JPH04316484A - 組換え蛋白質産生用培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は遺伝子組換え技術により
所望の組換え蛋白質を持続的に産生する動物細胞を培養
するための培地に関し、実質的に蛋白質成分を含まない
ことを特徴とする無血清培地に関する。更に詳細には、
組換え血液凝固第ＶＩＩＩ因子産生形質転換動物細胞を
培養して、所望の組換え血液凝固第ＶＩＩＩ因子を産生
せしめるための、血清あるいは血漿蛋白質を実質的に含
まない低あるいは無蛋白質培地に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】今日
、様々な生理活性物質が、遺伝子組換え技術によって組
換え蛋白質として大腸菌を初めとした様々な宿主で産生
されている。これらの中で、糖鎖の付加、高次構造の構
築といった翻訳後の修飾過程が産生産物の生理活性の発
現に必須である場合などには、動物細胞が宿主として選
択される。しかしながら、従来、動物細胞の培養上清液
に分泌された生理活性物質を大量に得る為には技術的に
いくつかの問題があった。

【０００３】動物細胞の培養においては一般に牛胎児血
清（ＦＣＳ）などの血清を添加することが必要であった
。 血清は非常に高価であり、さらにマイコプラズマやウイ
ルスに汚染されている可能性があるので、使用する血清
を事前に検定しなければならないという煩雑さがあった
。また、血清中には多様な異種蛋白質成分が含まれてお
り、そのため培養上清より目的物質を精製することは必
ずしも容易ではなかった。そこで、血清培地の代替とし
てインスリン、トランスフェリン、血清アルブミンなど
の性状の明らかな蛋白質成分のみを添加した培地が開発
されてきた（Ｄ．Ｂａｍｅｓ、Ｇ．Ｈ．Ｓａｔｏ，　　
Ｃｅｌｌ，２２巻、６４９頁、１９８０年）。

【０００４】さらに、上述の蛋白質成分を他の化合物で
代替させようとする技術思想が高まり、トランスフェリ
ンについてはエチレンジアミン四酢酸鉄錯体、グルコン
酸鉄などの鉄キレート剤などがその代替物として既に開
発されている（特開昭　６３−１４１５８４；　第８回
次世代産業基盤技術シンポジウム・バイオテクノロジー
予稿集）。また、アルブミンの代替としては、α−シク
ロデキストリンと不飽和脂肪酸、脂溶性ビタミンとの抱
接化合物が知られている（特開昭５６ー８１６００）。 プルロニック　Ｆ−６８と脂溶性因子とのマイクロエマ
ルジョンの添加によっても動物細胞の無血清培養が可能
であるという報告も行なわれている（国際特許出願　国
際公開　ＷＯ　９０／０３４２９）。

【０００５】しかしながら、これらの報告で明らかにさ
れた低もしくは無蛋白質培地は細胞増殖のみを指標とし
て開発されたものであり、形質転換動物細胞を用いて組
換え蛋白質を産生させる場合、所望の組換え蛋白質の産
生効率の観点からの効果は決して満足できるものではな
かった。

【０００６】このような状況のもと、本発明者らは動物
細胞による組換え蛋白質の大量生産を目的とした培地の
検討を活発に展開し、例えば、血友病Ａ患者の補充療法
に用いられるヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子のように所望
の蛋白質が不安定である場合など、培地中に１％血清ア
ルブミンを添加することで産生能を血清培地の約４倍に
増加せしめることを可能とし、既に特許出願している（
特願昭　６３−１５７５７０）。

【０００７】しかし、血清アルブミンなどの蛋白質成分
の添加は所望の産物の精製を非常に困難にする。また血
清アルブミンは貴重で、高価でもあるので大量生産を目
的とした場合、経済性の観点から実質上、添加は困難で
ある。

【０００８】本発明者らはこれらの問題を解決するべく
鋭意研究を重ねた結果、所望の組換え蛋白質を産生する
動物細胞の培養、特に組換え血液凝固第ＶＩＩＩ因子を
産生する形質転換動物細胞の培養系において、エチレン
オキシドポリプロピレングリコール（プルロニック　Ｆ
−６８；　Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ−６８）に代表される
プルロニック系界面活性剤、あるいはモノラウリン酸ソ
ルビトール（Ｔｗｅｅｎ　２０）、モノオレイン酸ソル
ビトール（Ｔｗｅｅｎ８０）などのソルビタン系界面活
性剤を包含する非イオン性界面活性剤、およびジメチル
−α−シクロデキストリンを代表例とするシクロデキス
トリンを添加することによって、もはや血清アルブミン
などの蛋白質成分の添加を実質的に必要としない低ある
いは無蛋白質培地を開発し、本発明を完成するに至った
。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは本発明にお
いて、遺伝子組換え技術によって調製され所望の蛋白質
を持続的に産生する形質転換動物細胞の培養の際、非イ
オン性界面活性剤およびシクロデキストリンを含む培地
が驚くべき効果を発揮し、細胞増殖および所望の蛋白質
産生能の点で従来の無血清培地を上回る血清アルブミン
含有培地の代替となり得ることを明らかにした。

【００１０】本発明で用いられる非イオン性界面活性剤
としてはプルロニックＦ−６１、プルロニックＦ−６８
、プルロニックＦ−７１、プルロニックＦ−１０８など
のプルロニック系界面活性剤、あるいはモノラウリン酸
ソルビトール（Ｔｗｅｅｎ２０）、モノオレイン酸ソル
ビトール（Ｔｗｅｅｎ８０）などのソルビタン系界面活
性剤が好適に選ばれる。

【００１１】また、シクロデキストリンは非修飾のα−
シクロデキストリン（α−ＣＤ）を好適に用いることが
出来るが、２，６−ジメチル−α−シクロデキストリン
（ＤＭ−α−ＣＤ）が最良の一例として挙げられる。本
発明におけるＤＭ−α−ＣＤとは、グルコース残基の２
位および６位の水酸基がメチル化されたグルコース単位
が６個（α）で環状になったデキストリンである。

【００１２】本発明における各添加剤の濃度範囲は、生
育させる形質転換動物細胞の生育並びに産生効率に悪影
響を及ぼさないように設定されるべきであるが、０．０
０５〜１．０％、好ましくは０．０１〜０．１％の範囲
のプルロニック系界面活性剤、および０．００１〜０．
３％好ましくは０．０１〜０．１％の範囲のα−ＣＤ、
または０．００１〜０．００６％、好ましくは０．００
２〜０．００３％の範囲のソルビタン系界面活性剤およ
び前記と同様の濃度範囲のα−ＣＤとを含む培地が好適
である。

【００１３】一般に、生理活性を有する蛋白質を生産す
る動物細胞として、チャイニーズハムスター卵巣細胞（
ＣＨＯ細胞）、Ｃ−１２７細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞な
どが使用され、本発明の対象としても特別な制約はない
。しかしながら、最も使用頻度の高いＣＨＯ細胞が好適
な対象細胞の一例として用いられる。

【００１４】本発明の実施態様においては、非イオン性
界面活性剤およびシクロデキストリンを含有する本発明
の培地は以下のようにして用いられる。まず、１０％血
清を含んだ培地で対象となる細胞を８〜２４時間培養し
、その後、上述の添加剤を好適な濃度で含有する培地に
置換して培養し、細胞を生育させることができる。なお
、非イオン性界面活性剤およびシクロデキストリンは培
地中に添加後、ろ過滅菌して調製することもできるが、
高濃度溶液を蒸気加熱滅菌後、所定量を培地中に添加し
て用いることも可能である。また、実施例には基礎培地
としてＡＳＦ培地１０４を用いたが、これに限定される
ことなく、インスリン、トランスフェリン、エタノール
アミン、亜セレン酸塩などを含んだ合成培地などが好適
に用いられ得る。

【００１５】本発明者らは、先に培養細胞による蛋白質
産生能が培地への酪酸塩及び、リチウム塩の添加により
増強されることを明らかにし、既に特許出願を行なって
いる（特願平　２−１２１７２９）。本発明において提
供される上記の低あるいは無蛋白質培地へ、上述の酪酸
塩およびリチウム塩を添加すると、蛋白質産生能が従来
の血清アルブミン含有培地での培養に比較して２倍以上
増大されることが認められ、本発明の効果をさらに増加
させ得ることを確認した。

【００１６】以下、本発明の特徴をさらに明らかにする
ために、実施例に沿って詳述するが、これらの実施例は
本発明の具体例を説明するものであって、本発明はこれ
らの実施例に限定されるものではない。

【００１７】実施例　１ 　　プルロニック　Ｆ−６８添加培地 　　０．１％ＤＭ−α−ＣＤを含むＡＳＦ培地１０４（
味の素（株））を基礎培地として、これに所定の濃度の
プルロニック　Ｆ−６８（ＧＩＢＣＯ社）を添加した。 細胞は、遺伝子組換え技術を用いて調製された血液凝固
第ＶＩＩＩ因子産生チャイニーズハムスター卵巣細胞（
特願昭６３−８５４５４、寄託番号　　微工研　第９８
７３号）を使用し、これをカルチャーデイッシュ（Ｆａ
ｌｃｏｎ社製）上で培養した。このとき、生育培地は１
０％牛胎児血清を含んだＡＳＦ培地１０４とし、底面積
９．６ｃｍ２のウェルあたり５×１０５個の細胞密度で
播種した。細胞が充分に生育した後、生育培地を吸引除
去して各濃度のプルロニック　Ｆ−６８を含有した基礎
培地で置換した。培地の容量はウェルあたり３ｍｌとし
た。培養はＣＯ２インキュベーター中でＣＯ２濃度５％
、温度３７℃で行なった。ＤＭ−α−ＣＤを含まない血
清アルブミン含有培地を対照に比較検討した。血清アル
ブミンは２０％ヒト血清アルブミン製剤（（財）化血研
製）を使用した。またＤＭ−α−ＣＤはコスモバイオ社
製ものを用いた。

【００１８】細胞数の計測は、トリパンブルーで染色さ
れる死細胞以外の生細胞について血球計算盤を用いて行
なった。また、第ＶＩＩＩ因子活性は、標準的な血液凝
固定量法（Ｈａｒｄｉｓｔｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｒｏ
ｍｂｏｓｉｓ　ｅｔ　Ｄｉａｔｈｅｓｉｓ　Ｈａｅｍｏ
ｌｏｇｉｃａ　７２，　ｐ．２１５　（１９６２））に
おける、第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿の遅延部分トロンボプ
ラスチン時間を減少させる能力について定量した。この
とき、凝固因子定量用因子標準血漿（Ｄａｄｅ社）をス
タンダードとして、これを１単位（国際単位、ＩＵ）／
ｍｌとした。その結果を第１表に示す。 第１表

【表１】

【００１９】これらの結果から、０．１％のＤＭ−α−
ＣＤに加えて、プルロニック　Ｆ−６８などの界面活性
剤を０．００５〜１．０％までの濃度範囲で添加するこ
とにより、組換え第ＶＩＩＩ因子の産生能を増大せしめ
ることが確認された。

【００２０】実施例　２ 　　Ｔｗｅｅｎ−８０添加培地 　　プルロニック　Ｆ−６８の代わりにＴｗｅｅｎ８０
を用いた以外は実施例１と同様の実験手順に従った。そ
の結果を第２表に示す。 第２表

【表２】

【００２１】これらの結果より、０．１％のＤＭ−α−
ＣＤに加えて、Ｔｗｅｅｎ８０を０．００１〜０．００
６％濃度範囲で添加することにより組換え第ＶＩＩＩ因
子の産生能を増大せしめることが明らかになった。

【００２２】実施例　３ 　　ジメチル−α−シクロデキストリン（ＤＭ−α−Ｃ
Ｄ）添加培地　　ＡＳＦ培地１０４に０．１％の濃度で
プルロニック　Ｆ−６８を加えたものを基礎培地とし、
これに各濃度のＤＭ−α−ＣＤを添加して、その効果を
血清アルブミン含有培地と比較検討した。この他は実施
例１と同様の実験手順に従った。得られた結果を第３表
に示す。第３表

【表３】

【００２３】その結果、０．１％のプルロニックＦ−６
８に加えて、ＤＭ−α−ＣＤを０．００１〜０．３％の
濃度範囲で添加することにより組換え第ＶＩＩＩ因子の
産生能が増大することが認められた。この範囲より低い
濃度では効果が認められず、高い濃度では培養細胞に毒
性を認めた。

【００２４】実施例　４ 　　酪酸塩およびリチウム塩の添加効果　　産生培地と
して、ＡＳＦ培地１０４にＤＭ−α−ＣＤ、プルロニッ
ク　Ｆ−６８をそれぞれ０．１％の濃度で添加し、更に
１ｍＭの酪酸ナトリウム（和光純薬、特級）および５ｍ
Ｍの酢酸リチウム（和光純薬、特級）をそれぞれ添加し
、４８時間培養を継続させた。なお、酪酸ナトリウムは
予め中和したものを用いた。結果を第４表に示す。 第４表

【表４】

【００２５】その結果、ＤＭ−α−ＣＤ、プルロニック
　Ｆ−６８をそれぞれ０．１％の濃度で添加した培地に
おいても酪酸塩およびリチウム塩の添加効果が認められ
、酪酸塩およびリチウム塩無添加培地あるいは血清アル
ブミン添加培地での培養の２倍以上の産生能の増加が確
認された。

【００２６】実施例　５ 　　血清アルブミン含有培地との細胞増殖性の比較　　
プルロニック　Ｆ−６８およびＤＭ−α−ＣＤをそれぞ
れ０．１％添加した培地と従来の血清アルブミン含有培
地の増殖性について比較検討を行なった。このとき、基
礎培地としてＡＳＦ培地１０４を用いた。

【００２７】血液凝固第ＶＩＩＩ因子産生ＣＨＯ細胞を
ディッシュウェルあたり２×１０５個播種し、２日おき
に培地交換を繰り返しながら７日間培養した。その結果
を第５表に示す。 第５表

【表５】

【００２８】これらの結果より、プルロニック　Ｆ−６
８、およびＤＭ−α−ＣＤをそれぞれ０．１％添加した
培地は１．０％血清アルブミン含有培地とほぼ同等の細
胞増殖性を示し、血清アルブミンを添加しなくとも、従
来の血清アルブミン添加培地に匹敵する細胞増殖および
それに伴う物質生産を得ることが可能になった。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　遺伝子組換え技術を用いて調製された
   所望の蛋白質を持続的に産生する形質転換動物細胞を培
   養するための培地であって、非イオン性界面活性剤およ
   びシクロデキストリンを含有することを特徴とする蛋白
   質産生用低あるいは無蛋白質培地。
2. 【請求項２】　　前記細胞が遺伝子組換え技術を用いて
   調製された血液凝固第ＶＩＩＩ因子を産生する形質転換
   動物細胞である請求項１に記載の蛋白質産生用低あるい
   は無蛋白質培地。
3. 【請求項３】　　前記非イオン性界面活性剤がプルロニ
   ックＦ−６１、プルロニックＦ−６８、プルロニックＦ
   −７１、プルロニックＦ−１０８から選ばれるプルロニ
   ック系界面活性剤、あるいはラウリン酸ソルビトール（
   Ｔｗｅｅｎ２０）、モノオレイン酸ソルビトール（Ｔｗ
   ｅｅｎ８０）などから選ばれるソルビタン系界面活性剤
   である請求項１に記載の蛋白質産生用低あるいは無蛋白
   質培地。
4. 【請求項４】　　前記シクロデキストリンが非修飾α−
   シクロデキストリン、メチル化α−シクロデキストリン
   より選ばれる、請求項１に記載の蛋白質産生用低あるい
   は無蛋白質培地。
5. 【請求項５】　　プルロニック系界面活性剤およびシク
   ロデキストリンを各々０．００５〜１．０％、０．００
   １〜０．３％、好ましくは各々０．０１〜０．１％、０
   ．０１〜０．１％の濃度で含有する請求項１に記載の蛋
   白質産生用低あるいは無蛋白質培地。
6. 【請求項６】　　ソルビタン系界面活性剤およびシクロ
   デキストリンを、各々０．００１〜０．００６％、０．
   ００１〜０．３％、好ましくは０．００２〜０．００３
   ％、０．０１〜０．１％の濃度で含有する請求項１に記
   載の蛋白質産生用低あるいは無蛋白質培地。
7. 【請求項７】　　追加的に酪酸あるいはその塩、および
   リチウム塩を各々０．１〜５．０ｍＭ、２．０〜５０ｍ
   Ｍ、好ましくは各々０．５〜２．０ｍＭ、２．０〜５．
   ０ｍＭの濃度で含む請求項１〜６のいずれかに記載の蛋
   白質産生用低あるいは無蛋白質培地。