JPH04276551A - 免疫分析要素および免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は均一系酵素免疫測定法を
適用した乾式免疫分析要素及びそれを用いた免疫分析方
法に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】血液や尿などの体液に含まれる生体成分
、薬物等の分析は、病態の診断や治療経過の判定に非常
に有用であり、臨床検査の分野で重要な役割を果たして
いる。このような微量成分（リガンド）の分析方法とし
て、酵素免疫分析方法（エンザイムイムノアッセイ）が
ある。酵素免疫分析方法には、Ｂ／Ｆ分離が必要な非均
一系とＢ／Ｆ分離が不要な均一系がある。均一系反応は
抗体と抗原（リガンド）が結合すると標識酵素の酵素活
性が何らかの干渉を受けることに基づくもので、抗原抗
体結合による阻害作用を利用する。一般には、抗原を酵
素標識しておいて、これに大分子である抗体が結合する
ことにより、酵素の基質に対する結合が立体障害を受け
たり、或いは酵素の立体構造が変化するために生じる酵
素活性の抑制を検出する。

【０００３】抗原が高分子である場合には、これとは逆
に抗体に酵素標識しておいても、抗原抗体結合反応によ
る酵素活性の抑制を検出できる。

【０００４】一方、多数の検体試料を取扱いルーティン
化している臨床検査では、簡便、迅速に分析でき自動操
作化もできることが望まれ、このような観点から、乾式
分析要素が提案されている（例えば特開昭４９−５３８
８８、同５９−７７３５６、　同５９−１０２３８８、
米国特許４，４５９，３５８　）。

【０００５】抗体に酵素標識しておいて均一系酵素免疫
反応をさせる乾式分析要素は以下のものが知られている
（特開平１−３２１３６０）。これは （Ａ）　高分子化抗原（リガンドと高分子化合物との結
合物）、 （Ｂ）　水不溶性の高分子基質、 （Ｃ）　リガンドに対する抗体と、基質に対する酵素と
の結合物、 の３つを多層分析要素の同一層或いは別々の層に含有さ
せたものである。分析要素に点着し供給された抗原は、
高分子化抗原と競争して、抗体−酵素結合物に結合する
。この抗原−抗体−酵素複合体は、水不溶性高分子基質
に反応して、可溶性の低分子生成物を生成する。一方、
高分子化抗原と結合してできた高分子抗原−抗体−酵素
複合体は、高分子基質に対して酵素活性を示すことがで
きない。従って検体中の抗原量が増えるに従って、酵素
反応生成物は増えることになる。この生成物を検出層に
移行させて、その量をその有色化学基が与える吸収の光
学濃度を測定することにより、検体中の抗原量を分析す
るというものである。

【０００６】特願平２−９６４９９　記載の免疫分析要
素は、これをさらに改良したものである。この分析要素
では、標識酵素分解物をさらに低分子化する低分子化酵
素を含有する試薬層を設けられ、この低分子化生成物を
検出することにより感度の上昇が図られている。

【０００７】測定対象が高分子抗原である場合には、特
願平２−２４８７１１記載の免疫分析要素を使用するこ
とができる。この分析要素は、 （Ａ）　水不溶性の高分子基質、 （Ｂ）　高分子抗原に対する抗体と、基質に対する酵素
との結合物、 の２つを多層分析要素の同一層或いは別々の層に含有さ
せたもので、特願平２−９６４９９　記載の免疫分析要
素と同じように、標識酵素分解物をさらに低分子化する
低分子化酵素を含有する試薬層を設けて、この低分子化
生成物を検出することにより感度の上昇を図っている。

【０００８】いずれの場合でも、標識酵素の高分子基質
に対する活性が十分に高いことが望ましい。しかし、非
拡散性高分子基質は、本来巨大分子であるため酵素の基
質としては不利であった。

【０００９】

【発明の目的】本発明は、以上のような事情に鑑みなさ
れたものであり、簡便な操作で高感度にかつ迅速な分析
が出来る、均一系酵素免疫反応を適用した免疫分析要素
を提供することを目的とする。また本発明は、その分析
要素を用いる方法を提供することも目的とする。

【００１０】

【発明の構成】このような本発明の目的は、低分子抗原
と、低分子抗原と高分子化合物との結合物と、酵素標識
抗体との間の反応により生じた酵素活性の変化を測定す
ることにより低分子抗原の量を分析する免疫分析要素で
あって、前記酵素により拡散性物質を生成する非拡散性
基質を含有する基質層と、前記拡散性物質を検出する試
薬層とを備えるものにおいて、前記非拡散性基質が微粒
子化された不溶性多糖類であることを特徴とする免疫分
析要素により達成される。

【００１１】また本発明の目的は、高分子抗原と、酵素
標識抗体との間の反応により生じた酵素活性の変化を測
定することにより高分子抗原の量を分析する免疫分析要
素であって、前記酵素により拡散性物質を生成する非拡
散性基質を含有する基質層と、前記拡散性物質を検出す
る試薬層とを備えるものにおいて、前記非拡散性基質が
微粒子化された不溶性多糖類であることを特徴とする免
疫分析要素により達成することができる。

【００１２】いずれの場合でも、試薬層又はその下の層
に、拡散性物質をさらに低分子生成物にする低分子化酵
素を含有させ、この低分子生成物を検出するのが好まし
い態様である。また高分子化抗原と酵素標識抗体とは、
基質層或いは基質層の上に積層された別の層に予め含有
させておくこともできる。

【００１３】

【作用】測定対象（リガンド）が低分子量抗原である場
合には、高分子化抗原（リガンドと高分子化好物との結
合物）を用いる。高分子化抗原と結合した酵素標識抗体
の酵素は、立体障害により、非拡散性基質に対する酵素
活性が干渉される。検体中の抗原（リガンド）が結合し
た酵素標識抗体の酵素は、非拡散性基質に対する酵素活
性は影響されない。従って、検体中の抗原量に比例して
拡散性の反応生成物が生成される。反応生成物は速やか
に試薬層に移行して検出される。未反応の非拡散性基質
は基質層に留まる。測定対象が血漿・血清蛋白のような
高分子量の抗原の場合には、高分子量抗原と結合した酵
素標識抗体の酵素は、非拡散性基質に対する酵素活性が
干渉される。従って、検体中の高分子抗原（リガンド）
量に反比例して拡散性の反応生成物が生成される。この
反応生成物は速やかに試薬層に移行して検出される。未
反応の非拡散性基質は基質層に留まる。

【００１４】

【発明の構成の詳細な説明】

免疫分析要素の層構成 図１に本発明の免疫分析要素の一実施態様を示す。この
図１において符号１０は光透過性支持体であり、その上
には試薬層１２、基質層１４が積層されている。基質層
１４は、水浸透性層で構成され、抗体に標識として結合
された酵素の基質である非拡散性基質を含有する。試薬
層１２は、水浸透性層で構成され、基質層から拡散・移
行してきた拡散性物質を検出する試薬組成物を含有する
。また好ましい態様では拡散性物質をさらに低分子量の
生成物にする低分子化酵素を含有して、試薬組成物はこ
の低分子量生成物を検出する。この基本構成は、測定対
象が低分子抗原であるか高分子抗原であるかを問わず同
じである。ただし、測定対象が低分子抗原である場合に
は、検体と高分子化抗原と酵素標識抗体とを混合して競
争反応をした混合液を、基質層１４に点着又は供給する
ことにより分析を行う。この場合には、リガンド（低分
子抗原）の量が多いほど生成される拡散性物質は増大す
る。これに対して、測定対象が高分子量の抗原である場
合には、検体と酵素標識抗体のみを混合して抗原抗体結
合反応させ、その反応液を基質層１４に点着又は供給す
ればよい。この場合には、リガンド（高分子抗原）の量
が多いほど生成される拡散性物質は減少する。

【００１５】測定対象 本発明の測定対象は検体に含まれる抗原決定基を有する
リガンドである。検体の種類は限定されないが、例えば
血液（全血、血漿、血清）リンパ液、尿などがある。血
球などの浮遊物がある場合には予め除去しておくのが好
ましい。ただし適当な濾過層を分析要素の最上層に設け
た場合にはそのまま分析要素に点着・供給してもよい。 リガンドは抗原性があってその抗体を用意できるもので
あれば、低分子量物質から高分子量物質までの抗原につ
いて本発明の分析要素で分析できる。

【００１６】低分子量の抗原としては、例えば、ジゴキ
シン、テオフィリン、フェノバルビタール、フェニトイ
ン、ペニシリン、アミカシン等の薬物の誘導体（例えば
薬物と蛋白等の生体物質との結合物）、プロスタグラン
ジン、テストステロン、プロゲステロン、チロキシン等
のホルモン等を挙げることができる。高分子量の抗原と
しては、例えば、各種内分泌腺に由来するホルモン類、
免疫グロブリン、アルブミン、フェリチン、Ｃ−反応性
蛋白（以下ＣＲＰと略す）等の血漿蛋白質、ＨＢ抗原等
のウイルス、バクテリア類、α−フェトプロティン、癌
胎児性抗原（ＣＥＡ）等の各種臓器あるいは血中、尿中
に存在する抗原がある。

【００１７】なお本明細書でいう高分子抗原とは、酵素
標識抗体に結合してる酵素活性への干渉（抑制）作用を
示す程度の高分子量の抗原をいい、例えば分子量２万ダ
ルトン以上、好ましくは約５万ダルトン以上の抗原をい
う。これに対して本明細書でいう低分子抗原とは、酵素
標識抗体に結合してる酵素活性にあまり影響を与えない
程度の分子量の抗原をいい、例えば分子量２万ダルトン
以下の抗原をいう。但しこれらの分子量の値はあくまで
目安であって、リガンドが低分子抗原であるか高分子抗
原であるかの判断は、高分子化合物と結合した結合物（
高分子化抗原）との競合反応を利用するか否かでなされ
る。

【００１８】高分子化抗原 高分子化抗原、即ちリガンドと高分子化合物との結合物
は、抗体と結合することにより、その抗体を標識する酵
素の活性を抑制するものである。測定対象が低分子抗原
である場合に使用されるものであり、測定対象が高分子
抗原である場合には使用されない。高分子化合物の分子
量は分子量５万ダルトン以上のもので、かつ水溶性のも
のが好ましい。このような高分子化合物として、ゼラチ
ン、ヘモシアニンやフェリチン等の蛋白質、ポリエチレ
ングリコールなどを挙げることができる。これらはリガ
ンドと結合した状態で前述の条件を備えていれば十分で
あり、例えば牛血清アルブミンのような比較的低分子量
のものであっても、それを多量体に自家重合させるなど
して高分子化したものでもよい。

【００１９】リガンドと高分子化合物との結合方法は双
方の官能基を考慮して決定することができる。官能基は
、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イ
ミダゾール基、フェニル基などを利用することができる
。例えばアミノ基相互間を結合する方法は、イソシアネ
ート法、グルタルアルデヒド法、ジフルオロベンゼン法
、ベンゾキノン法等数多く知られている。アミノ基とカ
ルボキシル基とを結合する方法としては、カルボキシル
基をサクシニルイミドエステル化する方法の他カルボジ
イミド法、ウッドワード試薬法等が知られており、アミ
ノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ
法）も適用できる。チオール基を利用する場合には、例
えば一方の側のカルボキシル基をサクシニルイミドエス
テル化してこれにシスティンを反応させてチオール基を
導入し、チオール基反応性二価架橋剤を用いて双方を結
合することができる。フェニル基を利用する方法として
はジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合方法はこ
れらの例に限られるものではなく、この他例えば「Ｍｅ
ｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｖｏｌ．１，（Ｃ．Ａ．
Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｗ．Ｃｈａｓｅ，　Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９６７年）　あるいは石川、河
井、宮井　　編「酵素免疫測定法」（医学書院、１９７
８年発行）等の成書に記載されている方法の中から適宜
選択して利用することができる。リガンドと高分子化合
物との結合比は１：１に限らず、目的に応じて任意の比
率とすることができるのはいうまでもない。結合反応後
は、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー等によ
り精製し、必要により凍結乾燥法等により乾燥する。ま
た、リガンド自体を重合させて高分子化抗原としてもよ
い。 その場合の重合方法は前述の結合方法に準じて行なうこ
とができ、例えばカルボジイミド、グルタルアルデヒド
等の二価性架橋剤で高分子化すればよい。高分子化合物
には，リガンドの代わりに、リガンドに対する抗体と交
差反応性を有するリガンド誘導体を結合させてもよい。 ここでいうリガンド誘導体とは、単に化学構造上の類縁
体のみならず、免疫反応性において、リガンドと類似の
挙動を示すものを指す。例えば、リガンドであるテオフ
ィリンに対する抗体がカフェインにも交差反応する場合
には、カフェインの誘導体も高分子化抗原の材料として
用いることができる。なおリガンドまたはリガンド誘導
体に高分子化合物と結合させるための適当な官能基がな
い場合には、これらにアミノ基、カルボキシル基或いは
チオール基等が導入してもよい。その際にはスペーサー
を介して導入し、高分子化合物と結合し易くしてもよい
。例えばリガンドがテオフィリンである場合には、カル
ボキシル基を導入した８−プロピルカルボキシルテオフ
ィリンを高分子化合物に結合することができる。

【００２０】抗体 酵素で標識される抗体は、被検物であるリガンドに対す
る特異抗体を用いる。高分子化抗原にリガンド誘導体を
用いる場合には、リガンドとリガンド誘導体に共通する
抗原決定基に反応するものを用いる。常法により得られ
る抗体でよいが、モノクローナル抗体を用いれば、より
感度が向上する。またこの抗体はＦ（ａｂ’）２、Ｆａ
ｂ’　、Ｆａｂなどのフラグメントでもよい。

【００２１】酵素−非拡散性基質−低分子化酵素抗体に
標識として結合された酵素は、高分子からなる非拡散性
基質を分解して、低分子化酵素によりさらに低分子の生
成物を生じるような拡散性生成物を生成する。非拡散性
基質は、水性検体液に対して非拡散性でそれ自体は基質
層１４から試薬層１２に拡散・移行しない。低分子化酵
素は、抗体に標識として結合された酵素により、非拡散
性基質より生成した拡散性生成物を、さらに検出可能な
低分子生成物にするものであり、本発明の分析要素の試
薬層１２に含有される。これらの組合わせは、酵素が非
拡散性基質に作用して拡散性物質を生成し、さらにこの
拡散性生成物が、後記低分子化酵素によりさらに低分子
の生成物を生じて容易に検出できるような組合わせから
選ぶことができる。

【００２２】酵素 このような酵素としては重合体からなる非拡散性基質か
ら拡散性オリゴマーを生成するような分解酵素があり、
例えば、糖質加水分解酵素を挙げることができる。この
ような糖質加水分解酵素として、α−アミラーゼ、β−
アミラーゼ、グルコアミラ−ゼ、リゾチ−ム等がある。 酵素と抗体との結合は前記した高分子化合物と抗原との
結合方法と同様に行なうことができるので、ここではそ
の説明を省略する。

【００２３】これらの酵素はいずれの検体中に存在する
妨害因子で影響されないものが好ましく、また検体中に
は競合する同種の酵素がないことが好ましい。ただし、
標識酵素を同種の酵素が検体中に含まれている場合には
、この酵素阻害剤を用いてもよい。この酵素阻害剤は、
検体中の酵素を阻害する程度が標識酵素の活性を阻害す
る程度より大きいものであればよい。酵素阻害剤は検体
中の酵素を完全に失活させるが、標識酵素を全く阻害し
ないものが最も好ましい。しかし実用上は単に測定時に
おいてブランク値を上昇させなければよく、測定後には
酵素阻害剤が失活するなどして検体中の酵素活性が回復
しても構わない。なお酵素阻害剤は、酵素標識抗体の酵
素を阻害しないものであればよく、遊離状態の酵素を阻
害することは構わない。この酵素阻害剤は、公知の酵素
阻害剤から上記のような特異性を持つものを選んで用い
ればよい。或いは検体中の問題となる酵素に対する抗体
を作って、これを酵素阻害剤として用いてもよい。

【００２４】非拡散性基質 本発明では、非拡散性基質として、微粒子化された不溶
性多糖類を用いる。前述のα−アミラーゼ、β−アミラ
−ゼ、グルコアミラ−ゼに対する基質の例として、カル
ボキシメチル化澱粉、澱粉がある。カルボキシメチル化
澱粉、澱粉を非拡散性基質とする場合には、標識酵素と
してα−アミラーゼ、低分子化酵素として後述するグル
コアミラーゼ又はα−グルコシダーゼを用いた組み合わ
せが可能である。

【００２５】本発明で特に有用な不溶性多糖類は澱粉で
ある。このような澱粉は当業界で周知であり、各種起源
例えばポテト、トウモロコシ、小麦、スイートポテトか
らの澱粉からのものを用いることができる。水不溶性の
カルボキシルメチル化澱粉としては、例えば、エクスプ
ロタブ（Ｅｄｗａｒｄ　Ｍｅｎｄｅｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ
　Ｉｎｃ．製）やボンタブ３０（日澱化学株式会社）を
用いることができる。

【００２６】不溶性多糖類を微粒子化する方法として、
刃で切る方法、凍結させた状態でたたいてくだく方法、
流体エネルギ−ミル（ジェットミル）による方法などが
あり、ジェットミルによる方法が好ましい。ジェットミ
ルによる方法のうちでは、シングルトラック・ジェット
ミルによる方法が好ましい。微粉砕した後、湿式の遠心
分級法、乾式の遠心分級法により分級する。分級法とし
ては、乾式の遠心分級法が好ましい。乾式の分級法のう
ちでは、スペヂック・クラシファイア−による方法が好
ましい。本発明では、不溶性多糖類を微粒子化すること
により、標識酵素に対する活性上昇を図っている。微粒
子化により何故酵素活性が上昇するのかその詳細は不明
である。おそらくは、基質の加水分解部位に酵素が接近
して基質のある化学結合部位を切断する際に、それ自体
が巨大分子である基質が立体障害となり、この基質のサ
イズが小さくなることで立体障害が緩和されるためであ
ろうと思われる。この観点からすると、不溶性多糖類基
質の粒子サイズは小さければ小さい程よいとも思われる
。しかしながら、基質の粒子サイズが小さすぎると標識
酵素はあまりに容易に基質の加水分解部位に接近しこれ
を分解することが可能となり、高分子化抗原（又は高分
子抗原）と結合した抗体の標識酵素も、この基質に対し
て大きな活性を示すようになる。このため、分析要素の
Ｓ／Ｎ比が低くなり実用に適さなくなる。従って、不溶
性多糖類基質の粒子サイズは、酵素活性の上昇とＳ／Ｎ
比の減少とのバランスを見て決められる。この観点から
好ましいと考えられる不溶性多糖類基質の粒子サイズの
範囲は、平均粒径３〜３２μｍである。その内、より好
ましい範囲は平均粒径３〜１０μｍであり、特に平均粒
径３〜５μｍの範囲が最も好ましい。

【００２７】微粒子化した不溶性多糖類はアルカリや熱
などにより変性処理することによって、さらに好ましい
基質となる。このような変性処理によって酵素活性が上
昇する理由は不明であるが、おそらくは、巨大分子であ
る不溶性多糖類の表面状態が変わって、加水分解部位に
酵素の活性中心が近接しやすくなりその分解が促進され
るためと思われる。アルカリ変性の方法としては、トリ
エチルアミン、ジイソプロピルアミン、ｎ−ブチルアミ
ンなどの有機塩基、ＮａＨＣＯ３、ＫＯＨ　、ＮａＯＨ
などの無機塩基を用いた変性処理がある。その際、処理
液のｐＨは９〜１４の範囲であり、ｐＨ１１〜１３が最
も好ましい。処理時間は０．５　時間から３６時間の範
囲が適当であり、好ましくは１〜３時間の範囲である。 処理温度は０℃から４０℃の範囲が好ましい。アルカリ
変性処理後は中和処理を行う必要がある。この中和処理
は公知方法に基づき塩酸、酢酸、硫酸などで行うことが
できるが、澱粉のグリコシド結合を切断する影響が少な
い酢酸で中和処理するのが最も好ましい。

【００２８】微粒子化工程や変性処理工程で可溶性成分
（高分子の多糖類）が生成する場合には、この可溶性成
分と不溶性多糖類とを分離する必要がある。可溶性成分
除去には公知方法で行え、例えば遠心分離により除去で
きる。カルボキシルメチル化澱粉としてエクスプロタブ
を用いる場合、この物質の可溶物には電荷があるので、
遠心上層液の電気泳動度を測定することにより遠心分離
精製の程度を確認することができる。また可溶性成分を
公知の糖関連の呈色反応により検出するようにして、分
離精製の程度を確認してもよい。分散液中の成分を粉末
にする方法としては、公知の有機溶媒で沈澱させ、得ら
れた沈澱物を濾取し乾燥させる方法が最適である。有機
溶媒として、アセトン、メタノール、エタノールなどを
使用できる。

【００２９】低分子化酵素 この低分子化酵素は標識酵素と同じ種類の酵素であって
もよい。この場合には標識酵素は分子内部から切断して
オリゴマーを生成するエンド（ｅｎｄｏ）活性の酵素で
あり、低分子化酵素は分子の端から作用して単量体を生
成するエクソ（ｅｘｏ）　活性を持つものとするのが好
ましい。例えば、非拡散性基質が重合体（例えば澱粉）
である場合に、標識酵素により生成される拡散性オリゴ
マー（例えばマルトース）を単量体（例えばグルコース
）にまで分解できるものが用いられる。このような低分
子化酵素の例として糖加水分解酵素、より具体的には、
α−アミラ−ゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、
α−グルコシダ−ゼ等があげられる。非拡散性基質と標
識酵素として、カルボキシルメチルセルロースとセルラ
ーゼを用いた場合には、低分子化酵素としてＣ１エンザ
イムを用いることができる。

【００３０】試薬層において低分子化酵素により生成さ
れた低分子生成物は、公知の検出系試薬により光学的に
検出することができる。前記低分子化酵素により最終的
に生成したグルコースを検出する方法としては、例えば
、グルコースをグルコースオキシダーゼ存在下に酸化し
生成した過酸化水素を検出する方法（例えばＡｎｎ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　６，２４（１９６４）　
、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，　２２，２４６（１
９６９）に記載のＴｒｉｎｄｅｒ　試薬、特開昭４９−
５０９９１号（　対応米国特許３，８８６，０４５）、
　米国特許３，９９２，１５８　号、　特開昭５５−１
６４３５６　号（　対応米国特許４，２９２，２７２）
等に記載のＴｒｉｎｄｅｒ　試薬、特開昭５３−２６１
８８号（対応米国特許４，０８９，７４７）、特開昭５
８−４５５５７号等に記載のトリアリール置換イミダゾ
ールロイコ色素を含む試薬、特開昭５９−１９３３５２
　号（　対応欧州特許公開　ＥＰ　０１２２６４１Ａ）
、特開昭６０−２２４６７７　号（　対応米国特許４，
６６５，０２３）等に記載のジアリール−モノアラルキ
ル置換イミダゾールロイコ色素を含む試薬を用いる方法
）、グルコースデヒドロゲナーゼとＮＡＤの存在下に生
成するＮＡＤＨを検出する方法、またヘキソキナーゼ存
在下に生成するグルコース−６−リン酸を検出する方法
等、公知の方法を用いることができる。これらの検出方
法の中で、グルコースオキシダーゼ存在下にグルコース
を酸化し生成した過酸化水素をペルオキシダーゼとロイ
コ色素を用いて検出する方法が、感度の点で最も望まし
い。

【００３１】これらの検出試薬は分析要素の試薬層１２
に低分子化酵素と一緒に含有させてもよいが、試薬層１
２の下層に設けた別の層（例えば第２試薬層又は検出層
等）に含有させてこの層で検出するようにしてもよい。 なお、ロイコ色素を使用する場合には、水非混和性溶媒
の溶液の親水性バインダー中への分散物とするのが生成
した色素の安定性の上で好ましい。

【００３２】分析要素の層構成 本発明の乾式免疫分析要素は、公知の多種の乾式分析要
素と同様の層構成とすることができる。要素は、基質層
、試薬層の他、支持体、展開層、検出層、光遮蔽層、接
着層、吸水層、下塗り層その他の層を含む多重層として
もよい。このような分析要素として、例えば特開昭４９
−５３８８８号（対応米国特許　３，９９２，１５８）
、特開昭５１−４０１９１号（対応米国特許　４，０４
２，３３５）、　及び特開昭５５−１６４３５６　号（
対応米国特許　４，２９２，２７２）、　特開昭６１−
４９５９（対応ＥＰＣ公開特許０１６６３６５Ａ）　の
各明細書に開示されたものがある。光透過性水不透過性
支持体を用いる場合には、本発明の乾式免疫分析要素は
、実用的に次のような構成を取り得る。ただし本発明の
内容はこれに限定はされない。 （１）　支持体上に試薬層、その上に基質層を有するも
の。 （２）　支持体上に試薬層、接着層、基質層をこの順に
有するもの。 （３）　支持体上に検出層、試薬層、基質層をこの順に
有するもの。 （４）　支持体上に試薬層、光反射層、基質層をこの順
に有するもの。 （５）　支持体上に検出層、試薬層、光反射層、基質層
をこの順に有するもの。 （６）　支持体上に検出層、光反射層、試薬層、基質層
をこの順に有するもの。 （７）　支持体上に第２試薬層、光反射層、第１試薬層
、基質層をこの順に有するもの。 （８）　支持体上に検出層、第２試薬層、光反射層、第
１試薬層、基質層をこの順に有するもの。 上記（１）　ないし（６）　において試薬層は異なる複
数の層から成ってもよい。また試薬層は後述するように
免疫反応し得る成分を含む免疫反応層としてもよい。支
持体と試薬層又は検出層との間には吸水層を設けてもよ
い。また各層の間には濾過層を設けてもよい。また基質
層の上には展開層を設けてもよく、又は基質層に展開作
用を持たせ展開層として機能させてもよい。

【００３３】基質層 基質層１４は、水浸透性層で構成され、抗体を標識する
酵素の基質である非拡散性基質を含有する。基質層の水
浸透性を確保するためには、多孔性媒体からなる多孔性
層とするか、親水性ポリマーバインダーからなる層とす
るのが好ましい。

【００３４】多孔性層は繊維質であってもよいし、非繊
維質であってもよい。繊維質材料としては、例えば濾紙
、不織布、織物布地（例えば平織布地）、編物布地、（
例えばトリコット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用い
ることができる。非繊維質材料としては、特開昭４９−
５３８８８等に記載の酢酸セルロース等からなるメンブ
ランフィルター、特開昭４９−５３８８８、特開昭５５
−９０８５９（対応米国特許　４，２５８，００１）、
特開昭５８−７０１６３（対応米国特許　４，４８６，
５３７）等に記載の無機物又は有機物微粒子からなる連
続空隙含有粒状構造物層等のいずれでもよい。特開昭６
１−４９５９（対応欧州公開　ＥＰ　０１６６３６５Ａ
）、特開昭６２−１１６２５８　、特開昭６２−１３８
７５６（対応欧州公開　ＥＰ　０２２６４６５Ａ）、特
開昭６２−１３８７５７（対応欧州公開　ＥＰ０２２６
４６５Ａ）、特開昭６２−１３８７５８（対応欧州公開
　ＥＰ　０２２６４６５Ａ）等に記載の部分接着された
複数の多孔性層の積層物も好適である。多孔性層は供給
される液体の量にほぼ比例した面積に液体を展開する、
いわゆる計量作用を有する展開層であってもよい。展開
層としては、これらのうち織物布地、編物布地などが好
ましい。織物布地などは特開昭５７−６６３５９号に記
載されたようなグロー放電処理をしてもよい。展開層に
は、展開面積、展開速度等を調節するため、特開昭６０
−２２２７７０　（　対応：　ＥＰ　０１６２３０１Ａ
　）、特開昭６３−２１９３９７　（　対応***特許公
開　ＤＥ　３７　１７　９１３Ａ）、特開昭６３−１１
２９９９（　対応：　ＤＥ　３７　１７　９１３Ａ　）
、特開昭６２−１８２６５２　（　対応：　ＤＥ　３７
　１７　９１３Ａ　）　に記載したような親水性高分子
あるいは界面活性剤を含有させてもよい。例えば紙、布
、高分子からなる多孔質膜等に基質を予め含浸又は塗布
した後、支持体上に設けた他の水浸透性層、例えば試薬
層の上に、特開昭５５−１６４３５６　号のような方法
で接着させるのも有用な方法である。また別の方法とし
て多孔質層を他の水浸透性層（例えば試薬層）に前記の
ような方法で接着させた後、基質を含む組成物を多孔質
層に塗布してもよい。 多孔質層への含浸又は塗布には公知の方法を利用できる
。塗布には例えばディップ塗布、ドクター塗布、ホッパ
ー塗布、カーテン塗布等を適宜選択して用いる。こうし
て作られる基質層の厚さは特に制限されないが、塗布層
として設ける場合には、１μｍ〜５０μｍ程度、好まし
くは２μｍ〜３０μｍの範囲が適当である。ラミネート
による積層など、塗布以外の方法による場合、厚さは数
十μｍから数百μｍの範囲で大きく変化し得る。

【００３５】親水性ポリマーバインダーからなる水浸透
性層で基質層を構成する場合、使用できる親水性ポリマ
ーとしては、例えば、以下のものがある。ゼラチン及び
これらの誘導体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロー
ス誘導体（例えばヒドロキシエチルセルロース）、アガ
ロース、アルギン酸ナトリウム、アクリルアミド共重合
体、メタアクリルアミド共重合体、アクリルアミド又は
メタアクリルアミドと各種ビニル性モニマーとの共重合
体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニル
アルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナ
トリウム、アクリル酸と各種ビニル性モノマーとの共重
合体などである。親水性ポリマーバインダーで構成され
る基質層は、特公昭５３−２１６７７号（対応米国特許
　３，９９２，１５８）、特開昭５５−１６４３５６　
号（対応米国特許　４，２９２，２７２）、特開昭５４
−１０１３９８　号（対応米国特許　４，１３２，５２
８）、特開昭６１−２９２０６３　号（Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，　１０６，　２１０５６７ｙ
）等の明細書に記載の方法に従って、基質その他の試薬
組成物と親水性ポリマを含む水溶液又は水分散液を支持
体又は検出層等の他の層の上に塗布し乾燥することによ
り設けることができる。親水性ポリマーをバインダーと
する基質層の乾燥時厚さは約２　μｍ　〜約５０μｍ　
、好ましくは約４　μｍ　〜約３０μｍ　の範囲、被覆
量では約２　ｇ／ｍ２〜約５０ｇ／ｍ２、好ましくは約
４　ｇ／ｍ２〜約３０ｇ／ｍ２の範囲である。

【００３６】基質層には非拡散性基質の他に、塗布特性
、拡散性化合物の拡散性、反応性、保存性等の諸性能の
向上を目的として、酵素の活性化剤、補酵素、界面活性
剤、ｐＨ緩衝剤組成物、微粉末、酸化防止剤、その他、
有機物あるいは無機物からなる各種添加剤を加えること
ができる。基質層に含有させることができる緩衝剤の例
としては、日本化学会編「化学便覧　　基礎編」（東京
、丸善（株）、１９６６年発行）１３１２−１３２０　
頁、Ｒ．Ｍ．Ｃ．Ｄａｗｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ編、「Ｄａ
ｔａ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ」第２版（Ｏｘｆｏｒｄ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｃｌａｒ
ｅｎｄｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，１９６９　年発行）　４７６
−５０８　頁、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」　５，４
６７−４７７頁　（１９６６年）　、「Ａｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」　１０４，３００
−３１０　頁　（１９８０年）　に記載のｐＨ緩衝剤系
がある。ｐＨ緩衝剤の具体例としてトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）を含む緩衝剤；燐酸
塩を含む緩衝剤；硼酸塩を含む緩衝剤；クエン酸又はク
エン酸塩を含む緩衝剤；グリシンを含む緩衝剤；ビシン
（Ｂｉｃｉｎｅ）を含む緩衝剤；ＨＥＰＥＳ　を含む緩
衝剤；ＭＥＳ　を含む緩衝剤などのグッド緩衝剤等があ
る。

【００３７】試薬層 試薬層１２は、基質層１４から拡散・移行してきた拡散
性物質を検出する試薬組成物を含有する。必要に応じて
試薬組成物の中には低分子化酵素が含有され、拡散性物
質を低分子化して生じた低分子生成物を検出するための
検出試薬組成物を含有する。試薬層は、水浸透性層で構
成され、前記基質層の説明で述べた水浸透性層のうち、
親水性ポリマーバインダーからなる連続層とするのが好
ましい。用いる親水性ポリマーバインダーは基質層で生
成される拡散性生成物や、試薬層内に含有する発色試薬
などを考慮して決められる。

【００３８】支持体 支持体１０としては光不透過性（不透明）、光半透過性
（半透明）、光透過性（透明）のいずれのものも用いる
ことができるが、一般的には光透過性で水不透過性の支
持体が好ましい。光透過性水不透過性支持体の材料とし
て好ましいのものはポリエチレンテレフタレート、ポリ
スチレンである。親水性層を強固に接着させるため通常
、下塗り層を設けるか、親水化処理を施す。

【００３９】免疫反応層 図１の基質層１４には、非拡散性基質のみならず、酵素
標識抗体を併せて含有させ、この基質層内で免疫反応を
併せて行なわせる免疫反応層としてもよい。この場合に
は、要素に検体を点着するだけで、要素内で均一系の酵
素免疫反応が進行させることができる。基質層とは別の
層に酵素標識抗体を含有させてもよい。例えば図２に示
すように、基質層１４の上に酵素標識抗体を含有する水
浸透性層１６を設け免疫分析要素を構成してもよい。こ
の場合には、検体中の低分子抗原又は高分子抗原は、層
１６の酵素標識抗体の抗体と結合し、さらに基質層１４
に移行する。１つの層に酵素標識抗体を実質的な乾燥状
態又は実質的に水の非存在状態で含有させるには、酵素
標識抗体をアルコール（例、エタノール）等の非水溶媒
に溶解又は分散させて水浸透性層に含浸させればよい。

【００４０】免疫分析要素の製造方法 本発明の乾式免疫分析要素は前述の諸特許明細書に記載
の公知の方法により調製することができる。本発明の分
析要素は一辺約１５ｍｍから約３０ｍｍの正方形または
ほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭５７−２
８３３１（対応米国特許　４，１６９，７５１）、実開
昭５６−１４２４５４　（対応米国特許　４，３８７，
９９０）、特開昭５７−６３４５２，実開昭５８−３２
３５０，特表昭５８−５０１１４４　（　対応国際公開
：　ＷＯ　８３／００３９１）等に記載のスライド枠に
収めて化学分析スライドとして用いることが、製造，包
装，輸送，保存，測定操作等の観点で好ましい。使用目
的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジン
に収めて用いたり、または小片を開口のあるカードに貼
付または収めて用いることなどもできる。

【００４１】免疫分析要素による分析方法本発明の分析
要素は前述の諸特許明細書等に記載の操作と同様の操作
により液体試料中の被検物である高分子抗原の定量分析
ができる。例えば約５μＬ　〜約３０μＬ　、好ましく
は８〜１５μＬ　の範囲の血漿、血清、尿などの水性液
体試料液を基質層１４に点着する。点着した分析要素を
約２０℃〜約４５℃の範囲の一定温度で、好ましくは約
３０℃〜約４０℃の範囲内の一定温度で１〜１０分間イ
ンキュベーションする。要素内の発色又は変色を光透過
性支持体側から反射測光し、予め作成した検量線を用い
て比色測定法の原理により検体中の高分子抗原の量を求
めることができる。点着する液体試料の量、インキュベ
ーション時間及び温度を一定にすることにより定量分析
を高精度に実施できる。測定操作は特開昭６０−１２５
５４３、同６０−２２０８６２、同６１−２９４３６７
、同５８−１６１８６７（対応米国特許　４，４２４，
１９１）などに記載の化学分析装置により極めて容易な
操作で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必
要精度によっては、目視により発色の度合いを判定して
、半定量的な測定を行なってもよい。分析要素内に、酵
素標識抗体を含有させていない場合には、要素に点着す
る前に、水性試料液を酵素標識抗体を含む溶液と混和し
て、結合反応を十分行なわせてから、基質層に点着すれ
ばよい。

【００４２】

【合成例１】（１）　酵素標識抗体の合成■ＣＨＭ化ア
ミラーゼの作製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ　５ｍｇをｐＨ６．３
　の　０．１Ｍグリセロ燐酸１ｍＬに溶かし、［４−（
マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−　カルボン酸
］スクシンイミドエステル（ＣＨＭＳ）２ｍｇ／ｍｌの
ＤＭＦ溶液　１００ｍＬを加えて室温で、１時間反応さ
せた。この反応液をセファデックスＧ−２５カラムにア
プライして、ｐＨ６．３の　０．１Ｍグリセロ燐酸を流
して素通り分画を分取、　４−（　マレイミドメチル）
シクロヘキサン−１−　カルボン酸アミド化アミラーゼ
（ＣＨＭ化アミラーゼ）を得た。 ■抗テオフィリンマウスＩｇＧＦ（ａｂ’）２の作製抗
テオフィリンマウスＩｇＧ　１０ｍｇ　（０．１Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ　５．５））２ｍＬにパパイン３００　μ
ｇを加え、３７℃で１８時間撹拌した。０．１　Ｎ　Ｎ
ａＯＨを加えてｐＨを６．０　に調節したこの反応液を
予め０．１　Ｍ　燐酸緩衝１ｍＭ　ＥＤＴＡ　溶液（ｐ
Ｈ６．３　）で緩衝化したＡｃＡ−４４ゲルカラムに入
れ、上記の燐酸緩衝液で溶出した。分子量約１０万付近
に溶出されたピーク部分を集めて１ｍＬに濃縮し、目的
の抗テオフィリンマウスＩｇＧＦ（ａｂ’）２を得た。 ■α−アミラーゼ−抗テオフィリンマウスＩｇＧＦａｂ
’　結合物の作製 ■で調製した抗テオフィリンマウスＩｇＧＦ（ａｂ’）
２６ｍｇを含む０．１　Ｍ　燐酸緩衝液（１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ含有、　ｐＨ６．０　）１ｍＬに１０ｍｇ／ｍＬ　
の２−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液　１００μ
Ｌ　を加え、３７℃で９０分間撹拌した。この反応液を
予め０．１　Ｍ　燐酸緩衝液（ｐＨ　６．３）で緩衝化
したセファデックスＧ−２５カラムでゲル濾過して未反
応の２−メルカプトエチルアミンを除去し、ＨＳ−Ｆａ
ｂ’　を得た。これに■で調製したＣＨＭ化α−アミラ
ーゼ２ｍｇを加え、３７℃で９０分間反応させた。次に
この反応液を０．１　Ｍ　酢酸緩衝５ｍＭ塩化カルシウ
ム溶液（ｐＨ　７．０）で緩衝化したＡｃＡ−３４カラ
ムでゲル濾過して分子量２０万以上の分画を集め、これ
を濃縮して目的の結合物を得た。

【００４３】■抗ＣＲＰ・マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）２
の作製抗ＣＲＰ・マウスＩｇＧ１０ｍｇ（０．１Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ　５．５））２ｍＬ　にパパイン　３００
μｇ　を加え、３７℃で１８時間撹拌した。０．１　Ｎ
　ＮａＯＨを加えてｐＨを６．０　に調節したこの反応
液を予め０．１　Ｍ　燐酸緩衝１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐ
Ｈ６．３　）で緩衝化したＡｃＡ−４４ゲルカラムにア
プライし、上記の燐酸緩衝液で溶出した。分子量約１０
万付近に溶出されたピーク部分を集めて１ｍＬ　に濃縮
し、目的の抗ＣＲＰ・マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）２を得
た。 ■α−アミラーゼ−抗ＣＲＰ・マウスＩｇＧＦａｂ’　
結合物の作製 ■で調製した抗ＣＲＰ・マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）２６
ｍｇ　を含む０．１　Ｍ　燐酸緩衝液（　１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ含有、　ｐＨ６．０）１ｍＬ　に１０ｍｇ／ｍＬ　
の２−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液　１００μ
Ｌ　を加え、３７℃で９０分間撹拌した。この反応液を
予め０．１　Ｍ　燐酸緩衝液（ｐＨ６．３）で緩衝化し
たセファデックスＧ−２５カラムでゲル濾過して未反応
の２−メルカプトエチルアミンを除去し、ＨＳ−Ｆａｂ
’　を得た。これに■で調製したＣＨＭ化α−アミラー
ゼ２ｍｇを加え、３７℃で９０分間反応させた。次にこ
の反応液を０．１　Ｍ　酢酸緩衝５ｍＭ塩化カルシウム
溶液（ｐＨ　７．０）で緩衝化したＡｃＡ−３４カラム
でゲル濾過して分子量２０万以上の分画を集め、これを
濃縮して目的の結合物を得た。

【００４４】

【合成例２】高分子化抗原（テオフィリン−ＢＳＡ結合
物）の合成 ８−プロピルカルボキシテオフィリン５ｍｇを１ｍＬ　
　ＤＭＦに溶かし、これにＮ−ヒドロキシサクシンイミ
ド３ｍｇ、水溶性カルボジイミド５ｍｇを加え室温にて
２時間撹拌し活性化テオフィリンを調製した。ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）１０ｍｇを０．１　Ｍ　炭酸水素
ナトリウム水溶液１ｍＬ　に溶かし、上記活性化テオフ
ィリン溶液を５００　μＬ　加え室温にて１時間放置し
、予めＰＢＳで平衡化したセファデックス−Ｇ２５ゲル
カラムにて、未反応物を除去し目的の高分子化抗原（テ
オフィリン−ＢＳＡ結合物）を９ｍｇ得た。

【００４５】

【実施例１】微粒子化カルボキシルメチル化澱粉の調製
エクスプロタブ（Ｅｄｗａｒｄ　Ｍｅｎｄｅｌ　Ｃｏｍ
ｐａｎｙ　Ｉｎｃ．製）５０ｋｇをシングルトラックジ
ェットミル（ＦＳ−４型）で粉砕し、平均粒径７．８　
μｍ　の粉砕品４８．２ｋｇ（　収率９６．３％）を得
た。この粉砕品２５．８１ｋｇ　をスペヂッククラッシ
ファイアーを用いて分級し、平均粒径５．０　μｍ　の
粉砕・分級品１０．５ｋｇ（　収率４０．６８％）　を
得た。なお、粉砕前のエクスプロタブの平均粒径は４１
．９μｍ　であった。

【００４６】

【実施例２】微粒子化カルボキシルメチル化澱粉のアル
カリ変性処理 実施例１で得られた平均粒径５．０　μｍ　のエクスプ
ロタブ微粒子１０ｇを２００ｍＬの蒸留水に分散し、０
．５Ｎ　ＮａＯＨ　溶液５０ｍＬを加えて室温で１時間
撹拌した。１Ｎ酢酸でｐＨ７．０５に中和し、蒸留水を
加え全量を１．５　Ｌ　にした。これを約１万Ｇで高速
遠心機にかけ、遠心上層液の電気電導度が２０μｓ／ｃ
ｍ以下になるまで遠心精製を繰り返して可溶性成分を除
去した。分散物をよく撹拌しながらエタノール１０　Ｌ
を加え、沈澱してきた白色物質を減圧濾過で集めた。こ
れを３０℃で１０時間乾燥し、６．６ｇ（　収率６５％
）のエクスプロタブ微粉化アルカリ処理物質を得た。

【００４７】

【実施例３】微粒子化カルボキシルメチル化澱粉の熱変
性処理 実施例１で得られた平均粒径５．０　μｍ　のエクスプ
ロタブ微粒子１０ｇを２５０ｍＬの蒸留水に分散し、オ
ートクレーブ中で１２０℃、８時間処理した。熱処理後
の分散液を実施例２と同様、遠心操作により精製しエタ
ノール沈澱を集めてエクスプロタブ微粉化熱処理物質を
得た（収量６．０ｇ、　収率６０％）。

【００４８】

【実施例４】実施例１のエクスプロタブ微粒子、実施例
２のアルカリ変性エクスロプロタブ微粒子、実施例３の
熱変性エクスプロタブ微粒子、さらに比較例として微粒
子化処理していないエクスプロタブを、各々５０ｍＭマ
レイン酸緩衝液（ｐＨ　６．５　）に分散し０．５％（
Ｗ／Ｖ）　分散液とした。各分散液１ｍＬに、合成例１
で得たα−アミラーゼ−抗ＣＲＰ結合物の各希釈倍率の
溶液を１００　μＬ　加えて３７℃で３０分間インキュ
ベートした。反応後、遠心により上清（５００　μＬ　
）を分け取り、グルコアミラーゼ１００　Ｕ　を加え、
３７℃で２時間インキュベートした。上清２００　μＬ
　を取り出し、和光純薬製のグルコース測定キット「Ｗ
ａｋｏＧｌｕ　Ｃ」　を用いてアッセイし、波長５１０
ｎｍ　で吸光度を測定した。結果を図１に示す。図から
明らかなように、微粒子化したもの（図中Ａ）は、比較
例の未微粒子化エクスプロタブ（図中Ｒ）よりも酵素活
性が大きくなっている。さらにアルカリ変性したもの（
図中Ｂ）、熱変性したもの（図中Ｃ）では、酵素活性が
より大きくなっている。

【００４９】

【実施例５】ゼラチン下塗層が設けられている厚さ１８
０　μｍの無色透明ポリエチレンテレフタレート（ＰＥ
Ｔ　）シート（支持体）上に下記の被覆量になるように
架橋剤含有試薬溶液を塗布し、乾燥して試薬層を設けた
。 　　　　アルカリ処理ゼラチン　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１４．５　ｇ／ｍ２　　　　　ノニルフェノキシポリエ
トキシエタノール　　　　　　　　　　（オキシエチレ
ン単位平均　９〜１０含有）　　　　　　　　　　　　
　　　０．２　ｇ／ｍ２　　　　　グルコースオキシダ
ーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　５０００　ｕ／ｍ２　　　　　
ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５０
００　ｕ／ｍ２　　　　　グルコアミラーゼ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　５０００　ｕ／ｍ２　　　　　２
−（４−　ヒドロキシ−３，５−　ジメトキシフェニル
−４−［４−（ジメチルアミノ）　　　　フェニル］−
５−フェネチルイミダゾール（ロイコ色素）酢酸塩　　
　０．３８　ｇ／ｍ２　　　　ビス［（ビニルスルホニ
ルメチルカルボニル）アミノ］メタン　　　０．１　ｇ
／ｍ２　この試薬層の上に下記の被覆量になるように接
着層を塗布、乾燥して設けた。 　　　　アルカリ処理ゼラチン　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１４．５　ｇ／ｍ２　　　　　ビス［（ビニルスルホニ
ルメチルカルボニル）アミノ］メタン　　　０．１　ｇ
／ｍ２　ついで接着層の表面に下記の被覆量になるよう
に下記試薬含有水溶液を塗布し、ゼラチン層を膨潤させ
、その上に５０デニール相当のＰＥＴ　紡績糸３６ゲー
ジ編みした厚さ約２５０　μｍのトリコット編物布地を
ほぼ一様に軽く圧力をかけてラミネートして多孔性展開
層を設けた。 　　　　ノニルフェノキシポリエトキシエタノール　　
　　　　（オキシエチレン単位平均　９〜１０含有）　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１５　ｇ／
ｍ２　　　　ビス［（ビニルスルホニルメチル　　カル
ボニル）アミノ］メタン　　０．４　ｇ／ｍ２次に、実
施例１で得られた微粒子化エクスプロタブ（平均粒径５
．０　μｍ　）を用いて、下記の被覆量になるように基
質を塗布、乾燥して基質層を設けてテオフィリン分析用
多層分析要素を調製した。 　　　　微粒子化エクスプロタブ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５　ｇ／ｍ
２　　　　ノニルフェノキシポリエトキシエタノール　
　　　（オキシエチレン単位平均　９〜１０含有）　　
　　　　　　　　　　　　０．２　ｇ／ｍ２さらに合成
例（２）　で合成したテオフィリン−ＢＳＡ結合物を３
　ｍｇ／ｍ２　の被覆量となるようにして水溶液を塗布
し含浸させ、次いで合成例（１）　で合成したアミラー
ゼ−抗テオフィリンＩｇＧ結合物を３ｍｇ／ｍ２　の被
覆量となるようにしてエタノール溶液を塗布し含浸させ
乾燥させて乾燥させてテオフィリン分析用多層免疫要素
を作成した。次いでこの分析要素を１５ｍｍ四方のチッ
プに裁断し、特開昭５７−６３４５２に記載のスライド
の枠に収めて、本実施例のテオフィリン分析用多層乾式
スライド１とした。比較用試料として、基質のカルボキ
シメチル化澱粉として微粉砕したエクスプロタブ（平均
粒径５．０　μｍ　）の代りに未粉砕のエクスプロタブ
（平均粒径４１．９μｍ　）を用いた他は、実施例４と
全く同様な構成の比較用スライド２を作成した。両スラ
イド１，２に既知量のテオフィリンを含有するｐＨ７　
の５０ｍＭグリセロ燐酸緩衝溶液１０μＬ　を点着し、
３７℃に保って、支持体側から６５０ｎｍ　の反射光学
濃度を測定し、点着から４分後および６分後の反射光学
濃度の差（ΔＯＤ６−４　）を求めて、検量線を作成し
た。図４に示すように、本実施例のスライド１は比較用
スライド２に比べ、感度が高く、テオフィリンの定量を
精度良く行えることが判明した。

【００５０】

【実施例６】実施例５と全く同様の手順、構成で、透光
性支持体（ＰＥＴ　シート）上に試薬層、接着層、多孔
性展開層を順次積層した。この多孔性展開層の上に、実
施例１で得られた微粒子化エクスプロタブ（平均粒径５
．０　μｍ　）を用いて、下記の被覆量になるように基
質を塗布、乾燥して基質層を設けた。 　　　　　　微粒子化エクスプロタブ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　６　ｇ／ｍ２　　　
　　　ノニルフェノキシポリエトキシエタノール　　　
　　　（オキシエチレン単位平均　９〜１０含有）　　
　　　　　　　　０．２　ｇ／ｍ２この基質層の上から
、合成例（１）　で合成したアミラーゼ−抗ＣＲＰ・Ｉ
ｇＧ結合物のエタノール溶液を３ｍｇ／ｍ２の被覆量と
なるように塗布、含浸させ乾燥させ、得られた積層物を
実施例５と同様のスライド枠に納めて、ＣＲＰ分析用多
層分析スライド３を作成した。比較用試料として、基質
のカルボキシメチル化澱粉として微粉砕したエクスプロ
タブ（平均粒径５．０　μｍ　）の代りに未粉砕のエク
スプロタブ（平均粒径４１．９μｍ　）を用いた他は、
実施例６と全く同様な構成の比較用スライド４を作成し
た。 両スライド３，４に既知量のＣＲＰを含有するｐＨ７　
の５０ｍＭグリセロ燐酸緩衝溶液１０μＬ　を点着し、
３７℃に保って、支持体側から６５０ｎｍ　の反射光学
濃度を測定し、点着から３分後および５分後の反射光学
濃度の差（ΔＯＤ５−３　）を求めて、検量線を作成し
た。図４に示すように、本実施例のスライド３は比較用
スライド４に比べ、感度が高く、ＣＲＰの定量を精度良
く行えた。

【００５１】

【実施例７】次にエクスプロタブの粒径による酵素活性
に対する影響を調べた。実施例１と同様な方法で粉砕・
分級して得た平均粒径３、５、１０及び３２μｍ　のエ
クスプロタブ微粒子を実施例２の方法でアルカリ処理し
た。実施例５と全く同様の手順、構成で、透光性支持体
（ＰＥＴ　シート）上に試薬層、接着層、多孔性展開層
を順次積層した。この多孔性展開層の上に、各平均粒径
のアルカリ変性エクスプロタブ微粒子を用いて、下記の
被覆量になるように基質を塗布、乾燥して基質層を設け
た。 　　　　　　アルカリ変性エクスプロタブ微粒子　　　
　　　　　　　　　　　　　　　６　ｇ／ｍ２　　　　
　　ノニルフェノキシポリエトキシエタノール　　　　
　　（オキシエチレン単位平均　９〜１０含有）　　　
　　　　　　　　　　　０．２　ｇ／ｍ２得られた積層
物をそれぞれ実施例５と同様のスライド枠に納めて、多
層分析スライド１、２、３及び４を作成した。合成例（
１）　で合成したアミラーゼ−抗テオフィリンＩｇＧ結
合物の１０μｇ／ｍｌの溶液１０μＬ　を各スライドに
点着し、３７℃で６分間インキュベート後、中心波長６
５０ｎｍの可視光でＰＥＴ支持体側から反射光学濃度（
Ａ）を測定した。また前記酵素標識抗体（アミラーゼ−
抗テオフィリンＩｇＧ結合物）の溶液５０μＬ　に、合
成例（２）　で合成した高分子化抗原（テオフィリン−
ＢＳＡ結合物）の２０μｇ／ｍｌの溶液５０μＬ　を混
合し、これを１０μＬ　各スライドに点着し、３７℃で
６分間インキュベート後、同様に反射光学濃度（Ｂ）を
測定した。それぞれのスライドについて光学濃度の差Ａ
−Ｂを求めた。 下記の表１から明らかなように、平均粒径３〜３２μｍ
　の範囲で高分子化抗原の存在を検出できた。また平均
粒径が小さくなるにつれ感度（Ａの値）は上昇するが、
バックグラウンドに相当するＢの値は平均粒径が小さく
なるにつれ増加していた。この結果、より好ましい粒子
サイズの範囲としては粒径３〜１０μｍ　、特に好まし
いのは粒径５〜１０μｍ　の範囲であると判定できた。

【００５２】

【表１】 　　───────────────────────
───────────　　　　スライド番号　　　　
　　　　　　　　１　　　　　　　　　　２　　　　　
　　　　　３　　　　　　　　４　　────────
─────────────────────────
─　　　　微粒子の平均粒径　　　　　　　　３　　　
　　　　　　　５　　　　　　　　１０　　　　　　３
２　　　　　　　　（μｍ） 　　───────────────────────
───────────　　　　反射光学濃度 　　　　　　　　　　Ａ　　　　　　　　　　　　　　
１．１５２　　　　　　　１．０９２　　　　　　　０
．５５０　　　　　　０．１６０　　　　　　　　　　
Ｂ　　　　　　　　　　　　　　０．５６０　　　　　
　　０．２４０　　　　　　　０．１２０　　　　　　
０．０９０　　──────────────────
────────────────　　　　　　　　Ａ
−Ｂ　　　　　　　　　　　　０．５９２　　　　　　
　０．８５２　　　　　　　０．４３０　　　　　　０
．０７０　　───────────────────
───────────────

【００５３】最後に本発明の好ましい態様をまとめると
、以下の通りである。 （１）　低分子抗原と、低分子抗原と高分子化合物との
結合物と、酵素標識抗体との間の反応により生じた酵素
活性の変化を測定することにより低分子抗原の量を分析
する免疫分析要素であって、前記酵素により拡散性物質
を生成する非拡散性基質を含有する基質層と、前記拡散
性物質を検出する試薬層とを備えるものにおいて、前記
非拡散性基質が微粒子化された不溶性多糖類であること
を特徴とする免疫分析要素。 （２）　前記微粒子化された不溶性多糖類が、粉砕分級
処理されたものであることを特徴とする（１）　記載の
免疫分析要素。 （３）　前記微粒子化された不溶性多糖類が、平均粒径
２〜３２μｍのものであることを特徴とする（１）　記
載の免疫分析要素。 （４）　前記不溶性多糖類が、カルボキシルメチル化澱
粉であることを特徴とする（１）　に記載の免疫分析要
素。 （５）　前記不溶性多糖類が、アルカリ変性または熱変
性されたものであることを特徴とする（１）　に記載の
免疫分析要素。 （６）　前記カルボキシルメチル化澱粉が、アルカリ変
性または熱変性されたものであることを特徴とする（４
）　に記載の免疫分析要素。 （７）　前記抗体を標識する酵素が、糖質加水分解酵素
であることを特徴とする（１）記載の免疫分析要素。 （８）　前記糖質加水分解酵素が、α−アミラーゼであ
ることを特徴とする（７）　記載の免疫分析要素。 （９）　前記試薬層またはその下の層には、前記拡散性
物質をさらに低分子生成物にする低分子化酵素が含有さ
れていることを特徴とする　（１）〜（８）　記載の免
疫分析要素。 （１０）前記低分子生成物と反応して可視吸収を有する
色素を生成する試薬組成物が、前記試薬層または他の水
浸透性層に含有されていることを特徴とする（９）　記
載の免疫分析要素。 （１１）前記標識抗体が、前記基質層または基質層の上
に積層された層に含有されてていることを特徴とする（
１）　〜（１０）記載の免疫分析要素。 （１２）高分子抗原と、酵素標識抗体との間の反応によ
り生じた酵素活性の変化を測定することにより高分子抗
原の量を分析する免疫分析要素であって、前記酵素によ
り拡散性物質を生成する非拡散性基質を含有する基質層
と、前記拡散性物質を検出する試薬層とを備えるものに
おいて、前記非拡散性基質が微粒子化された不溶性多糖
類であることを特徴とする免疫分析要素。 （１３）前記微粒子化された不溶性多糖類が、粉砕分級
処理されたものであることを特徴とする（１２）記載の
免疫分析要素。 （１４）前記微粒子化された不溶性多糖類が、平均粒径
２〜３２μｍのものであることを特徴とする（１２）記
載の免疫分析要素。 （１５）前記不溶性多糖類が、カルボキシルメチル化澱
粉であることを特徴とする（１２）に記載の免疫分析要
素。 （１６）前記不溶性多糖類が、アルカリ変性または熱変
性されたものであることを特徴とする（１２）に記載の
免疫分析要素。 （１７）前記カルボキシルメチル化澱粉が、アルカリ変
性または熱変性されたものであることを特徴とする（１
２）に記載の免疫分析要素。 （１８）前記抗体を標識する酵素が、糖質加水分解酵素
であることを特徴とする（１２）記載の免疫分析要素。 （１９）前記糖質加水分解酵素が、α−アミラーゼであ
ることを特徴とする（１８）記載の免疫分析要素。 （２０）前記試薬層またはその下の層には、前記拡散性
物質をさらに低分子生成物にする低分子化酵素が含有さ
れていることを特徴とする　（１２）　〜（１９）記載
の免疫分析要素。 （２１）前記低分子生成物と反応して可視吸収を有する
色素を生成する試薬組成物が、前記試薬層または他の水
浸透性層に含有されていることを特徴とする（２０）記
載の免疫分析要素。 （２２）前記標識抗体が、前記基質層または基質層の上
に積層された層に含有されてていることを特徴とする（
１２）〜（２１）記載の免疫分析要素。 （２３）　　低分子抗原と、低分子抗原と高分子化合物
との結合物と、酵素標識抗体との間の反応により生じた
酵素活性の変化を測定することにより、検体中の低分子
量抗原を分析するため、 （ａ）　前記検体を、前記酵素により拡散性物質を生成
する非拡散性基質を含有する基質層に供給し、次いで、
（ｂ）　前記基質層で生成された拡散性物質を試薬層に
移行させて検出する免疫分析方法において、前記非拡散
性基質が微粒子化された不溶性多糖類であることを特徴
とする免疫分析方法。 （２４）　　高分子抗原と酵素標識抗体との間の反応に
より生じた酵素活性の変化を測定することにより、検体
中の高分子量抗原を分析するため、 （ａ）　前記検体を、前記酵素により拡散性物質を生成
する非拡散性基質を含有する基質層に供給し、次いで、
（ｂ）　前記基質層で生成された拡散性物質を試薬層に
移行させて検出する免疫分析方法において、前記非拡散
性基質が微粒子化された不溶性多糖類であることを特徴
とする免疫分析方法。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の免疫分析要素の一実施態様例の構成図
である。

【図２】本発明の免疫分析要素の他の実施態様例の構成
図である。

【図３】実施例４の結果を示す図であり、図中（Ａ）は
実施例１のエクスプロタブ微粒子、（Ｂ）は実施例２の
アルカリ変性エクスロプロタブ微粒子、（Ｃ）は実施例
３の熱変性エクスプロタブ微粒子、（Ｒ）は比較例（微
粒子化処理していないエクスプロタブ）の、それぞれ抗
体標識酵素に対する活性を示す。

【図４】実施例５の免疫分析要素の検量線を示す図であ
る。

【図５】実施例６の免疫分析要素の検量線を示す図であ
る。

【符号の説明】

１０　　透光性支持体 １２　　試薬層 １４　　基質層

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　低分子抗原と、低分子抗原と高分子化
   合物との結合物と、酵素標識抗体との間の反応により生
   じた酵素活性の変化を測定することにより低分子抗原の
   量を分析する免疫分析要素であって、前記酵素により拡
   散性物質を生成する非拡散性基質を含有する基質層と、
   前記拡散性物質を検出する試薬層とを備えるものにおい
   て、前記非拡散性基質が微粒子化された不溶性多糖類で
   あることを特徴とする免疫分析要素。
2. 【請求項２】　　高分子抗原と、酵素標識抗体との間の
   反応により生じた酵素活性の変化を測定することにより
   高分子抗原の量を分析する免疫分析要素であって、前記
   酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含有す
   る基質層と、前記拡散性物質を検出する試薬層とを備え
   るものにおいて、前記非拡散性基質が微粒子化された不
   溶性多糖類であることを特徴とする免疫分析要素。
3. 【請求項３】低分子抗原と、低分子抗原と高分子化合物
   との結合物と、酵素標識抗体との間の反応により生じた
   酵素活性の変化を測定することにより、検体中の低分子
   量抗原を分析するため、 （ａ）　前記検体を、前記酵素により拡散性物質を生成
   する非拡散性基質を含有する基質層に供給し、次いで、
   （ｂ）　前記基質層で生成された拡散性物質を試薬層に
   移行させて検出する免疫分析方法において、前記非拡散
   性基質が微粒子化された不溶性多糖類であることを特徴
   とする免疫分析方法。
4. 【請求項４】高分子抗原と酵素標識抗体との間の反応に
   より生じた酵素活性の変化を測定することにより、検体
   中の高分子量抗原を分析するため、 （ａ）　前記検体を、前記酵素により拡散性物質を生成
   する非拡散性基質を含有する基質層に供給し、次いで、
   （ｂ）　前記基質層で生成された拡散性物質を試薬層に
   移行させて検出する免疫分析方法において、前記非拡散
   性基質が微粒子化された不溶性多糖類であることを特徴
   とする免疫分析方法。