Lyse und der Freisetzung einer großen Menge an geeigneten Transduktionsteilchen führt.
Die Verwendung eines sekundären Selektionsmarkers bei der Herstellung von Transduktionsteilchen durch Transposonmutagenese ist hilfreich, aber nicht erforderlich. Phagen, die so mutiert worden sind, daß sie den primären Selektionsmarker, das Eiskeimbildungsgen, enthalten, können gegenüber dem Hintergrund an Wildtyp-Phagen identifiziert werden, indem ein geeignetes Assay durchgeführt wird, wie z.B. ein Replikaplattierungsassay für Eiskeime im Fall des Eiskeimbildungsgens. Solche Screening-Assays werden in Lindow et al. (1978) "App.Environ.Microbiol." 36:831-838 gelehrt.
Neben den obigen Techniken können Transduktionsteilchen durch homologe Rekombination hergestellt werden, was zu Niedrigfrequenztransduktionsteilchen oder Hochfrequenztransduktionsteilchen führt. Niedrigfrequenztransduktionsteilchen können aus dem die Markergenkassette tragenden Plasmid konstruiert werden, indem zuerst eine Restriktionsbibliothek des Bakteriophagengenoms von Interesse hergestellt wird. Die Restriktionsfragmente aus der Bibliothek werden dann in einem geeigneten Wirt in das Plasmid kloniert, was zu Plasmiden führt, die relativ große Bereiche tragen, die mit dem Wildtyp-Bakteriophagen homolog sind. Solche Bereiche dienen als "cross-over"- Punkte bei homologen Rekombinationsereignissen, die auf nach dem Stand der Technik gut beschriebene Weise erfolgen. Das rekombinante Plasmid wird dann in einen geeigneten bakteriellen Wirt eingebracht, und Kolonien, die das primäre oder sekundäre Markergen exprimieren, werden zur Infektion mit deni Wildtyp-Bakteriophagen ausgewählt. Ein relativ geringer Prozentsatz der durch die Bakteriophageninfektion erzeugten Transduktionsteilchen umfaßt das gesamte Plasmid, das die Markergenkassette als Insert trägt. Eine frische Bakterienkultur wird dann mit den gemischten Transduktionsteilchen infiziert, und die transformierten Kolonien werden auf Basis der Expression entweder des primären Markers oder des sekundären Markers, die vom Plasmid getragen werden, ausgewählt.
Ein spezifisches Beispiel für die Herstellung von Niedrigfrequenztransduktionsteilchen, die fähig sind, spezifisch S.typhimurium zu infizieren, wird im nachstehenden Abschnitt über Versuche als Beispiel 2 angeführt.
Niedrigfrequenztransduktionsteilchen mit einer relativ hohen Transduktionsfrequenz, üblicherweise mehr als etwa 5%, können verwendet werden, um das Assay gemäß vorliegender Erfindung durchzuführen. Für Transduktionsteilchen mit einer niedrigeren Transduktionsrate ist es üblicherweise wünschenswert, die bakteriellen Wirte weiter zu modifizieren, um Hochfrequenztransduktionsteilchen herzustellen.
Hochfrequenztransduktionsteilchen werden wie oben beschrieben hergestellt, wobei jedoch ein Prophage im bakteriellen Genom als Ziel für die homologe Rekombination verwendet wird. Zu diesem Zweck wird ein lysogener Stamm (ein Stamm, der die Wildtyp-Bakteriophagen-DNA in seinem Genom als Prophage trägt) eingesetzt und mit einem Pläsmid transformiert, das die Genmarkerkassette trägt, die zur Replikatiom im Wirt unfähig ist. Daher sind unter den entsprechenden selektiven Bedingungen nur Wirte lebensfähig, bei denen die selektiven Marker in den Prophagen aufgenommen worden sind. Alternativ dazu kann das Plasmid auf andere Weise verändert werden, sodaß Rekombination mit dem Prophagen leicht zu detektieren ist. Plasmide, die zur Replikation im gewünschten bakteriellen Wirt unfähig sind, können durch mehrere Techniken hergestellt werden. Beispielsweise kann ein Niedrigfrequenztransduktionsphage, der wie oben beschrieben hergestellt wird, eingesetzt werden, da die vom Prophagen exprimierten Immunitätsfunktionen Replikation verhindern. Als zweites können Plasmide verwendet werden, die zur Replikation in einem geeigneten Klonierwirt fähig, aber zur Replikation im Zielwirt von Interesse nicht fähig sind. Schließlich kann das Plasmid so modifiziert werden, daß das primäre Markergen in den Prophagen insertiert wird, während der sekundäre Marker außerhalb des Bereichs angeordnet ist, der im Prophagen aufgenommen ist. Rekombination kann dann detektiert werden, indem bezüglich Zellen gescreent wird, die den primären Selektionsphenotyp exprimieren, die aber den sekundären Selektionsphenotyp verloren haben. Die Aufnahme des gewünschten Markergens in den Prophagen kann durch Standardtechniken, wie z.B. Southern Blotting, wie von Southern (1975) "J.Molec.Biol." 98:503-517 beschrieben, bestätigt werden.
Ein spezifisches Beispiel für ein Hochfrequenztransduktionsteilchen, das fähig ist, S.typhimurium spezifisch zu infizieren, wird im nachstehenden Abschnitt über Versuche als Beispiel 3 angeführt.
Ein bevorzugtes Mittel zur Herstellung von Hochfrequenztransduktionsteilchen über homologe Rekombination umfaßt den Einsatz von Transposonmarkieren, wobei ein insertierbares Element das Gen für einen nachweisbaren Phenotyp von Interesse verbunden mit den essentiellen Terminalsequenzen eines Transposon umfaßt. Solche insertierbaren Elemente können Stellen in einem Bakteriophagengenom identifizieren, in die ein Eiskeimbildungs- oder anderes Reportergen insertiert werden kann, ohne daß die essentiellen Bakteriophagenfunktionen gestört werden. Im allgemeinen kann jedes bakterielle Transposon verwendet werden, um das insertierbare Element herzustellen. Es ist wünschenswert, daß die Größe des resultierenden insertierbaren Elements so gering wie möglich ist, um das Packen des gesamten resultierenden Phagengenoms in reife Virusteilchen zuzulassen.
Da erwartet wird, daß die Frequenz des Auftretens geeigneter Stellen beim Transposonmarkieren gering ist, kodiert das verwendete bakterielle Transposon vorzugsweise für Funktionen, die die Selektion von Transpositionsereignissen zulassen. Zu diesem Zweck kann ein natürlich auftretendes Transposon so modifiziert werden, daß ein kleines selektierbares Transposon bereitgestellt wird. Es wäre jedes Transposon geeignet, bei dem die Transposasefunktionen von den Enden des transponierbaren Elements abgetrennt werden können. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, IS (Insertionssequenz-)Elemente, wie IS50, und transponierbare Arzneimittelresistenzelemente, wie Tn3, Tn5 und Tn7, wie nach dem Stand der Technik bekannt ist. Das bakterielle Transposon Tn5 ist für solche Modifikationen am zweckmäßigsten, da es nach dem Stand der Technik detailliert charakterisiert worden ist. Krebs und Reznikoff (1986); J.Mol.Bioi.192: 721-791; Dogson und Berg (1989) "Gene 76:207-213.
Als ein Ansatz können die essentiellen terminalen DNA-Sequenzen eines Transposons nach Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, chemisch synthetisiert werden. Beim Synthetisieren dieser DNA-Sequenzen ist es vorteilhaft, Flankiersequenzen (Polylinker) aufzunehmen, die die Erkennungsstellen für eine Anzahl von Restriktionsendonukleasen enthalten. Das erleichtert das Insertieren selektierbarer Marker zwischen den Enden des Transposonelements und ermöglicht es, daß das so erzeugte Element leicht in ein Vektorplasmid kloniert wird, dessen Wahl von der Art des bakteriellen Wirts für speziellen Bakteriophagen abhängt. Wie nach dem Stand der Technik wohlbekannt, wären zur Verwendung in Bakterien von der Familie Enterobacteriaceae Plasmide mit engem Wirtsbereich geeignet, die von ColE1, P15A oder pMB9-Replikons abstammen (wie z.B. pAT273, pACYC184, pBR322 oder pUC19), während im allgemeinen jedes Plasmid mit breiten Wirtsbereich, das von den Inkompatibilitätsgruppen IncP, IncW oder IncQ abstammt (wie z.B. jene, die von pRK2, pS-a oder pRSF1010 abstammen), zur Verwendung in anderen gram-negativen Bakterien geeignet wäre. Für gram-positive Bakterien können andere geeignete Plasmidvektoren verwendet werden, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind.
Es ist vorzuziehen, daß die Transposase für das gewählte Transposon nicht zwischen den Enden des Transposons angeordnet ist. Auf diese Weise ist das transponierbare Element, sobald es in das Bakteriophagengenom insertiert worden ist, nicht mehr in der Lage, eine zweite Transposition zu erfahren. Im allgemeinen ist es auch wünschenswert, daß sich diese Stelle auf demselben DNA-Molekül wie das zu transponierende Element (d.h. in cis) befindet, obwohl das Transposon und die Transposase in manchen Systemen auf getrennten Plasmidreplikons (d.h. in trans) angeordnet sein könnten.
Es kann auch wünschenswert sein, die Expression des Transposasegens des transponierbaren Elements zu modifizieren, indem die Kodiersequenz für das Transposaseprotein stromab von einem hochexprimierenden bakteriellen Promotor insertiert wird. Solche Promotoren sind Fachleuten bekannt und umfassen die tac-, trcund lac-Promotoren von E.coli. Es ist bekannt, daß die Überexpression der bakteriellen Transposasen für die Wirtszelle schädlich sein kann, sodaß es auch wünschenswert ist, daß die Transkription vom gewählten Promotor regulierbar ist. Promotoren wie z.B. die tac-, trc- und lac-Promotoren werden durch den lac-Repressor, das Produkt das lacI- Gens, reprimiert. Das Einschließen eines solchen Gens auf dem gleichen Molekül wie die Transposase gewährleistet die Expression des Transposaseproteins nur unter Bedingungen, bei denen die Repression ausgeschaltet wird (d.h. Induktionsbedingungen). Beim lacI-Gen tendiert die Chemikalie Isopropylthiogalaktosid (IPTG) dazu, den lac-Repressor zu beschränken.
Im allgemeinen hat jede Kombination aus einem hochexprimierenden, aber reprimierbaren Promotor und seinem assoziierten Repressorgen die Funktion, das gleiche Ergebnis zu ergeben. Wenn ein auswählbarer Marker als Insert zwischen den Enden des transponierbaren Elements verwendet wird, sollte der Marker so klein wie möglich sein. Vorzugsweise beträgt die Größe des transponierbaren Elements weniger als 1 kb. Im allgemeinen sind Gene mit Antibiotikaresistenz größer als erwünscht, obwohl die absolute Größe der transponierten DNA durch die Packungsgrenzen des einzelnen Bakteriophagen beschränkt ist.
Bei einem bevorzugten Mittel zur Selektion wird das Phänomen der α- Komplementierung zur Laktoseverwertung in E.coli, wie beschrieben, eingesetzt. Hier kodiert ein kleines Fragment des β-Galaktosidasegens (das lacZα-Fragment mit einer Länge von etwa 500 bp) für ein Polypeptid, das die Funktionalität eines andere mutanten Polypeptids wiederherstellt, bei dem Aminosäuren deletiert worden sind (die M15-Deletion). Der Einschluß des lacZ-α-Fragments zwischen den Enden des Transposons ermöglicht die Wahl von Bakteriophagen, die die insertierte DNA tragen, durch deren Fähigkeit, die Laktoseverwertung bei Wirtsbakterien, die die lacZM15- Deletion entweder auf einem Plasmid oder im Chromosom tragen, wiederherzustellen.
Die DNA-Fragmente, die für diese beiden Aktivitäten kodieren, sind im Detail charakterisiert worden und können von Fachleuten leicht manipuliert werden. Siehe I.Zabin et al., "The Operon" (Hrs. J.H. Miller et al.), Cold Spring Harbor Laboratory (New York) 104-107 (1978).
Ein Plasmid, das die Transposase, Endstück-DNA, Marker-DNA und Repressor, wie oben beschrieben, enthält, wird in eine Bakterienzelle (z.B. Salmonella) eingeracht, die innerhalb des bakteriellen Genoms Prophagen-DNA (z.B. P22) enthält. Die Transposase wird durch einen geeigneten chemischen Inducer (z.B. Isopropyl-β-D- thiogalactopyranosid) induziert, und die Bakterienzellen werden mehrere Generationen lang gezüchtet. Der Prophage wird dann z.B. mit einem geeigneten chemischen Inducer (z.B. Mitomycin C) induziert, was Bakteriophagen ergibt. Die Bakteriophagen, die ein Transposoninsert tragen, werden durch Infizieren eines geeigneten bakteriellen Wirt (z.B eines, der die M15-Deletion aufweist) mit dem induzierten Phagenlysat ausgewählt. Die infizierten Zellen werden auf Medien ausplattiert, die für den Marker selektiv sind (z.B. lacZα), was zur Auswahl von Zellen führt, die ein Prophagengenom enthalten, das wiederum das Transposonfragment enthält, das Endstücke und Marker enthält. Die ausgewählten Zellen werden dann zur Phagenlyse induziert, um reine Phagenpräparate zu erhalten. Das DNA-Fragment des Bakteriophagen, der das Transposoninsert trägt, wird unter Einsatz von in vitro-Techniken isoliert. Dieses Fragment wird auf einem geeigneten Plasmidvektor kloniert. Der selektierbare Marker (z.B. lacZ α) wird unter Einsatz von in vitro-Techniken durch das Eisgen ersetzt. Homologe Rekombination kann dann unter Verwendung eines Plasmids durchgeführt werden, das das so hergestellte Eisgen enthält, wobei die homologe Rekombination die Rekombination zwischen der Prophagen-DNA im bakteriellen Genom und der Prophagen-DNA, die das Eisgen auf dem Plasmid flankiert, umfaßt. Der resultierende Stamm ergibt bei Phageninduktion Transduktionsteilchen, die Eisgen-DNA an einer Stelle innerhalb der Prophagen-DNA enthält, wobei das Vorhandensein des Eisgens an dieser Stelle essentielle Phagenfunktionen nicht stört.
Die wie oben beschrieben hergestellten Transduktionteilchen werden verwendet, um Zielbakterien in biologischen Proben wie folgt zu detektieren. In manchen Fällen ist es möglich, eine biologische Probe zu infizieren und die Anderung und den Phenotyp direkt zu beobachten, obwohl es in anderen Fällen vorzuziehen sein kann, zunächst eine Massenkultur der in der Probe vorhandenen Bakterien herzustellen. Verfahren zum Erhalten von Proben und (falls notwendig) Herstellen von Massenkultur variieren je nach der Art der biologischen Probe, und geeignete Techniken zur Herstellung verschiedener Probentypen sind in Standardtexten zur Mikrobiologie und Bakteriologie im Detail beschrieben, wie z.B. "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" (8.Auf.) Buchanan und Gibbons (Hrsg.) Williams & Wilkens Co., Baltimore (1974); "Manual of Methods for General Bacteriology" Gerhardt et al. (Hrsg.) "Am.Soc.Microbiology", Washington (1981); und "Manual of Clinical Microbiology" (2.Auf.) Lennette et al. (Hrsg.), "Am.Soc.Microbiology", Washington (1974).
Sobald die biologische Probe (mit oder ohne Züchten einer Massenkultur) hergestellt worden ist, wird sie typischerweise Transduktionsteilchen unter Bedingungen ausgesetzt, die die Bindung der Teilchen an die Bakterien und Injektion des genetischen Materials fördern, typischerweise bei einer Temperatur, die das rasche Wachstum der Bakterien unterstützt (z.B. 35ºC bis 40ºC) ohne Rühren für einen ausreichenden Zeitraum, um die Infektion zu ermöglichen (z.B. 15 min bis 120 min). Für Transduktionsteilchen, die ein ina-Gen tragen, wird die Probe dann bei einer geringeren Temperatur (z.B. 20ºC bis 25ºC) inkubiert, um die Bildung von Eiskeimbildungsstellen zuzulassen. Nach einer kurzen Zeit, typischerweise 30 min bis 2 h, kann die Probe auf Eiskeime untersucht werden, wie detaillierter nachstehend beschrieben.
Für Transduktionsteilchen, die ein Eiskeimbildungsgen tragen, können herkömmliche Tröpfchengefrierassays nützlich sein, wie in Vali (1971), oben, beschrieben, um die Transformation zum Phenotyp mit Eiskeimbildung zu detektieren. Alternativ dazu wird in der US-PS-4.784.943 ein spezifischer Fluoreszenzgefrierassay zur Detektion des Phenotyps mit Eiskeimbildung gelehrt. Kurz gesagt umfaßt der Assay zum Detektieren von Eiskeimbildung die Verwendung von fluoreszierenden Verbindungen, die im wäßrigem Zustand beim Frieren oder Tauen des wäßrigen Mediums eine Änderung in der Fluoreszenz oder den sichtbaren Eigenschaften zeigen. Geeignete Fluoreszenzverbindungen können aus der Fluoresceinfamilie ausgewählt werden, z.B. Calcein, Carboxyfluorescein und verwandte Verbindungen.
Wie oben beschrieben ist der Assay gemäß vorliegender Erfindung nützlich, um biologische Proben zu screenen, um zu bestimmen, ob im Wirtsbereich des Transduktionsteilchens vorhandene Bakterien vorhanden ist. Die vorliegende Erfindung ist auch nützlich, um bakterielle Spezies und Stämme auf ähnliche Weise wie durch herkömmliche Phagentypisierung zu typisieren, bei der zum Ermitteln von Phageninfektion Plaqueassays durchgeführt werden.
Zur Typisierung gemäß vorliegender Erfindung wird eine Gruppe von Transformationsteilchen mit unterschiedlichen, üblicherweise überlappenden Wirtsbereichen eingesetzt. Die Spezies und der Stamm der Zielbakterien können dann auf Basis des Reaktivitätsmusters mit den verschiedenen Transformationsteilchen ermittelt werden. Derartige Tests können häufig auf einem einzelen Träger durchgefrüht werden, wo die verschiedenen Transformationsteilchen in einer feststehenden Geometrie oder Matrix auf der Trägeroberfläche aufgetragen sind. Das Reaktivitätsmuster kann dann rasch beobachtet werden.
Die vorliegende Erfindung kann mit Nährstoffscreening kombiniert werden, um die untersuchten Bakterien weiter zu charakterisieren. Durch Bereitstellen eines selektiven Mediums entweder während der Massenkutur oder während der Ausplattierkutur kann der Bereich von Bakterien, die lebensfähig bleiben können, begrenzt sein. Da der phenotypische Assay der vorliegenden Erfindung nur lebensfähige Zellen detektieren kann, begrenzt das Fehlen eines detektierbaren Phenotyps den Bakterientyp, der vorhanden sein kann. Durch entsprechendes Kombinieren des Wirtsbereichs der Transduktionsteilchen und des Lebensfähigkeitsbereichs des sel ektiven Mediums kann das erfindungsgemäße Verfahren für den Bakterientyp, der ermittelt wird, sehr spezifisch gemacht werden.
Ein zweiter Ansatz, um die Fähigkeit der vorliegenden Erfindung, spezifisch bakterielle Wirte zu identifizieren, zu erhöhen, umfaßt den Einsatz von Immunadsorption. Immobilisierte Antikörper, einschließlich Antiseren oder monoklonaler Antikörper, werden eingesetzt, um spezifisch Bakterienzellen auf Basis der Identität ihrer Zelloberflächenepitope einzufangen. Die Bakterien können dann unter Verwendung der Transduktionsteilchen gemäß vorliegender Erfindung, wie oben beschrieben, weiter detektiert werden. Geeignete Materialien und Verfahren für die Immunadsorption spezieller bakterieller Spezies und Stämme auf Festphasenoberflächen werden in "Enterobacterial surface antigens: Methods for molecular characterization", Korhonen et al. (Hrsg.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985) beschrieben.
Die vorliegende Erfindung kann besonders in der Patientendiagnose nützlich sein, da sie die Ermittlung bakterieller Empfindlichkeit für Antibiotika und andere Bakterizide ermöglicht. Mittels Durchführung einer kurzen Inkubation der Bakterien mit einem zu screenenden Antibiotikum oder Bakterizid vor der Einwirkung der Transduktionsteilchen werden die Stoffwechselaktivitäten der Zellen angehalten und die Änderung des Phenotyp verhindert. Ein solches Testen ist nützlich, nachdem das Vorhandensein der Bakterien zunächst unter Verwendung der Transformationteilchen wie oben beschrieben bestätigt wird. Antibiotika und Bakterizide, die als für die bakterielle Infektion tödlich ermittelt wurden, können dann für die Behandlung des Patienten eingesetzt werden. Solche rasche und frühe Ermittlung nützlicher Antibiotika und Bakterizide kann bei der Behandlung schwerwiegender bakterieller Infektionen von unschätzbarem Wert sein.
Bei einer spezifischen Ausführungsform wird ein Mittel für die Untersuchung von Bakterien, die zuvor auf phagenspezifischer Basis für den erfindungsgemäßen Bakteriophagen anfällig gemacht worden sind, bereitgestellt. Das heißt, in einem ersten Schritt werden die Zielbakterien z.B. durch Transformation modifiziert, sodaß sie einen zellenspezifischen Rezeptor für den Bakteriophagen von Interesse enthalten oder exprimieren. In einem zweiten Schritt werden die modifizierten (oder markierten) Bakterien in eine Probenumgebung eingebracht oder eingemischt, in der sie zu verfolgen sind. Die Probenumgebung kann jede Umgebung sein, in der Bakterien vorliegen, darunter im Freien (z.B. Erde, Luft oder Wasser); auf lebenden Wirten (z.B. Pflanzen, Tieren, Insekten); auf Geräten (z.B. Herstellungs-, Bearbeitungs- oder Verpackungsgeräten); und in klinischen Proben. Der Bakteriophagenassay gemäß vorliegender Erfindung (wie zuvor beschrieben) kann dann unter Verwendung von Bakteriophagen, die für den eingebrachten Rezeptor spezifisch sind, durchgeführt werden und das Vorhandensein der markierten Bakterien kann überwacht oder quantifiziert werden.
Ein Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, daß sie ein Mittel bereitstellt, um Bakterien zu überwachen oder zu verfolgen, die in eine Probenumgebung abgegeben werden sollen, die bereits die gleiche Art von Bakterien (oder sehr ähnliche Bakterien) enthält oder die dem Einbringen der gleichen Art von Bakterien (oder stark ähnlicher Bakterien) aus einer getrennten Probe unterliegt. Die verfolgten Bakterien können dank des Vorhandenseins des zellspezifischen Rezeptors, der in die verfolgten Bakterien eingebracht worden ist, von den anderen Bakterien (d.h. Bakterien, die im wesentlichen gleich sind) unterschieden werden. So besteht die Möglichkeit, ein Assay bezüglich des Vorhandenseins freigesetzter Bakterien in Gegenwart (mit Ausnahme der Rezeptorkomponente) ansonsten identischer Bakterien ohne Kreuzreaktivität (Hintergrund) durchzuführen.
Bei einem exemplarischen Ansatz zur Überwachung von Pseudomonas wird das lamB- Gen von E.coli verwendet, von dem bekannt ist, daß es ein Rezeptor für den Coli- Phagen λ ist. Siehe G.Vries et al. (1984) "Proc.Natl.Acad.Sci." USA 81:6080-6084 und R. Ludwig (1987) ibid. 84:3334-3338. Die Expression von lamB macht die Pseudomonas-Spezies anfällig für die Befestigung des λ-Phagen und Injektion von Phagen-DNA. Ein rekombinanter λ-Phage, der ein Reporter-Gen, z.B. ein Eiskeimbildungsgen, trägt, üblicherweise unter der Steuerung eines starken Promotors, wird in einem Plasmid mit breiten Wirtsbereich konstruiert. Ein lamB-Gen wird (z.B. durch homologe Rekombination) in das Chromosom der zu untersuchenden Bakterien insertiert. Der Assay wird dann nach den Lehren gemäß vorliegender Erfindung durchgeführt.
Eine spezifische Anwendung dieses Ansatzes besteht darin, Pseudomonas-Bakterien (z.B. P.syringae), darunter Pseudomonas-Bakterien im Boden und epiphytische Pseudomonas-Bakterien zu überwachen, die in eine spezifische Umgebung oder Anordnung freigesetzt werden, z.B. Boden, ein Treibhaus oder Feld. Zumindest ein Teil der freizusetzenden Bakterien wird zuerst transformiert, um den bakteriophagenspezifischen Rezeptor zu exprimieren. Dann kann durch das Sammeln von Bakterien aus der Umgebung zu einem späteren Zeitpunkt das Vorhandensein der Bakterien in der Umgebung ermittelt werden. Der Ansatz liefert ein Mittel, um das Vorhandensein, die Migration und die Überlebensfähigkeit der Bakterien zu verfolgen.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung.

VERSUCHE

1. Assay auf männliche (F+) E.coli

INA-Transduktionsteilchen wurden wie folgt hergestellt. Das pUC118 Plasmid-M13- Bakteriophagensystem (Vieira und Messing (1987) "Meths.Enz." 153:3-11) wurde modifiziert, indem das Eiskeimbildungsgen inaY (isoliert aus dem Pseudomonas syringae Stamm PS31, der in Deininger et al. (1988), "J.Bacteriol." 170:669-675) beschrieben wird, in das Plasmid pLVC76 insertiert wird; dieses Plasmid weist auch eine M13-Bakteriophagen-pac-Stelle auf. Dann wurden Transduktionsteilchen unter Verwendung eines M13-Helferphagen mit fehlerhafter Verpackung hergestellt. Das inaY-Gen wurde von einem lac-Promotor, der vom ursprünglichen pUC118-Plasmid stammte, gesteuert und die resultierenden Transduktionsteilchen behielten die Spezifität des M13-Phagen für männliche (F+)-Stämme von E.coli.
Die Transduktionsteilchen wurden durch ein 0,2 µm-Filter geschickt (um jegliche im Präparat verbleibende INA&spplus;-Zeilen zu entfernen), und es wurde festgestellt, daß sie bis auf -12ºC frei von Eiskeimbildungsaktivität sind. Die Transformationseffizienz von E.coli MV1193 (F&spplus;) wurde unabhängig von der Eiskeimbildungsaktivität basierend auf der Aktivität eines von pLVC76 getragenen Ampicillinresistenzgens gemessen. Plattierungsassays von Zellen (100 µl; OD&sub6;&sub0;&sub0; =0,001), die den INA-Transduktionsteilchen (10µl) ausgesetzt wurden, wurden durch Inkubation bei 37ºC für 30 min, Verdünnung auf 1 ml und Plattierung von 50 µl-Aliquoten durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angeführt. TABELLE 2
Die Transduktionsteilchen erzeugen zwei Wirkungen. Zunächst verringerten sie die Lebensfähigkeit der Zellen. Eine derartige verringerte Lebensfähigkeit wurde vermutlich durch die Helferphagen verursacht, die Phagen mit fehlerhafter Packung, die zur Konstruktion der Teilchen verwendet wurden und die die Transduktionsteilchen verunreinigten. Zweitens transformierten sie einige Zellen zu Ampicillinresistenz. Fünf der ampicillinresistenten Kolonien wurden auf Eiskeime überprüft; alle getesteten Kolonien sind INA&spplus;. Wenn die Anzahl der bei niedrigen Phagenkonzentrationen in Abwesenheit von Ampicillin gewonnenen Kolonien verwendet wurde, um die Anzahl an ursprünglich vorhandenen Bakterien zu schätzen, betrug die Transformationseffizienz bei hohen Phagenkonzentrationen etwa 501º.
Proben von E.coli MV1193 wurden wie folgt getestet. Zeilen (100 µl, OD&sub6;&sub0;&sub0;=0,01) wurden mit 10 µl einer Suspension von INA-Transduktionsteilchen (10º-Verdünnung) bei 37ºC 2 lang, dann bei Raumtemperatur 1 h lang inkubiert. Die Proben wurden dann in einem Standard-Tröpfchengefrierassay, das aus 40 x 10 µl Tropfen pro Verdünnung bestand, mit Verdünnung um Dekaden von 10&supmin;¹ bis 10&supmin;&sup5; der ursprünglichen Proben konzentration, auf Eiskeimbi Idungsaktivität getestet. Die Ergebnisse des Gefrierassays sind in Tabelle 3 angeführt. TABELLE 3
¹ Tps sind Transduktionsteilchen
² Die ursprüngliche Zellkonzentration wurde unter Verwendung der Näherungsbeziehung berechnet, daß ein OD&sub6;&sub0;&sub0; von 1,0 7,0 x 10&sup8; Zeilen/ml entspricht. Die Detektionsgrenze lag bei 5 Keimen/ml.
Nach 3 Stunden wurde mit dem Test die Anzahl der Zellen in einer verdünnten Suspension mit einer Empfindlichkeit (etwa 40%) gemessen, die jener eines Ausplattierassays nahe kommt (etwa 90%). Der Ausplattierassay benötigt für E.coli etwa 15 h. Der Hintergrund lag unter der Detektionsgrenze. Daher betrug das Verhältnis Signal:Rauschen zumindest 10&sup5;. Die Daten zeigten die temperaturabhängige Empfindlichkeit, die für Eiskeimbildungsassays typisch ist, wobei der Datenpunkt bei -11ºC ein Indikator für die Gesamtanzahl an zum INA&spplus;-Phenotyp transformierten Zellen ist.
Um einen Test bezüglich der biologischen Spezifität des INA-Transduktionsphagen durchzuführen, wurde ein F-Stamm von E.coli (JE5505 ein K12-Derivat) unter Verwendung der gleichen Vorschrift, wie oben für E.coli MVI 193 beschrieben, getestet. Die versuchte Transduktion des E.coli JE5505 ließ keine detektierbaren Keime entstehen. Auf Antibiotikaempfindlichkeit oder -resistenz wurde wie folgt getestet. Der Versuch war im wesentlichen der gleiche wie der in Verbindung mit Tabelle 3 beschriebene, mit der Ausnahme, daß die Bakterien zuerst 30 min lang bei 37ºC mit Tetracyclin (10 µg/ml), Chloramphenicol (50 µg/ml) oder ohne Antibiotikum (Vergleich) inkubiert wurden. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 4 angeführt. TABELLE 4¹
¹ Die Testbedingungen waren die gleichen wie bei Tabelle 3, mit der Ausnahme, daß die Zellen vor der Zugabe der INA-Transduktionsteilchen 30 min lang bei 37ºC mit dem angegebenen Antibiotikum vorinkubiert wurden.
Der Assay maß die Anzahl der tetrazyklinresistenten Bakterien in der Probe korrekt und ermittelte korrekt, daß alle diese Bakterien chloramphenikolempfindlich waren. Somit eignet sich der Assay gemäß vorliegender Erfindung zum Screenen bezüglich Antibiotikaresistenz und -empfindlichkeit.

2. Assay bezüglich Salmonella typhimurium

Ein Niedrigfrequenztransduktionsteilchen, das Eiskeimbildungsaktivität verleihen kann, wurde durch homologe Rekombination von Plasmid pRLG61 mit dem Bakteriophagen P22 erhalten. Das Plasmid pRLG61 enthält daß Eiskeimbildungsgen inaW (isoliert aus Pseudomonas fluorescens MS1650, wie in Corotto et al. (1986) EMBO J. 5:231-236 beschrieben) unter der Transkriptionssteuerung des tac-Promotors (Bagdasarian et al. (1983) "Gene" 26:273-282). Der Replikationsursprung und ein Ampicillinresistenzgen stammen aus pBR322 (Bolivar et al. (1977) "Gene" 2:95-113), und RLG61 enthält ein 4,3 kb-Insert von P22-DNA, die aus einem HindIII-Verdau des P22-Chromosoms kloniert wurde. pRLG61 wurde in vitro konstruiert und in E.coli kloniert. Unter Verwendung eines Plasmidmobilisierungssystems wurde es dann durch Konjugation auf den Salmonella typhimurium-Stamm LT2 übertragen. Ein Eiskeimbildungsassay für den pRLG61 (LT2)-Stamm (als RGS1 bezeichnet) zeigte ein hohes Maß an Eiskeimbildungsaktivität.
INA-Transduktionsteilchen wurden durch Infizieren einer flüssigen Kultur von RGS1 mit P22-Phagen des Wildtyps bei einer Multiplizität der Infektion (m.o.i.) von 5 Plaque bildenden Einheiten (PFU) pro Zelle hergestellt. Die infizierte Kultur wurde für mehrere Stunden inkubiert, und ein Lysat, das rohe Phagen enthält, durch Behandlung der Kultur mit Chloroform (zur Lyse bakterieller Zellen), gefolgt von Zentrifugieren (zum Pelletieren von Zellresten) hergestellt. Die Phagen blieben gemeinsam mit verschiedenem zellularen Material, einschließlich noch aktiver Eiskeime, in der Überstandfraktion. Darauffolgende Zentrifugation durch einen Caesiumchlorid- Blockgradienten trennte Phagenteilchen (die aus der 3M/5M-Grenzfläche entnommen wurden) von den Eiskeimen und anderen eiweißartigen zellularen Verunreinigungen ab (Davis et al. (1980) "Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, S.80-82). Schließlich wurde die phagenhältige Fraktion dialyisiert, um das Caesiumchlorid zu entfernen, dann durch ein 0,45 µm-Filter filtriert, um das Präparat zu sterilisieren.
Aufgrund der Art ihrer Bildung war der Anteil von Transduktionsteilchen zu Wildtypphagen in einem solchen Präparat klein. Sowohl die Detektion der Eiskeimbildungsaktivität als auch die Gewinnung arzneimittelresistenter Transduktanten aus einer transfizierten Kultur (siehe unten) wiesen darauf hin, daß das Transduktionsteichenpräparat ein einziges Transduktionsereignis für jeweils etwa 1.000 normale lytische Infektionen erzeugen konnte.
Ein Präparat aus Niedrigfrequenztransduktionsteilchen (stammt aus der Infektion von RGS1 mit P22, wie oben beschrieben) wurde verwendet, um das inaW-Gen in eine Kultur von S.typhimurium LT2 zu transduzieren. Kulturen mit relativ hoher Dichte wurden verwendet, um dabei zu helfen, transduzierte Zellen vor lethaler Superinfektion durch Wildtypphagen zu schützen, die die Hauptspezies im Transduktionsteilchenpräparat sind. Außerdem wurde dem Medium nach der Phagenadsorption an die Wirtszellen Ampicillin (Ap) zugegeben, um die Rate der lytischen Infektionen mit P22 des Wildtyps weiter zu verringern (weder die Wirtszellen, noch die Wildtyp-Phagen waren gegen Ap resistent). Die Speziesspezifität der Transduktionsphagen wurde durch parallele Transfektion von E.coli Stamm AB1157 mit dem Transduktionsteilchenpräparat getestet.
Kulturen aus den späten log-Phasen (OD&sub6;&sub0;&sub0;=0,5-1,0) von S.typhimurium LT2 und E.coli AB157 wurden mit dem Transduktionsteilchenpräparat mit einem m.o.i. von etwa 0,1 PFU pro Zelle infiziert. Kulturen wurden bei 37ºC ohne Rühren inkubiert, und man ließ die Teilchen für einen Zeitraum von 20 min an die Wirtszellen adsorbieren. Vergleichsproben wurden parallel untersucht und bestanden aus steriler Brühe, die mit Transduktionsphagen "infiziert" war, sowie uninfizierten bakteriel len Kulturen. Ap wurde den infizierten Kulturen zugegeben und die Inkubation für weitere 40 min bei 37ºC unter Rühren fortgesetzt. Die Kulturen wurden dann 1 h lang bei 24ºC inkubiert, um die Expression von Eiskeimbildungsaktivität zu ermöglichen.
Dann wurden Eiskeimbildungsassays durchgeführt, wie oben in Verbindung mit Tabelle 3 für E.coli beschrieben. OD&sub6;&sub0;&sub0; der LT2- und AB1157-Kulturen wurde bei 1,0 bzw. 0,67 gemessen. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle 5 dargelegt. TABELLE 5
Die Tabelle zeigt die Eiskeimbildungsaktivität von Versuchsproben als Funktion der Temperatur. Die kumulative Eiskeimfrequenz pro ml ursprünglicher Kultur ist für bestimmte Temperaturpunkte angegeben. Die letzte Spalte (% INA&spplus; LT2) stellt die Anzahl an Eiskeimen pro ml, ausgedrückt als Prozentsatz der Zellpopulation, dar, wobei für OD&sub6;&sub0;&sub0;= 1,0 7 x 10 Zelien/ml geschätzt wurde.
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß die Expression von Eiskeimbildungsaktivität nur als Ergebnis der Infektion eines anfälligen Wirtsstammes (LT2) mit dem Transduktionsphagenpräparat auftritt. Weder die Wirtszellen noch die Phagen an sich exprimieren irgendeine detektierbare Eiskeimbildungsaktivität. Weiters hat dieser Versuch bestätigt, daß die Wirtsstammspezifität für die Teilchen nach der Transduktion des inaw-Gens beibehalten wird, da in E.coli AB1157 keine detektierbare Transduktion der Eiskeimbildungsaktivität beobachtet wurde. Als Indikator der Transduktionsfrequenz entspricht die im obigen Versuch beobachtete maximale Eiskeimfrequenz von 2,7 x 10&sup5; pro ml 1 x 10&supmin;³ Eiskeimen pro PFU des Transduktionsphagenpräparats.
Die Transduktion von Plasmid pRLG61 wurde auch durch die Gewinnung ampicillinresistente Kolonien aus der transfizierten Kultur detektiert. Nach der Infektion und ersten Inkubation, wie oben beschrieben, wurden die Zellen auf Agarmedium verteilt, das Ampicillin enthielt. Die Agaroberfäche war zuvor mit einer Schicht aus durch Hitze abgetöteten LT2 beschichtet worden, um Rezipientenzellen zu adsorbieren und so vor den lethalen Wildtypphagen im Präparat zu schützen. Nach der Inkubation über Nacht erschienen ampicillinresistente Transduktanten kolonien. Die Ergebnisse wiesen auf eine Transduktionsfrequenz für pRLG61 von 6 x 10&supmin;³ Apr-Kolonien pro PFU des Transduktionsphagenpräparats hin. Somit haben zwei getrennte Versuche ermittelt, daß die Transduktionsfrequenz dieses Systems im Bereich von 10&supmin;³ bis 10&supmin;² Transduktionsereignissen pro PFU des Transduktionsteilchen präparats liegt.
Zusammengefaßt wurden die Niedrigfrequenztransduktionsteilchen durch Transduktion des Eiskeimbildungsgens in den Phagen P22 hergestellt. Die so herstellten Teilchen wurden dann in Salmonella typhimurium-Stamm LT2 transduziert, und es wurde festgestellt, daß sie leicht detektierbare Eiskeimbildungsaktivität verleihen. Es wurde das Fehlen von Hintergrundeiskeimbildungsaktivität in experimentellen Vergleichsproben ermittelt, und bei der versuchten Transfektion eines Bakteriums, E.coli, das für P22 nicht anfällig ist, entstand keine Eiskeimbildungsaktivität.

3. Hochfrequenztransduktionssystem mit dem Phagen P22

Im folgenden wird ein Hochfrequenztransduktions-(HFT)-System beschrieben, das unter Verwendung des Phagen P22 entwickelt wurde. Dieses System ermöglichte die Hochfrequenztransduktion des inaW-Gens in anfällige Salmonella-Stämme.
Das HFT-System wurde so konstruiert, daß das transduzierte Reportergen (das inaW- Eiskeimbildungsgen aus Pseudomonas fluorescens) als permanentes Kointegrat mit einem P22-Prophagen vorlag, der in einem lysogenen Salmonella-Stamm enthalten war, der verwendet wurde, um die Hochfrequenztransduktionsteilchen/Phagen (HFTPs) herzustellen. Die Vermehrung des HFTP erzeugenden Stammes führte zu einer Kultur, in der jede Zelle (nach der Induktion des lytischen Zyklus des rekombinanten Prophagen) ein potentieller Produzent von Tps war, was zu einem hohen Anteil an Tps gegenüber nichttransduzierenden, zum Wildtyp zurückkehrenden Phagen führt.
Zwei Grundkomponenten wurden verwendet, um das HFT-System zu konstruieren: i) ein polA-Mutantenstamm von S.typhimurium (fehlerhaft bezüglich DNA Polymerase I), und ii) Plasmid pRLG68, ein mobilisierbares Plasmid, das für Eiskeimbildungsaktivität und Ampicllin(Ap)-Resistenz kodiert, mit einem Replikationsursprung vom ColE1-Typ.
Der als AA3007 bezeichnete polA-Stamm (Whitfield und Levine, (1973), "J.Bacteriol." 116:54-58) wurde spezifisch verwendet, weil er nicht fähig ist, die autonome Replikation von von ColE1 abgeleiteten Plasmiden zu unterstützen. Um seine Verwendung in darauffolgenden Manipulationen zu erleichtern, wurde zunächst ein spectinomycinresistentes (Scr) Derivat von AA3007 wie folgt ausgewählt: eine Kultur aus AA3007 wurde bei 37ºC über Nacht (ON) in 5 ml L-Brühe (LB) gezüchtet; 2 ml der ON-Kultur wurden wiederum als Inokulum für eine 200 ml L-Brühenkultur verwendet, die Scr in einer Konzentration von 100 µg/ml enthielt. Nach 24stündigem Wachstum wurden Replikatplattierungen der Kultur auf LB+Sc (Sc mit 50 µg/ml)-Platten gemacht, wobei 50 µl der 24stündigen Flüssigkultur pro Platte verwendet wurden Scr-Kolonien wurden nach 24stündigem Züchten der Platten bei 37ºC identifiziert und isoliert. Eine solche Scr-Kolonie war der Ursprung des AA3007 Scr-Stammes, der nachstehend mit RGS10 bezeichnet ist. Das. Wachstum von P22 auf RGS10 wurde bestätigt, und ein Derivat, das für P22 lysogen geworden war, mit der Bezeichnung RGS11 wurde isoliert, indem Zellen von der trüben Mitte eines auf einem RGS10-Teppich gebildeten P22- Plaques gestreift wurden.
Ein weiteres Schlüsselelement des HFT-Systems war Plasmid pRLG68, das dazu bestimmt war, die Aufnahme (über homologe Rekombination) eines hochexprimierten inaW (Eiskeimbildungs)-Gens in den P22-Prophagen von Stamm RGS11 zu erleichtern. pRLG68 wurde in zwei Schritten konstruiert. Zunächst wurde ein inaW-Klon, der auf einem Bamhl/HindIII-Restriktionsenzymfragment mit 4,6 kb erhalten wurde, in das Expressionsvektorplasmid pKK223-3 kloniert (Brosius und Holly (1984) "Proc.Natl.Acad.Sci." USA 81:6929-6983). pKK223-3 enthält das Ampicillinresistenz(Apr)-Gen, den Replikationsursprung und die "bom"-Stelle (durch die es durch bestimmte bakterielle Konjugationssysteme mobilisiert werden kann) von pBR322 (Bolivar et al. (1977) Gene 2:95-113); außerdem enthält es den starken tac- Promotor (deBoer et al. (1983) "Proc.Natl.Acad.Sci." USA 80:21-25), der so angeordnet ist, daß er fremde Gene fördert, die neben den Polylinker (Multiklonierstellen-) Bereich des Plasmids insertiert sind. Das Zwischenkonstrukt inaW/pKK223-3 wurde als pRLG66 bezeichnet. Der zweite und letzte Schritt der Konstruktion von pRLG68 umfaßte das Insertieren eines Fragments von chromosomaler P22-DNA in eine Stelle in pRLG66. Das in der physikalischen Karte von P22 als BamHI-Fragment "B" bekannte P22- Fragment mit 2,5 kb (Rutila und Jackson (1981) "Virology 113:769-775) wurde aus einem BamHI-Digest des P22-Chromosoms gereinigt und in die einzige BamHI-Stelle (unmittelbar stromaufwärts vom tac-Promotorbereich) von pRLG66 insertiert, um keine wesentlichen Plasmidfunktionen zu unterbrechen und auch die Expression von inaW nicht zu stören. Das P22-Fragment wurde aufgrund seines Mangels an Genen gewählt, die für den Basislebenszyklus von P22 wesentlich sind, da es schlußendlich der Insertionspunkt der fremden DNA im P22-Prophagen während der Konstruktion des HFTP erzeugenden Stammes ist. Das resultierende P22/pRLG66-Konstrukt wurde als pRLG68 bezeichnet.
Der bom-Bereich von pRLG68 (schlußendlich von seinem pBR322-Vorläufer abgeleitet) ermöglichte seine Mobilisation und Übertragung während der bakteriellen Konjugation, solange durch den konjugalen Donorstamm Konjugations- und Mobilisationsfunktionen in trans bereitgestellt wurden. So wurde pRLG68 in den E.coli-Stamm GJ23 transformiert, in dem es durch das R64drd11/pGJ28-System mobilisierbar war (Van Haute et al. (1983) EMBO J. 2:411-417), und von dort über Interspezies-Konjugation auf RGS11 übertragen. Da pRLG68 (aufgrund der polA-Mutation) nicht autonom im Rezipienten- RGS11-Stamm replizieren konnte, wurde angenommen, daß jeglicher AprScr- Abkömmling aus der Paarung pRLG68-Insertionen im P22-Prophagen enthält, die aus der homologen Rekombination zwischen dem P22-DNA-Bereich des Plasmids und dem homologen Bereich im Prophagen resultieren. Eine Southern-blot-Analyse einiger repräsentativer Klone (gemeinsam mit ihren AA3007- und RGS11-Vorläuferstämmen) ergab Ergebnisse, die mit der Bildung eines solchen pRLG68/P22-Kointegrats in Übereinstimmung standen. Der resultierende Stamm wurde als RGS12 bezeichnet und war der Stamm, aus dem HFTPs erzeugt wurden.
HFTPs wurden aus RGS12 durch die Behandlung der Kulturen des Stammes mit Mitomycin-C hergestellt, einem Arzneimittel, von dem bekannt ist, daß es den lytischen Zyklus in Lysogenen von P22 und anderen solchen Phagen herbeiführt (Arber et al., (1983) in Lambda II, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, S.443-445). Eine solche Induktion von RGS12 führte zur Replikation und Packung von nachfolgenden Phagenteilchen, von denen viele rekombinante HFTPs waren. Eine RGS12-Kultur wurde in L-Brühe bei 37ºC bis zur mittleren exponentiellen Phase gezüchtet (A&sub6;&sub0;&sub0;=0,40), an welchem Punkt Mitomycin-c bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben wurde. Der Kulturkolben wurde mit Folie abgedeckt, um jegliches Licht abzuhalten, das den bakteriellen photoaktiven DNA-Reparaturmechanismus stimulieren (und so möglicherweise die Induktionseffizienz beeinträchtigen) würde, und Inkubation mehrere Stunden lang wieder aufgenommen, bis die Bakterienzeen vollständig lysiert worden waren. Bakterienreste wurden aus der lysierten Kultur durch 20-minütiges Zentrifugieren mit 2.000 x g geklärt, und der Überstand wurde durch Hindurchschicken durch ein 0,45 µm-Filter sterilisiert. Außerdem wurde der RGS12-Überstand 15 min lang auf 55ºC erhitzt, da festgestellt wurde, daß dadurch übrige Eiskeimbildungsaktivität zerstört wurde (wie durch ein Standard-Tröpfchengefrier-Assay des Materials bestimmt wurde), ohne daß die HFTPs selbst negativ beeinflußt werden. Als experimenteller Vergleich wurden Phagen aus RGS11 (dem nicht-rekombinanten, lysogenen Vorfahrensstamm von RGS129 auf identische Weise erzeugt.
Einige Versuche wurden durchgeführt, um die RGS12-HFTPs zu charakterisieren. Zuerst wurden die Titer der Phagenpräparate aus den mit Mitomycin-C induzierten RGS11- und RGS12-Kulturen mit einer Probe von Phagen verglichen, die aus einem ähnlich behandelten, lysogenen nichtmutanten LT2(P22)&spplus; Stamm erzeugt wurden. (LT2 ist ein gut wachsender, nichtmutanter Vorläuferstamm von RGS11 und RGS12). Die Titer betrugen für das LT2(P22)&spplus;-, RGS11- und RGS12-Präparat 10&sup9;, 10&sup8; bzw. 10&sup7; PFU/ml. Da Phagentiter durch das Zählen von Plaques gemessen werden, die auf einem bakteriellen Teppich gebildet werden, sind nur solche Phagen bestimmbar, die eine lytische Infektion ergeben. Der relativ geringe Titer des RGS12-Präparats wies auf einen beträchtlichen Anteil an Tps hin, da die Tps meistens defekt bezüglich lytischem Wachstum sind (die heterologe DNA, die sie enthalten, würde essentielle Gene hinausdrängen). Dies wurde durch die elektrophoretische Analyse von Restriktionsverdauen von gereinigten RGS11- und RGS12-Phagen-DNAs bestätigt, die das Vorhandensein zusätzlicher Restriktionsfragmente in der RGS12-Phagen-DNA zeigt. Die Größen der zusätzlichen Fragmente entsprachen den für das pRLG68/P22-Prophagen- Kointegrat vorhergesagten; darüberhinaus zeigten ihre relativen Intensitäten, daß die meisten der Phagenteilchen die zusätzliche DNA enthielten.
Bei der folgenden Arbeit wurde das Präparat aus RGS12 HFTPs, wie oben beschrieben hergestellt, verwendet. Die Detektion bakterieller Zellen durch die Transduktion von Eiskeimbildungsaktivität (INA) unter Verwendung von RGS12-HFTPs wird nachstehend als "Transduktionsassay" bezeichnet. Das Transduktionsassayverfahren umfaßte die Infektion von Bakterien enthaltenden Proben mit HFTPS und darauffolgend die Bestimmung der in den Proben exprimierten Eiskeimbildungsaktivität (INA). Anfangsversuche wurden durchgeführt, um die Detektion von Bakterien unter Verwendung des HFTP- Systems zu charakterisieren und zu optimieren. Schließlich wurden Versuche durchgeführt, um den Assay von Bakterien in echten Nahrungsmittelproben zu simulieren, wie das nachstehend beschriebene Beispiel.
Der folgende Versuch wurde durchgeführt, um die Detektion von in einem Gesamteigemisch vorhandenen Salmonella zu demonstrieren. Eine Kultur aus S.typhimurium Stamm LT2 wurde in L-Brühe bei 37ºC bis zu einer optischen Dichte (A&sub6;&sub0;&sub0;) von 0,35 gezüchtet. Die Kultur wurde dann in einer Abfolge von 10-fachen Zunahmen in rohes vermischtes Ei (d.h. mit homogenisiertem Dotter und Eiweiß) verdünnt; die Verdünnungsreihe in Ei erstreckte sich bis 10&supmin;&sup5; bezogen auf die ursprüngliche (A&sub6;&sub0;&sub0;=9,35) Kultur. Bakterien wurden durch Transduktion unter Verwendung von RGS12-HFTPs wie folgt untersucht: 40 µl-Proben einer jeden der bakteriellen 10&supmin;² bis 10&supmin;&sup5;-Verdünnungen in Ei wurden zu 360 µl steriler L-Brühe zugegeben, was eine 10-fache Verdünnung der ursprünglichen Proben darstellte. Außerdem wurden Vergleichsproben des unbeimpften Eigemisches auf ähnliche Weise hergestellt (1:10 in LB verdünnt). jeder Probe wurden 100 µl RGS12 HFTP-Präparat (das ingesamt 2x10&sup6; pfu enthielt) zugegeben, mit Ausnahme einer der unbeimpften Eivergeiche, der anstelle dessen eine äquivalente Menge steriler L-Brühe erhielt. Die Proben wurden dann 1 h lang bei 37ºC inkubiert, gefolgt von 1 h bei 23ºC, um die Expression von transduzierter INA zuzulassen. Die INA transduzierter Proben wurden dann durch einen Tröpfchen-Gefrierassay wie folgt gemessen. Jeder transduzierten Probe wurde 1/100 Volumen eines Fluoreszenzfarbstoffgemisches (100 mM Carboxyfluorescein, 100 mM Tris-HCl, pH 7,0) zugegeben, was bei der Detektion von Gefrierereignissen während des Assays hilft (die Farbstofffarbe ändert sich beim Gefrieren von fluoreszierend gelb auf mattrot). Verdünnungen einer jeden Probe erfolgten dann in Zehnerschritten von 10&supmin;¹ auf 10&supmin;&sup5;) in den gleichen Carboxyfluoresceinpuffer (mit 1 mM Konzentration in allen Verdünnungen). 20x10µl-Tröpfchen einer jeden Verdünnung (10º bis 10&supmin;&sup5;) der ursprünglichen Assayproben (die selbst transduzierte Verdünnungen der ursprünglichen bakteriellen Kultur waren) wurden dann auf mit Paraffin beschichtete Folie gegeben, die auf der Oberfläche eines Abschreckbades mit geregelter Temperatur schwamm. Das Gefrieren von Tröpfchen wurde dann überwacht, während die Temperatur des Bades über einen Zeitraum von 80 min von -2,0ºC auf -12,0ºC gesenkt wurde. Die rohen Daten für gefrorene Tröpfchen wurden dann verwendet, um die Eiskeimfrequenz in den ursprünglichen Proben zu berechnen (Vali (1971) "J.Atmos.Sci." 28:402-409). In ihrer Endform sind die Daten als Temperaturspektrum de kumulativen INA ausgedrückt, d.h. als Anzahl an Eikeimen pro ml in einem Bereich von Temperaturpunkten. Die Ergebnisse des obigen Versuchs sind in Tabelle 5 angeführt. TABELLE 5¹
¹ Die obigen Daten zeigen die Ergebnisse von an transduzierten Proben durchgeführten INA-Assays. Bakterien/ml wurde aus dem A&sub6;&sub0;&sub0; der ursprünglichen Kultur (gemäß der Gleichung A&sub6;&sub0;&sub0;=0,7=5x10&sup8; Zellen/ml) geschätzt, wobei die 1:10-Verdünnung der Bakterien/Ei-Gemische in LB, um die Proben zur Transduktion vorzubereiten, berücksichtigt wurde.
Wie in Tabelle 5 gezeigt, ermöglichte die Transduktion von INA unter Verwendung des HFT-Systems die Detektion von LT2-Zeiien in allen Proben, in denen sie vorhanden waren, auch bei einer Konzentration von nicht mehr als 250 Zellen/ml (nach Verdünnung in LB vor der Zugabe von HFTPs). Äus den unbeimpften Eiproben ist auch das Fehlen von Hintergrundaktivität offensichtlich, wenn keine Bakterien vorhanden sind. Die bei solchen Versuchen beobachtete INA war dadurch von stark ereigniszählender Art, als einzelne INA&spplus;-Zeilen detektiert wurden. Eine Vereinfachung davon besteht darin, daß, da eine Vielzahl von Zellen in einer Probe zum INA&spplus;-Phenotyp transduziert wird, die INA-Frequenz der Probe das Schätzen der bakteriellen Zelldichte zuließ. Somit stand die Messung von INA bei -12ºC (bei welcher Temperatur die Detektion von INA am empfindlichsten ist) in starker Korrelation mit der Population von LT2-Zellen in der Probe.
Zusammenfassend wurde ein Hochfrequenztransduktionssysem im Phagen P22 entwickelt, in dem die Transduktion eines tac-promoteten inaW-Gens durch die Herstellung von Transduktionsteilchen aus einem Salmonella-Stamm, der ein Eiskeimbildungsgen in einem P22-Prophagen enthielt, maximiert wurde. Nach der Verifizierung seiner Struktur durch DNA-Analysetechniken wurde das HFT-System in einem Transduktionsassay verwendet, um LT2-Zellen zu detektieren, die in Proben aus unbeimpftem rohem Ei vorhanden waren. Der Transduktionsassay zeigte sehr hohe Empfindlichkeit bei der Detektion dünner Bakterienpopulationen ohne Hintergrundsignal und zeigte, daß das Assay verwendet werden konnte, um die Anzahl vorhandener bakterieller Zellen zu schätzen.

4. Transduktion in durch Hitze inaktivierten Zeilen

Dieses Beispiel beschreibt eine Versuchsreihe, die dazu bestimmt ist, die Reaktion inaktivierter Bakterien auf die Phagentransduktion zu testen und zu ermitteln, wie viel Erholungszeit notwendig sein kann, bevor derartige Bakterien nach dem Verfahren detektierbar werden.
Zellschäden wurden in Kulturen von Salmonella typhimurium LT2 herbeigeführt, indem sie schädigend hoher Temperatur ausgesetzt wurden, während in diesem Zeitraum Aliqote zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten entfernt und auf L-Agar (ein vollständiges, nichtselektives Medium) und SS-Agar (ein stark selektives Medium, das bei der Isolation von Salmonella und Shigella verwendet wird) ausplattiert. Nach der Inkubation über Nacht wurde die relative Anzahl der Kolonien, die auf L- und SS-Agars für jedes hitzebehandelte Aliquot wuchsen, verwendet, um das Ausmaß des durch die Hitzebehandlung verursachten Schadens zu ermessen. Der nachstehende Versuch beschreibt die Ergebnisse der Transduktion hitzebehandelter Zellen unter Verwendung des im vorherigen Beispiels beschriebenen Hochfrequenztransduktions(HFT)-Systems (Beispiel 3).
Im folgenden Versuch wurde eine verdünnte LT2-Kultur durch Eintauchen in ein Wasserbad einer Temperatur von 55ºC ausgesetzt. Probenaliquote wurden aus der Kultur zum Zeitpunkt 0 (d.h. unmittelbar vor dem Eintauchen in das Wasserbad) und zu den Zeitpunkten 60, 90, 120 und 150 s nach dem Eintauchen entfernt. Verdünnungen der Aliquoten wurden sofort auf L- und SS-Agar ausplattiert, um eine Beurteilung des gesamten den Bakterien zugefügten Schadens zu ermöglichen. jedes Aliquot wurde dann unterteilt, um zwei identische Sätze hitzebehandelter Aliquote herzustellen. Ein Satz wurde unter Verwendung von RGS12-Transduktionsphagen unter Einsatz eines Verfahrens transduziert (wie in Beispiel 3 beschrieben), das ingesamt 2 h Inkubation umfaßte: 1 h bei 37ºC, gefolgt von 1 h bei 23ºC. Der andere Aliquotensatz wurde nicht transduziert, sondern wurde während des Transduktionsverfahrens parallel mit der Transduktion als Vergleich für die Gewinnung der durch Hitze inaktivierten Zellen inkubiert (diese Beobachtung wäre bei den phageninfizierten Aliquoten unklar). Verdünnungen der untransduzierten Vergleichsaliquoten wurden dann am Ende der Transduktionsinkubationen auf L- und SS-Agar ausplattiert, während Assays durchgeführt wurden, um die durch die transduzierten Probenaliquoten exprimierte INA zu messen. Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 6 angeführt.

TABELLE 6

¹ Vergleich von Plattenzähungen und INA der Probenaliquote, die aus dem Hitzeinaktivierungsversuch stammen. Kolonienzählungen an einzelnen Platten sind in koloniebildende Einheiten (cfu) pro ml wie für die unverdünnte Kultur umgeformt worden, damit sie direkt mit INA-Daten vergleichbar sind. "DL" weist darauf hin, wo die Kolonienzählungen unter die Detektionsgrenze fiel (d.h. bei den plattierten Verdünnungen wurden keine Kolonien detektiert); DL für die Plattierungen dieses Versuchs betrug 1x10³ cfu/ml. Werte für "%" inaktiviert" wurden als 100-% (cfu auf SS/cfu auf L) angenommen; wenn auf SS-Platten keine Kolonien beobachtet worden waren, wurde in der Berechnung der höchste Wert unter der Detektionsgrenze für die Plattierungen ersetzt.
Eine offensichtliche Wirkung der Hitzebehandlung bestand im tatsächlichen Abtöten von Zellen, was die Population lebensfähiger Zellen bis zum Ende des Zeitverlaufs um 95% verringerte. Ebenfalls offensichtlich war der steigende Anteil an inaktivierten Zellen unter zu späteren Zeitpunkten entnommenen Überlebenden; d.h. progressiv konnten weniger der auf LB plattierbaren Zellen auf 55-Agar wachsen. Wie in Tabelle 6 zu sehen ist, enthielten nach 90 s entfernte Aliquote größtenteils oder vollständig inaktivierte Zellen. Insbesondere in diesen späteren Proben blieben die Wirkungen der Hitzebehandlung bis zum Ende des Transduktionsverfahrens bestehen; ein Teilen der Kulturen war nicht möglich, und sie erlitten offensichtlich in den 120 s- und 150 s- Aliquoten während der folgenden 2 Stunden zusätzliche Mortatät. Es gab jedoch trotz des Fehlens von Wachstum in den stark beschädigten Aliquoten einen gewissen Grad an Erholung aus dem inaktivierten Zustand während des Zeitraums, den es dauerte, die Transduktionsassays durchzuführen. Der Erholungsgrad war bei stärker beschädigten Proben geringer, bei denen eine Vielzahl von ursprünglich inaktivierten Zellen bis zum Ende des Verfahrens in diesem Zustand verblieb.
Die in Tabelle 6 angeführten Ergebnisse weisen darauf hin, daß die Frequenz der in transduzierten Proben exprimierten Eiskeime in engem Zusammenhang mit den jeweiligen Populationen lebensfähiger Bakterien (d.h. Zellen, die die Hitzebehandlung entweder im inaktiverten oder im nichtinaktivierten Zustand überlebten) stand; das galt auch dann, wenn die anfängliche Population vollständig aus inaktivierten Zellen bestand. Ein wichtiger Zusatz dazu besteht darin, daß Zellen, die durch die Hitzebehandlung abgetötet worden waren, für den Assay unsichtbar waren. Kurz gesagt, die Reaktion der durch Hitze inaktivierten Bakterien auf die Detektion durch Transduktion war im wesentlichen die gleiche wie bei gesunden Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Phagentransduktionsassay durchgeführt werden kann, ohne daß ein Erholungszeitraum notwendig ist, um die Detektion inaktivierter Zellen zu gewährleisten.
Zusammengefaßt wurde Zellschaden bei Kulturen von S.typhimurium Stamm L12 herbeigeführt, indem sie unterschiedlich lange Zeitspannen einer Temperatur von 55ºC ausgesetzt wurden. Dann wurden Plattierungen der hitzebeschädigten Proben auf LB- Agar und SS-Agar durchgeführt; der Unterschied in der Anzahl bakterieller Kolonien, die auf den beiden Medien wuchsen, wurde als Maß für den Schaden an der bakteriellen Kultur verwendet. Dann wurden an solchen durch Hitze inaktivierten Bakterien unter Verwendung des RGS12-H FTP-Systems Transduktionsassays durchgeführt. Die Ergebnisse der Assays wiesen darauf hin, daß inaktivierte Bakterien mit gleicher Effizienz wie gesunde Bakterien detektiert wurden, und daß Bakterien, die durch die Behandlung abgetötet worden waren, für die Detektion durch das Assay unsichtbar wurden.

5. Wirtsbereichspezifität eines P22-Transduktionsphagen

Die folgenden Versuche wurden durchgeführt, um die Reaktion eines von P22 stammenden Transduktionssystems beim Assay einer Anzahl verschiedener Salmonella- Serotypen von verschiedenen Serogruppen zu testen. Das in Beispiel 3 beschriebene "Hochfrequenztransduktion"(HFT)-System wurde in den folgenden Versuchen verwendet. Hochfrequenztransduktionsteilchen/phagen (HFTPs) tragen ein hochexprimierendes Gen (tac-promotetes inaW), das für Eiskeimbildungsaktivität (INA) kodiert, und ermöglichen, wie in Beispiel 3 gezeigt, die empfindliche Detektion von S.typhimurium-Zellen vom Stamm LT2. Die folgende Versuchsreihe zeigte, daß von P22 stammende Tps dem bekannten Wirtsbereich von P22 entsprachen (da die biologische Spezifität des Transduktionsassays eines seiner Schlüsselmerkmale ist), daß verschiedene anfällige Bakterienstämme mit gleicher Effizienz transduzierbar/detektierbar waren und daß das Vorhandensein von nicht für P22 anfälligen Bakterien in den Assayproben die Detektion anfälliger Bakterien nicht störte. Die Ergebnisse aus zwei Vesuchen sind nachstehend angeführt: eines untersuchte die Transduktion in Bakterienreinkulturen, während der andere die Transduktion in Mischkulturen untersuchte.

A. Reinkulturen

Mehrere Salmonella-Stämme, die 9 verschiedene Serotypen umfaßten, die zu den Serogruppen B, D, C&sub1;, C&sub2; und G&sub2; des Klassifikationsschemas von Kauffmann-White für den Genus Salmonella gehören (Kauffmann (1978) "Das Fundament", Munksgaard, Kopenhagen) wurden von Dr. B. Stocker bereitgestellt. Das bekannte Vorhandensein oder Fehlen des P22-Rezeptormoleküls in den Außenmembranen der verschiedenen Stämme ermöglichte es, sie als P22-empfindlich (P22s) oder P22-resistent (P22r) zu klassifizieren; so sind Stämme, die zu den Serogruppen B und D gehören, P22s, während jene, die zu den Serogruppen C&sub1;, C&sub2; und G&sub2; gehören, P22r sind. Transduktionsassays wurden an Reinkulturen eines jeden Bakteriums durchgeführt, um zu bestätigen, daß die Transduktion nur bei bekannten P22s-Stämmen auftritt. S.typhimurium-Stamm LT2 (P22s) war im Panel als Kontrolle enthalten, da sein Verhalten bei der Transduktion durch das HFT-System zuvor ermittelt worden war (siehe Beispiel 3).
Reinkulturen eines jeden Stammes wurden in L-Brühe bei 37ºC bis zur mittleren exponentiellen Phase gezüchtet (A&sub6;&sub0;&sub0; lag im Bereich von 0,28 bis 0,67); dann wurden Reihenverdünnungen einer jeden Kultur (unter Verwendung von sterilem LB als Verdünnungsmittel) in Zehnerschritten bis hinunter zu 10&supmin;&sup7; bezogen auf die ursprüngliche Kultur hergestellt. Transduktion unter Verwendung von RGS12 (hergestellt, wie in Beispiel 3) HFTPs wurde dann nach dem in Beispiel 3 dargelegten Verfahren durchgeführt. Kleine Aliquote einer jeden Kulturverdünnung (0,1 ml) wurden hergestellt, von denen jedes 25 µl HFTP-Präparat erhielt, das ingesamt 2 x 10&sup6; pfu enthielt. Die Proben wurden 1 h lang bei 37ºC inkubiert, gefolgt von 1 h bei 23ºC. Nach der Inkubation wurde eine kleine Menge (1 µl) eines konzentrierten Fluoreszenzfarbstoffes (der verwendet wurde, um die Detektion von Gefrierereignissen während des darauffolgenden INA-Assays zu erleichtern) einer jeden transduzierten Kulturverdünnung hinzugefügt, wie in Beispiel 3 beschrieben. Drei idente 10 µl- Tröpfchen einer jeden transduzierten Verdünnung wurden dann in getrennte Näpfe einer 96 Napf-Mikrotiterplatte angeordnet. Die Mikrotiterplatte wurde dann auf einem der Form angepaßten Abschreckungsblöck angeordnet, der auf -10,0ºC äquilibriert war. Nach 10-15 min wurde die Anzahl der gefrorenen Tropfen gezählt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 7 gezeigt. TABELLE 7
¹ Jede der 10&supmin;¹- bis 10&supmin;&sup7;-Verdünnungen von Salmonella-Stämmen wurde nach der Transduktion mit HFTPs auf INA untersucht. INA wurde bei einer konstanten Temperatur von -10,0ºC gemessen. Die angeführten Daten sind die Anzahl an Tropfen einer jeden Probenverdünnung, die aus insgesamt 3 identen Tropfen pro Probenverdünnung froren. Die Serogruppe eines jeden Stammes ist in Klammern neben dem Stammnamen angeführt; Sternchen bezeichnen Stämme, die P22r sind, die übrigen sind P22s.
Die in Tabelle 7 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß die Transduktion von INA nur bei den P22s-Stämmen auftrat und daß weiters die anfälligen Bakterien in jedem Fall mit gleich hoher Empfindlichkeit detektiert wurden. Bei den P22r-Stämmen wurde kein INA- Hintergrund detektiert. Ausgehend von den A&sub6;&sub0;&sub0;-Messungen der ursprünglichen (unverdünnten) log-Phasen-Kulturen waren die Zellpopulationen der entsprechenden 10&supmin;&sup7;- Verdünnungen (und somit die minimabe Detektionsgrenze in diesem Versuch) geringer als 100 Zellen/ml. Dieser Empfindlichkeitsgrad stimmte mit dem zuvor mit Stamm LT2 allein beobachteten überein (siehe Beispiel 3). Dieser Versuch zeigte somit, daß P22- vermittelte Transduktion dem bekannten Wirtsbereich des Phagen entsprach und daß eine Vielzahl von P22s-Stämmen mit gleicher und hoher Effizienz transduziert werden kann.

B. Mischkulturen

Ein weiterer Aspekt der Spezifität des Transduktionsassays ist die Wirkung, die "Nicht- Ziei"-Bakterien (d.h. verschiedenste Bakterien, von denen nicht erwartet wird, daß sie vom Transduktionsassay detektiert werden) auf die Detektion von P22s-bakterien durch Phagentransduktion haben können. Der folgende Versuch wurde durchgeführt, um die Transduktion in einer solchen Anordnung zu untersuchen.
RGS12 HFTPs wurden in diesem Versuch ähnlich dem Verfahren von Teil A dieses Beispiels verwendet, wenn nachstehend nicht anders angeführt. Nur ein P22s-Stamm, S.dublin, wurde verwendet, und die Proben wurden so hergestellt, daß S.dublin dem Assay unterzogen wurden, während es sich in Gegenwart eines P22r-Bakteriums befand. Die P22r-Bakterien waren: E.coli Stamm JC10291 (Willis et al. (1981) "Mol.Gen.Genet." 183 479-504), B.subtilis Stamm BR151 (ATCC Nr.33677) und S.havana (ein natürlicher P22r-Stamm von Salmonella) - siehe Teil A dieses Beispiels. Jeder Stamm wurde in L- Brühe bei 37ºC bis zu mittleren exponentiellen Phase gezüchtet, und dann wurden A&sub6;&sub0;&sub0;-Messungen durchgeführt. Die Kulturen wurden dann (durch Verdünnung in frischer L-Brühe) auf die gleiche Dichte (A&sub6;&sub0;&sub0;= 0,36) eingestellt.
Vergleichstransduktionen einzelner Stämme wurden durchgeführt, um den Hintergrund (falls vorhanden) der P22r-Bakterien zu überprüfen und um die Reaktion des Assays mit einer Reinkultur von S.dublin zu messen. Die S.dublin-Proben wurden hergestellt, indem die ursprüngliche (A&sub6;&sub0;&sub0;=0,36)-Kultur in Zehnerschritten bis hinunter auf 10&supmin;&sup9; verdünnt wurde; nur die 10&supmin;² bis 10&supmin;&sup9;-Verdünnungen wurden im Assay verwendet. Vier solche Verdünnungsreihen wurden hergestellt: in einer wurde steriles LB als Verdünnungsmittel verwendet; in den anderen drei wurde eine von jeder der unverdünnten (A&sub6;&sub0;&sub0; - 0,36) Kulturen von P22r-Bakterien als Verdünnungsmittel verwendet. Mit anderen Worten, jede solche Probenreihe bestand aus 8 Verdünnungen, in denen die Konzentration von S.dublin im Bereich von 10&supmin;² bis 10&supmin;&sup9; (bezogen auf die ursprüngliche Kultur) lag. Da eine der anderen unverdünnten Kulturen als Verdünnungsmittel für die S.dublin-Verdünnungsreihe verwendet wurde, war das andere Bakterium in unverdünnte Stärke in jeder der S.dublin-Verdünnungen vorhanden. So war jedes P22r-Bakterium in einem Überschußbereich vorhanden: von 10²-fach (in 10&supmin;² S.dublin-Verdünnungen) bis 10&sup9;-fach (in den 10&supmin;&sup9; S.dublin- Verdünnungen).
Jede Probe/Verdünnung enthielt 0,1 ml Gesamtvolumen, und jede wurde einzeln durch die Zugabe von 25 µl RGS12 TPs (die 3 x 10&sup6; pfu enthielten) transduziert. Um die große Anzahl einzelner Proben unterzubringen, wurde das Verfahren in einer sterilen 96-Napf- Mikrotiterplatte mit Deckel durchgeführt. Inkubationen erfolgten 1 h lang bei 37ºC, gefolgt von 1 h bei 23ºC. Nach den Inkubationen wurde eine kleine Menge (1 µl) eines fluoreszierenden Farbstoffkonzentrats jeder Probe zugegeben, um die Detektion von Gefrierereignissen während der darauffolgenden INA-Assays zu unterstützen, wie in Beispiel 3 beschrieben. Vier idente 10 µl-Tropfen einer jeden Probe wurden dann in getrennten Näpfen einer 96-Napf-Mikrotiterplatte aus flexiblem Kunststoff angeordnet, die auf einen der Form angepaßten Abschreckblock gestellt wurde, der auf -10,0ºC äquilibriert wurde. Nach 10-15 min wurden die gefrorenen Tropfen gezählt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 8 gezeigt. TABELLE 8
¹ Jede Verdünnung einer jeden Probe wurde nach der Transduktion mit HFTPs auf NA untersucht. INA wurde bei einer konstanten Temperatur von -10,0ºC gemessen. Die Zahlen in der Tabelle geben die Zahl an Tröpfchen a, die für jede Verdünnung der Probenreihe gefror (aus ingesamt 4 Tropfen pro Probenverdünnung). Die Zahlen in den Spaltenüberschriften geben den Verdünnungsfaktor der S.dublin-Kultur in unverdünnte Kulturen der anderen Bakterien an (außer wo S. dublin allein untersucht wurde).
Die in Tabelle 8 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß das Vorhandensein anderer, nämlich P22r-Bakterien in den Assayproben offensichtlich keine Wirkung auf die Detektion des Zielstammes hatte. Beim Assay wurde keine Hintergrundaktivität, weder in den nicht transduzierten Bakterien, noch in den "transduzierten" (d.h. TPs ausgesetzten) P22r Bakterien, detektiert. Mit anderen Worten, die P22r-Bakterien waren für den Assay unsichtbar und übten, wenn sie bei einem P22s-Bakterium vorhanden waren, keine wesentliche Wirkung auf die Detektion des Bakteriums aus. Weil die oben in Teil A dieses Beispiels (unter Verwendung von Reinkulturen) beschriebenen Ergebnisse die untere Detektionsgrenze des Assays nicht erreichte (d.h. die höchsten Verdünnungen immer noch gefroren), wurde die Verdünnungsreihe im vorliegenden Versuch auf 10&supmin;&sup9; ausgedehnt und so versucht, unter die Detektionsgrenze zu gelangen. Da die ursprünglichen Kulturen (nach einer Schätzung der bakteriellen Population auf Basis von A&sub6;&sub0;&sub0;) im Bereich von 10&sup8; bis 10&sup9; Zeilen enthielten, wurden in den 10&supmin;&sup9;- Verdünnungen, wenn überhaupt, nur wenige Zellen erwartet. Somit zeigen diese Ergebnisse, daß auch in Gegenwart einer großen Anzahl von Nichtzieibakterien die Detektionsgrenze dieses Assays sich bis in die Nähe der theoretischen Grenze eines jeden bakteriellen Assays erstreckte: den Punkt, wo keine Zellen vorhanden sind.
Als Zusammenfassung der obigen Ergebnisse wurde die Reaktion eines P22/inaW- Transduktionssystems gegenüber mehreren Bakterien getestet, die sowohl P22-empfindliche als auch P22-resistente Stämme darstellten. Die Reaktion des Assays wurde bezogen auf seine vorausgesagte Spezifität (nach dem bekannten Vorhandensein/Fehlen von P22-Rezeptoren in einzelnen Stämmen), seine Empfindlichkeit bei der Detektion anfälliger Stämme und seine Widerstandsfähigkeit gegenüber Störungen aufgrund des Vorhandenseins großer Zahlen nichtanfälliger Bakterien beurteilt. Der Assay erwies sich als streng spezifisch: bei bekannten P22r-Stämmen zeigte sich keine Aktivität. Darüberhinaus war die Empfindlichkeit des Assays bei allen P22s-Stämmen, die untersucht wurden, gleich hoch; in jedem Fall arbeitete der Assay auf seinem optimalen Niveau, wie in vorhergehenden Versuchen unter Verwendung von Stamm LT2 allein ermittelt. Schließlich wurde gezeigt, daß die Empfindlichkeit des Assays durch das Vorhandensein einer großen Zahl von P22r-Bakterien nicht beeinflußt wurde; der Assay arbeitete dennoch auf seinem optimalen Niveau.

Claims

1. Verfahren zum spezifischen Detektieren von Zielbakterien in einer Probe, wobei das Verfahren umfaßt:

das Aussetzen der Probe einem für die Zielbakterien spezifischen Transduktionsteilchen, worin die Probe zuvor Bedingungen ausgesetzt worden ist, durch die die Bakterien abgetötet oder geschwächt werden sollen, wobei das Teilchen den Bakterien den detektierbaren Phenotyp der Eiskeimbildungsaktivität verleihen kann; und

das Detektieren des Vorhandenseins inaktivierter und nicht-inaktivierter Bakterien in der Probe, die die Bedingungen überleben, denen sie ausgesetzt worden sind, und die Eiskeimbildungsaktivität besitzen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe einer Vielzahl von Transduktionsteilchen mit verschiedenen Wirtsbereichspezifitäten ausgesetzt wird, wobei der Bakterien-Typ auf der Basis des Musters des nachweisbaren Phenotyps, der durch die Vielzahl von Teilchen verliehen wird, ermittelt werden kann

3. Verfahren nach Anspruch 1 der 2, worin die Probe:

in einem Wachstumsmedium in Gegenwart der Transduktionsteilchen unter Bedingungen, die die Anheftung der Teilchen an die Bakterien fördern, inkubiert wird; und

daraufhin unter Bedingungen, die die Entwicklung des Eiskeimbildungsphenotyps fördern, inkubiert wird.

4. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Eiskeimbildungsphenotyp durch Inkubieren der Probe unter Bedingungen, die die Bildung von Eis auf Zielbakterien fördern, die den Eiskeimbildungsphenotyp zeigen, detektiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Probe zuerst bei einer Temperatur im Bereich von etwa 35ºC bis 40ºC ohne Rühren für einen Zeitraum von etwa 15 bis 120 min inkubiert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die Probe daraufhin bei einer Temperatur im Bereich von 20ºC bis 25ºC für einen Zeitraum von etwa 30 min bis 2 h inkubiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 3, das weiters das Aussetzen der Probe einem immobilisierten Antikörper, der für die Zielbakterien spezifisch ist, und das Abtrennen der an den immobilisierten Antikörper gebundenen Zielbakterien vor dem Inkubieren der Probe umfaßt.

8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Probe eine Nahrungsmittelprobe ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Bedingungen, denen die Nahrungsmittelprobe vor dem Einwirken des Transduktionsteilchens ausgesetzt ist, umfassen: Behandlung mit Hitze; Behandlung mit Kälte; oder Trocknung.

10. Verfahren zum spezifischen Detektieren von Ziel bakterien, wobei das Verfahren umfaßt:

das Transformieren der Zielbakterien, um einen vorgewählten Zelberflächenrezeptor zu exprimieren;

das Einbringen der transformierten Zielbakterien in eine Umgebung;

das Entnehmen von Bakterien aus der Umgebung;

das Aussetzen der entnommenen Bakterien einem Transduktionsteilchen, das für den Oberflächenrezeptor spezifisch ist, wobei das Teilchen den Bakterien den detektierbaren Phenotyp der Eiskeimbildungsaktivität verleihen kann; und

das Detektieren des Vorhandenseins von Eiskeimbildungsaktivität aufweisenden Bakterien unter den entnommenen Bakterien.