JP2019504621A - 突然変異フォン・ヴィレブランド因子 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、2016年1月7日出願のオーストラリア特許出願番号第2016900033号に関連し、その優先権を主張するものである。
本明細書で使用される「フォン・ヴィレブランド因子」または「VWF」という用語は、野生型VWFの生物学的活性、特に第VIII因子に結合する能力を有する任意のポリペプチドを指す。野生型VWFをコードする遺伝子は、推定分子量310000Daを有する2813アミノ酸のプレ−プロポリペプチドに翻訳される9kbのmRNAに転写される。プレ−プロポリペプチドは、22アミノ酸のシグナルペプチド、741アミノ酸のプロ−ポリペプチドおよび成熟サブユニットを含む。N末端からの741アミノ酸のプロポリペプチドの切断は、2050アミノ酸からなる成熟VWFを生じる。VWFプレ−プロポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号2に示す。特に指示しない限り、本明細書におけるVWF残基のアミノ酸の番号付けは、VWF分子が配列番号2のすべての残基を含む必要がない場合であっても、配列番号2を参照する。成熟VWFのアミノ酸配列を配列番号2に示す。本明細書で使用される「VWF」という用語は、特に指示しない限り、VWFの成熟形態を指す。
D1−D2−D’−D3−A1−A2−A3−D4−B1−B2−B3−C1−C2−CK
「血液凝固第VIII因子」、「第VIII因子」および「FVIII」という用語は、本明細書において互換的に使用される。「血液凝固第VIII因子」は、野生型血液凝固FVIIIならびに野生型血液凝固FVIIIの凝血促進活性を有する野生型血液凝固FVIIIの誘導体を含む。誘導体は、野生型FVIIIのアミノ酸配列と比較して、欠失、挿入および/または付加を有し得る。FVIIIという用語は、FVIIIのタンパク質分解的にプロセシングされた形態、例えば重鎖および軽鎖を含む活性化前の形態を含む。Bドメイン欠失FVIIIを含む、血漿由来および組換えFVIIIが含まれる。市販製品の例としては、Advate(登録商標)、Kogenate(登録商標)、Xyntha(登録商標)、Loctate(登録商標)およびNovoeight(登録商標)が挙げられる。
本発明の改変VWFは、野生型VWFのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。本発明によると、改変VWFは、配列番号3に示される野生型VWFのD’−D3ドメインのアミノ酸配列と比較して、D’−D3ドメイン内に少なくとも1つのアミノ酸置換を有する。
本発明のポリペプチドは、改変VWFからなっていてもよい。別の実施形態では、本発明のポリペプチドが、半減期延長部分をさらに含み得る。半減期延長部分は、切断されたVWFと融合した異種アミノ酸配列であり得る。あるいは、半減期延長部分は、ペプチド結合とは異なる共有結合によって、切断されたVWFを含むポリペプチドと化学的に結合していてもよい。
好ましくは、半減期延長部分が半減期延長ポリペプチド(HLEP)であり、より好ましくは、HLEPがアルブミンまたはその断片、免疫グロブリン定常領域およびその部分、例えばFc断片、大きな流体力学体積を有する溶媒和ランダム鎖(例えば、XTEN(Schellenbergerら2009;Nature Biotechnol.27:1186〜1190)、ホモアミノ酸リピート(HAP)またはプロリンアラニンセリンリピート(PAS)、アファミン(afamin)、α−フェトプロテイン、ビタミンD結合タンパク質、トランスフェリンまたはその変異体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン−βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド(CTP)、生理条件下でアルブミンまたは免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチドまたは脂質から選択される。
mVWF−L1−H、[式1]
(式中、mVWFは改変VWFであり、L1は化学結合またはリンカー配列であり、HはHLEPである)。
「ヒト血清アルブミン」(HSA)および「ヒトアルブミン」(HA)および「アルブミン」(ALB)という用語は、本出願において互換的に使用される。「アルブミン」および「血清アルブミン」という用語はより広く、ヒト血清アルブミン(およびその断片および変異体)ならびに他の種のアルブミン(およびその断片および変異体)を包含する。
免疫グロブリンG(IgG)定常領域(Fc)は、治療用タンパク質の半減期を増加させることが当技術分野において知られている(Dumont J Aら2006、BioDrugs 20:151〜160)。重鎖のIgG定常領域は、3つのドメイン(CH1〜CH3)およびヒンジ領域からなる。免疫グロブリン配列は、任意の哺乳動物由来、またはそれぞれサブクラスIgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4由来であり得る。抗原結合ドメインを含まないIgGおよびIgG断片もHLEPとして使用され得る。治療用ポリペプチド部分は、好ましくは切断可能でさえあり得る抗体のヒンジ領域またはペプチドリンカーを介してIgGまたはIgG断片に連結される。いくつかの特許および特許出願は、治療用タンパク質のインビボ半減期を増強するための治療用タンパク質と免疫グロブリン定常領域の融合を記載している。米国特許出願公開第2004/0087778号明細書および国際公開第2005/001025号パンフレットは、インビボで迅速に排除される、Fcドメインまたは免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部と、ペプチドの半減期を増加させる生物学的に活性なペプチドの融合タンパク質を記載している。生物学的活性増強、循環半減期の延長およびより高い溶解度を達成したFc−IFN−β融合タンパク質が記載された(国際公開第2006/000448号パンフレット)。血清半減期が延長し、インビボ効力が増加したFc−EPOタンパク質(国際公開第2005/063808号パンフレット)、ならびに全て半減期増強特性を有するG−CSF(国際公開第2003/076567号パンフレット)、グルカゴン様ペプチド−1(国際公開第2005/000892号パンフレット)、凝固因子(国際公開第2004/101740号パンフレット)およびインターロイキン−10(米国特許第6403077号明細書)とのFc融合体が開示された。
本発明によると、治療用ポリペプチド部分を、ペプチドリンカーによってHLEP部分に結合させることができる。リンカーは非免疫原性であるべきであり、切断不能なリンカーであっても、切断可能なリンカーであってもよい。
(a)治療用ポリペプチドの活性化の間にタンパク質分解的に切断されるタンパク質分解性切断部位を含む場合、投与される治療用ポリペプチド自体、
(b)治療用ポリペプチドの関与により活性化もしくは形成されるプロテアーゼによって切断される基質ポリペプチド、または
(c)凝固もしくは線維素溶解に関与するポリペプチド
に由来する配列を含む。
本発明はさらに、本出願に記載されているように、改変VWFまたは前記改変VWFを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。「1個または複数のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、未改変RNAもしくはDNAまたは改変RNAもしくはDNAであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖DNA、一本鎖または二本鎖RNAであり得る。本明細書で使用される場合、「1個または複数のポリヌクレオチド」という用語はまた、1個または複数の改変塩基および/または異常塩基(イノシンなど)を含むDNAまたはRNAも含む。当業者に公知の多くの有用な目的を果たす種々の改変をDNAおよびRNAに対して行うことができることが認識されるであろう。「1個または複数のポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に改変された形態、ならびに例えば単純および複雑な細胞を含むウイルスおよび細胞に特有のDNAおよびRNAの化学的形態を包含する。
(a)本発明の宿主細胞を、所望の改変タンパク質が発現されるような条件下で培養するステップと;
(b)場合により、所望の改変タンパク質を宿主細胞または培養培地から回収するステップと
を含む。
適切な宿主細胞中での高レベルでの組換え突然変異タンパク質の生成には、上記改変ポリヌクレオチド、典型的にはcDNAの、当業者に公知の方法により種々の発現系で増殖させることができる組換え発現ベクター中での適切な調節エレメントと合わせた効率的な転写単位への組み立てが必要である。効率的な転写調節エレメントは、それらの天然宿主としての動物細胞を有するウイルスから、または動物細胞の染色体DNAから誘導され得る。好ましくは、シミアンウイルス40、アデノウイルス、BKポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルスもしくはラウス肉腫ウイルスの長い末端反復に由来するプロモーター−エンハンサーの組合せ、またはβ−アクチンもしくはGRP78などの動物細胞における強力に構成的に転写される遺伝子を含むプロモーター−エンハンサーの組合せを使用することができる。cDNAから転写される安定な高レベルのmRNAを達成するために、転写単位は、その3’近位部分に、転写終止ポリアデニル化配列をコードするDNA領域を含むべきである。好ましくは、この配列は、シミアンウイルス40初期転写領域、ウサギβグロビン遺伝子、またはヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子に由来する。
上記のタイプの分泌細胞の培地中に蓄積する組換え改変VWFタンパク質を、細胞培養培地中の所望のタンパク質と他の物質との間のサイズ、電荷、疎水性、溶解性、特異的親和性等の差異を利用する方法を含む種々の生化学的およびクロマトグラフィー方法によって濃縮および精製することができる。
例1
改善されたFVIII結合を有するvWF突然変異体
背景
上および同時係属中の国際特許出願番号PCT/AU2015/050369に論じられるように、循環FVIIIの大部分はVWFとの複合体である。ヒトでは、FVIIIは、VWFの非存在下および存在下でそれぞれ約2時間および16時間のt1/2で血液から除去される。VWFはFVIII半減期の増加をもたらすが、これはまた自身の半減期によって指示されるt1/2に上限を設定する。米国特許第8575104号明細書は、VWF−アルブミン融合タンパク質を開示している。この融合タンパク質は、げっ歯類モデルにおいて野生型VWFよりも5倍長い半減期を有する。この融合タンパク質とFVIIIの間の安定した複合体は、FVIIIに追加の半減期利益を与えることができる。FVIII/vWF相互作用の平衡結合定数は高いが、結合速度論が迅速であり、VWF−アルブミン融合タンパク質との複合体中のFVIIIは、注入時に内因性vWFと迅速に交換する。したがって、FVIIIとVWF−アルブミン融合体の解離速度が、FVIIIと天然VWFの解離速度と実質的に同等である場合、VWF−アルブミン融合体の使用は、FVIIIの半減期の実質的な増加をもたらさない。
ヒトフォン・ヴィレブランド因子(vWF;アミノ酸(aa)764〜1242(配列番号2);GenBank受託番号NP_000543に基づく)のD’およびD3ドメインをコードする合成コドン最適化cDNAを、GeneART AG(Regensberg、ドイツ)から得た。これを、グリシンセリンリンカーを介して自身のシグナルペプチド(aa1〜22)をコードするために5’末端でおよびヒト血清アルブミン(HAS)をコードするために3’末端で改変した。開始メチオニンの上流にKozakコンセンサス配列(GCCACC)およびオープンリーディングフレームの3’末端にダブル終止コドン(TGA)を有するpcDNA3.1哺乳動物発現ベクター(Invitrogen、米国)に構築物(Hu−vWF[764−1270]−HSA)を指向的にクローニングし、プラスミド配列を自動配列決定により確認した。次いで、この発現プラスミドを鋳型として使用して、標準的なPCR技術を用いて一重、二重または三重残基変化を生じさせ、構築物をpcDNA3.1にクローニングし、上記のように配列決定した。C末端FLAGタグ(DYKDDDDK)を有するHu−vWFのD1およびD2ドメイン(aa1〜762)をコードする第2のコドン最適化cDNAも合成し、GeneArtから得た;これを上記のようにpcDNA3.1にクローニングし、配列決定した。
詳細な動態解析
pH7での詳細な動態解析を対照を含む上位2つの候補物質について設定したその後の実験を精製物質を用いて行った。vWF−HASタンパク質を、Capture Select(商標)ヒトアルブミン親和性樹脂を用いて精製し、vWF−HAS二量体を調製物サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。次いで、精製物質を分析前に4℃で保存した。前と同様にvWF−HAS二量体の捕捉を行い、次いで、第VIII因子を1、0.5、0.25、0.125および0.06nMで注射した。同様の様式で、対照を含む上位2つの候補物質についての詳細な動態解析をpH5.5で設定し、第VIII因子を相互作用に最も適した種々の濃度で注入した。
さらなる動態解析
簡単な方法:
HASに融合した天然vWF(Hu−vWF[1−1242]−HAS)のD1D2D’D3領域をコードする単一DNS構築物を用いて生成した上位候補タンパク質について、pH7およびpH5.5でのさらに詳細な動態解析を設定するその後の実験を行った。これまでのように、この構築物を、一重、二重または三重残基変更を行うための鋳型として使用した。これまでのように、vWF−HAS二量体のトランスフェクションおよび精製を行った。
PK分析およびFVIII半減期への影響
方法
Hu vWF D’D3−FP S764E;S766Y変異体を発現する安定なCHO由来細胞株を、標準的な実験方法を用いて作製した。材料を、10Lバイオリアクターで安定な細胞株から作製し、vWF D’D3−FP S764E;S766Y二量体を前記のように精製した。
最初のスクリーニングから、突然変異:S764P、S766W、V1083A(PWA突然変異体と呼ばれる)およびS764G、S766Y、V1083A(GYA突然変異体と呼ばれる)を有するD’D3−HSAは、第VIII因子に対して最も強い親和性および最も遅い解離速度を有するようであった。
配列表15 <223>成熟一本鎖第VIII因子
本明細書で使用される「フォン・ヴィレブランド因子」または「VWF」という用語は、野生型VWFの生物学的活性、特に第VIII因子に結合する能力を有する任意のポリペプチドを指す。野生型VWFをコードする遺伝子は、推定分子量310000Daを有する2813アミノ酸のプレ−プロポリペプチドに翻訳される9kbのmRNAに転写される。プレ−プロポリペプチドは、22アミノ酸のシグナルペプチド、741アミノ酸のプロ−ポリペプチドおよび成熟サブユニットを含む。N末端からの741アミノ酸のプロポリペプチドの切断は、2050アミノ酸からなる成熟VWFを生じる。VWFプレ−プロポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号2に示す。特に指示しない限り、本明細書におけるVWF残基のアミノ酸の番号付けは、VWF分子が配列番号2のすべての残基を含む必要がない場合であっても、配列番号2を参照する。成熟VWFのアミノ酸配列を配列番号4に示す。本明細書で使用される「VWF」という用語は、特に指示しない限り、VWFの成熟形態を指す。
Claims (45)
- 第VIII因子に結合する改変ポリペプチドであって、配列番号3に示される配列またはその断片においてL18、V42、K149、N248、S279、V320、T325、Q395およびK418からなる群から選択される少なくとも1つの位置における少なくとも1つの改変を含む配列またはその断片を含み;改変されていない配列番号3を含む参照ポリペプチドよりも低い解離速度で第VIII因子に結合する改変ポリペプチド。
- 前記参照ポリペプチドよりも少なくとも5倍低い解離速度で第VIII因子に結合する、請求項1に記載の改変ポリペプチド。
- 前記参照ポリペプチドよりも少なくとも10倍低い解離速度で第VIII因子に結合する、請求項1に記載の改変ポリペプチド。
- 前記参照ポリペプチドよりも少なくとも5倍低いKDで第VIII因子に結合する、請求項1に記載の改変ポリペプチド。
- 前記参照ポリペプチドよりも少なくとも10倍低い解離速度で第VIII因子に結合する、請求項4に記載の改変ポリペプチド。
- 少なくとも2つの改変を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 少なくとも3つの改変を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 配列番号5(S764P/S766W/V1083A)を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 配列番号6(S764G/S766Y/V1083A)を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 配列番号7(S764E/S766Y/V1083A)を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 配列番号8(N1011S/V1083A/K1181E)を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 配列番号17(S766Y/V1083A)を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 配列番号9(V1083A)を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 配列番号10(S1042T)を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 配列番号11(V805A/Q1158L)を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 配列番号12(K912E/T1088S)を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 配列番号13(L781P)を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 配列番号3において少なくとも320位ならびに1位および/または3位の改変を含む配列を含み、改変されていない配列番号3を含む参照ポリペプチドよりも低い解離速度で第VIII因子に結合する、第VIII因子に結合する改変ポリペプチド。
- 配列番号3の少なくとも1、3および320位に改変を含む、請求項6に記載の改変ポリペプチド。
- 配列番号3が、320位の残基がAとなるように改変されている、請求項18または19に記載の改変ポリペプチド。
- 配列番号3が、3位の残基がY、I、M、V、F、H、RおよびWからなる群から選択されるように改変されている、請求項17から20のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 配列番号3が、1位の残基がG、P、V、E、Y、AおよびLからなる群から選択されるように改変されている、請求項17から21のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 改変フォン・ヴィレブランド因子(VWF)である、請求項1から22のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 半減期延長部分をさらに含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 前記半減期延長部分が前記切断されたVWFと融合した異種アミノ酸配列である、請求項24に記載の改変ポリペプチド。
- 前記異種アミノ酸配列が、免疫グロブリン定常領域およびその部分、例えばFc断片、トランスフェリンおよびその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのC末端ペプチド、XTENとして知られている大きな流体力学体積を有する溶媒和ランダム鎖、ホモアミノ酸リピート(HAP)、プロリンーアラニン−セリンリピート(PAS)、アルブミン、アファミン、α−フェトプロテイン、ビタミンD結合タンパク質、生理条件下でアルブミンまたは免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチド、ならびにこれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチドを含むまたはポリペプチドからなる、請求項25に記載の改変ポリペプチド。
- 前記半減期延長部分が改変ポリペプチドにコンジュゲートしている、請求項24から26のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 前記半減期延長部分がヒドロキシエチルデンプン(HES)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリシアル酸(PSA)、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸およびアルブミン結合リガンド、例えば脂肪酸鎖、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される、請求項27に記載の改変ポリペプチド。
- 前記異種アミノ酸配列がアルブミンを含む、請求項28に記載の改変ポリペプチド。
- 前記アルブミンのN末端が直接またはスペーサーを介して改変ポリペプチド配列のC末端に融合している、請求項29に記載の改変ポリペプチド。
- 改変ポリペプチドの天然C末端の1〜5個のアミノ酸が欠失している、請求項30に記載の改変ポリペプチド。
- 第VIII因子分子と、請求項1から31のいずれか一項に記載の改変ポリペプチドとを含む複合体。
- 出血障害の治療または予防に使用するための、請求項1から31のいずれか一項に記載の改変ポリペプチドまたは請求項32に記載の複合体。
- 前記出血障害が、フォン・ヴィレブランド病(VWD)または血友病Aである、請求項33に記載の使用するための改変ポリペプチドまたは複合体。
- 請求項1から31のいずれか一項に記載の改変ポリペプチドまたは請求項32に記載の複合体を含む医薬組成物。
- 薬学的有効量の請求項1から31のいずれか一項に記載の改変ポリペプチドまたは請求項32に記載の複合体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、出血障害を治療する方法。
- 前記出血障害がフォン・ヴィレブランド病(VWD)または血友病Aである、請求項36に記載の方法。
- 出血障害を治療するための医薬品の調製における、請求項1から31のいずれか一項に記載の改変ポリペプチドまたは請求項32に記載の複合体の使用。
- 前記出血障害がフォン・ヴィレブランド病(VWD)または血友病Aである、請求項38に記載の使用。
- 請求項1から31のいずれか一項に記載の改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項40に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクター。
- 発現ベクターである、請求項41に記載のプラスミドまたはベクター。
- 請求項40に記載のポリヌクレオチドまたは請求項41もしくは42に記載のプラスミドを含む宿主細胞。
- 改変VWFを含むポリペプチドを生成する方法であって、
(i)請求項43に記載の宿主細胞を、改変VWFを含むポリペプチドが発現されるような条件下で培養するステップと;
(ii)場合により、改変VWFを含む前記ポリペプチドを前記宿主細胞または前記培養培地から回収するステップと
を含む方法。 - 第VIII因子の半減期を増加させる方法であって、前記第VIII因子を、請求項1から31のいずれか一項に記載の改変ポリペプチドと混合するステップを含む方法。
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