JPH04287693A

JPH04287693A - ε−ポリリジンの製造方法

Info

Publication number: JPH04287693A
Application number: JP3072052A
Authority: JP
Inventors: Tsugihiko Yoshida; 亜彦吉田; Tatsuro Maeda; 竜郎前田; Toshiyuki Miyazaki; 俊之宮崎; Hirobumi Motoi; 博文本井; Toshiaki Kodama; 俊明児玉
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1991-03-13
Filing date: 1991-03-13
Publication date: 1992-10-13
Anticipated expiration: 2015-03-21
Also published as: JP3022615B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は重合度２〜１９のε−ポ
リリジンを製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】重合度２０〜２５のε−ポリリジンが、
グラム陽性菌、グラム陰性菌、真菌、乳酸菌、酵母菌等
の種々の菌類に対する抗菌作用、バクテリオファージに
対する抗ファージ作用を有していることが知られており
、そのような特性に基づいて食品保存料等としての使用
が提案されている。また、本発明者らの研究の結果、上
記の重合度を有するε−ポリリジンが血清や肝臓のコレ
ステロールレベルの上昇を抑制する作用および低下させ
る作用があることが発見された。

【０００３】ところで、上記の重合度を有するε−ポリ
リジンは持続性の強いえぐ味（あくの強い不快な味）を
有している。そのため、それをそのまま直接摂取した場
合は勿論のこと、飲食物中に少量添加した場合にもえぐ
味を感じ、その摂取を困難または不快なものにし、また
飲食物の食感や風味を不良なものにしている。特に、上
記の重合度を有するε−ポリリジンをコレステロール抑
制剤として飲食物中に添加する場合は、１％以上の添加
が効果の発現の点から望ましいが、１％以上の添加は飲
食物の味をえぐいものにし、飲食物本来の食感や風味を
大幅に低下させる傾向がある。

【０００４】

【発明の内容】本発明者らは、抗菌作用、抗ファージ作
用、コレステロール抑制作用等の上記した有用な特性を
保ちながら、ε−ポリリジンの呈味をえぐ味のないもの
にすることを目的として研究を続けてきた。その結果、
重合度が１９以下のε−ポリリジンはえぐ味がかなり少
なく、しかも重合度２０〜２５のε−ポリリジンと同様
に抗菌作用、抗ファージ作用、コレステロール抑制作用
を有すること、そしてそのような重合度１９以下のε−
ポリリジンは上記した重合度２０〜２５のε−ポリリジ
ンまたはそれより大きな重合度を有するε−ポリリジン
を中性プロテアーゼを使用して加水分解することによっ
て得ることができることを見出した。

【０００５】したがって、本発明は、重合度が２０以上
のε−ポリリジンを中性プロテアーゼで加水分解するこ
とにより重合度が２〜１９のε−ポリリジンを製造する
方法である。ε−ポリリジンは、下記の化学式１で表さ
れる。

【０００６】

【化１】

【０００７】本発明では、重合度が２０以上のε−ポリ
リジンのいずれもが原料として使用できる。その場合に
、ε−ポリリジン原料は、その大半が重合度２０以上の
ε−ポリリジンからなるものであれば一つの重合度のみ
からなる単一のε−ポリリジンであっても、種々の重合
度のε−ポリリジンの混合物であってもよく、更に場合
によっては重合度が１９以下のε−ポリリジンを少量含
有していてもよい。２０以上の重合度を有するε−ポリ
リジンとしては、チッソ株式会社等により市販されてい
る重合度が２０〜２５のε−ポリリジンが、目的とする
重合度２〜１９のε−ポリリジンを高効率で製造でき、
且つ入手が容易であり望ましい。

【０００８】中性プロテアーゼによる加水分解処理は、
原料である重合度２０以上のε−ポリリジンを、水溶液
または水性分散液の形態にして行うのがよい。そして、
本発明者らの研究の結果、上記の中性プロテアーゼとし
ては、多数の中性プロテアーゼのうちで、アスペルギル
ス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌の産生する中性プロ
テアーゼが、目的とする重合度２〜１９のε−ポリリジ
ンの生成に有利であること、そのうちでも特にアスペル
ギルスソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）
菌、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
　ｏｒｙｚａｅ）菌、およびアスペルギルスメレウス（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｍｅｌｌｅｕｓ）菌の産生す
る中性プロテアーゼが適することがわかった。

【０００９】したがって、本発明は、その望ましい態様
として、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属
菌の産生する中性プロテアーゼを使用して、重合度が２
０以上のε−ポリリジンから重合度が２〜１９のε−ポ
リリジンを製造する方法を包含する。ここで、「アスペ
ルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌の産生する中
性プロテアーゼ」とは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ）属菌により産生され且つｐＨ６〜８の中性
領域で反応性を示す、すなわちペプチド結合を加水分解
するプロテアーゼをいう。

【００１０】そして、上記したアスペルギルス（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌の産生する中性プロテアーゼの
うち、アスペルギルスソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
　ｓｏｊａｅ）菌の産生する中性プロテアーゼは、ＩＰ
酵素［盛進製薬（株）］、ＰＲＯＴＥＡＳＥ７０２６（
ＳＩＧＭＡ社）として、アスペルギルスオリゼー（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）菌の産生する中性
プロテアーゼは、デナチームＡＰ［長瀬産業（株）］、
プロチンＦＮ［大和化成（株）］、プロテアーゼＡおよ
びプロテアーゼＭ［天野製薬（株）］、スミチームＬＰ
［新日本化学工業（株）］、オリエンターゼＯＮ［上田
化学工業（株）］、ＰＲＯＴＥＡＳＥ４０３２（ＳＩＧ
ＭＡ社）等として、またアスペルギルスメレウス（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｍｅｌｌｅｕｓ）菌は、プロテア
ーゼＰ［天野製薬（株）］等として市販されており、容
易に入手可能である。それらのプロテアーゼのうちでも
、デナチームＡＰが分解効率が良いので、特に好ましい
。

【００１１】中性プロテアーゼは、遊離の状態で使用し
ても、担体に固定化して使用してもよい。また中性プロ
テアーゼによる加水分解処理は、連続法で行ってもバッ
チ法で行ってもよい。中性プロテアーゼを遊離の状態で
使用するかまたは固定化して使用するか、加水分解処理
を連続法で行うかまたはバッチ法で行うか等に応じて、
中性プロテアーゼの種類、その使用量、処理時の温度、
圧力、ｐＨ、処理時間等の諸条件を適宜選んで処理を行
うとよい。一般に、中性プロテアーゼの使用量が多いほ
ど、目的とする重合度のε−ポリリジンを短時間で得る
ことができる。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ）属菌の産生する中性プロテアーゼを使用する場合は
、通常、液のｐＨを約６〜８にして、約３５〜４５℃の
温度で加水分解を行うのがよい。

【００１２】２０以上の重合度を有するε−ポリリジン
は、中性プロテアーゼにより加水分解されて、次第に重
合度が１９以下の低重合度ε−ポリリジンになってゆく
。その場合に、加水分解が過度に行われると、最終的に
はアミノ酸であるリジンになり、目的とする重合度が２
〜１９のε−ポリリジンが得られない。したがって、加
水分解処理に際しては、加水分解の途中で経時的に反応
液を採取して、生成物中の重合度が２〜１９のε−ポリ
リジンの割合を逆相クロマトグラフィーやその他適当な
方法によって分析して、加水分解反応の継続または停止
を決定するのが望ましい。

【００１３】通常は、原料である重合度２０以上のε−
ポリリジンの約８０重量％以上、好ましくは約９０重量
％以上が加水分解された時点で、加水分解反応を停止さ
せるのがよい。加水分解反応は加熱やその他の適当な手
段で中性プロテアーゼを失活させることにより停止する
ことができる。加熱により中性プロテアーゼを失活させ
る場合は、一般に約８０〜１００℃に加熱するとよい。

【００１４】例えば、重合度２０〜２５のε−ポリリジ
ンを濃度５０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ約６〜８の水溶液とし、
これに約１２５ｕｎｉｔｓ／ｍｌのアスペルギルス（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌の産生する中性プロテアー
ゼを加えて、約３５〜４５℃の温度で加水分解処理を行
う場合は、約２４〜４８時間後にプロテアーゼを失活さ
せると、原料として用いたε−ポリリジンの約９５〜９
９重量％が加水分解されて、重合度２〜１９のε−ポリ
リジンを約９４〜９８重量％含有する生成物が得られる
。

【００１５】上記液中に含まれる重合度２〜１９のε−
ポリリジン以外の成分としては、少量のリジンや重合度
２０以上のε−ポリリジン等である。上記液を、例えば
噴霧乾燥、凍結乾燥、その他適当な乾燥手段によって乾
燥して、目的とする重合度２〜１９のε−ポリリジンを
多量に含む粉体としてもよい。以上のようにして得られ
る重合度が２〜１９のε−ポリリジンは、えぐ味が生じ
ない程度の少量（通常約１０％以下）の重合度２０以上
のε−ポリリジンを含んでいてもよい。

【００１６】より純度の高い生成物を得たい場合は、上
記で得た重合度２〜１９のε−ポリリジンを含有する液
を、イオン交換、限外濾過、ゲル濾過等の分離手段の１
つまたは複数を組合せて処理することにより、目的とす
るε−ポリリジンを重合度別に単独で、または重合度２
〜１９のうちの任意の重合度のものの混合物の形態で分
離回収することができる。

【００１７】上記で得られた重合度２〜１９のε−ポリ
リジンは、重合度２０以上のε−ポリリジンと同様にコ
レステロールレベルの上昇抑制作用や低下作用、抗菌作
用、抗ファージ作用を有している。しかも、重合度２０
以上のε−ポリリジンとは異なり、えぐ味がないので摂
取しやすく、それ自体でコレステロール抑制剤、抗菌剤
、抗ファージ剤等として有効に使用することができる。重合度２〜１９のε−ポリリジンをそれ自体で投与する
場合は、水溶液；澱粉、タルク、炭酸カルシウム等の担
体に担持させた固型剤（錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル
剤等）等の任意の剤型を採ることができる。また、種々
の飲食物（例えば、パン、クッキー、ビスケット、めん
類、チューインガム、飲料等）に添加して使用すること
ができ、その場合にえぐ味がないので、飲食物の食感や
風味を損なうことがない。

【００１８】

【実施例】《実施例　　１》チッソ（株）社製のε−ポ
リリジン（重合度２０〜２５のε−ポリリジンを５０重
量％含有）２００ｇを水２０００ｍｌに溶解した後、６
Ｎ塩酸を使用して水溶液のｐＨを７．０に調整した。こ
のε−ポリリジン水溶液の一部を採取して、逆相クロマ
トグラフィー［使用カラム：Ｗａｔｅｒｓ　μ　Ｂｏｎ
ｄａｐａｋ　Ｃ１８：日本ウオーターズ社製：内径３．
９ｍｍ、長さ３０ｍｍ］に供した。次いで、トリフルオ
ロ酢酸０．１％を含有する水溶液（Ａ液）、トリフルオ
ロ酢酸０．１％を含有するアセトニトリル８０％水溶液
（Ｂ液）を使用して、Ａ液とＢ液の混合液中において、
６０分間でＢ液の濃度が０％から２０％まで直線的に増
加する濃度勾配にて１．０ｍｌ／分の流速で溶出させた
。この流出液を波長２２０ｎｍのＵＶで検出したところ
、図１のクロマトグラムを示した。

【００１９】重合度２０〜２５のε−ポリリジンを含有
するｐＨ７．０の上記の水溶液に、デナチームＡＰ［長
瀬産業（株）社製：アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）産生の中性プロテアーゼ
］５ｇを添加して、４０℃で２４時間反応させ、その時
点で９０℃に３０分間保ってプロテアーゼを失活させた
。その結果、原料である重合度２０〜２５のε−ポリリ
ジンの約９５重量％が加水分解されていた。こうして得
られた加水分解液を噴霧乾燥して粉末状の生成物１９０
ｇを得た。加水分解処理前のε−ポリリジン水溶液に対
して行ったのと全く同様にして、この加水分解液を逆相
クロマトグラフィーに供してクロマトグラムをとったと
ころ、図２に示す結果を得た。この実施例１で得られた
上記粉末状生成物中には、重合度２〜１９のε−ポリリ
ジンが約４７重量％含まれていた。

【００２０】《実施例　　２》デナチームＡＰによる加
水分解処理を４０℃で４８時間行った以外は実施例１と
同様にして、加水分解処理を行い、その結果得られた加
水分解液を噴霧乾燥したところ、粉末状の生成物１９２
ｇを得た。この加水分解液を上記実施例１と同様にして
逆相クロマトグラフィーに供してクロマトグラムをとっ
たところ、図３に示す結果を得た。この実施例２で得ら
れた上記粉末状生成物中には、重合度２〜１９のε−ポ
リリジンが約４９重量％含まれていた。

【００２１】官能（食味）試験実施例１および実施例２で得られた粉末状生成物、並び
に加水分解処理を施す前の上記チッソ（株）社製のε−
ポリリジン（重合度２０〜２５のε−ポリリジンを５０
％含有）の各々を使用して、下記の表１に示す配合のグ
レープフルーツジュースＡ〜Ｃをつくった。各々のグレ
ープフルーツジュースを１３名のパネラーにより飲食し
てもらって、下記の評価基準にしたがってその食味の良
否を試験した。その結果を、表１に示す。

【００２２】ここで、表１における食味の点数は、１３
名のパネラーの付した点数の平均値を採ったものである
。［評　　価　　基　　準］５点・・・非常に強いえぐ味を感じ、食味が極めて劣る
４点・・・強いえぐ味を感じ、食味が大きく劣る３点・
・・えぐ味を感じ、食味が劣る２点・・・ややえぐ味を感じ、食味がやや劣る１点・・
・かすかにえぐ味を感じ、食味が少し劣る０点・・・え
ぐ味を感じず、食味が良好

【００２３】

【表１】

【００２４】表１の結果から、本発明の実施例１および
実施例２で製造された重合度２〜１９のε−ポリリジン
を含むグレープフルーツジュースＡおよびＢは、ε−ポ
リリジンを含有しない対照のグレープフルーツジュース
とほぼ同様にえぐ味がなく良好な食味を有するか、また
はそのえぐ味が少ないのに対して、重合度２０以上のε
−ポリリジンを含有するグレープフルーツジュースＣは
えぐ味が強く食味が劣ることがわかる。

【００２５】《参　　考　　例》コレステロール抑制作
用試験５週令のＦｉｓｈｅｒ系雌ラットを各群７匹づつ４群準
備し、群毎に個別の金網ケージで４日間予備飼育後、１
１日間各群毎に表２に示す配合組成の飼料および水を自
由に摂取させた。飼育環境条件は、湿度６０±１０％、
温度２３．０±１．０℃とし、照明期間を毎日２２時か
ら翌１０時までとした。表２から明らかなように、第１
群（標準群）のラットに対する飼料は、コレステロール
、ラードおよびコール酸ナトリウムを含まない標準飼料
であり、第２群（対照群）、第３群および第４群（いず
れも本発明群）のラットに対する飼料は、コレステロー
ル、ラードおよびコール酸ナトリウムを含む高コレステ
ロール飼料である。そして、第２群〜第４群の高コレス
テロール飼料のうち、第３群と第４群の飼料は、実施例
１および実施例２で得られた重合度２〜１９のε−ポリ
リジンを更に含有している。

【００２６】

【表２】

【００２７】上記第１群〜第４群のラットの飼育開始時
の初体重、飼育終了時の終体重、増体重、飼育期間中の
飼料摂取量および飼料効率を調べたところ、下記の表３
に示すとおりであった。なお、表３の値はラット１匹当
たりの平均値であり、また飼料効率は下記の式で表され
る。飼料効率　　＝　　（増体重／飼料摂取量）×１００

【
００２８】

【表３】

【００２９】上記表３の結果から、標準飼料を給与した
第１群のラットおよび高コレステロール飼料を給与した
第２〜４群のラットのいずれもが成長が良好であること
、飼料摂取量では第１群のラットと第２〜４群のラット
との間に有意な差がみられるものの、増体重については
第１群のラットと第２〜４群のラットの間に有意な差が
ないことがわかる。

【００３０】また、上記飼育期間中、４日目と７日目に
尾静脈から、そして１１目に下大動脈から採血して血液
中の総コレステロールをＲｉｃｈｍｏｎｃｌ　Ｗ．らの
方法により定量したところ、下記の表４に示す結果を得
た。

【００３１】

【表４】

【００３２】更に、１１日間の飼育期間終了日の１９時
から翌日９時まで１４時間絶食させた後に、エーテル麻
酔下に解剖して肝臓を摘出してその重量を測定すると共
に、Ｆｏｌｃｈらの方法により摘出した肝臓から脂質を
抽出して、総コレステロール、遊離コレステロール、リ
ン脂質および中性脂質を分析した。その結果を下記の表
５に示す。

【００３３】

【表５】

【００３４】上記表４および表５の結果から、本発明の
方法により製造された重合度２〜１９のε−ポリリジン
を含有する高コレステロール飼料を給与した第３群と第
４群のラットは、標準飼料を給与した第１群のラットに
比べて血液中および肝臓におけるコレステロール量が多
くなっているものの、上記ε−ポリリジンを含まない高
コレステロール飼料を給与した第２群のラットに比べて
、血液中および肝臓におけるコレステロール量が少なく
なっており、重合度２〜１９のε−ポリリジンがコレス
テロールレベルの抑制作用を有することがわかる。

【００３５】《実施例　　３》下記の表６に示した種々
のプロテアーゼを使用して、実施例１と同様にして重合
度２０〜２５のε−ポリリジンの加水分解処理を行った
。その際に、該ε−ポリリジン含有水溶液のｐＨは、各プ
ロテアーゼの活性に対して最適であるとされている表６
に示すｐＨ値を採用した。各々で得られた加水分解液を
実施例１と同じようにして逆相クロマトグラフィーに供
して、そこに含まれる生成物のクロマトグラムを採った
。その結果、重合度２０〜２５の中重合度ε−ポリリジ
ンに対する各プロテアーゼの加水分解能は、表６に示す
とおりであった。

【００３６】表６において、プロテアーゼの加水分解能
は次の基準で判定した。プロテアーゼの加水分解能の判定基準＋・・・ε−ポリリジンが加水分解された。 −・・・ε−ポリリジンがまったく加水分解されなかっ
た。

【００３７】

【表６】

【００３８】表６の結果から、アスペルギルス（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌の産生する中性プロテアーゼが
、重合度２０以上のε−ポリリジンから重合度２〜１９
のε−ポリリジンを製造する際のプロテアーゼとして特
に適していることがわかる。

【００３９】

【発明の効果】本発明の方法により、重合度が２〜１９
のε−ポリリジンを円滑に製造することができる。特に
、プロテアーゼとしてアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ）属菌の産生する中性プロテアーゼを使用した
場合には、目的物である上記ε−ポリリジンを高収率で
得ることができる。本発明の方法により製造された重合
度２〜１９のε−ポリリジンは、えぐ味がかなり少なく
、しかもコレステロールレベルの上昇抑制および低下作
用、抗菌作用、抗ファージ作用を有しており、そのまま
でまたは飲食物中に添加して有効に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】市販の重合度２０〜２５のε−ポリリジンを含
む液を逆相クロマトグラフィーに供し、次いで溶出させ
たときの流出液を波長２２０ｎｍのＵＶで検出したクロ
マトグラムを示す図である。

【図２】実施例１で得た加水分解液を逆相クロマトグラ
フィーに供し、次いで溶出させたときの流出液を波長２
２０ｎｍのＵＶで検出したクロマトグラムを示す図であ
る。

【図３】実施例２で得た加水分解液を逆相クロマトグラ
フィーに供し、次いで溶出させたときの流出液を波長２
２０ｎｍのＵＶで検出したクロマトグラムを示す図であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　重合度が２０以上のε−ポリリジンを
中性プロテアーゼで加水分解することにより重合度が２
〜１９０のε−ポリリジンを製造する方法。
【請求項２】　　中性プロテアーゼがアスペルギルス属
菌の産出する中性プロテアーゼである請求項１の製造方
法。