JPH0448189B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

本発明は一般にグルコースの半定量的測定のた
めの非酵素的方法、特に水性試験試料中のグルコ
ースの比色測定のための非酵素的診断用組成物に
関する。 水溶液中のグルコース濃度の測定は砂糖工業に
おいて工業上、および医学上有用である。医学
上、尿又は血液のような体液中のグルコースの半
定量的測定は、糖尿病の集団検診を行うための公
的健康診断として重要であり、砂糖摂取量をコン
トロールしなければならない糖尿病患者にとつて
特に大切である。糖尿病においては早期診断及び
不断のコントロールは極めて重要なので、内科
医、臨床医又は自宅における糖尿病治療薬の利用
者にとつて多大の価値あるものであるためには、
グルコース試験は都合よく実施するに十分な程に
迅速かつ簡便であり、その上更に尿及び血液中グ
ルコースの有意の変動を反映するに十分な程感度
の高いものでなければならない。 １dl当り1000mg（mg／dl）以上のグルコース濃
度としてここで定義される高領域グルコースの半
定量測定は、糖尿病患者の尿中グルコース濃度が
5000mg／dl以上までになりうるので重要である。
高濃度の尿中グルコースの定量測定は少なくとも
２つの理由により重要である。第一に、緊急の場
合、無意識状態が糖尿性昏睡によるものでありう
るかどうか決定するのに重要であり、もし糖尿性
昏睡の場合には高い尿中グルコース濃度により示
唆されるであろう。第二に、もし不十分な量のイ
ンシユリンが投与されていると尿中グルコース濃
度が高まる。従つて高い尿中グルコース濃度を測
定できる試験はインシユリンの必要量を治療上監
視するのに利用できる。 現在臨床的に実施されているグルコースの診断
試験のほとんどはグルコースオキシダーゼのβ−
Ｄ−グルコースへの酵素作用： β−Ｄ−グルコース〔グルコースオキシダーゼ〕 ――――――――――――――――→ H₂O₂＋グルコン酸＋O₂＋H₂O 及びその結果色原体（Cr）が酸化されて、その
酸化状態（Cr^*）（色の変化により目視的に検出
可能）になる反応： H₂O₂＋Cr〔ペルオキシダーゼ〕 ――――――――――――→ H₂O＋Cr^* に基づく。 試験具を半定量的に用いて、試験試料との接触
後発現する色を適切なカラーチヤートと目視比較
することによりグルコース濃度を測定することが
できれば非常に便利である。このような半定量的
測定は反応させた試験具の反射率を計測すること
により機器を用いて実施することもできる。しか
しながらグルコース濃度が1000mg／dl以上に上昇
するにつれ酵素系に用いた大部分の色原体の色が
非常に暗色となり高濃度レベルの識別を行うこと
が不可能となる。米国特許第4340669号には、被
検液体中０、50、100、250、500及び1000mg／dl
のグルコース濃度においてｏ−トリジン、テトラ
メチルベンジジン及びテトラエチルベンジジンを
色原体として用いた場合の観察結果が記載されて
いる。グルコース濃度が０から50mg／dlに上昇す
るとこれら色原体はそれぞれ黄色から明緑色に変
わる。グルコース濃度が500mg／dl以上に上昇す
ると酸化色原体の色は暗色になりそれぞれの色原
体の色を観察するとオリーブ−黒色、黒色及び濃
緑色であつた。この観察によれば、水性液体中の
グルコースの半定量的酵素測定についての問題
点、すなわち高濃度では公知色原体は黒色又は濃
暗緑色に見え、それ故にこの試験具を500mg／dl
以上のグルコース測定に利用するのが制限される
という問題点が強調される。色の変化を機器を用
いて測定するならばこの問題はそれ程深刻ではな
いが、それでも尚問題はある。ｍ−アニシジンの
ような第二色原体を添加することにより、酵素組
成物でのグルコースの目視読取り可能範囲を広げ
るのに成功した例もある（米国特許第4340669
号）。 高グルコース濃度における色識別がむずかしい
上に、酵素に基づくグルコース試験は体液中に存
在するアスコルビン酸（ビタミンＣ）により妨害
され、高価でもありかつ安定性の問題にも遭遇す
る。 グルコース測定のための非酵素的方法も又用い
られている。これらとしては測定電極に基づく機
器的方法（例えば、米国特許第4127448号参照）
及び更に角膜を介して放射線を当てて患者の眼を
走査する非侵入自動グルコースセンサー方式に基
づく機器的方法（米国特許第3958560号参照）が
挙げられる。米国特許第4278438号には糖類の分
析法及び分析装置が開示されている。ホウ酸塩緩
衝援中に調製されたアルキレンポリアミンを用い
て糖類をクロマトグラフイーカラムから溶離す
る。 米国特許第4371374号には、尿試料を適切なボ
ロン酸と処理してグリコシル化化合物を複合化
し、それらを分離しついでその分離された複合化
物質を分析することにより、非酵素的グリコシル
化アミノ酸類、ペプチド類又はそれらの混合物を
分離定量して血中グルコースを監視する方法が開
示されている。 本発明では精密な装置を必要としないにも拘ら
ず、グルコースのジヒドロキシド成分との複合体
生成を用いて任意の所望の濃度レベルに至るグル
コースを測定することができる。砂糖類の、ホウ
素及びアルカリ土類金属ジヒドロキシド類との複
合体生成が報告されている。〔エス・エー・バー
カー（S.A.Barker）等、炭水化物の研究
（Carbohydrate Research）、26（1973）33−40；
エヌ・ロイ（N.Roy）等、炭化水素の研究
（Carbohydrate Research）、24（1972）180−
183〕が、この現象は水性試験試料中のグルコー
ス濃度の半定量的測定の問題を解決するためには
用いられてはいない。 本発明の好ましい実施態様は、グルコースのジ
ヒドロキシド成分との複合体生成の使用に基づく
グルコース測定用の自己表示具を提供する。本発
明の自己表示具によれば色表示チヤートと比較す
ることなしにグルコース濃度の目視測定ができ
る。 コレステロール測定用の使い捨て表示具は米国
特許第4042329号に開示された。この開示された
表示具によれば、表示フオーマツトで直接読取り
可能な、任意の生物学的液体中のコレステロース
濃度が表示される。 本発明は水性試験試料中のグルコースを半定量
的に測定する方法、かかる測定に有用な試験組成
物、その調製及び使用のための試験具及び試験方
法を提供する。水性試験試料中のグルコースを測
定するための本方法は；(a)水性試験試料と、初期
PH6.5以上においてグルコースと複合体を生成す
ることができ、この複合体生成がプロトンを放出
するようなジヒドロキシド成分とを接触させるこ
とにより試験溶液を調製する工程、ついで(b)その
試験溶液の最終PHを測定する工程からなる。本試
験組成物は：(a)初期PH6.5以上においてグルコー
スと複合体を生成することができこの複合体生成
がプロトンを放出するようなジヒドロキシド成
分；及び(b)約PH6.5から約PH12までのPH範囲にお
いて検出可能な比色応答をなすことができるPH指
示薬からなる。担体マトリツクスにこの試験組成
物を包含せしめて特に便利な試験具フオーマツト
を提供することができる。好ましい実施態様は自
己表示試験具である。 シス−ジオール基を含有する多くの炭水化物類
はジヒドロキシド基を含有する化合物と様々な複
合体を生成する〔例えば、エヌ・ロイ（N.Roy）
等、炭水化物の研究（Carvohydrate
Research）、24（1972）180−183、及びエス・エ
ー・バーカー（S.A.Barker）等、炭水化物の研
究（Carbohydrate Research）、26（1973）33−
40参照〕。この複合体生成は、初期PH6.5以上でグ
ルコースと複合体を生成することができこの複合
体生成がプロトンを溶液中に放出するようなジヒ
ドロキシドと、試料とを接触させることにより試
験溶液を調製し、ついでこの試験試料の最終PHを
測定することにより、水性試験試料中のグルコー
ス濃度の半定量的測定を行うのに用いることがで
きることが見出されている。 適切なジヒドロキシド類としてはバリウム、ホ
ウ素、カルシウム、マグネシウム及びストロンチ
ウムのジヒドロキシドである〔Ba（OH）₂、Ｚ−
Ｂ（OH）₂、Ca（OH）₂、Mg（OH）₂及びSr（OH）₂〕。
ホウ素及びストロンチウムのジヒドロキシド類が
好ましい。特に好ましいものは一般式： Ｚ−Ｂ（OH）₂ 式中、Ｚはニトロ基のような電子吸引基又は水
酸基もしくはアレン基のような電子安定基であ
る、 のホウ素ジヒドロキシド類である。Ｚが水酸基で
ある場合はホウ素ジヒドロキシドはホウ酸であ
る。適切なホウ素ジヒドロキシドとしてはホウ
酸、フエニルボロン酸、ｐ−ニトロフエニルボロ
ン酸、４−メトキシフエニルボロン酸及びα−ナ
フチルボロン酸、ナフチルボロン酸並びにアレン
ボロン酸及びそれらの誘導体が挙げられる。アレ
ン基は少なくとも１つの芳香族環を含有する任意
の炭化水素基として定義される。もしジヒドロキ
シドの陰イオン性負型が芳香族環上の電子共鳴に
より安定化されうるならば、これらの基は本発明
において有用である。例えば、Ｚがフエニル基で
ある化合物フエニルボロン酸は本発明において特
に有用である。更に芳香族環上に置換基として電
子吸引基を含むｐ−ニトロフエニルボロン酸のよ
うなアレン誘導体も又有用である。 グルコースは、水性試験試料及び初期PH6.5以
上でグルコースと複合体を生成することができこ
の複合体生成がプロトンを放出するようなジヒド
ロキシドを用いて試験溶液を調製し、ついでこの
試験試料の最終PHを測定することにより測定する
ことができる。試験溶液は通常ジヒドロキシドを
水性試験試料と単に接触させることにより調製す
ることができる。 バリウム、ホウ素、カルシウム、マグネシウム
及びストロンチウムのジヒドロキシドは通常グル
コースと１：１の複合体を生成する。従つて、ジ
ヒドロキシドの試験試料中のグルコースに対する
比は約１：１でなければならない。約500mg／dl
以上のグルコース濃度を測定するのに十分な濃度
に、ホウ素ジヒドロキシド、例えば、ホウ酸の試
験溶液を調製するためには、水酸化カリウム又は
水酸化ナトリウムのような塩基を用いてホウ素ジ
ヒドロキシドを溶解する必要があるかもしれな
い。同等の操作としては水酸化物成分の一部とし
てホウ酸の塩型を用いることであろう。明らか
に、他の塩基類も又ジヒドロキシドとグルコース
間の複合体生成を妨害しないならば有用である。 試験溶液の最終PHは従来PHメーター又はPH指示
薬添加後目視又は機器を用いて測定することがで
きる。 ジヒドロキシド成分とグルコース間の複合体生
成に伴つて起るPH変化は緩衝剤の添加により調整
することができる。約PH6.5から約PH12のPH範囲
に亘るPH変化を調整することができる緩衝剤を含
む試験組成物は、そのような緩衝剤を含まない試
験組成物よりも広い濃度範囲に亘るグルコースの
測定に用いることができる。適切な緩衝剤として
は一般にTRISとして知られているトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン、一般にBICINEと
して知られているＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ
エチル）グリシン及び一般にHEPESとして知ら
れているＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
N′−エタンスルホン酸が挙げられる。ジヒドロ
キシド成分として緩衝剤型を用いることは、ホウ
酸又はフエニルボロン酸のようなホウ素ジヒドロ
キシドを用いる場合には特に便利である。 ホウ酸塩緩衝剤はＺ−Ｂ（OH）₂化合物の酸型
及び塩基型の混合物として定義される。この二型
間の平衡は図式的に： 式中、Ｚは先に述べたいずれの基でもよい、と
して示すことができる。 ホウ酸塩緩衝液はホウ酸（Ｚ＝OH）から又は
フエニルボロン酸のようなアレンボロン酸誘導体
もしくはＺ＝Ｂ（OH）₂化合物の混合物から当業
者に周知の常用の実験室的方法により調製するこ
とができる。例えば、ホウ酸塩緩衝液は、用いた
Ｚ−Ｂ（OH）₂化合物の緩衝範囲内の初期PHまで
水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムのような塩
基でホウ酸を滴定することにより調製することが
できる。この緩衝範囲は、ほとんどのＺ−Ｂ
（OH）₂化合物についてPH6.5からPH12の間になる
と期待される。緩衝液は、等モル部のジヒドロキ
シドの酸型及び塩基型を添加し水に溶解すること
により調製することもできる。 緩衝剤の初期PHの選択は特定の試験組成物で測
定できるグルコースの濃度範囲に影響を与えるこ
とがある。例えば、溶液のPHがホウ酸塩緩衝剤の
pKa以下に落ちるにつれ、ホウ素ジヒドロキシド
のグルコースとの複合体生成効果は下がる。アレ
ンボロン酸誘導体から調製した緩衝剤に電子吸引
性置換基が加わると緩衝剤のpKa、従つてその有
効PH及び複合体生成範囲が変化する。例えば、
pKa9.2のホウ酸は約PH7.0以下のより低い複合体
生成範囲を有するのに対し、pKa8.8のフエニル
ボロン酸は6.5という低いPHでグルコースと複合
体を生成するであろう。pKa7.4のｐ−ニトロフ
エニルボロン酸は更に低い有効PHを有する。ホウ
酸塩緩衝剤及びフエニルボロン酸緩衝剤のような
ホウ酸塩緩衝剤の混合物はホウ酸塩−グルコース
複合体生成の有効PH範囲、及び従つて測定可能な
グルコース濃度範囲を拡げることができる。ホウ
酸塩緩衝剤を用いる場合は、8.0以上の初期PHが
好ましい。ホウ酸塩緩衝液での高領域グルコース
測定のためには、9.0以上の初期PHが特に好まし
い。 初期PHがそのpKaにより僅かに上の場合に、緩
衝剤はグルコース測定には最も有用である。緩衝
剤は、勿論初期PHの設定後水を除去することによ
り乾燥状態で供給することもできる。緩衝剤は再
設定する場合にはそのPHにすることができる。 ここに定義したジヒドロキシド、及び約PH6.5
から約PH12までのPH範囲において検出可能な比色
応答をなすことができるPH指示薬を含む、グルコ
ース測定用試験組成物を提供することは特に便利
である。このPH範囲内で色が変化するいずれのPH
指示薬も、又は指示薬のいずれの組合せも用いる
ことができる。有用な指示薬としてはｍ−クレゾ
ール・パープル、クレゾール・レツド、ニユート
ラル・レツド、チモール・ブルー、フエノールフ
タレイン、ｏ−クレゾール・フタレイン、フエノ
ール・レツド、ブロモチモール・ブルー又はコダ
ツクから入手可能な指示薬の混合物であるユニバ
ーサル・インジケータ（Universal Indicator）
が挙げられる。この試験組成物は、単に組成物と
水性試験試料を接触させ、ついで、生じた検出可
能な比色応答を観察することによりグルコース濃
度を測定するのに用いることができる。 PH指示薬はある範囲のPH値に亘つて色が変化す
る。指示薬のpKaはその色変化のほぼ中間点を表
わす。選択されたホウ酸塩緩衝液の初期PHはどの
指示薬を用いたかに関連する。例えば、ｍ−クレ
ゾール・パープルはPH9.0での紫色からPH7.4での
黄色まで変化する。PH9.0以上のPH値では、この
指示薬は紫色のままか又はPH変化につれ非常に僅
かに色が変化する。もし9.0の初期PHを用いた場
合は、いかなるPH変化についても検出可能な応答
が容易に認められるであろう。9.2以上の初期PH
を用いた場合は、PHがPH9.0より下がるまで組成
物はグルコース濃度に対して色が変化せず、すな
わち検出可能な応答をなさないであろう。従つ
て、初期PHを9.0とすることができる緩衝剤を含
有し、ｍ−クレゾール・パープルを利用する組成
物は、初期PHを9.2とすることができる緩衝剤を
含有する、そのような組成物より低グルコース濃
度に対して感度がより高いことになるであろう。
もし異なるPH指示薬を用いるならば、別の初期PH
が好ましいこともある。例えば、クレゾール・レ
ツドは約8.8（赤）と約7.2（黄）間のPH範囲を有す
る；この試験組成物を用いて最適作業を行うため
には従つてPH9.0のようなより低い初期PHが好ま
しい。１個以上の指示薬を用いると、より広いPH
範囲、従つてより広いグルコース濃度範囲に亘つ
て色を変化させることができる。 高領域グルコース（１dl当り少なくとも1000mg
のグルコースとここでは定義）の測定に特に適切
な試験組成物は約PH6.5から約PH12までのPH範囲
内でPH変化を調節できるホウ酸塩緩衝剤及び約PH
6.5から約PH12までのPH範囲内で検出可能な比色
応答をなすことができるPH指示薬である。高領域
尿グルコース測定用に調製された好ましい組成物
においては、ホウ酸塩緩衝液は約9.2の初期PHを
提供することができるように調製されたホウ酸塩
緩衝液である。この高初期PHによれば、非特性PH
変化並びに尿PH及び緩衝容量による妨害が回避さ
れる。このように調製された緩衝液は凍結乾燥又
は単に乾燥して、緩衝液を調製するために用いた
水を除去することにより乾燥状態で提供すること
ができる。 湿潤剤、安定剤、増粘剤のような更なる成分
を、もしそれらがジヒドロキシのグルコースとの
複合体生成を妨害しないならば試験組成物に添加
することができる。 これら組成物のいずれも瓶詰め試薬、試薬の形
で試験組成物を含有する易破砕性カプセル、丸薬
又は錠剤の形で提供することができる。 本発明の好ましい形の試験具は適切な担体マト
リツクスを液体試薬の形の試験組成物で処理し、
ついで乾燥することにより製造される。 担体マトリツクスは、試験組成物に対して実質
的に不活性であり、試験されるべき水性試料に対
して多孔性及び／又は吸収性である限り、試験組
成物を包含せしめることができるいかなる物質で
あつてもよい。語句“担体マトリツクス”とは水
又は他の生理学的液体にさらされた際、不溶であ
りその構造をもとのままに保持するマトリツクス
ならば吸収性又は非吸収性のいずれのものをも指
す。用いることのできる適切な吸収性マトリツク
スとしては紙、セルロース、木材、合成樹脂フリ
ース、織布、不織布等が挙げられる。非吸収性マ
トリツクスとしてはガラス繊維、ポリマーフイル
ム及び微孔性膜が挙げられる。 従つて、本発明の試験具を製造するに当つて
は、他のものができると同様にすべての上記担体
マトリツクス概念を用いることができることを認
識すべきである。マトリツクスは、組成物成分が
液体又は半液体状態で均一に合せられており、後
に硬化もしくは固化してそれにより成分を包含せ
しめる系からなることもできる。他のマトリツク
ス・フオーマツトでは微孔性膜もしくはポリマ
ー・フイルム・マトリツクスの使用を意図してい
る。微孔性膜はプレフオーム膜として利用可能で
あり、転相のような技法により製造することがで
きる。適切なポリマーフイルムは、スチレン及び
ブタジエンの60：40共重合体から生成されたもの
のようなラテツクスポリマー懸濁液に基づく市販
のラテツクス配合物を用いて製造することができ
る。他の天然もしくは合成ポリマー又はそれらの
混合物も又用いることができる。上記フイルム配
合物の例は、参考のためにここに包含されている
米国特許第3630957号及び第4312834号に見出すこ
とができる。 現在好ましい製造方法は、吸収性担体マトリツ
クス、例えば、ろ紙に組成物の水溶液を含浸せし
め、ついで乾燥し、続いてこの乾燥含浸マトリツ
クスを支持体部材に固着させることである。含浸
溶液は所望の初期PHを示すように調製する。全血
試料が試験される場合には、乾燥含浸担体マトリ
ツクスに塗布して過剰の試料を洗浄、もしくは拭
き取ることができる。乾燥は、包含組成物に有害
な影響を与えないいずれの方法によつて行うこと
ができ、通常は空気炉法による。包含は、担体マ
トリツクスに分析組成物を包含せしめることがで
きる任意の方法、例えば、塗布、浸積、散布、噴
霧又は印刷により達成することができる。乾燥担
体マトリツクスをついで裁断し、支持体部材、例
えば、硬質又は半硬質ポリスチレンフイルム片の
一端に貼付することができる。ジヒドロキシド成
分及び／又は緩衝剤は、担体が湿潤した際包含担
体の表面において初期PHを6.5以上にすることが
できるような形になつている。湿潤した包含担体
のPHは表面電極を用いて測定することができる。
用語“包含担体”とは、試験組成物を包含せしめ
ついで乾燥した担体マトリツクスを指す。透明フ
イルム細片を用いた場合には、反応した試験具の
機器読取りは細片のいずれの側からも行うことが
できる。紙の細片上への貼付は両面接着テープ、
例えば、登録商標ダブル・ステイツク
（DOUBLE STICK ）の下にスリーエム・カン
パニー、セント・ポール、ミネソタ（3M Co.、
St.Paul，MN.）から市販されているものを用い
て行うことができる。 紙担体マトリツクスがホウ酸塩緩衝剤と共に用
いられる場合は、ホウ酸塩緩衝剤を含有する試験
組成物の包含に先立ち、初期PH6.5以上において
フエニルボロン酸から調製したもののような第二
ホウ酸塩緩衝剤の水性溶液で紙を処理することが
有利であることがある。このような前処理は、紙
と試験組成物中のホウ酸塩緩衝剤との間に起こり
うる相互反応を回避するものと考えられる。 固相試験具を製造するにために用いられる試薬
溶液中の成分の濃度範囲は次のようである： 可使濃度 好ましい濃度 ホウ酸塩緩衝剤 0.1−0.9M 0.1−0.4M PH指示薬 0.025−0.2％ 0.04−0.15％ 成分のこれら濃度範囲及び相対濃度は溶液が水
性含浸溶液であろうが又はポリマー懸濁液であろ
うが実行可能である。好ましい試薬溶液は、0.01
から0.30Mのホウ酸塩緩衝剤（滴定によると約
8.5から約9.5の初期PHを示す）及び0.05％から
0.10％の指示薬、例えばｍ−クレゾール・パープ
ルを含む。好ましい実施態様においては、試験組
成物を包含せしめるのに先だち、0.1から0.3Mの
ホウ酸塩緩衝剤（滴定によると6.5以上の初期PH
を示す）を含有する水溶液を紙マトリツクスに含
浸させる。前処理用の好ましいホウ酸塩緩衝剤は
フエニルボロン酸から調製する。 試験具は、試験試料中にそれを瞬間的に浸漬す
るか、そうでなければ試験試料を担体マトリツク
ス上に導入することにより使用するのが有利であ
り、それにより、グルコースが存在する際には検
出可能な比色変化が生じる結果となる。試験試料
との接触はピペツト、綿棒又はスパチユラによつ
ても又行うことができる。尿が用いられる場合は
浸積することは極めて満足できる接触法である
が、血清試料の場合は普通ピペツトを用いること
が必要である。 半定量的グルコース濃度は適切なカラーチヤー
トと比較することにより目視的に測定することが
できるか又は測定はもし透明支持体部材が用いら
れるならば試験具のいずれかの側からの反射率に
より機器を用いて行うことができる。 本発明のグルコース試験具の好ましい実施態様
は、更に用意されたカラーチヤートと比較するこ
となしに水性試験試料中のグルコース濃度を測定
することができる自己表示具である。事実、本発
明に含まれる試薬の基本的化学の故に、使用者が
しなければならない測定はマルチパツド試験具上
の色変化をおこした試験体の数を単に数えるだけ
である自己表示具を提供することができる。自己
表示具は、それぞれの試験体が特定濃度（その濃
度に対してはその試験体は反応するように設計さ
れている）と同等か又はより高い濃度のグルコー
ス試験試料と接触した際、ほぼそれと同一の色に
変化するように作製することができる。 この自己表示具は複数個の試験マトリツクスを
支持体部材に固着することにより製造することが
できる。各試験マトリツクスは、異つたしかし予
め決められた濃度のグルコースと反応するように
設計されている試験組成物を担体に包含せしめる
ことにより製造される。試験組成物は先に述べた
ように配合することができるが、しかしながら通
常は同一の化学成分を各マトリツクスに包含せし
め、各試験マトリツクス中の組成物は単にジヒド
ロキシド濃度及び初期PHが異るであろう。高領域
グルコースのための好ましい配合においては、こ
の自己表示試験具は、検出可能な比色応答をなす
ことができるPH指示薬及びホウ酸塩緩衝剤を有す
る複数個の試験マトリツクスを包含せしめること
により製造され、この試験マトリツクスにおいて
はホウ酸塩緩衝剤濃度及びホウ酸塩緩衝剤の初期
PHがそれぞれの試験マトリツクスで異つている。 この自己表示フオーマツトはホウ酸塩緩衝剤を
用いるグルコース測定には特に好ましい。色が変
化したパツド数を数えることにより、使用者はグ
ルコースの存在量をカラーチヤートとの比較に頼
ることなしに知ることができる。パツドはトリサ
イト（Trycite）のような支持体上に別々に又は
一緒につなげて配列することができる。試験体が
反応するように設計されている濃度より低い試料
グルコース濃度については、色の変化が起こらな
いであろう。１〜２個の試験体の色変化は正常な
読取りに相当するが、３個以上の試験体の変化は
病的症状の可能性を示唆するものであるという情
報が与えられている使用者は、パツドの色をカラ
ーチヤートと比較する必要なしに適切な行動をと
り、もしくは専門的援助を求めることができる。
個々の使用者間の色判別の相違及び異つた照明状
態での色判別の相違があるので、このフオーマツ
トとして本発明を用いることは特に有利である。 ジヒドロキシド複合体生成系において、グルコ
ースのジヒドロキシドとの複合体生成はプロトン
を放出する。従つて系のPHは下がる。単一（試験
体）パツド系においては、その系が測定できるよ
うに設計されているグルコース濃度範囲のグルコ
ースが複合体を生成すると生じるPH範囲に亘つて
指示薬は色が変化する。通常、試験において期待
されるPH範囲のほぼ中間範囲のpKaを有する指示
薬が選択される。グルコースの増加に伴うPHの減
少は、生じたPH変化を最もよく調整する点に試験
体の初期PHを設定することによりいくらか調整す
ることができる。 ほとんどのPH指示薬はかなり広いPH範囲に亘つ
て色が変化するが、しかしながら前記範囲内のよ
り狭いPH範囲に亘つては眼に見える色は明らかに
同一である。 次の実施例は本発明の開発中に行われた実験を
説明するものである。好ましい自己表示フオーマ
ツトは実施例４に述べられている。実施例は本発
明を説明するのに役立つが、それらは発明の範囲
を制限するものとして解釈されるべきではなく、
発明の範囲は特許請求の範囲によつてのみ定義さ
れる。当業者は望ましいと思われる組成物、配合
物及び反応パラメータの成分の変化、代替及び変
更を行うことができるであろう。 省略形 実施例においては次の省略形が用いられる。 mg ミリグラム ml ミリリツトル dl デシリツトル Ｍ モル ％ 100ml溶液当りの重量パーセント PVP−K90 ポリ（ビニルピロリドン）；ジー
エーエフ・コーポレーシヨン（GAF
Corp.）、ニユーヨーク、ニユーヨーク
州から入手の平均分子量360000のもの ｍ−クレゾールパープル メタクレゾールスルホンフタレイン クレゾール・レツド ｏ−クレゾールスルホンフタレイン ニユートラル・レツド ２−メチル−３−アミノ−６−ジメチ
ルアミノフエナジン チモール・ブルー チモールスルホンフタレイン フエニルフタレイン ３，３−ビス（ｐ−ヒドロキシフエニ
ル）フタリド フエノール・レツド フエノルスルホンフタレイン ブロモチモール・ブルー ジブロモチモールスルホンフタレイン クルーセル（Klucel）LF ヒドロキシプロピルセルロース ポリエチレングルコール4000 ポリエチレングルコール；分子量4000 実施例 １ フエニルボロン酸緩衝剤による前処理 ワツトマン（Whatman）54のろ紙を0.2Mフエ
ニルボロン酸緩衝剤（初期PH9.05）を含む水溶液
に含浸した。乾燥紙を次に空気炉中60℃で15分間
乾燥した。乾燥紙を、0.25Mのホウ酸塩緩衝剤
（初期PH9.05）及び0.08％ｍ−クレゾール・パー
プル（ナトリウム塩）を含む水溶液中に含浸し
た。エタノールに溶解した１％ｍ−クレゾール・
パープルの貯蔵溶液を含浸溶液を調製するのに用
いた。ホウ酸塩緩衝液は、ホウ酸を水に溶解し、
水酸化カリウムでPHを9.05に調整しついで所望の
容量に希釈することにより調整した。二度含浸さ
れたろ紙を再び空気炉中60℃で15分間乾燥した。 二度乾燥されたろ紙を取扱いが便利なようにポ
リスチレン支持体部材に固着させた。試験具は、
1000mg／dlから8000mg／dl（すなわち1g／dlか
ら8g／dl）のグルコースを含む水性試料に浸漬
することにより試験された。図に示されたデータ
によれば、グルコース濃度（ｇ／dl）と誌験片の
読取り値との間に良好な直線関係が示されてい
る。 ２ 前処理なしの場合 ワツトマン（Whatman）54のろ紙を： ホウ酸塩緩衝液（1M、初期PH9.5） 2.0ml PVP K90（15％） 1.1ml フエノール・レツド（1M） 0.2ml 水 10.0ml を含む溶液に含浸した。含浸液を空気炉中60℃で
15分間乾燥しついで乾燥紙をポリスチレン製の支
持体部材に固着した。完成された試験具は1000、
2000、3000及び5000mg／dlのグルコース間で良好
な目視解析能を示した。陰性（1000mg／dl未満の
グルコース）に相当する赤色から、黄色（5000
mg／dlのグルコース）まで色が変化する。 ３ ２重指示薬系 尿試験試料中の高領域グルコース（すなわち、
１dl当り少なくとも1000mgの濃度）を測定するた
めの特に好ましい試験具を次のように製造した： 溶液１（10％アセトン水溶液） フエニルボロン酸緩衝剤（初期濃度PH9.0）
0.23M ドデシルベンゼンスルホン酸（ナトリウム
塩） 0.04％ 溶液２ ホウ酸塩緩衝剤（初期PH9.0） 0.30M PVP−Ｋ 60 1.2％ ポリエチレングルコール4000 0.8％ クルーセルLF（エタノール中） 0.4％ トウイーン（Tween）21 0.04％ クレゾール・レツド 0.03％ ブロモチモール・ブルー（エタノール中）
0.003％ 溶液２は10％アセトン溶液になるように調製し
た。最終溶液は10％アセトン及び10％エタノール
を含有した。 ワツトマン（Whatman）54又はＥ＆D204のよ
うなろ紙を溶液１に浸漬しついで乾燥することに
より前処理を施した。乾燥前処理紙を溶液２に浸
漬しついで乾燥した。二重指示薬系によれば、異
なる濃度間の比色応答の差異がより大きいので、
1000mg／dlと10000mg／dl間のグルコース濃度の
半定量的判別が容易になる。このことは目視読取
り試験具にとつて特に望ましい。 ４ グルコース自己表示具 Ａ 支持薬ｍ−クレゾール・パープルを用い
て、１dl当り１、２、４及び8gの尿中グルコー
スを測定するための試験具を製造した。 ４枚のワツトマン54ろ紙（10″×2″もしくは
25.4×5.08cm）をPH9.0において0.2Mホウ酸フエ
ニルで含浸しついで15分間50℃において乾燥し
た。次に各ろ紙片を次の溶液の１つで処理した： The present invention relates generally to non-enzymatic methods for the semi-quantitative determination of glucose, and in particular to non-enzymatic diagnostic compositions for the colorimetric determination of glucose in aqueous test samples. The measurement of glucose concentration in aqueous solutions is of industrial and medical use in the sugar industry. Medically, semi-quantitative measurement of glucose in body fluids such as urine or blood is important as a public health check for mass screening for diabetes, and is useful for diabetic patients who must control their sugar intake. This is especially important. Since early diagnosis and constant control are extremely important in diabetes, they are of great value to physicians, clinicians, or users of home diabetes medications.
Glucose tests must be quick and simple enough to perform conveniently, yet sensitive enough to reflect significant changes in urine and blood glucose. Semi-quantitative measurement of high-range glucose, defined here as a glucose concentration of 1000 mg per deciliter (mg/dl) or higher, is a measure of glucose concentration in the urine of a diabetic patient.
This is important because it can exceed 5000 mg/dl.
Quantitative measurement of high concentrations of urinary glucose is important for at least two reasons. First, in emergency cases, it is important to determine whether unconsciousness may be due to diabetic coma, which would be indicated by high urinary glucose concentrations. Second, if insufficient amounts of insulin are administered, urinary glucose levels increase. Tests that can measure high urinary glucose concentrations can therefore be used to therapeutically monitor insulin requirements. Most of the glucose diagnostic tests currently performed clinically involve glucose oxidase β-
Enzyme action on D-glucose: β-D-glucose [glucose oxidase] ――――――――――――――――→ H ₂ O ₂ + gluconic acid + O ₂ + H ₂ O and the resulting color Reaction in which the drug substance (Cr) is oxidized to its oxidized state (Cr ^* ) (visually detectable by color change): H ₂ O ₂ + Cr [Peroxidase] ------------------------ ---→ Based on H ₂ O + Cr ^* . It would be very convenient to be able to use a test device semi-quantitatively to determine the glucose concentration by visually comparing the color developed after contact with the test sample with an appropriate color chart. Such semi-quantitative measurements can also be performed instrumentally by measuring the reflectance of the reacted test device. However, as glucose concentrations rise above 1000 mg/dl, most of the chromogens used in enzyme systems become very dark in color, making it impossible to discriminate at high concentration levels. U.S. Pat. No. 4,340,669 discloses 0, 50, 100, 250, 500 and 1000 mg/dl in the test liquid.
Observations are described when using o-tolidine, tetramethylbenzidine, and tetraethylbenzidine as chromogens at glucose concentrations of . As the glucose concentration increases from 0 to 50 mg/dl, each of these chromogens changes from yellow to bright green. When the glucose concentration rose to 500 mg/dl or more, the color of the oxidized chromogen became dark, and when the colors of each chromogen were observed, they were olive-black, black, and dark green. This observation addresses a problem with semi-quantitative enzymatic determination of glucose in aqueous liquids, namely that at high concentrations known chromogens appear black or dark green;
The problem is emphasized that the above methods are limited in their use for glucose measurement. Although this problem is less severe if the color change is measured mechanically, it is still a problem. In some cases, the visual readability of glucose in enzyme compositions has been successfully extended by adding a second chromogen such as m-anisidine (U.S. Pat. No. 4,340,669).
issue). In addition to difficult color discrimination at high glucose concentrations, enzyme-based glucose tests are interfered with by ascorbic acid (vitamin C) present in body fluids, are expensive, and encounter stability problems. Non-enzymatic methods for measuring glucose have also been used. These include instrumental methods based on measuring electrodes (see e.g. US Pat. No. 4,127,448);
and also instrumental methods based on non-invasive automated glucose sensor systems (see US Pat. No. 3,958,560) that scan the patient's eye with radiation directed through the cornea. US Pat. No. 4,278,438 discloses a method and apparatus for analyzing sugars. Sugars are eluted from the chromatographic column using an alkylene polyamine prepared in borate buffer. U.S. Pat. No. 4,371,374 discloses non-enzymatically glycosylated amino acids by treating a urine sample with a suitable boronic acid to complex glycosylated compounds, separating them and analyzing the separated complexed materials. A method for monitoring blood glucose by separately quantifying peptides, peptides, or mixtures thereof is disclosed. Although the present invention does not require sophisticated equipment, complexation of glucose with the dihydroxide component can be used to measure glucose to any desired concentration level. Complex formation of sugars with boron and alkaline earth metal dihydroxides has been reported. [SA Barker et al., Carbohydrate Research, 26 (1973) 33-40;
N.Roy et al., Carbohydrate Research, 24 (1972) 180−
[183], but this phenomenon has not been used to solve the problem of semi-quantitative measurement of glucose concentration in aqueous test samples. A preferred embodiment of the present invention provides a self-indicating device for glucose measurement based on the use of complexation of glucose with a dihydroxide moiety. The self-indicating device of the present invention allows visual measurement of glucose concentration without comparison with a color display chart. A disposable indicator for measuring cholesterol was disclosed in US Pat. No. 4,042,329. The disclosed display device displays the cholesterol concentration in any biological fluid that is directly readable in a display format. The present invention provides methods for semi-quantitatively measuring glucose in aqueous test samples, test compositions useful for such measurements, test devices and test methods for their preparation and use. The present method for determining glucose in an aqueous test sample includes: (a) an aqueous test sample and an initial
preparing a test solution by contacting with a dihydroxide component capable of forming a complex with glucose at a pH of 6.5 or above and such that the complex formation releases protons; and (b) the test solution. The process consists of measuring the final pH of the The test composition includes: (a) a dihydroxide component that is capable of forming a complex with glucose at an initial pH of 6.5 or above and such that this complex formation releases protons; and (b) from about PH 6.5 to about It consists of a PH indicator capable of producing a detectable colorimetric response in the PH range up to PH12. The test composition can be incorporated into a carrier matrix to provide a particularly convenient test device format. A preferred embodiment is a self-indicating test device. Many carbohydrates containing cis-diol groups form various complexes with compounds containing dihydroxide groups [e.g. N.Roy et al.
Carbohydrate research, etc.
Research), 24 (1972) 180-183, and SA Barker et al., Carbohydrate Research, 26 (1973) 33-
40]. This complex formation is performed by bringing the test solution into contact with a dihydroxide that can form a complex with glucose at an initial pH of 6.5 or above, and this complex formation releases protons into the solution. It has been found that it can be used to make semi-quantitative measurements of glucose concentration in aqueous test samples by preparing and then measuring the final PH of this test sample. Suitable dihydroxides include barium, boron, calcium, magnesium and strontium dihydroxides [Ba(OH) ₂ , Z-
B(OH) ₂ , Ca(OH) ₂ , Mg(OH) ₂ and Sr(OH) ₂ ].
Boron and strontium dihydroxides are preferred. Particularly preferred are boron dihydroxides of the general formula: Z-B(OH) ₂ , where Z is an electron-withdrawing group such as a nitro group or an electron-stabilizing group such as a hydroxyl group or an allene group. When Z is a hydroxyl group, the boron dihydroxide is boric acid. Suitable boron dihydroxides include boric acid, phenylboronic acid, p-nitrophenylboronic acid, 4-methoxyphenylboronic acid and alpha-naphthylboronic acid, naphthylboronic acid and areneboronic acid and their derivatives. An allene group is defined as any hydrocarbon group containing at least one aromatic ring. If the anionic negative form of dihydroxide can be stabilized by electronic resonance on the aromatic ring, these groups are useful in the present invention. For example, the compound phenylboronic acid, where Z is a phenyl group, is particularly useful in the present invention. Additionally, arene derivatives such as p-nitrophenylboronic acid containing electron-withdrawing groups as substituents on the aromatic ring are also useful. Glucose is prepared by preparing a test solution using an aqueous test sample and a dihydroxide that can form a complex with glucose at an initial pH of 6.5 or above, and this complex formation releases protons, and then It can be determined by measuring the final PH. Test solutions can usually be prepared by simply contacting the dihydroxide with an aqueous test sample. Barium, boron, calcium, magnesium and strontium dihydroxides usually form a 1:1 complex with glucose. Therefore, the ratio of dihydroxide to glucose in the test sample should be approximately 1:1. Approximately 500mg/dl
To prepare a test solution of boron dihydroxide, e.g., boric acid, to a concentration sufficient to measure glucose concentrations of May need to be dissolved. An equivalent operation would be to use the salt form of boric acid as part of the hydroxide component. Obviously, other bases are also useful provided they do not interfere with complex formation between dihydroxide and glucose. The final PH of the test solution can be measured visually or mechanically using a conventional PH meter or after addition of a PH indicator. The PH change that occurs with the formation of a complex between the dihydroxide component and glucose can be adjusted by adding a buffer. A test composition containing a buffer that is capable of adjusting for PH changes over a PH range of about PH 6.5 to about PH 12 will result in glucose measurements over a wider concentration range than a test composition without such a buffer. It can be used for. Suitable buffers include tris(hydroxymethyl)aminomethane, commonly known as TRIS, N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine, commonly known as BICINE, and N-bis(2-hydroxyethyl)glycine, commonly known as HEPES. 2-Hydroxyethylpiperazine-
N'-ethanesulfonic acid is mentioned. The use of a buffer type as the dihydroxide component is particularly convenient when using boron dihydroxides such as boric acid or phenylboronic acid. Borate buffers are defined as a mixture of the acid and base forms of the Z-B(OH) ₂ compound. The equilibrium between these two forms is diagrammatically: In the formula, Z can be any of the groups mentioned above. Borate buffers may be prepared from boric acid (Z=OH) or from areneboronic acid derivatives such as phenylboronic acid or mixtures of Z=B(OH) ₂ compounds by routine laboratory methods well known to those skilled in the art. Can be done. For example, a borate buffer can be prepared by titrating boric acid with a base such as sodium hydroxide or potassium hydroxide to an initial pH within the buffer range of the Z-B(OH) ₂ compound used. can. This buffer range covers most Z-B
It is expected that the PH for the (OH) ₂ compound will be between PH6.5 and PH12. Buffers can also be prepared by adding equimolar parts of acid and base forms of dihydroxide and dissolving them in water. The selection of the initial PH of the buffer can influence the range of glucose concentrations that can be measured with a particular test composition. For example, if the pH of the solution is
As the pKa decreases, the effectiveness of boron dihydroxide in forming a complex with glucose decreases. The addition of electron-withdrawing substituents to buffers prepared from areneboronic acid derivatives changes the pKa of the buffer, and thus its effective PH and complex formation range. for example,
Boric acid with a pKa of 9.2 has a lower conjugation range below about PH 7.0, whereas phenylboronic acid with a pKa of 8.8 will complex with glucose at a PH as low as 6.5. p-Nitrophenylboronic acid with a pKa of 7.4 has an even lower effective PH. Mixtures of borate buffers, such as borate buffers and phenylboronic acid buffers, can extend the effective PH range of borate-glucose complex formation, and thus the range of glucose concentrations that can be measured. When using a borate buffer, an initial pH of 8.0 or higher is preferred. An initial pH of 9.0 or higher is particularly preferred for high range glucose measurements in borate buffers. Buffers are most useful for glucose measurements when the initial PH is slightly above its pKa. The buffer can of course also be supplied in a dry state by removing the water after setting the initial pH. The buffer can be reset to that PH. dihydroxide as defined herein, and about PH6.5
It would be particularly advantageous to provide a test composition for measuring glucose that includes a PH indicator that is capable of producing a detectable colorimetric response in the PH range from about PH12 to about PH12. Any PH that changes color within this PH range
An indicator or any combination of indicators can be used. Useful indicators include m-cresol purple, cresol red, neutral red, thymol blue, phenolphthalein, o-cresol phthalein, phenol red, bromothymol blue or mixtures of indicators available from Kodak. Universal Indicator
can be mentioned. This test composition can be used to measure glucose concentration by simply contacting the composition with an aqueous test sample and then observing the detectable colorimetric response that occurs. PH indicators change color over a range of PH values. The pKa of an indicator represents approximately the midpoint of its color change. The initial PH of the selected borate buffer is related to which indicator is used. For example, m-cresol purple changes from purple at PH9.0 to yellow at PH7.4. At pH values above PH9.0, this indicator remains purple or changes color very slightly as the pH changes. If an initial PH of 9.0 is used, a detectable response to any PH change will be easily observed. Initial PH of 9.2 or higher
If used, the composition will not change color, ie, have no detectable response to glucose concentration, until the PH falls below PH 9.0. Therefore, a composition containing a buffering agent capable of setting an initial pH of 9.0 and utilizing m-cresol purple is a composition containing a buffering agent capable of setting an initial pH of 9.2. There will be greater sensitivity to lower glucose concentrations.
If a different PH indicator is used, a different initial PH
is sometimes preferable. For example, Cresol Red has a PH range between about 8.8 (red) and about 7.2 (yellow); optimal working with this test composition therefore requires a lower initial PH such as PH9.0. is preferred. Using more than one indicator allows for a wider range of pH
The color can change over a range and therefore a wider range of glucose concentrations. High-range glucose (at least 1000 mg per dl)
A particularly suitable test composition for the measurement of glucose (as defined herein) is a borate buffer that can adjust the PH change within the PH range of about PH 6.5 to about PH 12 and about PH
It is a PH indicator that can produce a detectable colorimetric response within the PH range of 6.5 to about PH12. In a preferred composition prepared for high-range urine glucose measurements, the borate buffer is a borate buffer prepared to provide an initial PH of about 9.2. According to this high initial PH, non-characteristic PH
Changes and disturbances due to urine PH and buffer capacity are avoided. Buffers thus prepared can be provided in a dry state by lyophilization or simply drying to remove the water used to prepare the buffer. Additional ingredients such as wetting agents, stabilizers, thickening agents can be added to the test composition if they do not interfere with complex formation of dihydroxy with glucose. Any of these compositions can be provided in the form of a bottled reagent, a crushable capsule, a pill, or a tablet containing the test composition in reagent form. A preferred form of the test device of the invention comprises treating a suitable carrier matrix with a test composition in the form of a liquid reagent;
It is then manufactured by drying. The carrier matrix is any material capable of entrapping the test composition as long as it is substantially inert to the test composition and porous and/or absorbent to the aqueous sample to be tested. It may be hot. The term "carrier matrix" refers to any absorbable or nonabsorbable matrix that is insoluble and retains its structure when exposed to water or other physiological fluids. Suitable absorbent matrices that can be used include paper, cellulose, wood, synthetic resin fleece, woven fabrics, non-woven fabrics, and the like. Non-absorbable matrices include glass fibers, polymer films and microporous membranes. It should therefore be appreciated that all of the above carrier matrix concepts can be used, as well as others, in manufacturing the test devices of the present invention. The matrix can also consist of a system in which the components of the composition are uniformly combined in a liquid or semi-liquid state, which subsequently hardens or solidifies, thereby enclosing the components. Other matrix formats contemplate the use of microporous membranes or polymer film matrices. Microporous membranes are available as preformed membranes and can be manufactured by techniques such as phase inversion. Suitable polymer films can be made using commercially available latex formulations based on latex polymer suspensions, such as those made from 60:40 copolymers of styrene and butadiene. Other natural or synthetic polymers or mixtures thereof can also be used. Examples of such film formulations can be found in US Pat. Nos. 3,630,957 and 4,312,834, which are incorporated herein by reference. A currently preferred method of manufacture is to impregnate an absorbent carrier matrix, such as filter paper, with an aqueous solution of the composition, then dry, and subsequently adhere the dry impregnated matrix to a support member. The impregnation solution is prepared to exhibit the desired initial PH. If a whole blood sample is to be tested, a dry impregnated carrier matrix can be applied and excess sample washed or wiped off. Drying can be accomplished by any method that does not deleteriously affect the included composition, typically by air oven methods. Encapsulation can be accomplished by any method capable of incorporating the analytical composition into the carrier matrix, such as coating, dipping, dusting, spraying or printing. The dry carrier matrix can then be cut and applied to one end of a support member, such as a piece of rigid or semi-rigid polystyrene film. The dihydroxide component and/or the buffer are in such a form that when the carrier is wetted, the initial pH on the surface of the encapsulated carrier can be 6.5 or higher. The PH of a wetted inclusion carrier can be measured using a surface electrode.
The term "containing carrier" refers to a carrier matrix that has encapsulated the test composition and then dried. If a transparent film strip is used, instrumental readings of the reacted test device can be taken from either side of the strip. For pasting onto paper strips, use double-sided adhesive tape,
For example, under the registered trademark DOUBLE STICK, 3M Co., St. Paul, Minn.
St. Paul, Minn.). If the paper carrier matrix is used with a borate buffer, a secondary borate salt, such as that prepared from phenylboronic acid, at an initial pH of 6.5 or above, is added prior to inclusion of the test composition containing the borate buffer. It may be advantageous to treat the paper with an aqueous solution of a buffer. Such pretreatment is believed to avoid possible interactions between the paper and the borate buffer in the test composition. The concentration ranges of the components in the reagent solution used to manufacture the solid phase test device are as follows: Working concentration Preferred concentration Borate buffer 0.1−0.9M 0.1−0.4M PH indicator 0.025−0.2 % 0.04-0.15% These concentration ranges and relative concentrations of the components are workable whether the solution is an aqueous impregnation solution or a polymer suspension. A preferred reagent solution is 0.01
to 0.30M borate buffer (according to titration approx.
showing an initial PH of about 9.5 from 8.5) and from 0.05%
Contains 0.10% indicator, such as m-cresol purple. In a preferred embodiment, a 0.1 to 0.3 M borate buffer (with an initial pH of 6.5 or higher by titration) is added prior to incorporation of the test composition.
The paper matrix is impregnated with an aqueous solution containing . A preferred borate buffer for pretreatment is prepared from phenylboronic acid. The test device is advantageously used by momentarily immersing it in the test sample or otherwise introducing the test sample onto the carrier matrix, so that when glucose is present A detectable colorimetric change results. Contact with the test sample can also be made with a pipette, cotton swab or spatula. Immersion is a very satisfactory contact method when urine is used, but for serum samples it is usually necessary to use a pipette. Semi-quantitative glucose concentrations can be determined visually by comparison with a suitable color chart or, if a transparent support member is used, measurements can be made by instrumentation by reflectance from either side of the test device. This can be done using A preferred embodiment of the glucose test device of the present invention is a self-indicating device that is capable of determining the glucose concentration in an aqueous test sample without further comparison to a prepared color chart. In fact, because of the basic chemistry of the reagents involved in the present invention, the present invention provides a self-indicating device in which the only measurement the user has to make is simply counting the number of specimens that have undergone a color change on the multipad test device. be able to. The self-indicating device detects approximately the same concentration of glucose test sample when each test specimen comes into contact with a glucose test sample at a concentration equal to or greater than the specified concentration (to which the test specimen is designed to respond). It can be made to change to the same color. This self-indicator device can be manufactured by affixing a plurality of test matrices to a support member. Each test matrix is manufactured by incorporating into a carrier a test composition that is designed to react with a different but predetermined concentration of glucose. The test compositions can be formulated as described above, however, typically the same chemical constituents are incorporated into each matrix and the compositions in each test matrix differ simply in dihydroxide concentration and initial pH. Probably. In a preferred formulation for high range glucose, the self-indicating test device is manufactured by incorporating a plurality of test matrices having a PH indicator and a borate buffer capable of producing a detectable colorimetric response. In this test matrix, the borate buffer concentration and initial borate buffer
The pH is different for each test matrix. This self-indicating format is particularly preferred for glucose measurements using borate buffers. By counting the number of pads that have changed color, the user can know the amount of glucose present without relying on comparison with a color chart. The pads can be arranged separately or strung together on a support such as Trycite. For sample glucose concentrations lower than the concentration to which the test specimen is designed to react, no color change will occur. The user should be informed that a color change in one or two specimens corresponds to a normal reading, but that a change in three or more specimens is indicative of a possible pathological condition. , you can take appropriate action or seek professional help without having to compare the color of the pads to a color chart.
The use of the present invention in this format is particularly advantageous because of differences in color perception between individual users and in different lighting conditions. In the dihydroxide complex formation system, complex formation of glucose with dihydroxide releases protons. Therefore, the pH of the system decreases. In a single (test specimen) pad system, the indicator changes color over the PH range that occurs when glucose forms complexes over the glucose concentration range that the system is designed to measure. Typically, an indicator is selected that has a pKa in the approximate mid-range of the PH range expected in the test. The decrease in PH with increasing glucose can be adjusted somewhat by setting the initial PH of the test specimen to a point that best adjusts for the resulting PH changes. Most PH indicators change color over a fairly wide PH range, however over narrower PH ranges within said range the visible color is clearly the same. The following example describes experiments conducted during the development of the present invention. A preferred self-display format is described in Example 4. While the examples serve to illustrate the invention, they should not be construed as limiting the scope of the invention;
The scope of the invention is defined solely by the claims. Those skilled in the art will be able to make changes, substitutions and modifications in the compositions, formulations and reaction parameters as deemed desirable. Abbreviations The following abbreviations are used in the examples. mg milligram ml milliliter dl deciliter M mole % weight percent per 100 ml solution PVP-K90 Poly(vinylpyrrolidone); GAF Corporation (GAF
Corp., New York, New York, with an average molecular weight of 360,000. Najin Thymol Blue Thymol Sulfone Phthalein Phenyl Phthalein 3,3-bis(p-hydroxyphenyl) phthalide Phenol Red Phenol Sulfone Phthalein Bromo Thymol Blue Dibromo Thymol Sulfone Phthalein Klucel LF Hydroxypropyl Cellulose Polyethylene Glycol 4000 Polyethylene Glycol; Molecular Weight 4000 Example 1 Pretreatment with Phenylboronic Acid Buffer A Whatman 54 filter paper was impregnated with an aqueous solution containing 0.2M phenylboronic acid buffer (initial pH 9.05). The dried paper was then dried in an air oven at 60°C for 15 minutes. The dry paper was impregnated in an aqueous solution containing 0.25M borate buffer (initial pH 9.05) and 0.08% m-cresol purple (sodium salt). 1% m-cresol dissolved in ethanol
The purple stock solution was used to prepare the impregnation solution. Borate buffer dissolves boric acid in water,
The pH was adjusted to 9.05 with potassium hydroxide and then diluted to the desired volume. The twice-impregnated filter paper was again dried in an air oven at 60° C. for 15 minutes. The twice dried filter paper was affixed to a polystyrene support member for convenient handling. The test equipment is
It was tested by immersion in an aqueous sample containing 1000 mg/dl to 8000 mg/dl (i.e. 1 g/dl to 8 g/dl) of glucose. The data shown in the figure shows a good linear relationship between glucose concentration (g/dl) and strip reading. 2. Without pretreatment: Whatman 54 filter paper: Borate buffer (1M, initial pH 9.5) 2.0ml PVP K90 (15%) 1.1ml Phenol Red (1M) 0.2ml Water 10.0ml It was impregnated with a solution containing. The impregnating solution was heated at 60℃ in an air oven.
After drying for 15 minutes, the dried paper was fixed to a polystyrene support member. 1000 completed test tools,
It showed good visual resolution between 2000, 3000 and 5000 mg/dl glucose. from red corresponding to negative (less than 1000 mg/dl glucose) to yellow (5000 mg/dl).
mg/dl of glucose). 3 Dual indicator system High range glucose in urine test sample (i.e.
A particularly preferred test device for determining concentrations of at least 1000 mg/dl) was prepared as follows: Solution 1 (10% acetone in water) Phenylboronic acid buffer (initial concentration PH 9.0)
0.23M Dodecylbenzenesulfonic acid (sodium salt) 0.04% Solution 2 Borate buffer (initial pH 9.0) 0.30M PVP-K 60 1.2% Polyethylene glycol 4000 0.8% Krucel LF (in ethanol) 0.4% Tween )21 0.04% Cresol Red 0.03% Bromothymol Blue (in ethanol)
0.003% Solution 2 was prepared to be a 10% acetone solution. The final solution contained 10% acetone and 10% ethanol. Pretreatment was performed by soaking filter paper, such as Whatman 54 or E&D 204, in solution 1 and drying. The pre-drying treated paper was dipped into solution 2 and then dried. According to the dual indicator system, the difference in colorimetric response between different concentrations is larger;
Semi-quantitative discrimination of glucose concentration between 1000 mg/dl and 10000 mg/dl becomes easy. This is particularly desirable for visual read test devices. 4. Glucose self-indicating device A Test devices for measuring urinary glucose of 1, 2, 4, and 8 g per dl were manufactured using the supporting agent m-cresol purple. 4 sheets of Watmann 54 filter paper (10″ x 2″ or
25.4 x 5.08 cm) was impregnated with 0.2M phenyl borate at pH 9.0 and dried for 15 minutes at 50°C. Each filter paper strip was then treated with one of the following solutions:

【表】 ろ紙を再び乾燥し（15分間50℃において）、両
面接着テープに貼付しついで１／5″（0.508cm）の
リボンに裁断した。このリボンを、ホウ酸塩及び
PHが把手に向つて増加していくような順にトリサ
イト（Trycite）上に貼付しついで１／5″（0.508
cm）細片に裁断した。 １dl当り6gのグルコースを含有する尿試料に
浸漬すると、３つの試験体は紫色から金色に色が
変化した。最終的金色の濃さはそれぞれの反応試
験体について異る（すなわち、僅かに淡い金色か
ら濃い金色まで）が、6g／dl以下のグルコース
を測定するように設計された反応パツドのすべて
は容易に金色として同定された。8g／dlのグル
コースと反応するように設計された四番目の試験
体は紫色のままであつた。 Ｂ 同様の自己表示具を指示薬としてクレゾー
ル・レツドを用いて製造した。 ４枚のワツトマン54ろ紙（10″×2″もしくは
25.4×5.08cm）をPH8.0において0.1Mホウ酸フエ
ニルで処理しついで15分間50℃で乾燥した。それ
ぞれを別々に４つの異る溶液の１つで含浸した：[Table] The filter paper was dried again (15 minutes at 50°C), applied to double-sided adhesive tape, and cut into 1/5" (0.508 cm) ribbons. The ribbons were coated with borate and
Paste it on the Trycite in the order that the PH increases toward the handle, and then
cm) cut into strips. When immersed in a urine sample containing 6 g glucose per dl, the three specimens changed color from purple to gold. Although the final gold color strength will vary for each reaction specimen (i.e., from slightly pale gold to deep gold), all reaction pads designed to measure glucose below 6 g/dl easily Identified as golden. The fourth specimen, designed to react with 8 g/dl glucose, remained purple. B. A similar self-indicator was manufactured using cresol lead as an indicator. 4 sheets of Watmann 54 filter paper (10″ x 2″ or
25.4 x 5.08 cm) was treated with 0.1M phenyl borate at pH 8.0 and dried at 50°C for 15 minutes. Each was impregnated separately with one of four different solutions:

【表】 試験体はそれぞれ尿試験試料の１、２、４、及
び8g／dlグルコースと反応するように設計され
た。試験具は先に述べたように組立てられた。こ
の自己表示具は、0.5g／dlのグルコースを含有す
る尿試料に浸漬した際、色の変化を示さなかつた
（赤色のまま）。しかしながら3g／dlのグルコー
スを含有する尿試料に浸漬した際、２つのパツド
は色が変化した（黄色に）。 上述の本発明の多くの修正及び変更が本発明の
精神又は範囲を逸脱することなく行うことができ
ることは明らかである。Table: The test specimens were designed to react with 1, 2, 4, and 8 g/dl glucose of the urine test sample, respectively. The test device was assembled as described above. This self-indicator device showed no color change (remained red) when immersed in a urine sample containing 0.5 g/dl glucose. However, when immersed in a urine sample containing 3 g/dl glucose, the two pads changed color (to yellow). It will be obvious that many modifications and variations of the invention described above can be made without departing from the spirit or scope of the invention.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

図は、本発明の非酵素的試験具を用いてのグル
コース濃度の目視測定の再現性を示している。高
領域グルコースの半定量的測定用に案出された試
験具を1g／dlから8g／dlまでのグルコースを含
有する考案された尿試験試料と接触させた。グラ
フは、グルコース濃度すなわちｇ／dlで表わされ
たＧと試験具の読取り値すなわちｇ／dlで表わさ
れたＲとの直線関係を立証している。試験具は、
ホウ酸から調製したホウ酸塩緩衝剤及びPH指示薬
からなる試験組成物を包含させるのに先立ち、フ
エニルボロン酸から調製したホウ酸塩緩衝剤で紙
製担体マトリツクスを前処理することにより製造
した。 The figure shows the reproducibility of visual measurements of glucose concentration using the non-enzymatic test device of the invention. A test device designed for semi-quantitative measurement of high range glucose was contacted with a designed urine test sample containing glucose from 1 g/dl to 8 g/dl. The graph establishes a linear relationship between the glucose concentration, G in g/dl, and the test device reading, R in g/dl. The test equipment is
A test composition consisting of a borate buffer prepared from boric acid and a PH indicator was prepared by pre-treating a paper carrier matrix with a borate buffer prepared from phenylboronic acid.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １ 水性試験試料中のグルコースの半定量的測定
に有用な方法であつて、 (a) 水性試験試料と、初期PH6.5以上においてグ
ルコースと複合体を形成してプロトンを放出す
ることができるジヒドロキシド成分とを接触さ
せることにより試験溶液を調製する工程；及び (b) 試験溶液の最終PHを約PH6.5から約PH12まで
のPH範囲において検出可能な比色応答をなすこ
とができるPH指示薬を用いて測定する工程； からなることを特徴とする方法。 ２ ジヒドロキシド成分がホウ素及びストロンチ
ウムのジヒドロキシドから選択される特許請求の
範囲第１項記載の方法。 ３ ジヒドロキシド成分がホウ素ジヒドロキシド
であり、かつ試験溶液が約PH6.5からPH12までの
範囲でのPH変化を調整することができる緩衝剤を
更に含有する特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ ジヒドロキシド成分が約PH6.5から約PH12ま
でのPH範囲でのPH変化を調整することができるホ
ウ酸塩緩衝剤である特許請求の範囲第１項記載の
方法。 ５ 緩衝剤がホウ酸緩衝剤又はフエニルボロン酸
緩衝剤である特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６ 水性試験試料中のグルコースの半定量的測定
のための試験組成物であつて、 (a) 初期PH6.5以上においてグルコースと複合体
を形成してプロトンを放出することができるジ
ヒドロキシド成分；及び (b) 約PH6.5から約PH12までのPH範囲において検
出可能な比色応答をなすことができるPH指示
薬； からなることを特徴とする試験組成物。 ７ ジヒドロキシド成分がホウ素及びストロンチ
ウムのジヒドロキシドから選択される特許請求の
範囲第６項記載の組成物。 ８ ジヒドロキシド成分がホウ素ジヒドロキシド
であり、かつ試験溶液が約PH6.5から約PH12まで
の範囲でのPH変化を調整することができる緩衝剤
を更に含有する特許請求の範囲第７項記載の組成
物。 ９ ジヒドロキシド成分が約PH6.5から約PH12ま
でのPH範囲でのPH変化を調整することができるホ
ウ酸塩緩衝剤である特許請求の範囲第６項記載の
組成物。 １０ 1dL当り少なくとも1000mgの水性試験試料
中グルコースの半定量測定のための試験組成物で
あつて、 (a) 約PH6.5から約PH12までのPH変化を調整する
ことができるホウ酸塩緩衝剤；及び (b) 約PH6.5から約PH12までのPH範囲において検
出可能な比色応答をなすことができるPH指示
薬； からなる特許請求の範囲第６項記載の試験組成
物。 １１ 水性試験試料中のグルコースの半定量的測
定のための試験具であつて、担体マトリツクス及
びそれに包含せしめられた試験組成物からなり、
試験組成物が、 (a) 担体が湿潤した際、包含担体の表面において
PH6.5以上を示すことができ、又グルコースと
複合体を形成してプロトンを放出することので
きるジヒドロキシド成分；及び (b) 約PH6.5から約PH12までのPH範囲において検
出可能な比色応答をなすことができるPH指示
薬； を含有することを特徴とする試験具。 １２ ジヒドロキシド成分がホウ素及びストロン
チウムのジヒドロキシドから選択される特許請求
の範囲第１１項記載の試験具。 １３ 1dL当り少なくとも1000mgの水性試験試料
中グルコースの半定量的測定のための試験具であ
つて、担体マトリツクス及びそれに包含せしめら
れた試験組成物からなり、試験組成物が、 (a) 約PH6.5から約PH12までのPH範囲でのPH変化
を調整することができるホウ酸塩緩衝剤；及び (b) 約PH6.5から約PH12までのPH範囲において検
出可能な比色応答をなすことができるPH指示
薬； を含有する特許請求の範囲第１１項記載の試験
具。 １４ カラーチヤートなしに、水性試験試料中の
グルコース濃度の目視半定量的測定を行うのに有
用な自己表示試験具であつて、 (a) 指示体部材に固着した複数個の試験マトリツ
クスからなり； (b) 各試験マトリツクスが担体マトリツクス及び
それに包含された試験組成物からなり； (c) 各試験組成物が、初期PH6.5以上においてグ
ルコースと複合体を形成してプロトンを放出す
ることができるジヒドロキシド成分、及び約PH
6.5から約PH12までのPH範囲において検出可能
な比色応答をなすことができるPH指示薬を含有
し； (d) 各試験マトリツクスが、用いる初期PH及びジ
ヒドロキシドの包含濃度により他の包含試験組
成物とは異なる試験組成物を包含せしめたもの
であり； 各試験マトリツクスが異なる濃度のグルコース
に応答してほぼ同一の目視比色応答をなすことが
できるようにしたことを特徴とする試験具。 １５ ジヒドロキシド成分がホウ素及びストロン
チウムのジヒドロキシドから選択される特許請求
の範囲第１４項記載の試験具。 １６ ジヒドロキシド成分がホウ素ジヒドロキシ
ドであり、かつ試験溶液が約PH6.5から約PH12ま
での範囲でのPH変化を調整することができる緩衝
剤を更に含有する特許請求の範囲第１５項記載の
試験具。 １７ ジヒドロキシド成分が約PH6.5から約PH12
までのPH範囲でのPH変化を調整することのできる
ホウ酸塩緩衝剤である特許請求の範囲第１６項記
載の試験具。 １８ カラーチヤートなしに、１dl当り少なくと
も1000mgの水性試験試料中グルコースの目視半定
量的測定を行うのに有用な自己表示試験具であつ
て、 (a) 指示体部材に固着した複数個の試験マトリツ
クスからなり； (b) 各試験マトリツクスが担体マトリツクス及び
それに包含された試験組成物からなり； (c) 各試験組成物が、約PH6.5から約PH12までの
PH範囲でのPH変化を調整することができるホウ
酸塩緩衝剤、及び約PH6.5から約PH12までのPH
範囲において検出可能な比色応答をなすことが
できるPH指示薬を含有し； (d) 各試験マトリツクスが、用いる初期PH及びホ
ウ酸塩緩衝剤の濃度により他の包含試験組成物
とは異なる試験組成物を包含せしめたものであ
り； 各試験マトリツクスが異なる濃度のグルコース
に応答してほぼ同一の目視比色応答をなすことが
できるようにした特許請求の範囲第１４項記載の
試験具。[Scope of Claims] 1. A method useful for semi-quantitative measurement of glucose in an aqueous test sample, which method comprises: (a) forming a complex with the aqueous test sample and glucose at an initial pH of 6.5 or higher to generate protons; (b) adjusting the final pH of the test solution to a detectable colorimetric response in the PH range from about PH 6.5 to about PH 12; A method characterized by comprising: a step of measuring using a PH indicator that can be performed. 2. The method of claim 1, wherein the dihydroxide component is selected from boron and strontium dihydroxides. 3. The method of claim 2, wherein the dihydroxide component is boron dihydroxide, and the test solution further contains a buffering agent capable of adjusting pH changes in the range of about PH6.5 to PH12. . 4. The method of claim 1, wherein the dihydroxide component is a borate buffer capable of adjusting PH changes in the PH range from about PH 6.5 to about PH 12. 5. The method according to claim 3, wherein the buffer is a borate buffer or a phenylboronic acid buffer. 6. A test composition for semi-quantitative measurement of glucose in an aqueous test sample, comprising: (a) a dihydroxide component capable of forming a complex with glucose and releasing protons at an initial pH of 6.5 or higher; and (b) a PH indicator capable of producing a detectable colorimetric response in the PH range from about PH6.5 to about PH12. 7. The composition of claim 6, wherein the dihydroxide component is selected from boron and strontium dihydroxides. 8. The method of claim 7, wherein the dihydroxide component is boron dihydroxide, and the test solution further contains a buffering agent capable of adjusting pH changes in the range of about PH6.5 to about PH12. Composition. 9. The composition of claim 6, wherein the dihydroxide component is a borate buffer capable of adjusting PH changes in the PH range from about PH 6.5 to about PH 12. 10 A test composition for the semi-quantitative determination of glucose in an aqueous test sample of at least 1000 mg per 1 dL, the test composition comprising: (a) a borate buffer capable of adjusting PH changes from about PH 6.5 to about PH 12; and (b) a PH indicator capable of producing a detectable colorimetric response in the PH range of about PH 6.5 to about PH 12. 11 A test device for the semi-quantitative determination of glucose in an aqueous test sample, comprising a carrier matrix and a test composition incorporated therein,
The test composition (a) forms on the surface of the encapsulating carrier when the carrier is wetted;
a dihydroxide component capable of exhibiting a pH of 6.5 or higher and capable of forming a complex with glucose to release protons; and (b) a ratio detectable in the PH range of about PH 6.5 to about PH 12. A test device comprising: a PH indicator capable of producing a color response; 12. The test device of claim 11, wherein the dihydroxide component is selected from boron and strontium dihydroxides. 13 A test device for the semi-quantitative determination of glucose in an aqueous test sample of at least 1000 mg per dL, comprising a carrier matrix and a test composition incorporated therein, the test composition having: (a) a pH of about 6. (b) a borate buffer capable of modulating PH changes in the PH range from about PH 5 to about PH 12; and (b) capable of producing a detectable colorimetric response in the PH range from about PH 6.5 to about PH 12. 12. The test device according to claim 11, comprising: a PH indicator that can be used. 14. A self-indicating test device useful for visual semi-quantitative determination of glucose concentration in an aqueous test sample without a color chart, the test device comprising: (a) a plurality of test matrices affixed to an indicator member; (b) Each test matrix consists of a carrier matrix and a test composition contained therein; (c) Each test composition is capable of forming a complex with glucose and releasing protons at an initial pH of 6.5 or higher. dihydroxide component, and approximately PH
(d) Each test matrix is compatible with other inclusion test compositions depending on the initial PH and inclusion concentration of dihydroxide used; A test device comprising test compositions different from the test matrices; each test matrix having substantially the same visual colorimetric response in response to different concentrations of glucose. 15. The test device of claim 14, wherein the dihydroxide component is selected from boron and strontium dihydroxides. 16. The method of claim 15, wherein the dihydroxide component is boron dihydroxide, and the test solution further contains a buffering agent capable of adjusting PH changes in the range of about PH 6.5 to about PH 12. Test equipment. 17 Dihydroxide component has a pH of about 6.5 to about 12
17. The test device according to claim 16, which is a borate buffering agent capable of adjusting PH changes in a PH range of up to 100 mL. 18. A self-indicating test device useful for the visual semi-quantitative determination of glucose in an aqueous test sample of at least 1000 mg per dl without a color chart, comprising: (a) a plurality of test matrices affixed to an indicator member; (b) each test matrix comprises a carrier matrix and a test composition contained therein; (c) each test composition has a pH of from about 6.5 to about 12;
Borate buffer that can adjust PH changes in the PH range, and PH from about PH6.5 to about PH12
(d) each test matrix has a test composition that differs from other included test compositions by the initial PH and concentration of borate buffer used; 15. The test device of claim 14, wherein each test matrix has substantially the same visual colorimetric response in response to different concentrations of glucose.