JPH04502253A - 植物染色体中のdna配列を同定する方法 - Google Patents
植物染色体中のdna配列を同定する方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
植物染色体中のDNA配列を同定する方法本発明は、植物の核ゲノム中のDNA
配列を同定する方法に関し、かつこの方法を使用して、植物育種の方法に関する
ものである。
植物のゲノム中に他の源からDNA配列を取込むことがしばしば望まれる。従来
の植物育種技術は、望ましい性質(例えば、病気抵抗性、タンパク質特性)を、
得られる植物品種中にコード付けする遺伝子を導入する為に、同じ種の異なる株
、又は異なる種の異なる株さえも交雑させてきた。伝統的方法は、供与体種又は
品種と受容体種又は品種の間の多数のランダム雑種を栽培し、かつ継続繁殖と同
系繁殖に対して望ましい性質を有した雑種を選択することに頼っていた。この方
法は時間の掛かる方法である。遺伝子の伝達は、一つの植物から他の植物へ全染
色体を伝達し、次いで数世代の選別、時には戻し交雑を伴って行われる。この期
間の間、染色体間の組換えが起こるであろう。多くの品種において、唯少数の染
色体セグメントのみが、供与体種から標的植物中へ伝達される。
今や、DNA配列が、この配列を有する植物における一定の特性の原因となるこ
とを決定することは、しばしば可能である。分子生物学における最近の進歩は、
新しい品種中にDNAセグメントの直接挿入を可能とする。総ての場合において
、植物の圃場試験にのみ頼ること無しに、ゲノム中に異質のDNAの取込みをめ
る技術を有することは有用である。
一般に、以前は、標的植物において重要な遺伝子を有する、取込まれた異質のD
NAをめかつ同定していた方法は、高価でかつ解明することが困難であった。従
って、DNA配列の転移は、植物の形態学により、染色体自体の形態学により、
染色体バンディングにより、イソ酵素の存在の決定により、又はRFLP(制限
断片長さ冬型性現象)により同定される。他の方法は、Nラビタン等(N La
pitan)[ジャーナルへレディテ4 (J Heredity)第77巻、
第4’15−419頁、1986年]に開示される様に、原位置でクローン化D
N人配列を有する雑種植物細胞中の染色体を雑種形成化することである。クロー
ンを使用することにより、プローブDNA配列は、総て同一であるだろう。クロ
ーン化配列は、標的植物におけるDNAの源の一つの特性である様に選択される
。然し乍ら、クローンは、単離することが困難であり、かつ一般に応用されない
ようである。
1988年のトロントにおける第XVI回国際遺伝子会議に関して出版された抄
録において、しくLe)等により、全ゲノムDNAは、ライムギ起源の染色体又
は大染色体セグメントを、ライムギーコムギ雑種におけるコムギと、ライムギ交
換を有するコムギ品種とから区別するのに使用されたことを開示している。この
方法は、染色体の単一鎖変形を生成し、次いでこれらをライムギ親から単離した
標識付は単一鎖DNAと接触させることに頼っている。ライムギから誘導される
雑種の単一鎖染色体は、ライムギ源からの標識付は相補的DNAに、優先的に結
合するだろう。
し等(前記引用文中)により開示された方法は、供与体と受容体種が大きく異な
る植物における−例えば、異なる属の植物からの親の間の雑種における全染色体
又は大染色体セグメントの起源を同定するだろう。然し乍ら、植物育種において
、短いDNA配列(典型的には敵方のベース対)を、同類源から標的植物の核ゲ
ノム中へ導入することが、しばしば望まれる。例えば、一つの市販コムギ品種に
おける眼状斑点病に対する抵抗性は、エギロブス属ベントリコサ(Aegilo
psventricosa)の野生二倍体のコムギ種からのDNA配列により付
与される。この様な改良植物を生成するに際して、有性雑種形成によるか又はよ
り直接的な実験室手技によるかのいずれであろうと、異質源からのDNAの配列
が一定の植物に存在するかどうか決定する必要がある。このことは、植物育種家
が、DlfA配列が転移されたかどうか確かめることを可能とし、かつDNA配
列が染色体の長さ又は位置において変化しつつあるかどうか確かめる為に、かつ
減数***においてDNA配列の対合挙動を検査する為に、幾世代を通してのDN
A配列をめることを可能とする。し等(前記引用文中)により記載された技術が
、DNAが2つの近親源から誘導される植物の核ゲノムに応用されるならば、一
つの源からの全mW付はゲノム性単一鎖プローブDNAは、同じ源からの単−鎮
咳DNAでのみならず近相同の為に他の源からの配列でも雑種化されるだろう(
取込んで二重fi DNAを形成する)。
従って、近親である2つ以上の源からのDlfA配列を含む、標的植物の核ゲノ
ム中の一定の源からのDNA配列を同定する筒車な方法を見いだす必要がある。
更に、雑種と広範囲の種を含む異質Dlf人配列配列する植物とを包含する異な
る環境に応用され得る方法を見いだす必要もある。
本発明によると、少なくとも2つの異なる源からの遺伝子物質を含む、標的真核
性の植物の核ゲノム中の一つ又はそれ以上のDNA配列の起源を同定する方法は
、源の一つからのDNAを雑種化する為に選択された標識付は全ゲノムDNA断
片により、標的植物からのDNAを雑種形成し、一方、2つ以上の源に共通な配
列に対するプローブの雑種化を、標的植物DNA中及び/又は標識付けDNA中
の共通配列で雑種化することにより、この様な共通の配列を遮断する様に選択さ
れた未標識付は全ゲノムDNA断片により防止し、かつ標的植物のDNAに対す
る標識付はプローブの雑種化の部位を検出することからなる。
生物有機体を分類する為の各種の計画がある。本明細書の目的の為に使用される
計画は、0ワイスス(OVyss)。
、OBウィリアムス(OB Villiams)、及びIJガーデナーJr、
(ETGardener Jr、 )共著、「基本的微生物学」、ジョンビレイ
アンドサンズ社(John Viley & 5ons Inc、) 1963
年出版0第33頁に記載されている。この分類において、植物界は、プロトフィ
タ(Protohta)(細胞内膜の無い原始的植物)として同定される門に包
含されるバクテリアを含む。従って、真核性植物は、プロトフィタ以外の植物界
の総てである。
植物は、好適には、維管束植物であり、更に好適には、スペルマトフィタ(種子
植物) (Spermato hyta) [アンギオスペルムス(被子植物)
(angiosper+++s)、ギムノスペルムス(裸子植物) (gym
nosperms)]の一つである。植物は、最も好適には、単子葉植物、例え
ば、グラミネア(イネ科) (Gramineae)の一つである。標的植物は
、ホルデウム(Hordeum)種、−t−hしく5ecale)種、トリチク
ム(Triticua+)種、又はエギロプス(Aegilops)種からのD
NAを含む。本発明が適用される特定の標的植物は、a)ホルデウムfford
eum)源からとセカレ(Seca−江)源からのDNA5b) トリチクム(
Triticum)又はエギロプス7)源、及びセカレ(Secale)源から
のDNAを含むものである。
本明細書において、「標的植物」とは、そのDNA配列が、研究中である植物で
ある。標的植物は、有性方法又は遺伝子工学(即ち、ウィルスベクターを使用す
る)により導入される2つ以上の明確な「源」から生じるDNA配列を潜在的に
含む。「標的DNA配列」とは、検出され次いで続く世代を通してめられるべき
標的植物の核ゲノム中に潜在的に含まれるゲノム、染色体、又は染色体断片であ
って良いDNA配列のの幾つかである。
標的植物中のDNAの「源」は、H[例えば、第−世代雑ば、S、セリアール(
S、 cereale)とトリチカーレ(Triticale)中のT、デュル
ムデスフ、 (T、 durum Desf、 )、又はT、モノフクム(T、
monococcum)、及びT、エスチビウム(T、 aestivum)
中の他のもの]であっても良い。
標的植物中のDNA配列の少な(とも一つの、かつ好適には総ての源は、明確で
あるべきである。一つの源は、好適には、その遺伝子構Fy、(例えば、病気抵
抗性、形態学、及び包含遺伝子発現因子)における相違から結果し、他の源に存
在しないある種の確認可能な特性を有するべきである。
標的植物中の標識付はプローブと2つ以上の源との間の共同のDNA配列を遮断
する為に使用される核ゲノムの断片は、標的植物中の源の間の相違の程度により
選択されるだろう。源が近縁である[例えば、ホルデウムブルガー(H。
vulgare)とホルデウムブルボサム(■、 bulbosum月場合、遮
断として源の一つからの全ゲノムDNAを使用するのが好適であろう。
源が近縁でない、例えばホルデウムブルガーの源よりも、標識付けDNAの源に
近縁でないならば、遮断剤として使用される全ゲノムDNAは、遠縁源からのも
のであるのが良い。
単一鎖の標識付けDNAを有する植物からのDNAの単一鎖形態を人工的に再ア
ニーリングする為に使用される様な「雑種形成」の術語は、当技術分野において
理解されており、[しくLe)等及びラピタン(Lapitan)等により示さ
れる様に(前記引用文献中)、概説に対しては、ヘンダーラン(Henders
on)、インターナショナルレビューサイトロジー(Int、 Rev。
Cytol、 )、第76巻、第1〜46頁、1982年を参照されたいコ。
勿論、雑種形成は、天然における有性生殖の結果起こる雑種形成から明確である
。標的植物からの単一鎖DNAは、顕微鏡的に調製された染色体の形態である。
従って、本発明は、DNAが、標的植物からの***中期又は***間部の染色体の
調製として存在する標的植物中のDNAに適用されて良い。DNAは、標的植物
から抽出され、次いで膜上に、任意的に膜の制限区域に固定化されて良い。標的
植物からのDNAは、一つ又はそれ以上の制限酵素で消(にされ、次いで膜に転
移される前に電気泳動によりサイズ分割されるのが良い。別案として、DNAは
、標的植物組織を押しつぶすことにより膜上に固定され、次いで侵出物を膜上に
転移されても良い。単一鎖DNAを生成し、次いでそれを、標識付けDNAプロ
ーブで雑種化する方法は、一般的に公知であり、かつ例えば、ラビタン(Lap
i−tan)等とヘンダーラン(Henderson)により開示されている(
前記引用文献中)。
本発明の方法は、他の源からの未標識付は全ゲノムDNAで遮断されて、標的D
NA配列に雑種化するプローブとしてLe付は全ゲノムDNAを使用するもので
ある。elt付は及び未標識付はプローブDNA配列の長さは、一般的に、染色
体中のDNA配列の全長さ未満、典型的には50〜1000ベース対である。長
さ削減は、例えば、DNA抽出方法自体により、DNAをオートクレーブ処理し
、音波処理又は機械的剪断処理により達成される。DlfA標識付は方法もまた
、DNA配列の断片を生成し一オリゴー1Mm付けは、80〜120ベース対の
長さを有する断片を与える。
標的植物中に存在する源の一つからの全ゲノムDNAは、標識付けされ、「標識
付けDNAJと呼ばれる。好適には、標的植物中に存在する源の一つ又はそれ以
上からの全ゲノム性DNAは、しかし標識付けDNAを供給する源からのDNA
でなく、「遮断DNAJとして使用され、かつ未標識付けである。
DNAは、雑種形成を与える条件下に直かれる前に、単一鎖にされる。雑種形成
の前に及びl又は間に、標識付けDNAの濃度の6倍以上で存在するであろう遮
断DNAは、(a)標的植物DNA、(b) tLiRt付けDNA、又は組合
せられた(a)と(b)と接触させられる。若しくA)の場合には、標識付は配
列は、未だ単一鎖形態にある標的植物囲Aの配列により雑種形成されることが出
来、その理由は、mW付は配列は、遮断DNA中の配列に相当しないからである
。若しくb)の場合には1.遮断DNAに共通でない標識付けDNAの配列の多
くは、単一鎖に留まり、その時にこれらの配列は、単一鎖に留まる標識付は配列
だけであり、従って標的植物DNAに雑種形成に役立つ。
遮断DNAは、遮断DNAと同じ源から誘導された標的植物の配列で雑種形成し
、更に標的植物DNA及び/又は標識付けDNAの配列は、遮断源DNAと共通
である。総ての場合、未標識付は間で、標識付けと未標識付は間で、及び標識付
は間で、雑種DNAは形成するだろう。未標識付けDNAのより高い濃度の為に
、未標識付けDNAの頻度は、より低く、e4識付けされた、標的植物からのD
NAに相当する配列に雑種形成するのに役立つ、一般的に低いコピー数の配列を
残すだろう。
雑種形成の後、標識付けDNAは、未標識付けDNA配列と異なる様な幾つかの
方法において検出され、例えば、放射性原子、又は他の原子又は基、例えばビオ
チン又は水銀の存在により検出される。DNA配列をmW付けする方法及び雑種
形成の後に、標識付けDNAを検出する方法は、周知である。
放射性標識付けが使用されて良く、これはオートラジオグラフにより検出され得
る。好適な方法は、前記ビオチンによる標識付けであり、例えば、ラビタン(L
apitan)等(前記引用文献中)のニックト転移を使用する方法である。ビ
オチン標識付は物質の存在は、蛍光又は比色技術により検出され得る。
別の方法は、DNAを酵素で標識付けし、次いで酵素による触媒反応によりmW
を検出する。
潜在的に存在する標的DNAの標識は、陽性又は陰性であるに違いない。陽性標
識は、例えば雑種形成後の放射性原子又はビオチン基の存在により標的DNAを
標識付けするであろう。別案として、陰性標識は、標識の不存在により標的DN
Aを区別するであろう。
本発明は、次の実施例に関して記載される。
実施例1及び比較試験人
植物DNA :全ゲノムDNAを、ホルデウムブルガ−(Hordeu117)
、ホルデウムチレンセ(Hordeum chilense)ロエム&シュルト
CRoem & 5chult)、セカレセリアール(Secalecerea
le)、セカレアフリカナム(Secale africanum)スタフ(S
taph)、及び雑種のホルデウムブルガ−(Hordeumプロッティングプ
ロトコルに従って、DNAを変性し、次いで雑種形成伝達膜[遺伝子選別プラス
膜、イーアイデュポンデネモウルスアンドコインク(E I du Pont
de Nemours& Co Inc)、米国ボストン]に転移し、各々の種
のDNAの約0.08.0.2.0.8.及び2.0μgを、アルカリ変性前に
、斑点プロッターの異なる斑点に適用した。
壁厚コ因上黙:セカレアフリカナム(SeCa1eHfrican+n++)か
らの全ゲノムDNAを、ビオチン−11−dUTPを使用してオリゴ−標識付け
により標識付けした。
遮断DNA :ホルデウムブルガー(Hordeum vulgare)からの
全ゲノムDNAをオートクレーブ処理した。
転移膜を、2mlの標準雑種形成溶液中の変性遮断DlfAの200μgで予備
雑種形成した[シャープPJ、クライスy、シエブリPR,ガーレMD、 (S
harp PJ、 Krels L 5hevry PR,Ga1e1[D、
)セオジーアブライドジエネチツク(Theor、 Appl。
Genet、 )、第75巻、第289−290頁、1988年]。雑種形成の
為に、0.5μgの変性標識付けDNAと1a+Hの変性へリング担持DNAを
、プラスチック袋に添加し、次いで70℃で一晩装置した。後−雑種形成洗浄を
、60℃で、0.16xSSC(20xSSC: 311塩化ナトリウム、0.
31[クエン酸ナトリウムねpH7)にて達成した。この様な条件下の雑種形成
は、80%相同性を有する配列を雑種形成させた。
雑種形成ビオチン化DNAは、ベテスダリサーチラボラトリーズ(Bethes
da Re5earch [aboratories)(米国、メリーランド州
)によるストシブタビジン/アルカリ性ホスファターゼ比色検出システムを使用
して可視化させた。
セカレアフリカナム(Secale africanum)とセカレセリアール
(Secale cereale)両方に対する雑種形成は、2.0と0.8μ
gのDNAを含む斑点中に強く可視状であったが、0.2μgのDNAに対して
唯弱く見えるにすぎなかった。2個のホルデウム(Hordeum)種のDlf
Aに対する雑種形成は、2.0μgの斑点中にの検出されるだけであった。七カ
レアフリカナム(SecaLeafricanum)とホルデウム(Ilord
eum)種の間の区別と、雑種中の七カレアフリカナム(Secale afr
icanum)DNAの検出は、可能であったが(実施例1)、セカレアフリカ
ナム(Secale africa、num)とセカレセリアール(SecaL
e cereale)の間では不可能であった(比較試験A)。
実施例2
標識付けDNA (実施例1におけると同様に実施)としてセカレアフリカナム
(Secale africanum)による雑種形成実験において、遮断DN
Aとして使用したセカレセリアール(Secale cereale)からのD
NAは、セカレアフリカナム(Secalの属における種の間の識別を許した。
実施例3と比較試験B
雑種形成膜を調製し、実施例1に記載の通りに雑種形成した。ホルデウムブルガ
−(Hordeum vulgare)からの全ゲノムDNA(0,5μg)を
、ニック翻訳によりビオチンで標識付けし、次いでホルデウムチレンセ(Hor
deum chilense)からのオートクレーブ処理した全ゲノムDNA(
100μg)を遮断Dlf&として使用した。
成のシグナルを示した。
施例4と比較試験CとD
植物DffA:ホルデウムブルガ−(Hordeua+ vul are)と忠
土エウムブルボサムネブスキー(Hordeum bulbosum Nevs
ki)からの全ゲノムDNAを、制限酵素EcoRIとDraIにより消化し、
アガロースゲル電気泳動によりサイズ分割し、次いで、アルカリ性転移方法論を
使用して、ノ1イボンド(Hybond)N” [アマ−ジャムインターナシラ
ナルpie(Amersham Internationalplc)、英国、
アマ−ジャム(Amersham、 U、[、)コに転移した。
標識付けDNA :ホルデウムブルボサム(Hordeum bulbosum
)からの全ゲノムDNA。
J If’r DNA :±止1ヱ△二白拍安が■銀独且上吐組匹)からのオー
トクレーブ処理全ゲノムDN&。
プローブ標識付け、雑種形成、及び雑種形成のサイトに対して、化学蛍光方法E
CL[アマ−ジャム(人a+ersham)]が、製造会社の報告書に従って使
用された。概略的に、転移膜を、雑種形成溶液と変性遮断DHAC6μg/+1
)中に30分子備温装した。変性西洋ワサビのペルオキシダーゼ標識付けDNA
の12ng/a+1を添加し、次いで雑種形成を42℃で一晩実施した。
後−雑種形成洗浄物を、ナトリウムイオン濃度により調節して推定90%同定に
よる配列を残留アニールさせた。雑種形成サイトを、光り放射により検出して、
直接的にフィルム上にg己録した。
ゲノムDNAに対する標識付はプローブの雑種形成から結果する強いシグナルを
、ホルデウムブルボサム(Hordeui bulbosum)からのDNAを
含む軌道上で観察し、−万事サナシグナルを、土匹ヱユh二りと畳二鋤銀垣匹Δ
吐E匹)DNAの軌道上で検出した(比較試験C)。対照的に、遮断DNAを使
用しない場合(比較試験D)、ホルデウムブルガー(Hordeumvulga
re)に対する相当な交差雑種形成が検出された。遮断と共に標識付は全ゲノム
DNAで雑種形成する方法は、同じ属内の関係する種の区別を可能とする。
(Secale africanum)からの全ゲノムDNAを、EcoRIで
消化し、次いで実施例4に記載と同じに処理した。
(Secale african+u++)からの全ゲノムDNAの8μg/m
lで遮断し、次いでホルデウムチレンセ(Hordeu璽chilense)か
らのmW付は全ゲノムDNAの17ng/mlで標識付けした。後−標識付は洗
浄物を、80%と90%の厳密で実施した。
リカナム(Secale africanum)からの両方のDNAに対する交
差雑種形成を、未標識付はセカレアフリカナム(SecaLeafricanu
m)の添加により削減した(遮断DNA無しの同じプロット雑種形成と比較して
)。(比較試験E)実施例6
雑種形成実験(実施例5における記載の通りに実施)(Hordeum chi
lense)からの標識付けDNAの交差雑種形成を抑えた。
実施例5と6は、遠縁源からのDNAが、雑種形成実験における共通配列を遮断
するのに使用されることが出来ることを示した。 ・
実施例7と比較試験F
DNA: 6倍体トリチカレ[x )−リチコセカレ(Tritj、cosec
ale)ウィツトマーク(Wittmark)] シーヴイー、ラスコ(cv。
La5ko)、3個の異なるコムギの栽培品種[T、エスチバムL。
(T、 aestivum L、)、シーグイ−。チャイニーズスプリング。
シーブイ−。ビーバー、及びシーヴイー、グレンラン(cv、 Chinese
Spring、 cv、 Beaver and cv、 Glenson)
]、及びライムギ、[セカレセリアール(Secale cereale)]か
らの全ゲノムDNAのDral制限酵素断片を、実施例4に記載の通りに処理し
た。
標識付けDNA :セカレセリアール(Secale cereale)からの
全ゲノムDNAのLong/mlを実施例4に記載の通りにmW付けした。
遮断DNA: T、エスチバム(T、 aestivu++)、シーグイ−。チ
ャイニーズスプリング(cv、 Chinese Spring)からの未標識
付はオートクレーブ処理の全ゲノムDNAの3μg/ml。
■、エスチバム(T、 aestivum)、シーグイ−。チャイニーズスプリ
ング(cv、 Chinese Spring)のDNA (比較試験F)は、
唯弱い雑種形成を示した。強い雑種形成を、セカレセリアール(Secale
cereale)、トリチカレ、T、エスチバム(T、 aestivum )
、シーブイ−。ビーt< +、 及ヒ’z−’jイ+。
グレンラン(cv、 Beaver and cv、 Glenson)のDN
Aに対して検出した。従って、プローブと適切な遮断として、ライムギからの全
ゲノムDNAを使用して、ライムギDNAは、トリチカレ(コムギとライムギの
間の雑種)9、及びライムギ染色体断片[シーブイ−。ビーバー、及びシーヴイ
ー、グレンラン(CV。
Beaver and cv、 Glenson)]を含むコムギ品種において
識別8来る。シグナル数量化は、雑種形成が、ライムギ物質の存在量に略比例し
た。
根先端部から、これらを0.011(クエン酸/クエン酸ナトリウム緩衝液(p
E[4,6)中の4%セルラーゼと40%液体ペクチナーゼ混合物中に37℃で
1〜2時間宜くことにより調製した。次いで、これらを、45%酢酸中で圧し潰
すし、次いで標準的細胞学的方法に付した。
標識付けDNA :セカレアフリカナム(Secale africanum)
からの全ゲノムDNAを、ビオチン−11−d[ITPを使用するニック−転移
により標識付けした。
遮断DNA :ホルデウムチレンセ(tlordeum chilense)か
らのオートクレーブ処理した全ゲノムDNA。
雑種形成を、標準的技術を使用して実施した[シバルツアッケルT、レイチュA
R,ペンネットMD、ヘスロープーハリランJS(Schvarzacher
T、 LeitchλR,Bennett MD。
He5lop−Harrison JS)、アンナーレスボタニ(inn、 B
ot、)、第64巻、第315〜324頁、1989年]。染色体を、68〜7
2℃で2分間、ZxSSC中で脱イオン70%ホルムアミド中で変性し、脱水し
、次いで空気乾燥した。−晩の雑種形成を、50%ホルムアミド、10%デキス
トラン硫酸塩、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、及び2xSSC溶液の20μ
m中の変性遮断DNA1μgと共に、変性ビオチン化DNAの0.1μgで一晩
実施した。これらの条件下の雑種形成は、80〜85%の相同性レベルで起こる
べきである。
雑種形成した標識付はプローブを、フルオレセイン化アビジンを使用し、次いで
ビオチン化アンチ−アビジンで増幅して検出した。染色質を、沃化プロビジラム
(食塩前リン酸緩衝液中1〜2μg/+1)で後染色した。
アビジン生体内原位置雑種形成シグナルと沃化プロビジラムを、450〜490
nmで励起し、前者は緑色がかった黄色なmWを示さなかった。従って、この技
術は、2個の進化論的に関係する染色体セットを明らかに分割した。
衷度鳳」
実施例8に記載の通りに処理したプロスフアーゼ、テロファーゼ、及びインター
フアーゼは、セカレアフリカナム(Secale africanuIll)か
らの黄色tMm付は染色体、又は土ルデウムチレンセ(Hordeum chi
leose)からの赤色未標識付は染色体のいずれかに属する明確な頭載を示し
た。
アフリカナム(Secale africanum)の根先端部からの染色体を
調製し、実施例8に記載の通りに処理した。切片上雑種形成を、標識付けDNA
として七カレアフリカナム(Secale africal、5μgとを使用し
て実施した。2セツトの染色体が、標識付けと未標識付けとして明確に区別され
た。中期において、立しアフリカナム(Secale africanum)か
らの7個の大きな染色体が標識付けされ、かつ明るい黄色に蛍光を発し、一方、
土ルデウムブルガー(HordeuIIlvulgare)からの7個の小さな
染色体は、検出出来ない標識を示す橙赤色であった。前期、終期、及び間部にお
いて、黄色又は赤色染色体の明確な頭載が区別出来た。
実施例11
切片上雑種形成実験を、IB/IR転座、プローブとしてセカレセリアール(S
ecale cereale)からのビオチン化全ゲノムDNA、及びトリチク
ムデュルム(Triticum durum)からの未Li付は全ゲノムDNA
を担持するコムギ変種ビーバー(Beaver)からの染色体調製を使用して、
実施例8に記載の通りに達成した。使用したテキサス赤複合アビジンは、赤色蛍
光により雑種形成サイトを検出し、一方、未標識付は染色室は、不可視つままで
あった。転座ライムギセグメントは、中期と開部の両方において同定出来た。転
座の切断点の正確な測定は可能であった。
国際調査報告
一一一輪−^−−”’ PCT/GB 89101440
Claims (25)
- 1.少なくとも2つの異なる源からの遺伝子物質を含む、標的真核性の植物の核 ゲノム中の一つ又はそれ以上のDNA配列の起源を同定する方法が、源の一つか らのDNAに対して雑種化する為に選択された標識付け全ゲノムDNA断片によ り、標的植物からのDNAを雑種形成し、一方、2つ以上の源に共通な配列に対 するプローブの雑種化を、、標的植物DNA中及び/又は標識付けDNA中の共 通配列で雑種化することにより、この様な共通の配列を遮断する様に選択された 未標識付け全ゲノムDNA断片により防止し、かつ標的植物のDNAに対する標 識付けプローブの雑種化の部位を検出することからなることを特徴とする方法。
- 2.未標識付け全ゲノムDNAが、標的植物中のDNA配列の源であり、かつ標 識付けDNAの源と明確に異なる植物からのものである請求項1記載の方法。
- 3.標的植物中のDNAの源が同じ属からのものである請求項2記載の方法。
- 4.標識付けDNA断片の源が遠縁の源である請求項1〜3のいずれか1項に記 載の方法。
- 5.標識付け断片及び未標識付け断片が、50〜1000ベース対の範囲の長さ を有する請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 6.断片が、80〜250ベース対の範囲の長さを有する請求項5記載の方法。
- 7.未標識付け断片が、標的植物からのDNAで雑種形成された後に、標識付け DNAが、標的植物からのDNAで雑種形成される請求項1〜6のいずれか1項 に記載の方法。
- 8.未標識付け断片が標識付け断片で雑種形成された後に、標識付け断片が標的 植物からのDNAで雑種形成される請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 9.標的植物からのDNAが、未標識付けと標識付けのDNA断片の混合物で雑 種形成される請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 10.標識付けDNAが、ビオチンで標識付けされ、かつ標識が、蛍光又は比色 により検出される請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 11.標識付けDNAが、放射性原子で標識付けされ、かつ標識が、オートラジ オグラフにより検出される請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 12.標識付けDNAが酵素で標識付けされ、かつ標識が、酵素による触媒反応 で検出される請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 13.標的植物が、単子葉植物である請求項1〜12のいずれか1項に記載の方 法。
- 14.標的植物が、イネ科の一員である請求項11記載の方法。
- 15.源の一つが、ホルデウム(Hordeum)種である請求項12記載の方 法。
- 16.源の一つが、セカレ(Secale)種である請求項12又は13のいず れかに記載の方法。
- 17.源の一つが、コムギ(Triticum)種又はエギロプス(Aegil ops)種である請求項12又は13のいずれかに記載の方法。
- 18.標的植物が、ホルデウム(Hordeum)とセカレ(Secale)源 からのDNAを含む請求項12記載の方法。
- 19.標的植物が、コムギ(Triticum)又はエギロプス(Aegilo ps)源とセカレ(Secale)源からのDNAを含む請求項12記載の方法 。
- 20.標識付けDNAの雑種形成が、標的植物からの中期染色体調製に対して起 こる請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 21.標識付けDNAの雑種形成が、標的植物からの中期染色体調製に対して起 こる請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 22.標識付けDNAの雑種形成が、標的植物から抽出され、かつ膜上に固定化 されたDNAに対して起こる請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 23.標識付けDNAの雑種形成が、膜上の考慮した領域中に固定化されている 請求項22記載の方法。
- 24.標的植物からのDNAが、一つ又はそれ以上の制限酵素により消化され、 かつ膜へ転移される前に電気泳動によりサイズ分離される請求項22記載の方法 。
- 25.DNAが、植物組織を押し漬し、次いで浸出液を膜上に転移することによ り膜上に固定化される請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
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- 1989-12-01 CA CA002004408A patent/CA2004408A1/en not_active Abandoned
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