JPH04226101A - 低分子量多糖類の混合物、及びその製造と利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は低分子量多糖類、特に低分子量ヘ
パリンに関する。

【０００２】ヘパリンは天然源から抽出されるグリコサ
ミノグリカン類の生物学的物質であり、その抗凝固因子
及び抗血栓症性の故に使用される。特に術後血栓症の治
療に使用される。しかしヘパリンはその本来の形態では
多くの欠点を示し、その使用条件が限られる。特に抗凝
固因子活性は出血の原因となり、ｐｆ４などのいくつか
の血清因子に対して過敏なため比較的大量に投薬せざる
を得ない。従って抗トロンビン効果に帰せられる抗凝固
因子活性を犠牲にして特に抗プロトロンビナ−ゼ活性に
帰せられる抗血栓症活性を大事にする必要がある。

【０００３】この目的のためにヘパリンを低平均分子量
の分子に分断することが提唱されてきた。特に欧州特許
ＥＰ　　４０，１４４はヘパリンを構成する多糖類の一
般的構造を持ち、その鎖末端にエチレン性二重結合を持
ち、重量平均分子量が２，０００−１０，０００ダルト
ンである硫酸化多糖類の混合物につき記述している。こ
の混合物はヘパリンエステルの解重合及びけん化によっ
て得る。これらは高い抗血栓症活性を示し、全体として
の抗凝固因子活性はヘパリンより低いと言われている。

【０００４】しかしヘパリンの場合に遭遇する主な問題
のひとつは、これが非常に不均一な物質であるというこ
とである。従って各片のヘパリンの活性における寄与を
評価し、これらの片の解重合中の挙動を見いだし、最終
的にこれらの片の構造及び最終生成物中のそれぞれの割
合を制御することは困難である。このような理由で上記
の欠点を完全に満足できるように解決することは不可能
であった。特に先行技術、特に特許ＥＰ　　４０，１４
４に記載された方法は適用性の向上のために必要な薬理
学的性質、すなわち十分長い血漿半減期、非常に速い吸
収速度、高い生物的有効性、言い換えれば低いクリアラ
ンスを有する混合物を与えることができない。

【０００５】しかしその悪影響を減少させるためにヘパ
リンを分断することのできる他の方法が記載されている
（Ｊｏｈｎｓｏｎ　　等，Ｔｈｒｏｍｂｏｓ．Ｈａｅｍ
ａｓｔａｓ．Ｓｔｕｔｔｇ．，１９７６，３５，５８６
；Ｌａｎｅ　　等，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　　Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ　　１６，６５１；Ｌａｓｋｅｒ　　等，ＵＳ
　　３，７６６，１６７）。これらの各方法はヘパリン
のフラグメント化の程度が増加すると所望の活性が有力
になることを示しているようである（抗血栓症活性を持
つ五糖類に関する欧州特許出願Ｅｐ　　３０１，６１８
も参照）。

【０００６】同様にトロンビン形成におけるヘパリンの
作用の機構に関する最近の研究により、試験管内のその
活性に対するヘパリンの平均分子量の影響が示された（
Ｂｅｇｕｉｎ　　等，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．
，６１，３０，１９８９）。著者等は低分子量のヘパリ
ンが抗プロトロンビナ−ゼ活性を有し、高分子量のヘパ
リンが抗トロンビン活性を有する傾向があると述べてい
る。

【０００７】同時に、より均一な平均分子量の混合物を
抽出するためにヘパリンを分別することが提唱されてき
た。ヘパリンから誘導したオリゴ糖類を製造する方法を
述べ、分子量の分散性の低い混合物を得ることを可能に
した欧州特許出願ＥＰ　　３３７，３２７が特に知られ
ている。この方法により分子量が３，０００ダルトン以
下の留分を前もって除去し、最終生成物から１０−１６
糖以下のフラグメント、及び分子量が約７，０００ダル
トン以上の片を除去する。発明者によると最終生成物の
均一化を目的とするこの処理が抗凝固因子活性を減少さ
せ、同時に所望の抗血栓症活性を与えると考えられる。

【０００８】しかしこの方法にもかかわらず、得られる
混合物にはまだ出血効果が残り、あるいは抗血栓症活性
が低すぎる。さらに最適生物活性を得るためにどの性質
を組み合わせるべきなのかを決定することを可能にする
先行技術はない。そればかりでなく上記の文献の著者の
結論がそれ自身で：”我々はヘパリンの性質のどの組み
合わせが最適かわからない。種々の配合物の正確な特性
化、及びこれらの性質と臨床的観察の関連づけがおそら
く答えを与えるであろう”と述べている。

【０００９】ここで、有利な性質を示すヘパリン、特に
急性の血栓性発作の予防及び治療において使用するため
のヘパリンが得られることを見いだした。予想に反して
出願人等は最終生成物中における高分子量及び低分子量
の片の両方の存在が、生成物により良い活性を与えるこ
とを見いだした。従って先行技術の指摘と対照的に最終
混合物中に高分子量の片を残し、ある程度不均一性を残
すのが好ましいと思われる。

【００１０】本発明の混合物の薬物動態学的研究により
、本発明の混合物が有利な性質の組み合わせを有するこ
とが示されている。特に本発明の混合物は他の周知の生
成物より、又成熟ヘパリンより長い半減期を持つ。さら
に後者に関し、本発明の混合物の半減期は注入した投薬
量に依存しないことを強調するのが重要である。これは
、得られる効果がヘパリンの場合より予測可能となるた
め有利である。

【００１１】さらに抗−Ｘａ活性により測定すると、本
発明の混合物は人間において、優れた生物有効性を示す
。この活性はヘパリンの場合約３０％であるが、本発明
の混合物の場合、約９０％である。これは注入する投薬
量を減少させ、治療力を向上させることを可能にするの
で非常に有利である。

【００１２】さらに本発明の混合物の他の重要な性質は
、速い吸収速度である。この特徴により実際に即座に生
物活性を得ることができ、従って患者を迅速に保護する
ことにより治療におけるより大きな安全性が得られる。

【００１３】本発明の混合物の他の特徴は、他の生成物
及び成熟ヘパリンと比較した低いクリアランス速度であ
る。これらの混合物の化学構造、分子量又は硫酸塩含有
量の故に、これらは分解（脱硫酸、加水分解）、及び脱
離にたいして特別な耐性を示しさらに治療の可能性を増
す。

【００１４】さらに本発明の配合物はヘパリン出発材料
と比較して長い滞留時間を有する。この性質は生成物が
生体内で活性である時間の延長、及び従ってより良い治
療効果に反映される。

【００１５】さらに本発明の配合物は血清因子に対する
過敏性が減少し、生体内における作用の持続性が増加し
、低投薬量での使用を可能にする。

【００１６】これらの特に有利な性質は、存在する片の
ある種の構造的特徴及び分子量分布を製造中に制御する
ことにより得られる。そのようにして得られる混合物は
低分子量の留分に対する高分子量の留分の比率が好まし
く、必須の抗血栓症性とほんのわずかな出血効果を混合
物に与えることができる。

【００１７】本発明のこの特徴は重鎖及び軽鎖のパ−セ
ント、ならびに分子量分布を反映する、混合物中の数平
均分子量に対する重量平均分子量の比率の両方により表
すことができる。

【００１８】本発明はヘパリンを構成する多糖類の一般
的構造を持つ硫酸化多糖類の混合物において、多糖類の
重量平均分子量がヘパリンより低く、２，０００ダルト
ンより低い分子量の鎖を９−２０％、及び８，０００ダ
ルトンより高い分子量の鎖を５−２０％含み、重量平均
分子量／数平均分子量の比率が１．３−１．６であるこ
とを特徴とする混合物を提供する。

【００１９】さらに出願人等は、不純物の含有量を低下
させることにより混合物の性質を向上させることができ
ることを見いだした。特に、大多数のヘパリンは核酸、
ポリペプチド又は他の多糖類などの汚染物を含む。後者
の中ではコンドロイチン硫酸及びヘパラン又はデルマタ
ン硫酸が特に挙げられる。これらの汚染物はそれぞれそ
の非常な高分子量の結果、及びそれが含む置換基、ある
いは硫酸化の程度の結果、生成物の製造中（例えば解重
合中）に最終分子量分布に干渉し、それを修正し、ある
いは特に活性鎖の割合を修正することにより活性を直接
修正し得る。出願人等はこれらの不純物の除去を可能に
する方法を開発し、この前処理を行った混合物の質が向
上することを観察した。この前処理の効果は標準不純物
としてデルマタン硫酸を用いて測定することができる。 上記の特徴を有する本発明の硫酸化多糖類の混合物は２
％以下のデルマタン硫酸に相当する量の多糖類不純物を
含む。

【００２０】好ましい具体化において、本発明の硫酸化
多糖類の混合物の重量平均分子量は約３，５００ダルト
ンから約５，５００ダルトンの間である。

【００２１】さらに特別に、本発明の混合物を構成する
硫酸化多糖類の鎖はその末端の片方に２−Ｏ−スルホ−
４−エノピラノスロン酸を有する。

【００２２】本発明のもうひとつの側面は、重量平均分
子量がヘパリンより低く、２，０００ダルトンより低い
分子量の鎖を９−２０％、及び８，０００ダルトンより
高い分子量の鎖を５−２０％含み、重量平均分子量／数
平均分子量の比率が１．３−１．６である硫酸化多糖類
の製造法において、以下：−第１段階で水媒体中のヘパ
リンをその長鎖第４アンモニウム塩に変換し、−第２段
階でそのようにして得た塩をエステル化してエステル化
度が９．５−１４％のエステルを得、−第３段階で、そ
のようにして得たエステル化度が９．５−１４％のエス
テルを解重合する段階から成ることを特徴とする方法で
ある。

【００２３】出願人等は解重合の程度、従って最終生成
物の分子量分布をヘパリン塩出発材料のエステル化の程
度を変化させることにより制御することができることを
見いだした。この方法に従い、上記の特徴を有する硫酸
化多糖類の混合物を直接、及び再現性良く得ることが可
能である。

【００２４】本発明の方法で使用するヘパリン出発材料
はブタヘパリン、特にブタ粘膜ヘパリンが好ましい。得
られる混合物の活性はヘパリン出発材料の起源により実
質的に変わることが見いだされた。特にヘパリン出発材
料がウシ起源の場合、好ましくないことに、ぶた腸粘膜
ヘパリンから得たものより抗凝固因子活性が大きい混合
物が得られる。

【００２５】さらに特別に有利な変法として本発明の方
法はアルコ−ルを用いたヘパリンの沈澱という予備段階
をさらに含む。この前処理によりコンドロイチン硫酸、
又はヘパラン硫酸の種類の不純物の含有量を減少させる
ことができる。良い結果を与えるアルコ−ルは例えばメ
タノ−ルである。

【００２６】ヘパリンナトリウムの不純度は立体排除液
体クロマトグラフィ−により決定することができる。

【００２７】この予備段階は特に２％以下のデルマタン
硫酸の量に相当する量の不純物を含むヘパリンの製造を
可能にする。

【００２８】特にヘパリンの塩化を以下の方法で行う。 水媒体中、２０℃近辺の温度において、過剰の対応する
第４アンモニウム塩をヘパリンナトリウムに作用させる
ことによりヘパリン塩を得る。使用する第４アンモニウ
ム塩は特に、ベンゼトニウムクロリドなどのヘパリンナ
トリウムと反応させることができるベンゼトニウム塩が
有利である。

【００２９】第２段階で以下の条件下でエステル化を行
うのが好ましい。塩素化有機溶媒中、エステル化アルコ
−ルに対応するクロリドの存在下におけるヘパリンの長
鎖第４アンモニウム塩のエステル化により塩の形態のヘ
パリンの、エステル化度が９．５−１４％である部分エ
ステルが得られる。さらに種々の反応物の割合、反応温
度及び時間を制御することにより反応の効率が上がる。

【００３０】ヘパリンの部分エステルは芳香族エステル
であることが有利であり、クロリドはベンジルクロリド
、及び塩素化溶媒はクロロホルム又はメチレンクロリド
が好ましい。

【００３１】９．５−１４％のエステル化度を得るため
に、３−５容量部の塩素化有機溶媒中で１重量部のヘパ
リン塩に対して約１容量部のクロリドを使用し、反応を
２５−４５℃、好ましくは３０−４０℃の温度にて１５
−４８時間行うのが特に有利である。

【００３２】好ましい具体化において、ヘパリンの部分
エステルはナトリウム塩の形態である。

【００３３】そのようにして形成されたエステルは酢酸
ナトリウムの存在下で、特にメタノ−ルなどのアルコ−
ルを用いた沈澱により回収することができる。反応媒体
１容量当たり１−１．２容量のアルコ−ルの使用が好ま
しい。エステルのエステル化度は高性能液体クロマトグ
ラフィ−により調べることができる。特にベンジルエス
テルの場合、０℃におけるエステルのけん化により得ら
れるベンジルアルコ−ルの量を測定することができる。

【００３４】本発明の最終段階は以下の方法で行うのが
有利である。解重合はエステルを水溶液中にて強塩基で
処理して行うのが好ましい。特に水酸化ナトリウムを使
用することができる。塩基／エステルの重量比は０．０
５−０．２、好ましくは０．０８−０．１５が有利であ
る。

【００３５】媒体の温度は５０−７０℃、好ましくは５
５−６５℃に調節し、反応は３０分−３時間、好ましく
は１−２時間の間行う。さらに水／エステルの重量比が
１５−３０である媒体中で行うのが好ましい。

【００３６】解重合を行う特に有利な方法は、以下：−
１重量部の第２段階で得た塩の形態のヘパリンの、エス
テル化度が９．５−１４％の芳香族エステル−０．０８
−０．１５重量部の水酸化ナトリウム、及び−２０−３
０重量部の水を混合し、５５−６５℃の温度を１−２時
間保つことから成る。

【００３７】その後反応媒体を希無機酸、好ましくは塩
酸を用いて中和し、メタノ−ルなどのアルコ−ルの存在
下で沈澱させることにより回収することができる。

【００３８】このようにして −９−２０％の、分子量が２，０００ダルトン以下の鎖
、及び −５−２０％の、分子量が８，０００ダルトン以上の鎖
を含み、重量平均分子量が３，５００−５，５００であ
り、重量平均分子量／数平均分子量の比率が１．３−１
．６である硫酸化多糖類の混合物を直接、及び再現性良
く得ることができる。

【００３９】本発明の混合物は抗血栓症剤として有利に
使用することができる。

【００４０】特に長引いた場合を含む危険な状況におけ
る静脈血栓症の予防に適用することができる。特にこれ
らの混合物は初めて、決まった投薬量にて整形外科手術
における急性血栓症発作の危険を減少させることを可能
にする。この危険は、何の処理も行わないと７０％存在
し、ヘパリンの存在下では約２５％であり、本発明の混
合物の存在下では約１０％かそれ以下である。

【００４１】同様に人口腎臓の管に注入すると、これら
の混合物はそこで起こり易い血栓症を減少させることが
できる。後者の適用は外科的装具における血栓症の予防
に広げることができる。

【００４２】本発明の混合物の他の有利な治療への利用
は、特に心筋梗塞の場合の急性動脈血栓症発作の予防で
ある。

【００４３】さらに本発明の混合物の特別に有利な適用
は、外科患者の静脈血栓症の予防のための術後管理への
利用の可能性である。本発明の混合物は手術中の出血の
危険、及び術前管理として起こる麻酔剤の種類や投薬量
の問題を避けることを可能にするので、この適用は非常
に有利である。

【００４４】これらの集合的性質は本発明の配合物の治
療上の可能性を示す。

【００４５】以下の実施例は本発明を説明するものであ
る。

【００４６】分析法 生成物の分子量及び分子量分布は、例えばＴＳＫ　　Ｇ
　　３０００ｓｗ（３０ｘ０．７５ｃｍ）とＬｉｃｈｒ
ｏｓｏｒｂ　　１００　　Ｄｉｏｌ　　１０ｕ（２５ｘ
０．７５ｃｍ）、又はＴＳＫ　　Ｇ　　２０００ＳＷの
名前で販売されている２本のカラムを直列につなぎ屈折
計検出器と組み合わせた高圧液体クロマトグラフィ−を
用いて決定する。使用溶媒は０．３Ｍリン酸塩緩衝液ｐ
Ｈ７、流量は０．７ｍｌ／分である。系はＢａｒｒｏｗ
Ｃｌｉｆｆｅ等，Ｔｈｒｏｍｂ．ｒｅｓ．，１２，２７
−３６（１９７７−７８）又はＤ．Ａ．Ｌａｎｅ等，Ｔ
ｈｒｏｍｂ．ｒｅｓ．，１２，２５７−２７１（１９７
７−７８）に記載の方法に従い、アガロ−ス−ポリアク
リルアミド（ＩＢＦ）上の排除クロマトグラフィ−によ
るエノキサパリン（ＰＦＡＲＭＵＫＡ）の分別により調
製した標準を用いてキヤリブレ−ションを行う。結果は
ＧＰＣ６ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ　　Ｅｌｍｅｒ）
を用いて計算する。

【００４７】以下の実施例において、混合物全体の抗凝
固因子活性は低分子量ヘパリンの第１国際標準規格を用
いた濁り滴定により測定する。抗−因子Ｘａ（抗血栓症
）活性は、Ｔｅｉｅｎ等，Ｔｈｒｏｍｂ．ｒｅｓ．，１
０，３９９−４１０（１９７７）に記載の発色物質につ
いてのアミドリシス法により、低分子量ヘパリンの第１
国際標準規格を用いて測定する。

【００４８】

【実施例】実施例１ この実施例はコンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸の種
類の不純物の含有量を減少させるためのヘパリンナトリ
ウムの処理の前段階を示す。

【００４９】塩化ナトリウム（３ｇ）を含む水（１００
ｍｌ）の水に溶解した市販のヘパリン（ナトリウム塩）
（１０ｇ）にメタノ−ル（８０ｍｌ）を加える。沈澱し
たヘパリンを濾過し、すすぎ、乾燥する。そのようにし
て得たヘパリンナトリウムの純度を、ＴＳＫ　　２００
０ＳＷ（６０ｘ０．７５ｃｍ）とＴＳＫ　　３０００Ｓ
Ｗ（３０ｘ０．７５ｃｍ）の名前で販売されている２本
のカラムを直列につなげ、２０６ｎｍに合わせたＵＶ検
出器と組み合わせた立体排除液体クロマトグラフィ−に
より測定する。使用した移動相は０．５Ｍの硫酸ナトリ
ウム水溶液で、流量は１ｍｌ／分である。試験試料のＵ
Ｖ吸収をデルマタン硫酸（２％）を含む標準ヘパリンの
吸収と比較する。

【００５０】上記の条件下で得られたヘパリンは、２％
以下のデルマタン硫酸に相当する量のコンドロイチン硫
酸及びヘパラン硫酸の種類の不純物を含む。

【００５１】実施例２ この実施例はヘパリンの第４アンモニウム塩の製造を示
す。

【００５２】水（１２５ｍｌ）中のベンゼトニウムクロ
リド（２５ｇ）の溶液を、実施例１で得た精製ヘパリン
ナトリウム（１０ｇ）の水（１００ｍｌ）溶液に加える
。その後沈澱生成物を室温で濾過し、水で洗い、乾燥す
る。

【００５３】同様の方法で実施例１の精製を行わないヘ
パリンのベンゼトニウム塩も製造する。

【００５４】実施例３ この実施例は本発明の混合物の製造及び性質を示す。

【００５５】１．エステル化 実施例１の方法により処理したヘパリンから実施例２の
記載のとうりにして得たベンゼトニウムヘパリネ−ト（
１５ｇ）のメチレンクロリド（７５ｍｌ）中の溶液にベ
ンジルクロリド（１５ｍｌ）を加える。溶液を３５℃の
温度に加熱し、２５時間保つ。メタノ−ル中の酢酸ナト
リウムの１０％溶液（９０ｍｌ）を加え、沈澱生成物を
濾過し、メタノ−ル中で洗い、乾燥する。このようにし
てヘパリンベンジルエステル（６．５ｇ）をナトリウム
塩の形態で得、上記のようにして決定したそのエステル
化度は１３．３％である。

【００５６】２．解重合 上記のようにして得たヘパリンベンジルエステルナトリ
ウム塩（１０ｇ）を水（２５０ｍｌ）に溶解する。この
溶液を６２℃に加熱し、水酸化ナトリウム（０．９ｇ）
を加える。６２℃の温度を１時間３０分保持する。その
後反応混合物を約２０℃に冷却し、希塩酸を加えて中和
する。反応媒体中の塩化ナトリウムの濃度を１０％に調
節する。最後に生成物をメタノ−ル（７５０ｍｌ）中で
沈澱させ、濾過し、乾燥する。このようにして以下の構
造的特徴を持つヘパリンが得られる： −重量平均分子量が３，９００ダルトン、−分子量分布
： ・２，０００ダルトン以下の分子量の鎖が２０％・８，
０００ダルトン以上の分子量の鎖が５．５％−分散：　
　ｄ＝１．３９ −抗−Ｘａ活性：１０６ＩＵ −抗凝固因子活性：２２．６ＩＵ。

【００５７】実施例４ 同様の方法で、エステル化度が９．５−１４％のエステ
ルから出発し、以下の構造的特徴を持つ解重合ヘパリン
の溶液を製造する：ａ）−重量平均分子量：４，４２５
ダルトン−分子量分布：・２，０００ダルトン以下の分
子量の鎖が１２．４％・８，０００ダルトン以上の分子
量の鎖が９．３％−分散：　　ｄ＝１．３７−抗−Ｘａ
活性：１０２ＩＵ−抗凝固因子活性：３３ＩＵ。

【００５８】ｂ）−重量平均分子量：４，５７９ダルト
ン −分子量分布： ・２，０００ダルトン以下の分子量の鎖が１１．２％・
８，０００ダルトン以上の分子量の鎖が１０．４％−分
散：　　ｄ＝１．３７ −抗−Ｘａ活性：１０４ＩＵ −抗凝固因子活性：３７ＩＵ。

【００５９】ｃ）−重量平均分子量：４，４４６ダルト
ン −分子量分布： ・２，０００ダルトン以下の分子量の鎖が１２．６％・
８，０００ダルトン以上の分子量の鎖が９．５％−分散
：　　ｄ＝１．３８ −抗−Ｘａ活性：１００ＩＵ −抗凝固因子活性：３２ＩＵ。

【００６０】実施例５ この実施例は本発明に含まれない混合物の製造を示す。

【００６１】１．エステル化 実施例１の方法により処理したヘパリンから実施例２の
記載のとうりにして得たベンゼトニウムヘパリネ−ト（
１５ｇ）のメチレンクロリド（６０ｍｌ）中の溶液にベ
ンジルクロリド（１２ｍｌ）を加える。溶液を２８℃の
温度に加熱し、３０時間保つ。メタノ−ル中の酢酸ナト
リウムの１０％溶液（９０ｍｌ）を加え、沈澱生成物を
濾過し、メタノ−ル中で洗い、乾燥する。このようにし
てヘパリンベンジルエステル（６．３ｇ）をナトリウム
塩の形態で得る。０℃におけるエステルのけん化により
放出されるベンジルアルコ−ルの量を高性能液体クロマ
トグラフィ−により測定して決定した生成物のエステル
化度は９．２％である。

【００６２】２．解重合 上記のようにして得たナトリウム塩の形態のヘパリンベ
ンジルエステル（１０ｇ）を水（２００ｍｌ）に溶解す
る。この溶液を５８℃に加熱し、水酸化ナトリウム（１
．１ｇ）を加える。５８℃の温度を１時間保持する。そ
の後反応混合物を約２０℃に冷却し、希塩酸を加えて中
和する。反応媒体中の塩化ナトリウムの濃度を１０％に
調節する。最後に生成物をメタノ−ル（６００ｍｌ）中
で沈澱させ、濾過し、乾燥する。このようにして以下の
構造的特徴を持つヘパリンが得られる：−平均分子量が
５，４２５ダルトン、 −分子量分布： ・２，０００ダルトン以下の分子量の鎖が９．６％・８
，０００ダルトン以上の分子量の鎖が１９．５％−分散
：　　ｄ＝１．４４ −抗−Ｘａ活性：１２２ＩＵ −抗凝固因子活性：６８．６ＩＵ。

【００６３】高い抗凝固因子活性を示すこれらの結果は
、本発明に従って調製した上述の特徴を有する混合物の
優秀性を示している。

【００６４】実施例６ この実施例は血漿中の半減期によって表される本発明の
混合物の生体内における安定性の増加を示す。

【００６５】年令２１−３０才のボランティアについて
最初の薬物動態学的研究を行った。２０−８０ｍｇ／ｍ
ｌの投薬量の皮下注射を行う。時間的間隔をおいて試料
（４．５ｍｌ）を得、約４℃に保存する。その後試料を
２，３００ｇにて１５分間遠心し、血小板の少ない血漿
を分離し、分析の前に凍結する。その後抗−Ｘａ活性を
測定することにより混合物の半減期を決定する。得られ
た結果は以下のとうりである：−実施例３及び４により
得た混合物を用いた場合：・投薬量４０ｍｇ：半減期が
４時間以上の場合が７５％あり、４時間３０分以上の場
合が約４５％ある。

【００６６】・投薬量６０ｍｇ：半減期が３．７時間以
上の場合が７５％。

【００６７】−同様の投薬条件において、静脈注射によ
る未処理のヘパリンの半減期は約０．６時間である。

【００６８】−欧州特許ＥＰ　　４０，１４４に記載の
方法で生成物を製造した場合、半減期が４時間３０分以
上の場合が１７％である。

【００６９】第２の研究を同様の条件下で２０人の患者
について行い、本発明の混合物の場合に以下の結果を得
た：・投薬量４０ｍｇ：半減期が４時間以上の場合が８
０％あり、４時間３０分以上の場合が約４０％ある。

【００７０】・投薬量２０ｍｇ：半減期が３．９時間以
上の場合が６０％ある。

【００７１】本発明の主たる特徴及び態様は以下のとう
りである。

【００７２】１．ヘパリンを構成する多糖類の一般的構
造を持つ硫酸化多糖類の混合物において、多糖類の重量
平均分子量がヘパリンより低く、２，０００ダルトンよ
り低い分子量の鎖を９−２０％、及び８，０００ダルト
ンより高い分子量の鎖を５−２０％含み、重量平均分子
量／数平均分子量の比率が１．３−１．６であることを
特徴とする混合物。

【００７３】２．第１項に記載の混合物において、２％
以下のデルマタン硫酸に相当する量の不純物を含むこと
を特徴とする混合物。

【００７４】３．第１又は２項に記載の混合物において
、重量平均分子量が約３，５００ダルトン−約５，５０
０ダルトンであることを特徴とする混合物。

【００７５】４．第１−３項のいずれかに記載の混合物
において、硫酸化多糖類の鎖がその末端の片方に２−Ｏ
−スルホ−４−エノピラノスロン酸を有することを特徴
とする混合物。

【００７６】５．ヘパリンを構成する多糖類の一般的構
造を持つ硫酸化多糖類の混合物において、多糖類の重量
平均分子量がヘパリンより低く、２，０００ダルトンよ
り低い分子量の鎖を９−２０％、及び８，０００ダルト
ンより高い分子量の鎖を５−２０％含み、重量平均分子
量／数平均分子量の比率が１．３−１．６であることを
特徴とする混合物の製造法において、以下：−第１段階
で水媒体中のヘパリンをその長鎖第４アンモニウム塩に
変換し、−第２段階でそのようにして得た塩をエステル
化してエステル化度が９．５−１４％のエステルを得、
−第３段階でそのようにして得たエステル化度が９．５
−１４％のエステルを解重合する段階から成ることを特
徴とする方法。

【００７７】６．第５項に記載の方法において、第２段
階を塩素化有機溶媒中にてエステル化アルコ−ルに対応
するクロリドを用いて行うことを特徴とする方法。

【００７８】７．第６項に記載の方法において、クロリ
ドがベンジルクロリドであり、溶媒がクロロホルム又は
メチレンクロリドであることを特徴とする方法。

【００７９】８．第６又は７項に記載の方法において、
３−５容量部の塩素化有機溶媒中、２５−４５℃の温度
にて１重量部のヘパリン塩を約１容量部のクロリドと混
合することにより、エステル化を行うことを特徴とする
方法。

【００８０】９．第８項に記載の方法において、温度が
３０−４０℃であることを特徴とする方法。

【００８１】１０．第５−９項のいずれかに記載の方法
において、エステルを水溶液中、強塩基で処理すること
により解重合を行うことを特徴とする方法。

【００８２】１１．第１０項に記載の方法において、塩
基／エステルの重量比が０．０５−０．２であることを
特徴とする方法。

【００８３】１２．第１１項に記載の方法において、重
量比が０．０８−０．１５であることを特徴とする方法
。

【００８４】１３．第１０，１１又は１２項に記載の方
法において、水／エステルの重量比が１５−３０である
ことを特徴とする方法。

【００８５】１４．第１０−１３項のいずれかに記載の
方法において、媒体の温度を５０−７０℃に調節し、反
応を３０分−３時間の間行うことを特徴とする方法。

【００８６】１５．第１４項に記載の方法において、媒
体の温度が５５−６５℃であり、反応を１−２時間行う
ことを特徴とする方法。

【００８７】１６．第５−１５項に記載の方法において
、ヘパリン出発材料がアルコ−ルを用いた水溶液からの
沈澱により精製してあることを特徴とする方法。

【００８８】１７．血栓症の予防又は治療のための治療
用配合物において、請求項１に記載の硫酸化多糖類の混
合物を含むことを特徴とする配合物。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ヘパリンを構成する多糖類の一般的構
   造を持つ硫酸化多糖類の混合物において、多糖類の重量
   平均分子量がヘパリンより低く、２，０００ダルトンよ
   り低い分子量の鎖を９−２０％、及び８，０００ダルト
   ンより高い分子量の鎖を５−２０％含み、重量平均分子
   量／数平均分子量の比率が１．３−１．６であることを
   特徴とする混合物。
2. 【請求項２】　　ヘパリンを構成する多糖類の一般的構
   造を持つ硫酸化多糖類の混合物において、多糖類の重量
   平均分子量がヘパリンより低く、２，０００ダルトンよ
   り低い分子量の鎖を９−２０％、及び８，０００ダルト
   ンより高い分子量の鎖を５−２０％含み、重量平均分子
   量／数平均分子量の比率が１．３−１．６であることを
   特徴とする混合物の製造法において、以下：−第１段階
   で水媒体中のヘパリンをその長鎖第４アンモニウム塩に
   変換し、−第２段階でそのようにして得た塩をエステル
   化してエステル化度が９．５−１４％のエステルを得、
   −第３段階でそのようにして得たエステル化度が９．５
   −１４％のエステルを解重合する段階から成ることを特
   徴とする方法。
3. 【請求項３】　　血栓症の予防又は治療のための治療用
   配合物において、請求項１に記載の硫酸化多糖類の混合
   物を含むことを特徴とする配合物。