JPH04502106A - 第x3因子の精製 - Google Patents
第x3因子の精製Info
- Publication number
- JPH04502106A JPH04502106A JP2500450A JP50045090A JPH04502106A JP H04502106 A JPH04502106 A JP H04502106A JP 2500450 A JP2500450 A JP 2500450A JP 50045090 A JP50045090 A JP 50045090A JP H04502106 A JPH04502106 A JP H04502106A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- factor
- factor xiii
- precipitate
- buffer
- biological fluid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
- C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般的にタンパク質精製の方法及びより詳しくは種々の生物学的流体
からの第X■因子の精製方法に関する。
発明の背景
第X■因子(フィブリン安定化因子、フィブリノリガーゼ又は血漿トランスグル
タミナーゼとしても知られている)は、フィブリノーゲンと複合体化されたチモ
ーゲン(Mr=〜320KD)として血液中を循環する血漿糖タンパク質である
(Greenberg and Shuman、 J、 Biol、 Chem
、257: 6096〜6101゜1982)。血漿第X■因子チモーゲンは、
a2b2として命名された全体構造を有する2種のaサブユニッ)(Mr=〜7
5KO)及び2種のbサブユニッ)(Mr=〜80KO)から成るテトラマーで
ある(Chungなど、、 J、Biol、Chem、 249: 94(1〜
950、1974)。aサブユニットは酵素の触媒部位を含み、そしてbサブユ
ニットはaサブユニットを安定化し又は第X■因子の活性化を調節するように思
われる(Folk and Firlayson。
前記; Lorandなど、、Biochem、Biophys、Res、Co
mm、56:914〜922.1974)。a及びbサブユニットのアミノ酸配
列は既知である(Ichinoseなど、、 Biochemistry 25
: 6900〜6906、 1986 ; Ichinoseなど、、Bio
chemistry 25 : 4633〜4638、1986)。第xm因子
に、a2ホモダイマーとして胎盤に生じる。
インビボで活性化されて第X■因子(第XIIIa因子)は他のタンパク質分子
間の架橋反応を触媒する。血液凝固の最終段階の間、トロンビンが第X■因子チ
モーゲンを中間体形(a’ zbz)に転換し、次にこれは第XIIIa因子、
すなわちa′サブユニットのホモダイマーを生成するためにカルシウムイオンの
存在下で解離する。胎盤第X■因子はトロンビンによる分解に基づいて活性化さ
れる。第XI[Ia因子は、分子間(ε(γ−グルタミル) リシン結合の形成
によりフィブリンポリマーの架橋を触媒するトランスグルタミナーゼであり、そ
れによってクロット強度を高める(Chen and口ool 1ttle。
1972)。この架橋反応は、カルシウムイオンの存在を要する(lorand
など、、 Prog、 Hemost、 Thromb、 5: 245〜29
0゜1980;Folk and Finlayson、 Adv、 Prot
、Chem、31: 1〜133、1977)。第Xma因子はまた、α2−プ
ラスミンインヒビタ−及びフィブロネクチンへのフィブリンのγ鎮の架橋及びコ
ラーゲン及びフィブロネクチン(傷の治療に関係する)の架橋を触媒する(Sa
kata and Aoki、 J、 Cl1n、 Invest。
65: 290〜297.1980 ; Mo5her、 J、 Biol、
Chem、250:6614〜6621.1975; Mo5her and
Chad、 J、 Cl1n、Invest。
64: 7g1〜?87.1979 ; Folk and Pinlayso
n、前記;Lorandなど、、 前記)。フィブリンネットワーク中へのα2
−プラスミンインヒビタ−の共有的導入は、溶解するりL1ットの耐性を高める
ことができる(Lorandなと、、 前記)。
第X■因子の欠失は、“遅められた出血”をもたらすが、しかし初期の止血には
影響を与えない(Loran+iなど、、 前記)。
第X■因子欠失症の患者のための現在の処置は、血漿又は血漿透導体による又は
粗胎盤第X■因子濃縮物による置換治療を包含する(Lorandなど1. 前
記: Frobischなど、、 Dtsch。
第XlTl因子はまた、手術後の傷の治癒における疾患潰瘍性大腸炎(Suzu
ki and Takamura、 Thromb、 Haemostas。
(う8 : 509.1987)、偽膜性結膜炎(Kuratsujiなど、、
Haemostasisll: 229〜234.1982>を有する患者の
処置及びクモ膜下出血を有する患者における再出血の予防(Henzeなど、。
Thromb。
11aemostas、 58 : 513.1.987)に有用である。さら
に、第xm因子は組織接着剤の成分と1−ても使用されて来たくアメリカ特許第
4.41.4.976号;第4.453.939号:第4.377、572号:
第4、362.567号;第4.298.598号;第4.265.233号及
びイギリス特許第2102811A号)。
第X■因子のための多くの精製スヶムが記載されて来た。
Chung and Folk (J、 Biol、Chem、247 : 2
798〜2807. 1972)は、血小板濃縮血漿又はフィブリノーゲン調製
物から第X■。 因子を調製した。Cook and Holbrook(Bi
ochem、 J、 141 : 79〜84.1974)は、Cohn −I
画分からの第XI因子の精製を記載する。その方法は、複数の硫酸アンモニウム
沈澱段階及びDEARセルロース上での分別を包含する。Loewyなど、(J
。
Biol、 Chem、 326 : 2625〜2633.1961)は、血
漿から第xm因子を精製するために硫酸アンモニウム分別及びDEAEセ)Lt
。
−スクロマトグラフィーを用いた。5krzyniaなど、(Blood60
: 1089〜1095.1985)は、り0マドグラフイー処理及び硫酸ナン
モニウム沈澱により胎盤濃縮物から第X■因子のaサブユニットを精製した。Z
wislerなど、(アメリカ特許第3、904.751号)及びBohnなど
、(アメリカ特許第3,931.399号)は、第XlTl因子を沈澱せしめる
ためにジアミノ−エトキシ−アクリジンラクテートの使用に基づく複数段階単離
方法を記載する。この沈澱剤は、治療組成物に許容されない汚染物で3 ある。
Faik (アメリカ特許第4.597.899号)は、アルコール沈澱法によ
る胎盤の抽出物からの第X■因子の単離を記載する。
第X■因子を精製するための前記方法の多くは、血漿、血清又はそれらの画分か
らそれを単離するのに向けられて来た。
これらの出発材料は第X■因子のためにすでに富化されており、そして汚染性タ
ンパク質は一般的に十分に特徴づけられており、そして既知の方法により除去で
きる。結果的に、これらの精製スクムは、他のより不均質な出発材料、特に粗細
胞溶解物(ここで汚染性クンバク質分解活性が高い)から第X■因子を調製する
こまに完全には適合しないっさらに、これらの方法の多くは、実験規模の精製の
ために開発され、そして第XlTl因子の治療的な量の経済的な調製のためには
困難である。
従って、第X■因子を精製するための単純且つ経済的な方法のための必要性が当
業界において存在する。そのような方法は、粗出発材料、たとえば組換え細胞の
溶解物から大規模な生成に有用であるべきである。本発明は、他の関連する利点
を伴って、そのような方法を提供する。
本発明は生物学的流体から第X■因子を精製するための方法を提供し、前記方法
は、第xm因子を沈澱せしめるために流体のp)Iを約5.5〜6.5に調節し
、そし7て続いてその沈澱せしめられた第XlTl因子を回収することを含んで
成る。流体のpflは好ましくは、低いイオン強度の生物学的緩衝液、たとえば
複素環式ポリアミン又はホスフェート緩衝液の使用により調節される。適切な低
いイオン強度の複素環式ポリアミンは、ピペラジン、スペルミジン、カダベリン
及びそれらの誘導体を包含する。1つの態様において、第XHI因子は、10〜
100mMのピペラジンを含む緩衝液(pH6,0)において生物学的流体を透
析することによって沈澱せしめられる。
本発明の関連する観点は、生物学的流体から第XUI因子を精製するための方法
を提供し、前記方法は、(a)富化された両分を生成するためにアニオン交換ク
ロマトグラフィーにより生物学的流体を分別し; (b)’JXIH因子を沈澱
せしめるためにその富化された両分のPHを約5.5〜6.5に調節し;そして
(c)沈澱せしめられた第XlTl因子を回収する段階を含んで成る。
この方法は、溶液を生成するために回収された沈#第X■因子の溶解、第2の富
化された両分を生成するために前記溶液をクロマトグラフィー処理により分別し
、そして前記第2の富化された両分を回収する追加の段階を包含する。1つの態
様において、生物学的流体は、清澄化細胞溶解物、たきえは清澄化酵母細胞溶解
物である。生物学的流体は、清澄化溶解物を生成するために細胞溶解物から粒状
物質を除去し、沈殿物を生成するために前記清澄化溶解物に沈殿剤を添加し、た
とえば約30%〜40%の飽和のために硫酸アンモニウムを添加し又は約6〜1
7重量%の濃度のためにポリエチレングリコールを添加し7、そして適切な緩衝
液にその沈殿物を再懸濁することによって調製され得る。
本発明の他の観点は、次の詳細な記載及び添付図面から明らかになるであろう。
図面の簡単な説明
第1図は、酵母細胞からの組換え第X■因子の精製を要約するフローチャートで
ある。
第2図は、流れの早いDEAE 5ephadexからの第xm因子の典型的な
溶離プロフィールを示す。バーは、続くピペラジン沈殿のためにプールされる両
分を示す。
本発明を実施するための最良の態様
本発明を示す前に、この後に使用される特定の用語を定義することは、その理解
のために有益である。
第X■因子:用語“第X■因子”とは、完全な第X■因子チモーゲンテトラマー
、a’ 、b、中間体及び第XIIIa因子、並びにそれらのサブユニット、た
とえばaサブユニット、a′サブユニット及びa2ダイマーを包含する。
生物学的流体:細胞、細胞成分又は細胞生成物に起因する又は含むいづれかの流
体。生物学的流体は細胞培養上清液、細胞溶解物、清澄化細胞溶解物、細胞抽出
物、組織抽出物、血液、血漿、血清及びそれらの両分を包含するが、但しこれだ
けには限定されない。
沈殿剤:溶液に添加される場合、溶液からの他の化合物の沈殿を引き起こす化合
物。沈殿は、沈殿剤と他の化合物との間の複合体の形成又は不溶性をもたらす相
変化による。沈殿剤は、有機変性剤、たとえばエタノール、プロパツール、ポリ
エチレングリコール及び塩、たとえば硫酸アンモニウムを適切な変化を妨げる物
質。緩衝液は一般的に、弱酸又は弱塩基のプロトン−供与体及びプロトン−受容
体形の組合せを含んで成る。緩衝化された溶液への少量の酸又は塩基の添加は、
プロトン供与体及びプロトン受容体の間の平衡を変える。この平衡シフトはpH
を安定化する。
本発明は、種々の生物学的流体から第X■因子を精製する方法を提供する。適切
な生物学的流体は、天然において第X■因子を回収可能な量で生成する細胞、た
とえば胎盤細胞の溶解物又は抽出物、及び血液及び血液画分を包含する。そのよ
うな細胞及び組織の溶解物及び抽出物は、当業者に知られている種々の方法によ
り調製され得る。しかしながら、血液及び組織のウィルス汚染の危険性のために
、第X■因子を生成するために遺伝的に変性されたウィルスを含まない細胞又は
細胞系に起因する流体が好ましい源である。これに関する特に好ましい生物学的
流体は、第X■因子を生成するために形質転換された酵母細胞の溶解物及び清澄
化溶解物を包含し、ここでクローン化されたDNA配列を発現することができる
いづれの細胞タイプでも使用され得る。
本発明内においては、第X■因子がその等電点(すなわち約5.8)で又はその
近くでpHを有する低いイオン強度の溶液に不溶性であることが見出されており
、ここで沈殿剤を必要としないで溶液から第X■因子の分離を可能にする。従っ
て、本発明によれば、第XIII因子は、沈殿物を形成するためにたとえば緩衝
液交換により流体のpHを約5.5〜6.5に調整することによってその生物学
的流体から単離される。沈殿物は、使用の前、さらに精製され、又はたとえば組
織接着剤の調製物に直接使用され得る。沈殿のための好ましい緩衝液は、所望す
るpHに調整される、複素環式ポリアミン、たきえばピペラジン、スペルミジン
、カダベリン及びそれらの誘導体の低イオン強度溶液を包含する。ピペラジン及
びピペラジン誘導体、たとえば硫酸ピペラジンが特に好ましい。他の適切な緩衝
液は、MES、リン酸塩、ADA及びビス−) IJスを含む、pH6,0のま
わりの有用なpH範囲を有する生物学的緩衝液を包含する。緩衝液は一般的に、
約10mM〜100mM 、好ましくは約50mMの濃度で使用されるであろう
。緩衝液は、商業的供給者、たとえばSigma Chemical Co、、
St、 Louis、 MOから得られる。
本明細書に使用される場合、用語“低イオン強度”とは、約150m5 (約2
00mMのNaCIに等しい)以下の電導度を有する溶液を包含する。
上記のように、組換え細胞及び細胞系が第X■因子の好ましい源である。組換え
細胞、たとえば細菌、酵母及び培養された哺乳類細胞における第X■因子の生成
は、Grundmannなど(オーストラリア特許出願第69896/87号)
及び口avieなど(アメリカ特許出願第174.287号;EP第268.7
72号)(これらは引用により本明細書に組込まれる)により記載されている。
クローン化されたDNA配列を発現するための方法は当業界において良く知られ
ている。手短に言えば、第X■因子をコードするDNA配列が適切なプロモータ
ー及びターミネータ−配列に操作可能的に連結され、そしてこの発現単位が選択
された宿主細胞と適合するベクター中に挿入される。
次に前記ベクターが宿主細胞中に挿入され、そして得られた組換え細胞が培養さ
れ、第X■因子が生成される。使用される特定の宿主細胞及び発現単位に依存し
て、第X■因子は細胞から分泌され又は細胞質に保持され得る。
第X■因子を分泌しない細胞を使用する場合、細胞は、培養培地から除去され(
たとえば遠心分離により)、そして溶解物を生成するために処理される。典型的
には、酵母細胞は、粗溶解物を生成するために、ガラスピーズを用いて機械的破
壊により処理される。好ましくは、粗溶解物は低速度(たとえば2.0OOX
g )で遠心分離され、そして上清液画分が回収される。ストレプトマイシンス
ルフェート (2%)が添加され、そしてその上清液が高速度遠心分離(たとえ
ば20.000〜30、000x g )により清澄化溶解物を生成するために
処理される。次にその得られた清澄化溶解物が富化され、そして分別され、その
後、緩衝液交換により第X■因子を沈殿せしめることができる。富化のための適
切な方法は、硫酸アンモニウムの添加により約30〜40%、好ましくは約35
%の飽和にすることにより、又はポリエチレングリコールの添加により約6%〜
17%、好ましくは約6%〜12%(重量)にすることによりその清澄化溶解物
を処理することを包含する。次にその混合物は、沈殿物を生成するために、約3
0分〜3時間インキュベートされる。1つの態様においては、医薬品種のポリエ
チレングリコール(4000〜goooの分子量)が8重量%添加され、そして
その溶液が4℃で1時間インキュベートされる。当業者に明らかなように、時間
、温度及び沈殿剤の濃度は相互関係し、そして従って変えられ得る。次に得られ
た沈殿物が、典型的には遠心分離により回収され、そして低いイオン強度の弱ア
ルカリ緩衝液に再懸濁される。好ましくは緩衝液はプロチアーゼインヒビター、
たとえばフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、ロイペプシン又は
ペプスタチンを含む。
これに関する特に好ましい緩衝液は、5mMのNaJDTA 、 5 mMの2
−メルカプトエタノール及び0.5mMのPMSFを含む50mMのトリス−H
Cl (pH7,5)である。硫酸アンモニウム沈殿法を用いる場合、さらに精
製する前、たとえば透析により再懸濁された沈殿物における塩濃度を低める必要
がある。次にその得られた生物学的流体が下記に示されるように分別される。
第X■因子はまた、培養培地中にそれを分泌する細胞から得られる。一般的に、
細胞は遠心分離により除かれ、そして培地が下記のようにして分別される。他方
、培養培地が、たとえば上記沈殿法により第X■因子のために富化され、そして
続いて再懸濁された沈殿物が分別される。
タンパク質の複雑な混合物を含む生物学的流体により作業する場合、富化された
両分を生成するためにアニオン交換クロマトグラフィーにより生物学的流体を分
別することが一般的に好ましいであろう。次に、第X■因子が緩衝液交換により
その得られた富化画分から沈殿せしめられる。典型的には、生物学的流体はアニ
オン交換媒体のカラム上に通され、そして充填緩衝液よりも低い少なくとも約0
.5 pH単位での緩衝液における狭い塩グラジェントを用いて溶離される。好
ましい溶離手段は、50mMのイミダゾール(p)t6.3 )における0〜1
50mMのNaClグラジェントを用いる。適切なアニオン交換培地は、誘導体
化された5ephadex(Pharnacia、 Piscataway。
NJ) 、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカ、等を含む。PEI、
DEAR及びQAE誘導体が好ましく、モしてDEAIEの早い流速5eph
adexが特に好ましい。当業者に明らかなように、分別はバッチ工程で行なわ
れ得る。ピーク画分は、第X■因子の続く精製のためにプールされる。この段階
では、そのプールされた画分の体積を濃縮により減じることが一般的に好ましい
。好ましい濃縮の方法は、70%飽和(NH,) 2So4による第X■因子の
沈殿である。
次に第XI因子は、上記のように第X■因子調製物のpHを調整することによっ
て沈殿せしめられる。好ましい態様においては、上記のようにして硫酸アンモニ
ウム沈殿法により調製された富化された両分が、5mMのEDTA、 5 mM
の2−メルカプトエタノール(2−吐) 、0.02%のNaN、を含む、II
cIにより6.0にpH調整された50mMのピペラジン溶液に4″Cで溶解さ
れ、そして4℃で5時間、同じ緩衝液に対して透析し、沈殿物が生成される。沈
殿物は遠心分離により回収され、そして新しいピペラジン緩衝液中で数回洗浄さ
れる。この点で、第X■因子調製物は典型的には約98%の純度である。他の生
物学的流体からの第X■因子の沈殿は、実質的には同じ方法で、すなわち沈殿物
を生成するために沈殿緩衝液に対してその流体を透析することによって行なわれ
るであろう。
追加の精製は、沈殿せしめられた第X1lN因子を、約7.4〜8.0のpit
での低いイオン強度の緩衝液、たとえば50mMのトリス(pH7,5) 、5
0mMのNaCl又は50mMのグリシン(pH7,5)、50mMのNaC1
に溶解し、そしてpH5,5〜6.5で沈殿の段階をくり返すことによって得ら
れる。次にこの調製物が回収され、そして直接使用するために適切な緩衝液に再
!!!濁され、又は下記のようにしてさらに精製される。
所望には、最終精製は、従来の化学分離技法、たとえばイオン交換クロマトグラ
フィー、サイズ排除クロマトグラフィー、等の使用により達成される。多くの場
合、調製物から残留プロテアーゼを除くことが所望されるであろう。1つの態様
においては、これは、わずかにアルカリ性のpHでの低イオン強度の緩衝液、た
とえば50mMのトリス、pH8,0又は50mMのイミダゾール、p)18.
0 (200mMのNaClを含む)に沈殿せしめられた第XIII因子を溶解
し、溶液を生成し、次にその溶液をサイズ排除クロマトグラフィーにより分別す
ることによって達成される。これに関する適切なりロマトグラフィー媒体は、架
橋されたデキストラン、ポリアクリルアミド及び親水性コーチング又は結合され
た相を有する特殊シリカを包含する。
5ephac!ex S−200(5−200(Pharが特に好ましいデキス
トラン基礎媒体である。好ましい態様においては、ピペラジン沈殿物が50mM
のトリス−11c1. pH8,0、200mMのNaCl、2.5 mMのE
DTA、1mMの2−メルカプトエタノールに再溶解される。その溶液は遠心分
離され、不溶性残留物が除去され、そして上清液が5ephadex S−20
0カラム上で分別される。ピーク画分がプールされ、そして適切な貯蔵用緩衝液
に対して透析される。
この方法で調製された第XIII因子は典型的には、99%以上の純度であり、
ぞして発熱物質を含まない。
本発明の方法により調製された第XIII因子は、当業者に既知の方法により医
薬製剤、たとえば組織接着剤を調製するために使用され得る。そのような製剤は
、たとえばアメリカ特許第4.265.233号及び公開されてオーストラリア
特許出願第75097/87号(これらは引用により本明細書に組込まれる)に
記載される。
次の例は例示目的のためであって、制限目的のためではない。
餞
例1:ピペラジン緩衝液を用いての第X■因子の精製A9発酵及び上流処理
組換え酵母細胞から第X■因子を精製するための典型的な方法を、第1図に要約
する。手短に言えば、細胞を収穫し、溶解し、そしてその溶解物を清澄化する。
次にその清澄化された溶解物を濃縮し、そしてクロマトグラフィーにより分別す
る。第X■因子を、ピペラジンを用いて第X■因子含有画分から沈殿せしめ、そ
して最終精製段階を用いて微量の汚染物を除去する。
現単位を含むベクター(pD16)により形質転換した。その形質転換された細
胞を約0.1g/βで接種し、そして25g/βの酵母抽出物、22.5 g
/βの(NH4)2So、 、6.5 g/ I!のKH2PO,,3g/j1
7のMg5(J g及び0.5%のグルコースを含むpH5,5の培地において
0〜24又は40時間グルコース供給物と共に及び0〜12又は20時間エタノ
ール供給物と共に培養した。
その培養物(10〜601)を30℃で増殖せしめ、約60g/12の最終細胞
密度にした。
細胞培養物を、0.2μのセルロースエステル中空繊維カートリッジ(Micr
ogon、 Laguna )fills、 CA)を用いいての濃縮により収
穫した。その最終濃縮物は、典型的には、脱イオン水中に酵母細胞600〜30
0g湿量(50湿量%以上の濃度)を含んだ。
次に、濃縮された細胞を溶解した。最大400g (湿量)の細胞を、溶解緩衝
液(50mMのトリスH(1’l 、p)17.4.150mMのNaC1,1
5mMのEDTA、 5 mMの2−ME、1mMのPMSF)に希釈し、40
湿量%にした。細胞を、Dynomill(Glen Mills、 Inc、
。
Maywood、 Nj)を用いて連続した流れの態様で溶解した。細胞懸濁液
を0.6ffiの容器中で酸洗浄された500μのガラスピーズ0.51と共に
混合し、そして60〜100 W11/分の流速を用いて300rpmで溶解し
、3〜5分の平均滞留時間を得た。追加の11の緩衝液をその容器を通してポン
プで送った。
次に溶解物を遠心分離により清澄化した。溶解物の11ボトルをトロ00Aロー
ターを有する5orvall RC−3B遠心分離機により5000rρmで4
5分間遠心分離し、そしてベレットを捨てた。
次に、上清液画分を、PMSFを添加し、1.mMの最終濃度にし、そして7%
のストレプトマイシンスルフェート0.3体積を添加することにより条件つけし
た。次にその混合物を4℃で12時間放置した。最終清澄化を、G5−30−タ
ーを用いて7500rpmで90分間500−ボトルを用いて及び/又はGSA
ローターを用いて12. OOOrpmで60分間250rdのボトルを用いて
5orvall RC−5B遠心分離機により遠心分離することによって達成し
た。次にその得られた清澄化溶解物を下流処理のために用意した。
B、下流処理
清澄化された溶解物を、ポリエチレングリコール1000 (PEG−1000
)の添加により12%の最終濃度にすることにより又はPEG −8000の添
加により8%の最終濃度にすることにより分別した。その混合物を4℃で1時間
インキュベートし、次に5orvall GS −30−ターを用いて7500
rpmで90分間500−のボトルを用いて及び/又はGSAローターを用いて
12.00Orpmで60分間250mjl!のボトルを用いて遠心分離した。
沈殿物を回収した。
PEG沈殿物を、出発緩衝液(50mMのトリス−)1c’l 、pH7,8,
5mMのEDTA、5ITIMの2−MB、0.5 mMのPMSP)に溶解し
、そしてその得られた溶液をDEAEの早い流れのSephadex(Phar
macia)上に負荷した。カラムを11の出発緩衝液により洗浄し、そして第
X■因子を、緩衝液A (50mMのイミダゾール、pH6,3,5+nMのE
DTA、 5 mMの2−ME)及び緩衝液B(150mMのNaC1を含む緩
衝液A)のそれぞれ1βの線状グラジェントを用いて溶離した。典型的な溶離プ
ロフィールは第2図に示される。両分を、N、N−ジメチルカゼインへの3H−
ヒスタミンの導入を測定することにより又は酸素結合免疫吸着アッセイによりア
ッセイした。プールされた第X■因子含有画分を、(N)1.)2SO,の添加
により、70%の飽和にすることにより沈殿せしめた。
次に第X■因子をピペラジン緩衝液を用いて沈殿せしめた。
(NH4)、SO,混合物を遠心分離し、そして上清液画分を捨てた。
ベレットを50−〇トリス、pH8,0,200mMのNaCl、 2.5 m
MのEDTA、1mMの2−ME溶液に溶解し、そして50mMのピペラジン、
pH6,0,5mMのEOTA、 5 mMの2−肝、0.02%のNaN 3
溶液において4℃で約5〜12時間透析した。次にその混合物を5S−340−
ターを用いて5orvall RC−5B遠心分離機で5000rpmで5分間
遠心分離した。その得られたペレットを新しいピペラジン緩衝液で数回洗浄した
。
最終精製をゲル濾過により達成した。ピペラジンペレットを、緩衝液20m1当
たり100■以上の沈殿物の濃度でランニング緩衝液(50mMのトリスMCI
、PH8,0、200mMのNaC1,2,5mMの[EDTA、1mMの2
−畦)に再懸濁した。その溶液を4℃で5時間ランニング緩衝液中において透析
し、そして遠心分離し、いづれかの残留物を除いた。次にその透析された溶液を
4、5 x 80cm (1270m1)の5ephadex S−200カラ
ム上に負荷した。
カラムを0.17m1/分でランニング緩衝液により溶離した。第X■因子のピ
ーク画分をプールした。
第1表は上記精製段階を要約する。収率は、胎盤第XI[T因子及びウサギポリ
クローナル抗体に対するマウスモノクローナル抗体を用いてサンドウィッチ酵素
結合免疫吸着アッセイ第1表
ELISAによる粗溶解物・・・480■の合計第X■因子ピペラジンpptで
の合計収率・・・65%例2:第X■因子の沈殿
上記精製された第X■因子を、約5.8■/m1.の濃度で50mMのトリス−
HCl 、 pH8,0、200mMのNaCl、 2.5 mMのE[lTA
、1mMの2−ME溶液に溶解した。その得られた溶液0.5mlアリコートを
ピペットで透析バッグに入れ、そして次の緩衝液において4℃で2日間透析した
:
50mMのMES (2−CN−モルホクツ〕エタンスルホン酸)、pH6,1
,
50mMのPIP (ピペラジン)、p)16.2.50mMのホスフェート、
p)16.0.50mMのADA(N−[2−アセトアミド〕−2−イミノニ酢
酸)、pH6,0、
50mMノビスートリス(ビス〔2−ヒドロキシエチル〕−イミノートリス〔ヒ
ドロキシメチルコメタン) 、pH6,1゜緩衝液は、Sigma Chemi
cal Co、、 St、 Louis、 MOから得られた。
透析の後、透析バッグの内容物を遠心分離し、そしてベレット及び上清液を、製
造業者により説明されているようにしてProtein As5ay Reag
ent 23200(Pierce Chemical Co、)を用いてBr
adfordの方法により第X■因子についてアッセイした。
第2表に要約される結果は、第X■因子がその等電点で又は等電点近くで種々の
緩衝液に不溶性であることを示す。
第2表
前記発明は、理解の目的のために例示的及び測的な手段によりいくらか詳細に記
載したが、本発明の範囲内で変更及び修飾を行なうことができることは明らかで
あろう。
上流精製 下流精製
下流精製 第xm因子
Fig、 1
国際調査報告
−PCT/US 89105190
国際調査報告
PCT/υ589105190
一一一一一′″″″−1°°−−□−“+Twp m訪i「−一1゜Tlw w
mMwnr m mm m m F−1嘴情1)ll1w r盲IF 114
+w〜Fwapavm P−慣□−” ” !−+wrh町−wawq m I
yn4v−1−側一一一一一一国際調査報告
PCT/US 89/n5190
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.生物学的流体から第XIII因子を精製するための方法であって: 第XIII因子を沈殿せしめるために生物学的流体のpHを約5.5〜6.5に 調整し;そして 沈殿せしめられた第XIII因子を回収することを含んで成る方法。 2.前記流体のpHを、低いイオン強度の複素環式ポリアミン又はホスフェート 緩衝液の使用により調節する請求の範囲第1項記載の方法。 3,前記低いイオン強度の複素環式ポリアミンを、ピペラジン、スペルミジン、 カダベリン及びそれらの誘導体から成る群から選択する請求の範囲第2項記載の 方法。 4.前記調整段階が、10〜100mMのピペラジンを含んで成る緩衝液(pH 6.0)において前記生物学的流体を透析することを含んで成る請求の範囲第1 項記載の方法。 5.回収された沈殿第XIII因子を洗浄することをさらに含んで成る請求の範 囲第1項記載の方法。 6.生物学的流体から第XIII因子を精製するための方法であって: 富化された画分を生成するために前記生物学的流体をアニオン交換クロマトグラ フィーにより分別し;第XIII因子を沈殿せしめるために前記富化された画分 のpHを約5.5〜6.5に調整し;そして 沈殿せしめられた第XIII因子を回収することを含んで成る方法。 7.溶液を生成するために前記回収された沈殿第XIII因子を溶解し; 第2富化画分を生成するために前記溶液をクロマトグラフィーにより分別し;そ して 前記第2富化画分を回収する追加の段階を含んで成る請求の範囲第6項記載の方 法。 8.前記富化された画分のpHを、低イオン強度の複素環式ポリアミン又はホス フェート緩衝液の使用により調整する請求の範囲第6項記載の方法。 9.前記低イオン強度の複素環式ポリアミンを、ピペラジン、スペルミジン、カ ダベリン及びそれらの誘導体から成る群から選択する請求の範囲第8項記載の方 法。 10.前記低イオン強度の複素環式ポリアミンがピペラジン又はその誘導体であ る請求の範囲第8項記載の方法。 11.前記調整段階が、10〜100mMのピペラジンを含んで成る緩衝液(p H6.0)において前記富化された画分を透析することを含んで成る請求の範囲 第6項記載の方法。 12.前記生物学的流体が清澄化された細胞溶解物である請求の範囲第6項記載 の方法。 13.前記清澄化された細胞溶解物が酵母細胞溶解物である請求の範囲第12項 記載の方法。 14.前記生物学的流体を: 清澄化された溶解物を生成するために細胞溶解物から粒状物質を除去し; 沈殿物を生成するために前記清澄化された溶解物に沈殿剤を添加し;そして 生物学的流体を形成するために適切な緩衝液に前記沈殿物を再懸濁することによ って細胞溶解物から調製する請求の範囲第6項記載の方法。 15.前記沈殿剤の添加段階が、約30%〜40%の飽和にするために硫酸アン モニウムを添加し、又は約6%〜17%(重量)の濃度にするためにポリエチレ ングリコールを添加することを含んで成る請求の範囲第14項記載の方法。 16.前記分別段階がDEAEアニオン交換媒体上でのクロマトグラフィー処理 を含んで成る請求の範囲第6項記載の方法。 17.前記クロマトグラフィーによる溶液の分別段階が、ゲル濾過クロマトグラ フィー媒体上での溶液の濾過を含んで成る請求の範囲第7項記載の方法。 18.生物学的流体から第XIII因子を精製するための方法であって: 沈殿物を生成するために生物学的流体に硫酸アンモニウムを約30%〜約40% の飽和度で添加し;前記沈殿物を低イオン強度の弱アルカリ緩衝液に再懸濁し; 富化された画分を生成するために前記再懸濁された沈殿物をアニオン交換クロマ トグラフィーにより分別し;第XIII因子を沈殿せしめるために前記富化され た画分のpHをピペラジン緩衝液により約5.5〜6.5に調整し;前記沈殿せ しめられた第XIII因子を回収し;溶液を生成するために前記沈殿せしめられ た第XIII因子を溶解し; 第2富化画分を生成するために前記溶液をサイズ排除クロマトグラフィーにより 分別し;そして 前記第2富化画分を回収することを含んで成る方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US270,714 | 1988-11-14 | ||
US07/270,714 US5204447A (en) | 1988-11-14 | 1988-11-14 | Purification of factor xiii |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04502106A true JPH04502106A (ja) | 1992-04-16 |
Family
ID=23032486
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2500450A Pending JPH04502106A (ja) | 1988-11-14 | 1989-11-14 | 第x3因子の精製 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5204447A (ja) |
EP (1) | EP0442964A1 (ja) |
JP (1) | JPH04502106A (ja) |
KR (1) | KR900702011A (ja) |
AU (1) | AU639218B2 (ja) |
CA (1) | CA2002962A1 (ja) |
DK (1) | DK91191A (ja) |
FI (1) | FI912322A0 (ja) |
WO (1) | WO1990005777A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5612456A (en) * | 1988-11-14 | 1997-03-18 | Zymogenetics, Inc. | Factor XIII compositions |
AU2478292A (en) * | 1991-08-07 | 1993-03-02 | Zymogenetics Inc. | Purification of factor xiii |
WO1993012813A1 (en) * | 1991-12-31 | 1993-07-08 | Zymogenetics, Inc. | Methods and compositions for reducing blood loss |
US5618684A (en) * | 1992-02-07 | 1997-04-08 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Method of determination of calcium |
US5463029A (en) * | 1992-11-23 | 1995-10-31 | Immunex Corporation | Purification of fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
US5639940A (en) | 1994-03-03 | 1997-06-17 | Pharmaceutical Proteins Ltd. | Production of fibrinogen in transgenic animals |
US5609631A (en) * | 1995-04-28 | 1997-03-11 | Rubens; Fraser D. | Fibrin D-domain multimer coated prostheses and methods for their production |
JPH08333277A (ja) * | 1995-06-05 | 1996-12-17 | Hoechst Japan Ltd | ヒト血液凝固第xiii因子の安定化された水性液製剤 |
WO2001089584A2 (en) * | 2000-05-23 | 2001-11-29 | Amersham Health As | Contrast agents |
WO2006021584A2 (en) * | 2004-08-27 | 2006-03-02 | Novo Nordisk Health Care Ag | Purification of factor xiii polypeptides from biological materials |
US8461302B2 (en) * | 2004-11-23 | 2013-06-11 | Zymogenetics, Inc. | Purification of recombinant human factor XIII |
CN110314414B (zh) * | 2019-07-23 | 2021-10-19 | 宝锐生物科技泰州有限公司 | 凝血因子xiii的分离纯化方法及其应用 |
KR20230121373A (ko) * | 2022-02-11 | 2023-08-18 | 주식회사 녹십자 | 인자 xiii의 정제방법 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3904751A (en) * | 1970-12-22 | 1975-09-09 | Behringwerke Ag | Process for isolating a fibrin stabilizing factor from human placenta |
US3931399A (en) * | 1970-12-22 | 1976-01-06 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Process for isolating a fibrin-stabilizing factor |
FR2254316B1 (ja) * | 1973-12-18 | 1977-04-22 | Choay Sa | |
JPS6029687B2 (ja) * | 1978-11-07 | 1985-07-12 | 株式会社ミドリ十字 | ヒト胎盤由来血液凝固第103因子の濃縮液の製造方法 |
JPS6035119B2 (ja) * | 1982-06-11 | 1985-08-13 | 株式会社 ヤトロン | 血漿中のx3因子を測定する方法 |
DE3419581A1 (de) * | 1984-05-25 | 1985-11-28 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur gewinnung einer faktor xiii-praeparation sowie ihre verwendung |
DE3621371A1 (de) * | 1986-03-12 | 1987-09-17 | Behringwerke Ag | Gentechnische herstellung von faktor xiiia |
DE3751269T2 (de) * | 1986-09-19 | 1995-09-14 | Univ Washington | Expression des biologisch aktiven Faktors XIII. |
-
1988
- 1988-11-14 US US07/270,714 patent/US5204447A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-11-14 WO PCT/US1989/005190 patent/WO1990005777A1/en not_active Application Discontinuation
- 1989-11-14 AU AU46501/89A patent/AU639218B2/en not_active Ceased
- 1989-11-14 JP JP2500450A patent/JPH04502106A/ja active Pending
- 1989-11-14 EP EP90900485A patent/EP0442964A1/en not_active Withdrawn
- 1989-11-14 CA CA002002962A patent/CA2002962A1/en not_active Abandoned
- 1989-11-14 KR KR1019900701505A patent/KR900702011A/ko not_active Application Discontinuation
-
1991
- 1991-05-13 FI FI912322A patent/FI912322A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1991-05-14 DK DK091191A patent/DK91191A/da unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK91191D0 (da) | 1991-05-14 |
FI912322A0 (fi) | 1991-05-13 |
CA2002962A1 (en) | 1990-05-14 |
AU639218B2 (en) | 1993-07-22 |
WO1990005777A1 (en) | 1990-05-31 |
KR900702011A (ko) | 1990-12-05 |
AU4650189A (en) | 1990-06-12 |
DK91191A (da) | 1991-07-12 |
US5204447A (en) | 1993-04-20 |
EP0442964A1 (en) | 1991-08-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7879331B2 (en) | Ultra-high yield intravenous immune globulin preparation | |
JPH04502106A (ja) | 第x3因子の精製 | |
CA1202566A (en) | Separation of plasma proteins from cell culture systems | |
JP2644946B2 (ja) | IgG− モノクロナール抗体の精製方法及びその使用方法 | |
AU2006287833B2 (en) | An ultra-high yield intravenous immune globulin preparation | |
US5612456A (en) | Factor XIII compositions | |
JPH04243899A (ja) | 第viii因子の精製およびこの方法で得られた第viii因子 | |
US6815535B1 (en) | Purification of fibrinogen | |
SE452250C (sv) | Sätt att framställa ett koncentrat av protrombinkomplex | |
Ng et al. | Pasteurization of antihemophilic factor and model virus inactivation studies | |
NZ518692A (en) | Purified fibrinogen free of destabilising levels of plasminogen and other proteases obtained from a Fraction I paste | |
US4977246A (en) | High recovery process for antihemophilic factor | |
EP0603215B1 (en) | Purification of factor xiii | |
JPH05504960A (ja) | 内皮細胞の増殖抑制剤 | |
Ferro et al. | Adenosine triphosphate: nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase of pig liver: Purification and properties | |
US20100120120A1 (en) | Haemocoagulase | |
US8461302B2 (en) | Purification of recombinant human factor XIII | |
EP0302459A2 (en) | Human placenta-derived thermostable cell growth factor and a process for production thereof | |
JPH07508009A (ja) | クリングル含有タンパク質及び特にt−PAの精製 | |
CZ287035B6 (en) | Process for preparing soluble recombinant proteins from bacterial cells | |
RU1829938C (ru) | Способ очистки гамма-глобулина дл внутривенного введени | |
JPH06105683A (ja) | 第xiii因子の精製方法 | |
AU761987B2 (en) | Purification of fibrinogen | |
GB2163751A (en) | Human insulin-like growth factor II | |
JPH03106824A (ja) | 血液凝固第x3因子の加熱処理方法 |