JPH04502253A - 植物染色体中のｄｎａ配列を同定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 植物染色体中のＤＮＡ配列を同定する方法本発明は、植物の核ゲノム中のＤＮＡ 配列を同定する方法に関し、かつこの方法を使用して、植物育種の方法に関する ものである。

植物のゲノム中に他の源からＤＮＡ配列を取込むことがしばしば望まれる。従来 の植物育種技術は、望ましい性質（例えば、病気抵抗性、タンパク質特性）を、 得られる植物品種中にコード付けする遺伝子を導入する為に、同じ種の異なる株 、又は異なる種の異なる株さえも交雑させてきた。伝統的方法は、供与体種又は 品種と受容体種又は品種の間の多数のランダム雑種を栽培し、かつ継続繁殖と同 系繁殖に対して望ましい性質を有した雑種を選択することに頼っていた。この方 法は時間の掛かる方法である。遺伝子の伝達は、一つの植物から他の植物へ全染 色体を伝達し、次いで数世代の選別、時には戻し交雑を伴って行われる。この期 間の間、染色体間の組換えが起こるであろう。多くの品種において、唯少数の染 色体セグメントのみが、供与体種から標的植物中へ伝達される。

今や、ＤＮＡ配列が、この配列を有する植物における一定の特性の原因となるこ とを決定することは、しばしば可能である。分子生物学における最近の進歩は、 新しい品種中にＤＮＡセグメントの直接挿入を可能とする。総ての場合において 、植物の圃場試験にのみ頼ること無しに、ゲノム中に異質のＤＮＡの取込みをめ る技術を有することは有用である。

一般に、以前は、標的植物において重要な遺伝子を有する、取込まれた異質のＤ ＮＡをめかつ同定していた方法は、高価でかつ解明することが困難であった。従 って、ＤＮＡ配列の転移は、植物の形態学により、染色体自体の形態学により、 染色体バンディングにより、イソ酵素の存在の決定により、又はＲＦＬＰ（制限 断片長さ冬型性現象）により同定される。他の方法は、Ｎラビタン等（Ｎ　Ｌａ ｐｉｔａｎ）［ジャーナルへレディテ４　（Ｊ　Ｈｅｒｅｄｉｔｙ）第７７巻、 第４’１５−４１９頁、１９８６年］に開示される様に、原位置でクローン化Ｄ Ｎ人配列を有する雑種植物細胞中の染色体を雑種形成化することである。クロー ンを使用することにより、プローブＤＮＡ配列は、総て同一であるだろう。クロ ーン化配列は、標的植物におけるＤＮＡの源の一つの特性である様に選択される 。然し乍ら、クローンは、単離することが困難であり、かつ一般に応用されない ようである。

１９８８年のトロントにおける第ＸＶＩ回国際遺伝子会議に関して出版された抄 録において、しくＬｅ）等により、全ゲノムＤＮＡは、ライムギ起源の染色体又 は大染色体セグメントを、ライムギーコムギ雑種におけるコムギと、ライムギ交 換を有するコムギ品種とから区別するのに使用されたことを開示している。この 方法は、染色体の単一鎖変形を生成し、次いでこれらをライムギ親から単離した 標識付は単一鎖ＤＮＡと接触させることに頼っている。ライムギから誘導される 雑種の単一鎖染色体は、ライムギ源からの標識付は相補的ＤＮＡに、優先的に結 合するだろう。

し等（前記引用文中）により開示された方法は、供与体と受容体種が大きく異な る植物における−例えば、異なる属の植物からの親の間の雑種における全染色体 又は大染色体セグメントの起源を同定するだろう。然し乍ら、植物育種において 、短いＤＮＡ配列（典型的には敵方のベース対）を、同類源から標的植物の核ゲ ノム中へ導入することが、しばしば望まれる。例えば、一つの市販コムギ品種に おける眼状斑点病に対する抵抗性は、エギロブス属ベントリコサ（Ａｅｇｉｌｏ ｐｓｖｅｎｔｒｉｃｏｓａ）の野生二倍体のコムギ種からのＤＮＡ配列により付 与される。この様な改良植物を生成するに際して、有性雑種形成によるか又はよ り直接的な実験室手技によるかのいずれであろうと、異質源からのＤＮＡの配列 が一定の植物に存在するかどうか決定する必要がある。このことは、植物育種家 が、ＤｌｆＡ配列が転移されたかどうか確かめることを可能とし、かつＤＮＡ配 列が染色体の長さ又は位置において変化しつつあるかどうか確かめる為に、かつ 減数***においてＤＮＡ配列の対合挙動を検査する為に、幾世代を通してのＤＮ Ａ配列をめることを可能とする。し等（前記引用文中）により記載された技術が 、ＤＮＡが２つの近親源から誘導される植物の核ゲノムに応用されるならば、一 つの源からの全ｍＷ付はゲノム性単一鎖プローブＤＮＡは、同じ源からの単−鎮 咳ＤＮＡでのみならず近相同の為に他の源からの配列でも雑種化されるだろう（ 取込んで二重ｆｉ　ＤＮＡを形成する）。

従って、近親である２つ以上の源からのＤｌｆＡ配列を含む、標的植物の核ゲノ ム中の一定の源からのＤＮＡ配列を同定する筒車な方法を見いだす必要がある。

更に、雑種と広範囲の種を含む異質Ｄｌｆ人配列配列する植物とを包含する異な る環境に応用され得る方法を見いだす必要もある。

本発明によると、少なくとも２つの異なる源からの遺伝子物質を含む、標的真核 性の植物の核ゲノム中の一つ又はそれ以上のＤＮＡ配列の起源を同定する方法は 、源の一つからのＤＮＡを雑種化する為に選択された標識付は全ゲノムＤＮＡ断 片により、標的植物からのＤＮＡを雑種形成し、一方、２つ以上の源に共通な配 列に対するプローブの雑種化を、標的植物ＤＮＡ中及び／又は標識付けＤＮＡ中 の共通配列で雑種化することにより、この様な共通の配列を遮断する様に選択さ れた未標識付は全ゲノムＤＮＡ断片により防止し、かつ標的植物のＤＮＡに対す る標識付はプローブの雑種化の部位を検出することからなる。

生物有機体を分類する為の各種の計画がある。本明細書の目的の為に使用される 計画は、０ワイスス（ＯＶｙｓｓ）。

、ＯＢウィリアムス（ＯＢ　Ｖｉｌｌｉａｍｓ）、及びＩＪガーデナーＪｒ、　 （ＥＴＧａｒｄｅｎｅｒ　Ｊｒ、　）共著、「基本的微生物学」、ジョンビレイ アンドサンズ社（Ｊｏｈｎ　Ｖｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　Ｉｎｃ、）　１９６３ 年出版０第３３頁に記載されている。この分類において、植物界は、プロトフィ タ（Ｐｒｏｔｏｈｔａ）（細胞内膜の無い原始的植物）として同定される門に包 含されるバクテリアを含む。従って、真核性植物は、プロトフィタ以外の植物界 の総てである。

植物は、好適には、維管束植物であり、更に好適には、スペルマトフィタ（種子 植物）　（Ｓｐｅｒｍａｔｏ　ｈｙｔａ）　［アンギオスペルムス（被子植物） 　（ａｎｇｉｏｓｐｅｒ＋＋＋ｓ）、ギムノスペルムス（裸子植物）　（ｇｙｍ ｎｏｓｐｅｒｍｓ）］の一つである。植物は、最も好適には、単子葉植物、例え ば、グラミネア（イネ科）　（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）の一つである。標的植物は 、ホルデウム（Ｈｏｒｄｅｕｍ）種、−ｔ−ｈしく５ｅｃａｌｅ）種、トリチク ム（Ｔｒｉｔｉｃｕａ＋）種、又はエギロプス（Ａｅｇｉｌｏｐｓ）種からのＤ ＮＡを含む。本発明が適用される特定の標的植物は、ａ）ホルデウムｆｆｏｒｄ ｅｕｍ）源からとセカレ（Ｓｅｃａ−江）源からのＤＮＡ５ｂ）　トリチクム（ Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）又はエギロプス７）源、及びセカレ（Ｓｅｃａｌｅ）源から のＤＮＡを含むものである。

本明細書において、「標的植物」とは、そのＤＮＡ配列が、研究中である植物で ある。標的植物は、有性方法又は遺伝子工学（即ち、ウィルスベクターを使用す る）により導入される２つ以上の明確な「源」から生じるＤＮＡ配列を潜在的に 含む。「標的ＤＮＡ配列」とは、検出され次いで続く世代を通してめられるべき 標的植物の核ゲノム中に潜在的に含まれるゲノム、染色体、又は染色体断片であ って良いＤＮＡ配列のの幾つかである。

標的植物中のＤＮＡの「源」は、Ｈ［例えば、第−世代雑ば、Ｓ、セリアール（ Ｓ、　ｃｅｒｅａｌｅ）とトリチカーレ（Ｔｒｉｔｉｃａｌｅ）中のＴ、デュル ムデスフ、　（Ｔ、　ｄｕｒｕｍ　Ｄｅｓｆ、　）、又はＴ、モノフクム（Ｔ、 　ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）、及びＴ、エスチビウム（Ｔ、　ａｅｓｔｉｖｕｍ） 中の他のもの］であっても良い。

標的植物中のＤＮＡ配列の少な（とも一つの、かつ好適には総ての源は、明確で あるべきである。一つの源は、好適には、その遺伝子構Ｆｙ、（例えば、病気抵 抗性、形態学、及び包含遺伝子発現因子）における相違から結果し、他の源に存 在しないある種の確認可能な特性を有するべきである。

標的植物中の標識付はプローブと２つ以上の源との間の共同のＤＮＡ配列を遮断 する為に使用される核ゲノムの断片は、標的植物中の源の間の相違の程度により 選択されるだろう。源が近縁である［例えば、ホルデウムブルガー（Ｈ。

ｖｕｌｇａｒｅ）とホルデウムブルボサム（■、　ｂｕｌｂｏｓｕｍ月場合、遮 断として源の一つからの全ゲノムＤＮＡを使用するのが好適であろう。

源が近縁でない、例えばホルデウムブルガーの源よりも、標識付けＤＮＡの源に 近縁でないならば、遮断剤として使用される全ゲノムＤＮＡは、遠縁源からのも のであるのが良い。

単一鎖の標識付けＤＮＡを有する植物からのＤＮＡの単一鎖形態を人工的に再ア ニーリングする為に使用される様な「雑種形成」の術語は、当技術分野において 理解されており、［しくＬｅ）等及びラピタン（Ｌａｐｉｔａｎ）等により示さ れる様に（前記引用文献中）、概説に対しては、ヘンダーラン（Ｈｅｎｄｅｒｓ ｏｎ）、インターナショナルレビューサイトロジー（Ｉｎｔ、　Ｒｅｖ。

Ｃｙｔｏｌ、　）、第７６巻、第１〜４６頁、１９８２年を参照されたいコ。

勿論、雑種形成は、天然における有性生殖の結果起こる雑種形成から明確である 。標的植物からの単一鎖ＤＮＡは、顕微鏡的に調製された染色体の形態である。

従って、本発明は、ＤＮＡが、標的植物からの***中期又は***間部の染色体の 調製として存在する標的植物中のＤＮＡに適用されて良い。ＤＮＡは、標的植物 から抽出され、次いで膜上に、任意的に膜の制限区域に固定化されて良い。標的 植物からのＤＮＡは、一つ又はそれ以上の制限酵素で消（にされ、次いで膜に転 移される前に電気泳動によりサイズ分割されるのが良い。別案として、ＤＮＡは 、標的植物組織を押しつぶすことにより膜上に固定され、次いで侵出物を膜上に 転移されても良い。単一鎖ＤＮＡを生成し、次いでそれを、標識付けＤＮＡプロ ーブで雑種化する方法は、一般的に公知であり、かつ例えば、ラビタン（Ｌａｐ ｉ−ｔａｎ）等とヘンダーラン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）により開示されている（ 前記引用文献中）。

本発明の方法は、他の源からの未標識付は全ゲノムＤＮＡで遮断されて、標的Ｄ ＮＡ配列に雑種化するプローブとしてＬｅ付は全ゲノムＤＮＡを使用するもので ある。ｅｌｔ付は及び未標識付はプローブＤＮＡ配列の長さは、一般的に、染色 体中のＤＮＡ配列の全長さ未満、典型的には５０〜１０００ベース対である。長 さ削減は、例えば、ＤＮＡ抽出方法自体により、ＤＮＡをオートクレーブ処理し 、音波処理又は機械的剪断処理により達成される。ＤｌｆＡ標識付は方法もまた 、ＤＮＡ配列の断片を生成し一オリゴー１Ｍｍ付けは、８０〜１２０ベース対の 長さを有する断片を与える。

標的植物中に存在する源の一つからの全ゲノムＤＮＡは、標識付けされ、「標識 付けＤＮＡＪと呼ばれる。好適には、標的植物中に存在する源の一つ又はそれ以 上からの全ゲノム性ＤＮＡは、しかし標識付けＤＮＡを供給する源からのＤＮＡ でなく、「遮断ＤＮＡＪとして使用され、かつ未標識付けである。

ＤＮＡは、雑種形成を与える条件下に直かれる前に、単一鎖にされる。雑種形成 の前に及びｌ又は間に、標識付けＤＮＡの濃度の６倍以上で存在するであろう遮 断ＤＮＡは、（ａ）標的植物ＤＮＡ、（ｂ）　ｔＬｉＲｔ付けＤＮＡ、又は組合 せられた（ａ）と（ｂ）と接触させられる。若しくＡ）の場合には、標識付は配 列は、未だ単一鎖形態にある標的植物囲Ａの配列により雑種形成されることが出 来、その理由は、ｍＷ付は配列は、遮断ＤＮＡ中の配列に相当しないからである 。若しくｂ）の場合には１．遮断ＤＮＡに共通でない標識付けＤＮＡの配列の多 くは、単一鎖に留まり、その時にこれらの配列は、単一鎖に留まる標識付は配列 だけであり、従って標的植物ＤＮＡに雑種形成に役立つ。

遮断ＤＮＡは、遮断ＤＮＡと同じ源から誘導された標的植物の配列で雑種形成し 、更に標的植物ＤＮＡ及び／又は標識付けＤＮＡの配列は、遮断源ＤＮＡと共通 である。総ての場合、未標識付は間で、標識付けと未標識付は間で、及び標識付 は間で、雑種ＤＮＡは形成するだろう。未標識付けＤＮＡのより高い濃度の為に 、未標識付けＤＮＡの頻度は、より低く、ｅ４識付けされた、標的植物からのＤ ＮＡに相当する配列に雑種形成するのに役立つ、一般的に低いコピー数の配列を 残すだろう。

雑種形成の後、標識付けＤＮＡは、未標識付けＤＮＡ配列と異なる様な幾つかの 方法において検出され、例えば、放射性原子、又は他の原子又は基、例えばビオ チン又は水銀の存在により検出される。ＤＮＡ配列をｍＷ付けする方法及び雑種 形成の後に、標識付けＤＮＡを検出する方法は、周知である。

放射性標識付けが使用されて良く、これはオートラジオグラフにより検出され得 る。好適な方法は、前記ビオチンによる標識付けであり、例えば、ラビタン（Ｌ ａｐｉｔａｎ）等（前記引用文献中）のニックト転移を使用する方法である。ビ オチン標識付は物質の存在は、蛍光又は比色技術により検出され得る。

別の方法は、ＤＮＡを酵素で標識付けし、次いで酵素による触媒反応によりｍＷ を検出する。

潜在的に存在する標的ＤＮＡの標識は、陽性又は陰性であるに違いない。陽性標 識は、例えば雑種形成後の放射性原子又はビオチン基の存在により標的ＤＮＡを 標識付けするであろう。別案として、陰性標識は、標識の不存在により標的ＤＮ Ａを区別するであろう。

本発明は、次の実施例に関して記載される。

実施例１及び比較試験人 植物ＤＮＡ　：全ゲノムＤＮＡを、ホルデウムブルガ−（Ｈｏｒｄｅｕ１１７） 、ホルデウムチレンセ（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｃｈｉｌｅｎｓｅ）ロエム＆シュルト ＣＲｏｅｍ　＆　５ｃｈｕｌｔ）、セカレセリアール（Ｓｅｃａｌｅｃｅｒｅａ ｌｅ）、セカレアフリカナム（Ｓｅｃａｌｅ　ａｆｒｉｃａｎｕｍ）スタフ（Ｓ ｔａｐｈ）、及び雑種のホルデウムブルガ−（Ｈｏｒｄｅｕｍプロッティングプ ロトコルに従って、ＤＮＡを変性し、次いで雑種形成伝達膜［遺伝子選別プラス 膜、イーアイデュポンデネモウルスアンドコインク（Ｅ　Ｉ　ｄｕ　Ｐｏｎｔ　 ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ＆　Ｃｏ　Ｉｎｃ）、米国ボストン］に転移し、各々の種 のＤＮＡの約０．０８．０．２．０．８．及び２．０μｇを、アルカリ変性前に 、斑点プロッターの異なる斑点に適用した。

壁厚コ因上黙：セカレアフリカナム（ＳｅＣａ１ｅＨｆｒｉｃａｎ＋ｎ＋＋）か らの全ゲノムＤＮＡを、ビオチン−１１−ｄＵＴＰを使用してオリゴ−標識付け により標識付けした。

遮断ＤＮＡ　：ホルデウムブルガー（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ）からの 全ゲノムＤＮＡをオートクレーブ処理した。

転移膜を、２ｍｌの標準雑種形成溶液中の変性遮断ＤｌｆＡの２００μｇで予備 雑種形成した［シャープＰＪ、クライスｙ、シエブリＰＲ，ガーレＭＤ、　（Ｓ ｈａｒｐ　ＰＪ、　Ｋｒｅｌｓ　Ｌ　５ｈｅｖｒｙ　ＰＲ，Ｇａ１ｅ１［Ｄ、　 ）セオジーアブライドジエネチツク（Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ。

Ｇｅｎｅｔ、　）、第７５巻、第２８９−２９０頁、１９８８年］。雑種形成の 為に、０．５μｇの変性標識付けＤＮＡと１ａ＋Ｈの変性へリング担持ＤＮＡを 、プラスチック袋に添加し、次いで７０℃で一晩装置した。後−雑種形成洗浄を 、６０℃で、０．１６ｘＳＳＣ（２０ｘＳＳＣ：　３１１塩化ナトリウム、０． ３１［クエン酸ナトリウムねｐＨ７）にて達成した。この様な条件下の雑種形成 は、８０％相同性を有する配列を雑種形成させた。

雑種形成ビオチン化ＤＮＡは、ベテスダリサーチラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓ ｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　［ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（米国、メリーランド州 ）によるストシブタビジン／アルカリ性ホスファターゼ比色検出システムを使用 して可視化させた。

セカレアフリカナム（Ｓｅｃａｌｅ　ａｆｒｉｃａｎｕｍ）とセカレセリアール （Ｓｅｃａｌｅ　ｃｅｒｅａｌｅ）両方に対する雑種形成は、２．０と０．８μ ｇのＤＮＡを含む斑点中に強く可視状であったが、０．２μｇのＤＮＡに対して 唯弱く見えるにすぎなかった。２個のホルデウム（Ｈｏｒｄｅｕｍ）種のＤｌｆ Ａに対する雑種形成は、２．０μｇの斑点中にの検出されるだけであった。七カ レアフリカナム（ＳｅｃａＬｅａｆｒｉｃａｎｕｍ）とホルデウム（Ｉｌｏｒｄ ｅｕｍ）種の間の区別と、雑種中の七カレアフリカナム（Ｓｅｃａｌｅ　ａｆｒ ｉｃａｎｕｍ）ＤＮＡの検出は、可能であったが（実施例１）、セカレアフリカ ナム（Ｓｅｃａｌｅ　ａｆｒｉｃａ、ｎｕｍ）とセカレセリアール（ＳｅｃａＬ ｅ　ｃｅｒｅａｌｅ）の間では不可能であった（比較試験Ａ）。

実施例２ 標識付けＤＮＡ　（実施例１におけると同様に実施）としてセカレアフリカナム （Ｓｅｃａｌｅ　ａｆｒｉｃａｎｕｍ）による雑種形成実験において、遮断ＤＮ Ａとして使用したセカレセリアール（Ｓｅｃａｌｅ　ｃｅｒｅａｌｅ）からのＤ ＮＡは、セカレアフリカナム（Ｓｅｃａｌの属における種の間の識別を許した。

実施例３と比較試験Ｂ 雑種形成膜を調製し、実施例１に記載の通りに雑種形成した。ホルデウムブルガ −（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ）からの全ゲノムＤＮＡ（０，５μｇ）を 、ニック翻訳によりビオチンで標識付けし、次いでホルデウムチレンセ（Ｈｏｒ ｄｅｕｍ　ｃｈｉｌｅｎｓｅ）からのオートクレーブ処理した全ゲノムＤＮＡ（ １００μｇ）を遮断Ｄｌｆ＆として使用した。

成のシグナルを示した。

施例４と比較試験ＣとＤ 植物ＤｆｆＡ：ホルデウムブルガ−（Ｈｏｒｄｅｕａ＋　ｖｕｌ　ａｒｅ）と忠 土エウムブルボサムネブスキー（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｂｕｌｂｏｓｕｍ　Ｎｅｖｓ ｋｉ）からの全ゲノムＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩとＤｒａＩにより消化し、 アガロースゲル電気泳動によりサイズ分割し、次いで、アルカリ性転移方法論を 使用して、ノ１イボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎ”　［アマ−ジャムインターナシラ ナルｐｉｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｐｌｃ）、英国、 アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　Ｕ、［、）コに転移した。

標識付けＤＮＡ　：ホルデウムブルボサム（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｂｕｌｂｏｓｕｍ ）からの全ゲノムＤＮＡ。

Ｊ　Ｉｆ’ｒ　ＤＮＡ　：±止１ヱ△二白拍安が■銀独且上吐組匹）からのオー トクレーブ処理全ゲノムＤＮ＆。

プローブ標識付け、雑種形成、及び雑種形成のサイトに対して、化学蛍光方法Ｅ ＣＬ［アマ−ジャム（人ａ＋ｅｒｓｈａｍ）］が、製造会社の報告書に従って使 用された。概略的に、転移膜を、雑種形成溶液と変性遮断ＤＨＡＣ６μｇ／＋１ ）中に３０分子備温装した。変性西洋ワサビのペルオキシダーゼ標識付けＤＮＡ の１２ｎｇ／ａ＋１を添加し、次いで雑種形成を４２℃で一晩実施した。

後−雑種形成洗浄物を、ナトリウムイオン濃度により調節して推定９０％同定に よる配列を残留アニールさせた。雑種形成サイトを、光り放射により検出して、 直接的にフィルム上にｇ己録した。

ゲノムＤＮＡに対する標識付はプローブの雑種形成から結果する強いシグナルを 、ホルデウムブルボサム（Ｈｏｒｄｅｕｉ　ｂｕｌｂｏｓｕｍ）からのＤＮＡを 含む軌道上で観察し、−万事サナシグナルを、土匹ヱユｈ二りと畳二鋤銀垣匹Δ 吐Ｅ匹）ＤＮＡの軌道上で検出した（比較試験Ｃ）。対照的に、遮断ＤＮＡを使 用しない場合（比較試験Ｄ）、ホルデウムブルガー（Ｈｏｒｄｅｕｍｖｕｌｇａ ｒｅ）に対する相当な交差雑種形成が検出された。遮断と共に標識付は全ゲノム ＤＮＡで雑種形成する方法は、同じ属内の関係する種の区別を可能とする。

（Ｓｅｃａｌｅ　ａｆｒｉｃａｎｕｍ）からの全ゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで 消化し、次いで実施例４に記載と同じに処理した。

（Ｓｅｃａｌｅ　ａｆｒｉｃａｎ＋ｕ＋＋）からの全ゲノムＤＮＡの８μｇ／ｍ ｌで遮断し、次いでホルデウムチレンセ（Ｈｏｒｄｅｕ璽ｃｈｉｌｅｎｓｅ）か らのｍＷ付は全ゲノムＤＮＡの１７ｎｇ／ｍｌで標識付けした。後−標識付は洗 浄物を、８０％と９０％の厳密で実施した。

リカナム（Ｓｅｃａｌｅ　ａｆｒｉｃａｎｕｍ）からの両方のＤＮＡに対する交 差雑種形成を、未標識付はセカレアフリカナム（ＳｅｃａＬｅａｆｒｉｃａｎｕ ｍ）の添加により削減した（遮断ＤＮＡ無しの同じプロット雑種形成と比較して ）。（比較試験Ｅ）実施例６ 雑種形成実験（実施例５における記載の通りに実施）（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｃｈｉ ｌｅｎｓｅ）からの標識付けＤＮＡの交差雑種形成を抑えた。

実施例５と６は、遠縁源からのＤＮＡが、雑種形成実験における共通配列を遮断 するのに使用されることが出来ることを示した。　・ 実施例７と比較試験Ｆ ＤＮＡ：　６倍体トリチカレ［ｘ　）−リチコセカレ（Ｔｒｉｔｊ、ｃｏｓｅｃ ａｌｅ）ウィツトマーク（Ｗｉｔｔｍａｒｋ）］　シーヴイー、ラスコ（ｃｖ。

Ｌａ５ｋｏ）、３個の異なるコムギの栽培品種［Ｔ、エスチバムＬ。

（Ｔ、　ａｅｓｔｉｖｕｍ　Ｌ、）、シーグイ−。チャイニーズスプリング。

シーブイ−。ビーバー、及びシーヴイー、グレンラン（ｃｖ、　Ｃｈｉｎｅｓｅ 　Ｓｐｒｉｎｇ、　ｃｖ、　Ｂｅａｖｅｒ　ａｎｄ　ｃｖ、　Ｇｌｅｎｓｏｎ） ］、及びライムギ、［セカレセリアール（Ｓｅｃａｌｅ　ｃｅｒｅａｌｅ）］か らの全ゲノムＤＮＡのＤｒａｌ制限酵素断片を、実施例４に記載の通りに処理し た。

標識付けＤＮＡ　：セカレセリアール（Ｓｅｃａｌｅ　ｃｅｒｅａｌｅ）からの 全ゲノムＤＮＡのＬｏｎｇ／ｍｌを実施例４に記載の通りにｍＷ付けした。

遮断ＤＮＡ：　Ｔ、エスチバム（Ｔ、　ａｅｓｔｉｖｕ＋＋）、シーグイ−。チ ャイニーズスプリング（ｃｖ、　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ）からの未標識 付はオートクレーブ処理の全ゲノムＤＮＡの３μｇ／ｍｌ。

■、エスチバム（Ｔ、　ａｅｓｔｉｖｕｍ）、シーグイ−。チャイニーズスプリ ング（ｃｖ、　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ）のＤＮＡ　（比較試験Ｆ）は、 唯弱い雑種形成を示した。強い雑種形成を、セカレセリアール（Ｓｅｃａｌｅ　 ｃｅｒｅａｌｅ）、トリチカレ、Ｔ、エスチバム（Ｔ、　ａｅｓｔｉｖｕｍ　） 、シーブイ−。ビーｔ＜　＋、　及ヒ’ｚ−’ｊイ＋。

グレンラン（ｃｖ、　Ｂｅａｖｅｒ　ａｎｄ　ｃｖ、　Ｇｌｅｎｓｏｎ）のＤＮ Ａに対して検出した。従って、プローブと適切な遮断として、ライムギからの全 ゲノムＤＮＡを使用して、ライムギＤＮＡは、トリチカレ（コムギとライムギの 間の雑種）９、及びライムギ染色体断片［シーブイ−。ビーバー、及びシーヴイ ー、グレンラン（ＣＶ。

Ｂｅａｖｅｒ　ａｎｄ　ｃｖ、　Ｇｌｅｎｓｏｎ）］を含むコムギ品種において 識別８来る。シグナル数量化は、雑種形成が、ライムギ物質の存在量に略比例し た。

根先端部から、これらを０．０１１（クエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐ Ｅ［４，６）中の４％セルラーゼと４０％液体ペクチナーゼ混合物中に３７℃で １〜２時間宜くことにより調製した。次いで、これらを、４５％酢酸中で圧し潰 すし、次いで標準的細胞学的方法に付した。

標識付けＤＮＡ　：セカレアフリカナム（Ｓｅｃａｌｅ　ａｆｒｉｃａｎｕｍ） からの全ゲノムＤＮＡを、ビオチン−１１−ｄ［ＩＴＰを使用するニック−転移 により標識付けした。

遮断ＤＮＡ　：ホルデウムチレンセ（ｔｌｏｒｄｅｕｍ　ｃｈｉｌｅｎｓｅ）か らのオートクレーブ処理した全ゲノムＤＮＡ。

雑種形成を、標準的技術を使用して実施した［シバルツアッケルＴ、レイチュＡ Ｒ，ペンネットＭＤ、ヘスロープーハリランＪＳ（Ｓｃｈｖａｒｚａｃｈｅｒ　 Ｔ、　ＬｅｉｔｃｈλＲ，Ｂｅｎｎｅｔｔ　ＭＤ。

Ｈｅ５ｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ　ＪＳ）、アンナーレスボタニ（ｉｎｎ、　Ｂ ｏｔ、）、第６４巻、第３１５〜３２４頁、１９８９年］。染色体を、６８〜７ ２℃で２分間、ＺｘＳＳＣ中で脱イオン７０％ホルムアミド中で変性し、脱水し 、次いで空気乾燥した。−晩の雑種形成を、５０％ホルムアミド、１０％デキス トラン硫酸塩、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、及び２ｘＳＳＣ溶液の２０μ ｍ中の変性遮断ＤＮＡ１μｇと共に、変性ビオチン化ＤＮＡの０．１μｇで一晩 実施した。これらの条件下の雑種形成は、８０〜８５％の相同性レベルで起こる べきである。

雑種形成した標識付はプローブを、フルオレセイン化アビジンを使用し、次いで ビオチン化アンチ−アビジンで増幅して検出した。染色質を、沃化プロビジラム （食塩前リン酸緩衝液中１〜２μｇ／＋１）で後染色した。

アビジン生体内原位置雑種形成シグナルと沃化プロビジラムを、４５０〜４９０ ｎｍで励起し、前者は緑色がかった黄色なｍＷを示さなかった。従って、この技 術は、２個の進化論的に関係する染色体セットを明らかに分割した。

衷度鳳」 実施例８に記載の通りに処理したプロスフアーゼ、テロファーゼ、及びインター フアーゼは、セカレアフリカナム（Ｓｅｃａｌｅ　ａｆｒｉｃａｎｕＩｌｌ）か らの黄色ｔＭｍ付は染色体、又は土ルデウムチレンセ（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｃｈｉ ｌｅｏｓｅ）からの赤色未標識付は染色体のいずれかに属する明確な頭載を示し た。

アフリカナム（Ｓｅｃａｌｅ　ａｆｒｉｃａｎｕｍ）の根先端部からの染色体を 調製し、実施例８に記載の通りに処理した。切片上雑種形成を、標識付けＤＮＡ として七カレアフリカナム（Ｓｅｃａｌｅ　ａｆｒｉｃａｌ、５μｇとを使用し て実施した。２セツトの染色体が、標識付けと未標識付けとして明確に区別され た。中期において、立しアフリカナム（Ｓｅｃａｌｅ　ａｆｒｉｃａｎｕｍ）か らの７個の大きな染色体が標識付けされ、かつ明るい黄色に蛍光を発し、一方、 土ルデウムブルガー（ＨｏｒｄｅｕＩＩｌｖｕｌｇａｒｅ）からの７個の小さな 染色体は、検出出来ない標識を示す橙赤色であった。前期、終期、及び間部にお いて、黄色又は赤色染色体の明確な頭載が区別出来た。

実施例１１ 切片上雑種形成実験を、ＩＢ／ＩＲ転座、プローブとしてセカレセリアール（Ｓ ｅｃａｌｅ　ｃｅｒｅａｌｅ）からのビオチン化全ゲノムＤＮＡ、及びトリチク ムデュルム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｄｕｒｕｍ）からの未Ｌｉ付は全ゲノムＤＮＡ を担持するコムギ変種ビーバー（Ｂｅａｖｅｒ）からの染色体調製を使用して、 実施例８に記載の通りに達成した。使用したテキサス赤複合アビジンは、赤色蛍 光により雑種形成サイトを検出し、一方、未標識付は染色室は、不可視つままで あった。転座ライムギセグメントは、中期と開部の両方において同定出来た。転 座の切断点の正確な測定は可能であった。

国際調査報告 一一一輪−＾−−”’　ＰＣＴ／ＧＢ　８９１０１４４０

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも２つの異なる源からの遺伝子物質を含む、標的真核性の植物の核 ゲノム中の一つ又はそれ以上のＤＮＡ配列の起源を同定する方法が、源の一つか らのＤＮＡに対して雑種化する為に選択された標識付け全ゲノムＤＮＡ断片によ り、標的植物からのＤＮＡを雑種形成し、一方、２つ以上の源に共通な配列に対 するプローブの雑種化を、、標的植物ＤＮＡ中及び／又は標識付けＤＮＡ中の共 通配列で雑種化することにより、この様な共通の配列を遮断する様に選択された 未標識付け全ゲノムＤＮＡ断片により防止し、かつ標的植物のＤＮＡに対する標 識付けプローブの雑種化の部位を検出することからなることを特徴とする方法。
2. ２．未標識付け全ゲノムＤＮＡが、標的植物中のＤＮＡ配列の源であり、かつ標 識付けＤＮＡの源と明確に異なる植物からのものである請求項１記載の方法。
3. ３．標的植物中のＤＮＡの源が同じ属からのものである請求項２記載の方法。
4. ４．標識付けＤＮＡ断片の源が遠縁の源である請求項１〜３のいずれか１項に記 載の方法。
5. ５．標識付け断片及び未標識付け断片が、５０〜１０００ベース対の範囲の長さ を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. ６．断片が、８０〜２５０ベース対の範囲の長さを有する請求項５記載の方法。
7. ７．未標識付け断片が、標的植物からのＤＮＡで雑種形成された後に、標識付け ＤＮＡが、標的植物からのＤＮＡで雑種形成される請求項１〜６のいずれか１項 に記載の方法。
8. ８．未標識付け断片が標識付け断片で雑種形成された後に、標識付け断片が標的 植物からのＤＮＡで雑種形成される請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
9. ９．標的植物からのＤＮＡが、未標識付けと標識付けのＤＮＡ断片の混合物で雑 種形成される請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
10. １０．標識付けＤＮＡが、ビオチンで標識付けされ、かつ標識が、蛍光又は比色 により検出される請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. １１．標識付けＤＮＡが、放射性原子で標識付けされ、かつ標識が、オートラジ オグラフにより検出される請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
12. １２．標識付けＤＮＡが酵素で標識付けされ、かつ標識が、酵素による触媒反応 で検出される請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
13. １３．標的植物が、単子葉植物である請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方 法。
14. １４．標的植物が、イネ科の一員である請求項１１記載の方法。
15. １５．源の一つが、ホルデウム（Ｈｏｒｄｅｕｍ）種である請求項１２記載の方 法。
16. １６．源の一つが、セカレ（Ｓｅｃａｌｅ）種である請求項１２又は１３のいず れかに記載の方法。
17. １７．源の一つが、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）種又はエギロプス（Ａｅｇｉｌ ｏｐｓ）種である請求項１２又は１３のいずれかに記載の方法。
18. １８．標的植物が、ホルデウム（Ｈｏｒｄｅｕｍ）とセカレ（Ｓｅｃａｌｅ）源 からのＤＮＡを含む請求項１２記載の方法。
19. １９．標的植物が、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）又はエギロプス（Ａｅｇｉｌｏ ｐｓ）源とセカレ（Ｓｅｃａｌｅ）源からのＤＮＡを含む請求項１２記載の方法 。
20. ２０．標識付けＤＮＡの雑種形成が、標的植物からの中期染色体調製に対して起 こる請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. ２１．標識付けＤＮＡの雑種形成が、標的植物からの中期染色体調製に対して起 こる請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
22. ２２．標識付けＤＮＡの雑種形成が、標的植物から抽出され、かつ膜上に固定化 されたＤＮＡに対して起こる請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
23. ２３．標識付けＤＮＡの雑種形成が、膜上の考慮した領域中に固定化されている 請求項２２記載の方法。
24. ２４．標的植物からのＤＮＡが、一つ又はそれ以上の制限酵素により消化され、 かつ膜へ転移される前に電気泳動によりサイズ分離される請求項２２記載の方法 。
25. ２５．ＤＮＡが、植物組織を押し漬し、次いで浸出液を膜上に転移することによ り膜上に固定化される請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。