JPH07508103A - トロンビン−アンチトロンビン３複合体のためのイムノアッセイ及び試験キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トロンビン−アンチトロンビン１１１複合体のためのイムノアッセイ及び試験キ ット 発明の背景 １、発明の分野 本発明は、ヒトの液体サンプル中の当該複合体に特異的に結合する抗体を含んで なる、トロンビン−アンチトロンビン■複合体のためのイムノアッセイに関する 。

２、背景 血液凝固は３つの必須の段階を含むということが一般に合意されている。すなわ ち、ｌ）例えば血管の破裂又は血液自体の損傷に応答して、プロトロンビン活性 化因子と呼ばれる物質の複合体が形成される、２）このプロトロンビン活性化因 子が、プロトロンビンのトロンビンへの変換を触媒する、そｑて３）トロンビン が、血小板を活性化させ且つフィブリノーゲンを（血小板、血球及び血漿を絡め て凝血自体を形成する）フィブリン繊維へと変換する酵素として働く。

トロンビンの酵素活性は、トロンビン−アンチトロンビン■複合体又はｒＴＡＴ 複合体」として知られているアンチトロンビン■との不活性複合体の形成を含む 種々の方法で制御され得る。アンチトロンビン■すなわちＦＡＴＩＩＩ」は、ト ロンビンに加えて数種のセリンプロテイナーゼと複合体を形成する血漿中のプロ テイナーゼ阻害因子の一つである。こうして、ＡＴＩＩＩは、セリンプロテアー ゼ第Ｘｎａ、　Ｘ■ａ、Ｘａ、及び工Ｘａ因子と複合体を形成することか知られ ている。

ヒトの液体サンプル中のＴＡＴ複合体の量を測定することが望ましい。ＴＡＴ複 合体のレベルの定量は、患者の凝固活性の指標を提供し、そして血栓症の危険性 及び播種住血管内凝固症候群のような他の疾患を評価する助けとなるであろう。

ヒト血漿中のＴＡＴ複合体のアッセイは、例えばＴＡＴ複合体並びに第ＸＩＩａ 、ＸＩａ、Ｘａ、及びＩＸａ因子とＡＴＩとの複合体等のような、血漿サンプル 中のＡＴＩｌｌｌ［の全複合体の濃度の測定ではなく、ＴＡＴ複合体の濃度の選 択的な評価を提供しなければならない。そのようなＡＴＩの「全」複合体の測定 は、数種の反応の平衡の指標を提供し、それらの幾らかは、特定のＴＡＴ複合体 レベルに関連する以外の状態を反映するであろう。例えば、第Ｘ■及びＸＩ因子 の接触活性化は、主として補体及びキニン系の活性化をもたらし、従ってＸＩＩ ａ−ＡＴｎ［及びＸ　Ｉ　ａ−ＡＴｎ［複合体は血栓症の危険性の指標ではない であろう。

従って、ヒトの液体サンプル中のＴＡＴ複合体のレベルを定量するための一手段 を持つことは望ましいことであろう。アッセイがサンプルのＡＴＩの全複合体の 測定でなく試験サンプル中のＴＡＴ複合体の濃度の選択的評価を提供するもので ある、ヒトの液体サンプル中のＴＡＴ複合体の濃度についてのアッセイを有する ことか特に望ましいてあろう。

発明の要約 本発明は、ヒトの液体サンプル中のヒトのトロンビン−アンチトロンビンＩ［（ ＴＡＴ）複合体の検出及び濃度測定のためのイムノアッセイを提供する。このア ッセイは、ヒトの液体サンプルを少なくとも２つの抗体又はその免疫反応性フラ グメント、好ましくはモノクローナル抗体又はその反応性フラグメントと接触さ せることを含んでなり、ここに該抗体のうち少なくとも１つは液体サンプル中の ＴＡＴ複合体に特異的に結合する。好ましくは、このアッセイの抗体の各々がＴ ＡＴ複合体に特異的に結合する。ここに用いるｒＴＡＴ？３ｊ合体に特異的に結 合する」又は別の類似の語句は、その抗体又はそれらの抗体が、ＴＡＴ複合体に は結合するがしかし、遊離の（すなわち複合体形成していない）アンチトロンビ ン■や他の血漿因子のアンチトロンビン■複合体、特に第Ｘａ因子−アンチトロ ンビン■複合体及び第工χａ−アンチトロンビン■複合体とは、実質的又は本質 的に交差反応性を示さないことを示している。好ましくは、このアッセイの抗体 の混合物はＴＡＴ複合体の異なったエピトープに結合する、すなわちそれらの抗 体は競合的でない。加えて、本発明のイムノアッセイの抗体は、好ましくは、単 一のインキュベーション及び洗浄の段階のみを用いるよう、同時にヒトの液体サ ンプルに接触される。本発明の他の面は以下に開示されている。

発明の詳細な開示 本発明のイムノアッセイは、少なくとも２つの抗体とヒトの液体サンプルとの反 応を含んでなり、ここに該抗体のうち少なくとも１つはＴＡＴ複合体に特異的に 結合する。好ましくは、それらの抗体はモノクローナル抗体であり、該アッセイ の該２つの抗体の双方がＴＡＴ複合体に特異的に結合する。ＴＡＴ複合体に特異 的に結合する該アッセイの抗体は、下記の実施例７に記述されたようなアッセイ 又はヒト血漿サンプルについての類似のアッセイにおいて、ＡＴ■、第Ｘａ因子 −アンチトロンビン■複合体及び第１Ｘａ因子−アンチトロンビン■複合体と、 好ましくは約３％未満の交差反応性しか示さない。より好ましくは、本発明の抗 体は、ＡＴＩＩ［及びそのようなＡＴＩＩＩ複合体と、約１％未満の交差反応ｆ １．　Ｌか示さない。更により好ましくは、本発明の抗体は、下記の実施例７に 記述したアッセイ又はヒト血漿サンプルを用いる類似のアッセイにおいて、アン チトロンビン■及びそのようなアンチトロンビン■複合体と約０．２％未満の、 更には約０．１％未満の交差反応性しか示さない。本発明の抗体か、遊離の（複 合体形成していない）トロンビンとの交差反応性の欠如を示すこと、すなわち、 本発明の抗体が、ヒト血漿サンプルとの反応において遊離のトロンビンと約３％ 未満の交差反応性、より好ましくはトロンビンと約１％未満の交差反応性、そし て更により好ましくはヒト血漿サンプルとの該抗体の接触反応により遊離のトロ ンビンと約０．２％未満の、更には約０．１％未満の交差反応性しか示さないこ ともまた好ましい。特に、本発明の特に好ましいモノクローナル抗体は、ヒトの 液体サンプルとの接触により、ヒトＴＡＴ複合体に結合し、かつ、トロンビンと の約０．（１０５％未満の交差反応性、アンチトロンビン■との約０．００５％ 未満の交差反応性、第１Ｘａ−アンチトロンビン■複合体との約０．００５％未 満の交差反応性、及び第Ｘａ−アンチトロンビン複合体との約０．０２％未満の 交差反応性しか示さないことが見出された。ここに用いる「抗体Ｊ、ｒ本発明の 抗体Ｊ又は他の類似の語は、全イムノグロブリン、並びに、）’ａｂ、　）’ａ ｂ’　、　）’（ａｂ’）ｚ及びＦ　（Ｖ）を含む、ＴＡＴ複合体に特異的に結 合する抗原結合性のフラグメント又は免疫反応性のフラグメントを含む。

もしも該イムノアッセイの抗体の１つのみがＴＡＴ複合体に特異的に結合するな らば、該アッセイの他の抗体は、ＴＡＴ複合体に結合しなければならないがしか し例えばアンチトロンビン■又は他のアンチトロンビン■の複合体と交差反応性 を示してもよい。ここに、ＴＡＴ複合体に［結合する」　（それに特異的に結合 するのではなく）抗体というときは、該抗体が、ヒトＴＡＴ複合体に結合しそし てまたアンチトロンビン■、第Ｘａ因子−アンチトロンビン■複合体及び／又は 第１Ｘａ因子−アンチトロンビン■複合体とも交差反応性を示してもよいことを 示す。ＴＡＴ複合体に結合し且つアンチトロンビン■及びその複合体とも交差反 応性を示す抗体（モノクロ−（１９９＋）、及びヨーロッパ特許出願公開第０３ ９１１１３３Ａ２を参照。本発明のこの具体例においては、好ましくは、ＴＡＴ 複合体に特異的に結合する抗体は、担体抗体として使用され、サンドイッチタイ プのアッセイにおいて基質上に固定化され、そして交差反応性抗体は、標識され た接合体として使用されるが、尤も、交差反応性抗体を担体抗体として使用しそ してＴＡＴ複合体に特異的に結合する抗体を標識された接合体として使用するこ ともできる。

本発明のアッセイにおいて用いられるヒトの液体サンプルは、例えば血液又は尿 等、ＴＡＴ複合体を含有する如何なるサンプルであってもよい。典型的には、血 漿サンプルが用いられる。

本発明の抗体は、当該分野において一般に知られている技術を用いて調製するこ とができ、典型的には、ヒト血漿のＴＡＴ複合体の精製されたサンプルに対して つくり出される。該抗体は、遊離のＡＴＲＩ又はトロンビンによっては示されな い、ＴＡＴ複合体の１つ以上のエピトープを含んでなる免疫原性ペプチドからつ くり出されてもよい。

より具体的には、抗体は、ＴＡＴ複合体の精製されたサンプル又は上述の免疫原 性ペプチド（単独又は担体と複合体形成させたもの）によって哺乳類を免疫する ことにより調製できる。適当な哺乳類には、ヒツジ、ヤギ、家兎、モルモット、 ラット及びマウス等のような典型的な実験動物が含まれる。ラット及びマウス、 特にマウスは、モノクローナル抗体を得るには優先される。抗原は、該哺乳類に 、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮肉注射等のような多くの適当な経路の何 れによって投与してもよい。

好ましくは、免疫は、皮下、腹腔内、又は静脈注射による。最適の免疫間隔、免 疫投与量等は、比較的広い範囲で変わり得、この開示に基づいて実験的に決定す ることができる。典型的な手順は、何週にもわたって抗原を数回注射することを 伴う。抗体は免疫された動物の血清から標準の技術によって収集され、ＴＡＴ複 合体に特異的な抗体を見出すためにスクリーニングされる。モノクローナル抗体 は、抗体を産生する細胞中で産生されることができ、それらの細胞は、ハイブリ ドーマ細胞を形成するための標準の融合技術を用いることによって、モノクロー ナル抗体をつくり出すために使用することができる。Ｇ、　Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２５６：　１１５６　（１９７５）　全参照のこ と。典型的には、これは、抗体産生細胞を骨髄腫細胞のような不死の細胞系と融 合させてハイブリッド細胞を産生ずることを伴う。代わりとして、モノクローナ ル抗体は、Ｈｕｓａ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２５６：１２７５　 （＋９８９）の方法により、細胞から産生することができる一つの適当なプロト コールは、精製されたＴＡＴ複合体を含んでなる組成物による、約２乃至７か月 かけて実施されるマウスの腹腔内免疫を提供する。次いで免疫されたマウスから 膵臓細胞を除去することがてきる。膵臓細胞の摘出に先立って、免疫されたマウ スからの血清を、ＴＡＴ複合体に対し特異的な抗体の力価についてアッセイする 。摘出されたマウスの膵臓細胞が次いで、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボ シルトランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ−）又はチミジンキナーゼ欠損（ＴＫ −）のようなマーカーを有する適当な、同種又は異種（好ましくは同種）のリン パ球細胞系に融合される。好ましくは、リンパ球細胞系として骨ｕＮｍ胞が用い られる。骨髄腫細胞及び膵臓細胞は、例えば骨髄腫細胞：牌臓細胞比率約ｌ：４ て混合される。細胞は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法によって融合させ ることがてきる。Ｇ、　Ｋｏｈｌｅｒ　ａｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ（上記） を参照のこと。こうしてクローン化したハイブリドーマを、例えばＲＰＭＩ−１ ６１１０等の培地中で増殖させる。Ｇ、　Ｅ、　Ｍｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔ ｉｏｎ、　＋９９：　５４９　（＋９６７）を参照のこと。融合操作の後増殖さ せたハイブリドーマは、ＴＡＴ複合体に特異的に結合する抗体の分泌につきラジ オイムノアッセイ又はエンザイムイムノアッセイ等によりスクリーニングされ、 例えばＴＡＴ複合体に結合するがＡＴＩＩ［には結合しない抗体が選択される。

このスクリーニングには、好ましくは、酵素免疫抗体法が用いられる。そのよう なスクリーニングにおいて陽性結果を示すハイブリドーマを展開し限界希釈法に よってクローン化することができる。

更なるスクリーニングが、溶液中並びにヒトの液体サンプル中においてＴＡＴ複 合体と結合することのできる抗体を選択するために、好ましくは実施される。

本発明の抗体は、好ましくは、約１　ｘｌＯ”　Ｌ／Ｍより大きな、より好まし くは約ＩＸ＋Ｏ’Ｌ／Ｍより大きな、更に好ましくは約ｌ×＋Ｏ”　Ｌ／Ｍより 大きな、ＴＡＴ複合体との親和性定数を示し、そのような定数は、Ｆｒｉｇｕｅ ｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　７７：　３ ０５　（１９８５）に開示されている方法によって測定される。

本発明の好ましい抗体は、ヒトの液体ノ”ラブル中のＴＡＴ複合体に対し非常に 高感度である。例えば、好ミしい抗体は、血漿サンプル１ｍｌ当たり約０．５５ ｎ　ｇ以上のＴ　Ａ　Ｔ　ｒａ会合体濃度を、本質的に１００％という添加材料 の回収率で、精度をもって検出した。

本発明のイムノアッセイは、一般に優れた精度を示す。例えば、本発明の好まし いアッセイについて次の結果が得られた。すなわち、ｎ＝８０での対照レベルＩ 及び■についての同−ロットアッセイ内位で変動係数それぞれ３．９％及び６． ８％、及び、ｎ＝８０てのロット間アッセイ精度値で変動係数それぞれ９．３％ 及び１２．２％。

競合的アッセイは、本発明の好ましい抗体が少なくとも実質的に又は本質的に非 競合的であること示した。すなわち、本発明の２以上の抗体は、ＴＡＴ複合体の サンプルと同時に反応させたとき、それら自身の間で殆と又は全く結合妨害を示 さない。イムノアッセイにおいてそのような抗体を使用することにより、試験サ ンプルは同時に（すなわち単一のインキュベーション段階）、該アッセイの、結 合した捕捉抗体及び標識された接合体抗体の双方とインキュベートすることがで きる。これは、捕捉抗体と接合体抗体の各々について（例えばそれら抗体間にお ける結合妨害を回避するために）別個のインキュベーション及び洗浄段階を利用 するものである先行のアッセイとは、全く異なる。

本発明の好ましい抗体が、希釈されていないか又はＴＡＴ複合体抗体を含有する 溶液のみによって希釈されただけのヒトの液体サンプル、特にヒト血漿サンプル 中のＴＡＴ複合体に結合できることも判明した。特に、液体サンプルが等量の又 はより少ない液量の希釈液のみによって希釈されたときに、本発明の好ましい抗 体がヒトの液体サンプルのＴＡＴ複合体に結合できることが判明した。これは、 ＴＡＴ複合体に結合はするが相当程度（例えば血漿又は他の試験サンプルが１０ ０倍以上に希釈される）に希釈された血漿サンプルと接触させたときのみ結合す ることの報告されている、少なくとも先行の幾つかの抗体とは全く異なる。その ような希釈は、そのような抗体を利用するＴＡＴ複合体アッセイの複雑さを増し 得ることがら望ましくない。

特に好ましいモノクローナル抗体には、０２Ｍ　、Ｃ７２、ＣＩＪ４−Ｔ及び５ Ｂ４６が含まれ、これらはＴＡＴ複合体に特異的に結合するマウスモノクローナ ル抗体である。そのようなモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、＋ ２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙ ｌａｎｄ　２０８５２のＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１ １ｅｃｔｉｏｎ　（Ａ　Ｔ　ＣＣ）に寄託Ｍ；Ｄ２Ｍを発現）。

こうして本発明の抗体は、ヒトの液体サンプル中のＴＡＴ複合体の検出及び濃度 測定のためのイムノアッセイにおいて使用するのに特に適している。本発明の特 に好ましいイムノアッセイの一つは、支持体の表面上への物理的吸着のような既 知の方法を用いて捕捉抗体が固定化される、サンドイッチアッセイである。適当 な支持体には、例えばポリプロピレン又はポリスチレンのようなポリマー材料、 ガラス、金属、架橋デキストラン、アガロースその他である。支持体は、トレー 、球、棒、試験管その他のような様々な形状であってよい。マイクロタイタープ レートのような、ウェルを有するトレーが一般に好ましい。

本アッセイの検出可能に標識された抗体は、該抗体をレポーター例えば放射性同 位元素、酵素、蛍光又はルミネセンス試薬その他に結合させることによって形成 される。典型的に用いられる放射性同位元素は、　＋　２５１　、！　１　ｗａ 　Ｔｃ及び１Ｈである。既知の同位元素標識方法には、　＋′Ｉについてはラク トペルオキシダーゼ及びハンター・ポルトン法、　３Ｈについては還元メチル化 法が含まれる。Ａ、　Ｂｏｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈａｍ、　Ｊ、 、　１３３：　５２９−５３９　（＋９７２）を参照のこと。酵素の取付けには 、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、 グルコースオキシダーゼその他が含まれる。ペルオキシダーゼが特に好ましい。

ペルオキシダーゼは、種々の起源、例えばセイヨウワサビ、パイナツプル、イチ ジク、サトウキビ、ジャワビーン、トウモロコシ等から得られるものから選ばれ る。セイヨウワサビペルオキシダーゼが特に好ましい材料である。共有結合によ るそのような酵素による抗体標識のための手段は、当該分野において既知である 。特定の酵素及び抗体について適した方法は、該酵素及び抗体上の利用しつる反 応性部分に依存しており、実験的に直ちに確認することができる。

本発明のアッセイは、接合体抗体の標識としてペルオキシダーゼを用いた次のプ ロトコールにより説明される。試験サンプル、例えばヒト血漿サンプルが、マイ クロタイタープレートのような担体上に結合させたＴＡＴ複合体抗体（すなわち 、ＴＡＴ複合体に結合する抗体）に添加され、抗体−抗原反応が行われ、続いて 、上に概説したようにして得られたペルオキシダーゼ標識したＴＡＴ複合体抗体 接合体が添加され、次いで更なる抗体−抗原反応が行われる。該ている。適した 希釈剤には、イムノアッセイにおける使用のために当該分野において知られてい る希釈剤が含まれる。試験サンプルと接触させるための抗体を溶解するのに特に 好ましい溶液の一つは、２０ｍＭのトリス、ＵＯＯｍＭの塩化ナトリウム、０． ０５ｍｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ及び５％のＢＳＡである。

好ましくは、本発明のアッセイの担体抗体及び接合体抗体の双方ともに、ＴＡＴ 複合体に特異的に結合し、そして支持体に結合した抗体、ヒトの液体サンプル及 び標識された抗体が一緒にインキュベートされ、続いて、反応したＴＡＴ複合体 以外の未反応の標識抗体とヒト血漿サンプルを全て除去するために単一の洗浄段 階が行われる。適した洗浄剤には、イムノアッセイにおいて使用するために当該 分野において知られている洗浄剤が含まれる。特に好ましい洗浄緩衝液の一つに は、２７．２ｇ／ｊ７のイミダゾール、＋７．５ｇ／４７の塩化ナトリウム及び ４　ｍ　ｌ　／　Ｉ！のＴｗｅｅｎ　２０が含有される。必要ならば、ペルオキ シダーゼのための基質をアッセイに添加して、生じる物質の吸光度又は蛍光を測 定することにより、酵素活性につき反応生成物がアッセイされる。検出された結 合した標識抗体量は、アッセイにかけられたヒト血漿サンプル中のＴＡＴ複合体 の濃度に正比例する。こうして、試験サンプルの吸光度又は蛍光を、既知量のＴ ＡＴ複合体を含有する標準溶液から得られた吸光度値と比較することにより、血 漿試験サンプル中のＴＡＴ複合体濃度の定量的測定を達成することができる。試 験サンプルから得られる値の解釈を容易にするために、多くの標準溶液ら得られ る吸光度値から較正曲線を作成することが望ましいである。

本発明の特に好ましいイムノアッセイの一つが、次の通りに実施された。捕捉モ ノクローナル抗体とセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）により標識され た接合モノクローナル抗体とを、ヒト血漿サンプルと一緒に３７°Ｃにて３０分 間インキュベートする。次いでプレートを洗浄しＨＲＰ基質と共に室温にて１５ 分間インキュベートし、結合された接合体を定量する。

本発明の好ましいイムノアッセイの一つが、播種住血管内凝固症候群を有する個 体（ｎ　＝　１５）の血漿サンプルを測定するのに使用された。アッセイ結果は 、−人を除き全ての患者の血漿サンプル中において存意に上昇したＴＡＴ複合体 レベルを示した。試験された個体のうち１２例は、１６０ｎｇ／ｍｉ’より高い ＴＡＴ複合体レベルを有していた。

ＴＡＴ複合体は、本発明の１又はより多くの抗体と結合させた担体複合体を用い て、ヒト血漿サンプルから精製でき、そしてそれ故本発明は、本発明の抗体及び 関連装置を用いた、精製されたＴＡＴ複合体を得るための方法を包含する。適し た精製手順の一つでは、本発明の抗体をゲル又は樹脂のような当該分野において 既知の適当な担体に結合させ、次いで該担体をカラムに充填し、そして次いで該 カラムを通してＴＡＴ複合体を含有するサンプル溶液を流し、選択的にＴＡＴ複 合体を吸着させる。該抗体は、例えば臭化シアン法及びグルタルアルデヒド法、 水性カルボジイミド法、活性エステル法その他の既知の方法により、該担体上に 適切に結合させることができる。該抗体はまた、該担体の表面上に物理的に吸着 させてもよい。

本発明の抗体はまた、ｉｎ　ｖｉｖｏでＴＡＴ複合体の所在をつきとめこれをモ ニターするために使用することができる。例えば、本発明の１又はより多くの抗 体を、インジウム１１のような放射性核種で標識することができる。標識された 抗体が次いでヒトに静脈注射され、そして該標識された抗体がどこに蓄積するか を測定するために該ヒトがスキャンされる。標識された抗体は典型的には、例え ば出血部位のような血液凝固の起こりつつある所等の、ＴＡＴ複合体の濃度の高 い領域に差別的に蓄積する。標識された抗体の量は、シンチグラフィーカメラを 用いる等、既知のスキャニング方法によって定量することができる。

本発明の抗体はまた、例えば薬物、特に血液凝固機序における相互作用に向けら れた薬剤（例えばストレプトキナーゼ、ＴＰＡ及びウロキナーゼのような）のた めの担体として、治療にも使用することができる。該薬剤は、先に特記した標識 の取付けと同じ手段、例えば該抗体の特異性や該薬物の所望の薬理学的効果を阻 害しない共存結合による連結によって、本発明の抗体に取り付けることができる 。薬剤の取り付けられた抗体は、治療的に有効な量で、例えば非経口的に又は経 口で等、多くの既知の如何なる手段によってもヒトに投与することができる。非 経口投与のためには、薬剤の取り付けられた抗体は、典型的には、当該分野にお いて知られている水性及び非水性の滅菌注射組成物として投与される。経口投与 のためには、本発明の治療剤は、例えば、各々が所定量の治療剤を含有したカプ セル剤又は錠剤のような分離した単位として、水性又は非水性液体中の溶液又は 懸濁液として、油／水液体エマルジョンとして、乳糖又はショ糖のような粉末担 体に入れて、ヒトに投与することができる。

ここに言及した全ての文書を、参照によりここにそのまま導入する。

次の限定的でない実施例は、本発明を説明するものである。

一般的コメント 以下の実施例において用いられたＴＡＴ複合体の精製されたサンプルは、Ｇ、　 Ｅｌｇｕｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍｏｓｔａ ｓｉｓ、　６３（３）：’４３５　（＋９９０）に記述された手順によって一般 的に得られた。要するに、トロンビン及びアンチトロンビン■を反応させ、得ら れたＴＡＴ複合体をゲル濾過によって単離した。実施例において用いられた２０ ％完全培地は、１００ｍＪ’当たり次の組成を有していた。

２００ｍＭの１−グルタミン、１ｍ！、７．５％の重炭酸ナトリウム、１ｍＡ’ 、５０００単位／ｍｌのペニシリン＋５０００μ２ζ／ｍｌのストレプトマイシ ン、１ｍＡ？ ０．１Ｍの２−メルカプトエタノール、　’−・、０５ｍＡ’、胎仔牛血清、２ ０ｍＪ、及び Ｌ−グルタミン不含のＲＰＭＩ　１６４０　（ギブコ）で＋ＯＯｍＩ！に。

実施例において用いられたＨΔＴ培地は、次の組成を有してし）た。すなわち、 完全培地１００ｍ１に、１ｍｆの１００×ヒボキサンチン・チミジン及び２ｍｊ ７の５０×アミノプテリンを加えた。実施例において用いられたＨＡＴＧ培地は 次の組成を有していた。ＨＡＴ培地の１００ｍＩ！に、１ｒｎｊ＋の１００×グ リシンを加えた。実施例におし）で用いたＩＬ−６は、培地１ｍＡ？当たり５０ ０単位のヒト組換えＩＬ−６（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 　Ｉｎｃ、）を加えることによって調製した。実施例において用いたＳＴＭは、 培地１ｒｒｌ当たりＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　フィトジエ ン（Ｒｉｂｉ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈａｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ。

）５μｇを添加することによって調製した。

実施例１−免疫法 以下に記述するように、ＴＡＴ複合体に特異的に結合するモノクローナル抗体を 産生ずるＰＥＧ融合のための膵臓ドナーを供するため、次の２群のＢＡＬＢ／ｃ 雌性マウスをＴＡＴ複合体で免疫した。

１、第１群 次のようにして調製したイムノジエンエマルジョン中の各７μｇの精製ＴＡＴ複 合体で、ＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスを感作した。

０．１２５ｍ１のＴＡＴ複合体（５０ｍＭ）リス１５０ｍＭ塩化ナトリウム／　 ０．Ｉ　Ｍ　ＥＤＴＡ＋　ｐ　Ｈ７−’４中３２５μｇ／ｍ　Ｉり１．５００　 ｍｌの完全フロインドアジュバントＬ３７５　ｍ　ＩｌのＤｕｌｂａｃｃｏリン 酸緩衝食塩水各マウスには、このイムノジエンエマルジョンの０．５ｍ！！を腹 腔内注射した。約７か月続いた免疫法プロトコールにおいて、マウスを５乃至１ １０８ｇの精製ＴＡＴ複合体の腹腔内投与によって追加免疫した。

２、第２群 次のようにして調製したイムノジエンエマルジョン中の各１０μｇの精製ＴＡＴ 複合体で、ＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウスを感作した。

０、１２０　ｍ　ｌのＴＡＴ複合体（３２１μｇ／ｍｊ２）１．０００ｍ１７の 完全フロインドアジュバント０．８８０　ｍ　ｌのＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝 食塩水各マウスには、このイムノジエンエマルジョンの０．５ｍ１７を腹腔内注 射した。約９週間続いた免疫法プロトコールにおいて、マウスを１０乃至１１μ ｇのＴＡＴ複合体の腹腔内投与によって追加免疫した実施例２−ＴＡＴ抗体につ いてのＥＬＩＳＡアッセイ１、ＴＡＴ及びＡ　Ｔ　ＩＩ＋によるマイクロタイタ ープレートの被覆ＴＡＴ複合体及びＡＴＩＩ［をそれぞれ別個に、１μｇ　／　 ｍｌの濃度に被覆緩衝液（炭酸緩衝液ｐ）（９）で希釈した。各溶液の１００μ β（＋ＯｎｇのＴＡＴ複合体又はＡＴＩ［）をマイクロタイタープレートの各ウ ェルに入れ、シールして２〜８℃にて終夜インキュベートした。次いで、ウェル の内容物を吸引し、洗浄／貯蔵緩衝液で一回プレートを洗浄し、洗浄液を吸引し 、そしてプレートを再度シールした。プレートは２〜８°Ｃにて使用時まで貯蔵 した。

２、マウス血清の力価測定 上記実施例１の第１群及び第２群の各々の免疫したマウスから収集された血清を 、ＴＡＴ複合体被覆マイクロプレート上におけるＥＬＩＳＡによって、ＴＡＴ複 合体抗体の力価につきア・ソセイした。連続的に希釈された血清（通常１量００ ０乃至１　：３１２５０００までの希釈で試験した）をマイクロプレート上でイ ンキュベートし、酵素標識したヒツジ又はヤギの抗マウス接合体によって探査し 、続いて基質と反応させた。相対力価は、発色反応の強さに従って測定し、８０ ５ｎｍにおいて分光光度法により読み取った。全アッセイにおいて、免疫前血清 を陰性対照として用い、市販のマウスＴＡＴモノクローナル抗体（１ａｔｒｏｎ 　）を陽性対照として用いた。

実施例３−ハイブリドーマの調製 ＴＡＴに対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、２種の細胞融 合によってつくり出された。用いたＰＥＧ融合法は、Ｇ、　Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２５６：　４９５　（＋９７５）によって開示され てイル技術に基づ（。用イた骨髄腫細胞は、ＨＲＰＴ−ｍｉｎｕｓ　Ｐ３−　Ｘ ６３−Ａｇ３．６５３　（Ｐ３Ｘ）　（ＡＴＣＣＣＲＬ＋５８０）テアツタ。ハ イブリッドの選択は、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジ ン）を用いて達成した。融合しなかったＰ３Ｘ骨髄腫細胞は、プリンを産生ずる ためのヒボキサンチンを用いる装置を欠いており且つ培地中に存在するアミノプ テリンがプリン及びピリミジンの内因性合成を阻止するために、この培地では生 存しない。

１、ハイブリドーマＴＡＴ−４を形成するための融合牌細胞の調製 膵臓細胞は、上記実施例１において第１群について記述されているようにして、 ＴＡＴ複合体によって免疫したマウスから得られた。ピンセット及び針を用いて 細胞を牌臓からとり、次いで、血清不含の１２ｍ１の冷２０％完全培地（ＲＰＭ Ｉ　１６１ＪＯ基礎、ギブコ）に懸濁させた。細胞を次いて２００ｘｇにて１０ 分間遠心し、その後上澄を吸引除去し、そして細胞を再度冷培地に懸濁させた。

この洗浄行程を２回反復し、細胞を最終液量］Ｏｍ１に再懸濁させた。該牌細胞 の生存可能細胞カウントは、トリバンブルー排除法により、９８％生存可能性テ １．７　ｘｌＯ＠個であった。用いた計数方法は、Ｋｒｕｓｅ、　Ｐ、Ｆ、　ａ ｎｄＰａｔｔｅｒｓｏｎ、　Ｍ、に、　ａｄｓ、　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　ｐｐ、　３９５−３９７：　１９７３中のＭ、 　Ａｂｓｈａｒ、　”Ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔａｒ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ”によっ て開示されている通りとした。要するに、細胞懸濁液のある量が等量の０．０２ ％トリパンブルーと混合され、標準の計数方法によってヘラサイトメーター中で 細胞が計数される。

骨髄腫調製 骨髄腫細胞を、機械的に採取し、プールし、２００Ｘｇにて１０分間遠心し、そ の後上澄を吸引除去し、そして細胞を２０％完全培地の５０ｍ１に再懸濁させた 。該骨髄腫細胞の生存可能細胞カウントは、７６％生存可能性で、１ｍ４７当た りの生存可能細胞２．９　ｘｌＯ６個であった。

牌細胞と骨髄腫細胞との融合 牌細胞と、＋５ｍ　ｌの骨髄腫細胞懸濁液を、Ｉｌ’ｌ！細胞・骨髄腫細胞懸濁 液４＝ｌて合わせ総生存可能細胞カウント２−＋３ｘ＋Ｏ’とした。血清不含の 冷２０％完全培地によって液量を５０＋ｎ　ｌまで引上げ、次いて細胞を２００ ｘｇにて１０分間遠心した。次いて細胞ペレットを、この培地５０ｍ　！！で２ 回洗浄した。最後の洗浄の後、上澄を吸引除去し、ペレットを２００Ｘｇにて３ 分間遠心し、残った上澄を吸引した。次いでＲＰＭＩ　１６１１０中で緩衝化し た４０％のＰＥ（−；（分子量７０００乃至９０００）により細胞を次いで融合 させた。融合は温（３７°Ｃ）水浴中に保持した管中において行った。３７°Ｃ まて加温したＰＥＧ溶液の１ｍｌをペレットに加え、１分間インキュベートした 。次いで、血清不含の温２０％完全培地の２０ｍＩ！を加えることによって該Ｐ ＥＧ溶液を希釈した。融合した細胞を、３７°Ｃにて１０分間インキュベートし 、次いで２００Ｘｇにて１０分間遠心した。

次いで、融合した細胞のペレットを２０％完全培地の５０ｍ　Ｉｌに再懸濁させ 、ウェル当たり＋、０９ｘｌＯ５乃至Ｌ２６ｘ１０５個の細胞濃度にてプレート に播種した。細胞は、２０％完全培地、２゜５μｇ／ｍｊ！のＳＴＭ含有２０％ 完全培地、又は２５０単位／ｍＩｌのＩＬ−６含有２０％完全培地の、ウェル当 たり最終液量２００μｌとして播種された。３７℃及び１０％ＣＯ２にて終夜イ ンキュベーションの後、各ウェルの培地の半分を吸引し、細胞に２０％ＨＡＴ、 ５　ｕ　ｇ／ｍ　ｉのＳＴＭ含＄２０％ＨＡＴ又は５００単位／ｍｌのＩＬ−６ 含有２０％ＨＡＴを供給した。細胞を肉眼で点検し、融合後１２乃至１４よりハ イブリドーマの増殖をモニターし増殖中のウェルを抗ＴＡＴ複合体抗体の存在に ついてスクリーニングしつつ、数週間のあいだこれらの培地を定期的に供給した 。

２、ハイブリドーマＴＡＴ−５の融合 牌細胞の調製 上記実施例】の第２群について記述した通りにして、ＴＡＴ複合体で免疫したマ ウスから膵臓細胞を得た。ピンセット及び鋏を用いて細胞を膵臓からとり、冷Ｒ ＰＭＩ　１６１１０中で３回洗浄した。細胞を、ＲＰＭＩ　１６ＪＩＯの最終液 量１４０ｍ１にて再懸濁させた。牌細胞の生存可能細胞カウントは、トリパンブ ルー排除法により、９５％生存可能性で５ｘｌＯ’であった。

骨髄腫調製 骨髄腫細胞を、機械的に採取し、プールし、そして冷ＲＰＭＩ　＋６１ＪＯ中で ３回洗浄した。細胞を、最終液量１０ｍ７にて再懸濁させた。骨髄腫細胞の生存 可能細胞カウントは、７１％の生存可能性で１ｒｒｌ当たりの生存可能細胞３． ６　ｘｌＯ’個であった。

牌細胞と骨髄腫細胞の融合 牌細胞と、４．２ｍｊ７の骨髄腫細胞懸濁液とを、牌細胞：骨髄腫細　、胞比約 ４＝１にて合わせて、総生存可能細胞カウント７．５　ｘｌＯ’とした。細胞混 合物を２００ｘｇにて８分間遠心し、上澄を吸引した。

次いで細胞を、ＲＰＭＩ　１６４０中に緩衝化し、たｌｌＯ％ＰＥＧ　（分子量 ７０００乃至９０００）で融合させた。融合は、温（３７°Ｃ）水浴中に保持し た管中で実施した。３７℃に加温したｌ乃至１．５ｍ！！のＰＥＧ溶液を、ペレ ットに１乃至１．５分かけて滴下して加えた。該ＰＥＧ溶液を次いで温ＲＰＭＩ 　１６１１０の添加により５０ｍ　Ｉに希釈した。次いで、融合した細胞を２０ ０Ｘｇにて１０分間遠心した。

上澄を吸引した後、融合した細胞を５０ｍ　Ｉｌの２０％完全培地に再懸濁させ 、ウェル当たり１００μｌで、すなわち生存可能細胞１．２ｘｌ。

６個／ウェルの牌細胞密度で、播種した。３７°Ｃ及び１０％ＣＯｚにて終夜イ ンキュベーションの後、２０％ＨＡＴＧ　（グリシン補充ＨＡＴ培地）の１００ μｌを各ウェルに加えた。細胞を肉眼で点検し、融合後１２乃至Ｉｌｌよりハイ ブリドーマの増殖をモニターし増殖中のウェルを抗ＴＡ’１合体抗体の存在につ いてスクリーニングしつつ、数週間、２０％ＨＡＴＧを定期的に供給した。

実施例４−ＴＡＴ複合体に特異的に結合する抗体のスクリーニング上の実施例３ に記述されているようにして融合によりつくり出された増殖しているハイブリド ーマＴＡＴ−４及びＴＡＴ−５から収集された上澄のサンプルを、上の実施例２ に記述された抗原被覆マイクロプレート（ｌμｇ／ｍ　ｌ　）を用いて、ＴＡＴ 複合体及びＡＴ■に対する活性につきスクリーニングした。ＴＡＴ複合体への結 合につき試験陽性でＡＴＩ［への結合につき陰性であった２１の抗体の各々が、 次の更なる試験のために選択された。

更なる試験は、溶液中のＡＴＩＩ［の存在下（３００μｇ／ｍｌまで）における サンドイッチＥＬ工ＳＡ試験を実施することによって、及びＴＡＴ複合体をスパ イク（５０ｎｇ／ｍｌ）した血漿サンプルについてサンドイッチＥＬＩＳＡを実 施することによって行った。実施した各ＥＬＩＳＡアッセイにつき、２０μｌの 上澄が、被覆されたマイクロプレートのウェル中の８０μｌのサンプル／接合体 希釈液に添加された。これらの新しい抗体は、捕捉抗体として用い（１０μｇ／ ｍＩり、そして用いた接合体はＴＡＴ複合体モノクローナル抗体（０２Ｍ）であ った。低いブランク、ＡＴＩ［どの交差反応性の欠如を示し且つ直線的に希釈し た血漿中の低下したＴＡＴレベルを検出することのできる抗体が選択された。

インキュベーション：　希釈液中のＴＡＴ又は希釈液中の血漿／ＡＴＩＩ［、室 温にて２時間。接合、室温１時間。基質、室温２０分。このような連続的スクリ ーニングに基づき、４つの抗体、０２Ｍ、　Ｃ７２，Ｃ１１４−Ｔ及び５Ｂ４６ が、更なる検討のために選択された。

実施例５−親和性データ 捕捉抗体ＣＩＪｉｌ−Ｔについての親和性定数は、３　ｘｌＯ’　Ｌ／Ｍと測定 された。この定数は、Ｆｒｉｇｕｅｔ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅ ｎｔｓ　ｏｆ’　Ｔｒｕｅ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｏｎ５ｔａｎｔ　ｉｎ　５ｏ ｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｇｅｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃｏｍｐｌａｘｅｓ 　ｂｙＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ ａｙｓ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、。

７７：　３０５　（１９８５）に記述された方法を用いて得られた。

接合体抗体５Ｂ４６の見かけの親和性定数は、３．８　ｘｌＯ’と測定された。

この定数は、抗原被覆プレート上のＨＲＰと接合した及びしていない抗体を用い た、競合的アッセイを実施することによって得られた。

実施例６−競合アッセイ Ｃ７２及びＣｌｌｌ４−Ｔプレートについて、接合体と無標識抗体との異なる組 合せを用いて、競合アッセイを実施した。プレートを、１０μｇ／ｍｊ７のＣＩ Ｊ４−Ｔ又はＣ７２Ｆ（ａｂ’　）２て被覆した。接合体を１．１μｇ／ｍ１に 希釈し、競合抗体を１１０．１１、及び００−１１ａ／ｍｌの濃度に加えた。Ｔ ＡＴインキュベーション室温１時間、接合体＋ＩｇＧインキュベーション室温３ ０分、及び基質インキュベーション室温１５分。結果は、本発明の、Ｄ２Ｍ　１ Ｃ７２、ＣＩＪＩＪ−Ｔ　、及び５Ｂ４６の４つのＴＡＴ抗体の多くの異なる組 合せが、相互の結合を妨害しないか殆と妨害しないということを示した。

実施例７−抗体の特異性の決定 マイクロタイタープレートを、Ｃ１１４−Ｔ　Ｆ（ａｂ’　）ｚ　（Ｉｏμｇ　 ／　ｍ　ｌ　）で被覆した。ＡＴＩ［Ｉの他の複合体（第１ａ因子ＡＴＩＩＩ又 は第１Ｘａ因子ＡＴＩＩ［）を、５０ｎｇ／ｍｊ７で室温にて６０分間インキュ ベートした。次いでプレートを３回洗浄し、接合体（ＨＲＰて標識した５Ｂ１１ ６）を５．５μｇ／ｍＩ！の濃度に添加した。３０分間のインキュベーションの 後、プレートを３回洗浄し、そして基質を添加した。１５分後に１Ｍ硫酸による 処理により反応を停止させた。この抗体の対はいずれの複合体とも何ら有意な交 差反応性を示さず、特に第Ｘａ因子−ＡＴＩ［［複合体とはｏ、ｏｏｑ％未満の 交差反応性しか認められず、第１Ｘａ因子−ＡＴＩ［複合体とは０．０２％未満 の交差反応性しか認められながった。

実施例８−モノクローナル抗体を用いたサンドイッチアッセイモノクローナルＣ ｇｌＩイをマイクロタイターウェルの固相担体に固定化した。次いで、ＴＡＴ複 合体を含有する患者血漿のサンプル及び測定された量のモノクローナル５Ｂｌ１ ６　（酵素、特にセイヨウワサビペルオキシダーゼを共有結合させて標識）を、 該固定化されたＣ８８−Ｔに３７°Ｃにて３０分間加えた。次いで、反応しなか った接合体（５ＢＩＩＪ６）及び反応しなかったいかなるＴＡＴも、洗浄により 除去される。

。結合した標識された抗体の量は、試験サンプル中のＴＡＴ複合体の濃度に正比 例する。

本発明は、その好ましい具体例を参照して詳細に記述された。しかしながら、当 業者が、該開示を考慮することにより、本発明の精神及び範囲の中において修正 及び改良をなし得るということは、認フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号／／　Ｃ１２Ｎ　１５１ ０２ （Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） （７２）発明者　ミラー、ステイープ アメリカ合衆国３３３５１フロリダ、サンライズ、ノースウェスト３１ストリー ト１１７４１（７２）発明者　ペレス・テヒドール、リリアーナアメリカ合衆国 ３３１８５フロリダ、マイアミ、サウスウウエスト１４８アベニュー・コートＩ （７２）発明者　アーバスノット、キャスリン、ニーアメリカ合衆国３３１２９ フロリダ、マイアミ、サウスウウエスト１８テランス　４５９（７２）発明者　 マスティン、エリツク、エルアメリカ合衆国３７６１４テネシー、ジョンソンシ ティ−、アールサークル　１

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトの液体サンプル中のヒトのトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体 の検出のためのイムノアッセイであって、第１の抗体を該液体サンプルと接触さ せ、そして第２の抗体を該液体サンプルと接触させることを含んでなり、ここに 該第１及び第２の抗体のうち少なくとも一方がヒトのトロンビン−アンチトロン ビンＩＩＩ複合体に特異的に結合するものであるイムノアッセイ。
2. ２．該抗体の双方がヒトのトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体に特異的 に結合するものである、請求項１のイムノアッセイ。
3. ３．該第１及び第２の抗体が、該複合体への結合に関し本質的に非競合的である 、請求項１のイムノアッセイ。
4. ４．該第１及び第２の抗体を実質的に同時に該液体サンプルと接触させるもので ある、請求項１のイムノアッセイ。
5. ５．該第１の抗体を該液体サンプルと接触させそして次いで該第２の抗体を該液 体サンプルと接触させるものである、請求項１のイムノアッセイ。
6. ６．該第１の抗体が固体マトリックス上に吸着されておりそして該第２の抗体が レポーター基によって標識されているものである、請求項１のイムノアッセイ。
7. ７．該液体サンプル中のＴＡＴ複合体の量を定最するものである、請求項１のイ ムノアッセイ。
8. ８．該第１及び第２の抗体がモノクローナル抗体である、請求項１のイムノアッ セイ。
9. ９．該液体サンプルが血漿である請求項１のイムノアッセイ。
10. １０．該トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体に特異的に結合する抗体が 、トロンビン、アンチトロンビン、セリンプロテアーゼ第Ｘａ−アンチトロンビ ンＩＩＩ複合体、及びセリンプロテアーゼ第ＩＸａ因子−アンチトロンビンＩＩ Ｉ複合体の各々と約１％未満の交差反応性しか示さないものである、請求項１の イムノアッセイ。
11. １１．該トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体に特異的に結合する抗体が 、トロンビン、アンチトロンビン、セリンプロテアーゼ第Ｘａ−アンチトロンビ ンＩＩＩ複合体、及びセリンプロテアーゼ第ＩＸａ因子−アンチトロンビンＩＩ Ｉ複合体の各々と約０．２％未満の交差反応性しか示さないものである、請求項 １のイムノアッセイ。
12. １２．該第１の抗体がＤ２Ｍ、Ｃ７２、Ｃ４４−Ｔ又は５Ｂ４６の特徴を有する ものである、請求項１のイムノアッセイ。
13. １３．該第２の抗体がＤ２Ｍ、Ｃ７２、Ｃ４４−Ｔ又は５Ｂ４６の特徴を有する ものである、請求項１又は１２のイムノアッセイ。
14. １４．該第１の抗体がＤ２Ｍ、Ｃ７２、Ｃ４４−Ｔ又は５Ｂ４６である、請求項 １のイムノアッセイ。
15. １５．該第２の抗体がＤ２Ｍ、Ｃ７２、Ｃ４４−Ｔ又は５Ｂ４６である、請求項 １又は１４のイムノアッセイ。
16. １６．該第１の抗体がＣ４４−Ｔの特徴を有し且つ該第２の抗体が５Ｂ４６の特 徴を有するものである、請求項６のイムノアッセイ。
17. １７．該第１の抗体がＣ４４−Ｔであり該第２の抗体が５Ｂ４６である、請求項 ６のイムノアッセイ。
18. １８．試験サンプル中のヒトのトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体の検 出のための試験キットであって、第１及び第２の抗体を含んでなり、該抗体のう ち少なくとも一方がヒトのトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体に特異的 に結合することのできるものであるキット。
19. １９．該抗体の双方がヒトのトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体に特異 的に結合するものである、請求項１８の試験キット。
20. ２０．該抗体のうち一方がヒトのトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体に 特異的に結合し、且つ、該抗体のうち他方がヒトのトロンビン−アンチトロンビ ンＩＩＩ複合体に結合するものである、請求項１８の試験キット。
21. ２１．該第１の抗体がＤ２Ｍ、Ｃ７２、Ｃ４４−Ｔ又は５Ｂ４６の特徴を有する ものである、請求項１８の試験キット。
22. ２２．該第２の抗体がＤ２Ｍ、Ｃ７２、Ｃ４４−Ｔ又は５Ｂ４６の特徴を有する ものである、請求項１８の試験キット。
23. ２３．ヒトのトロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体に特異的に結合するモ ノクローナル抗体。
24. ２４．Ｄ２Ｍ、Ｃ７２、Ｃ４４−Ｔ又は５Ｂ４６の特徴を有するものである、請 求項２３のモノクローナル抗体。
25. ２５．Ｄ２Ｍ、Ｃ７２、Ｃ４４−Ｔ又は５Ｂ４６である、請求項２３のモノクロ ーナル抗体。