JPH04502106A - 第ｘ３因子の精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般的にタンパク質精製の方法及びより詳しくは種々の生物学的流体 からの第Ｘ■因子の精製方法に関する。

発明の背景 第Ｘ■因子（フィブリン安定化因子、フィブリノリガーゼ又は血漿トランスグル タミナーゼとしても知られている）は、フィブリノーゲンと複合体化されたチモ ーゲン（Ｍｒ＝〜３２０ＫＤ）として血液中を循環する血漿糖タンパク質である （Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｓｈｕｍａｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ 、２５７：　６０９６〜６１０１゜１９８２）。血漿第Ｘ■因子チモーゲンは、 ａ２ｂ２として命名された全体構造を有する２種のａサブユニッ）（Ｍｒ＝〜７ ５ＫＯ）及び２種のｂサブユニッ）（Ｍｒ＝〜８０ＫＯ）から成るテトラマーで ある（Ｃｈｕｎｇなど、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２４９：　９４（１〜 ９５０、１９７４）。ａサブユニットは酵素の触媒部位を含み、そしてｂサブユ ニットはａサブユニットを安定化し又は第Ｘ■因子の活性化を調節するように思 われる（Ｆｏｌｋ　ａｎｄ　Ｆｉｒｌａｙｓｏｎ。

前記；　Ｌｏｒａｎｄなど、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ ｍｍ、５６：９１４〜９２２．１９７４）。ａ及びｂサブユニットのアミノ酸配 列は既知である（Ｉｃｈｉｎｏｓｅなど、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５ 　：　６９００〜６９０６、　１９８６　；　Ｉｃｈｉｎｏｓｅなど、、Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５　：　４６３３〜４６３８、１９８６）。第ｘｍ因子 に、ａ２ホモダイマーとして胎盤に生じる。

インビボで活性化されて第Ｘ■因子（第ＸＩＩＩａ因子）は他のタンパク質分子 間の架橋反応を触媒する。血液凝固の最終段階の間、トロンビンが第Ｘ■因子チ モーゲンを中間体形（ａ’　ｚｂｚ）に転換し、次にこれは第ＸＩＩＩａ因子、 すなわちａ′サブユニットのホモダイマーを生成するためにカルシウムイオンの 存在下で解離する。胎盤第Ｘ■因子はトロンビンによる分解に基づいて活性化さ れる。第ＸＩ［Ｉａ因子は、分子間（ε（γ−グルタミル）　リシン結合の形成 によりフィブリンポリマーの架橋を触媒するトランスグルタミナーゼであり、そ れによってクロット強度を高める（Ｃｈｅｎ　ａｎｄ口ｏｏｌ　１ｔｔｌｅ。

１９７２）。この架橋反応は、カルシウムイオンの存在を要する（ｌｏｒａｎｄ など、、　Ｐｒｏｇ、　Ｈｅｍｏｓｔ、　Ｔｈｒｏｍｂ、　５：　２４５〜２９ ０゜１９８０；Ｆｏｌｋ　ａｎｄ　Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ、　Ａｄｖ、　Ｐｒｏｔ 、Ｃｈｅｍ、３１：　１〜１３３、１９７７）。第Ｘｍａ因子はまた、α２−プ ラスミンインヒビタ−及びフィブロネクチンへのフィブリンのγ鎮の架橋及びコ ラーゲン及びフィブロネクチン（傷の治療に関係する）の架橋を触媒する（Ｓａ ｋａｔａ　ａｎｄ　Ａｏｋｉ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ。

６５：　２９０〜２９７．１９８０　；　Ｍｏ５ｈｅｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｍ、２５０：６６１４〜６６２１．１９７５；　Ｍｏ５ｈｅｒ　ａｎｄ　 Ｃｈａｄ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ。

６４：　７ｇ１〜？８７．１９７９　；　Ｆｏｌｋ　ａｎｄ　Ｐｉｎｌａｙｓｏ ｎ、前記；Ｌｏｒａｎｄなど、、　前記）。フィブリンネットワーク中へのα２ −プラスミンインヒビタ−の共有的導入は、溶解するりＬ１ットの耐性を高める ことができる（Ｌｏｒａｎｄなと、、　前記）。

第Ｘ■因子の欠失は、“遅められた出血”をもたらすが、しかし初期の止血には 影響を与えない（Ｌｏｒａｎ＋ｉなど、、　前記）。

第Ｘ■因子欠失症の患者のための現在の処置は、血漿又は血漿透導体による又は 粗胎盤第Ｘ■因子濃縮物による置換治療を包含する（Ｌｏｒａｎｄなど１．　前 記：　Ｆｒｏｂｉｓｃｈなど、、　Ｄｔｓｃｈ。

第ＸｌＴｌ因子はまた、手術後の傷の治癒における疾患潰瘍性大腸炎（Ｓｕｚｕ ｋｉ　ａｎｄ　Ｔａｋａｍｕｒａ、　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ。

（う８　：　５０９．１９８７）、偽膜性結膜炎（Ｋｕｒａｔｓｕｊｉなど、、 　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓｌｌ：　２２９〜２３４．１９８２＞を有する患者の 処置及びクモ膜下出血を有する患者における再出血の予防（Ｈｅｎｚｅなど、。

Ｔｈｒｏｍｂ。

１１ａｅｍｏｓｔａｓ、　５８　：　５１３．１．９８７）に有用である。さら に、第ｘｍ因子は組織接着剤の成分と１−ても使用されて来たくアメリカ特許第 ４．４１．４．９７６号；第４．４５３．９３９号：第４．３７７、５７２号： 第４、３６２．５６７号；第４．２９８．５９８号；第４．２６５．２３３号及 びイギリス特許第２１０２８１１Ａ号）。

第Ｘ■因子のための多くの精製スヶムが記載されて来た。

Ｃｈｕｎｇ　ａｎｄ　Ｆｏｌｋ　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４７　：　２ ７９８〜２８０７．　１９７２）は、血小板濃縮血漿又はフィブリノーゲン調製 物から第Ｘ■。　因子を調製した。Ｃｏｏｋ　ａｎｄ　Ｈｏｌｂｒｏｏｋ（Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１４１　：　７９〜８４．１９７４）は、Ｃｏｈｎ　−Ｉ 画分からの第ＸＩ因子の精製を記載する。その方法は、複数の硫酸アンモニウム 沈澱段階及びＤＥＡＲセルロース上での分別を包含する。Ｌｏｅｗｙなど、（Ｊ 。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　３２６　：　２６２５〜２６３３．１９６１）は、血 漿から第ｘｍ因子を精製するために硫酸アンモニウム分別及びＤＥＡＥセ）Ｌｔ 　。

−スクロマトグラフィーを用いた。５ｋｒｚｙｎｉａなど、（Ｂｌｏｏｄ６０　 ：　１０８９〜１０９５．１９８５）は、り０マドグラフイー処理及び硫酸ナン モニウム沈澱により胎盤濃縮物から第Ｘ■因子のａサブユニットを精製した。Ｚ ｗｉｓｌｅｒなど、（アメリカ特許第３、９０４．７５１号）及びＢｏｈｎなど 、（アメリカ特許第３，９３１．３９９号）は、第ＸｌＴｌ因子を沈澱せしめる ためにジアミノ−エトキシ−アクリジンラクテートの使用に基づく複数段階単離 方法を記載する。この沈澱剤は、治療組成物に許容されない汚染物で３　ある。

Ｆａｉｋ　（アメリカ特許第４．５９７．８９９号）は、アルコール沈澱法によ る胎盤の抽出物からの第Ｘ■因子の単離を記載する。

第Ｘ■因子を精製するための前記方法の多くは、血漿、血清又はそれらの画分か らそれを単離するのに向けられて来た。

これらの出発材料は第Ｘ■因子のためにすでに富化されており、そして汚染性タ ンパク質は一般的に十分に特徴づけられており、そして既知の方法により除去で きる。結果的に、これらの精製スクムは、他のより不均質な出発材料、特に粗細 胞溶解物（ここで汚染性クンバク質分解活性が高い）から第Ｘ■因子を調製する こまに完全には適合しないっさらに、これらの方法の多くは、実験規模の精製の ために開発され、そして第ＸｌＴｌ因子の治療的な量の経済的な調製のためには 困難である。

従って、第Ｘ■因子を精製するための単純且つ経済的な方法のための必要性が当 業界において存在する。そのような方法は、粗出発材料、たとえば組換え細胞の 溶解物から大規模な生成に有用であるべきである。本発明は、他の関連する利点 を伴って、そのような方法を提供する。

本発明は生物学的流体から第Ｘ■因子を精製するための方法を提供し、前記方法 は、第ｘｍ因子を沈澱せしめるために流体のｐ）Ｉを約５．５〜６．５に調節し 、そし７て続いてその沈澱せしめられた第ＸｌＴｌ因子を回収することを含んで 成る。流体のｐｆｌは好ましくは、低いイオン強度の生物学的緩衝液、たとえば 複素環式ポリアミン又はホスフェート緩衝液の使用により調節される。適切な低 いイオン強度の複素環式ポリアミンは、ピペラジン、スペルミジン、カダベリン 及びそれらの誘導体を包含する。１つの態様において、第ＸＨＩ因子は、１０〜 １００ｍＭのピペラジンを含む緩衝液（ｐＨ６，０）において生物学的流体を透 析することによって沈澱せしめられる。

本発明の関連する観点は、生物学的流体から第ＸＵＩ因子を精製するための方法 を提供し、前記方法は、（ａ）富化された両分を生成するためにアニオン交換ク ロマトグラフィーにより生物学的流体を分別し；　（ｂ）’ＪＸＩＨ因子を沈澱 せしめるためにその富化された両分のＰＨを約５．５〜６．５に調節し；そして （ｃ）沈澱せしめられた第ＸｌＴｌ因子を回収する段階を含んで成る。

この方法は、溶液を生成するために回収された沈＃第Ｘ■因子の溶解、第２の富 化された両分を生成するために前記溶液をクロマトグラフィー処理により分別し 、そして前記第２の富化された両分を回収する追加の段階を包含する。１つの態 様において、生物学的流体は、清澄化細胞溶解物、たきえは清澄化酵母細胞溶解 物である。生物学的流体は、清澄化溶解物を生成するために細胞溶解物から粒状 物質を除去し、沈殿物を生成するために前記清澄化溶解物に沈殿剤を添加し、た とえば約３０％〜４０％の飽和のために硫酸アンモニウムを添加し又は約６〜１ ７重量％の濃度のためにポリエチレングリコールを添加し７、そして適切な緩衝 液にその沈殿物を再懸濁することによって調製され得る。

本発明の他の観点は、次の詳細な記載及び添付図面から明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 第１図は、酵母細胞からの組換え第Ｘ■因子の精製を要約するフローチャートで ある。

第２図は、流れの早いＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｄｅｘからの第ｘｍ因子の典型的な 溶離プロフィールを示す。バーは、続くピペラジン沈殿のためにプールされる両 分を示す。

本発明を実施するための最良の態様 本発明を示す前に、この後に使用される特定の用語を定義することは、その理解 のために有益である。

第Ｘ■因子：用語“第Ｘ■因子”とは、完全な第Ｘ■因子チモーゲンテトラマー 、ａ’　、ｂ、中間体及び第ＸＩＩＩａ因子、並びにそれらのサブユニット、た とえばａサブユニット、ａ′サブユニット及びａ２ダイマーを包含する。

生物学的流体：細胞、細胞成分又は細胞生成物に起因する又は含むいづれかの流 体。生物学的流体は細胞培養上清液、細胞溶解物、清澄化細胞溶解物、細胞抽出 物、組織抽出物、血液、血漿、血清及びそれらの両分を包含するが、但しこれだ けには限定されない。

沈殿剤：溶液に添加される場合、溶液からの他の化合物の沈殿を引き起こす化合 物。沈殿は、沈殿剤と他の化合物との間の複合体の形成又は不溶性をもたらす相 変化による。沈殿剤は、有機変性剤、たとえばエタノール、プロパツール、ポリ エチレングリコール及び塩、たとえば硫酸アンモニウムを適切な変化を妨げる物 質。緩衝液は一般的に、弱酸又は弱塩基のプロトン−供与体及びプロトン−受容 体形の組合せを含んで成る。緩衝化された溶液への少量の酸又は塩基の添加は、 プロトン供与体及びプロトン受容体の間の平衡を変える。この平衡シフトはｐＨ を安定化する。

本発明は、種々の生物学的流体から第Ｘ■因子を精製する方法を提供する。適切 な生物学的流体は、天然において第Ｘ■因子を回収可能な量で生成する細胞、た とえば胎盤細胞の溶解物又は抽出物、及び血液及び血液画分を包含する。そのよ うな細胞及び組織の溶解物及び抽出物は、当業者に知られている種々の方法によ り調製され得る。しかしながら、血液及び組織のウィルス汚染の危険性のために 、第Ｘ■因子を生成するために遺伝的に変性されたウィルスを含まない細胞又は 細胞系に起因する流体が好ましい源である。これに関する特に好ましい生物学的 流体は、第Ｘ■因子を生成するために形質転換された酵母細胞の溶解物及び清澄 化溶解物を包含し、ここでクローン化されたＤＮＡ配列を発現することができる いづれの細胞タイプでも使用され得る。

本発明内においては、第Ｘ■因子がその等電点（すなわち約５．８）で又はその 近くでｐＨを有する低いイオン強度の溶液に不溶性であることが見出されており 、ここで沈殿剤を必要としないで溶液から第Ｘ■因子の分離を可能にする。従っ て、本発明によれば、第ＸＩＩＩ因子は、沈殿物を形成するためにたとえば緩衝 液交換により流体のｐＨを約５．５〜６．５に調整することによってその生物学 的流体から単離される。沈殿物は、使用の前、さらに精製され、又はたとえば組 織接着剤の調製物に直接使用され得る。沈殿のための好ましい緩衝液は、所望す るｐＨに調整される、複素環式ポリアミン、たきえばピペラジン、スペルミジン 、カダベリン及びそれらの誘導体の低イオン強度溶液を包含する。ピペラジン及 びピペラジン誘導体、たとえば硫酸ピペラジンが特に好ましい。他の適切な緩衝 液は、ＭＥＳ、リン酸塩、ＡＤＡ及びビス−）　ＩＪスを含む、ｐＨ６，０のま わりの有用なｐＨ範囲を有する生物学的緩衝液を包含する。緩衝液は一般的に、 約１０ｍＭ〜１００ｍＭ　、好ましくは約５０ｍＭの濃度で使用されるであろう 。緩衝液は、商業的供給者、たとえばＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、 　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯから得られる。

本明細書に使用される場合、用語“低イオン強度”とは、約１５０ｍ５　（約２ ００ｍＭのＮａＣＩに等しい）以下の電導度を有する溶液を包含する。

上記のように、組換え細胞及び細胞系が第Ｘ■因子の好ましい源である。組換え 細胞、たとえば細菌、酵母及び培養された哺乳類細胞における第Ｘ■因子の生成 は、Ｇｒｕｎｄｍａｎｎなど（オーストラリア特許出願第６９８９６／８７号） 及び口ａｖｉｅなど（アメリカ特許出願第１７４．２８７号；ＥＰ第２６８．７ ７２号）（これらは引用により本明細書に組込まれる）により記載されている。

クローン化されたＤＮＡ配列を発現するための方法は当業界において良く知られ ている。手短に言えば、第Ｘ■因子をコードするＤＮＡ配列が適切なプロモータ ー及びターミネータ−配列に操作可能的に連結され、そしてこの発現単位が選択 された宿主細胞と適合するベクター中に挿入される。

次に前記ベクターが宿主細胞中に挿入され、そして得られた組換え細胞が培養さ れ、第Ｘ■因子が生成される。使用される特定の宿主細胞及び発現単位に依存し て、第Ｘ■因子は細胞から分泌され又は細胞質に保持され得る。

第Ｘ■因子を分泌しない細胞を使用する場合、細胞は、培養培地から除去され（ たとえば遠心分離により）、そして溶解物を生成するために処理される。典型的 には、酵母細胞は、粗溶解物を生成するために、ガラスピーズを用いて機械的破 壊により処理される。好ましくは、粗溶解物は低速度（たとえば２．０ＯＯＸ　 ｇ　）で遠心分離され、そして上清液画分が回収される。ストレプトマイシンス ルフェート　（２％）が添加され、そしてその上清液が高速度遠心分離（たとえ ば２０．０００〜３０、０００ｘ　ｇ　）により清澄化溶解物を生成するために 処理される。次にその得られた清澄化溶解物が富化され、そして分別され、その 後、緩衝液交換により第Ｘ■因子を沈殿せしめることができる。富化のための適 切な方法は、硫酸アンモニウムの添加により約３０〜４０％、好ましくは約３５ ％の飽和にすることにより、又はポリエチレングリコールの添加により約６％〜 １７％、好ましくは約６％〜１２％（重量）にすることによりその清澄化溶解物 を処理することを包含する。次にその混合物は、沈殿物を生成するために、約３ ０分〜３時間インキュベートされる。１つの態様においては、医薬品種のポリエ チレングリコール（４０００〜ｇｏｏｏの分子量）が８重量％添加され、そして その溶液が４℃で１時間インキュベートされる。当業者に明らかなように、時間 、温度及び沈殿剤の濃度は相互関係し、そして従って変えられ得る。次に得られ た沈殿物が、典型的には遠心分離により回収され、そして低いイオン強度の弱ア ルカリ緩衝液に再懸濁される。好ましくは緩衝液はプロチアーゼインヒビター、 たとえばフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ロイペプシン又は ペプスタチンを含む。

これに関する特に好ましい緩衝液は、５ｍＭのＮａＪＤＴＡ　、　５　ｍＭの２ −メルカプトエタノール及び０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む５０ｍＭのトリス−Ｈ Ｃｌ　（ｐＨ７，５）である。硫酸アンモニウム沈殿法を用いる場合、さらに精 製する前、たとえば透析により再懸濁された沈殿物における塩濃度を低める必要 がある。次にその得られた生物学的流体が下記に示されるように分別される。

第Ｘ■因子はまた、培養培地中にそれを分泌する細胞から得られる。一般的に、 細胞は遠心分離により除かれ、そして培地が下記のようにして分別される。他方 、培養培地が、たとえば上記沈殿法により第Ｘ■因子のために富化され、そして 続いて再懸濁された沈殿物が分別される。

タンパク質の複雑な混合物を含む生物学的流体により作業する場合、富化された 両分を生成するためにアニオン交換クロマトグラフィーにより生物学的流体を分 別することが一般的に好ましいであろう。次に、第Ｘ■因子が緩衝液交換により その得られた富化画分から沈殿せしめられる。典型的には、生物学的流体はアニ オン交換媒体のカラム上に通され、そして充填緩衝液よりも低い少なくとも約０ ．５　ｐＨ単位での緩衝液における狭い塩グラジェントを用いて溶離される。好 ましい溶離手段は、５０ｍＭのイミダゾール（ｐ）ｔ６．３　）における０〜１ ５０ｍＭのＮａＣｌグラジェントを用いる。適切なアニオン交換培地は、誘導体 化された５ｅｐｈａｄｅｘ（Ｐｈａｒｎａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ。

ＮＪ）　、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカ、等を含む。ＰＥＩ、 　ＤＥＡＲ及びＱＡＥ誘導体が好ましく、モしてＤＥＡＩＥの早い流速５ｅｐｈ ａｄｅｘが特に好ましい。当業者に明らかなように、分別はバッチ工程で行なわ れ得る。ピーク画分は、第Ｘ■因子の続く精製のためにプールされる。この段階 では、そのプールされた画分の体積を濃縮により減じることが一般的に好ましい 。好ましい濃縮の方法は、７０％飽和（ＮＨ，）　２Ｓｏ４による第Ｘ■因子の 沈殿である。

次に第ＸＩ因子は、上記のように第Ｘ■因子調製物のｐＨを調整することによっ て沈殿せしめられる。好ましい態様においては、上記のようにして硫酸アンモニ ウム沈殿法により調製された富化された両分が、５ｍＭのＥＤＴＡ、　５　ｍＭ の２−メルカプトエタノール（２−吐）　、０．０２％のＮａＮ、を含む、ＩＩ ｃＩにより６．０にｐＨ調整された５０ｍＭのピペラジン溶液に４″Ｃで溶解さ れ、そして４℃で５時間、同じ緩衝液に対して透析し、沈殿物が生成される。沈 殿物は遠心分離により回収され、そして新しいピペラジン緩衝液中で数回洗浄さ れる。この点で、第Ｘ■因子調製物は典型的には約９８％の純度である。他の生 物学的流体からの第Ｘ■因子の沈殿は、実質的には同じ方法で、すなわち沈殿物 を生成するために沈殿緩衝液に対してその流体を透析することによって行なわれ るであろう。

追加の精製は、沈殿せしめられた第Ｘ１ｌＮ因子を、約７．４〜８．０のｐｉｔ での低いイオン強度の緩衝液、たとえば５０ｍＭのトリス（ｐＨ７，５）　、５ ０ｍＭのＮａＣｌ又は５０ｍＭのグリシン（ｐＨ７，５）、５０ｍＭのＮａＣ１ に溶解し、そしてｐＨ５，５〜６．５で沈殿の段階をくり返すことによって得ら れる。次にこの調製物が回収され、そして直接使用するために適切な緩衝液に再 ！！！濁され、又は下記のようにしてさらに精製される。

所望には、最終精製は、従来の化学分離技法、たとえばイオン交換クロマトグラ フィー、サイズ排除クロマトグラフィー、等の使用により達成される。多くの場 合、調製物から残留プロテアーゼを除くことが所望されるであろう。１つの態様 においては、これは、わずかにアルカリ性のｐＨでの低イオン強度の緩衝液、た とえば５０ｍＭのトリス、ｐＨ８，０又は５０ｍＭのイミダゾール、ｐ）１８． ０　（２００ｍＭのＮａＣｌを含む）に沈殿せしめられた第ＸＩＩＩ因子を溶解 し、溶液を生成し、次にその溶液をサイズ排除クロマトグラフィーにより分別す ることによって達成される。これに関する適切なりロマトグラフィー媒体は、架 橋されたデキストラン、ポリアクリルアミド及び親水性コーチング又は結合され た相を有する特殊シリカを包含する。

５ｅｐｈａｃ！ｅｘ　Ｓ−２００（５−２００（Ｐｈａｒが特に好ましいデキス トラン基礎媒体である。好ましい態様においては、ピペラジン沈殿物が５０ｍＭ のトリス−１１ｃ１．　ｐＨ８，０、２００ｍＭのＮａＣｌ、２．５　ｍＭのＥ ＤＴＡ、１ｍＭの２−メルカプトエタノールに再溶解される。その溶液は遠心分 離され、不溶性残留物が除去され、そして上清液が５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｓ−２０ ０カラム上で分別される。ピーク画分がプールされ、そして適切な貯蔵用緩衝液 に対して透析される。

この方法で調製された第ＸＩＩＩ因子は典型的には、９９％以上の純度であり、 ぞして発熱物質を含まない。

本発明の方法により調製された第ＸＩＩＩ因子は、当業者に既知の方法により医 薬製剤、たとえば組織接着剤を調製するために使用され得る。そのような製剤は 、たとえばアメリカ特許第４．２６５．２３３号及び公開されてオーストラリア 特許出願第７５０９７／８７号（これらは引用により本明細書に組込まれる）に 記載される。

次の例は例示目的のためであって、制限目的のためではない。

餞 例１：ピペラジン緩衝液を用いての第Ｘ■因子の精製Ａ９発酵及び上流処理 組換え酵母細胞から第Ｘ■因子を精製するための典型的な方法を、第１図に要約 する。手短に言えば、細胞を収穫し、溶解し、そしてその溶解物を清澄化する。

次にその清澄化された溶解物を濃縮し、そしてクロマトグラフィーにより分別す る。第Ｘ■因子を、ピペラジンを用いて第Ｘ■因子含有画分から沈殿せしめ、そ して最終精製段階を用いて微量の汚染物を除去する。

現単位を含むベクター（ｐＤ１６）により形質転換した。その形質転換された細 胞を約０．１ｇ／βで接種し、そして２５ｇ／βの酵母抽出物、２２．５　ｇ　 ／βの（ＮＨ４）２Ｓｏ、　、６．５　ｇ／　Ｉ！のＫＨ２ＰＯ，，３ｇ／ｊ１ ７のＭｇ５（Ｊ　ｇ及び０．５％のグルコースを含むｐＨ５，５の培地において ０〜２４又は４０時間グルコース供給物と共に及び０〜１２又は２０時間エタノ ール供給物と共に培養した。

その培養物（１０〜６０１）を３０℃で増殖せしめ、約６０ｇ／１２の最終細胞 密度にした。

細胞培養物を、０．２μのセルロースエステル中空繊維カートリッジ（Ｍｉｃｒ ｏｇｏｎ、　Ｌａｇｕｎａ　）ｆｉｌｌｓ、　ＣＡ）を用いいての濃縮により収 穫した。その最終濃縮物は、典型的には、脱イオン水中に酵母細胞６００〜３０ ０ｇ湿量（５０湿量％以上の濃度）を含んだ。

次に、濃縮された細胞を溶解した。最大４００ｇ　（湿量）の細胞を、溶解緩衝 液（５０ｍＭのトリスＨ（１’ｌ　、ｐ）１７．４．１５０ｍＭのＮａＣ１，１ ５ｍＭのＥＤＴＡ、　５　ｍＭの２−ＭＥ、１ｍＭのＰＭＳＦ）に希釈し、４０ 湿量％にした。細胞を、Ｄｙｎｏｍｉｌｌ（Ｇｌｅｎ　Ｍｉｌｌｓ、　Ｉｎｃ、 。

Ｍａｙｗｏｏｄ、　Ｎｊ）を用いて連続した流れの態様で溶解した。細胞懸濁液 を０．６ｆｆｉの容器中で酸洗浄された５００μのガラスピーズ０．５１と共に 混合し、そして６０〜１００　Ｗ１１／分の流速を用いて３００ｒｐｍで溶解し 、３〜５分の平均滞留時間を得た。追加の１１の緩衝液をその容器を通してポン プで送った。

次に溶解物を遠心分離により清澄化した。溶解物の１１ボトルをトロ００Ａロー ターを有する５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−３Ｂ遠心分離機により５０００ｒρｍで４ ５分間遠心分離し、そしてベレットを捨てた。

次に、上清液画分を、ＰＭＳＦを添加し、１．ｍＭの最終濃度にし、そして７％ のストレプトマイシンスルフェート０．３体積を添加することにより条件つけし た。次にその混合物を４℃で１２時間放置した。最終清澄化を、Ｇ５−３０−タ ーを用いて７５００ｒｐｍで９０分間５００−ボトルを用いて及び／又はＧＳＡ ローターを用いて１２．　ＯＯＯｒｐｍで６０分間２５０ｒｄのボトルを用いて ５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−５Ｂ遠心分離機により遠心分離することによって達成し た。次にその得られた清澄化溶解物を下流処理のために用意した。

Ｂ、下流処理 清澄化された溶解物を、ポリエチレングリコール１０００　（ＰＥＧ−１０００ ）の添加により１２％の最終濃度にすることにより又はＰＥＧ　−８０００の添 加により８％の最終濃度にすることにより分別した。その混合物を４℃で１時間 インキュベートし、次に５ｏｒｖａｌｌ　ＧＳ　−３０−ターを用いて７５００ ｒｐｍで９０分間５００−のボトルを用いて及び／又はＧＳＡローターを用いて １２．００Ｏｒｐｍで６０分間２５０ｍｊｌ！のボトルを用いて遠心分離した。

沈殿物を回収した。

ＰＥＧ沈殿物を、出発緩衝液（５０ｍＭのトリス−）１ｃ’ｌ　、ｐＨ７，８， ５ｍＭのＥＤＴＡ、５ＩＴＩＭの２−ＭＢ、０．５　ｍＭのＰＭＳＰ）に溶解し 、そしてその得られた溶液をＤＥＡＥの早い流れのＳｅｐｈａｄｅｘ（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）上に負荷した。カラムを１１の出発緩衝液により洗浄し、そして第 Ｘ■因子を、緩衝液Ａ　（５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ６，３，５＋ｎＭのＥ ＤＴＡ、　５　ｍＭの２−ＭＥ）及び緩衝液Ｂ（１５０ｍＭのＮａＣ１を含む緩 衝液Ａ）のそれぞれ１βの線状グラジェントを用いて溶離した。典型的な溶離プ ロフィールは第２図に示される。両分を、Ｎ、Ｎ−ジメチルカゼインへの３Ｈ− ヒスタミンの導入を測定することにより又は酸素結合免疫吸着アッセイによりア ッセイした。プールされた第Ｘ■因子含有画分を、（Ｎ）１．）２ＳＯ，の添加 により、７０％の飽和にすることにより沈殿せしめた。

次に第Ｘ■因子をピペラジン緩衝液を用いて沈殿せしめた。

（ＮＨ４）、ＳＯ，混合物を遠心分離し、そして上清液画分を捨てた。

ベレットを５０−〇トリス、ｐＨ８，０，２００ｍＭのＮａＣｌ、　２．５　ｍ ＭのＥＤＴＡ、１ｍＭの２−ＭＥ溶液に溶解し、そして５０ｍＭのピペラジン、 ｐＨ６，０，５ｍＭのＥＯＴＡ、　５　ｍＭの２−肝、０．０２％のＮａＮ　３ 溶液において４℃で約５〜１２時間透析した。次にその混合物を５Ｓ−３４０− ターを用いて５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−５Ｂ遠心分離機で５０００ｒｐｍで５分間 遠心分離した。その得られたペレットを新しいピペラジン緩衝液で数回洗浄した 。

最終精製をゲル濾過により達成した。ピペラジンペレットを、緩衝液２０ｍ１当 たり１００■以上の沈殿物の濃度でランニング緩衝液（５０ｍＭのトリスＭＣＩ 　、ＰＨ８，０、２００ｍＭのＮａＣ１，２，５ｍＭの［ＥＤＴＡ、１ｍＭの２ −畦）に再懸濁した。その溶液を４℃で５時間ランニング緩衝液中において透析 し、そして遠心分離し、いづれかの残留物を除いた。次にその透析された溶液を ４、５　ｘ　８０ｃｍ　（１２７０ｍ１）の５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｓ−２００カラ ム上に負荷した。

カラムを０．１７ｍ１／分でランニング緩衝液により溶離した。第Ｘ■因子のピ ーク画分をプールした。

第１表は上記精製段階を要約する。収率は、胎盤第ＸＩ［Ｔ因子及びウサギポリ クローナル抗体に対するマウスモノクローナル抗体を用いてサンドウィッチ酵素 結合免疫吸着アッセイ第１表 ＥＬＩＳＡによる粗溶解物・・・４８０■の合計第Ｘ■因子ピペラジンｐｐｔで の合計収率・・・６５％例２：第Ｘ■因子の沈殿 上記精製された第Ｘ■因子を、約５．８■／ｍ１．の濃度で５０ｍＭのトリス− ＨＣｌ　、　ｐＨ８，０、２００ｍＭのＮａＣｌ、　２．５　ｍＭのＥ［ｌＴＡ 、１ｍＭの２−ＭＥ溶液に溶解した。その得られた溶液０．５ｍｌアリコートを ピペットで透析バッグに入れ、そして次の緩衝液において４℃で２日間透析した ： ５０ｍＭのＭＥＳ　（２−ＣＮ−モルホクツ〕エタンスルホン酸）、ｐＨ６，１ ， ５０ｍＭのＰＩＰ　（ピペラジン）、ｐ）１６．２．５０ｍＭのホスフェート、 ｐ）１６．０．５０ｍＭのＡＤＡ（Ｎ−［２−アセトアミド〕−２−イミノニ酢 酸）、ｐＨ６，０、 ５０ｍＭノビスートリス（ビス〔２−ヒドロキシエチル〕−イミノートリス〔ヒ ドロキシメチルコメタン）　、ｐＨ６，１゜緩衝液は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯから得られた。

透析の後、透析バッグの内容物を遠心分離し、そしてベレット及び上清液を、製 造業者により説明されているようにしてＰｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａｙ　Ｒｅａｇ ｅｎｔ　２３２００（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）を用いてＢｒ ａｄｆｏｒｄの方法により第Ｘ■因子についてアッセイした。

第２表に要約される結果は、第Ｘ■因子がその等電点で又は等電点近くで種々の 緩衝液に不溶性であることを示す。

第２表 前記発明は、理解の目的のために例示的及び測的な手段によりいくらか詳細に記 載したが、本発明の範囲内で変更及び修飾を行なうことができることは明らかで あろう。

上流精製　下流精製 下流精製　第ｘｍ因子 Ｆｉｇ、　１ 国際調査報告 −ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０５１９０ 国際調査報告 ＰＣＴ／υ５８９１０５１９０ 一一一一一′″″″−１°°−−□−“＋Ｔｗｐ　ｍ訪ｉ「−一１゜Ｔｌｗ　ｗ ｍＭｗｎｒ　ｍ　ｍｍ　ｍ　ｍ　Ｆ−１嘴情１）ｌｌ１ｗ　ｒ盲ＩＦ　１１４　 ＋ｗ〜Ｆｗａｐａｖｍ　Ｐ−慣□−”　”　！−＋ｗｒｈ町−ｗａｗｑ　ｍ　Ｉ ｙｎ４ｖ−１−側一一一一一一国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ　８９／ｎ５１９０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生物学的流体から第ＸＩＩＩ因子を精製するための方法であって： 第ＸＩＩＩ因子を沈殿せしめるために生物学的流体のｐＨを約５．５〜６．５に 調整し；そして 沈殿せしめられた第ＸＩＩＩ因子を回収することを含んで成る方法。 ２．前記流体のｐＨを、低いイオン強度の複素環式ポリアミン又はホスフェート 緩衝液の使用により調節する請求の範囲第１項記載の方法。 ３，前記低いイオン強度の複素環式ポリアミンを、ピペラジン、スペルミジン、 カダベリン及びそれらの誘導体から成る群から選択する請求の範囲第２項記載の 方法。 ４．前記調整段階が、１０〜１００ｍＭのピペラジンを含んで成る緩衝液（ｐＨ ６．０）において前記生物学的流体を透析することを含んで成る請求の範囲第１ 項記載の方法。 ５．回収された沈殿第ＸＩＩＩ因子を洗浄することをさらに含んで成る請求の範 囲第１項記載の方法。 ６．生物学的流体から第ＸＩＩＩ因子を精製するための方法であって： 富化された画分を生成するために前記生物学的流体をアニオン交換クロマトグラ フィーにより分別し；第ＸＩＩＩ因子を沈殿せしめるために前記富化された画分 のｐＨを約５．５〜６．５に調整し；そして 沈殿せしめられた第ＸＩＩＩ因子を回収することを含んで成る方法。 ７．溶液を生成するために前記回収された沈殿第ＸＩＩＩ因子を溶解し； 第２富化画分を生成するために前記溶液をクロマトグラフィーにより分別し；そ して 前記第２富化画分を回収する追加の段階を含んで成る請求の範囲第６項記載の方 法。 ８．前記富化された画分のｐＨを、低イオン強度の複素環式ポリアミン又はホス フェート緩衝液の使用により調整する請求の範囲第６項記載の方法。 ９．前記低イオン強度の複素環式ポリアミンを、ピペラジン、スペルミジン、カ ダベリン及びそれらの誘導体から成る群から選択する請求の範囲第８項記載の方 法。 １０．前記低イオン強度の複素環式ポリアミンがピペラジン又はその誘導体であ る請求の範囲第８項記載の方法。 １１．前記調整段階が、１０〜１００ｍＭのピペラジンを含んで成る緩衝液（ｐ Ｈ６．０）において前記富化された画分を透析することを含んで成る請求の範囲 第６項記載の方法。 １２．前記生物学的流体が清澄化された細胞溶解物である請求の範囲第６項記載 の方法。 １３．前記清澄化された細胞溶解物が酵母細胞溶解物である請求の範囲第１２項 記載の方法。 １４．前記生物学的流体を： 清澄化された溶解物を生成するために細胞溶解物から粒状物質を除去し； 沈殿物を生成するために前記清澄化された溶解物に沈殿剤を添加し；そして 生物学的流体を形成するために適切な緩衝液に前記沈殿物を再懸濁することによ って細胞溶解物から調製する請求の範囲第６項記載の方法。 １５．前記沈殿剤の添加段階が、約３０％〜４０％の飽和にするために硫酸アン モニウムを添加し、又は約６％〜１７％（重量）の濃度にするためにポリエチレ ングリコールを添加することを含んで成る請求の範囲第１４項記載の方法。 １６．前記分別段階がＤＥＡＥアニオン交換媒体上でのクロマトグラフィー処理 を含んで成る請求の範囲第６項記載の方法。 １７．前記クロマトグラフィーによる溶液の分別段階が、ゲル濾過クロマトグラ フィー媒体上での溶液の濾過を含んで成る請求の範囲第７項記載の方法。 １８．生物学的流体から第ＸＩＩＩ因子を精製するための方法であって： 沈殿物を生成するために生物学的流体に硫酸アンモニウムを約３０％〜約４０％ の飽和度で添加し；前記沈殿物を低イオン強度の弱アルカリ緩衝液に再懸濁し； 富化された画分を生成するために前記再懸濁された沈殿物をアニオン交換クロマ トグラフィーにより分別し；第ＸＩＩＩ因子を沈殿せしめるために前記富化され た画分のｐＨをピペラジン緩衝液により約５．５〜６．５に調整し；前記沈殿せ しめられた第ＸＩＩＩ因子を回収し；溶液を生成するために前記沈殿せしめられ た第ＸＩＩＩ因子を溶解し； 第２富化画分を生成するために前記溶液をサイズ排除クロマトグラフィーにより 分別し；そして 前記第２富化画分を回収することを含んで成る方法。