JPH04501665A - レセプター誘導結合部位に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 レセプター誘導結合部位に対するモノクローナル抗体（関連分野） 本発明はリガンドがレセプターと結合しレセプター−リガント複合体が形成され る際リガンド上に誘導される抗体結合部位に関する。また該レセプター誘導結合 部位と免疫反応するモノクローナル抗体および該モノクローナル抗体を用いる治 療法および診断法に関する。

（関連技術） 細胞表面レセプター分子とリガンドとの相互作用は生物学的過程のホールマーク である。このような相互作用の例にはＴ細胞上のＣＤ４レセプターとＡＩＤＳウ ィルス（ＨＩＶ）の外皮たんばく質（ｇｐ１４０）の一部によって形されるリガ ンドの結合、免疫系における自己／非自己識別過程における多数のリガンドと相 互作用する主要組織適合性複合体のレセプターおよび血小板上のＧｐＨｂ／Ｉｎ ａ細胞性レセプターとフィブリノーゲンリガンドとの相互作用がある。フィブリ ノーゲン：ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａリガンド−レセプターベアは凝血、血栓形成に おいて特に興味深く本明細書でリガンドおよびレセプターの例として使用する。

本分野においてレセプター：リガンド複合体形成による生理学的メカニズムの状 態の測定を可能にするという意味でリガンドおよびレセプターの結合型および非 結合型を区別する免疫学的方法がめられてきた。最近まで生物学的サンプルが結 合型および遊離型のリガンドおよびレセプターを含むことから免疫的方法による 測定は困難であった。

たとえば血栓を起こしている人の血液は表面にフィブリノーゲン：ＧＰＨｂ／Ｉ ＩＩａ複合体を含む血小板と同時に非結合型のフィブリノーゲンおよびＧＰＩＩ ｂ／Ｉ［［ａを含んでいる。このフィブリノーゲン：ＧＰｎｂ／ＩＩ［ａ複合体 は非結合型のフィブリノーゲンおよび非結合型のＧＰＩＩｂ／ｌ１ｒａに共通す る抗原決定基を発現しているので既存の免疫学的方法で血栓状態または血栓の位 置を同定するのは困難である。

最近、フレリンガ−（Ｆｒｅｌｉｎｇｅｔ）等（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、 　２６３　：１２３９７１２４０２　（１９８８）　）はＧＰＩＩｂ／ＩＩ［ａ がリガンドに結合したときのみＧＰＩＩｂ／Ｉ［Ｉａによって発現される抗原決 定基を同定したことを報告した。すなわちフレリンガ−（Ｆｒｅｌ　ｉｎｇｅｔ ）等によって報告された抗原決定基はレセプター、リガンド複合体のレセプター によって発現された。

別の研究者は人工の非レセプター表面に結合するリガンドで発現される抗原決定 基と免疫反応するモノクローナル抗体の調製を報告している。ソリア（Ｓｏｒ　 ｉａ）等（Ｊ、Ｃｏ１１ｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ。

１０７　、２０４−２０８　（１９８５））は架橋フィブリンフラグメントとの 免疫反応で誘導され、かつプラスチック吸着フィブリノーゲンに結合し、またプ ラスチック上に吸着されるかまたは溶液中に遊離したいわゆるフィブリノーゲン Ｄフラグメントに結合するが溶液相フィブリノーゲンまたは溶液中のいわゆるフ ィブリノーゲンＥフラグメントとは結合しないＤＳＢ’と呼ばれる特定のモノク ローナル抗体について報告している。

ニルリン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）等（Ｍｏｌｅｃ、Ｉｍｍｕｎｕｌ、、２４　：　４ ８７−９４゜１９８７）は粒子がザイモサンＡと結合している時補体Ｃ３フラグ メントと免疫反応するが可溶性Ｃ３フラグメントとは反応しないモノクローナル 抗体の調製について報告している。アイモサンＡに結合するたんばく質の性質に は共有化学結合を含んでいる。

別の報告でアブラムス（Ａｂｒａｍｓ）等（Ｂｌｏｏｄ　（Ｓｕｐｐｌ　１）　 ７０　：３５５ａ　（１９８７年１２月））は血小板結合フィブリノーゲンに結 合することが概要で述べられている９Ｆ９と命名されているモノクローナル抗体 について簡単に議論している。しかしこの報告はモノクローナル抗体９Ｆ９の特 異的結合性についての特性は明らかにしていない。

可溶性フィブリノーゲンと免疫反応する多くのモノクローナル抗体が報告されて きた。その１つの報告はリントン（Ｌｉｎｄｏｎ）等、Ｂｌｏｏｄ、　６８　： 　３５５−３６２　（１９８８年８月）である。この報告はＤおよびＥフラグメ ントに対しアフィニティー精製したポリクローナル抗体同様市販の抗ヒトフィブ リノーゲンモノクローナル抗体の使用について報じている。

（本発明の概要） 現在レセプターに特異的に結合するリガンドはレセプター結合リガンドによって 発現されるレセプター誘導抗体結合部位（ＲＩＢＳ）の存在により非結合リガン ドと区別し得ることが分ってきた。すなわちあるクラスの抗原決定基はレセプタ ーにリガンドが特異的に結合したときに発現されるが非結合レセプターまたは非 結合リガンドでは発現されないことが発見された。

ＲＩＢＳがその同系のレセプターに結合するリガンドの特異的相互作用によりリ ガンド上に発現される。ＲＩＢＳはたんばく質がプラスチック吸着たんばく質の ように他の表面に非特異的に相互作用を起こしたとき、またはたんばく質が共有 化学結合により表面と相互作用を起こすときに露呈する抗原決定基ではない。こ れら後者の２つの例は上述の参考文献ソリア（Ｓａｒｉａ）等およびニルリン（ Ｎｉｌｓｓｏｎ）等により議論されており、ここで報告しているＲＩＢＳを生ず る特異的レセプターリガンド結合相互作用を含まない。

本発明はレセプターと結合したときリガンド、特にフィブリノーゲンとは免疫反 応を起こすがたとえば血漿中のフィブリノーゲンとは免疫反応を起こさない抗体 分子に関する。

これらの抗体は血小板上のたんばく質、好ましくはＧＰｎｂ／ＩＩＩａとのフィ ブリノーゲンの相互作用の結果誘導されるＲＩＢＳを認識する。本発明の抗体は 大過剰の血漿フィブリノーゲンの存在下でも結合フィブリノーゲンに選択的に作 用する。それゆえこれらの抗体のユニークな性質は広範囲な診断法および治療法 に応用し得る。

本発明の１つの態様はレセプターリガンド複合体と免疫反応を起こすモノクロー ナル抗体に関する。このモノクローナル抗体は２Ｇ５．２Ｆ１０．３Ｇ１１およ び４Ｇ１０からなる群から選ばれることが好ましい。

このモノクローナル抗体はハイブリドーマ２Ｇ５．２Ｆ１０．３Ｇ１１および４ Ｇ１０からなる群から選ばれたハイブリドーマにより生産される。

本発明の別の態様は ａ）　ＧＰＩ［ｂ／］ＩＩａ：フィブリノーゲン複合体により発現されるレセプ ター誘導結合部位と免疫反応する抗体を産生ずるハイブリドーマで、ハイブリド ーマ２Ｇ５．２Ｆ１０．３Ｇ１１および４Ｇ１０からなる群から選ばれるハイブ リドーマ、ｂ）　そのハイブリドーマから分泌される抗体、およびＣ）　そのハ イブリドーマの培養培地 を含む細胞培養混合物である。

さらに本発明はその系がレセプターリガンド複合体によって発現されるが非結合 レセプターおよび非結合リガンドによっては発現されないレセプター誘導結合部 位と免疫反応するモノクローナル抗体を含むレセプターリガンド複合体の検出法 に関する。このレセプター複合体はＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａフィブリノーゲンであ ることが゛好ましい。またこのモノクローナル抗体がインビボでの支持手段に結 合していることが好ましい。

本発明のもう１つの特徴にはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ：フィブリノーゲン複合体に よって発現されるＲＩＢＳと免疫反応するモノクローナル抗体を含む血液サンプ ル中の該複合体の検出を行なうキット型の診断システムがある。

また本発明の別の態様には、 ａ）　ＧＰＩ［ｂ／ＩＩＩａ：フィブリノーゲン複合体により発現されるレセプ ター誘導結合部位と免疫反応するモノクローナル抗体−プラスミノーゲン活性化 酵素結合体の効果量を哺乳類に静脈投与することを含む哺乳類の血栓をインビボ で分散させる方法がある。

このプラスミノーゲン活性化酵素は組織プラスミノーゲン活性化因子であり、か つこのモノクローナル抗体２Ｇ５．２Ｐ１０．　３Ｇ１１および４Ｇ１０からな る群から選ばれるものであることが好ましい。

本発明の抗体のインビボにおける診断および治療への応用にはその他に、 ａ）　ＧＰＩｌ　ｂ／Ｉｎｓ　：フィブリノーゲン複合体によって発現されるレ セプター誘導結合部位と免疫反応する効果量のモノクローナル抗体を哺乳類に静 脈投与する工程、 ｂ）　その抗体が複合体と免疫反応し、免疫反応産物を形成するのに十分な所定 の時間投与した哺乳類を維持する工程、およびＣ）　ステップｂ）で形成した免 疫反応産物の存在、すなわち血栓の存在を検定する工程、 を含む哺乳類における血栓の検定およびその存在部位の決定を行う方法がある。

この抗体はインビボでの指示手段と結合していることが望ましい。

（発明の詳細な説明） Ａ、定義 レセプター一本明細書で使用しているレセプターおよびレセプターたんばく質と はリガンドと呼ばれる別の分子に特異的に結合しレセプターリガンド複合体を形 成する生物学的に活性のあるたんばく質性の分子を示している。

リガンドおよび同系リガンド；リガンドとは特定のレセプターたんばく質と特異 的相互作用により結合する構造を含む分子である。

レセプター誘導結合部位（ＲＩＢＳ）　；　ＲＩＢＳはレセプター−リガンド複 合体のリガンド部分によって発現されるが非結合リガンドまたは非占有レセプタ ーによっては発現されない新抗原決定基である。ＲＩＢＳは“構造的”でも“配 列的”でもよい。旧ＢＳはレセプター結合によって誘導されるリガンドの特異的 変化の結果生成する、すなわち“潜在的抗原決定基”である。

潜在的抗原決定基：これはリガンドたんばく質がその同系の（特異的）レセプタ ーに結合することによるその構造の変化によって形成される新抗原決定基である 。したがって、ここで述べているリガンドはレセプターに特異的に結合しない限 り潜在的抗原決定基を発現しない。本発明の接種物に対して用いられている“単 位投与量”とは必要とする希釈剤、すなわちキャリヤーまたはベヒクルと合せて 望ましい免疫原的効果を生むよう計算された所定量の活性物質を含む動物対する 単位投与量として適する物理的に分離された単位を示している。本発明における 新しい単位投与量の明細は（ａ）活性物質独特の特性および達成すべき特定の免 疫学的効果、およびら）本発明の特徴でありここで詳細に示されているような動 物への免疫用途に使用するための活性物質の調合技術に関する制約に直接依存す る。

単位投与型は一般に凍結または乾燥した抗体を水、生理食塩水、またはリン酸緩 衝液など生理的に許容可能な希釈剤またはベヒクルに分散し水性組成物を作るこ とにより調製する。これらの希釈剤は当分野でよく知られており、たとえばレミ ントンファーマシューティカルサイエンス（第１６編、フック出版社、イースト ン、ＰＡ　（１，９８０）　、ｐｐ１４６５−１４６７）で議論されている。

また投与物は希釈剤の一部としてアジュバントを含み得る。完全フロインドアジ ュバント（ＣＦＡ）、不完全フロインドアジュバント（ＴＦＡ）＃よび明ばんな どのアジュバントは当分野でよく知られた物質であり市販されている。

抗原決定基または抗原；抗原決定基または抗原は抗体結合部位により免疫学的に 結合される抗原の構造的に活性な領域を示す。

またこの語句はエピトープと同義的に使われる。

新−抗原：ここで定義される新−抗原とはりガント−レセプター複合体では発現 されるがレセプターに結合する前のりガントには発現されない新しい抗原決定基 である。

抗体：種々の文法型の抗体という語は免疫グロブリン分子または免疫グロブリン 分子の免疫学的に活性な領域、すなわち抗体結合部位またはバラトープを含む分 子を示している。代表的抗体分子には本来の免疫グロブリン、実質的な免疫グロ ブリンおよび当分野でＦａｂ、　Ｆａｂ’　、Ｆ（ａｂ’　）２およびＦ　（Ｖ ）として知られている領域を含む免疫グロブリンの一部がある。

抗体結合部位；抗体結合部位は抗原を特異的に結合する重鎮お・　よび軽鎖の可 変および超可変領域を含む抗体分子の一部分である。

種々の文法型の免疫反応という語は抗原決定基含有分子と抗体分子全体またはそ の一部のような抗体結合部位を含む分子の間の特異的結合を意味する。

モノクローナル抗体；種々の文法型のモノクローナル抗体という語句は特定の抗 原と免疫反応し得る唯一種の抗体結合部位を含む抗体集団を意味する。したがっ て一般にモノクローナル抗体はそれが免疫反応する抗原に対する単一の結合アフ ィニティーを示す。それゆえモノクローナル抗体はたとえば二特異的モノクロー ナル抗体など種々の抗原に対して各々が免疫特異的な複数の抗体結合部位を有す る抗体分子も含む。

一般的にモノクローナル抗体は唯一種の抗体分子を分泌するハイブリドーマのよ うな単一細胞のクローンによって生産される抗体分子から成る。このハイブリド ーマは抗体産生細胞とミエローマまたは自己増殖細胞系列との融合により形成さ れる。このような抗体はケラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイン（Ｍｉｌ ｓｔｅｉｎ）（Ｎａｔｕｒｅ、　２５６　：　４９５−４９７　＜１９７５）　 、参考として引用した）によって始めて報告された。

Ｂ、リガンド−レセプター相互作用 光に示されたようにリガンドーレ七ブター複合体形成は多くの生物学的過程の中 心にある。そのような相互作用が存在する事実とは別に、これらの相互作用はそ の複合体形成を開始ステップとする生物学的過程で重要な次の事象へと誘導する 。

現在りガント−レセプター形成に伴なう生物学的機能に沿ってより精妙な変化が 起こることが分ってきた。この変化はレセプターとの結合相互作用および複合体 形成から発生するリガンド分子の構造の変化である。リガンドの構造の変化は複 合体の形成によってのみ実質的に発現される新−抗原を形成させる。先に示した ようにこの新−抗原はレセプター誘導結合部位またはＲＩＢＳと呼ばれる。

レセプターＧＰＩｌｂ／ＩＩＩａへのりガントフィブリノーゲンの結合により形 成される複合体によって発現されるＲＩＢＳを用いてＲＩＢＳ形成現象を説明す る。フィブリノーゲン−ＧＰＩＩｂ／Ｉ［Ｉａ複合体とは免疫反応するが複合体 として存在しないリガンドまたはレセプターとは実質的に反応しないモノクロー ナル／抗体を抗ＲＩＢＳ　（より簡略してＲＩＢＳ）モノクローナル抗体の例と して用いる。

本明細書で特に議論する代表的ＲＩＢＳおよびＲＩＢＳモノクローナル抗体に加 えて、いくつかのりガント−レセプター複合体が文献的に報じられている。これ らの複合体もＲＩＢＳを形成し、ここで示した方法を用いてこれらのＲＩＢＳに 対するモノクローナル抗体を作製し得る。これらのモノクローナル抗体はリガン ド結合レセプター複合体のリガンド部分とのみ免疫反応し、遊離したレセプター またはリガンドとは反応しない。これらのＲＩＢＳモノクローナル抗体を用いて 、リガンド−レセプター複合体すなわち占有されたレセプターまたは占有された リガンドの存在および量を遊離したレセプターおよびリガンドの存在下で検定し 得る。

ＲＩＢＳ形式リガンドおよびレセプターのその他の代表的ペアを以下の第１表に 示す。これらのペアは形成し得るＲＩＢＳを説明するものであってこれを制限す るものではない。

第１表 リガンド　レセプター　ペア リガンド　レセプター　引用番号 ヴイトロネクチン　ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ　１フイブロネクチン　フィブロネク チンレセプター　ＩＩＣＡＭ−Ｉ　ＬＦＡ−１１ ラミニン　Ｃ３ＡＴ　２ コラーゲン　ＶＬＡ−２３ Ｃ３ｂｉ　ＣＲ３補体レセプター　４ Ｃ３ｄ　ＣＲ２補体レセプター　５ ＨＩＶ−ｇｐ１４０　ＣＤ４Ｔ細胞レセプター　６ＦＳＨ放出たんばく質　ＦＲ Ｐレセプター　７Ａｐｏ　Ｂ−１００アポリポプロティンレセプター　８ＩＬ− ２インターロイキンレセプター　９免疫グロブリン　Ｆｃレセプター　１０絨毛 性性腺刺激ホルモン　ソマトスタチンレセプター　１１ＰＤＧＦ　ＰＤＧＦレセ プター　１２ トランスフエリン　トランスフェリンレセプター　１３（１９８５）。

３　ニューウェンハイスｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１８　：　４７０ −４７２（１９８５）。

４　ライトｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ。

８４　：　１９６５−１９６８　（１９８７）。

Ｃ，モノクローナル抗体 本発明のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）はリガンドのレセプター誘導結合部位と 免疫反応する抗体分子を含むことを特徴とする。

レセプター誘導結合部位（ＲＩＢＳ）はリガンドがレセプターに結合したときに リガンドによって発現されるが遊離した（非結合）リガンドによっては発現され ない新−抗原決定基である。すなわちレセプター−リガンド複合体はＲＩＢＳを 発現するが非占有レセプターおよび非結合リガンドは発現しない。本発明のＭＡ ｂはＲＩＢＳと免疫反応するがリガンドまたはレセプターが溶液中で遊離してい る非結合（遊離）のリガンドまたはレセプターとは実質的に免疫反応せず、それ ゆえこれがレセプター結合リガンドとは免疫反応し、遊離のリガンドとは反応し ないことからレセプター結合型と非結合型のリガンドを区別し得る。

非結合（遊離）のリガンドまたはレセプターと実質的に免疫反応しない”という 語句はモノクローナル抗体−（リガンド−レセプター）免疫反応が遊離のリガン ドまたはレセプターとの競合的結合により約１５パーセント、望ましくはそれ以 下の妨害しか受けないこと示している。

１つの好ましい態様において、本ＭＡｂはサイトアドヘシンーリガンド複合体に よって発現されるＲＩＢＳと免疫反応する抗体分子を含んでいる。サイトアトへ シンはアミノ酸残基配列アルギニン−グリシン−アスパラギン酸またはＲＤＧを 含むリガンドに結合するレセプター分子のスーパーファミリーに与えられた名称 である。プロ（Ｐｌｏｗ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡ、　８３；　６００２（１９８６）。このスーパーファミリーはインテ グリンという名前でも呼ばれる。ロースラーチ（Ｒｏｒｓｌａｈｔｉ）等、５ｃ ｉｅｎｃｅ、　２３８　；　４９１−４９７　（１９８７）。ここで特に興味深 いサイトアトへシンは血小板レセプターとしても知られているＧＰｎｂ／ＩＩＩ ａである。

本発明の好ましいモノクローナル抗体は以下の各ハイブリドーマから分泌（産生 ）される。ＡＴＣＣ名ＨＢ９８４７のハイブリドーマ２Ｇ５、ＡＴＣＣ名ＨＢ９ ８４４のハイブリドーマ２Ｆ１０、ＡＴＣＣ面ＨＢ９８４５のハイブリドーマ３ Ｇ１１およびＡＴＣＣ名ＨＢ９８４６のハイブリドーマ４Ｇ１０゜上記ハイブリ ドーマはブリペスト協定に基づき１９８８年９月２９日アメリカンタイプカルチ ャーコレクション（１２３０１、バークローンドライブ、ロックビル、ＭＤ、２ ０８５２、ＵＳＡ）に登録された。

Ｄ、モノクローナル抗体組成物の作製方法本発明はレセプター誘導結合部位と免 疫反応するモノクローナル抗体作成法に関する。本方法には、次のステップが含 まれる。

（ａ）　レセプター　ＩＪガント複合体による動物の免疫化。一般的にこのこと は免疫学的受容動物に免疫学有効量、すなわち免疫応答を起こすのに十分な量の 免疫原を投与することにより行なう。

動物としてはウサギ、ラットまたはマウスなどのけっ歯頚が好ましいがヤギ、ウ マまたはサルなどその他の哺乳類も使用し得る。

この哺乳動物がレセプター　ＩＪガント複合体と免疫反応する抗体分子を分泌す る細胞を生産するのに十分な時間この哺乳動物を維持する、 ら）　免疫化動物から取り出した抗体分泌細胞の懸濁液を調製する。一般的にこ れは哺乳動物の膵臓を採取し、従来法を用いて生理学的に許容可能な培地中側々 の牌細胞を機械的に分離する、（Ｃ）　懸濁した抗体産生細胞をトランスホーム （“不朽化”）した細胞系列を生産し得るトランスホーム剤で処理する。トラン スホーム剤および不朽化細胞系列生産のためのその使用法は当分野ではよく知ら れており、それらにはエプスタインバーウィルス（ＥＢＶ）、シミアンウィルス ４ｏ　（ｓＶ４ｏ）、ポリオマウィルスなどのＤＮＡウィルス、モロニームライ ン白血病ウィルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）　、ロウスザルコーマウィルスなどのＲＮ Ａウィルス、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４なトノミエロ ーマ細胞などが含まれる。

好ましい態様において、トランスホーム剤による処理で適当な融合促進剤を使用 することによる適当な細胞系列からのマウスミエローマ細胞と懸濁した膵臓細胞 の融合からバイブリド−７が生産される。ミエローマ細胞に対する牌細胞の比は 約５であることが望ましい。総容積には１０”個の牌細胞が含まれる。

使用する細胞系列はいわゆる“薬剤耐性”であることが好ましく、その結果未融 合のミエローマ細胞は選択培地中で生残できず、ハイブリドーマは生残すること になる。最も１般的クラスは８−アザグアニン耐性細胞系列であり、これは酵素 ヒボキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠いており、ＨＡ Ｔ（ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）培地では生きていけない 。また一般的に使用するミエローマ細胞系列はいわゆる“非分泌”型でそれ自体 抗体を生産しないものが望ましいが分泌型のものも使用できる。しかし分泌型ミ エローマの方が好ましい場合もある。好ましい融合促進剤には平均分子量約１０ ００〜約４０００のポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ１００Ｏとして市販 されているもの）があるが当分野で知られている他の促進剤も使用し得る。

（イ）それからこのトランスホームした細胞をクローン化（好ましくは単クロー ンに）する。このクローニングは非トランスホーム細胞は生育しない組織培養培 地で行ったことが望ましい。トランスホーム細胞がハイブリドーマのとき、これ は一般に分離した容器内で非融合細胞が死滅するのに十分な時間（約１週間）非 融合ミエローマ細胞を生育させない選択培地中で非融合牌細胞、非融合ミエロー マ細胞および融合細胞（ハイブリドーマ）の混合物を希釈、培養することによっ て行う。希釈および培養は分離した容器内で行ない、その希釈は各分離容器（た とえばマイクロプレートの各ウェル）内に特定数の細胞（たとえば１〜４個）が 含まれるよう希釈剤容積を算出する限界希釈を行う。この培地は薬剤耐性（たと えば８−アザグアニン耐性）非融合ミエローマ細胞系列を生育させないもの（た とえばＨＡＴ培地）である。

（ｅ）　クローン化したトランスホーマントの組織培養培地をレセプター−リガ ンド複合体の一部として存在するリガンドとは免疫反応するが遊離のリガンドと は免疫反応しない分泌された抗体分子の存在について調べる。この評価は以後述 べられる従来の免疫学的方法によって行なわれる。

（ｆ）　ステップ（ｅ）で一度望ましいトランスホーマントが同定されれば適応 な時間適当な組織培養培地中で選択かつ生育させ、ついでその培養上清から目的 とする抗体を回収する。適当な培地および培養時間は当分野ではよく知られてお り、また容易に決定される。

わずかに純度の劣るモノクローナル抗体をより高い濃度で産生させるため望まし いハイブリドーマをそれが生育し得るマウスまたは他の哺乳類、好ましくは同系 マウスまたは型開系マウスに注入する。適当なインキュベーションの後、このハ イブリドーマは抗体産生腫瘍を形成し、宿主マウスの血液および末梢分泌液（腹 水）中に高濃度の目的抗体（約５〜２０　ｍｇ／献）を生成する。

これらの組成物の調製に有効な媒体は当分野でよく知られており、また市販され ている・。それらには合成培養培地、近文系マウスなどが含まれる。代表的合成 培地には４．５ｇ／Ｉ！、グルコース、２０ｍｍグルタミン、および２０％ウシ 胎児血清を補ったダルベツコ最小基礎培地［：ＤＭＥＭ、ダルベア　コ（Ｄｕｌ ｂｅｃｃｏ）等、Ｖｉｒｏｌ。

旦：　３９６　（１９５９）：ｌがある。代表的近交系マウスには　Ｂａ　１１ 　ｂ／ｃがある。

上述の方法で産生じたモノクローナル抗体はたとえば後に詳しく議論されるよう なＲＩＢＳ含有免疫反応産物の形成が望まれる診断および治療法で使用し得る。

それらの用途にはたとえばインビボにおける血栓の検出、血栓の分散または血栓 像の描写を目的とした生体サンプル中のフィブリノーゲン−結合血小板を検出す るための本発明の診断法および診断システムがある。

一般にＲＩＢＳ・モノクローナル抗体は水性組成物中で使用される。

この組成物は組織培養培地または腹水液そのものまたは希釈物である。一般にこ れらの組成物はインビトロで使用される。インビボでの使用のためＲＩＢＳモノ クローナル抗体は一般に硫安沈殿、アフィニティー精製操作などで精製し、医薬 的に許容可能な希釈剤の水性組成物として使用する。その水性組成物中のＲＩＢ Ｓモノクローナル抗体濃度は目的とする用途に適するように調製する。

Ｅ、治療法および治療組成物 先に示した登録済のハイブリドーマのいずれかによって分泌されたモノクローナ ル抗体および同様の免疫特異性を有する抗体は凝血または血栓に関する分野で特 に有用である。これはこのタイプの抗−ＲＩＢＳモノクローナル抗体は結合フィ ブリノーゲンを含む活性化血小板上に存在するフィブリノーゲンＧＰｎｂ／ＩＩ Ｉａレセプター複合体と免疫反応し、かっ血小板結合フィブリノーゲンは血栓形 成に関係するからである。さらに定義よりこれらのＲＩＢＳモノクローナル抗体 はインビボの循環血液中に存在する可溶性フィブリノーゲンとは免疫反応しない ので１つ以上のこれらのモノクローナル抗体を使用することにより高度な特異性 をもつ免疫反応が達成される。

１、血栓分散 このように本発明の１つの特徴は血栓の分散法に関する。ここでＡＴＣＣ登録の ハイブリドーマの少なくとも１つによって産生されるモノクローナル抗体の抗体 分子をプラスミノーゲン活性化酵素に化学的に結合させ、その結合体の抗体部分 のＲＩＢＳへの接合が実質的にそこなわず、かつその酵素のプラスミノーゲン活 性化活性も実質的にそこなわれない結合体を形成させる。その結合体の画部分の 活性が実質的にそこなわれない抗体−たんばく質結合体の調製法は当分野でよく 知られている。

プラスミノーゲン活性化酵素とは全身性フィブリン分解またはフィブリノーゲン 分解を伴なわない血栓分解を誘導する組織プラスミノーゲン活性化因子などのト ロンポリシスにおけるフィブリン分解試薬を意味する。関連するその他のフィブ リン分解試薬はプロアクチベータープラスミノーゲンと相互作用し、これらに限 定されるわけではないがストレプトキナーゼウロキナーゼ（Ｕ−ＰＡ）および組 織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などを含むものである。

本方法に従かい血栓分散量の先に述べた結合体を含む医薬的に許容し得る水性組 成物を分散すべき血栓を有するヒトなどの哺乳動物に静脈注射または注入などに より投与する。このような治療を受けた哺乳動物（投与を受けた哺乳動物）をそ の結合体の抗体部分が血栓中の血小板結合フィブリノーゲン複合体と免疫反応し 、かつ結合体のプラスミノーゲン活性化酵素部分がプラスミノーゲンを活性化す るのに十分な時間維持する。結合体の除去は困難であり、時間がかかるのでそれ 自体の体がその結合体を通常の手段で一掃するのに必要な十分な時間その哺乳動 物を維持する。

２、血栓形成の阻害 本発明は冠状動脈バイパス手術のような重要な手術をして数日後の患者のように 血栓形成の危険がある動物に有用なもう１つの治療法に関する。

ここでは医薬的に許容し得る水性組成物中に存在するＡＴＣＣ登録のハイブリド ーマ２Ｇ５．２Ｆ１０．３Ｇ１１および４Ｃ１０の少なくとも１つによって生産 される抗体を含む血栓阻害量のモノクローナル抗体を血栓を阻害すべきヒトなど の哺乳動物に投与する。この治療哺乳動物（投与された哺乳動物）を投与された ＲＩＢＳモノクローナル抗体が通常の方法でその身体から一掃されるのに十分な 時間維持する。

この方法では結合したフィブリノーゲンを含む活性化した血小板とＲＩＢＳモノ クローナル抗体との免疫反応が血栓形成を阻害する。

もちろんＲＩＢＳモノクローナル抗体は血小板上のフィブリノーゲンＧＰＩＩｂ ／Ｉｌ［ａ複合体と免疫反応するが血液中のフィブリノーゲンとは反応しないの で、治療を受けた動物の正常な機能は損なわれない。

関連する態様において血小板含有溶液にＡＴＣＣ登録のハイブリドーマ２Ｇ５． ２Ｆ１０．３Ｇ１１および４Ｃ１０の少なくとも１つによって生産されるモノク ローナル抗体を含む医薬的に許容可能な水性組成物を投与することを含む血小板 凝集を防ぐ方法に関する。血小板凝集を阻害する量の抗体をインビボで血小板凝 集の阻害を必要とする動物に投与するか、またはインビトロで血漿または血液な ど血小板含有溶液と混合する。Ｒ［ＢＳモノクローナル抗体と血小板上のフィブ リノーゲン−ＧＰｎｂ／ＩＩＩａ複合体との免疫反応は血小板凝集を阻害する免 疫反応産物を生成する。

先に述べた単一のＲｒＢＳモノクローナル抗体は上述の各方法で使用でき、また それらを１つ以上含む混合物も使用し得る。したがって４つのＡＴＣＣ登録のハ イブリドーマによって生産される各モノクローナル抗体はＲＩＢＳモノクローナ ル抗体の性質を共有しているが各抗体結合部位は同じエピトープとは免疫反応し ない。したがって単一の結合フィブリノーゲン分子への結合部位の多重結合が起 こるような、これらのモノクローナル抗体の混合物（単離物または結合体として ）を用いる利点がある。

上述の２つの方法はフィブリノーゲン−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体と特異的に 免疫反応するＲ［ＢＳモノクローナル抗体について説明されているが、同様の方 法はＲＩＢＳを含む他のリガンド−レセプター複合体についても応用し得ること は理解されよう。

活性成分として抗体分子を含む医薬的に許容可能な水性組成物の調合法は当分野 でよく知られている。一般に、このような組成物は溶液または懸濁液など注射液 として調製されるが注射前に溶液や懸濁液とするのに適する固型物としても調製 される。またこの調製物がエマルジョンのこともある。

単独または結合体のモノクローナル抗体はしばしば医薬的に許容可能で結合体ま たはモノクロナル抗体自身に適合する当分野でよく知られている賦形剤と混合す る。適当な賦形剤には水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール などおよびそれらの組合せ物がある。

さらに望ましい場合、その組成物は湿潤剤またはエマルジョン剤、ｐＨ緩衝剤な ど活性成分の効果をあげる小量の補助物質を含むことがある。

結合体またはモノクローナル抗体は中性の医薬的に許容可能な塩として−Ｊ二述 の水性組成物中に成形し得る。医薬的に許容可能な塩にはたとえば塩酸またはリ ン酸などの無機酸または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される酸 付加塩（酵素または抗体分子の遊離アミノ基と形成される）が含まれる。遊離カ ルボキシル基で形成される塩がナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウ ムまたは鉄水酸化物などの無機塩基またはイソプロピルアミン、トリメチルアミ ン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロ力インなどの有機塩基から 誘導し得る。

治療用抗体分子含有組成物は従来たとえば単一投与量の静脈注射などにより投与 される。組成物は投与物成型に適した方法でかつ治療に有効な、すなわち血栓分 散または血栓阻害に有効な量が投与される。

投与量はとりわけ治療する動物検体の種類、検体動物のサイズ、（もし分子なら ）血栓のサイズ、存在するフィブリノーゲン結合血小板の量、および結合体また はモノクローナル抗体を使用できる検体の容量に依存する。また投与するのに必 要な結合体またはモノクローナル抗体の精密な量は担当医の判断や、特に検体が ヒトである場合には各個人に左右される。しかし、投与量の範囲は治療に有効な 血液内濃度で特徴づけられ、本発明の抗体含有結合体または抗体単独の濃度は約 ０．０１μ閏から約１００μＭ１好ましくは約０．１μＭから１０μＭの範囲に ある。

また最初の投与および二次注射に適する投与様式も様々であるが一般的には最初 の投与の後１時間以上の間隔をおいて次の注射または投与法で投与が繰り返され る。または、血中で治療に有効な濃度が維持できる連続的静脈注入もあり得る。

Ｆ１診断システム 本発明のキット型の診断システムは分包された形で４つのＡＴＣＣ登録のハイブ リドーマの１つによって生産される本発明のＲＩＢＳモノクローナル抗体の少な くとも１回の検定に十分な量を含んでいる。またＲＩＢＳおよび旧ＢＳモノクロ ーナル抗体の免疫反応の存在を示すラベルも同じかまたは別のパッケージ内に含 めることが好ましい。一般にパッケージされた試剤の使用説明も含められる。

一般に使用説明には試薬と投与を受けるサンプルの相対量、試薬／サンプル混合 物の維持時間、温度、バッファ条件など少なくとも１回の検定に必要なパラメー ターやその試薬濃度を示す実質的表示が含まれている。

本発明の１つの態様は血液または血漿など血小板含有血液サンプル中のフィブリ ノーゲン結合血小板を検定するキット型の診断システムである。このシステムに はレセブター−−リガンド複合体により発現されるＲＩＢＳと免疫反応するモノ クローナル抗体を含むパッケージが含まれる。このモノクローナル抗体の抗−Ｒ ＩＢＳ抗体分子は以下に示すハイブリドーマ、ハイブリドーマ２Ｇ５．２Ｆ１０ ．３Ｇ１１および４Ｇ１０のうちの１つによって生産されることが望ましい。こ の抗体分子は１つ以上の特定のモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体組 成物として存在することが望ましい。さらに放射性標識した抗体分子、好ましく は１２’　Ｉ　ｍ識した抗体分子を含むキットであることが望ましい。有効なラ ベルを後に議論する。

別の態様において本発明の診断システムはインビボで血栓の存在を検定するのに 適する。このシステムはレセプター−リガンド複合体によって発現される旧ＢＳ と免疫反応するモノクローナル抗体分子のパッケージを含む。存在する抗体分子 はハイブリドーマ２Ｇ５．２Ｆ１０．３Ｇ１１および４Ｃ１０からなる群から選 ばれるハイブリドーマから分泌されるものであることが望ましい。

またこの抗体分子はインビボでのラベルまたは指示手段に結合していることが好 ましい。

しばしばインビボイメージング用のキットをインビトロでの検定にも使用し得る が、逆は必ずしも正しくないことは理解されよう。たとえばインビボで使用され るモノクローナル抗体は水性組成物のバッファ塩や試薬と同様に発熱物質を含ん でいてはならない。発熱物質含量がないことはインビトロ検定には必ずしも必要 ではない。さらにインビボイメージングに有用な指示手段は一般に以後議論する ようにインビトロで使用するものとは異なる。したがってこの検定システムはイ ンビボイメージングに“適して”おり、同じ、または別のパッケージ内キットの １部として“適当な”バッファ塩、水性溶液および指示手段を供給し得る。

好ましい態様において、本発明の診断システムはさらに本発明の抗体分子を含む 複合体の形成を知らせるラベルまたは指示手段を含む。本明細書で用いられてい るように種々の文法型のラベルおよび指示手段という語句は複合体の存在を示す 検出可能なシグナルの生産に直接的あるいは間接的に関係する単一の原子および 分子を意味する。インビボのラベルまたは指示手段とはヒト検体の体内で有用な ものであり、それらには”’　Ｉ　ｎ　、”Ｔｃ、６７Ｇａ　ｓ”’Ｒｅおよび １３２Ｉが含まれる。

ラベルまたは指示手段は本発明の結合体またはモノクローナル抗体組成物の一部 である抗体分子に結合もしくは組込み得る。そしてこれらの原子または分子は単 独もしくは他の試薬と合せて使用される。このようなラベルは医療診断化学の分 野でよく知られており、それらをその他の新しいたんばく質を用いた方法、およ び、またはシステムで使用する場合のみ本発明の一部を構成する。

ラベルの結合、すなわち抗体の標識化は当分野でよく知られている。たとえば、 ハイブリドーマによって生産される抗体分子は培養培地中の成分として提供され るラジオアイソトープ含有アミノ酸の代謝的取り込みでラベルし得る。たとえば ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）等、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　７３　：　３− ４６　（１９８１）参照。活性化した官能基を介してのたんばく質結合技術が特 に使用可能である。たとえばオーラミアス（Ａｕｒａｍｅａｓ）等、５ｃａｎｄ 、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

８、５ｕｐｐｌ　７　：　７−２３　（１９７８）　、０７ドウエル（Ｒｏｄｗ ｅｌｌ）等、Ｂｉｏｔｅｃｈ、　３　：　８８９−８９４　（１９８４）および 米国特許Ｎａ　４．４９３．７９５参照。

またインビトロ診断システムは好ましくは分包形で特異的結合剤を含み得る。“ 特異的結合剤”とは本発明のモノクローナル抗体を選択的に結合し得るがそれ自 身は本発明の抗体分子ではない分子である。代表的な特異的結合剤には、二次抗 体、補体たんばく質またはそのフラグメント、Ｓ、オーレウス（ａｕｒｅｕｓ） プロティンＡなどがある。この特異的結合剤はりガント−レセプター複合体との 免疫複合体の一部として本発明のＲＩＢＳモノクローナル抗体が存在するとき本 モノクローナル抗体と結合する。好ましい態様においてはこの特異的結合剤はラ ベル化しである。しかし、この診断システムがラベル化していない特異的結合剤 を含む場合、この特異的結合剤は一般に増巾手段または増巾剤として用いられ、 かつラベル化した第２の試薬がその特異的結合剤（増巾剤）に結合する。これら の態様においてそのラベル化した第２の試薬はその増巾手段がＲＩＢＳモノクロ ーナル抗体含有免疫複合体に結合するときその増巾手段に特異的に結合し得る。

本発明の診断キットは“イライザ（ＥＬＩＳＡ　）”形式で使用し血清、血漿ま たは尿などの体液サンプル中のフィブリノーゲン結合血小板のようなりガント− レセプター複合体の存在や量を検出し得る。“イライザ”とは、固体サポートと 酵素−抗原または酵素−抗体結合体を形成する固相マ）　ＩＪクスに結合する抗 体または抗原（ここではＲＩＢＳ含有リガンド−レセプター複合体）を利用しサ ンプル中の抗原または抗体の検出や定量を行う酵素結合免疫吸着検定法である。

イライザ法の説明は参考として本明細書で引用する１９８２年ＣＡ、ロスアルト スのレンジメディカルバブリケーション社から出版されたり、Ｐ、サイン（Ｓｉ ｔｅｓ）等著の基礎および臨床免疫学第４編、第２２章および米国特許Ｎα３． ６５４，０９０　、Ｎα３、８５０．７５２およびＮα４．０１６．０４３に報 告されている。

好ましいイライザキット態様物においては本発明の抗体分子が固体マトリックス に固定され、本診断システムにおいて別々にパッケージされている固体サポート を形成している。一般にこの抗体は水性媒体からの吸着により固体マ）　ＩＪク スに固定されているが当分野でよく知られている他の様式の固定も使用し得る。

複合体またはその構成物質に結合する標識化した特異的結合剤、または標識され ていない特異的結合剤とこれに結合する標識化した二次試薬もキット中、各々１ つまたは２つの別々のパッケージに含まれている。マトリクス結合抗体の例とし てＡＴＣＣ登録ハイブリドーマの１つによって生産されるモノクローナル抗体の １つを用いるとき、市販されている標識化した抗フィブリノーゲン抗体が特異的 結合剤の例となる。

有用な固体マトリクスは当分野でよく知られている。このような物質にはファル マシア社（ビス力タウエイ、ＮＪ）の商標５ＥＰＨＡＤＥＸとして市販されてい る架橋デキストラン、アガロース、アボットラボラドリース（北シカゴ、ＩＬ） から市販されている約１ミクロンから約５ミリメートル径のポリスチレンビーズ 、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロース またはナイロン製のシート、リボンまたはヘラ状のもの、またはポリスチレンま たはポリ塩化ビニル製のマイクロプレートのウェル、チューブ、プレートなどが 含まれる。

本診断システムのモノクローナル抗体（標識化または非標識化）、標識化特異的 結合剤または増巾剤は液体分散物などの溶液として、または凍結乾燥体などの実 質的乾燥粉末として提供される。指示手段が酵素の場合、その酵素の基質もキッ トシステムの別のパッケージに含められる。先に述べたマイクロプレートなどの 固体サポートマトリクスや１つ以上のバッファもこの診断検定システム中別々に パッケージした要素として含められる。

診断システムについてこ＼で議論したパッケージは診断システムで通常使用され ているものである。このようなパッケージにはガラスやプラスチック製（たとえ ばポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリカーボネート）のビン、バイアル、 プラスチック製またはプラスチックコートした包装物が含まれる。

Ｇ、検定法 本発明はたとえば血栓またはフィブリノーゲン結合血小板中に見られるようなｌ ノセブター・リガンド複合体、好ましくはＧＰｎｂ／Ｈａ：フィブリノーゲン複 合体の検出法に関する。この方法はレセプター−リガンド結合部位（ＲＩＢＳ） の発現およびレセプター・リガンド複合体のりガント部分のＲＩＢＳとは免疫反 応するが非結合レセプターまたは非結合レセプターとは反応しないモノクローナ ル抗体を利用している。当業者はこれらの免疫複合体を形成するのに利用し得る 多くの臨床診断化学的方法があることを理解できよう。したがって代表的検定法 をここで示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。

１、血栓検出 本発明は特にヒトなどの哺乳動物中の血栓の検出法に関する。

インビボ指示手段に結合した抗体分子を含むイメージング有効量の本発明のモノ クローナル抗体を含む水性組成物を治療を必要とするヒトなどの哺乳動物に静脈 注射で投与する。投与した哺乳動物は標識化した抗体分子が血栓の一部として存 在する血小板結合フィブリノーゲン複合体と免疫反応するのに十分な所定の時間 維持する。それからこの検体哺乳動物について形成される標識化した免疫複合体 の存在、好ましくは位置を検定し、それにより血栓の有無およびその位置を検定 する。通常標識したＲＩＢＳモノクローナル抗体は標識または指示手段として放 射性核種を含むのでイメージング検定は通常よく知られているラジオイメージン グ技術で行なわれる。これらの技術は血栓にある比較的高濃度のラジオラベルを 比較的低い全身のラジオラベルから区別し得る。比較的長寿命のラジオアイソト ープを用いる場合、投与した哺乳動物を標識化した抗体が実質的に全身から一掃 されるのに十分な時間維持し、ラジオラベルからのパックグランドシグナルをよ り低くし得る。

２、身体サンプル中のフィブリノーゲン結合血小板の検出血小板含有および、ま たは遊離フィブリノーゲン含有身体サンプル中のフィブリノーゲン結合血小板の 存在、好ましくはその量を検出するために、競合的または非競合的な種々の異種 および同種検定品プロトコールを使用し得る。その身体サンプルは好ましくは血 液または血液の血小板含有部分のような体液サンプルである。たとえばヘパリン 保存（非凝血）血液サンプルと標識化した先に示した登録ＲＩＢＳ抗体分子の１ つを混合する。もちろん意味のある結果が得られるようなサンプルおよび標識化 モノクローナル抗体の量および濃度を採用する。このようにして作った免疫反応 混合物をサンプル中に存在するフィブリノーゲン結合血小板が標識化抗体と免疫 反応を起こし、標識化された免疫反応産物が生成するのに十分な時間、生物学的 検定条件下に維持する。存在する場合その標識化免疫反応産物を未反応の標識化 抗体と分離する。

均一系検定の場合一般に分離はサンプル中にある全ての血小板をペレット化する 遠心により行なう。イライザ法のような不均一系の検定の場合、その免疫反応産 物は固体サポートに結合しており、その分離は一般に未結合ＲＩＢＳ抗体は廃棄 され、固体サポート結合免疫産物は維持される洗浄ステップで行なう。

非標識化ＲＩＢＳモノクローナル抗体を用いてＲＩＢＳ含有リガンド−レセプタ ー複合体と免疫反応させる場合、先に述べた分離した免疫複合体および標識化結 合剤・または増巾手段として用いられる非標識化結合剤で第２の混合物が作られ ることを理解すべきである。第２結合複合体が最初に形成された免疫複合体と特 異的結合剤との間で形成されるのに十分な時間この反応物を生物学的条件下に維 持する。（この特異的結合剤が抗体分子を含む場合、その第２の結合複合体は第 ２の免疫複合体である。たとえばＳ、オーレウス（ａｕｒｅｕｓ）プロティンＡ を用いる場合、第２の結合複合体はその抗体結合部位における結合によるもので はなく、またその複合体はよく結合複合体と呼ばれる。免疫複合体は特異的結合 複合体であるので、特異的結合剤と第１の免疫複合体との間で形成される複合体 は第２の結合複合体である。）その後この第２結合複合体を先に述べた方法など により存在する未反応の特異的結合剤から分離し、その標識の存在、すなわち免 疫複合体の存在、好ましくはその量を検定する。

特異的結合剤が標識されておらず増巾手段として用いられている場合、存在する 場合上述のように分離した第２結合複合体および標識含有第２結合剤から第３混 合物を作る。もちろん第２結合複合体中の標識の存在は標識化した結合剤が含ま れない上述の方法では測定できない。標識を含む第３結合複合体が形成維持され るよう本方法の先に述べた維持および分離ステップを反復する。

その後このｅＡ識の存在、好ましくはその量を検定する。

このように、本検定法の上述の各場合において標識の存在、好ましくはその量は フィブリノーゲン結合血小板の存在好ましくはその量を測定する上での基礎を提 供する。

通常光に述べた検定を行う研究者は１つ以上の免疫複合体または結合複合体が存 在する標識量が測定されるまで実際に形成しているかどうか分らないことに注意 せよ。それにもかかわらず所定の検定操作の全てのステップはＲＩＢＳ含有複合 体が実際に存在すると想定して行なわれる。

ＲＩＢＳモノクローナル抗体のユニークな特異体のためフィブリノーゲン結合血 小板のための上述の検定法および血栓のための前述のイメージング検定法は遊離 の血小板および遊離のフィブリノーゲン、すなわち非複合体化血小板およびフィ ブリノーゲンの存在下で行ない得ることが強調される。結果として分離および洗 浄ステップなどの特別な取扱い操作を検定に使用する前に身体サンプルに行う必 要はない。この特徴はＲＩＢＳモノクローナル抗体を用いる全ての検定に共通し ている。

生物学的検定条件とは本発明の抗体分子の生物学的活性および検定されるフィブ リノーゲン結合血小板またはその他のＲＩＢＳ含有複合体を維持する条件である 。これらの条件には約４℃から約４５℃の範囲、好ましくは約３７℃の温度、約 ５から約９の範囲、好ましくは約７のＰＨおよび蒸留水から約１モルの食塩水の 範囲、好ましくは生理食塩水のイオン強度が含まれる。これらの条件を至適化す る方法は当分野でよく知られている。

（実施例） 以下の実施例は本発明を説明するものでこれを制限するものではない。

１、ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の生産モノクローナル抗体は標準 的ハイブリドーマ技術を用いて生産した。簡単に云うと、シエルニエスキー（Ｃ ｉｅｒｎｉｅｗｓｋｉ）等（Ｔｈｒｏｍｂ。

Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、）　４８　：　３３−３７　（１９８２））によって報告 された方法で調製したフィブリンＤ−ダイマー免疫原をＢａ１ｂ／ｃマウス１匹 当り約５０マイクログラム（μｇ）を用いて免疫化し、つづいて３回二次免疫化 した。

つづいて、抗体がその免疫原と免疫反応を起こした１匹の免疫化マウス由来の１ ．２３Ｘ１０”個の牌細胞を細胞融合促進剤であるポリエチレングリコール４０ ００の存在下、２．４６Ｘ１０’個のＰ３Ａｇ８６５３．１マウスミエローマ細 胞と混合した。このようにトランスホームした抗体産生細胞をウェル当り約３Ｘ １０’個の密度でマイクロプレートに移し培養した。

約１４日の培養後生存するハイブリドーマを含むと考えられる２３５個のウェル に由来する組織培養上清を抗−ＲＩＢＳ抗体分子の存在についてラジオ免疫検定 法でスクリーニングした。簡単に云うと１Ｍｇ／ｗｉのフィブリノーゲンまたは 低密度リボたんばく質（ＬＤＬ）（コントロール）を含む１００マイクロリツト ル（μｌ）のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を固相マトリクスとして平底９６穴ポリビ ニルマイクロプレートのウェルに入れた。その後このプレートを４℃に約１６〜 ２０時間維持し、ウェルの表面にフィブリノーゲンまたはＬ　Ｄ　Ｌを吸着させ て固体サポートを作った。

振ってコート溶液を除き、ウェルをすすいで１００μｌのブロッキング溶液（５ ％正常ヤギ血清）を各ウェルに入れて過剰のたんばく質結合部位をブロックした 。

そのウェルを３７℃に約３０分間維持し、その後ブロッキング溶液を除いた。各 ウェルに１００μｌの（ａ）　Ｐ　Ｂ　Ｓで１＝１０に希釈したハイプリドーマ 組織培養上清、または（ｂ）競合的インヒビターとして１００μｇ／−のフィブ リノーゲンを含むＰＢＳで１＝１０に希釈したハイブリドーマ上清を入れた。こ のようにして作った免疫反応混合物を４℃の室温下に約１６〜２０時間維持し固 相結合免疫反応産物および非結合モノクローナル抗体分子を含む液相を形成させ た。

それから各ウェルに１００μｌの１２５Ｉ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧを加えた。

このようにして作った標識化免疫反応混合物を４℃に約６〜２０時間維持し、１ ′ニ一標磁化第２固相免疫反応産物を形成させた。固相と液相を分離し非結合１ ２５１−ヤギ抗マウスＩｇＧを除去した。各ウェルへの１２５１＝結合量はガン マシンチレーションによって測定した。

フィブリノーゲンコートウェル中に、ＬＤＬコートウェルで測定される非特異的 に結合する１２５Ｉ量の少なくとも３倍が存在することはその組織培養上清中に 抗フィブリン抗体が存在することを示している。免疫混合物中液相フィブリノー ゲン競合物が存在することにより（上記パート（ロ））固相結合＋ｚｓＩが約１ ５％減少することはその組織培養上清中に抗ＲＩＢＳ抗体の存在を示している。

上述のスクリーニング操作でフィブリノーゲン：ＧＰＩ［ｂ／Ｈａ複合体を結合 する抗−ＲＩＢＳ抗体を産生ずる２Ｇ５．２Ｆ１０゜３Ｇ１１および４Ｇ１０と 命名される４種のハイブリドーマの同定される。４つの上述のハイブリドーマは 各々限界希釈により２度クローン化し、これを用いて腹水を生産する。その後プ ロティンＡセファロースを用いてその腹水から抗体を単離した。

モノクローナル抗体（Ｍａｂ）　２　Ｆ　１０のＦａｂ　フラグメントを含む組 成物はメージ（Ｍａｇｅ）等（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 　７０　：１４２−５０　（１９８０））の方法に従かいプロティンＡセファロ ース単離したＭａｂ２．Ｆ　１０をパパイン（Ｍａｂ：ババイン２００：１（重 量比））により３７℃で６時間消化することにより調製した。未消化の抗体およ びＦｃフラグメントをプロティンＡセファロースクロマトグラフィーを用いてＦ ａｂフラグメントから除去した。セファロースからＦａｂフラグメントを回収し ２Ｆ１０Ｆａｂ調製物とした。

２、活性化血小板上のフィブリノーゲンニＧＰｎ　ｂ／ＩＩＩ　ａＲＩＢｓの検 出 ハイブリドーマ２Ｇ５．２Ｆ１０および３Ｇ１１によって産生されるモノクロー ナル抗体、すなわち各々ＭＡｂ　２Ｇ５、ＭＡｂ２Ｆ１０およびＭＡｂ３Ｇ１１ を細胞表面結合器ＢＳと免疫反応する能力について試験した。４種のモノクロー ナル抗体の各々を標準的なりロラミンーＴ法を用いて＋２５１標識化した。グリ ーンウッド（Ｇｒ６６ｎｗｏｏｄ）等、Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｍ、　Ｊ、、　８９　 ：　１１４−１２３　（１９６３）。

０．０６ユニツト／ｍｆ　（Ｕ／ｍｆ）の濃度のヒルジン（シグマケミカル社、 セントルイス、Ｍｏ）を含む５Ｗｄ；！のＡＣＤ　（０，０６５Ｍクエン酸０． ０８５Ｍクエン酸ナトリウム、２％デキストロース）にヒトの血液６０　ミＩＪ 　！Ｊットル（ｍｌ）を採取し、１２０Ｉｇで１５分間遠心した。高血小板血漿 と命名したこの上清を回収、単離し、さらに１２００Ｘｇで１５分間遠心し単離 血小板のペレットを作った。

この単離血小板を１ｍｇ／ｍｆのウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）および１ｍ ｇ／ｍｊ？デキストロースを含む２ｒｎｌの無カルシウムタイローズバッフｙ　 （０，１３Ｍ　ＮａＣ１１０，００２６Ｍ　ＫＩ！！、０．００２ＭＭｇＣ１２ −６８２０，５ｍＭヘペス、０．０１２Ｍ　ＮａＨＣＯ−、ｐＨ７，２）に再懸 濁する。それからこの血小板懸濁液を同じタイローズバッファで平衡化したセフ ァロースＣＬＺＢカラム（ヘッドボリウム４０献、ファルマシア社、ビス力タウ ェイ、ＮＪ）。洗浄した血小板を最終体積的４〜５ｄのＣＬ２Ｂカラムのボイド 容積から回収した。洗浄血小板サンプルを１０マイクロモル濃度（μＭ）のアデ ノシンニリン酸または０．１ユニット／ｍｉ！のトロンビンを混合することによ り刺激（活性化）した。またＡＤＰ刺激血小板の一部のサンプルを１ｍＭのフィ ブリノーゲンと混合した。

いくつかの非刺激コントロールサンプルを含む血小板の各サンプルに１０ナノモ ル濃度となるように（ｎＭ＞　”’Ｉ標識ＭＡｂを加えた。この免疫反応混合物 を２０％スクロース０．３ｍｌを通過させる遠心により非結合”５１−ＭＡｂと 分離した。血小板ペレットに会合している　”’　Ｉ−ＭＡｂ量をシンチレーシ ョンスペクトロメトリーで測定した。

第」表に示すこの実験の結果は抗−ＲＩＢＳモノクローナル抗体は実質的に非刺 激血小板と免疫反応しないことを示している。しかしこの血小板をＡＤＰまたは トロンビンなどのアゴニストで刺激したとき、細胞上のフィブリノーゲン：ＧＰ Ｉｒｂ／Ｉ［Ｉａ？Ｊ［合体とＭＡｂとの有意な免疫反応が得られた。ＡＤＰま たはトロンビンによる血小板の刺激で血小板内在性フィブリノーゲンの分泌とＧ Ｐｎｂ　／　ｍ　ａとの表面での結合が起こる。外鉢フィブリノーゲンの付加は 刺激血小板への”５１−ＭＡｂの結合を中和（阻害）せず、このことはＭＡｂが ＲＩＢＳ特異的、すなわちそれらは溶液中に遊離するフィブリノーゲンとは免疫 反応しないことを示している。同様の第１表 血　小　板　結合＋２’　Ｉ　−ＭＡｂ　（ｃｐｍ／血小板）２Ｇ５　２Ｆ１０ 　３Ｇ１１ 非刺激　１，２００　２．８００　１．３００ＡＤＰ刺激　３３．７５０　４３ ．６００　３１．５５０外から加えたフィブリノーゲンは細胞と会合していない が（すなわち細胞レセプター−リガンド複合体の一部ではない）、ＭＡｂ２Ｇ５ ．２Ｆ１０．３Ｇ１１および４Ｇ１０のフィブリノーゲン：ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ ａ複合体との免疫反応は中和しないことを強調するためにこれらＭＡｂの血小板 との免疫反応性を２〜２ｍｇ／ｍｆフィブリノーゲンを含む高血小板血漿を用い て試験した。

第２表に示されているように大過側の遊離フィブリノーゲンがあるにもかかわら ず４種の”’　Ｉ　−ＭＡｂの各々は血小板表面のフィブリノーゲン：　ＧＰＩ Ｉ　ｂ　／　ＩＩＴ　ａ　ＲＩＢＳと免疫反応した。

′ｉ４２表 血　小　板　結合”’　Ｉ　−ＭＡｂ　（ｃｐｍ／血小板）２Ｇ５　２Ｆ１０　 ３Ｇ１１　４Ｇ１０非刺激　１７４　６６２　２１８　６７８ＡＤＰ刺激　１７ ．８２３　７．４７１２０，３８２１９．５４０ＲＩＢＳに対する４種の登録Ｍ Ａｂの特異性を示すためＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ血小板糖たんばく質レセプターで はなくＭａｃ−ルセブターを含む細胞を用いて同様のＭＡｂ結合実験を行った。

Ｍａｃ−１およびＧＰＩＩｂ／Ｉ［Ｉａは両方ともレセプター−リガンド様式で フィブリノーゲンに特異的に結合するが、この２つの相互作用は異なる生物学的 結果を産む。結合実験で、４つの登録ＲＩＢＳはフィブリノーゲン−Ｍａｃ−１ 複合体との免疫反応を示さなかったがフィブリノーゲン−ＧＰＩＩｂ／Ｉ［Ｉａ 複合体中のフィブリノーゲンとは免疫反応する。それゆえ、テストした４種のＭ ＡｂはＧＰＩＩｂ／Ｉａとの複合体中に発現されるフィブリノーゲンのＲＩＢＳ とは特異的に免疫反応するがＭａｃ−１との複合体のフィブリノーゲン上のＲ［ ＢＳとは反応しない。

３、ＲＩＢＳ抗体による血小板凝集の阻害実施例２で示したように調製した単離 血小板２００μｌをＢＳＡおよびデキストロース（各１＋＋＋ｇ／ｍｌ１）、フ ィブリノーゲン（１ｍＭ）、カルシウム（５ｍＭ）および実施例２で調製し、第 ３表に示すように種々の濃度のＭＡｂ２Ｆ１０のＦａ、ｂフラグメントを含む１ ９０μｌのタイローズバッファに添加した。それから１０μｌのＡＤＰ（タイロ ーズバッファ中８０μＭ）を加え血小板凝集を刺激した。

この混合物を３７℃に維持する一方デュアルサンプルアグリゲーションメーター （モデルＤＰ−２４７Ｅ、シエンコ社、モリソン、Ｇｏ）を用い経時的にその混 合物の光透過率をモニターした。

アグリゲーションメーターは２００μｌのＰＲＰおよび２００μ！のタイローズ バッファを含む溶液を用い光透過のベースラインをコントロール凝集を５パーセ ントおよび抗体存在下での凝集を１０％に設定する校正を行った。上限は１０　 Ｍ！ＰＲＰ＃よび３００μｌのタイローズバッファを用いて校正した。

抗体による血小板凝集阻害を測定して得た結果を第３表に示した。ＡＤＰを加え て約３〜４分後に測定する抗体なしで得られた光透過率（１００％）に対する割 合で表わした。

第３表 モノクローナル抗体２Ｆ１０による血小板凝集の阻害［Ｆ　Ａｂ］　光透過率 ０　μＭ　１００ ０．２５μＭ　７９ ０．５　μＭ　６２．５ １．２５μＭ　３４．５ １．８７μＭ　１７．５ 第３表の結果はＭａｂ２　Ｆ　１０フラグメントが血小板凝集の投与量依存の阻 害を起こすことを示している。したがって、この結果はフィブリノーゲン：ＧＰ ｎｂ／ＩＩＩａ複合体に特異的なＲＩＢＳと免疫反応する本発明の抗体を用いた 場合、血小板凝集や血栓形成など血小板凝集に関する過程を阻害するのに有用な 効果的投与量を示している。

特定の態様を含むこれまで述べてきた明細事項は本発明を説明するためのもので あり、これを制限するものではない。本発明の新しい概念の精神および範囲を逸 脱することなしに数多くの変化および修正を行ない得る。

平成　年　月　日

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．リガンドがレセプターーリガンド複合体として存在する場合の該リガンドに よって発現されるレセプター誘導結合部位とは免疫反応するが該リガンドまたは 該レセプターが溶液中で遊離している場合の該リガンドまたは該レセプターとは 免疫反応しないモノクローナル抗体。
2. ２．前記複合体のレセプターがたんぼく質のサイトアドヘシンスーバーファミリ ーの一員である請求項１記載のモノクローナル抗体。
3. ３．前記レセプターかＰＩＩｂ／ＩＩＩａである請求項２記載のモノクローナル 抗体。
4. ４．前記リガンドがフィブリノーゲンである請求項３記載のモノクローナル抗体 。
5. ５．前記抗体がハイブリドーマ２Ｇ５、ハイブリドーマ２Ｆ１０、ハイブリドー マ３Ｇ１１およびハイブリドーマ４Ｇ１０からなる群から選ばれるハイブリドー マによって分泌される請求項４記載のモノクローナル抗体。
6. ６．リガンドがレセプターーリガンド複合体中に存在する場合のリガンドに発現 されるレセプター誘導結合部位とは免疫反応するか該リガンドまたは該レセプタ ーが溶液中に遊離している場合の該レセプターまたは該リガンドとは免疫反応し ないモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ。
7. ７．前記ハイブリドーマのハイブリドーマ２Ｇ５、ハイブリドーマ２Ｆ１０、ハ イブリドーマ３Ｇ１１およびハイブリドーマ４Ｇ１０からなる群から選ばれる請 求項４記載のハイブリドーマ。
8. ８．細胞培養組成物であって、 ａ）リガンドがレセプターーリガンド複合体として存在する場合のリガンドに発 現されるレセプター誘導結合部位とは免疫反応するが該リガンドまたは該レセプ ターが溶液中に遊離している場合の該リガンドまたは該レセプターとは免疫反応 しないモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ、 ｂ）該ハイブリドーマによって分泌される抗体分子、およびｃ）該ハイブリドー マ用の培養培地 を含む組成物。
9. ９．前記ハイブリドーマがハイブリドーマ２Ｇ５、ハイブリドーマ２Ｆ１０、ハ イブリドーマ３Ｇ１１およびハイブリドーマ４Ｇ１０からなる群から選ばれる請 求項８記載の組成物。
10. １０．リガンドかレセプターーリガンド複合体として存在する場合のリガンドに 発現されるレセプター誘導結合部位とは免疫反応するが該リガンドまたは該レセ プターが溶液中で遊離してる場合の該リガンドまたは該レセプターとは免疫反応 しないモノクローナル抗体で、パッケージ中少なくとも１回の検定を行うのに十 分な量の該モノクローナル抗体を含むキット型の診断システム。
11. １１．前記レセプターーリガンド複合体がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ：フィブリノー ゲン複合体である請求項１０記載の診断システム。
12. １２．前記モノクローナル抗体がハイブリドーマ２Ｇ５、ハイブリドーマ２Ｆ１ ０、ハイブリドーマ３Ｇ１１およびハイブリドーマ４Ｇ１０からなる群から選ば れるハイブリドーマから分泌される請求項１１記載の診断システム。
13. １３．前記モノクローナル抗体が指示手段と結合している請求項１２記載の診断 システム。
14. １４．前記指示手段が前記モノクローナル抗体とは別にパッケージされている請 求項１３記載の診断システム。
15. １５．前記指示手段が前記モノクローナル抗体に結合しており、かつインビボ指 示手段である請求項１３記載の診断システム。
16. １６．哺乳動物の血栓を分散させる方法であって、医薬的に許容可能な希釈剤お よび該血栓を分散させるのに有効な量のモノクローナル抗体−プラスミノーゲン 活性化酵素結合体で該結合体のモノクローナル抗体がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ：フ ィブリノーゲン複合体のフィブリノーゲン部分に発現されるレセプター誘導結合 部位とは免疫反応するが溶液中で遊離するＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａまたはフィブリ ノーゲンとは免疫反応しないものである結合体を含む水性組成物を該哺乳動物に 静脈注射することを含む方法。
17. １７．前記複合体の前記プラスミノーゲン活性化酵素部分がストレプトキナーゼ 、ウロキナーゼおよび組織プラスミノーゲン活性化因子からなる群から選ばれる 請求項１６記載の方法。
18. １８．前記結合体の前記モノクローナル抗体部分がハイブリドーマ２Ｇ５、ハイ ブリドーマ２Ｆ１０、ハイブリドーマ３Ｇ１１およびハイブリドーマ４Ｇ１０か らなる群から選択されるハイブリドーマから分泌される請求項１７記載の方法。
19. １９．哺乳動物中インビボで血栓を検出する方法であって、ａ）医学的に許容可 能な希釈剤およびＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ−フィブリノーゲン複合体のフィブリノ ーゲン部分のレセプター誘導結合部位とは免疫反応するが溶液中に遊離している ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａまたはフィブリノーゲンとは免疫反応しないモノクローナ ル抗体で、インビボでラジオアイソトープラペルに結合したイメージング効果量 のモノクローナル抗体を含む水性組成物を該哺乳動物に静脈投与する工程、 ｂ）該投与哺乳動物を該モノクローナル抗体が存在する該複合体と免疫反応し免 疫反応産物を形成するのに十分な時間維持する工程、及び ｃ）形成された免疫反応産物中の該ラジオアイソトープラペルの存在を検出する 該哺乳動物のラジオイメージングを行ない血栓の存在を検出する工程を含む方法 。
20. ２０．前記モノクローナル抗体がハイブリドーマ２Ｇ５、ハイブリドーマ２Ｆ１ ０、ハイブリドーマ３Ｇ１１およびハイブリドーマ４Ｇ１０からなる群から選ぼ れるハイブリドーマによって分泌される請求項１９記載の方法。
21. ２１．ハイブリドーマ２Ｇ５、ハイブリドーマ２Ｆ１０、ハイブリドーマ３Ｇ１ １およびハイブリドーマ４Ｇ１０からなる群から選ばれるハイブリドーマから分 泌される少なくとも２種のモノクローナル抗体を含む抗体組成物。
22. ２２．医薬的に許容可能な希釈剤およびＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ：フィブリノーゲ ン複合体のフィブリノーゲン部分で発現されるレセプター誘導結合部位とは免疫 反応するが溶液中で遊離しているＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａまたはフィブリノーゲン とは免疫反応しないモノクローナル抗体で血栓形成阻害に効果的な量の該モノク ローナル抗体を含む水性組成物を患者に投与することを含む患者内で血栓の形成 を阻害する方法。
23. ２３．前記モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ２Ｇ５、ハイブリドーマ２Ｆ １０、ハイブリドーマ３Ｇ１１およびハイブリドーマ４Ｇ１０からなる群から選 択されるハイブリドーマによって産生される請求項２２記載の方法。
24. ２４．医薬的に許容可能な希釈剤およびＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ：フィブリノーゲ ン複合体のフィブリノーゲン部分で発現されるレセプター誘導結合部位とは免疫 反応するが溶液中で遊離しているＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａまたはフィブリノーゲン とは免疫反応しないモノクローナル抗体で血小板凝集陽害に効果的な量の該モノ クローナル抗体を含む水性組成物を患者に投与することを含む患者内で血小板の 凝集を阻害する方法。
25. ２５．前記モノクローナル抗体がハイブリドーマ２Ｇ５、ハイブリドーマ２Ｆ１ ０、ハイブリドーマ３Ｇ１１およびハイブリドーマ４Ｇ１０からなる群から選択 されるハイブリドーマによって産生される請求項２４記載の方法。
26. ２６．リガンドに特異的に結合した細胞表面レセプターを含むリガンド含有レセ プターーリガンド複合体によって発現されるレセプター誘導結合部位と免疫反応 するモノクローナル抗体の生成方法であって、 ａ）該複合体を含む組成物で哺乳動物を免疫化する工程、ｂ）該免疫化哺乳動物 から抗体産生細胞を採取し、該細胞の懸濁液を調製する工程、 ｃ）該細胞をトランスホーム剤で処理し、トランスホームした抗体産生細胞を調 製する工程、 ｄ）工程ｃで処理した細胞を非トランスホーム細胞は生育できない組織培養培地 による限界希釈でクローニングし、クローン化トランスホーマントを調製する工 程、 ｅ）クローン化したトランスホーマントの組織培養培地を検定し該レセプターー リガンド複合体中のリガンド上に存在するレセプター誘導結合部位とは免疫反応 するがいずれも非結合型の細胞表面レセプターまたはリガンドとは免疫反応しな い分泌された抗体分子の存在を検定し、それにより該抗体分子を産生するクロー ン化トランスホーマントを同定する工程、ｆ）同定された該クローン化トランス ホーマントを該分泌抗体分子の産生に適した条件下組織培養培地中で生育させる 工程、および、 ｇ）ステップｆ）の培養培地から該分泌抗体分子を回収する工程を含む工程。
27. ２７．前記リガンドがフィブリノーゲンであり、かつ該レセプターがＧＰＩＩｂ ／ＩＩＩａ血小板糖たんぼく質レセプターである請求項２６記載の方法。
28. ２８．血液サンプル中リガンドに特異的に結合した細胞表面レセプターを含むレ セプターーリガンド複合体の存在を検定する方法であって、 ａ）該レセプターーリガンド複合体中のリガント上にあるレセプター誘導結合部 位とは免疫反応するがいずれも非結合型の細胞表面レセプターまたはリガンドと は免疫反応しない抗体分子を含むモノクローナル抗体組成物を血液サンプルと混 合することにより免疫反応混合物を調製する工程、 ｂ）この混合物を該抗体がサンプル中に存在するレセプターーリガンド複合体を 免疫反応し、免疫反応産物を形成するのに十分な時間維持する工程、及び ｃ）工程ｂで形成された免疫反応産物の存在を検出し、それにより該サンプル中 の該複合体の存在を検出する工程を含む方法。
29. ２９．前記リガンドがフィブリノーゲンであり、かつ前記レセプターが血小板糖 たんぼく質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａである請求項２８記載の方法。
30. ３０．前記抗体分子がハイブリドーマ２Ｇ５、ハイブリドーマ２Ｆ１０、ハイブ リドーマ３Ｇ１１およびハイブリドーマ４Ｇ１０からなる群から選ばれるハイブ リドーマによって産生される抗体分子である請求項２９記載の方法。